KR20110020933A - 이력추적 체계에서 사용하기 위한 유전자형 분석 방법 및 이의 수단 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개별 가축의 머리의 유전자형 분석을 위한 수단 및 방법을 개시한다. 개별 DNA는 본원에서 정의된 PCR SNaPshot 프로토콜을 이용하여 유전자형 분석된다. 상기 프로토콜은 두 PCR 단계를 포함하는데, 상기 제 1 단계(PCR1)는 프라이머(SEQ ID No. 1-30) 및/또는 PCR 1 반응을 위한 공통의 10개 염기 모티프(ACGTTGGATG)를 5' 말단에 지닌 연장된 프라이머를 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 제 2 단계(PCR2)는 연장 프라이머(SEQ ID No. 31-45) 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 인접한 프라이머를 첨가하는 단계를 포함한다. 추가 단계는 주형 DNA 및 제 1 프라이머 세트를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 앰플리콘을 생성시켜 PCR1 생산물을 산출하는 단계, PCR1 생산물을 연장 프라이머 세트에 대한 주형으로 이용하여 PCR2 생산물을 산출하는 단계를 포함한다. 상이한 길이의 말단을 PCR2 프라이머에 첨가함으로써 크기 및 색상 분리가 성립된다. PCR2 생산물을 분리하고 결과물을 데이타뱅크로부터의 SNP 프로파일과 비교하여 매칭 결과를 획득한다.
Description
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 유전자형 분석(genotyping) 방법 및 수단에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 가축 및 식품의 이력추적(traceability)에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
대부분의 서양 국가에서 동물의 이력추적의 중요성의 인식 증가는 세계화, 질병, 예컨대, 구제역 및 BSE 및 과학 및 기술적 진보와 같은 요인에 의해 유도된 다. 동물 식별은 질병 발생을 빠르게 추적하고 분리시킬 수 있으며, 안전한 우리의 식량 공급을 돕고, 수출 시장을 보호하며, 절도를 막는데 도움을 주며, 공급망의 관리를 개선시키는 수단이 된다. 따라서, 이력추적 체계는 농부, 수의자, 육류 가공업자, 소매상인 및 소비자는 물론 정부 관료에게 흥미로운 것이다. 실제로, 대부분의 서양 정부는 요즘 어느 정도의 가축 이력추적을 필요로 하고, 다른 나라의 육류-소비자는 이력추적 프로그램에 다양한 수준의 지불 의사를 보이고 있다.
오늘날, DNA-태깅(DNA-tagging)은 소비될 때까지 동물로부터 제작된 모든 생산물의 기원 및 본질을 테스트하고 식별하기 위한 최상의 접근법으로 인식된다. 그러나, 요즘, 유전적 이력추적은 상당한 실험적 기술을 필요로 하는 버거운 기술이며, 거대 동물 집단에 적용하기 적합하지 않다.
DNA 식별 시스템을 기초로 한 사용하기 쉬운 이력 추적 체계가 상이한 수준의 넓이, 깊이 및 정밀도에 적용될 수 있다면, 특히 유용할 것이다. 유럽, 이스라엘, US, 캐나다, 오스트레일리아, 브라질, 아르엔티나, 및 일본에서, 다양한 유형의 이력추적 체계가 사용중에 있으나, 이것은 이들의 유용성 및 정확성에서 모두 제한적인데, 이는 이러한 체계가 DNA 식별 시스템을 이용하기에 효율적이고 손쉬운 데 기반하지 않기 때문이다.
BSE 스캔들에 의해 촉발되어, 동물들은 출생 후, 이들의 식별을 가능케 하는 두개의 번호가 매겨진 귀-태그(ear-tags)(전자 RPID 태그 포함)를 제공받게 되는, 농장 동물의 EU-광범위 강제 식별이 도입되었다. 도살장에서는 귀-번호를 체크함으로써 동물이 태어난 농장을 구별할 수 있다. 그러나, 이러한 귀-태그는 위조로부터 안전하지 않으며, 이러한 식별은 동물이 도살당할 경우 제거된다. 현대 검출 기법(PCR, 시퀀싱 등)은 심지어 매우 작은 조직 샘플로부터라도, 이들이 특정 개체로부터 유래한 것인지 여부를 결정할 수 있다. 이력추적 시스템은 소고기 생산 및 국가의 거래에서 구현되고 있다. 이러한 시스템의 넓이, 깊이 및 정밀도는 대부분 조직의 샘플링, 추출, 분석 및 저장의 난이도에 의존한다.
조직/DNA 샘플링 - 혈액 샘플은 보통 수의사에 의해 채취되고 분석된다. 그러나, 거대 동물 집단의 경우, 이것은 지나치게 노동-집약적이고, 경제적 관점에서 실용적이지 않다. 아르고비오겐사(Agrobiogen)는 자동적으로 조직의 작은 샘플을 채취하자마자 태그가 동물의 귀 내에 고정되는, 특허받은 귀-태킹 접근법을 보유한다. 상기 조직은 자동 밀봉식이며 접촉 후 조직을 말리고 DNA를 보존시키는 건조제를 포함하는 바코드화된 챔버에 포함된다.
DNA 추출 - DNA 샘플 제조를 위한 통용되는 종래 방법은 몇가지 단계를 포함하는데, 이는 시간 소모적이며 비용 소모적이다. 아르고비오겐사의 자매 회사인 넥스트테크사(Nexttec)는 보통의 분리 공정의 완전한 반전인, 특허받은 새로운 컬럼 시스템(PCT/EPOO/00117)을 보유한다: DNA 결합 대신에, 모든 비요망되는 화합물을 세척하고 최종적으로 DNA를 용리하며, 원하는 DNA가 하나의 단일 단계를 통과하는 동안, 효소-억제 특성을 지니는 원치않은 성분을 크로마토그래피 용매에 결합시킨다.
DNA 분석 - 유일한 상업적 가축 혈통 유형 시스템(StockMarks, Applied Biosystems)은 미세위성 마커(microsatellite markers)에 기반한다. 자동적 유전자형 분석에 효율적인 디지탈 스코어에 의해 특징화되는 SNPs는 미세위성 유전자형 분석를 대체할 가능성이 있다. SNP 유전자형 분석 플랫폼이 존재한다. 유전체 내에는 사실상 수백만 SNPs가 존재하지만, 이는 단지 개체의 식별을 성립할 목적으로 여겨지는 양측-대립유전자(bi-allelic) 분포(즉, 적어도 90:10)를 지닌다. SNPs는 유전체 내의 풍부함, 멀티플렉싱(multiplexing)의 단순함 및 자동화 분석에 대한 적합성 및 유전자형 분석 비용의 감소 때문에, 매력적인 마커로 여겨져 왔다. 미세위성에 비해 적은 정보 내용에도 불구하고, 더 높은 수의 SNP 마커의 멀티플렉싱의 단순성은 ID 파워 및 부모 제외(parent exclusion)에 대해 시험하기 위한 충분한 통계적 검증력을 제공한다. 잠재력이 큰 SNP 마커는 성공적인 고-처리량 유전자형 분석 플랫폼을 위한 요구조건으로 이어진다. 이는 정확도, 속도 및 비용에 관하여 효율성을 극대화하기 위한 적절한 검출 시스템을 지닌 신뢰성있는 분석 화학과의 커플링에 의존한다. 몇가지 상업적 시스템은 DNA 질량 스펙트럼(Sequenom), 파이로시퀀싱(Pyrosequencing), TaqMan 기술(Applied Biosystems), 센트릭스 어레이 매트릭스 상에 배치되는 비드어레이 기술(BeadArray technology) 등을 포함하는 이러한 시장을 이끈다. 현재 기술 플랫폼은 >99%의 정확도로, 1일 당 50,000 유전자형을 초과하는 처리량을 전달할 수 있다. 이러한 성능은 가축 동물을 분석하는 SNP의 임무에는 충분하지 않은데, 이러한 테스트는 지나치게 버거우며 상당한 자원을 필요로 하기 때문이다.
데이타의 저장 및 전달 - 국립 동물 식별 체계는 몇몇 나라에 존재하며 농장으로부터 데이타를 주고 받는 네트워크 및 중앙 데이타베이스를 기반으로 한다. 예를 들어, 이스라엘의 소고기 산업은 매우 발달되고 중앙집중된 낙농 부문의 필수적인 부산물이다. 이스라엘 축산 양육자 협회는 월드 와이드 웹(World Wide Web)(http://www.icba-israel.com/)을 통해 접근가능한 컴퓨터 데이타베이스를 실행하고 있다. 이것은 가축 무리의 관리(herd management)를 위해 중요한 데이타의 실시간 보고를 가능케 한다. 독일에서는, 전체 EU 국가에서와 같이, 태어난 송아지 모두를 태어난지 첫 7일 이내에 두개의 귀-태그를 이용해 식별화하고 정부의 국제 데이타 뱅크에 등록시킨다. 모든 개별 가축에 대해 "패스포트(passport)"를 발행하고, 패스포트를 지닌 동물만 거래, 운송 및 도살이 가능하다. 모든 운송은 중앙 데이타 뱅크에 의해 공고되고 기록되어야 한다. 놀랍게도, 지금까지 동물 생산물의 이력추적 또는 동물의 식별을 모니터하고 통제하기 위한 실질적이고 독립적인 가능성이 존재하지 않는다. 이것은 단지 DNA 분석을 이용하여 가능할 것이다.
메디게노믹스(Medigenomix) www.medigenomics.de는 이력추적 서비스 및 DNA 핑거프린팅 분석을 공급하지만, 샘플은 공정을 위해 중앙국으로 보내져야 한다. 아이덴티겐(IdentiGEN) www.identigen.com은 전체 이력추적 서비스를 제공하고, 또한, 상기 시스템은 샘플이 중앙 시설로 보내질 것을 필요로 한다. 제네틱 솔루션(Genetic Solutions) www.geneticsolutions.com.au 또한 샘플 수집 및 가공의 집중화를 요구하는 특별한 시스템을 보유한다.
농업 및 식품 부문에서 육류 제품을 이들의 원산으로 역으로 추적하는 효율적이고 매우 융통적인 방법 및 수단에 대한 전반적인 필요성이 존재한다. 더욱이, 이러한 방법 및 수단은 개별 고객 및 상황에 적용가능해야 하며, 비전문가에 의해 사용하기 쉬워야 한다. 샘플을 거리가 먼 중앙 시설로 보낼 필요성이 없는 추적 시스템에 기초한 사용하기 쉽고, 정확한 DNA 유전자형 분석의 제공은 오래도록 느꼈던 필요를 충족시킬 것이다. 특히, 표준 장비를 갖춘 실험실에서 개별 가축의 머리를 유전자형 분석하는 이러한 방법은 오래도록 느꼈던 충족되지 못한 필요를 충족시킬 것이다. 흥미로운 부분에 근접하는 수단이 될 수 있는 이력추적 체계를 위한 정확하고 신뢰성 있는 DNA 유전자형 분석 제공 시스템이 오래도록 느꼈던 충족되지 못한 필요를 충족시킬 것이다. 비전문가에 의해 관심 부분에 근접하여 손쉽게 이용될 수 있는 결과를 분석하기 위한 데이타 마이닝 소프트웨어(data mining software) 및 필수 분자 생물학 제품을 포함하는, 이용하기 쉬운 패키지가, 오래도록 느꼈던 충족되지 못한 필요를 충족시킬 것이다. 물론, 더 나아가서 오래도록 느끼고 충족되지 못했던 필요는 상기를 실현하는데 필요한 전문화된 DNA 프라이머의 제공에 의해 달성될 것이다. SNP 마커에 기반한 고-처리량 정확한 유전자형 분석 플랫폼은 오래도록 느꼈던 충족되지 못한 필요를 충족시킬 것이다. 국립 DNA 기반 이력추적 체계는 식량 안정성을 증가시키고, 가축 절도를 막으며, 가축 위조를 감소시킬 것이다. 추가적으로, 전체 이력추적은 가축 무리의 관리를 향상시키고, 전염병의 경우, 빠른 식별 및 감염원의 제거를 통해 경제적 손실을 줄일 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 효율적인 DNA 이력추적 시스템, 장기 DNA 뱅킹 및 SNP 마커의 멀티플렉싱에 의한 유전자형 분석을 제공하는 것이다. 본 발명은 DNA 마커 기술이 동물 생산 및 마케팅 사슬에서 원산지 농장 또는 시스템까지 효과적이고 효율적으로 전체 이력추적을 제공하게 할 수 있는, 동물을 식별하는 방법 및 시스템을 개시한다. 이러한 시스템은 개별 동물, 사체, 육류의 개별 절단품, 및 동물의 정확한 출처의 식별을 위해 SNP를 필요로 한다. 생산 및 유통 사슬에 걸친 다양한 조절점에서의 샘플의 수집, 통계학적-기반 샘플링 및 DNA 검증 시스템은 본 발명의 효과적인 구현 및 증명을 위해 필요하다.
본 발명의 한 양태는 개별 가축의 머리의 유전자형 분석 방법을 개시하는 것이다. 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 개별 가축의 머리에서 DNA 샘플을 획득하는 단계;
b. 상기 언급한 DNA의 유전자형을 분석하는 단계로서, 유전자형 분석이 본원에서 정의된 PCR SNaPshot 프로토콜을 이용한다. 상기 프로토콜은 제 1 PCR 단계(PCR 1) 및 제 2 PCR 단계(PCR 2)를 포함하고, 상기 PCR 1 단계는 프라이머(SEQ ID No. 1-30) 및/또는 PCR 1 반응을 위해 공통의 10개 염기 모티프(ACGTTGGATG)를 5' 말단에 지닌 연장된 프라이머를 첨가하는 단계를 포함하며, 상기 PCR2 단계는 연장 프라이머(SEQ ID No. 31-45) 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 인접한 프라이머를 첨가하는 단계를 포함한다;
c. 주형 DNA 및 제 1 프라이머 세트를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 앰플리콘을 생성하여 PCR1 생산물을 산출하는 단계;
d. PCR1 생산물을 연장 프라이머 세트에 대한 주형으로 이용하여 PCR2 생산물을 산출하는 단계;
e. 상이한 길이의 말단(tail)을 PCR2 프라이머에 첨가하여 정확한 크기 및 색 분리가 가능하게 하는 단계;
f. PCR2 프라이머의 말단을 안정화시키는 단계;
g. PCR2 생산물을 모세관 서열분석기(capillary sequencer)에서 분리하는 단계;
h. 상기 결과를 데이타 뱅크에 기록하는 단계; 및
i. 데이타 마이닝 소프트웨어를 이용한 데이타 뱅크로부터 SNP 프로파일과 상기 결과를 비교하여 데이타 뱅크 매칭 프로파일을 획득하는 단계.
본 발명의 추가 양태는 상기 프라이머 선택 단계가 단일 튜브내에서 PCR 산물을 일제히 증폭할 수 있도록 수행되는(멀티플렉싱), 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 멀티플렉싱 단계가 IPLEX 소프트웨어(SEQUENOM, Latham et al. 2006)를 적용함으로써, SNP 마커를 선택하는 단계를 포함하는 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 PCR1 프라이머 선택 단계가 GenBank 서열-파일을 입력값(Werner et al. 2004)으로 이용하는 단계를 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 상기 PCR1 생산물을 PCR2 프라이머에 대한 주형으로 이용하는 단계 및 SNaPshot 분석에서 4개의 형광 뉴클레오티드-유사체를 이용하여 상기 PCR2 프라이머를 연장하는 단계를 추가적으로 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 시토신 뉴클레오티드에 의해 단절된 아데닌계(adenine tracts)의 프라이머 말단을 PCR2 프라이머의 5' 말단에 도입함으로써 다양하게 연장된 PCR2 생산물이 형성되도록, 길이를 개질하는 단계를 추가적으로 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 PCR2를 안정화하는 단계가 시토신 뉴클레오티드를 상기 폴리-AC 말단에 첨가하는 단계를 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 도살장, 냉동 설비, 육류 포장 공장, 육류 가공 공장, 육류 배송 공장, 가축류 운송기, 농민 단체, 시장, 도매상, 배급업자(distributor), 검역 시설 스톡 야드, 농장, 대목장, 종마 농장 또는 목장을 포함하는 군에서 선택된 개별 시설로 상기 가축의 머리를 역으로 추적하는 단계를 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 슈퍼마켓, 정육점, 레스토랑 또는 시장에서 특정하게 절단된 육류까지 상기 개별 가축의 머리를 추적하는 단계를 포함하는, 상기 방법을 개시한다.
식당의 접시 위의 개별 스테이크를 원래의 개별 가축의 머리로 추적하는 수단 및 방법을 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 개별 휴식 테이블 절단 육류를 상기 개별 가축에 매치(match)시키는데 이용되는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 소매의 절단 육류를 개별 가축에 매치시키는데 이용되는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 방법이 가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서의 절단 육류의 단편을 매치시키는데 이용되는, 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 본원에 정의된 전체 이력추적 체계에서 이용되는 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 본원에 정의된 부분적 이력추적 체계에서 이용되는 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 본원에 정의된 간결한 이력추적 체계에서 이용되는 상기 방법을 개시한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 가축 DNA 내 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 SEQ ID GenBank(Werner et al., 2004)를 포함하는 군에서 선택된 DNA 프라이머 세트를 제공하는데, 상기 프라이머는 일제히 증폭되도록 개조되고, 이에 따라 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브내에서 멀티플 PCR1 생산물이 제공되고, 상기 혼합물은 또한 가축 주형 DNA를 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 SEQ ID No. 31-45으로 이루어진 군에서 선택된 5' 연장된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트를 제공하는데, 상기 PCR2 프라이머는 PCR1 생산물 주형에 대한 안티센스이며, 4개의 형광 뉴클레오티드 유사체를 이용해 연장되어 SNaPshot 분석 중에 PCR2 생산물을 형성한다.
본 발명의 추가 양태는 상기 정의된 바와 같은 5' 연장된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트를 제공하는데, 상기 PCR2 생산물은 모세관 서열분석기에서 분리가능하여 분리 데이타를 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 개별 가축의 머리의 유전자형 분석을 위한 패키지를 제공하는 것으로, 상기 패키지는 하기를 포함한다:
a. 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한, 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30 세트로서, 상기 제 1 프라이머 세트는 가축 주형 DNA를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브 내에서 최대 25 PCR 생산물의 증폭을 일제히 가능케하고,
b. SEQ ID No. 31-45로 이루어진 군에서 선택된 예혼합된 5' 연장된 안정화된 말단 프라이머 세트를 추가로 포함하는데, 상기 말단 프라이머는 PCR1 생산물과 함께 어닐링(annealing)한 뒤 PCRII 생산물을 산출하도록 개조되고, 상기 PCRII 생산물은 상기 모세관 서열분석기에서 분리가능하여 개별 가축에 대한 SNP 프로파일을 산출하고, 관련 데이타 마이닝 소프트웨어는 상기 프로파일을 매치시킬 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 상기 데이타 뱅크 매칭 프로파일로부터 미리 결정된 SNP 프로파일을 지닌 데이타, 소프트웨어에 의하여, 기록, 저장, 처리 및 매치시키기 위한 수단을 지닌 패키지를 제공한다.
마지막으로, 본 발명의 일양태는 상기 패키지가, 양친의 유전자형이 이용가능할 때 부정확한 부모의 약 99.9% 경우의 검출 및 모든 품종에서 부모 제외 확률을 가능케하면서, 리무진의 경우 약 1.11 x 10-8에서 홀스타인(Holstein)의 경우 약 2.3 x 10-10까지의 범위의 ID 파워 및/또는 품종에 걸쳐 약 900,822에서 약 43,671,580까지의 범위의 Mmax에서 데이타뱅크 프로파일과 SNP 프로파일의 매칭을 제공하는, 상기 패키지를 제공한다.
본 발명을 이해하기 위해 및 본 발명이 어떻게 실제 적용되는지 보이기 위해, 이제부터 다수의 구체예가 단지 비-제한적인 실시예에 의해 도면과 함께 참조하면서 기술되도록 개조하였는바,
도 1은 SNaPshot을 이용한 22-plex의 SNP-기반 이력추적-유전자형 분석의 개략도이다.
도 2는 부모 제외의 그래픽 표현이다.
도 3은 4개의 대표적인 가축 품종에서의 높은 정보 내용의 그래픽 표현이다.
도 4는 본 발명에 기초한 상이한 이력추적 체계의 개략도이다.
도 5는 SNaPshot을 이용한 22-plex의 SNP 유전자형의 분리를 묘사한 전형적인 크로마토그램이다.
도 6은 컴퓨터 스크린 그래픽 디스플레이의 개략도이다.
도 7은 본 발명에서 이용된 SNP 프라이머 서열의 리스트를 나타낸 표이다.
도 1은 SNaPshot을 이용한 22-plex의 SNP-기반 이력추적-유전자형 분석의 개략도이다.
도 2는 부모 제외의 그래픽 표현이다.
도 3은 4개의 대표적인 가축 품종에서의 높은 정보 내용의 그래픽 표현이다.
도 4는 본 발명에 기초한 상이한 이력추적 체계의 개략도이다.
도 5는 SNaPshot을 이용한 22-plex의 SNP 유전자형의 분리를 묘사한 전형적인 크로마토그램이다.
도 6은 컴퓨터 스크린 그래픽 디스플레이의 개략도이다.
도 7은 본 발명에서 이용된 SNP 프라이머 서열의 리스트를 나타낸 표이다.
지금부터 개별 가축의 머리의 유전자형 분석 방법에 대한 참고가 이뤄진다. 상기 언급한 방법은 개별 가축의 머리에서 DNA 샘플을 획득하는 단계 및 DNA를 유전자형 분석하는 단계를 포함한다. 상기 유전자형 분석은 본원에서 정의된 PCR SNaPshot 프로토콜을 이용한다. 상기 프로토콜은 제 1 PCR 단계(PCR1) 및 제 2 PCR 단계(PCR2)를 포함한다. 상기 언급한 프로토콜은 제 1 PCR 단계를 추가로 포함하는데, 상기 PCR 1 단계는 프라이머(SEQ ID No. 1-30) 및/또는 PCR 1 반응을 위해 공통의 10개 염기 모티프(ACGTTGGATG)를 이용하여 5' 말단이 연장된 프라이머를 첨가하는 단계를 포함하며, 추가로, 상기 PCR2 단계는 연장 프라이머(SEQ ID No. 31-45) 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 인접한 프라이머를 첨가하는 단계,
a) 주형 DNA 및 상기 제 1 프라이머 세트를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 엠플리콘을 생성하여 PCR1 생산물을 생성하는 단계;
b) PCR1 생산물을 연장 프라이머 세트에 대한 주형으로서 이용하여 PCR2 생산물을 생성하는 단계;
c) 상이한 길이의 말단을 PCR2 프라이머에 첨가하여 정확한 크기 및 색 분리가 가능하게 하는 단계;
d) PCR2 프라이머의 말단을 안정화시키는 단계;
e) PCR2 생산물을 모세관 서열분석기에서 분리하는 단계;
f) 상기 결과를 데이타 뱅크에 기록하는 단계; 및
g) 데이타 마이닝 소프트웨어를 이용하여 데이타 뱅크로부터 SNP 프로파일과 상기 결과를 비교하여 매칭 프로파일을 획득하는 단계를 포함한다.
상기 정의된 방법을 참고하여, 상기 프라이머를 선택하는 단계는 단일 튜브에서 PCR 생산물의 증폭이 일제히 일어나도록 수행된다(멀티플렉싱).
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 멀티플렉싱 단계는 IPLEX 소프트웨어를 적용하여 SNP 마커를 선택하는 것을 포함한다(SEQUENOM, Latham et al. 2006).
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 PCR1 프라이머를 선택하는 단계는 GenBank 서열-파일을 입력값으로 이용하는 것을 포함한다(Werner et al. 2004).
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 방법은 PCR1 생산물을 PCR2 프라이머에 대한 주형으로 이용하는 것 및 SNaPshot 분석에서 PCR2 프라이머를 4개의 형광 뉴클레오티드-유사체를 이용하여 연장시키는 것을 추가적으로 포함한다.
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 방법은 시토신 뉴클레오티드에 의해 단절된 아데닌계의 프라이머 말단을 PCR2 프라이머의 5' 말단에 도입함으로써 다양하게 연장된 PCR2 생산물이 형성되도록, 길이를 개질시키는 것을 추가적으로 포함한다.
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 PCR2를 안정화하는 단계는 시토신 뉴클레오티드를 상기 폴리-AC 말단에 첨가하는 단계를 포함한다.
상기 언급된 방법을 참고하여, 상기 방법은 도살장, 냉동 설비, 육류 포장 공장, 육류 가공 공장, 육류 배송 공장, 가축류 운송기, 농부 조직, 시장, 도매, 유통, 검역 시설 스톡 야드, 농장, 대목장, 종마 농장 또는 목장으로 이루어진 군에서 선택된 개별 시설까지 상기 가축의 머리를 역으로 추적하는 단계를 포함한다. 상기 방법이 슈퍼마켓, 정육점, 레스토랑 또는 시장에서 특정하게 절단된 육류까지 상기 개별 가축의 머리를 추적하는 단계를 포함하는 것은 본 발명의 범위 내이다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 개별 휴식 테이블 절단 육류(individual breaking table meat cuts)를 상기 개별 가축에 매치시키는데 이용된다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 소매의 절단 육류를 개별 가축에 매치시키는데 이용된다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서의 절단 육류의 단편을 매치시키는데 이용된다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 본원에 정의된 전체 이력추적 체계에서 이용된다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 본원에 정의된 부분적 이력추적 체계에서 이용된다.
상기 방법의 개시를 참고하여, 상기 방법은 본원에 정의된 간결한 이력추적 체계에서 이용된다.
본 발명의 구체예를 참고하여, 상기 가축 DNA 내 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 SEQ ID GenBank (Werner et al., 2004)를 포함하는 군에서 선택된 DNA 프라이머 세트를 제공하는데, 상기 프라이머는 일제히 증폭되도록 개조되고, 이에 따라 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브내에서 멀티플 PCR1 생산물이 제공되고, 상기 혼합물은 또한 가축 주형 DNA를 포함한다.
본 발명의 구체예를 참고하여, SEQ ID No. 31-45으로 이루어진 군에서 선택된 5' 연장된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트를 제공하는데, 추가로 상기 PCR2 프라이머는 PCR1 생산물 주형에 대한 안티센스이며, 4개의 형광 뉴클레오티드 유사체를 이용해 추가로 연장되어 SNaPshot 분석 중에 PCR2 생산물을 형성한다.
본 발명의 구체예를 참고하여, 상기 정의된 바와 같이 연장된 안정화된 말단 PCR2 프라이머의 세트를 제공하는데, 이 PCR2 생산물은 모세관 서열분석기에서 충분히 분리가능하여 유전자형 분석 데이타를 제공한다.
개별 가축의 머리의 유전자형 분석을 위한 패키지가 참조된다. 상기 패키지는 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한, 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30 세트를 포함하는데, 상기 제 1 프라이머 세트는 가축 주형 DNA를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브 내에서 최대 25 PCR 생산물의 증폭을 일제히 가능케하고, SEQ ID No. 31-45로 이루어진 군에서 선택된 예혼합된 5' 연장된 말단 프라이머 세트를 포함한다. 상기 말단 프라이머는 PCR1 생산물과 함께 풀린 뒤 PCRII 생산물을 산출하도록 개조되고, 상기 PCRII 생산물은 상기 모세관 서열분석기에서 분리가능하여 개별 가축에 대한 SNP 프로파일을 산출한다. 상기 패키지는 상기 프로파일을 매치시킬 수 있는 관련 데이타 마이닝 소프트웨어를 추가적으로 포함한다.
더욱이, 상기 언급된 패키지를 참조하여, 상기 패키지는 상기 데이타 뱅크로부터 미리 결정된 SNP 프로파일을 지닌 데이타, 소프트웨어를 이용하여, 기록, 저장, 처리 및 매치시키기 위한 수단과 함께 제공된다.
마지막으로, 본 발명의 구체예를 참조하여, 상기 패키지는 리무진의 경우 약 1.11 x 10-8에서 홀스타인(Holstein)의 경우 약 2.3 x 10-10까지의 범위의 ID 파워 및/또는 품종에 걸쳐 약 900,822에서 약 43,671,580까지의 범위의 Mmax에서의 데이타뱅크 프로파일을 SNP 프로파일과 매치시키는 것을 제공한다. 더욱이 상기 언급한 구체예는 양친의 유전자형이 이용가능할 때, 부정확한 부모의 약 99.9% 경우의 검출 및 모든 품종에서 부모 제외 확률을 가능케한다.
본 발명을 이해하기 위해 및 본 발명이 어떻게 실제 적용될 수 있는지 보이기 위해, 지금부터 이러한 이력추적 시스템의 다수의 바람직한 구체예가 단지 비-제한적인 실시예에 의해 하기 실시예를 참조하면서 기술될 것이다:
실시예
1
SNaPshot
및
IPLEX
방법 및
SNPs
마커의
정보 내용과의 비교
25-plex 분석은 단일 반응 내에서 몇가지 SNP 마커의 멀티플렉싱을 가능케 하는 프라이머 연장 방법인, SNaPshot에 기초한다. 이 분석은 이전 방법보다 효율성을 증가시킬 수 있다. 하기 대표적 개시에서, 육류 및 젖소 품종에서의 이력추적에 대한 22-plex 분석의 효율성은 MALDI-TOF 질량 분석법을 이용한 IPLEX 유전자형 분석과 비교된다. 하기 실시예에서, 22 SNP 마커는 다수의 품종에 있어서 강력한 분별력을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 상기 시스템이 이력추적에 적용가능하게 만든다.
방법 및 결론:
동물의 귀 내로의 태그 고정을 통해, 8개의 상업적 가축 품종으로부터의 조직 샘플을 TypiFix™ 귀-태그(Agrobiogen, Germany)로부터 수집하였다. 자동 밀봉식이며 접촉 후 조직을 말리고 DNA를 보존시키는 건조제를 포함하는 바코드화된 챔버에 상기 조직을 포함시켰다. 넥스트테크(Nexttec, Germany)에 의해 개발된 1-단계 컬럼 시스템을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다. 제노믹 DNA 농도를 측정하고 단일 반응을 위해 7.5 ng를 사용하였다.
제 1 단계에서, 단일 반응에서 멀티플렉싱할 수 있는 SNPs의 최대 개수를 획득하기 위해, [Werner et al. 2004]에 의해 공지된 38개의 마커 세트로부터 서열 데이타를 선택하고, IPLEX 방법에 의해 MALDI-TOF 질량분석법에 대해 MassARRAY TYPER 4.0 유전자형 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이 소프트웨어는 15개의 SNPs를 배제하고 38개의 마커 중에서 23개를 선택하였다. 이렇게 거부된 SNPs 중에서 9개는 IPLEX에 대한 질량 제한 때문에 거부되었고, 나머지는 SNaPshot 방법과 관련이 있다. 10개 각각은 IPLEX에서 23-멀티플렉스를 이용하여 유전자형 분석되었고, 1개의 SNP 마커는 배제되었는데 이는 다형성이 검출되지 않았기 때문이다.
IPLEX에서 획득된 결과와 SNaPshot 22-멀티플렉스 사이의 비교에 의해 상이한 가축 품종으로부터 72 마리 각각에서, 유전자형 분석 절차의 정확성을 시험하였다. 자동화 분석을 통해, 상기 비교는 1584 단일-SNP 유전자형(2.46%)에 걸쳐 39 불일치 또는 소 한마리당 0.54 불일치를 나타내었다. SNP 프라이머(Werner et al., 2004)에 대한 프라이머 상류를 이용하여, DNA 단편을 16개의 불일치 경우로부터 시퀀싱하였다. 결과는 모든 경우에서, 상기 서열이 명백하게 결정되었고 SNaPshot 결과와 매치되었음을 나타내었다.
제 2 단계에서, SNaPshot 절차를 22 마커 중 각각의 하나에 개별적으로 적용하였고, 모든 생성물을 ABI 서열분석기 310를 이용해 실행(run)시켰다. LIZ-120 크기-표준(ABI)을 이용하여 대립유전자의 크기를 결정하였다. 동일한 생성물의 반복적인 실행은, 이들의 크기가 신규한 모세관과 사용된 모세관 사이에서 최대 0.5 bp까지 다양하다는 사실을 나타냈다. 따라서, 본 발명자는 GeneMapper 소프트웨어(ABI)에서 예상된 대립유전자 크기 각각의 주변을 1.0 bp 빈(bins)으로 제한하였다. 상기 빈을 GeneMapper 디폴트에 따라 색칠하였다(도 1A). SNPs의 이중성(binary nature) 때문에, 두개의 빈이 각각의 마커에 대해 지정되었다.
SnaPshot을 위한 제 2 PCR 프라이머 17개를 이들의 5'에 폴리-A 말단을 첨가하여 연장시켰다. 이러한 설계는 동일한 색상을 지닌 두개의 빈 사이에 적어도 1.0 bp의 간격을 유지시켜 전체 크로마토그램의 길이를 최소화하면서 가능한 실수를 막을 수 있다(도 1A). 가능한 인위구조(artefact)를 최소화하기 위해 연장 반응을 위한 모든 프라이머를 PAGE-정제하였다. 본 발명자는 A-말단만이 상이한 두개의 22-멀티플렉스를 획득하였다. 이러한 두개의 멀티플렉스를 이용하여 두개의 상이한 방법을 비교하였다: IPLEX 및 SNaPshot. 제 3 단계에서, 본 발명자는 이전에 IPLEX 소프트웨어에 의해 거부되었던 9개의 SNP 마커 중 22-SNaPshot 패널 세개를 첨가하였다. 본 발명자는 소고기와 가축 집단 사이의 대립유전자 빈도를 비교하였고, 상기 둘에 대해서 상기 마커가 정보적이라는 결론을 내렸다(도 1B). 22 SNP-멀티플렉스의 병렬적 비교는 SnaPshot 방법이 IPLEX 방법에 대한 좋은 대안책이며(도 1C), IPLEX에서 사용된 금속칩은 필수적이지 않다는 사실을 명백하게 나타냈다.
도 1은 SNaPshot을 이용한 22-plex의 유전자형 분석-SNP 기반 이력추적을 나타낸다. 귀태그 샘플(TypiFix ™)로부터의, 114 마리의 젖소 및 육우(각각 47 마리 및 67 마리)로부터 추출한 DNA를 38마리의 젖소 SNPs의 패널(Werner et al., 2004)에서 선택된 22개의 프라이머 쌍을 이용하여 동시적 제 1 PCR 증폭에 대한 주형으로 이용하였다.
A. GeneMapper 소프트웨어를 이용한 5 마리의 상이한 개체의 대립유전자 분리 및 SNaPshot 유전자형 분석의 예. 상기 크로마토그램은 하기 색상 코드를 이용한 대립유전자 피크 및 빈을 나타낸다: 아데닌, 그린; 시토신, 블랙(빈에 대해서는 옐로우); 티민, 레드; 및 구아닌, 블루. SNaPshot 분석은 주형으로서 제 1 PCR 생산물, 형광 뉴클레오티드-유사체 및 폴리-A 말단을 지닌 연장 프라이머를 이용한 제 2 PCR 증폭에 기반하였다. 이러한 제 2 PCR 생산물을 ABI 모세관-서열분석기를 이용하여 분리하였다.
B. 두개의 테스트된 집단(젖소 중 한 집단과 육우 중 한 집단) 사이의 대립유전자 빈도의 비교. 개별 마커에 대해, 상기 두 대립유전자의 빈도(%)는 옐로우 및 레드로 나타내었다. 도시된 예에서, SNP26에 대해 옐로우로 표시된 대립유전자는 육우에서보다 젖소에서 더 높은 빈도를 보였다.
C. 유전자형 분석의 검증은 IPLEX 방법을 이용한 22 SNPs에 대해 수행되었다. 이 분석은 주형으로서 제 1 PCR 생산물, 질량(mass) 뉴클레오티드-유사체 및 연장 프라이머를 이용한 제 2 PCR 증폭에 기반하였다. 이러한 제 2 PCR 생성물을 MALDI-TOF 및 Sequenom 질량 분석기를 이용하여 분리하였다. A와 C의 비교는 SNaPshot 결과의 그래픽 표현이 IPLEX 보다 훨썬 더 해석하기 쉬움을 나타낸다.
실시예
2
(i)
이력추적
및 (
ii
) 부모 제외에 대한 본 발명의 통계적
검증력
유전적 마커의 대립유전자 빈도는 집단 사이에 매우 다양할 수 있으므로, 유전적 식별력(이력추적)에 영향을 미친다(Vignal et al. 2002).
식별 통제(identity control) 및 부모 테스트를 위한 25-plex 분석의 통계적 검증력을 평가하기 위해, 본 발명자는 6개의 상업적 가축 품종에서 대립유전자 빈도를 측정하였다. 고 처리량 유전자형 분석 체계는 25개의 프라이머 쌍과 함께 동시적 제 1 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된 후 SNaPshot 분석이 뒤따르는, 귀-태그 샘플에서 추출한 DNA를 기반으로 하였다. 표 1에서 나타나듯이 20 내지 107 개체의 다양한 품종의 샘플 크기를 이용하여 총 274 개체를 유전자형 분석하였다. 몇가지 예외를 제외하고, 상기 동물들 사이에 가족관계는 기록되지 않았다.
SNPs는 6개 가축 품종 전체에서 다형성이었으며, 대립유전자 분포는 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 벗어나지 않았다. 분석된 모든 품종 사이에서뿐만 아니라, 이전에 홀스타인(Werner et al. 2004)에 대해 기록되었던 대립유전자-빈도의 분포에 대해서, 매우 긍정적인 피어슨 상관계수가 획득되었다. 표 1에서 나타난 대립 유전자 빈도에 기반하여, 본 발명자는 각 집단에 대해 두개의 무작위 개체가 모든 마커에 대해 우연히 동일한 유전자형을 가질 수 있는 이론적 확률(ID 파워) 및 분석(resolve)될 수 있는 최대 개체 수(Mmax)를 계산하였다. 상기 두개의 파라미터는 표 1에 제시되어 있다. ID 파워는 1.11 × 10-8(리무진)에서 2.3 × 10-10(홀스타인) 범위이며, Mmax는 0.01의 유의 수준에서 품종에 걸쳐 900,822 내지 43,671,580 범위였다. 25마리 동물의 복제된 샘플에서 수행된 이력추적 분석은 모든 625개의 유전자형 분석된 SNPs에 대한 유전자형과 완벽한 일치를 보였다. 이러한 결과는 0.998을 초과하는 높은 유전자형 분석 정밀도를 나타낸다. 부가가치로서, 25-plex 분석에 기초한 상기 이력추적 시스템은 부모 기록을 더 잘 관리함으로써, 가축 무리의 관리에 도움을 줄 수 있다. 의심되는 양친을 유전자형 분석(양친 제외(Two-parent exclusion), 표 1)하는 경우를 참조하여 부모 제외 확률을 계산하였다. 모든 품종에서, 25-plex 분석은 양친의 유전자형이 이용가능함을 전제로, 부정확한 부모의 거의 모든(99.9% 이상) 경우를 탐지하기 위한 통계적 검증력을 가졌다.
표 1 6개의 가축 품종에서의 SNP-대립유전자 빈도, 식별 통제 및 부모 제외 확률.
1SNP 개수는 [Werner et al. 2004]를 따름.
2품종 명칭은 다음과 같이 축약함: HoL- 홀스타인; Sim.- 심멘탈; Lim.- 리무진; Char.- 샤롤레; Ang.- 앵거스(Angus); Tux.- 턱스(Tux) 가축.
3제외 확률은 양친이 잘못 기록된 확률임(방정식 3 a, Jamieson & Taylor 1997).
4확률은 두 개체가 우연히 동일한 유전자형을 가질 확률임(방정식 1, Weller et al. 2006).
5Mmax는 분석될 수 있는 최대 개체 수임(방정식 3, Weller et al. 2006).
실시예
3
부모 제외의 그래픽 표현.
부모 제외의 그래픽 표현이 도 2에 제시되어 있다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 25-plex에 대한 유전적 프로파일을 획득하였다. 트리오 패밀리(trio family)로 등록된 개체의 크로마토그램 관련 분석이 제시되어 있다. 네모칸은 이러한 샘플에 대해 부모를 제외한 SNPs를 나타낸다. 송아지의 부모의 부계 제외(paternity exclusion)가 도 2에 묘사되어 있다. 왼쪽의 검은 테를 두른 네모칸은 마커가 양친을 제외하고 있음을 나타낸다. 송아지(도 2C)는 블루 대립유전자를 나타내는 반면, 상기 양친(도 2A, 2B)은 블루 대립유전자를 결여하고, 그린 대립유전자에 대한 동형접합자(homozygotic)이다.
중앙의 네모칸은 수소(sire)의 제외를 나타내는 반면, 오른편의 네모칸은 암소(dam)의 제외를 나타낸다. 요약하여, 본 발명의 이러한 실시예는 2 SNP 마커에 의한 양친의 제외를 나타낸다. 따라서, 부모를 제외하기 위한 상기 방법의 효력이 예증된다.
실시예
4
임의의 가축 품종에 적용될 때의 본 발명의 다기능성(
versatility
)
18개의 품종으로부터의 수백 개체의 유전자형 분석은 유전적 분석에 있어서 25 SNP 마커의 유용성을 증명한다. 대립유전자 빈도는 마커 세트를 이용하여 광범위한 품종에서 개체 사이를 구별하는 능력이 본 발명의 보편성과 효율성을 설명함을 나타낸다. 놀랍게도, 일부 가축 품종이 작은 샘플 크기(예를 들어, 20 개체를 지닌 스프린젠)를 가짐에도 불구하고, 25 마커 전부는 다형성이었으며, 이는 발명된 세트 내의 마커가 정보적이라는 사실을 증명한다.
지금부터 도 3(4개의 대표적 가축 품종에서의 높은 정보 내용의 그래픽 표현)에 대한 참조가 이뤄진다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 25-plex의 유전적 프로파일을 획득하였다. 각 마커의 경우, 두 대립유전자의 빈도(%)는 옐로우 및 레드로 표시된다. 다음과 같은 수의 대표적 동물 및 가축 품종 유형이 유전자형 분석되었다: 샤롤레 품종에서 32마리(A), 스프린젠 품종에서 20마리(B), 리무진 품종에서 41마리(C) 및 심멘탈 품종에서 52마리(D).
실시예
5
본 발명에 기초한 상이한
이력추적
체계
지금부터 도 4에 대한 참조가 이뤄진다. DNA 이력추적 체계(도 4), 특히 육우 및 기타 육류에서 이용되기 위한 DNA 이력추적 체계를 제공하고 개시하는 것은 본 발명 범위 이내이다. 본 발명은 이러한 수단 및 방법을 제공한다:
이하에서 용어 "DNA 이력추적 체계"는:
1. 전체 DNA 이력추적(FDT)
2. 부분적 DNA 이력추적(PDT)
3. 간결한 DNA 이력추적(CDT)
을 지칭한다.
전체 DNA 이력추적(FDT)의 예:
농장에서 새롭게 태어난 모든 가축은 도 4C에 묘사하였듯이 귀-태깅되며, 이들의 DNA는 도 4D에서 제시된 바와 같이 추출된다. 모든 동물은 상기 정의된 바와 같은 SNaPshot 방법을 수단, SNP 마커, 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30의 세트 또는 군에서 선택된 DNA 프라이머, (SEQ ID No. 31-45) 군에서 선택된 안정화된 DNA 연장 프라이머 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 근접한 프라이머 및 동물의 유전적 프로파일을 달성하기 위한 데이타 마이닝 소프트웨어와 결합하여 이용함으로써, 유전적으로 프로파일링된다(도 4E에 도시됨).
가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서, 유전적으로 프로파일링된 절단 육류, 소매 절단 육류, 휴식 테이블 절단 육류, 및 개별 동물을 본래의 농장으로 역으로 추적하여, 농장의 가축 프로파일과 매치된다. FDT는 개체 당 적어도 두개의 샘플(예를 들어, 가축 자체로부터 유래된 것 및 가축 생산물에서 유래된 것)로부터 유래될 수 있거나, 더 예를 들어, 생산의 모든 단계 및 유통 체인으로부터 유래될 수 있다.
부분적 DNA 이력추적 체계(PDT)의 예:
도 4A에 도시된 바와 같이, 새롭게 태어난 모든 가축은 귀-태깅된다. 조직 및 데이타 뱅크가 도 4B에 제시된 바와 같이 성립되며, 요구에 따라서 DNA가 추출된다. 식별이 추적될 것을 필요로 하는 동물은 상기 정의된 바와 같은 SNaPshot 방법을 수단, SNP 마커, 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30의 세트 또는 군에서 선택된 DNA 프라이머, (SEQ ID No. 31-45) 군에서 선택된 안정화된 DNA 연장 프라이머 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 근접한 프라이머 및 유전적 프로파일을 매치시키기 위한 데이타 마이닝 소프트웨어와 결합하여 이용함으로써, 유전적으로 프로파일링된다. 가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서, 유전적으로 프로파일링된 절단 육류의 단편, 소매 절단 육류, 휴식 테이블 절단 육류, 및 개별 동물을 본래의 추정 동물의 유전적 프로파일로 역으로 추적 및 매치시키고, 요구되는 분석 수준에 따라, 본래의 동물 또는 농장으로 이력추적을 달성한다.
간결한 DNA 이력추적 체계(CDT):
이러한 체계의 예는 도살장 및 소매점 사이에서의 관리 절차 및 질적 통제의 검증 및 증명 확인하에 있다. 하루에 도살되는 모든 동물은 추출된 DNA를 갖는다. 동물은 상기 정의된 바와 같은 SNaPshot 방법을 수단, SNP 마커, 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30의 세트 또는 군에서 선택된 DNA 프라이머, (SEQ ID No. 31-45) 군에서 선택된 안정화된 DNA 연장 프라이머 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 근접한 프라이머 및 유전적 프로파일을 매치시키기 위한 데이타 마이닝 소프트웨어와 결합하여 이용함으로써, 유전적으로 프로파일링된다. 소매점에서 기원한 모든 생산물로부터의 DNA가 유전적으로 프로파일링된다. 가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서, 유전적으로 프로파일링된 절단 육류의 단편, 소매 절단 육류, 휴식 테이블 절단 육류, 및 개별 동물을 요구되는 분석 수준에 따라, 본래의 동물 또는 도살장으로 역으로 추적하고 매치시킨다. 따라서 최종 소매 생산품의 전체 이력추적이 달성된다. 동물 몸통(carcass)과 생산품 사이에 불일치가 존재한다면, 이것은 가능한 착오 또는 위조(fraud)를 정확히 나타낸다.
실시예
6
SNaPshot
을 이용한 25-
plex
의
SNP
유전자형의 분리를 도시한 대표적
크로마토그램
25 SNP 마커 멀티플렉스를 이용한 SNaPshot에 대한 프로토콜:
이러한 방법 적용을 위한 단계:
1. 제 1 PCR
2. Exo-SAP 처리(쉬림프 알칼리성 포스파타아제, Shrimp Alkaline Phosphatase)
3. 제 2 PCR
4. SAP 처리
5. ABI 310에서 실행하기 위한 샘플 제조
6. 실행 조건
각 단계의 상세설명:
1. 제 1
PCR
제 1 PCR을 위한 혼합물 제조:
제 1 PCR을 위한 프로그램:
2.
ExsoSAP
처리
ExsoSAP 처리를 위한 혼합물 제조:
엑소뉴클레아제 I과 SAP 완충용액의 새로운 혼합물을 (24:1)로 제조하자마자, 1st 혼합물과 SAP 효소 사이에 1:1로 혼합함.
ExsoSAP 처리를 위한 프로그램:
3. 제 2
PCR
제 2 PCR을 위한 혼합물 제조:
제 2 PCR을 위한 프로그램:
4.
SAP
처리
SAP 처리를 위한 혼합물 제조:
ExoSAP 처리를 위한 프로그램:
5,
ABI310
에서 실행하기 위한 샘플 제조:
6. 실행 조건:
지금부터 SNaP shot을 이용한 25-plex의 SNP 유전자형의 분리를 묘사한 전형적인 크로마토그램을 도시하는 도 5에 대한 참조가 이뤄진다.
귀태그 샘플(TypiFix™)에서 DNA를 추출하고, 38 젖소 SNPs (Werner et al., 2004)의 패널에서 선택된 25개 프라이머 쌍을 이용하여 동시적 제 1 PCR 증폭에 대한 주형으로 이용하였다. SNaPshot 분석은 주형으로서 제 1 PCR 생성물, 형광 뉴클레오티드 유사체 및 폴리-A 말단을 지닌 연장 프라이머를 이용한 제 2 PCR 증폭에 기초하였다. 10 μM의 각 dNTP, 2mM의 MgCl2, 다양한 농도(0.5-2 pmole/μl)의 특정 PCR 프라이머 및 0.5 U의 HotStartTaq DNA 폴리머라제(Qiagen, Inc, Valencia, Calif)를 지닌 10 μl의 총 부피에서, 7.5 ng의 제노믹 DNA로부터 PCR 단편을 증폭시켰다. 사이클 프로파일은: 94℃에서 15분 동안 최초 변성(denaturation) 후, 94℃에서 30초 동안 변성; 56℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링; 및 72℃에서 1분 동안 신장 과정이 55회 반복된다. 최종 연장은 72℃에서 3분 동안이었다. 남은 단일-가닥 프라이머 및 dNTPs를 제거하기 위해, 1.5 μl의 PCR 생성물을 4 U의 엑소뉴클레아제 I(USB, Cleveland, OH) 및 0.8 U의 쉬림프 알칼리성 포스파타아제(USB)로 처리한 뒤 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 75℃에서 15분 동안 효소 비활성화시킨 후, SNaPshot™ 키트(Applied Biosystems)를 제조업자의 지시에 따라 이용하여 단일-염기 연장 방법에 의해 SNP 스코어링을 수행하였다. 1.5 μl의 정제된 PCR 생성물, 2 μl의 SNaPshot™ 준비 반응 예혼합물 및 2 μl의 연장 프라이머 혼합물을 함유하는, 최종 부피 5.5 μl에서 연장 반응을 수행하였다. 상기 반응 혼합물에 94℃에서 10초, 51℃에서 20초 및 60℃에서 30초를 30회 반복하여 적용시켰다. 결합하지 않은 형광 ddNTPs를 제거하기 위해, 상기 반응에 0.5 U의 쉬림프 알칼리성 포스파타아제(USB)로 37℃에서 60분 동안 처리한 뒤 75℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. ABI 3100 유전적 분석기(Applied Biosystems) 및 GeneMapper 소프트웨어 V4.0(Applied Biosystems)을 이용한 모세관 전기영동에 의해 샘플을 분석하였다. 개체의 대립유전자 분리 및 유전자형 분석을 설명한 GeneMapper 플롯의 출력 결과가 제시되어 있다. 크로마토그램은 하기 색상 코드를 이용한 대립유전자 피크 및 빈을 나타낸다: 아데닌, 그린; 시토신, 블랙(빈에 대해서는 옐로우); 티민, 레드; 및 구아닌, 블루. 오렌지 피크는 DNA 크기 표준(GS120LIZ)의 단편을 나타낸다. 상기 크로마토그램 위에 스케일 상의 숫자는 염기 내의 크기를 나타낸다. 왼편 숫자는 형광 강도를 나타낸다. 네모칸은 각 마커 도메인 및 대립유전자를 표시한다(크로마토그램의 상단 및 하단 각각).
실시예
7
"스스로 하는(
Do
It
Yourself
,
DIY
)" 시스템 및 유전자형 마이닝
본 발명은 현재 조직 샘플 및 기록된 유전자형에 대한 중앙집중형 뱅크를 확립하는 것을 가능케 하고 가치있게 만든다. 수집된 샘플 모두는 쉽게 유전자형 분석되고 개체 프로파일("패스포트")은, 본 발명의 구체예에 따라, 거래, 운송 및 식품 생산을 통해 개별 가축과 동반할 수 있다. 유전자형 뱅크는 축산업자 및 당국이 가축 및 육류 생산품에 대한 소유권을 증명하는 것을 가능케 할 것이며, 또한 전염병 발생을 효과적으로 예방하도록 할 수 있을 것이다. 중앙집중형 유전자형 데이타-뱅크는 SNP 분석에 대한 고 처리량 시설을 이용하여 실험실에서 효과적으로 작업 조정될 수 있으며, 감염된 개체, 조직 또는 이들의 유도체의 검출 및 분리를 위한 빠른 조치를 취할 수 있도록 한다. 개발된 전체 이력추적 시스템은 유럽 공통체에서의 식품 산업 및 농업 분야에 중요하다.
(A) 상술한 스스로 하는(DIY) 시스템 및 (B) 유전자형 마이닝의 컴퓨터 스크린 그래픽 디스플레이를 도식적으로 도시한 도 6에 대한 참조가 이뤄진다.
본 발명은 한 튜브에서 SNP 마커의 멀티플렉싱, 데이타 뱅킹 및 유전자형 마이닝 소프트웨어에 의해 유전자형 분석하는, 다양한 수준에서의 DNA 이력추적 시스템에 관한 것이다. 유전적 분석의 신규한 방법은 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) 유전적 마커의 독특한 세트의 멀티플렉스를 이용하여 제시되며, 이는 태어나서 소비될 때까지 동물의 전체 이력추적을 효과적으로 제공한다. 이러한 이력추적 시스템의 독특한 파라미터는 장소 불문한 적용가능성, 비용-절감효과 및 이의 고객-지향적 관리이다.
본 발명은 그중에서도, 사용자가 중앙집중형 데이타베이스 및 실험실에 의존하지 않고 유전자형 분석을 수행할 수 있는 수단 및 방법을 제공하는 것에 있다. 따라서, 이러한 방법은 스스로 하는(DIY) 유전자형 분석 방법으로 지칭될 수 있다.
지금부터 본 발명의 SNP 프라이머 서열의 리스트를 포함한 표를 도시하는 도 7A에 대한 참조가 이뤄진다. Seq. ID 1-15는 PCR1 정방향 프라이머이며, Seq. ID 16-30은 PCR1 역방향 프라이머이고, Seq. ID 31-45는 PCRII 연장 프라이머이다. 도 7B는 가축 내의 25 마커-특이적 유전자좌(loci)를 나타낸다. 본 발명자는 GeneMapper 소프트웨어에서 각각의 예측되는 대립유전자 크기 주변을 1.0 bp 빈으로 제한한다. 상기 빈을 GeneMapper 디폴트에 따라 색칠하였다.
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acgttggatg ctttgtgacc tcatggactc 30
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c 61
Claims (21)
- 개별 가축(cattle)의 머리의 유전자형 분석(genotyping) 방법으로서,
a. 상기 개별 가축의 머리에서 DNA 샘플을 획득하는 단계;
b. 상기 DNA의 유전자형을 분석하는 단계로서, 상기 유전자형 분석이 본원에서 정의된 PCR SNaPshot 프로토콜을 이용하는데, 상기 프로토콜이 제 1 PCR 단계(PCR 1) 및 제 2 PCR 단계(PCR 2)를 포함하고, 상기 PCR 1 단계가 프라이머(SEQ ID No. 1-30) 및/또는 PCR 1 반응을 위해 공통의 10개 염기 모티프(ACGTTGGATG)를 5' 말단에 지닌 연장된 프라이머를 첨가하는 단계를 포함하며, 상기 PCR2 단계가 연장 프라이머(SEQ ID No. 31-45) 및/또는 상응하는 특정 SNPs에 인접한 프라이머를 첨가하는 단계를 포함하는, 상기 DNA의 유전자형 분석 단계;
c. 주형 DNA 및 제 1 프라이머 세트를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 앰플리콘(amplicons)을 생성하여 PCR1 생산물을 산출시키는 단계;
d. PCR1 생산물을 연장 프라이머 세트에 대한 주형으로 이용하여 PCR2 생산물을 산출시키는 단계;
e. 상이한 길이의 말단(tail)을 PCR2 프라이머에 첨가하여 정확한 크기 및 색 분리가 가능하게 하는 단계;
f. 상기 PCR2 프라이머의 말단을 안정화시키는 단계;
g. 상기 PCR2 생산물을 모세관 서열분석기(capillary sequencer)에서 분리하는 단계;
h. 상기 결과를 데이타 뱅크에 기록하는 단계; 및
i. 데이타 마이닝 소프트웨어(data mining software)를 이용한 상기 데이타 뱅크로부터의 SNP 프로파일과 상기 결과를 비교하여 매칭 프로파일을 획득하는 단계를 포함하는, 개별 가축의 머리의 유전자형 분석 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 선택 단계가 단일 튜브에서 PCR 생산물이 일제히 증폭할 수 있도록 수행되는(멀티플렉싱), 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 멀티플렉싱 단계가 IPLEX 소프트웨어(SEQUENOM, Latham et al 2006)를 적용하여 SNP 마커를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PCR1 프라이머를 선택하는 단계가 GeneBank 서열-파일을 입력 데이타(Werner et al. 2004)로 이용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 SNaPshot 분석에서 상기 PCR1 생산물을 PCR2 프라이머에 대한 주형으로서 이용하고, 상기 PCR2 프라이머를 4개의 형광 뉴클레오티드-유사체를 이용하여 연장하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 다양하게 연장된 PCR2 생산물이 형성되도록, 시토신 뉴클레오티드에 의해 단절된 아데닌계(adenine tracts)의 프라이머 말단을 상기 PCR2 프라이머의 5' 말단에 도입함으로써 길이를 개질시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 PCR2를 안정화시키는 단계가 시토신 뉴클레오티드를 상기 폴리-AC 말단에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 도살장, 냉동 설비, 육류 포장 공장, 육류 가공 공장, 육류 배송 공장, 가축류 운송기, 농민 단체, 시장, 도매상, 배급업자(distributor), 검역 시설 스톡 야드, 농장, 대목장, 종마 농장 또는 목장을 포함하는 군에서 선택된 개별 시설로 상기 가축의 머리를 역으로 추적하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 슈퍼마켓, 정육점, 레스토랑 또는 시장으로 상기 개별 가축의 머리를 역으로 추적하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 개별 휴식 테이블 절단 육류(individual breaking table meat cuts)를 상기 개별 가축에 매치(match)시키는데 이용되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 소매 절단 육류(retail meat cuts)를 개별 가축에 매치시키는데 이용되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 가공된 육류 생산품, 예컨대, 햄버거, 소세지, 살라미 등에서 절단 육류의 단편을 매치시키는데 이용되는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 본원에 정의된 전체 이력추적 체계(full traceability schemes)에서 이용되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 본원에 정의된 부분적 이력추적 체계(partial traceability schemes)에서 이용되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법이 본원에 정의된 간결한 이력추적 체계(concised traceability schemes)에서 이용되는 방법.
- 상기 가축 DNA 내 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 SEQ ID GenBank (Werner et al., 2004)를 포함하는 군에서 선택된 DNA 프라이머 세트로서, 상기 프라이머가 일제히 증폭되도록 개조되고, 이에 따라 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브내에서 멀티플 PCR1 생산물이 제공되고, 상기 혼합물이 또한 가축 주형 DNA를 포함하는, DNA 프라이머 세트.
- SEQ ID No. 31-45으로 이루어진 군에서 선택된 5' 연장된 안정화된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트로서, 상기 PCR2 프라이머가 PCR1 생산물 주형에 대한 안티센스이며, 4개의 형광 뉴클레오티드 유사체를 이용해 연장되어 SNaPshot 분석 중에 PCR2 생산물을 형성하는, 5' 연장된 안정화된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트.
- 제 17항에서 정의된 바와 같은 5' 연장된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트로서, 상기 PCR2 생산물이 모세관 서열분석기에서 분리가능하여 유전자형 분석 데이타를 제공하는, 5' 연장된 폴리-A 말단 PCR2 프라이머 세트.
- 개별 가축의 머리의 유전자형 분석을 위한 패키지로서, 상기 패키지가
a. 공지된(Werner et al 2004) 특정 SNPs에 유전적으로 근접하게 위치한 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30 세트로서, 상기 제 1 프라이머 세트가 가축 주형 DNA를 포함하는 PCR1 혼합물로부터 단일 튜브 내에서 최대 25 PCR 생산물의 증폭을 일제히 가능케하는, 예혼합된 DNA 프라이머 SEQ ID No. 1-30 세트,
b. SEQ ID No. 31-45로 이루어진 군에서 선택된 예혼합된 5' 연장된 말단 프라이머 세트로서, 상기 말단 프라이머가 PCR1 생산물과 함께 어닐링(annealing)한 뒤 PCRII 생산물을 산출하도록 개조되고, 상기 PCR2 생산물이 상기 모세관 서열분석기에서 분리가능하여 개별 가축에 대한 SNP 프로파일을 산출하는, 예혼합된 5' 연장된 말단 프라이머 세트,
c. 상기 프로파일을 매치시킬 수 있는 관련 데이타 마이닝 소프트웨어(associated data mining software)
를 포함하는, 개별 가축의 머리의 유전자형 분석을 위한 패키지. - 제 19항에 있어서, 상기 패키지가 데이타뱅크 프로파일로부터 미리 결정된 SNP 프로파일을 지닌 데이타, 소프트웨어에 의해, 기록, 저장, 처리 및 매치하기 위한 수단을 구비한, 패키지.
- 제 20항에 있어서, 상기 패키지가 리무진(Limousin)의 경우 약 1.11 x 10-8에서 홀스타인(Holstein)의 경우 약 2.3 x 10-10까지의 범위의 ID 파워 및/또는 품종에 걸쳐 약 900,822에서 약 43,671,580까지의 범위의 Mmax에서 상기 데이타뱅크 프로파일과 상기 SNP 프로파일의 매칭을 제공하고, 이는 양친의 유전자형이 이용가능할 때, 부정확한 부모(parenthood)의 약 99.9% 경우의 검출 및 모든 품종에서 부모 제외 확률(parental exclusion probabilities)을 가능케하는, 패키지.
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