KR102147142B1 - 염소 개체 식별용 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 11개의 프라이머 세트로 이루어진 염소 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 염소 개체 식별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 염소 개체 식별 방법에 관한 것으로, 본 발명의 키트 및 방법은 종래 기술과 대비하여 보다 많은 수의 초위성체 마커가 포함되어 개체식별, 친자확인에 대한 정확도가 높으며, 동일개체 출현확률이 매우 낮은 장점이 있어, 염소의 혈통 정립 및 이력 시스템 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 초위성체(microsatellite) 마커를 이용한 염소 개체 식별용 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
염소는 사람에 의해서 가장 먼저 가축화된 종으로 추정되고 있으며, 고기, 젖, 가죽, 털, 뼈, 연료 등 다양한 범위의 생산물을 사람에게 제공하고 있는 중요한 가축 중의 하나이다. 우리나라에서는 염소가 주로 약용으로 인식되어 증탕 위주의 건강보조식품으로 이용되어 왔으나, 최근 들어 외식산업의 발달과 웰빙, 건강식품에 대한 소비자의 인지도가 증가하면서 고기전문 음식점이 성행하는 등 염소의 소비가 증가 추세에 있다. 또한, 우리나라의 경우 2011년 구제역 사태 이후 젖소(Holstein) 위주의 낙농산업에서 축종의 다양화 필요성이 대두되었다.
초위성체(microsatellite) 마커는 다른 마커와 비교하여 유전변이가 높아 집단 간의 관계 및 분포, 근친 정도 파악에 대한 접근이 용이하여 1990년대 중반부터 재래가축의 유전적 다양성, 유래와 계통, 유전적 특성 및 보존 등의 목적으로 널리 이용되기 시작하였다. 국내에서도 초위성체 분석을 통해 여러 학술적·산업적 성과가 도출되고 있으며, 이와 함께 한우·수입육판별법 개발, 쇠고기 이력 관리제 등이 추진되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1535925호에는 총 7개의 초위성체 마커를 이용한 '염소 개체 식별용 초위성체 마커'가 개시되어 있으나, 총 11개의 초위성체 마커를 이용하여 멀티플렉스 PCR의 최적 반응 조건을 개시한 본 발명의 '염소 개체 식별용 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도'는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 염소 자원의 다양성 보존 및 효율적 관리를 위해 개체식별력이 우수한 키트 및 식별 방법을 제공하고자, 공지된 염소 초위성체 마커들의 다양한 조합을 이용하여 개체 식별능을 분석하였다. 그 결과, 초위성체 마커인 MAF065, INRA063, CSRD247, OarFCB20, SRCRSP5, INRA006, ILSTS008, ILSTS011, INRA005, ILSTS087 및 SRCRSP8을 증폭할 수 있는 11개의 프라이머 세트를 특정한 비율로 혼합하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 모든 마커가 교차반응없이 증폭되며 정확하게 염소 개체를 식별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 11개의 프라이머 세트를 포함하는 염소 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 염소 개체 식별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 식별하고자 하는 염소 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 염소 개체의 식별 방법을 제공한다.
본 발명은 종래 기술과 대비하여 보다 많은 수의 초위성체 마커가 포함되어 개체식별, 친자확인에 대한 정확도가 높으며, 동일개체 출현확률이 매우 낮은 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 염소 자원의 유전형 분석을 수행하면 개체식별력이 높고 오류를 최소화할 수 있으므로, 염소의 혈통 정립 및 이력 시스템 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 표 2에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 2는 본 발명의 표 3에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 표 4에 따른 조성으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것으로, 각각의 PCR 조건은 표 5에 개시된 바와 같다.
도 6은 본 발명의 표 6에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 표 7에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 9는 본 발명의 표 8에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 10은 본 발명의 표 7에 개시된 '도 8(좌)'의 조건과 동일한 프라이머 세트 조합 및 혼합 비율로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것으로, 'Tailing O'는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 역방향 프라이머를 포함하는 MAF065, ILSTS087, SRCRSP8 및 OarFCB20 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 것을 의미한다.
도 11은 본 발명의 표 9에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 12는 재래흑염소 DNA 시료를 본 발명의 표 9에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 2는 본 발명의 표 3에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 표 4에 따른 조성으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것으로, 각각의 PCR 조건은 표 5에 개시된 바와 같다.
도 6은 본 발명의 표 6에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 표 7에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 9는 본 발명의 표 8에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 10은 본 발명의 표 7에 개시된 '도 8(좌)'의 조건과 동일한 프라이머 세트 조합 및 혼합 비율로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것으로, 'Tailing O'는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34의 역방향 프라이머를 포함하는 MAF065, ILSTS087, SRCRSP8 및 OarFCB20 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 것을 의미한다.
도 11은 본 발명의 표 9에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 12는 재래흑염소 DNA 시료를 본 발명의 표 9에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 touchdown 방식으로 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3; 서열번호 7 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 4; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 5; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 6; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 7; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 8; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 9; 서열번호 19 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 10; 및 서열번호 21 및 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 11;을 포함하는 염소 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트는 11개의 프라이머 세트가 조합된 것으로, 프라이머 세트 1 내지 11은 각각 초위성체 마커인 MAF065, INRA063, CSRD247, OarFCB20, SRCRSP5, INRA006, ILSTS008, ILSTS011, INRA005, ILSTS087 및 SRCRSP8을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다(표 1).
본 발명에 있어서, 용어 "초위성체(microsatellite)"는 2 내지 6개의 염기서열이 반복되는 구조를 가지는 SSR(simple sequence repeat)을 의미한다. 이러한 초위성체는 대부분의 진핵생물 게놈에 골고루 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 non-coding DNA에 주로 존재한다. "초위성체 마커"는 상기 초위성체 반복 단위의 반복수에 변이가 존재하여 발생하는 다형성을 의미한다.
본 발명에 있어서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함되는데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 멀티플렉스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 세트를 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 간섭(interference) 및 억제(inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 세트 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1 및 31; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 34; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 32; 및 서열번호 21 및 33;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 염소 개체 식별을 위한 멀티플렉스 PCR 반응에서 교차 반응없이 정확한 식별 결과를 보여주는 최적화된 염기서열로 이루어져 있다. 특히, 서열번호 31, 32, 33 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이전의 보고에서 알려진 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열(각각 서열번호 2, 20, 22 및 8에 대응)을 사용할 경우, MAF065, ILSTS087, SRCRSP8 및 OarFCB20 마커에서 +a peak가 조절되지 않는 문제점이 있어, 상기 문제를 해결하기 위해 tailing 변형한 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이다. +a peak란 유전형분석 시 true peak 뒤에 발생하는 추가적인 peak를 의미하는 것으로, +a peak가 true peak와 같은 높이 등으로 발생이 된다면 peak를 정확히 읽을 수 없기 때문에 +a peak를 없애거나 true peak보다 높게 증폭되도록 하여 true peak가 정확하게 구별되도록 해야 정확한 유전형분석 결과를 도출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 11개의 프라이머 세트를 포함하는 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 염소 개체 식별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 멀티플렉스 PCR용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액 등을 포함할 수 있으며, 염화마그네슘을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 염소 개체 식별용 키트에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트는, 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 11이 차례대로 몰농도 기준 0.9~1.1: 1.3~1.5: 0.7~0.9: 1.1~1.3: 0.9~1.1: 1.5~1.7: 0.5~0.7: 1.5~1.7: 1.5~1.7: 0.9~1.1: 0.9~1.1의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 11이 차례대로 몰농도 기준 1: 1.4: 0.8: 1.2: 1: 1.6: 0.6: 1.6: 1.6: 1: 1의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭 산물에 대한 검출의 용이성을 위해 형광물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형광물질은 이에 한정되지 않으나, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있다.
본 발명은 또한,
식별하고자 하는 염소 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 염소 개체의 식별 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "생물학적 시료"는 본 발명의 초위성체 마커를 증폭할 수 있는, 염소의 DNA를 포함하는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 염소의 혈액, 각종 체액, 모근, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 염소 개체의 식별 방법에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트는, 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 11이 차례대로 몰농도 기준 0.9~1.1: 1.3~1.5: 0.7~0.9: 1.1~1.3: 0.9~1.1: 1.5~1.7: 0.5~0.7: 1.5~1.7: 1.5~1.7: 0.9~1.1: 0.9~1.1의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 11이 차례대로 몰농도 기준 1: 1.4: 0.8: 1.2: 1: 1.6: 0.6: 1.6: 1.6: 1: 1의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 염소 개체의 식별 방법에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR은, 95℃에서 15분간 반응; 94℃에서 1분, 58℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 9회 반복; 94℃에서 1분, 57℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 5회 반복; 94℃에서 1분, 56℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25회 반복; 및 65℃에서 1시간 반응;하는 단계로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 멀티플렉스 PCR의 증폭 조건은 11개의 프라이머 세트가 상호 교차 반응하지 않으며, 각각의 마커를 정확하게 증폭시킬 수 있는 최적화된 조건이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 염소 개체 식별을 위한 초위성체 마커
염소 개체 식별에 효과적으로 사용될 수 있는 초위성체 마커의 최적 조합을 선발하기 위해, 국제동물유전학회(International society for animal genetics, ISAG)에서 권고하는 마커를 포함하는 15개 염소(goat) 마커를 이용하였다(http://www.fao.org/3/i2413e/i2413e00.htm).
2. 공시재료 및 DNA 시료 준비
본 발명에서 초위성체 마커 분석을 위해 사용된 공시재료는 뉴질랜드 염소(Boar 종)와 재래흑염소를 이용하였다. 상기 공시재료에서 채혈(뉴질랜드 염소) 또는 모근(재래흑염소)을 채취하였고, 채혈한 혈액 샘플은 QuickGene SP kit DNA whole blood(KURABO, Japan)를, 모근 샘플은 QuickGene DNA tissue kit S(KURABO)를 이용하여 제조사가 권장하는 방법에 따라 게노믹 DNA를 추출하여 -20℃에서 보관하였다. 또한, 멀티플렉스 PCR 최적화 과정에는 ISAG로부터 제공받은 DNA 시료를 사용하였다.
3. 멀티플렉스 PCR 반응
멀티플렉스 PCR 반응액은 250 U의 Hot Start Taq DNA 중합효소(GENETBIO, Korea), 5 ng/㎕ 농도의 게노믹 DNA, 10 pmole의 각 프라이머, 및 2.5 mM dNTP를 사용하여 제조하였다. 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물들은 결과에 따라 Hi-Di formamide와 GeneScanTM 500 LIZ® size standard(Thermo Fisher Scientific, USA)로 희석하고, Genetic Analyzer 3130xl 자동 염기서열 분석장치(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하여 Fragment analysis를 수행하였다. 상기 초위성체 마커 세트에 특이적인 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 증폭산물의 전기영동 결과를 분석하였다.
| 마커 | 프라이머 서열(5'→3') (서열번호) | 증폭산물 크기 | 형광물질 | |
| MAF065 | F | AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG (1) | 116-158 (bp) | FAM-6 |
| R | CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG (2) | |||
| INRA063 | F | GACCACAAAGGGATTTGCACAAGC (3) | 160-186 | FAM-6 |
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| R | CACTGTGGTTTGTATTAGTCAGG (6) | |||
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| R | TGAAATGAAGCTAAAGCAATGC (10) | |||
| INRA006 | F | AGGAATATCTGTATCAACCTCAGTC (11) | 97-125 | NED |
| R | CTGAGCTGGGGTGGGAGCTATAAATA (12) | |||
| ILSTS008 | F | GAATCATGGATTTTCTGGGG (13) | 168-182 | NED |
| R | TACAGTGAGTGAGGTTGGC (14) | |||
| ILSTS011 | F | GCTTGCTACATGGAAAGTGC (15) | 250-300 | NED |
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| INRA005 | F | TTCAGGCATACCCTACACCACATG (17) | 119-125 | PET |
| R | AAATATTAGCCAACTGAAAACTGGG (18) | |||
| ILSTS087 | F | AGCAGACATGATGACTCAGC (19) | 142-164 | FAM-6 |
| R | CTGCCTCTTTTCTTGAGAG (20) | |||
| SRCRSP8 | F | TGCGGTCTGGTTCTGATTTCAC (21) | 215-255 | PET |
| R | CCTGCATGAGAAAGTCGATGCTTAG (22) | |||
| INRA023 | F | GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC (23) | 195-215 | VIC |
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| SRCRSP23 | F | TGAACGGGTAAAGATGTG (25) | 79-115 | FAM-6 |
| R | TGTTTTTAATGGCTGAGTAG (26) | |||
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| MAF065-tail | F | AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG (1) | 124-166 | FAM-6 |
| R | GTTTCTTCCACTCCTCCTGAGAATATAACATG (31) | |||
| ILSTS087-tail | F | AGCAGACATGATGACTCAGC (19) | 150-172 | PET |
| R | GTTTCTTCTGCCTCTTTTCTTGAGAGC (32) | |||
| SRCRSP8-tail | F | TGCGGTCTGGTTCTGATTTCAC (21) | 223-263 | PET |
| R | GTTTCTTCCTGCATGAGAAAGTCGATGCTTAG (33) | |||
| OarFCB20-tail | F | GGAAAACCCCCATATATACCTATAC (7) | 94-140 | VIC |
| R | GTTTCTTAAATGTGTTTAAGATTCCATACATGTG (34) | |||
실시예 1. 초위성체 마커를 이용한 멀티플렉스 PCR 반응 조건 최적화
본 발명자는 다수의 초위성체 마커를 이용한 멀티플렉스 PCR 반응의 조건(마트 세트의 조합 및 증폭 반응 조건)을 최적화하기 위해 표 1에 개시된 프라이머 세트를 활용하여 하기 표 2 내지 9의 조건으로 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하였다.
먼저, 본 발명자는 보유준인 14개 염소 초위성체 마커의 PCR 증폭 여부를 확인하였다. 표 2의 조건으로 증폭 반응을 수행한 결과, 일부 마커의 증폭 산물이 확인되지 않는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 동일한 마커 세트의 조합 및 혼합 비율이지만, 표 3에 개시된 것과 같이 touchdown PCR 방식으로 증폭 반응을 수행한 결과, 표 2의 조건으로 증폭 반응을 수행하였던 경우 증폭되지 않았던 SRCRSP23 및 MCM527 마커는 증폭산물이 확인되었으나, INRA063 마커는 여전히 증폭되지 않는 것을 알 수 있었다(도 2). 이에 증폭되지 않은 프라이머 세트들의 양을 늘리고(표 4) touchdown PCR 조건을 하기 표 5에서와 같이 조정하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
그 결과, 모든 마커에 대해서 증폭 산물(피크)이 확인되었으나, 마커별로 피크의 높이 차이가 많이 나는 것을 알 수 있었다(도 3). 또한, 일부 마커들의 피크가 낮게 확인되고, +a 피크가 발생되는 문제점이 확인되었다(도 4). 이에, 최종 신장(extension) 시간을 30분, 45분 및 1시간으로 설정하여 PCR 반응을 수행한 후 그 결과를 비교해 본 결과, +a 피크가 조절되는 마커가 일부 확인되었으나, 여전히 +a 피크가 조절되지 않는 마커가 확인되었다(도 5). 또한, 조건 최적화 과정 중 나머지 프라이머 세트가 준비되어 표 6의 조건으로 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 모든 마커가 증폭되는 것으로 확인되었으나 +a 피크가 조절되지 않는 마커가 확인되었다(도 6).
이와 같은 문제점을 해결하고자, 본 발명자는 +a 피크 조절을 위해 염화마그네슘(MgCl2)를 첨가한 조성(표 7 및 표 8)으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 염화마그네슘은 25mM 농도를 사용하였다.
그 결과, 여전히 일부 마커에서 +a 피크가 조절되지 않는 것으로 확인되었고(도 7 내지 9), 이러한 문제점을 해결하기 위해 MAF065, ILSTS087, SRCRSP8 및 OarFCB20 마커 증폭용 프라이머 세트의 역방향 프라이머 염기 서열을 tailing하였고(표 1 참고), PCR 조건과 조성을 일부 조정하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 그 결과, 모든 마커 증폭산물에서 +a 피크가 조절되었으나, 마커별로 피크 높이에 차이가 나는 것을 알 수 있었다(도 10). 다만, INRA023 마커의 경우 피크를 확인할 수 없어 최종 마커 세트 조합에서 제외시켰다.
본 발명자는 tailing한 프라이머 세트를 포함하는 조합으로, PCR 조성을 일부 조절하여(표 9), 뉴질랜드 염소 3번과 10번의 DNA 시료를 대상으로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 그 결과, 모든 마커들이 증폭되었으며, 피크 높이도 평준화되는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
또한, 표 9의 조건으로 재래흑염소 DNA 시료를 분석한 결과, 모든 마커들이 증폭되었으며, 뉴질랜드 염소와는 다른 패턴의 증폭 결과를 보여주는 것을 알 수 있었다(도 12). 상기 결과를 통해 본 발명의 초위성체 마커 증폭용 11개 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법은 염소 개체 식별에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되었다.
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HANKYONG & GENETICS
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gtttcttaaa tgtgtttaag attccataca tgtg 34
Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3; 서열번호 7 및 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 4; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 5; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 6; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 7; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 8; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 9; 서열번호 19 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 10; 및 서열번호 21 및 서열번호 33의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 11;을 포함하는 염소 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 염소 개체 식별용 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 식별하고자 하는 염소 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 염소 개체의 식별 방법. - 제4항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트는 프라이머 세트 1 내지 11이 차례대로 몰농도 기준 0.9~1.1: 1.3~1.5: 0.7~0.9: 1.1~1.3: 0.9~1.1: 1.5~1.7: 0.5~0.7: 1.5~1.7: 1.5~1.7: 0.9~1.1: 0.9~1.1의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 염소 개체의 식별 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR은, 95℃에서 15분간 반응; 94℃에서 1분, 58℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 9회 반복; 94℃에서 1분, 57℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 5회 반복; 94℃에서 1분, 56℃에서 90초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25회 반복; 및 65℃에서 1시간 반응;하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 염소 개체의 식별 방법.
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