KR101994831B1 - 감귤 트리스테자 바이러스 저항성 유전자좌의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

감귤 트리스테자 바이러스 저항성 유전자좌의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트는 감귤 식물체의 CTV 저항성 유전형을 효과적으로 동정할 수 있어, CTV 저항성 감귤 또는 대목 품종을 만들기 위한 분자육종에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

감귤 트리스테자 바이러스 저항성 유전자좌의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도{Multiplex primer sets for determining genotype of locus resistant to Citrus tristeza virus and uses thereof}
본 발명은 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV)는 전 세계 감귤 산업에서 가장 심각한 병원성 바이러스 중의 하나이다. CTV는 2가지의 병증 즉, 급성 쇠약(quick decline)과 고접병(stem-pitting)을 야기하는데, 급성 쇠약은 쓴 오렌지(sour orange) 중의 하나인 향귤(C. aurantium L.) 대목에서 감염된 접수(scion)의 접목부 아래에서 체관부 괴사를 유발하여 나무를 죽음에 이르게 한다. 고접병은 대목에 관계없이 나무의 수세, 열매 크기와 품질 및 생산성을 감소시킨다. 주로 아메리카 대륙과 지중해 지역에서 1억 그루의 감귤나무가 CTV에 감염된 것으로 보고되었다. Severinia buxifolia (Poir.) Tenore, Swinglea glutinosa (Blanco) Merr. 및 Poncirus trifoliata (L.) Raf.의 3 종의 감귤 근연종만이 CTV에 저항성이 있는 것으로 보고되었다. 감귤 속(genus)에서도 일부 문단[C. maxima (Burm.) Merrill]이 CTV에 저항성이 있는 것으로 보고되었다. CTV 저항성 유전자는 단일 우성인 것으로 알려졌으며, Ctv로 명명되었다(Gmitter et al. (1996) Theor. Appl. Genet. 92:688-695). Fang과 Roose(1999, Hortsci. 34:334-335)는 문단[C. maxima (Burm.) Merrill]인 'Chandler' 푸멜로로부터 CTV에 저항성을 부여하며 Ctv와는 독립적으로 유전되는 또 다른 단일 우성 유전자인 Ctv2의 존재를 보고하였다.
Ctv 유전자의 클로닝을 위하여 탱자(P. trifoliata)를 활용한 유전적 교배 또는 여교배 집단들에 대한 벌크 분리자 분석(bulked segregant analysis)으로부터 CTV 저항성과 연관된 RAPD (random amplified polymorphic DNA), ISSR (inter simple sequence repeat), SCAR (sequence characterized amplified regions) 및 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 등과 같은 많은 분자마커들이 개발되었다. 그 후 CTV 저항성 유전좌위에 대한 유전 연관지도 작성 및 개발된 분자마커를 활용한 MAS(marker-assisted selection) 등의 노력이 이루어졌다.
Ctv 유전자의 클로닝을 위하여 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BCA) 라이브러리가 제작되었고, Ctv 유전좌위와 밀접하게 연관된 분자마커를 활용한 chromosome walking과 저항성 유전자 후보 마커에 의한 BAC 클론 탐색을 통해 Ctv 유전좌위를 커버하는 BAC 컨티그 맵이 작성되었다(Deng et al. (2001) Mol. Genet. Genomics 265:739-747). 최종적으로 Yang 등(2003, Plant Physiol. 131:482-492)은 Ctv 영역을 커버하는 BAC 컨티그들에 대해 282 kb의 염기서열을 결정하고, 유전자 예측을 수행하였고, 7개의 CC-NBS-LRR (coiled-coil-nucleotide-binding site-leucine-rich repeat) 유전자들로 구성된 R 유전자 클러스터를 발견하였고, 이들 R 유전자들 중에서 1개가 CTV에 대한 광범위 저항성을 부여하는 Ctv 유전자일 가능성을 제시하였다. 저항성(Ctv) 또는 감수성 대립유전자(ctv)를 포함하는 2개의 BAC 컨티그 서열이 'Thong Dee' 푸멜로(C. grandis L.)와 CTV-저항성 USDA 17-47 계통('Thong Dee' 푸멜로 x 탱자)에 대한 BAC 라이브러리로부터 분리되었다. Ctv와 ctv 컨티그 서열을 비교한 결과, 2개의 CC-NBS-LRR 유전자, 즉, R2와 R3 유전자는 저항성 대립유전자를 포함하는 컨티그 서열에서만 발견되었다. 이러한 결과는 이들 2개의 R 유전자가 강력한 Ctv 후보 유전자임을 제시하였다. 다른 연구 그룹에서 R 유전자들을 포함하여 10개의 Ctv 저항성 후보 유전자들을 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 CTV-감수성 그레이프푸르트(C. paradisi) 품종으로 도입한 결과, R2 유전자를 발현하는 형질전환 계통의 경우, 감염 개시가 일어나지 않거나 병증이 느리게 퍼져나가는 것이 관찰되었고, R1과 R4 유전자를 발현하는 계통들의 경우, 감염 개시가 일어났다가 소멸되는 것으로 관찰되었다. 이러한 기존의 결과들은 4개의 R 유전자(R1~R4)가 CTV 저항성에서 핵심 역할을 수행한다는 사실을 제시한다. 또 다른 그룹에서 CTV 저항성에 대한 주요 양적형질 유전자좌(quantitative trait loci, QTL)의 위치가 'Thong Dee' 푸멜로, 향귤 및 탱자 간에 보존되어 있고, 연관 그룹 4b에 위치함을 보고하였다. 이러한 이전의 결과들은 Ctv 유전좌위의 R 유전자들이 감귤 육종 프로그램에서 MAS를 위한 유용한 유전자 마커가 될 수 있음을 강력하게 제시하였다.
감귤 산업에서 CTV 저항성 형질의 중요성에도 불구하고, CTV 저항성 품종을 만들기 위한 분자육종 프로그램은 형질과 매우 밀접하게 연관된 강력한 분자마커의 부재로 인해 체계적으로 이루어지고 있지 않은 실정이다(Kim et al. (2016) J. Plant Biotechnol. 43:261-271). Ctv 유전좌위의 클로닝과 특성분석이 이루어졌음에도 불구하고, 현재까지도 감귤에서 Ctv 유전좌위의 체계적인 검색이 수행되지 않았다.
한편, 한국등록특허 제1667548호에는 '다중 RT-PCR을 이용한 감귤 바이러스 진단방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제1992-0009516호에는 '검은줄오갈병바이러스 조기진단을 위한 핵산 프로브, 그의 제작방법 및 그를 이용한 보독충 조기진단 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 감귤 트리스테자 바이러스 저항성 유전자좌의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 계통들의 조기 선발이 가능하도록 하기 위하여, Ctv 유전좌위를 구성하는 7개의 R 유전자들을 특이적으로 증폭하는 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 개발하였으며, 개발된 프라이머 세트가 감귤류 유전자원에서 CTV 저항성을 부여하는 Ctv 유전좌위에 있는 R 유전자 조성을 결정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 감귤 식물체에서 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 감귤에서 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 감귤류 식물체에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 감귤류 식물체의 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트를 사용하면, 감귤 식물체의 CTV 저항성 유전형을 효과적으로 동정할 수 있어, CTV 저항성 감귤 품종을 만들기 위한 분자육종에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 CTV 저항성을 부여하는 Ctv 유전좌위에서 7개 R 유전자들을 특이적으로 증폭하는 DNA-기반 분자마커의 개발(A)과 2개 프라이머 세트로 구성된 다중 PCR 체계의 확립 결과로, 프라이머 세트 A와 B는 각각 4개의 R 유전자(R1/CTV#4, R2/CTV#7, R3/CTV#8 및 R5/CTV#17)와 3개의 R 유전자(R4/CTV#11, R6/CTV#18 및 R7/CTV#21)를 증폭한다. M, 1 kb plus DNA ladder.
도 2는 14개 감귤 그룹에 속하는 대표 품종들로부터 Ctv 유전좌위에 있는 7개 R 유전자들의 다중 PCR 증폭 결과이다. 1, C. paradisi; 2, C. paradisi 'Flame'; 3, F. crassifolia 'Meiwa'; 4, Fortunella spp. 'Puchimaru'; 5, C. latifolia; 6. C. aurantifolia 'West Indian Lime'; 7. C. limon; 8, C. limon 'Lisbon Lemon'; 9, C. reticulata 'Ponkan'; 10, C. reticulata 'Daisy'; 11, C. maxima 'Banbeiyu'; 12, C. maxima 'Reinking'; 13, C. sulcata; 14, C. taiwanica; 15, C. sinensis 'Yoshida Navel'; 16, C. sinensis 'Valencia Late'; 17, C. sphaerocarpa; 18, C. junos 'Sibori'; 19, C. iyo 'Ootaniiyokan'; 20, Citrus hybrid 'Suneat'; 21, Citrus hybrid 'Nova'; 22, Citrus hybrid 'Lee'; 23, P. trifoliata; 24, P. trifoliata 'Flying Dragon'; 25, Citrumelo 'Swingle'; M, 1 kb plus DNA ladder.
도 3은 탱자와 탱자 유래 품종 'Flying Dragon'에서 Ctv 유전좌위에 있는 7개 R 유전자들에 대한 완전한 크기의 유전자들의 PCR 증폭 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 감귤 식물체에서 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 멀티플렉스 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제1 그룹의 프라이머 세트;와 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제2 그룹의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R1 유전자를, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R2 유전자를, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R3 유전자를, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R4 유전자를, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R5 유전자를, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R6 유전자를, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 Ctv의 R7 유전자를 각각 표적으로 한다(표 1 참고).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 14의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 14의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13의 올리고뉴클레오티드는 정방향(forward) 프라이머이고, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 올리고뉴클레오티드는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 감귤에서 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
감귤류 식물체의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
상기 단계에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 감귤류 식물체의 감귤 트리스테자 바이러스(CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 감귤류 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다. 바람직하게는 표적 서열의 증폭은 멀티플렉스 PCR을 통해 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서 "멀티플렉스(multiplex) PCR"은 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법으로서, 일반적으로 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 각각 4종 또는 3 종의 프라이머 세트를 하나의 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 정확하게 생성되는 특징이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 단일 튜브에 넣고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 또다른 단일 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 각각의 프라이머 세트가 다른 프라이머 세트에 영향을 받지 않고 독립적으로 각 PCR 산물을 효율적으로 생성할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기와 같이 각 PCR 산물 생성 결과를 토대로 감귤류 식물체의 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형을 동정할 수 있었다(도 2 참고).
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;는 각각 몰농도를 기준으로 1.8~2.2 : 0.8~1.2 : 1.8~2.2 : 0.8~1.2의 비율, 바람직하게는 2 : 1 : 2 : 1의 비율로 혼합된 것일 수 있고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;는 각각 몰농도를 기준으로 1.3~1.7 : 1.8~2.2 : 0.8~1.2의 비율, 바람직하게는 1.5 : 2 : 1의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
감귤류 유전자원 및 genomic DNA 추출
제주도 소재 2곳의 공공 연구기관(제주특별자치도농업기술원 및 농촌진흥청 국립원예특작과학원 감귤연구소)에서 보유하고 있는 감귤류 유전자원을 본 발명에 활용하였다. 감귤 잎 조직은 두 기관의 연구용 포장에서 생육중인 개체들로부터 채집하였다. 채집한 잎 조직을 흐르는 수돗물에 세척한 후, -80℃에 보관하였다. 게노믹 DNA는 Biomedic® Plant gDNA Extraction 키트(Biomedic Co., Ltd., Korea; www.ibiomedic.co.kr)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 추출한 DNA의 양과 질은 각각 DeNovix DS-11+ 분광광도계(DeNovix, Wilmington, DE, USA)와 아가로스 겔 전기영동을 통해 결정하였다.
PCR 증폭
CC-NBS-LRR 수용체들을 암호화하는 7개 R 유전자들의 특이적 증폭을 위한 프라이머는 표 1에 정리하였다.
Figure 112018097181672-pat00001
PCR 반응용액은 1 ㎕의 게노믹 DNA (10 ng·㎕-1), 각각 0.5 ㎕의 정방향과 역방향 프라이머(각각 10 pmol·㎕-1), 5 ㎕의 2x HSTM Taq mix (Dongsheng Biotech., Guangzhou, China) 및 3 ㎕의 멸균 증류수를 포함하도록 하였다. 각각의 R 유전자를 증폭하기 위한 PCR 조건은 다음과 같다: 초기 변성반응-95℃/5분, 신장반응(전체 35회 반복)-95℃/30초, 55℃/30초, 72℃/1분, 최종 신장반응-72℃/10분. 증폭된 PCR 산물은 EtBr (ethidium bromide)을 포함하는 1%(w/v) 아가로스 겔에서 전기영동 하였다. 다중(multiplex) PCR을 수행하기 위하여, 프라이머 세트는 두개의 그룹(A와 B)으로 나누었다. A와 B 그룹은 각각 4개와 3개 프라이머 세트로 구성되었는데, 2개 그룹에 대한 각 프라이머 세트의 혼합 비율은 하기 표 2와 같다. 다중 PCR 반응용액은 1 ㎕의 게노믹 DNA (10 ng-1·㎕), 4 ㎕의 프라이머 혼합물, 10 ㎕의 2x HSTM Taq mix (Dongsheng Biotech.) 및 5 ㎕의 멸균 증류수를 포함하도록 하였다. 다중 PCR 반응은 전술한 바와 동일하게 수행하였다.
다중 PCR을 위한 프라이머 세트 그룹
그룹 프라이머 세트 혼합 비율 (몰농도)
A 2 (R1/CTV#4과 R3/CTV#8) : 1 (R2/CTV#7와 R5/CTV#17)
B 1.5 (R4/CTV#11) : 2 (R6/CTV#18) : 1 (R7/CTV#21)
실시예 1. Ctv 유전좌위를 특이적으로 검출하는 다중 PCR 세트의 확립
Ctv 유전좌위를 특이적으로 검출하는 DNA-기반 분자마커를 개발하기 위하여, 공개된 데이터베이스(GenBank accession No. AF506028; Poncirus trifoliata citrus tristeza virus resistance gene locus, complete sequence)에서 얻은 7개 R 유전자의 염기서열에 대해 다중 염기서열 배열을 수행하였다(자료 미제시). 7개 각각의 R 유전자들은 디자인된 PCR 프라이머 세트에 의해 특이적으로 검출되었다(도 1A). Ctv 유전좌위에 있는 7개 R 유전자 세트의 효율적 검출을 위하여 2개 프라이머 세트로 구성된 다중 PCR 시스템이 고안되었다. A와 B 그룹 프라이머 세트들은 각각의 그룹에 해당하는 4개(R1/CTV#4, R2/CTV#7, R3/CTV#8 및 R5/CTV#17)와 3개(R4/CTV#11, R6/CTV#18 및 R7/CTV#21) 유전자들을 특이적이며 효율적으로 증폭 가능함을 보여주었다(도 1B).
실시예 2. 다중 PCR 세트를 이용한 감귤류 유전자원에서 Ctv 유전좌위에 있는 R 유전자 조성의 결정
감귤류 유전자원에 속하는 143개 자원 및 제주 재래귤 12개 자원에서 Ctv 유전좌위를 구성하는 7개 R 유전자들의 조성을 결정하기 위하여 2회의 독립된 다중 PCR을 수행하였다. 도 2는 14개 감귤 그룹별 2개의 대표 자원에서 Ctv 유전좌위에 있는 7개 R 유전자들에 대한 다중 PCR 결과를 보여준다. 표 3 내지 표 5는 14개 감귤 그룹에 속하는 143개의 감귤류 유전자원에서 4개의 주요 R 유전자들을 포함한 총 7개 R 유전자들의 조성을 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 분석 결과를 정리한 것이다. 표 6은 12개 제주 재래귤 자원에서 4개의 주요 R 유전자들을 포함한 총 7개 R 유전자들의 조성을 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 분석 결과를 정리한 것이다.
Figure 112018097181672-pat00002
Figure 112018097181672-pat00003
Figure 112018097181672-pat00004
다중 PCR 결과는 R7 (CTV#21) 유전자가 본 분석에 사용된 모든 감귤류 유전자원에 공통적으로 존재함을 보여주었다. R2 (CTV#7)와 R6 (CTV#18) 유전자는 탱자(trifoliate orange) 그룹에 속하는 2개의 자원에서만 검출되었다. R4 (CTV#11) 유전자는 그레이프푸르트(C. paradisi 'Golden Special') 또는 탄골(Citrus hybrid 'Setoka' 및 Citrus hybrid 'Harumi') 그룹에 속하는 3개의 자원에서만 검출되지 않았다. 금감과 레몬 그룹에 속하는 자원들은 7개 R 유전자들 중에서 3개의 유전자만을 가졌는데, 이는 다른 감귤 그룹들과 비교하여 가장 적은 R 유전자 숫자였다. 레몬 그룹의 경우, 5개 자원 모두 4개의 주요 R 유전자들 중에서 R4 유전자만을 보유하였다. 탱자와 이로부터 파생된 품종들이 CTV에 대한 강한 저항성으로 인해 감귤 산업에서 대목으로 광범위하게 사용되고 있다. 탱자 및 탱자의 교잡 품종 그룹에 속하는 3개의 유전자원들 중에서, 7개 R 유전자는 2개의 자원에서만(P. trifoliata와 P. trifoliata 'Flying Dragon') 검출되었다(표 5와 도 2). 그러나 그레이프푸르트(C. paradisi 'Duncan')와 탱자 간의 교배로부터 파생된 교잡 품종 시트루멜로 'Swingle' 품종에는 2개의 R 유전자가[R2 (CTV#7)와 R6 (CTV#18)] 존재하지 않았다(도 2). 탱자 그룹에 속하는 2개의 유전자원에서 Ctv 유전좌위의 7개 R 유전자가 온전한 형태로 존재하는지의 여부를 확인하기 위하여, P. trifoliata와 P. trifoliata 'Flying Dragon'에서 각 R 유전자에 대한 완전한 크기의 유전자 서열을 증폭하기 위한 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 결과, GenBank 데이터베이스(Accession No. AF506028)의 염기서열에서 예측된 바와 같이 각 R 유전자에 대해 완전한 크기의 증폭 산물이 검출되었다(도 3).
제주 재래귤은 저온 및 병(세균, 곰팡이)과 같은 환경 스트레스에 대해 저항성을 갖는 것으로 알려져 있다. 제주 재래귤이 CTV에 대한 저항성을 갖는지의 여부를 파악하기 위하여, 만다린과 비만다린 그룹으로 구분되는 12종의 재래귤에서 Ctv 유전좌위를 구성하는 7개 R 유전자의 조성을 결정하였다. 그 결과, R3 (CTV#8), R4 (CTV#11), R5 (CTV#17) 및 R7 (CTV#21)을 포함한 4개의 R 유전자가 2개의 그룹에서 공통적으로 검출되었다. 다만, 비만다린 타입인 '유자'에서만 R3 (CTV#8) 유전자가 검출되지 않았다. R1 (CTV#4) 유전자는 만다린 타입 2개 종('청귤', '동정귤')과 비만다린 타입 3개 종('당유자', '지각', '유자')에서 검출되었다. '청귤', '동정귤', '당유자' 및 '지각'은 Ctv 유전좌위에 있는 4개의 주요 R 유전자들 중에서 3개의 유전자를 보유하였다(표 6).
Figure 112018097181672-pat00005
<110> Biomedic Co.,LTD <120> Multiplex primer sets for determining genotype of locus resistant to Citrus tristeza virus and uses thereof <130> PN18339 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#4F <400> 1 ctcgttacat gggattattg gta 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#4R <400> 2 tgcaaatgcg tttggatttc ca 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#7F <400> 3 aatcgcaatc gatggtgctg t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#7R <400> 4 attgcatgcc caccgctgca 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#8F <400> 5 tgaaaggcct atcgagccag c 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#8R <400> 6 ccagttactt ttaggaaacc ttcc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#11F <400> 7 gcgacggcgc tctctttaac 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#11R <400> 8 agaatatcgg gatgactgtt catg 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#17F <400> 9 aaaggcaaca aatgagccgc c 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#17R <400> 10 ccattaaagt ctccacaagt tgc 23 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#18F <400> 11 tgagagtaca actaatttta ataggaa 27 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#18R <400> 12 gaacttgatg ttcttaacac ttgg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#21F <400> 13 ggagaccgaa gctggtcaac 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CTV#21R <400> 14 caatcaaaat cgtttggcac ttg 23

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 감귤 식물체에서 감귤 트리스테자 바이러스(Citrus tristeza virus, CTV) 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제1 그룹의 프라이머 세트;와 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제2 그룹의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 멀티플렉스 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 감귤에서 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형 결정용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라아제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 감귤류 식물체의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    상기 단계에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 감귤류 식물체의 CTV 저항성 유전자좌(Ctv)의 R 유전자의 유전형을 결정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표적 서열 증폭 단계의 멀티플렉스 PCR은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제1 그룹의 프라이머 세트;와 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 제2 그룹의 프라이머 세트를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020180117344A 2018-10-02 2018-10-02 감귤 트리스테자 바이러스 저항성 유전자좌의 유전형 결정용 멀티플렉스 프라이머 세트 및 이의 용도 KR101994831B1 (ko)

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