KR101118342B1 - 초위성체 유전자를 이용한 의한 계육의 원산지 추적 및개체식별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재래닭의 초위성체 유전자로부터 선정된 유전자 표지의 수와 크기를 측정하여, 닭 시료의 개체 식별 유전자를 분석하고, 재래닭의 원산지 정보와 비교하여 동일 개체 여부를 판별할 수 있는 유효성이 높은 유전자 감식기법을 제공 할 수 있게 되었다.

재래닭, 초위성체 유전자, 유전자 표지, 원산지 추적, 개체식별

Description

초위성체 유전자를 이용한 의한 계육의 원산지 추적 및 개체식별 방법 {Method discrimination for product traceability and identification of chicken using Microsatellite DNA}

본 발명은 초위성체 유전자를 이용한 가금육 원산지 추적 및 개체식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재래닭 집단에서 높은 빈도로 출현하는 초위성체 유전자에서 유전자 표지를 선정하여, 유통시장의 도축물이 원산지에서 제공된 재래닭 개체인지의 진위여부를 판별하기 위한 유전자 검증 방법에 관한 것이다.

일반적으로 국외내의 경우 축산물(닭고기)의 원산지를 추적하는 것은 사스, 가금티푸스 등의 악성 질병이 사람이나 다른 지역의 가축, 동물 등으로 전파되는 것을 사전에 차단하기위해 실시되고 있다.

이를 위해, 유럽의 경우 원산지로부터 개체 식별이 된 가축만이 도축되거나 이동될 수 있도록 의무적으로 이표(귀에 부착된 바코드 표식)를 달도록 제도화 되어 있으며 도축 후에는 생축에서 확인된 바코드 번호가 연계되어 상품에 부착됨으로 인해 유통점에서 축산물의 원산지가 추적되는 시스템을 채택 하고 있다. 최근에는 닭으로부터 매개되는 악성전염원의 차단을 위해 닭고기의 경우에는 원산지 추적 및 이를 물류 흐름을 통제 검증할 수 있는 개술체계 개발이 추진되고 있으며 원산지 검증 모니터링을 위한 BT 기술의 도입을 검토하고 있는 실정이다. 이러한 원산지 추적 검증 기술의 적용을 방역차원에서 검토되고 있는 실정과 아울러 일본과 한국 등에서는 일반 외래 품종으로 사육 도축된 가축과 재래에 의해 사육된 계육의 가격차이가 매우 높기 때문에, 의도적으로 도축 후에 원산지의 정보가 차단되는 경향이 많이 있는 실정이다. 또한 의도적이지 않는 경우에도 재래 닭의 도축산물에 대한 물류 시스템의 오류 등의 원인으로 완벽한 원산지 정보가 연계되지 못하고 있다. 이와 아울러 재래 계육을 선택하고 있는 소비자에 대한 일정한 물류정보 차원에서 재래 닭을 산지 정보가 전달될 수 있는 시스템의 활용이 매우 중요한 상황이다. 이에 몇몇 나라에서는 유전자 감식 기법의 도입을 통한 원산지 정보의 진위 여부임을 시도하고 있다.

하지만, 닭의 유전자 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 닭의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 재래 닭의 개체 식별을 위해서는 재래 닭의 특이적인 유전양상에 근거한 표지 유전자를 선정하고, 이들을 활용한 유전자 감식기법을 설정하는 것이 매우 중요하다.

한편, 국내에서는 대부분이 재래 닭 유전자의 보존 측면과 품종 간 유전적 다양성 연구와 친자 확인용으로 개발된 유전자 표지(초위성체 유전자: Microsatellite DNA)를 활용한 유전자 감식 기법이 사용되고 있다.

그러나, 상기 사용되고 있는 유전자 표지를 부분적으로 재래 닭의 유전자 감식용으로 활용할 경우, 유용성 및 정확도가 떨어지는 단점이 있다.

또한, 현재 개발된 일부의 유전자 표지는 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있는 실정이기 때문에, 좀더 유용한 유전자 표지를 선별하여 재래 닭 개체 식별과 원산지 검증의 유효성을 높이면서, 다양한 개체의 품종을 확인할 수 있도록 충분한 수의 유전자 표지(Genetic marker)를 개발할 필요가 있다. 또한 이러한 분석에 있어 많은 비용이 소모됨에 따라 유통의 전반적인 과정에 사용되는 것 보다는 유통과정에서 때때로 모니터링 하는데 사용함으로 유통과정에서 발생하는 오류나 의도적인 생산품의 위장을 막을 수 있다.

이에, 본 발명자는 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 닭의 생산 및 도축 까지 가지고 있는 원산지의 생체 개체 유전자 정보를 데이터베이스화 하고, 상기 원산지 정보를 도축 후 포장되어 유통점에 이동되거나 판매되어 소비자에 전달된 상태에서 채취한 시료로부터 분석한 개체 유전자 감식 정보와 비교하여, 개체 식별을 하거나 재래 닭의 여부를 유효히고 정확하게 검증할 수 있는 다양한 닭의 유전자 표지를 선정하고 이의 유전자 표지를 이용한 분석 방법을 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 재래 닭의 초위성체 유전자로부터 유전자 표지를 선정하고, 이를 이용하여 유효성 및 정확성이 매우 우수한 계육의 원산지 추적 및 품종특성에 따른 개체 식별 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 닭의 초위성체 유전자좌에 특이적인 유전자 증폭 프라이머를 이용하여 검체에서 각각의 초위성체 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물을 크기별로 분획하여 상기 프라이머별로 증폭된 유전자 산물의 크기를 측정한 다음, 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는 계육 원산지 추적 및 개체식별의 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하자면 다음과 같다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

아울러, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 재래 닭의 혈액 및 기타 조직 시료에서 개체 식별을 위한 유전자 표지로, 염색체 내의 고도 원심분리에 의해 주 염색체와 분리되는 초위성체 유전자 (Microsatellite DNA)를 이용한다.

그리고, 상기 초위성체 유전자를 유전저 표지로 사용하기 위해, 본 발명에서는 국내 재래 닭 집단 중에서 300두를 공시재료로 이용하여, 공지된 유전자 중에서 실재(實在)하는 재래 닭에서 발현되고, 이론적으로 대립 유전자 크기의 다양성 및 이들 DNA의 증폭 온도 조건 등이 적합할 것으로 예상되는 유전자 표지를 최종적으로 선정하고, 상기 유전자 표지에 대한 유전자 진단용 프라이머를 디자인한다.

이때, 상기 유전자 진단용 프라이머는 유전자 표지당 2종의 프라이머를 제작하여 대립유전자를 분석할 수 있게 하고, 공시재료에서 추출한 재래 닭 초위성체 DNA와 함께 PCR 증폭 반응을 수행하여, 공시재료인 재래 닭에서 특이적으로 발현되는 각각의 유전자 표지별 대립 유전자(Allele)를 증폭시킨다.

그리고, 증폭된 대립 유전자들은 적합한 분석기기를 사용하여, 각각의 유전자 표지별로 대립유전자의 수, 유전자의 위치, 유전자 크기 및 이형접합체 출현율로 분류한다.

그런 다음, 본 발명은 상술한 선정방법으로부터 재래 닭 집단에서 높은 빈도로 출현하는 유효성이 높은 유전자 표지를 확보한다.

본 발명에서는 초위성체 유전자(Microsatellite DNA)를 검출하기 위해, 방사성 물질을 사용하는 것 보다는 형광 프로브 방법을 사용하고, 유전자 증폭용 프라이머에 형광물질을 결합하여 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명에서 초위성체 유전자를 증폭하는 반응은 먼저 95℃에서 5분간 반응하고, 94℃에서 30초, 53～55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간을 반응시켜서 완료하는 다중 PCR을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 계육의 원산지 추적 및 개체식별을 하기 위해, 유전자 표식(genetic marker)으로 사용하는 초위성체 유전자는 대립 유전자의 수가 3～6개이고, 이형접합체 출현율은 60％보다 높은 나타나며, 유전자의 크기는 81～280bp인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 대립 유전자의 수가 3개 미만일 경우에는 개체식별 확률이 너무 저하되고, 6개를 초과할 경우에는 실제 유전자 분석을 위해 실험을 실시할 경우, 대립 유전자의 다양한 출현으로 인해 개체의 유전자 분석 정보 를 처리하기에 복잡해지는 문제점이 발생되고, 유전자의 크기가 300bp 이상이 되면 검출감도가 떨어지기 쉽고, 이형접합체 출현율이 60％ 미만이면 대립 유전자가 개체마다 다양한 조합을 이루어 발현할 수가 없어서, 대립유전자의 수와 크기를 수치화 하기가 어렵워지기 때문이다.

이에, 본 발명에서는 상술한 조건에 적합하면서 재래 닭에서 출현 빈도가 높은 초위성체 유전자인 ADL268, LEI094, MCW216, MCW295, MCW330, ADL181,ADL176을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명에서 사용되는 상기 대조구는 공시된 재래 닭으로부터 초위성체 유전자좌에 특이적인 유전자 증폭 프라이머를 이용하여 각각의 초위성체 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물을 크기별로 분획하여 상기 프라이머 별로 증폭된 유전자 산물의 크기를 측정한 다음, 공시된 토종 닭 종별로 원산지 정보를 데이타베이스화한 정보로 구성된 것을 사용한다.

이하, 본 발명의 유전자 감식에 의한 계육의 원산지 추적 및 품종 판별 방법 및 효과를, 실시 예를 참조하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

그러나, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되지 않는다.

(실시예)

1. 공시재료

국내 재래 닭 집단 중 300수와 동일성 검정을 위해 안성 지역에서 출하된 50두를 공시재료로 활용하였다.

이들 각 재래 닭 개체에서 염색체를 추출하여 하기 다중 PCR에서 주형 DNA로 사용하였다.

2. 대상 유전자 표지 및 유전자 증폭 프라이머 제작

본 발명에서 사용한 대상 유전자 표지는 초위성체 DNA(마이크로세터라이트)를 사용하였으며, 이들 유전자 표지를 분석하기 위해 유전자좌를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1의 유전자 표지명은 종래 당해 기술 분야에서 그 의미가 확실하게 되어 있는 것으로, 예를 들면 웹사이트(www.NCBI.nlm.nih.gov)에도 나와 있다.

3. 다중 PCR (Multiplex PCR)

PCR증폭 반응은 형광 염색된 초위성체 DNA의 색상과 이의 대립 유전자의 크 기별 분포 등을 고려하여 주로 다중 PCR을 수행하였고, 18종에 대한 유전자형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 초위성체의 유전자 표지를 인지하기 위해 형광 물질을 유전자 증폭 프라이머에 부착하였다.

다중 PCR은 약 50ng의 주형 DNA, 20ng의 각 프라이머, 1.25mM의 각 dNTP, 0.5U의 Taq DNA 중합효소(Promega)과 1㎕ 10X PCR 완충용액(100mM Tris--HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 0.01％ gelatin, 0.25％ nonidet P40 and 20mM MgCl2)를 혼합하여 각 반응액의 총량이 10㎕가 되게 한 후, 상기 혼합물을 진앰프 9700(GeneAmp 9700, Applied Biosystems)에서 95 , 5분간 첫 반응을 시작하여, 94 에서 30초, 초위성체 DNA 표지에 따라 53～55 에서 1분간, 72 에서 1분 반응을 한 사이클로 하여 35회 반복반응을 실시하고 마지막으로 신장반응을 위해 72 에서 10분간 실시하여 완료하였다. PCR 수행후의 증폭산물들은 탈이온된 포름아미드(deionized formamide), 로딩 완충용액(loading buffer) 및 표준용액(Genescan 350-TAMRA internal size standard)을 잘 혼합하고, 5％ 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 분리된 상기 증폭산물들은 ABI PRISM 377 DNA sequencer(Applied Biosystems사, 미국)와 Genescan analysis software(version 3,1, Applied Biosystems사)를 이용하여 각 PCR 증폭된 유전자 단편들의 크기를 3차원 최소자승법(Third order least squares method)으로 분석하였고, Genotyper analysis software(version 2.0)을 이용하여 초위성체 유전자 위치(loci)별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.

그 결과, 각 유전자 표지별로 대립유전자의 수, 대립유전자의 크기, 이형접합체 발현율 및 유효대립유전자수를 하기 표 2와 같이 알 수가 있었다.

또한, 유전자 표지별로 서로 다른 개체가 동일 유전자형을 보일 수 있는 확률을 계산하여, 재래 닭 집단에 적합하고 유효성이 높을 것으로 예측되는 유전자 표지를 선정하여, 하기 표 3에 나타내었다.

4. 본 발명에서 선정된 표지를 이용한 재래 닭 판별 검증 효과

상기 실시예 3에서 제시된 유전자 표지를 활용하여 원산지 재래 닭 생체에서 채취된 시료의 유전자 감식 결과와 유통단계에서 채취된 시료의 유전자 감식 결과를 비교하여, 본 발명의 유효성을 평가하였다.

재래 계 동일성 판별에 대한 유효성의 평가는 10set(원산지 개체 + 도계축 개체)의 시료를 가지고 분석하였는데, 원산지로부터 출하된 개체를 표준 시료로 하고, 상기 재래계가 도계되어 개체식별로 5g 내외의 조직을 채취하여 원산지 생체상태와 도계된 후의 상태의 시료를 1set로 하고 임의로 다른 개체를 무작위로 선택하여 1set를 구성하여 선택한 후, 상기 실시 예 3의 방법에 따라 유전자 판별 검사를 실시하여 비교하였다. 이때, 사용된 유전자 표지는 ADL268, LEI094, MCW216, MCW295, MCW330, ADL181, ADL176를 사용하였다.

각 시료별 유전자 표지의 크기를 나타낸 결과, 본 발명에 의한 유전자 표지를 이용한 재래 동일성 판별 검사는 원산지 시료와 유통단계에서 채취된 시료와 다른 개체에서 채취된 1개의 시료를 정확히 판별해 내는 것을 알 수 있었다(표 4 참조).

이상과 같이, 본 발명은 재래 닭 집단에서 높은 빈도로 출현하는 유전자 표지(초위성체 DNA)를 유전자 분석하는 기법으로 활용함으로써 개체의 생체상에 나타 나는 유전자지문을 디지털정보화하여, 원산지 재래 닭 시료로부터 분석된 유전자 감식정보로 유통단계의 부분육과 원산지 재래 닭 시료의 동일 개체 여부를 100％ 판별할 수 있는 유효성이 높은 유전자 감식기법을 제공하게 되었다.

이에 따라, 본 발명은 닭고기 유통 시장에서 원산지로부터 특정 유통점으로 유입된 닭고기의 동일 개체 여부를 검증하는데 활용하여, 계육 여부를 판별하는 종래의 유전자 감식 차원을 뛰어넘어 원산지의 재래 닭 정보를 유통단계의 정보와 연계시킬 수 있는 수단과 안전성 여부를 추적할 수 있는 검증 수단 확보의 효과를 동시에 얻을 수 있다.

Claims (5)

1. ADL268, LEI094, MCW216, MCW295, MCW330, ADL181,ADL176인 닭의 초위성체 유전자좌에 특이적인 유전자 증폭 프라이머를 이용하여 검체에서 각각의 초위성체 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물을 크기별로 분획하여 상기 프라이머별로 증폭된 유전자 산물의 크기를 측정한 다음, 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는 계육 원산지 추적 및 개체식별의 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 닭의 초위성체 유전자는 대립유전자의 수가 3～6개이고, 이형접합체 출현율은 60％보다 높게 나타나며, 유전자의 크기는 81～289bp인 것을 특징으로 하는 계육 원산지 추적 및 개체 식별의 방법.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,

   유전자 증폭은 95℃에서 5분간 반응하고, 94℃에서 30초, 53～55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 35회 반복하고, 72℃에서 10분간을 반응시키는 것을 특징으로 하는 계육 원산지 추적 및 개체 식별의 방법.
5. 삭제