KR102318379B1

KR102318379B1 - 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물

Info

Publication number: KR102318379B1
Application number: KR1020210101357A
Authority: KR
Inventors: 정은지; 홍동기; 남문; 조성환; 이성진; 이수현; 최은진
Original assignee: 지노타입 주식회사; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2021-10-28

Abstract

본 발명은 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 과수 화상병과 가지검은마름병의 원인균에 각각 특이적으로 검출할 수 있다. 기존 마커에 비해 어위니아 아밀로보라와 피리폴리애를 검출하는데 소요되는 시간을 단축할 수 있으므로 과수 화상병의 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물{Marker composition for rapid and simultaneous detecting Erwinia amylovora and Erwinia pyrifoliae}

본 발명은 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물에 관한 것이다.

과수 화상병(fire blight)은 대표적인 세균성 식물 검역병 중의 하나로, 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)가 그 원인균으로 밝혀져 있으며, 마치 화상을 입은 것처럼 배나무 또는 사과나무의 꽃, 가지, 열매 등을 까맣게 고사시킨다고해서 국내에서는 화상병으로 불린다. 미국과 캐나다 등 이미 54개국에서 발병한 것으로 알려진 과수 화상병은 우리나라 식물방역법상 최상위로 분류되는 수입금지병이다.

자유무역협정(FTA) 체결 이후 수입이 늘어난 외국산 농산물에 병원균이 묻어 국내에 유입됐을 가능성이 높은 것으로 지적되고 있는 과수 화상병은 고온 다습한 조건에서 피목 또는 기공 등을 통해 전염될 수 있고, 과수의 꽃이 피는 시기(개화기)에 새, 진드기, 벌, 나비 등의 곤충과 비바람을 타고 전염될 수 있으며, 진딧물, 매미충류, 혹파리류, 노린재류 등의 흡즙 해충 또는 바람에 의한 마찰 및 모래, 우박 등에 의한 상처를 통해 전염되는 것으로 알려져 있다.

어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)는 미국에서 1780년경 처음 발견된 이래 1957년 영국, 1971년 독일 등의 유럽에 전파되고, 북미, 중동 등에서 추가적으로 발병된 것으로 보고되어 왔다. 최근 일본과 한국에서 화상병과 유사한 가지검은마름병(원인균: Erwinia pyrifoliae)이 발견되었으나, 과수화상병은 현재까지 동북아시아 등 주변 국가에서 발견된 보고는 없었으며, 2015년 국내 과수원에서 화상병 발병 보고 및 원인균 어위니아 아밀로보라가 분리되어 확인된 이후, 매년 병발생이 보고되고 있다.

병원성 미생물 진단을 위해 PCR(Polymerase chain reaction), SYBR Green 또는 TaqMan 프로브를 이용한 Real-time PCR, LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification) 기술들이 개발되어 이용되고 있으며, 이 중 고효율(high-throughput) 진단 시스템으로 전환이 가능하고 신속 정확한 진단 결과를 얻을 수 있는 Real-time PCR을 이용한 바이오마커 개발이 발전되어 왔다.

한편, 한국등록특허 제1954392호에는 '어위니아 아밀로보라 검출용 분자 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1947677호에는 '에르위니아 아밀로보라 검출용 LAMP 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브를 제작하기 위하여 과수 화상병의 원인균인 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)와 과수 화상병과 유사한 병징을 보이는 가지검은마름병의 원인균인 어위니아 피리폴리애(E. pyrifoliae) 간의 게놈 서열을 분석하여 potF 유전자에서 프라이머 세트와 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애에 각각 특이적인 프로브를 제작한 후 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애의 핵산 시료 및 화상병 감염 과수 시료를 대상으로 Real-time PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브가 어위니아 아밀로보라를 신속 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 검출용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 과수 화상병(fire blight) 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 과수 화상병 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애를 동시에 신속하게 검출할 수 있고, 특히 과수 화상병과 유사한 병징을 보이는 가지검은마름병의 원인균인 어위니아 피리폴리애에는 반응하지 않으면서 과수 화상병의 원인균인 어위니아 아밀로보라만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존의 마커에 비해 어위니아 아밀로보라를 검출하는데 소요되는 시간을 단축할 수 있으므로, 과수 화상병의 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 및 프로브 조합을 선발하기 위해 Real-time PCR을 수행한 결과로, (A)는 Real-time PCR 수행 시 온도 및 시간 조건을 나타낸 그림이고, (B)는 FB-5_1305-F2(서열번호 1) 및 FB-5_1305-R2(서열번호 4) 프라이머 세트; 어위니아 아밀로보라(E. amylovora)에 특이적인 EA-FB-5-8(HEX) 프로브(서열번호 7); 및 어위니아 피리폴리애(E. pyrifoliae)에 특이적인 EP-FB-5-10(ROX) 프로브(서열번호 9);조합을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 결과이고, (C)는 FB-5_1305-F2(서열번호 1) 및 FB-5_1305-R2(서열번호 4) 프라이머 세트; 어위니아 아밀로보라에 특이적인 EA-FB-5-9(HEX) 프로브(서열번호 8); 및 어위니아 피리폴리애에 특이적인 EP-FB-5-10(ROX) 프로브(서열번호 9); 조합을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 2 및 도 3은 어위니아 아밀로보라 검출을 위해 정방향 프라이머(FB-5_1305-F2)와 역방향 프라이머(FB-5_1305-R2)의 최적 농도 조건을 확인한 것으로, 도 2(A)는 정향향 및 역방향 프라이머를 4:40(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이고, 도 2(B)는 4:30(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이고, 도 3(A)는 4:20(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이며, 도 3(B)는 4:12(pmole/rxn) 농도로 혼합하여 Real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 4 및 도 5는 어위니아 아밀로보라 검출을 위해 어위니아 아밀로보라에 특이적인 EA-FB-5-8(HEX) 프로브와 어위니아 피리폴리애에 특이적인 EP-FB-5-10(ROX) 프로브의 최적 농도 조건을 확인한 것으로, 도 4(A)는 EA-FB-5-8(HEX) 및 EP-FB-5-10(ROX)를 1:1(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이고, 도 4(B)는 0.75:0.75(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이고, 도 5(A)는 2.5:2.5(pmole/rxn) 농도로 혼합한 것이며, 도 5(B)는 1.25:1.25(pmole/rxn) 농도로 혼합하여 Real-time PCR을 수행한 결과이다.
도 6은 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 Real-time PCR 단계 조건을 확인한 것으로, (A)는 변성(denaturation) 및 결합(annealing) 단계로 이루어진 2 step 조건으로 PCR을 수행한 결과이고, (B)는 변성(denaturation), 결합(annealing) 및 신장(extension) 단계로 이루어진 3 step 조건으로 PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 멜팅 커브 분석(melting curve analysis) 조건을 확인한 것으로, (A)는 프로브가 결합하는 단계가 포함된 조건(PNA binding step ○)으로 PCR을 수행한 결과이고, (B)는 프로브가 결합하는 단계가 없는 조건(PNA binding step ×)으로 PCR을 수행한 결과이다.
도 8은 기존 Real-time PCR과 비교하여 본 발명의 조건으로 Real-time PCR 수행할 경우 총 running time이 약 1시간 정도 감소되는 효과를 보여주는 그림이다.
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브와 기존 마커(한국등록특허 제1954392호)를 이용하여 어위니아 아밀로보라, 어위니아 피리폴리애, 배 건전 식물체 및 사과 건전 식물체 시료를 대상으로 Real-time PCR 수행한 결과이다.
도 10은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브와 기존 마커(한국등록특허 제1954392호)를 이용하여 어위니아 아밀로보라, 어위니아 피리폴리애 및 이병 식물체 시료를 대상으로 Real-time PCR 수행한 결과이다.
도 11은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 민감도를 분석하기 위해서 어위니아 아밀로보라 게노믹 DNA의 copy 수와 농도별로 Real-time PCR을 수행한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 검출용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 마커 조성물은 과수 화상병의 원인균인 어위니아 아밀로보라(E. amylovora)와 과수 화상병과 유사한 병징을 보이는 가지검은마름병의 원인균인 어위니아 피리폴리애(E. pyrifoliae)의 게놈 DNA를 분석하여 potF 유전자에서 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 4) 세트; 어위니아 아밀로보라의 게놈 DNA에 특이적인 프로브(서열번호 7) 및 어위니아 피리폴리애의 게놈 DNA에 특이적인 프로브(서열번호 9)를 디자인한 것이다. 상기 각 프로브는 전술한 프라이머 세트에 의해 증폭되는 서열 내에 결합할 수 있도록 디자인하였다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 서열번호 1의 올리고뉴클레티드에서 6번째 및 12번째 염기는 각각 Y(C 또는 T) 및 R(A 또는 G)로, 어위니아 아밀로보라에 특이적일 경우 Y에 해당하는 염기는 C, R에 해당하는 염기는 A이며(표 1의 서열번호 2), 어위니아 피리폴리애에 특이적일 경우 Y에 해당하는 염기는 T, 12번째 R에 해당하는 염기는 G이다(표 1의 서열번호 3).

또한, 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 서열번호 4의 올리고뉴클레티드에서 8번째 염기는 Y(A 또는 G)로, 어위니아 아밀로보라에 특이적일 경우 Y에 해당하는 염기는 A이고(표 1의 서열번호 5), 어위니아 피리폴리애에 특이적일 경우 Y에 해당하는 염기는 G이다(표 1의 서열번호 6).

상기 potF 유전자는 Putrescine-binding periplasmic 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 어위니아 아밀로보라(E. amylovora)의 potF 유전자 서열은 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, 과수 화상병과 유사한 병징을 보이는 가지검은마름병의 원인균인 어위니아 피리폴리애(E. pyrifoliae)의 potF 유전자 서열은 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 6의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkyl-phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로브(probe)"는 상보적인 단일가닥 표적서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.

본 발명의 프로브는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브이다.

본 발명의 상기 어위니아 아밀로보라 검출용 마커 조성물은 어위니아 아밀로보라 균주와 어위니아 속의 이종 균주를 구별할 수 있으며, 바람직하게는 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애를 구별하여 과수 화상병(어위니아 아밀로보라) 및 과수 화상병과 유사한 병징을 보이는 가지검은마름병(어위니아 피리폴리애)를 진단할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 어위니아 아밀로보라 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 마커 조성물은 서열번호 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하며, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

과수 화상병(fire blight) 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 과수 화상병 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현에 따른 방법에 있어서, 상기 마커 조성물은 서열번호 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하며, 상기 프라이머 세트 및 프로브는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 과수 화상병 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 과수 화상병 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 증폭 산물의 검출은, 본 발명의 프로브를 증폭 산물에 혼성화시키고 융해온도(Tm)를 분석하여 어위니아 아밀로보라를 검출할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 어위니아 아밀로보라 특이적 프로브(HEX 표식)와 어위니아 피리폴리애 특이적 프로브(ROX 표식)를 모두 사용하여 Mutiplex PCR을 수행함으로써 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 정확한 구별이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 제작

프라이머 세트는 어위니아 아밀로보라 CFBP1430(NCBI accession No: NC_013961.1) 및 어위니아 피리폴리애 EP12163(NCBI accession No: NC_017390.1)의 염기서열을 분석하여 potF 유전자 위치에서 Primer3 프로그램을 이용하여 150-200 bp의 PCR 산물이 생성되도록 디자인하였으며, 디자인 조건에서 GC 함량은 30~70%, 길이는 17~25bp, 융해 온도(Tm)는 58~65℃이다.

또한, PNA 프로브는 PNA tool( http://pnabio.com/support/PNA_Tool.htm)을 사용하여 GC 함량은 40~60%, 길이는 12~20bp, 융해 온도는 50~70℃ 범위에서 확인될 수 있도록 디자인하였으며, Self complementary가 발생하지 않도록 디자인하여 최종적으로 어위니아 아밀로보라의 게놈 DNA에 특이적인 프로브 2개와 어위니아 피리폴리애의 게놈 DNA에 특이적인 프로브 1개를 제작하였다(표 1).

실시예 1. 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 및 프로브 조건 확인

1-1. 어위니아 아밀로보라 특이적 프로브 선별

상기 제작된 어위니아 아밀로보라에 특이적인 프로브 2개 중 하나를 선별하기 위해, FB-5_1305-F2(서열번호 1) 및 FB-5_1305-R2(서열번호 4) 프라이머 세트; EA-FB-5-8(HEX) 프로브(서열번호 7), 또는 EA-FB-5-9(HEX) 프로브(서열번호 8); 및 EP-FB-5-10(ROX) 프로브(서열번호 9);를 하기 표 2의 조건으로 각각 혼합한 후 도 1A의 조건으로 Real-time PCR을 수행하였다.

그 결과, 프라이머 세트, EA-FB-5-9(HEX) 및 EP-FB-5-10(ROX) 프로브 조합을 사용한 경우의 Ct값 및 Tm(melting point) 값을 통해 EA-FB-5-9(HEX) 프로브의 재현성이 떨어짐을 확인하였고, 특히 멜팅 피크(melting peak)에서 Tm값이 음의 값으로 나타나 형광 신호가 감소된 것을 확인하였으며, 이를 통해 상기 프로브가 화상병 진단 시 민감도에 영향을 줄 수 있을 것으로 사료되었다. 따라서, 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 최적의 조건으로 EA-FB-5-8(HEX) 프로브를 선별하였다.

1-2. 프라이머 세트의 농도 조건 선별

상기 제작된 정방향 프라이머 FB-5_1305-F2와 역방향 프라이머 FB-5_1305-R2 의 농도 조건을 선별하기 위해 하기 표 3의 프라이머 혼합 비율(정방향:역방향=4:40, 4:30, 4:20 및 4:12)으로 PCR 반응물을 혼합하여 Real-time PCR을 수행하였다.

그 결과, PNA 프로브가 혼합되어 있는 상태에서 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 검출 민감도를 확인한 결과 1×10² copies/㎕까지 안정적인 검출 성능을 확인하였고, 프라이머의 농도를 높게 가져가는 것이 검출 민감도 및 안정성을 위해 좋을 것으로 사료되어 FB-5_1305-F2 및 FB-5_1305-R2 프라이머를 4:40(pmole/㎕) 농도로 혼합하는 것을 최적의 조건으로 선별하였다(도 2 및 3).

1-3. 프로브의 농도 조건 선별

상기 1-1에서 선별된 어위니아 아밀로보라에 특이적인 EA-FB-5-8(HEX) 프로브와 어위니아 피리폴리애에 특이적인 EP-FB-5-10(ROX) 프로브의 농도 조건을 선별하기 위해 표 4의 조건(1:1, 0.75:0.75, 2.5:2.5 및 1.25:1.25 pmole/rxn)으로 PCR 반응물을 혼합하여 Real-time PCR을 수행한 결과, 멜팅 피크의 높이가 200 d(RFU)/dT) 이상으로 안정적인 결과를 보이는 2.5:2.5(pmole/rxn) 농도를 최적의 조건으로 선별하였다(도 4 및 5).

실시예 2. Real-time PCR 조건 확인

2-1. PCR 단계 조건 선별

도 6에 나타난 바와 같이, 변성(denaturation) 95℃ 10초 및 결합(annealing) 58℃ 10초의 2 step 조건;과 변성(denaturation) 95℃ 10초, 결합(annealing) 58℃ 10초 및 신장(extension) 72℃ 10초의 3 step 조건;으로 PCR을 수행한 결과, 2 step 조건에서 Ct값의 재현성이 떨어진 것을 확인하였고, 높은 copy 수와 낮은 copy 수에서 최종 PCR 산물의 양에 큰 차이가 발생한 것을 확인하였다(도 6(A)의 빨간색 참고). 이를 통해, Real-time PCR은 3 step 조건으로 수행하는 것이 좋을 것으로 사료되었다.

2-2. 멜팅 커브 분석(melting curve analysis) 조건 확인

도 7에 나타난 바와 같이, 멜팅 커브 분석 과정에서 프로브가 결합하는 단계가 포함된 조건(PNA binding step ○)와 프로브가 결합하는 단계가 없는 조건(PNA binding step ×)으로 PCR을 수행한 결과, 프로브가 결합하는 단계가 없는 조건으로 PCR을 수행한 경우에는 프로브 결합 단계가 포함된 조건에 비해 증폭 곡선(amplification plot)이 매끄럽지 않은 것을 확인하였다(도 7(B)의 빨간색 참고). 이를 통해, 멜팅 커브 분석 시 프로브가 결합하는 단계가 포함된 조건으로 수행하는 것이 좋을 것으로 사료되었다.

2-3. 기존 마커 대비 시간 단축 효과

한국등록특허 제1954392호의 PCR 조건과 본 발명의 PCR 조건을 비교한 결과, 본 발명의 PCR 조건으로 수행할 경우 기존 PCR 조건에 비해 약 1시간 이상 시간 단축이 가능하여 어위니아 아밀로보라의 검출 효율이 증가한 것을 확인하였다(도 8).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 Real-time PCR을 수행할 때, 정방향 프라이머 세트인 FB-5_1305-F2와 역방향 프라이머 세트인 FB-5_1305-R2를 4:40 농도(1rxn 기준)로 혼합하고, EA-FB-5-8(HEX) 프로브와 EP-FB-5-10(ROX) 프로브를 2.5 pmole/rxn 농도로 혼합하고, PCR은 변성(denaturation) 95℃ 10초, 결합(annealing) 58℃ 10초 및 신장(extension) 72℃ 10초의 3 step 조건으로 수행하고, 멜팅 커브 분석 과정에서 프로브가 결합하는 단계를 포함하여 수행하는 것이 어위니아 아밀로보라를 단시간에 가장 효과적으로 검출할 수 있는 최적의 조건임을 알 수 있었다.

실시예 3. 본 발명의 어위니아 아밀로보라 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브의 검정

본 발명의 프라이머 세트 FB-5_1305-F2 및 FB-5_1305-R2; EA-FB-5-8(HEX) 프로브(서열번호 7); 및 EP-FB-5-10(ROX) 프로브(서열번호 9);를 이용하여 어위니아 아밀로보라, 어위니아 피리폴리애, 건전 식물체 및 이병 식물체 시료를 대상으로 Real-time PCR을 수행하여 어위니아 아밀로보라 검출능을 확인하였다.

그 결과, 어위니아 아밀로보라(HEX; 양성대조군, 10⁴ copies/㎕) 및 어위니아 피리폴리애(ROX; 양성대조군, 10⁴ copies/㎕)의 Tm값이 각각 65℃ 및 63℃로 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애가 정확하게 구별되었고, 배 건전주 및 사과 건전주 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않아 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애가 검출되지 않음을 확인하였다(도 9).

또한, 어위니아 아밀로보라에 감염된 배 및 사과의 이병 식물체 시료에서는 어위니아 아밀로보라가 검출되었고 어위니아 피리폴리애는 검출되지 않음을 확인하였다. 게다가 한국등록특허 제1954392호에 개시된 어위니아 아밀로보라 검출용 마커는 총 11개의 이병 식물체 시료 중에서 9개 시료에 대해서만 증폭 반응(81.8% 진단)을 보인 반면, 본 발명의 마커는 11개 시료에 대해 모두 증폭 반응(100% 진단)을 나타낸 점으로 보아 본 발명의 마커가 기존의 마커보다 어위니아 아밀로보라를 보다 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 10).

이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 과수화상병 역학 및 예찰 조사 시 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료되었다.

실시예 4. 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 민감도 분석

본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 진단 민감도를 조사하기 위해 어위니아 아밀로보라 게노믹 DNA의 copy 수를 10⁷에서 10¹까지 희석하고, DNA 농도를 10 ng에서 0.1 pg까지 희석하여 융해 곡선을 분석한 결과, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브가 어위니아 아밀로보라 DNA의 10¹ copy까지, 0.1 pg 농도까지 진단이 가능함을 확인하였다(도 11).

한국등록특허 제1954392호에 개시된 어위니아 아밀로보라 검출용 마커의 민감도가 1 pg인 점과 비교하였을 때, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 어위니아 아밀로보라 검출 및 과수 화상병 진단 효과가 매우 우수한 것임을 알 수 있었다. 또한 한국등록특허에 개시된 마커는 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애 간의 SNP 차이를 이용하여 어위니아 아밀로보라를 구별하는 것인 반면, 본 발명의 마커는 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 특이적 위치를 기반으로 각각 제작된 2개의 형광 프로브를 이용하기 때문에 기존의 마커보다 좀 더 안정적으로 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애를 구별 및 진단할 수 있다.

<110> XENOTYPE CO.,LTD REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Marker composition for rapid and simultaneous detecting Erwinia amylovora and Erwinia pyrifoliae <130> PN20181 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gattaytcgg grgcagccac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Erwinia amylovora <400> 2 gattactcgg gagcagccac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Erwinia pyrifoliae <400> 3 gattattcgg gggcagccac 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cctctttygg gatgctgtag gc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Erwinia amylovora <400> 5 gcctacagca tcccaaaaga gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Erwinia pyrifoliae <400> 6 gcctacagca tcccgaaaga gg 22 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 acgtgcgtgg ctat 14 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 caacacgtgc gtg 13 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 caacatctgc gtg 13 <210> 10 <211> 500 <212> DNA <213> Erwinia amylovora <400> 10 agcggcgctg ggcaaagacg cgccggtgga cagctgggat ctggtactga agcctgaaaa 60 tctcgctaag ctgaaaagct gtggcgtttc cttccttgac gctcctgagg aaatatttgc 120 caccgtgctg aattatcagg gtaaagaccc gaacagcagt gaggcaaaag attactcggg 180 agcagccact gacctgttgc tgaagctgcg tccaaacatt cgttacttcc actcatcgca 240 gtacatcaat gacctggcga acggcaacac gtgcgtggct atcggctggg cgggggacgt 300 tctgcaggcg aagaaccgcg cgctggcggc gaaaaatggt gtcgatattg cctacagcat 360 cccaaaagag ggcgcactgg cgttcttcga tacgctggcc atccctaaag atgcgaaaaa 420 tgttgatgaa gcctggcagt tccttaacta cctgatgaaa cctgaagtgg cggcgcagat 480 ttccaatgcg gttttctacg 500 <210> 11 <211> 500 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Erwinia pyrifoliae <400> 11 ctgggcaaag atgccccggt gaatagctgg gatctggtgc tgaagcctga aaatctcgcc 60 aggctgaaaa gctgtggcgt ttccttcctt gacgctcctg aagagatctt tgccaccgta 120 ctgaactatc agggtaaaga cccgaacagc agtgatgcaa aagattattc gggggcagcc 180 actgacctgc tgctgaagct gcgtccaaac attcgttact tccactcatc gcaatacatc 240 aatgatctgg ccaacggcaa catctgcgtg gccatcggct gggcgggcga cgttctgcag 300 gcgaagaacc gcgcgctggc ggcgaaaaac ggtgtcgata tcgcctacag catcccgaaa 360 gagggcgcac tggcgttttt cgatacgctg gccatcccta aagatgcgaa aaatgtcgat 420 gaagcttatc agttccttaa ttacctgctg aaacctgaag tgatggcgca gatatccaat 480 gcggttttct atgccagtgg 500

Claims

서열번호 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 9의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 검출용 마커 조성물.
제1항의 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 검출용 키트.
제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
과수 화상병(fire blight) 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 과수 화상병 진단 방법.
제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.