CN108913783A - 用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物及其应用 - Google Patents
用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物及其应用，该引物的核苷酸序列如下：上游引物GY‑F：5’‑CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT‑3’；下游引物GY‑R：5’‑GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA‑3’；利用该引物制作了用于鉴别鳜鱼的试剂盒，以及获得一种快速鉴别鳜鱼的方法。本发明的分子特异性标记引物（GY‑F/GY‑R）可对鳜鱼进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别鳜鱼的有效辅助手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对鳜鱼标本快速鉴别的方法。
背景技术
鳜鱼（学名：Siniperca chuatsi）又称桂花鱼、季花鱼、翘嘴鳜，属于硬骨鱼纲，鲈形目，暖鲈科，鳜亚科，是中国名贵淡水经济鱼类。鳜鱼是肉食性鱼类，食欲极强，是淡水鱼的优良品种。鳜鱼肉味鲜美，肉嫩无小刺，肥而不腻，营养价值高，是分布很广的淡水鱼。目前，对鳜鱼的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于长江上游水坝修筑导致产卵地遭到破坏；加之外来物种的入侵及水体污染导致鳜鱼的生存环境遭受严重破坏，所以鳜鱼的种群数量日益下降。因此，对鳜鱼进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前线粒体DNA Cytb基因序列已被广泛应用在鉴定和区分动物种类及解决系统进化的关系问题上。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对鳜鱼进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物及其应用，借助鳜鱼的分子特异性标记引物，能够快速鉴别土著鲫鱼。
本发明是通过以下技术方案实现的：
用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：
上游引物GY-F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’；
下游引物GY-R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA - 3’；该对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对鳜鱼标本的核糖体ITS区序列的克隆序列，然后通过NCBI的序列比对，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行PCR扩增，可以获得150bp左右的特异性片段。
一种用于鉴别鳜鱼的试剂盒，所述试剂盒中包含引物的核苷酸序列如下：
上游引物GY-F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’；
下游引物GY-R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA - 3’；还包含PCR常用试剂。
一种快速鉴别鳜鱼的方法，包括以下步骤：
（1）从浸泡标本中剪取形态学特征初步判断为鳜鱼的部分肌肉组织，保存在95%酒精中于-20℃冰箱中存放；
（2）采用用于鉴别鳜鱼的试剂盒提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用；
（3）以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出鳜鱼的核酸片段，其中，F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’，R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA -3’；
（4）采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为鳜鱼。
上述方法中扩增的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
进一步，所述的DNA目的条带为150±10 bp的DNA目的条带。
进一步，所述PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min；95℃、30s，52℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
进一步，所述步骤（3）中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：约50ng/μl DNA模板2μl，10 pmol/μl 引物F和R各1μl，10 ×PCR Buffer 2.5μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.2μl，dNTPS 0.5μl，MgCl2 1.5μl,双蒸水ddH2O 16.3μl。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明的分子特异性标记引物（GY-F/GY-R）可对鳜鱼进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别鳜鱼的有效辅助手段。
附图说明
附图说明
图1是采用本发明的分子特异性标记引物对鳜鱼进行PCR扩增的电泳图；
其中，M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段。
图2是采用本发明的分子特异性标记引物对鳜鱼、鲫鱼进行PCR扩增的电泳图；
其中，M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为鳜鱼DNA扩增；5,6为鲫鱼DNA扩增。
图3是采用本发明的分子特异性标记引物对不同品种的鱼类样本进行PCR扩增的电泳图；
其中，M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为鳜鱼样本1；5,6为鳜鱼样本2；7,8为非鳜鱼样本1；9,10为非鳜鱼样本3；11,12为鳜鱼样本2；13,14为非鳜鱼样本3；15,16为非鳜鱼样本4；17,18为鳜鱼样本4；19,20为非鳜鱼样本5；21,22为鳜鱼样本5。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
（1）待测鳜鱼基因组DNA的提取
取鳜鱼组织样品，剪碎后使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，利用2%琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。
（2）设计合成特异性PCR扩增引物
设计合成基于鳜鱼的特异性引物，上游引物GY-F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT-3’；和下游引物GY-R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA-3’。由技术人员设计，并由引物设计公司合成。
（3）分子特异性标记引物（GY-F/GY-R）的PCR扩增
PCR反应体系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPS 0.5μL，Taq(5 U/μl) 0.2μL，MgCl21.5μL，JYF引物(10μM) 1μL，JYR引物(10μM) 1μL，DNA模板(约50 ng/μl) 2μL，ddH2O 16.3μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；35个循环（95℃、30s，52℃、30s，72℃、1min）；72℃条件下延伸10min。
（4）电泳检测：
取5μL PCR产物，用2%琼脂糖凝胶电泳（120V，170mA，30min），genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。
由图1可见，扩增出分子量约为150bp左右的特异性DNA条带。
实施例2
用实施例1的方法进行鳜鱼、鲫鱼两种种冰冻鱼块检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种鱼块可扩增出分子量约为150bp左右的特异性DNA条带，另一种鱼块样本未能扩增出特异性条带，检测结果与取样人记录信息完全一致。其凝胶电泳结果如图2所示，因此可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别鳜鱼。
实施例3
从鱼类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95%酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为鳜鱼（5个样品），另一组为其他品种（5个样品），取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，PCR产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出150bp左右的特异性DNA条带为鳜鱼的组织样本，另一组的5个样品为非鳜鱼的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致，其凝胶电泳结果如图3所示。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
序列表
<110> 镇江华大检测有限公司
镇江科华渔业发展有限公司
<120> 用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物及其应用
<141> 2018-01-08
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
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cctctaacat ttcagtctga tgaaactttg gctctctact aggcctttgc ttggtcatcc 120
aaattctcac aggactattc ctcgccatac attacacttc agatatcgca acagctttct 180
cttcagtagc acata 195
Claims (6)
1.用于鉴别鳜鱼的分子特异性标记引物，其特征在于，该引物的核苷酸序列如下：
上游引物GY-F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’；
下游引物GY-R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA - 3’。
2.一种用于鉴别鳜鱼的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含引物的核苷酸序列如下：
上游引物GY-F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’；
下游引物GY-R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA - 3’；还包含PCR常用试剂。
3.一种快速鉴别鳜鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从浸泡标本中剪取形态学特征初步判断为鳜鱼的部分肌肉组织，保存在95%酒精中于-20℃冰箱中存放；
（2）采用用于鉴别鳜鱼的试剂盒提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用；
（3）以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出鳜鱼的核酸片段，其中，F：5’- CCACTCCTAAAAATCGCAAATGAT -3’，R：5’- GCTGTTGCGATATCTGAAGTGTAA -3’；
（4）采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为鳜鱼。
4.如权利要求3所述的一种快速鉴别鳜鱼的方法，其特征在于，所述的DNA目的条带为150±10 bp的DNA目的条带。
5.如权利要求3所述的一种快速鉴别土著鲫鱼的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min；95℃、30s，52℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
6.如权利要求3所述的一种快速鉴别土著鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤（3）中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：约50ng/μl DNA模板 2μl，10 pmol/μl 引物F和R各1μl，10 ×PCR Buffer 2.5μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.2μl，dNTPS 0.5μl，MgCl2 1.5μl,双蒸水ddH2O 16.3μl。
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