KR102319859B1 - 토종닭 개체 식별을 위한 초위성체 마커 기반 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 13개의 프라이머 세트로 이루어진 토종닭 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 토종닭 개체 식별용 키트 및 상기 프라이머 세트 조성물을 이용한 토종닭 개체 식별 방법에 관한 것으로, 본 발명의 키트 및 방법은 종래 기술과 대비하여 보다 개체식별, 친자확인에 대한 정확도가 높으며, 동일개체 출현확률이 매우 낮은 장점이 있어, 토종닭의 혈통 정립 및 이력 시스템 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 토종닭 개체 식별을 위한 초위성체 마커 기반 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
한국 정부는 가금육의 수입 의존도를 낮추고 미래농업을 선도하는 종자강국 실현을 위해 토종닭 품종을 개발하는 골든씨드 프로젝트(Golden Seed Project)를 기획하였다. 상기 프로젝트를 통해 개발되는 토종닭 신품종은 국내시장 점유율 30% 이상, 해외시장 수출 100만 달러의 목표로 진행되고 있다. 따라서, 앞으로 개발될 토종닭 품종의 경우 유전자형을 이용한 개체식별 방법을 확립하여 신속하고 정확하게 식별할 수 있는 방법이 필요하다. 그러나, 닭의 유전자 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 닭의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 닭의 개체 식별을 위해서는 닭의 특이적인 유전양상에 근거한 표지 유전자를 선정하고, 이들을 활용한 유전자 감식기법을 설정하는 것이 중요하다.
초위성체(microsatellite) 마커는 다른 마커와 비교하여 유전변이가 높아 집단 간의 관계 및 분포, 근친 정도 파악에 대한 접근이 용이하여 1990년대 중반부터 재래가축의 유전적 다양성, 유래와 계통, 유전적 특성 및 보존 등의 목적으로 널리 이용되기 시작하였다. 국내에서도 초위성체 분석을 통해 여러 학술적·산업적 성과가 도출되고 있으며, 이와 함께 한우·수입육판별법 개발, 쇠고기 이력 관리제 등이 추진되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2018-0050470호에는 '재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2019-0048898호에는 '재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법'이 개시되어 있으나, 13개의 프라이머 세트가 비특이적 반응 없이 효과적으로 표적을 증폭할 수 있도록 반응 조건을 최적화한 '토종닭 개체 식별을 위한 초위성체 마커 기반 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도'에 관한 본 발명은 개시되어 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토종닭 자원의 다양성 보존 및 효율적 관리를 위해 개체식별력이 우수한 키트 및 식별 방법을 제공하고자, 공지된 닭 다형성 분석용 초위성체 마커들의 다양한 조합을 이용하여 개체 식별능을 분석하였다. 그 결과, 초위성체 마커인 MCW0111, MCW0145, MCW0087, MCW0127, ADL0317, LEI0094, ROS0013, MCW0029, ROS0083, MCW0104, MCW0330, ADL0293 및 ADL0304을 증폭할 수 있는 13개의 프라이머 세트를 특정한 비율로 혼합하여 멀티플렉스 PCR (polymerase chain reaction)을 수행한 결과, 모든 마커가 교차반응없이 증폭되어 토종닭 개체를 식별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 4; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 5; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 6; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 7; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 8; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 9; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 10; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 11; 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 12; 및 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 13;을 포함하는 토종닭 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토종닭 개체 식별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 식별하고자 하는 토종닭 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 토종닭 개체의 식별 방법을 제공한다.
본 발명은 종래 기술과 대비하여 보다 개체식별, 친자확인에 대한 정확도가 높으며, 동일개체 출현확률이 매우 낮은 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 토종닭 자원의 유전형 분석을 수행하면 개체식별력이 높고 오류를 최소화할 수 있으므로, 토종닭의 혈통 정립 및 이력 시스템 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 토종닭 DNA 시료를 본 발명의 표 4 내지 표 6에 따른 조건으로 멀티플렉스 PCR을 수행하여 수득한 증폭산물의 전기영동 결과를 Fragment analysis로 분석한 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 13종 초위성체 마커의 대립유전자의 빈도를 기반으로 닭 집단별 주성분 분석(Principal Coordinates Analysis, PCoA)을 수행한 결과이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 13종 초위성체 마커의 대립유전자의 빈도를 기반으로 닭 집단별 주성분 분석(Principal Coordinates Analysis, PCoA)을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 4; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 5; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 6; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 7; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 8; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 9; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 10; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 11; 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 12; 및 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 13;을 포함하는 토종닭 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은 13개의 프라이머 세트가 조합된 것으로, 프라이머 세트 1 내지 13은 각각 초위성체 마커인 MCW0111, MCW0145, MCW0087, MCW0127, ADL0317, LEI0094, ROS0013, MCW0029, ROS0083, MCW0104, MCW0330, ADL0293 및 ADL0304를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로(표 3), 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은, 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.2~0.4: 0.6~0.8: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.3~0.5: 0.6~0.8의 비율로 혼합된 것일 수 있다(표 4).
본 발명에 있어서, 용어 "초위성체(microsatellite)"는 2 내지 6개의 염기서열이 반복되는 구조를 가지는 SSR(simple sequence repeat)을 의미한다. 이러한 초위성체는 대부분의 진핵생물 게놈에 골고루 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 non-coding DNA에 주로 존재한다. "초위성체 마커"는 상기 초위성체 반복 단위의 반복수에 변이가 존재하여 발생하는 다형성을 의미한다.
본 발명에 있어서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자를 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함되는데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 멀티플렉스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 세트를 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 간섭(interference) 및 억제(inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 세트 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 13개의 프라이머 세트를 포함하는 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토종닭 개체 식별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 멀티플렉스 PCR용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액 등을 포함할 수 있으며, 염화마그네슘을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토종닭 개체 식별용 키트에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은, 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.2~0.4: 0.6~0.8: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.3~0.5: 0.6~0.8의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.3: 0.7: 0.3: 0.3: 0.3: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.4: 0.7의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭 산물에 대한 검출의 용이성을 위해 형광물질로 표지될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형광물질은 이에 한정되지 않으나, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, NED, VIC, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있다.
본 발명은 또한,
식별하고자 하는 토종닭 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 토종닭 개체의 식별 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "생물학적 시료"는 본 발명의 초위성체 마커를 증폭할 수 있는, 토종닭의 DNA를 포함하는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 토종닭의 혈액, 각종 체액, 모근, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토종닭 개체의 식별 방법에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은, 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.2~0.4: 0.6~0.8: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.2~0.4: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.4~0.6: 0.3~0.5: 0.6~0.8의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.3: 0.7: 0.3: 0.3: 0.3: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.4: 0.7의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 공시재료 및 DNA 시료 준비
본 발명에서 초위성체 마커 분석을 위해 사용된 공시재료는 국립 축산과학원 가금과에서 보존하고 있는 토종닭 10종 240수를 사용하였다. 상기 공시재료의 품종 및 개체수를 정리하여 하기 표 1 에 나타내었다.
| code | breed | sample numbers |
| NC | Rhode Island Red C | 24 |
| ND | Rhode Island Red D | 24 |
| NF | Leghorn F | 24 |
| NH | Black Cornish | 24 |
| NS | Brown Cornish | 24 |
| NG | Gray Korea Native Chicken | 24 |
| NL | Black Korea Native Chicken | 24 |
| NR | Red Korea Native Chicken | 24 |
| NW | White Korea Native Chicken | 24 |
| NY | Yellow Korea Native Chicken | 24 |
| Total | 240 | |
상기 공시재료에서 혈액 또는 모근을 채취하였고, 채혈한 혈액 샘플은 QuickGene SP kit DNA whole blood (KURABO, Japan)를, 모근 샘플은 QuickGene DNA tissue kit S (KURABO)를 이용하여 제조사가 권장하는 방법에 따라 게노믹 DNA를 추출하여 -20℃에서 보관하였다.
2. 토종닭 개체 식별을 위한 초위성체 마커
토종닭 개체 식별에 효과적으로 사용될 수 있는 초위성체 마커의 최적 조합을 선발하기 위해, 서 등 (Asian-Australas J Anim Sci. 2013, 26(3):316-322)에 의해 보고된 닭의 염색체 전 영역에 위치한 닭 다형성 분석용 초위성체 마커 150종을 검토하였다. 상기 150종의 마커를 토대로 멀티플렉스 PCR을 위해 증폭산물의 크기 범위별 조합과 형광물질을 고려하였으며, Botstein (Am J Hum Genet. 1980, 32(3):314-31)에 따라 다형지수를 고려하여, 최종적으로 개체식별 및 생산 이력 시스템 활용에 유용한 13종의 초위성체 마커를 선발하였다. 상기 초위성체 마커 조합을 하기 표 2에 나타내었다.
| no | 마커 이름 | 염색체 위치 |
| 1 | MCW0111 | 1 |
| 2 | MCW0145 | 1 |
| 3 | MCW0087 | 2 |
| 4 | MCW0127 | 3 |
| 5 | ADL0317 | 4 |
| 6 | LEI0094 | 4 |
| 7 | ROS0013 | 5 |
| 8 | MCW0029 | 5 |
| 9 | ROS0083 | 13 |
| 10 | MCW0104 | 13 |
| 11 | MCW0330 | 17 |
| 12 | ADL0293 | 17 |
| 13 | ADL0304 | 18 |
3. 멀티플렉스 PCR 증폭을 위한 프라이머 제작
선발된 13종의 초위성체 마커 프라이머 중 정방향 프라이머 끝에 FAM, NED, VIC, PET으로 이루어진 표지 형광염료를 부착하였으며, 각 마커 프라이머의 염기서열, 증폭산물의 크기 및 부착된 형광물질 등을 하기 표 3에 나타내었다.
4. 멀티플렉스 PCR 반응
수집된 DNA 시료를 주형으로 하고, 제작된 프라이머 세트 13쌍을 표 4에 개시된 것처럼 조합한 후, 멀티플렉스 PCR을 다음과 같은 조건으로 각각 수행하였다. 각각의 프라이머(10 pmole)는 형광물질의 감도를 고려하여 혼합하였다.
멀티플렉스 PCR 반응액은 표 5에 나타낸 바와 같이 주형 DNA 8-13 ng/㎕, 프라이머 세트 혼합물 5 ㎕, 250 U의 Hot Start Taq DNA 중합효소(GENETBIO, Korea) 0.5 ㎕, 10×Buffer 1.5 ㎕, 2.5 mM의 dNTP 1.0 ㎕를 첨가한 후, 증류수를 첨가하여 총 15㎕로 제조하였다. 그리고, 95℃에서 30분간 전변성(pre-denaturation)한 후 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 결합(annealing), 72℃에서 30초간 신장(extension)을 30회 반복한 후 60분간 72℃에서 최종 신장을 수행하였다.
| 마커 이름 | Volume (㎕) | |
| F primer | R primer | |
| MCW0111 | 0.3 | 0.3 |
| MCW0145 | 0.7 | 0.7 |
| MCW0087 | 0.3 | 0.3 |
| MCW0127 | 0.3 | 0.3 |
| ADL0317 | 0.3 | 0.3 |
| LEI0094 | 0.5 | 0.5 |
| ROS0013 | 0.5 | 0.5 |
| MCW0029 | 0.5 | 0.5 |
| ROS0083 | 0.5 | 0.5 |
| MCW0104 | 0.5 | 0.5 |
| MCW0330 | 0.5 | 0.5 |
| ADL0293 | 0.4 | 0.4 |
| ADL0304 | 0.7 | 0.7 |
| Total | 12 | |
| Component | Volume (㎕) |
| Genomic DNA | 8~13 ng/㎕ |
| 프라이머 혼합물(표 4) | 5 |
| Taq polymerase (250U) | 0.5 |
| 10x buffer | 1.5 |
| dNTPs | 1.0 |
| 증류수 | 6 |
| Total | 15 |
| 단계 | 온도 (℃) | 시간 | 횟수 |
| 전변성 | 95 | 10분 | 1 |
| 변성 | 95 | 30초 | 30 |
| 결합 | 55 | 30초 | |
| 신장 | 72 | 1분 | |
| 최종신장 | 72 | 30분 | 1 |
| 유지 | 4 | ∞ |
실시예 1. 유전자형 분석
상기 멀티플렉스 PCR로 증폭된 산물들은 결과에 따라 Hi-DiTMformamide와 GeneScanTM-500LIZ® size standard (Thermo Fisher Scientific, USA)로 희석하고, Genetic Analyzer 3730 자동 염기서열 분석장치(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하여 Fragment analysis를 수행하였다. 상기 초위성체 마커 세트에 특이적인 프라이머와 Rhode Island Red C 품종 개체의 익하정맥에서 채혈한 혈액으로부터 Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 추출한 게노믹 DNA를 이용하여 실시한 PCR 산물의 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다. 초위성체 마커별 대립유전자형의 정확한 크기 및 대립유전자 수 등은 GeneMapper ver 5 (AppliedBiosystems, USA)을 이용하여 결정하였다.
실시예 2. 초위성체 마커의 다형지수 분석
각 마커의 대립유전자를 이용하여, 전체 집단(표 1)에 대한 집단의 관측이형접합율(observed heterozygosity, Hobs), 기대이형접합율(expected heterozygosity, Hexp), 다형성정보지수(Polymorphism information content, PIC)를 Cervus 3.0 program(version 3.0.3 The University of Edinburgh)을 이용하여 계산하였다(Marshall et al., 1998, Mol. Ecol. 7:639-655). 그 결과 각 초위성체 마커의 다형지수는 하기 표 7과 같으며, 선발된 초위성체 마커의 대립유전자 수는 8개에서 16개로 평균 11.38개인 것으로 확인되었다.
또한, 이전 연구를 통해 선발된 12종의 초위성체 마커(한국등록특허 제1989983호)와 본 발명에서 선발된 13종의 초위성체 마커의 다형지수를 비교했을 때(표 8), 다형성 정보지수(PIC) 값이 0.588(0.3979~0.6961)와 0.6044(0.4924~0.6961)로 본 발명의 13종의 마커에서 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따른 초위성체 마커 세트의 조합이 토종닭 개체 식별에 있어 이전 연구의 마커보다 우수할 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 3. 주성분분석
본 발명의 13종 초위성체 마커의 대립유전자의 빈도를 기반으로 표 1의 닭 집단별 주성분 분석(Principal Coordinates Analysis, PCoA)을 수행하고, 상기 수행 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. PCoA는 데이터 세트의 가변성을 요약하기 위해 축(직교) 세트를 생성한다. 각 축에는 해당 축에서 수집된 변동의 양을 나타내는데, 이 고유 값의 합에 대한 특정 고유 값의 비율(제 1, 2 또는 3분산치)은 각 축의 상대적인 '중요도'를 나타낸다. 성공적인 PCoA는 상대적으로 큰 고유 값을 가진 2-3개 축을 생성하여 입력 데이터 변동의 50% 이상을 수집하고 다른 모든 축은 고유 값이 작게 나타난다.
도 2는 PCoA 분석을 통해 얻은 결과로 가로축(제 1분산치)과 세로축(제 2분산치)에 의해 각 집단이 분포한 결과를 나타내는 것이고, 도 3은 PCoA 분석을 통해 얻은 결과로 가로축(제 2분산치)과 세로축(제 3분산치)에 의해 각 집단이 분포한 결과를 나타내는 것이다. PCoA 분석 결과, 제 1성분의 분산치는 35.53%, 제 2성분의 분산치는 23.98%, 제 3성분의 분산치는 15.17%로 확인되었으며, 제 1성분의 분산치에 의해 한국 로드 아일랜드레드(NC, ND)와 한국 화이트 레그혼(NF, NK)이 명확히 구분되는 것을 확인할 수 있었으며, 제 2성분의 분산치에 의해 갈색 코니쉬(NS)와 한국 화이트 레그혼(NF)이 타 품종들과 떨어져 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 동일개체 출현빈도(Probability of identity; PI)
본 발명에서 사용된 13종의 초위성체 마커(MCW0111, ADL0293, ADL0304, ADL0317, ROS0083, LEI0094, MCW0029, MCW0087, MCW0104, ROS0013, MCW0127, MCW0145 및 MCW0330)를 이용하여, 토종닭의 동일개체 출현빈도를 API-CALCver 1.0(Ayres and Overall, 2004) 프로그램을 통해 산출하였다. 무작위 교배집단(Random)으로 가정하였을 경우 동일개체 출현빈도(Probability of identity; PI)는 13종의 마커를 사용하였을때, 8.75x10-17 빈도로 출현하는 것을 확인할 수 있었으며, 반형매 교배집단(Half-sibs)과 전형매 교배집단(sibs)으로 가정했을 경우에는 1.61x10-12, 1.88x10-06으로 각각 확인되었다. 즉, 모든 집단에서 0에 수렴하는 동일 개체 출현빈도를 나타내기 때문에 개체식별률이 매우 높아 국내 재래닭의개체식별 및 친지확인을 위한 마커로서 본 발명에 따른 13종의 초위성체 마커가 충분히 활용 가능할 것으로 판단되었다.
<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center
<120> Multiplex primer sets based on microsatellite markers for
identification of Korean native chicken and uses thereof
<130> PN21095
<160> 26
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gctccatgtg aagtggttta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
catcattgac aagtggacat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
actttattct ccaaatttgg ct 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gtttccgttg ccattgtgtt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
atttctgcag ccaacttgga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
tgttcttgag aactgcctga g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gagttcagca ggaatgggat g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gaccttacct tctcttattg ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
agttggtttc agccatccat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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cagtgacagt gtgctctggg 20
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gatctcacca gtatgagctg c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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gcactgtgtt acagtgtgag a 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tgctgctcct ggraaattg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
tgattcctcc atggcttttc 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
gtggacaccc atttgtaccc tatg 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tgcacggtcc tgaattgcat g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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cattacagct cagtgttggc a 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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gatgggagag cacttgcaa 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
tagcacaact caagctgtga g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
ggtacacagc tgtgcaagtc t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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tggacctcat cagtctgaca g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
gcaggaactc tatgagaaca tt 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
gtaatctaga aaccccatct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
gaacaaagac tgcggtatgt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
ggggaggaac tctggaaatg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
aaaaagcacg aagcatgagg 20
Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 4; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 5; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 6; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 7; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 8; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 9; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 10; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 11; 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 12; 및 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 13;을 포함하는 토종닭 개체 식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트 조성물로서,
상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물은 프라이머 세트 1 내지 13이 차례대로 몰농도 기준 0.3: 0.7: 0.3: 0.3: 0.3: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.4: 0.7의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 토종닭 개체 식별용 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물. - 삭제
- 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토종닭 개체 식별용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 식별하고자 하는 토종닭 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 이용하여 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 토종닭 개체의 식별 방법. - 삭제
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| KR1020210045684A KR102319859B1 (ko) | 2021-04-08 | 2021-04-08 | 토종닭 개체 식별을 위한 초위성체 마커 기반 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
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| KR20160094342A (ko) * | 2015-01-30 | 2016-08-09 | 대한민국(농촌진흥청장) | 우리맛닭 2호 생산방법 및 이의 식별을 위한 초위성체 마커 조성물 |
| KR20190048898A (ko) * | 2017-10-31 | 2019-05-09 | 한경대학교 산학협력단 | 재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법 |
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2021
- 2021-04-08 KR KR1020210045684A patent/KR102319859B1/ko active IP Right Grant
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| KR20190048898A (ko) * | 2017-10-31 | 2019-05-09 | 한경대학교 산학협력단 | 재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| X091 | Application refused [patent] | ||
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