KR101480155B1 - 베치에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 베치(Vicia sativa spp. sativa)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 베치의 유전적 다형성 검출 방법 및 유전자원의 동정 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 베치(Vicia sativa spp. sativa)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 베치의 다형성 검출 방법 및 유전자원 동정 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소면적 재배 작물에 대해서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR(Simple Sequence Repeat; 반복염기서열) 방법은 DNA 반복 배열인 마이크로세틀라이트(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 마이크로세틀라이트 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소면적 재배 작물에서 SSR 마커를 개발하려는 연구가 한창 진행 중에 있다.
베치는 남부 유럽이 원산으로 지중해 유역, 서아시아, 중앙아시아, 동아시아, 미국 등 전 세계에 광범위하게 분포하고 있으며, 일반적인 중간의 내냉성을 가지고 있다. 또한 베치는 다양한 용도(곡물, 목초 등), 높은 영양적 가치, 넓은 기후대 및 토양 조건에서 생육이 가능하기 때문에 전 세계적으로 가장 중요한 두과 사료 작물 중에 하나이다.
베치(Vicia sativa spp. sativa)의 경우, 분자유전학적 분석법 중 재현성과 다형성이 높은 SSR (Simple Sequence Repeat; 반복염기서열) 프라이머가 많지 않다. 따라서 베치 유전자원의 분류, 중복성 검정, 향후 개발될 품종의 판별, 유용자원 선발 및 마커를 활용한 육종 등에 적용 가능한 새로운 SSR 프라미어 개발이 시급하다.
이에 본 발명자들은 베치 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커를 개발하기 위하여 연구를 수행 중, 다양한 베치 유전자원에서 다형성 변이를 많이 나타내는 SSR 프라이머쌍을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 베치(Vicia sativa spp. sativa) 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 마커 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용한 베치의 다형성 검출 방법 및 베치 유전자원 동정 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 베치의 다형성 검출용 키트 및 베치 유전자원 확인용 키트를 제공한다.
본 발명은 베치의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 마커를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 베치(Vicia sativa spp. sativa)에서 추출한 RNA에 대하여 염기서열 분석을 수행한 후, 이들에 대하여 SSR 부위를 확인을 하였다. RNA 염기서열 분석을 기초로 하여 베치에서 특이적인 반복 염기서열을 포함하는 부위를 증폭하여 확인할 수 있도록 프라이머를 제작하였다. 그 결과, 현재까지 베치에 적용 가능한 총 47쌍의 다형성 SSR 프라이머를 개발하였다.
본 발명에서 제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25과 26로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 44와 45로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 59와 60으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 61과 62로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 63과 64로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 65와 66으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 67과 68로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 69와 70으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 71과 72로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 73과 74로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 75와 76으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 77과 78로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 79와 80으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 81과 82로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 83과 84로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 85와 86으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 87과 88로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 89와 90으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 91과 92로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 93과 94로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 베치로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 베치에서 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 베치 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존하는 데 이용할 수 있으며, 또한 향후 개발될 베치 품종의 동정에 활용될 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 베치의 유전적 다형성 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 베치의 유전적 다양성 검출 방법은
(a) 베치 식물로부터 게놈 DNA를 추출하고;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고; 그리고
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 베치에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 70-75℃, 예를 들면 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성은 90-99℃, 92-97℃ 또는 94-95℃에서 수행될 수 있으며, 증폭은 70-75℃, 71-74℃ 또는 72℃에서 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있는데, 예를 들어 50-59℃, 52-57℃ 또는 55℃로 수행할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시킨다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 예를 들면, 아가로스 겔(agarose gel), 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)를 이용하여 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행할 수 있다. PCR 증폭 결과는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있어 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
또한 다른 측면에서 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 베치 속 식물의 유전자원 확인 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 '유전자원'이란 '종자 또는 식물체'를 의미한다.
구체적으로 베치 유전자원 확인 방법은
(a) 베치 및 대조군 베치 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고;
(b) 상기 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고;
(c) 상기 베치 및 대조군 베치의 PCR 산물을 크기별로 분리하고; 그리고
(d) 상기 PCR 산물의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함한다.
(a) 내지 (c) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 앞서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 베치 및 대조군 베치 종자에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대해 시료가 되는 베치와 대조군 베치 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 베치와 대조군 베치의 결과가 모두 일치하면 시료가 되는 베치는 대조군 베치와 동일하다고 할 수 있다. 이와 같은 유전자원 확인 방법은 신규 유전자원 도입시 중복 여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 베치 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 베치와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 베치보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 베치에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 베치 속 식물의 유전적(DNA) 다형성 검출용 키트를 제공한다. 상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 베치의 유전자원 확인용 키트를 제공한다. 유전자원 확인 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 베치의 유전적 다형성을 효과적으로 검출하여 베치의 유전자 프로파일을 작성하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 베치 속 식물의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 원산지 분석에 활용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: SSR 프라이머 제작
농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보유하고 있는 베치(K146681) 파종 30일 후 전체 RNA를 추출 하였다. mRNA 정제는 PolyATract mRNA Isolation System IV (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하였으며, 정제된 mRNA로 ZAP-cDNA Synthesis kit (Stratagene, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성 후 차세대 염기서열 분석장비(GS FLX, Roche)를 이용하여 염기서열 분석을 하였다.
분석된 염기서열 중 특이적인 단순반복염기(simple sequence repeats, SSR)를 ARGOS 프로그램을 이용하여 증폭할 수 있는 프라이머를 제작한 후 각각의 프라이머에 대한 증폭(PCR) 조건을 확인하였다.
각각의 프라이머쌍에 대한 PCR 조건은 다음과 같다. 주형 DNA 50 ng, 정방향 프라이머 0.5 μM, 역방향 프라이머 0.5 μM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 100 μM, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, 1 유니트 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하였다. PCR 반응은 PTC-200 thermocycler (MJ Research, USA)를 이용하여 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.
그 결과 베치의 다형성 및/또는 유전자원 확인에 사용할 수 있는 47개의 프라미어쌍을 선별하였다(표 1).
실시예 2: SSR 분석
농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보유하고 있는 베치 32점(표 2)에 대하여 상기 표 1의 47개 프라이머 쌍에 대한 유전자형(대립유전자) 분석은 다음과 같다. 각각의 프라이머 쌍으로 32점을 증폭 후 QIAxcel Gel Electrophoresis System (Qiagen)을 이용하여 증폭 산물(band)의 크기를 분석하였다. 그 결과를 표 3 내지 8에 나타내었다(표 안의 숫자는 대립유전자의 크기를 나타낸다).
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<220>
<223> GBSSR-VSspS-071 forward primer
<400> 17
gtattcctct ggtggtggg 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-071 reverse primer
<400> 18
caccaccaag acctccaa 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-073 forward primer
<400> 19
cctcccaatc ctccattc 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-073 reverse primer
<400> 20
ccctagtcct ccaatttcg 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-076 forward primer
<400> 21
cctggtccca gaaatggt 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-076 reverse primer
<400> 22
aagccagagg gcattgat 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-080 forward primer
<400> 23
aatgcatgga tcgaggtg 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-080 reverse primer
<400> 24
gaatccatcg gcaacgta 18
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-088 forward primer
<400> 25
cgaagaggta aatgacgcc 19
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-088 reverse primer
<400> 26
agtgacctat atttagcatc gtt 23
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-090 forward primer
<400> 27
agacgcacca caacagaaa 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-090 reverse primer
<400> 28
gggctagaca tggcacaa 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-091 forward primer
<400> 29
ccaaaccagc aagagcag 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-091 reverse primer
<400> 30
gagcagcgtt gtctcgtc 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-099 forward primer
<400> 31
atccatgcct cttttgcc 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-099 reverse primer
<400> 32
agcctcattt cagcagca 18
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-107 forward primer
<400> 33
tggtttcttt ctaaaggggt g 21
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-107 reverse primer
<400> 34
cggctcgatg gacagtag 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-117 forward primer
<400> 35
cggtgcacta agtgggaa 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-117 reverse primer
<400> 36
ttaatgatgg tggcgagg 18
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-118 forward primer
<400> 37
gcatttccct tggtctcc 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-118 reverse primer
<400> 38
cagaaagagc aaccgtgc 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-125 forward primer
<400> 39
ggccggtatt cgtcaact 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-125 reverse primer
<400> 40
ccccgtattt tctcggtc 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-126 forward primer
<400> 41
tggcgcttat cgctatgt 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-129 reverse primer
<400> 42
tccactcatt ccactcgt 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-129 forward primer
<400> 43
aggagaggca aggaccag 18
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-129 reverse primer
<400> 44
ctttttctct aactcattca tgtc 24
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-135 forward primer
<400> 45
tggtggagat ttgttggg 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-135 reverse primer
<400> 46
cttcatcttc ccacaccg 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-156 forward primer
<400> 47
ggccaattta gcgagctt 18
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-156 reverse primer
<400> 48
cactatcatc aacctctaac gga 23
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-158 forward primer
<400> 49
tgagcttatt gccagtgga 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-158 reverse primer
<400> 50
ccatgtcatc atcggattc 19
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-162 forward primer
<400> 51
gagacagtgg aagtatcggc 20
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-162 reverse primer
<400> 52
cacagcaaat gcatcggt 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-166 forward primer
<400> 53
gtggccatga tccatttg 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-166 reverse primer
<400> 54
ttcctcgaga gggaaagc 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-172 forward primer
<400> 55
gctttggaag agcccaat 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-172 reverse primer
<400> 56
tccaggattg taaccccc 18
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-181 forward primer
<400> 57
cactgtgact cagtttcgtt g 21
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-181 reverse primer
<400> 58
cgattttgaa ccctaaccg 19
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-182 forward primer
<400> 59
gcgttgtggc gtatttct 18
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-182 reverse primer
<400> 60
tggaggaaag gaaactactc a 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-187 forward primer
<400> 61
ccaggttgct ttccttactt t 21
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-187 reverse primer
<400> 62
ttagccctca aagcctcc 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-192 forward primer
<400> 63
agggtcttcc ttcccaca 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-192 reverse primer
<400> 64
tatggtgaca cgttcgca 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-203 forward primer
<400> 65
tccatctggt tggtggtg 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-203 reverse primer
<400> 66
gaaagccaat ttttcagcaa 20
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-217 forward primer
<400> 67
ccatcgccac cacca 15
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-217 reverse primer
<400> 68
tcccggaaca aaaatcaa 18
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-245 forward primer
<400> 69
caataggggg acccttca 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-245 reverse primer
<400> 70
gctgcaagct gctaccat 18
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-249 forward primer
<400> 71
aaaacatggt tgagtgtttt tg 22
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-249 reverse primer
<400> 72
taaccctctc ggtttcgg 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-252 forward primer
<400> 73
catggtgctt ccgacaat 18
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-252 reverse primer
<400> 74
tcgaaatcag gacttaccac a 21
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-262 forward primer
<400> 75
attgggccct ctttttga 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-262 reverse primer
<400> 76
gggggtagaa aagttgcg 18
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-268 forward primer
<400> 77
aaatttgtct gacgaaaaac g 21
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-268 reverse primer
<400> 78
tgcttgagag tgccatca 18
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-269 forward primer
<400> 79
ttccatttat cctcctatcc tct 23
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-269 reverse primer
<400> 80
cttgaatgcg aaacgagg 18
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-284 forward primer
<400> 81
tggaaggaaa tggcagtg 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-284 reverse primer
<400> 82
atccgtttcg gattggtt 18
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-291 forward primer
<400> 83
cccaaccgaa ccacttatt 19
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-291 reverse primer
<400> 84
taatagctcc ggcccagt 18
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-301 forward primer
<400> 85
aaccaaacaa caatgggtt 19
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-301 reverse primer
<400> 86
tcaaccggtg aaagatgg 18
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-305 forward primer
<400> 87
catgaaagag ttttgcacct t 21
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-305 reverse primer
<400> 88
ccgacgacga gattgaga 18
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-309 forward primer
<400> 89
tcttcaaaag agtacaaaag gga 23
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-309 reverse primer
<400> 90
gaattggaca ccttggca 18
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-311 forward primer
<400> 91
ttgaggcggt gttggtag 18
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-311 reverse primer
<400> 92
atgtcatggc caactgct 18
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-313 forward primer
<400> 93
gaacaatgca gcctggaa 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GBSSR-VSspS-313 reverse primer
<400> 94
gctgcaatcg cattctct 18
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 서열번호 94로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열로 표시되는 SSR(simple sequence repeat) 프라이머쌍.
- 제1항에 있어서,
서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15와 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17과 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19와 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21과 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23과 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25과 26로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27과 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29와 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31과 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33과 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35와 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37과 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39와 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41과 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43과 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 44와 45로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47과 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49와 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51과 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53과 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55와 56으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 57과 58로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 59와 60으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 61과 62로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 63과 64로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 65와 66으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 67과 68로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 69와 70으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 71과 72로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 73과 74로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 75와 76으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 77과 78로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 79와 80으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 81과 82로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 83과 84로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 85와 86으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 87과 88로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 89와 90으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 91과 92로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 93과 94로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR 프라이머쌍.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 프라이머쌍은 베치(Vicia sativa spp. sativa)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
- (a) 베치 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고; 그리고
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는;
단계를 포함하는 베치의 유전적 다형성 검출 방법.
- (a) 베치 및 대조군 베치 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고;
(b) 상기 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고;
(c) 상기 베치 및 대조군 베치의 PCR 산물을 크기별로 분리하고; 그리고
(d) 상기 PCR 산물의 크기별 분리 결과를 비교하는;
단계를 포함하는 베치 유전자원 확인 방법.
- 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 베치의 다형성 검출용 키트.
- 제1항 또는 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 베치 유전자원 확인용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120132317A KR101480155B1 (ko) | 2012-11-21 | 2012-11-21 | 베치에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120132317A KR101480155B1 (ko) | 2012-11-21 | 2012-11-21 | 베치에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 |
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- 2012-11-21 KR KR20120132317A patent/KR101480155B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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