KR20020028869A - 곤충 바이러스 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물, 곤충 또는 다른 숙주에 유전자를 전이하는데 유용한 곤충 바이러스 벡터를 제공한다.

Description

곤충 바이러스 벡터 및 이의 용도{Insect Viral Vectors and Uses thereof}

<정부 권리에 관한 진술>

본 발명은 미국 정부로부터의 보조금 지원하에 이루어졌다 (환경보호국으로부터의 지원 번호 CR822902, 미 농림부로부터의 지원 번호 58-3148-6-029 및 94-34190-1204, 및 AGRICCREE로부터의 재정 번호 94-39210-0559). 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.

<배경 기술>

식물에서 유용한 화합물(예, 치료제, 화학적 공급원료, 화장품 및 기타 소비재)의 합성 및 농작물 개량을 위한 유전 공학(예, 유전 공학적 병소 저항성 식물)은 세계적으로 경제적 중요성 및 연구적 관심이 증가하고 있는 식물 생물공학의 두 분야이다 (Miele, 1997; Franken 등, 1997; Beachy, 1997; Ma 등, 1996; Estruch 등, 1997; Palmgren, 1997). 또한, 식물 게놈 라이브러리 및 EST 라이브러리의 입수가능성은 상업적 식물 생물공학의 잠재성을 변화시키고 있다 (Briggs 등, 1997; McKusick, 1997; 및 Evans 등, 1997). 특히, 많은 식물 특성, 예를 들면, 수확량, 수확 지수, 잡종강세 및 환경적 스트레스 내성이 여러 유전자들의 협력 작용에 의해 조절되기 때문에, 유전자 서열 태그(tag) 및 게놈 라이브러리에 대한 접근은 상업적으로 흥미있는 유전자를 확인하는 수단 또는 이에 대한 편리한 공급원을 제공한다.

유용한 화합물의 합성을 위해 선택된 유전자를 식물에 도입하기 위해, 여러 식물 바이러스, 예를 들면, 담배 모자이크 바이러스(TMV), 코우피 모자이크 바이러스(CpMV), 브로모바이러스(예, BMV) 및 포티바이러스(Yusibov 등, 1997; Reimann-Phillip 등, 1993; Porta 등, 1996; Jhonson 등, 1997; Kollar 등, 1993; Pruss 등, 1997) 벡터들이 개발되고 있다. 바이러스 벡터는 유전자 전이에 있어서, 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환 및 입자 충격법을 보충하는 여러가지 독특한 장점을 제공한다. 바이러스 벡터는 쉽게 조작되고, 간단한 접종에 의해 전이될 수 있으며, 감염된 식물에서 높은 수준으로 발현된다. 그러나, 현존하는 식물 바이러스 벡터 시스템에는 한계가 있다. 이들은 식물 숙주에서 미미한 질병에서부터 재앙에 이르는 질병을 일으킬 수 있다. 또한, 이들은 성질상 들판에서 한 식물에서 다른 식물로 자연스럽게 퍼지고, 어떤 경우에는 꽃가루 또는 종자를 통해 다음 세대까지 퍼질 수 있다. 게다가, 이들 바이러스의 다수는 숙주 범위가 좁고, 외부 유전자의 변화가능한 발현에 기인하여 유용성이 제한되어 있다.

노다바이러스(Nodavirus)는 곤충 유래의 작고 외피로 싸이지 않은 20 면체의 바이러스이다. 모기(Culex tritaeniorhynchus, Aedesa egypti, Culex tarsalis, Aedes albopictus 및 Toxorhynchites amboinesis), 옥수수 가루(Indian meal) 나방 및 블랙 카펫(black carpet) 딱정벌레(Plodia interpunctella: Lepidoptera 및 Attagenus piceus: Coleoptera)의 유충, 왁스 나방 (Galleria mellonella: Lepidoptera) 및 꿀벌(Apis mellifera)의 유충은 노다바이러스에 의해 감염되는 곤충 숙주의 일부이고, 이들의 바이러스 감염은 마비 및 치사를 일으킨다 (Tesh, 1980; Bailey 및 Scott, 1972). 노다바이러스의 예로는 블랙 비틀 바이러스(BBV), 플록 하우스 바이러스(FHV), 불라라 바이러스(BOV) 및 노다무라 바이러스(NOV)가 포함된다. 이들 바이러스는 고등 또는 하등 동물의 유일하게 알려진 메신저 센스(messenger sense)의 이분 게놈 RNA 바이러스이다 (Hendry, 1991 참조). 그러나, 이분 게놈 식물 바이러스는 알려져 있지만, 게놈 부분이 별도의 비리온에서 캡시드화(encapsidation) 되어 있다 (Bruening, 1997).

FHV는 고등 동물 세포에서 전혀 증식하지 못하나, 노다바이러스는 그의 천연 숙주가 곤충이지만, 동물에서 증식할 수 있고 (예를 들면, NOV는 마우스 및 가능하게는 돼지도 감염시킬 수 있음. Bailey 및 Scott, 1972; Scherer 및 Hurlbut, 1967; Scherer 등, 1968 참조), 최근에는 해양 어류에서 발견되었다 (Mori 등, 1992; Nishizawa 등, 1995; Frerichs 등, 1996). 게다가, FHV는 질병을 일으키지 않고 식물에서 쉽게 증식한다 (Selling 등, 1990). FHV는 잎을 기계적으로 마찰시킴으로써 식물에 도입될 수 있거나, 또는 바이러스를 함유하는 용액을 잎에 분무함으로써 도입될 수 있다. 그러나, FHV는 감염 부위로부터 거의 또는 전혀 이동하지 않는다.

따라서, 식물에 질병을 일으키지 않으면서 목적하거나 또는 미리 선택된 핵산 단편 또는 서열을 식물에 전신 또는 국소 전이하는 벡터의 필요성이 존재한다.

<발명의 개요>

본 발명은 유전자를 식물 및 동물(예, 곤충)에 전달하는데 유용한 재조합 바이러스 핵산 유전자 전이 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 단일 스트랜드 선형 RNA를 포함하는 이분 게놈을 갖는 바이러스, 예를 들면 노다바이러스 (Hendry, 1991), 디안트로바이러스, 토브라바이러스(Mattews, 1991) 등으로부터 유래된다. 따라서, 본 발명은 연결된 핵산 서열을 포함하는, 생물학적으로 활성인 유전자 전이 벡터를 제공한다. 연결된 핵산 서열은 바이러스 핵산의 5' 말단 (예, 노다바이러스 RNA-1 및 RNA-2의 5' 말단)으로부터 유래된 핵산 서열, 관심있는 핵산 단편 하나 이상을 포함하는 핵산 서열, 및 바이러스 핵산의 3' 말단 (예, 노다바이러스 RNA-1 및 RNA-2의 3' 말단)으로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 관심있는 핵산 단편을 포함하는 핵산 서열은 바람직하게는 식물 바이러스 이동 단백질, 식물 바이러스 외피 단백질 (예, 선천성 외피 단백질, 또는 선천성 외피 단백질과 다른 성질을 갖는 변형된 외피 단백질), 성장 호르몬, 독소 (예, 옥신 또는 포토랍두스(Photorhabdus) 독소와 같은 반치사(sublethal) 독소), 사이토카인, 질병 저항성, 충해 저항성, 웅성 불임성, 백신 생산에 유용한 바이러스의 표면상의 항원성 부위, 또는 살충 저항성을 코딩하고(하거나), 합성 유전자, 식물 성질을 개질하기 위한 표적화 안티센스 RNA 서열/효소, 표지 유전자 또는 선택 표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 단편은 식물에서 발현을 증진시키기 위해 변형된 서열을 포함한다. 핵산 단편(들)은 바람직하게는 융합 폴리펩티드를 생성하도록 연결된다. 별법으로는, 단백분해 부위를 코딩하는 핵산 서열을 각 핵산 단편 사이에 도입할 수 있다. 임의적으로는, 각 핵산 단편은 전사 조절 단위(예, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 벡터는 다른 동물 바이러스 벡터, 식물 바이러스 벡터 또는 다른 곤충 바이러스 벡터, 예를 들면 담배 모자이크 바이러스 벡터(Beachy, 1997), 바쿨로바이러스 벡터 (Schneemann 등, 1993) 또는 우두 바이러스 벡터(Ball, 1992)와 결합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 벡터는 벡터의 5' 및 3' 말단에 노다바이러스 핵산을 포함하고, 식물 바이러스 이동 단백질(MP)을 코딩한다. MP는 식물 세포에서 식물 세포로의 바이러스 또는 바이러스 핵단백질(유전 물질 및 "담체 단백질")의 전위를 돕는다. 따라서, 본 발명의 벡터를 갖는 식물 세포에서 MP의 발현은 벡터 서열의 주위 식물 세포로의 전이를 초래하고, 이것은 이들 서열의 국소적 또는 일시적 전이 및 발현을 가져온다. 따라서, 일시적 또는 국소적 발현이 바람직하고 충분한 경우(고효율의 선별/게놈에서와 같이), 본 발명의 벡터의 전이는 형질전환법에 비교하여 발현을 선별하는데 드는 시간을 현저히 감소시킬 수 있다. 게다가, 노다바이러스, 디안토바이러스 및 토브라바이러스는 잎의 간단한 기계적 마찰에 의해 전이될 수 있기 때문에, 이들 바이러스 벡터는 형질전환형을 제조할 필요없이 현존하는 다양한 식물에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 형질전환 농작물의 제조에 요구되는 시간 소모적이고 고가의 방법을 회피하고, 형질전환법과 관련된 종자 은행 및 생식질 컬렉션(collection)이 외부 유전자로 오염될 잠재성을 회피하는 농작물 개량법을 제공한다.

본 발명은 미리 선택된 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 감염성 바이러스 입자를 생성하지 않으면서 미리 선택된 핵산서열을 발현하기에 유효한 양의 본 발명의 벡터를 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 숙주가 생물인 경우, 감염성 바이러스의 부재는 숙주(예, 곤충 또는 사람)에 대한 어떠한 예기치않고 바람직하지 못한 결과를 가져올 위협을 완전히 제거한다. 바람직하게는, 식물 숙주에 있어서 상기 접촉은 예를 들면, 잎의 기계적 마찰을 포함한다.

본 발명은 또한 유전자를 숙주 세포에 전달하는데 유용한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물의 한 실시태양은 (a) 바이러스 중합효소(복제효소)를 코딩하는 핵산, 예를 들면, 노다바이러스 RNA-1 일정량, 및 (b) 재조합 핵산 일정량을 포함한다. 재조합 핵산은 바이러스 핵산의 5' 말단, 예를 들면, 노다바이러스 RNA-2의 5' 말단으로부터 유래된 핵산 서열; 관심있는 핵산 단편 하나 이상을 포함하는 핵산 서열; 및 바이러스 핵산의 3' 말단, 예를 들면, 노다바이러스 RNA-2의 3' 말단으로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 조성물 중에 바이러스 복제효소를 코딩하는 핵산(예, 노다바이러스의 RNA-1)의 존재에 의해 복제효소를 코딩하는 핵산과 함께 숙주 세포로 전이된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 별법으로, 복제효소는 숙주 세포에 의해 코딩될 수 있다. 복제효소를 코딩하는 바람직한 핵산 서열은 FHV RNA-1을 포함한다. RNA 분자는 예를 들면, T7, T3 또는 SP6 중합효소를 사용하거나, 또는 비리온 또는 본 발명의 RNA 분자, DNA 분자 또는 조성물에 감염되었거나 접촉된 배양된 세포 (예, 설치류, 초파리 또는 곤충 세포)로부터 RNA를 단리함으로써 시험관 내에서 제조할 수 있다.

관심있는 유전자의 전신 전달을 목적으로 하는 경우, 본 발명의 조성물 중핵산 서열의 하나는 바람직하게는 CP를 코딩하고, 임의적으로는 또한 MP를 코딩하여 벡터가 관다발 조직(체관부)으로 전이된다. CP 및 MP의 발현에 의해 목적하는 화합물을 높은 수율로 합성할 수 있고, 모든 식물 조직에 질병 저항성을 부여할 수 있다. 하기에 기술하는 바와 같이, 담배 모자이크 바이러스의 30 kDa 이동 단백질 (TMV MP; Doem 등, 1992) 및 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스(RCNMV; Xiong 등, 1993)의 외피 단백질을 포함하는, 식물의 전신 감염을 위한 FHV 벡터를 제조할 수 있다. 식물을 통한 벡터의 이동을 모니터하기 위해, 표지 유전자, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP, Epel 등, 1996; 및 Casper 등, 1996)을 코딩하는 유전자를 벡터에 도입할 수 있다. GFP는 원래 해파리 Aquorea victoria(Av)로부터 단리된 238 개의 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다. 이것은 395 nm에서 최대 흡광도를 갖는 청색광을 흡수하고, 590 nm에서 피크 방출을 갖는 녹색광을 방출한다. GFP가 원핵 또는 진핵 세포에서 발현될 때, 이것은 청색광에 의한 여기시 강한 녹색 형광을 생성할 수 있고, 이 형광은 숙주로부터 어떠한 부가의 유전자 산물도 요구하지 않는다.

따라서, 본 발명의 벡터 및 조성물을 사용하여 목적하는 약리학적 화합물 또는 기타 약물(예, 곤충 저항성을 코딩하는 약물)을 합성할 수 있고, 비특성화된 유전 물질(예, 유용한 형질을 코딩하는 살충제 저항성 식물 또는 곤충 핵산으로부터의 비특성화된 유전 물질)을 고효율로 선별할 수 있다. 예를 들면, 해충 저항성 식물로부터의 비특성화된 유전 물질을 본 발명에 벡터에 도입하고, 그로부터 RNA를 발현시켜서, 본 발명의 조성물을 제조한다. 해충 피해를 받기 쉬운 식물을 바람직하게는 분무에 의해 본 발명의 조성물에 노출시킨 다음, 해충 감염에 노출시킨다. 저항성의 징후를 나타내는 잎으로부터, 도입된 유전 물질이 해충 저항성을 코딩할 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 곤충 및 사람의 발생 유전자, 조절 유전자, 및 약물 저항성 및 독성을 나타내는 유전자를 위한 빠른 분석 시스템을 제공한다.

재조합 단백질(예, 제약학적 화합물)을 발현시키고 숙주 식물로부터 단리하고자 하는 경우, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 마찰 또는 분무에 의해 식물에 적용된다. 예를 들면, 식물의 접촉 면적은 예를 들면, 잎이 상업적으로 어떠한 가치도 없는 괴경과 같은 식물의 잎만을 조성물에 노출시킬 수 있도록 하는 정도이다. 일단 단백질이 식물에서 발현되면, 재조합 단백질(들)을 식물 또는 그의 조직으로부터 단리하고(하거나) 정제할 수 있다.

또한, 본 발명은 숙주 세포 또는 숙주에서 미리 선택된 핵산 분자를 발현시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 숙주 세포 또는 숙주를 본 발명의 조성물 일정량과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 조성물은 재조합 바이러스, 단리된 비리온 RNAs, 시험관내에서 제조된 RNA 전사체, 또는 이들의 모든 혼합물을 포함한다. 이어서, 관심있는 유전자의 발현을 검출하거나 또는 측정한다. 따라서, 본 발명은 게놈이 본 발명의 벡터로 증대되는 형질전환 숙주를 추가로 제공한다.

본 발명의 유전자 전달 벡터 및 조성물을 위한 바람직한 식물 숙주는 형질전환 및 비형질전환 외떡잎류 및 쌍떡잎류, 예를 들면, 브라시카(Brassica), 사탕 옥수수, 오이, 보리, 케노포디움(예, Chenopodium hybridum), 코우피, 담배 및 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 등을 포함한다. 바람직하게는, 식물 숙주는 노다바이러스에 의해 감염될 수 있다.

<도면의 간단한 설명>

도 1은 플록 하우스 바이러스(FHV)의 게놈 조직임. FHV는 직경이 30 nm인 이분 게놈을 갖는 작은 20면체의 바이러스이다. RNA-1은 캡핑되어 있고, 길이가 약 3.1 kb이며, 약 112 kDa의 복제효소를 코딩한다. RNA-2는 캡핑되어 있고, 길이가 약 1.4 kb이며, 외피/캡시드 단백질의 약 44 kDa 전구체를 코딩한다. RNA-3도 캡핑되어 있고, 길이가 약 0.39 kb이며, 약 11.6 kDa의 단백질을 코딩한다. 3' 말단의 굵은 점은 이 말단이 차폐 또는 차단되어 있음을 나타낸다. RNA-1 및 RNA-2는 동일 비리온에서 캡시드화된다.

도 2는 FHV RNA-2 및 결손 간섭 RNA DI-634의 구조임. DI-634는 RNA-2의 634 bp 자발적 결실 생성물이며, 효율적으로 복제되고 비리온으로 압축된다. I, II, III로 표시된 단편은 FHV RNA-2의 5' 말단, 중간 및 3' 말단으로부터의 서열에 대응한다. 얇은 선은 RNA-2로부터 결실된 영역을 나타낸다.

도 3은 FHV RNA-2의 복제에 요구되는 시스 작용 서열임. (A) 굵은 선은 FHV RNA-2의 cDNA 클론의 전체 길이 또는 결실 돌연변이체에 존재하는 cDNA 서열을 나타낸다. 얇은 선은 각 구조체의 우축에 표시한 결실(△) 염기를 나타낸다. 문헌[Zhong 등, 1992]에 기술된 바와 같이, 전체 길이의 클론(100 %)에 대한 결실 돌연변이체의 복제 효율을 측정하였다. 매우 빈약한 복제 효율을 갖는 돌연변이체를 화살표로 표시하였다. (B) 굵은 선은 FHV RNA-2의 복제에 필수적인 세 개의 단편을 나타낸다.

도 4는 노다바이러스의 RNA-2에 있는 가공의 캡시드화 서열의 컴퓨터로 예측되는 머리핀 구조임. FHV, BBV, BOV 및 NOV RNA-2의 총 길이는 각각 1400, 1399, 1305 및 1355 염기이다 (Dasgupta 및 Sgro, 1989).

도 5는 식물에서 FHV 합성을 검출하기 위한 과정을 나타내는 모식도임. 문헌[Selling 등, 1990]에 기술된 바와 같이, 다수 식물종의 잎 하나를 FHV RNA를 사용하여 접종하였다. 용균반 분석에 의해 검출하였을 때, 보리, 케노포디움, 코우피 및 니코티아나 벤타미아나의 접종된 잎으로부터 유래된 대부분의 균질화액에서 FHV 감염도가 발견되었다.

도 6은 RCNMV의 게놈 조직임. RNA-1 및 RNA-2를 개방형 상자로 동정되는 ORF를 사용하여 굵은 선으로 도식화하였다. ORF의 위 또는 아래의 숫자는 ORF 개시 및 종결 코돈의 위치를 나타낸다. RNA-1에서 리보좀 틀이동 영역은 비스듬한 상자로 표시하였다. 예상되었으며 관찰된 단백질 생성물은 검은 상자로 나타내었다. RCNMV 단백질의 공지된 기능(Matthews, 1991)은 각 단백질의 아래에 기재하였다.

도 7은 벡터 구성, RNA 제조, 접종 및 검출을 위한 일반적인 전략임.

도 8은 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 노다바이러스 RNA-2 벡터의 구성임. NsiI 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 TMV cDNA 클론 p30BGFPC3로부터 GFP 서열을 증폭하였다. NsiI을 사용하여 상기 PCR 생성물 및 FHV cDNA 클론 pBWD2를 소화시키고, 연결 및 형질전환함으로써 FHV RNA-2:GFP 키메라 pF2G3를 얻었다. 뉴클레오티드 위치 및 특이 제한 부위를 표시하였다.

도 9는 담배 모자이크 바이러스 이동 단백질(TMV MP) 및 GFP를 코딩하는 노다바이러스 DI 벡터의 구성임. Sac I 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 TMV cDNA 클론 p30BGFPC3로부터 GFP 및 MP 서열을 증폭하였다. Sac I 을 사용하여 상기 PCR 생성물 및 FHV DI cDNA 클론 pD1634를 분해하고, 연결 및 형질전환함으로써 FHV DI:TMV MP:GFP 키메라 pFdTmG3를 얻었다. 뉴클레오티드 위치 및 특이 제한 부위를 표시하였다.

도 10은 TMV MP, 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스 외피 단백질(RCNMV CP) 및 GFP를 코딩하는 노다바이러스 DI 벡터의 구성임. 상술한 바와 같이, RCNMV cDNA 클론 pRC1으로부터 RCNMV 외피 단백질 서열을 증폭하고, pFdTmG3의 MP와 GFP 서열 사이에 삽입하여 pFdTmRcG3를 얻었다. T3=T3 프로모터; T7=T7 프로모터; RBZ=리보자임.

도 11은 니코티아나 벤타미아나 식물상에서 FHV 벡터 구조체의 발현을 모니터하는 것임. T3 또는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 제조한 RNA 전사체로 잎을 마찰시킴으로써 잎을 접종하였다. 모든 식물은 FHV 복제효소원으로서 FHV RNA-1을 사용하여 공동 접종하였다.

도 12는 TMV MP 또는 RCNMV MP 형질전환 식물의 접종된 및 이차성 니코티아나 벤타미아나 잎으로부터 추출된 RNA의 RT-PCR임. 레인 1; 주형으로 사용된 정제된 FHV RNA-2 (800 ng). 레인 2; 위(완충액) 접종된 잎. 레인 3; 야생형(비형질전환형) 식물의 접종된 잎. 레인 4; 야생형 식물의 비접종된 이차성 잎. 레인 5; TMV MP 형질전환형 식물의 접종된 잎. 레인 6; TMV MP 형질전환형 식물의 비접종된 이차성 잎. 레인 7; RCNMV MP 형질전환형 식물의 접종된 잎. 레인 8; RCNMV MP 형질전환형 식물의 비접종된 이차성 잎. 레인 9; 표지. 화살표는 전체 길이의 FHV RNA-2 (1.4 kb)에 대응하는 PCR 생성물을 나타낸다. TMV MP 및 RCNMV MP는 FHV를 비접종 이차성 잎으로 이동시켰다.

도 13A는 GFP를 발현하는 니코티아나 벤타미아나 식물의 잎임. TMV MP를 발현하는 2주령의 형질전환형 식물을 TMV 발현 벡터 30BGFPC3 (TMV 복제효소, 30 kDa MP, GFP 및 CP를 함유하는 10.4 kb 플라스미드)로부터의 RNA 전사체 1 ㎍을 사용하여 접종하였다. 접종 후 10일에 식물을 두 개의 장파장 UV 램프 사이에 놓고, 소니 3CCD 컬러 비데오 카메라(모델 DXC-960MD)를 사용하여 촬영 하였다.

도 13B는 GFP를 발현하는 니코티아나 벤타미아나 식물의 사진임. 조건은 미놀타 마맥섬(Minolta MaMaxxum) 7000i 카메라 및 1000 ASA 코닥 엑타크롬(Kodak Ectachrome) 필름을 사용하여 촬영한 것을 제외하고는, 도 13A와 동일하였다. 4초 동안 필름을 노출시켰다.

도 14는 도 13에서 기술한 것과 동일한 조건하에서 성장시키고 촬영한 비접종 니코티아나 벤타미아나의 잎임. 잎은 UV 빛 때문에 보라색으로 보이고, 어떠한 녹색 형광도 관찰되지 않았다는 것을 주목한다.

도 15는 전신 후천성 저항 유전자 SAR 8.2를 함유하는 플라스미드 pCGN1788A의 지도임. BamHI-Sst1 단편(529 bp)을 FHV 기재의 벡터 pFdTmRcG3에 도입하였다.

도 16은 4개의 포토랍두스 독소(Pht) 좌위:tca, tcb, tcc 및 tcd의 지도임. 유전자 붕괴에 사용되는 제한 부위를 각 좌위 아래에 나타내었다. 빗금은 추정 단백질분해효소 절단 부위를 둘러싸는 TcaB, TcbA 및 TcdA 사이에 유사성을 갖는 영역이 있음을 나타낸다. 좌위 tca 및 tcd로부터의 단편(Bowen 등, 1998)을 본원 발명의 FHV 벡터 pFdTmRcG3로 서브클로닝하고, 독성에 대해 시험하였다.

도 17은 식물에서 FHV의 수율임. 단일층의 초파리 세포 상에서 잎 균질화액을 용균반 분석함으로써 수율을 측정하였다. 수율은 잎 조직 mg (100 내지 500 mg) 당 용균반 형성 단위로 표현하였다. 비형질전환(야생형) 식물에 비교하여 형질전환형 니코티아나 벤타미아나에서 100 배 증가하였음을 주목한다.

<발명의 상세한 설명>

I. 노다바이러스 복제 및 전이

A. 노다바이러스의 게놈 조직

대표적인 노다바이러스인 FHV의 게놈 전략을 도 1에 나타내었다. RNA-1 및 RNA-2는 단일 비리온 내에서 캡시드화되는 센스 RNA이다. FHV RNA-1(3106 염기)은 중합효소(복제효소) 활성을 담당하는 A로 지칭되는 단백질(112 kDa)을 코딩한다. FHV RNA-2(1400 염기)는 알파라고 하는 비리온 캡시드 전구체(44 kDa)의 합성을 지시하며, 이것은 성숙 외피 단백질(베타라고 함; 39 kDa) 및 감마라고 하는 4.4 kDa의 소단백질로 가공된다. FHV로 감염된 세포는 B라고 하는 단백질(11.6 kDa)을 코딩하는 부가의 전령 RNA-3 (389개 염기)을 생성한다. RNA-3은 비리온으로 캡시드화되지 않는 RNA-1의 3' 말단에 함유된 서브게놈(subgenome) 전령 RNA이다. 단백질 B는 중합효소 기능에 관련되어 있다. 모든 노다바이러스 RNA는 5' 말단에서 캡핑(m7GpppGp)되고, 어떠한 다른 공지된 RNA 바이러스와는 달리, 3' 말단은 심지어변성 조건하에서의 변형에 대한 저항성에 의해 입증되는 바와 같이 차폐 또는 차단되어 있다 (Dasgupta 등, 1984).

두 게놈 RNA의 cDNA 클론은 입수가능하고, 이들 클론으로부터 제조된 시험관내 RNA 전사체는 감염성이고, 진정한 자손 비리온을 생성한다 (Dasmahapatra 등, 1986).

B. 지속성 감염 및 DI RNA의 생산

시험관 내에서, 노다바이러스는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 세포에서 매우 잘 성장하고 (Friesen 및 Rueckert, 1984), 용균반(plaque) 형성에 의해 정량적으로 분석할 수 있다 (Selling 및 Rueckert, 1984). 드로소필라 멜라노가스터 세포를 낮거나 높은 감염 다중도(m.o.i)로 즉, 0.1 내지 10으로 FHV를 사용하여 감염시킬 때, 바이러스는 3 일 이내에 심한 세포변성 효과 및 세포 치사를 일으킨다. 그러나, 감염 주기의 각 라운드에서 감염된 세포의 약 1 %가 생존한다. 이들 세포는 FHV, 및 BBV (Longworth 및 Archibald, 1975) 및 BOV (Reinganum 등, 1985)와 같은 다른 관련 노다바이러스에 의한 중복감염에 대해 저항성이 있다. 이들 감염된 세포는 유사한 효율로 신선한 세포를 용균할 수 있는 바이러스의 공급원이다. 따라서, 이들 세포는 비용균 양식으로 지속적으로 감염된다.

이들 지속적으로 감염된 세포주 10 개로부터의 바이러스 RNA를 악티노마이신 D의 존재하에³H-우리딘으로 표지하고, 아가로오스 겔 상에서 분석하였다. 방사선사진으로부터 10 개의 세포주 중 4 개 이상에서 게놈 RNA 이외에 소 RNA가 관찰되었다 (Selling, 1986). 상기 더 작은 RNA 중 일부는 지속적으로 감염된 세포로부터 정제된 비리온에서 발견되었으며, 이로부터 이들 더 작은 RNA가 복제 및 압축(packaging)에 대한 신호를 함유하고 있다는 것을 알 수 있다. 이들 RNA 및 비리온 RNA를 사용하여 신선한 초파리 세포를 감염시킬 경우, 야생형 FHV에 비교하여 용균반 형성이 1,000배 억제되었다. 이것은 이들 RNA가 경쟁하여 게놈 RNA의 복제를 간섭하고, 아마도 이들 RNA가 복제 및 캡시드화에 대한 더 양호한 주형일 것이라는 것을 암시한다. 이들 RNA는 결손 간섭(DI) RNA 분자로 지칭된다.

C. DI RNA의 구조

DI RNA의 효소적 서열화(Dasgupta 등, 1980)는 이들이 비리온 RNA의 3' 및 5' 말단과 동일한 서열을 보유한다는 것을 나타내었다. FHV RNA-1(Dasmahapatra 등, 1985) 및 RNA-2 서열(Dasgupta 및 Sgro, 1989)의 말단에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 pUC13 및 pBS+ 벡터에서 cDNA 클론을 제조하였다. 이어서, 서열화효소(유나이티드 스테이츠 바이오케미컬즈(United States Biochemials), Kraft 등, 1988)를 사용하여 디데옥시 뉴클레오티드 사슬 종결법에 의해 이들 cDNA를 서열화하였다. 7 개의 DI RNA 분자를 서열화하였다. 이들 중 6개는 게놈 RNA-2로부터 유래하였고, 하나는 게놈 RAN-1으로부터 유래하였다. RNA-2로부터 유래된 DI RNA는 구조에 따라 세개의 군으로 분류하였다. 도 2에 나타낸 가장 간단한 형태의 DI(DI-634)는 RNA-2에서 2개의 주요 결실에 기인하였다. 이것은 RNA-2의 5' 말단으로부터 처음 249 개의 염기, 중간(염기 517 내지 728) 및 3'말단 (염기 1228 내지 1400)을 보유하였다. 서열의 재배열은 없었다.

다른 유형의 RNA-2 유래 DI RNA 서열은 더 복잡한 구조를 가졌다. 이들은 게놈 RNA의 5' 말단으로부터의 처음 15 또는 41개 염기, 이어서 게놈 RNA-2의 중간으로부터 유래된 염기 75 내지 249 및 염기 517 내지 728을 보유하였다. 이들 DI 분자의 3' 절반은 RNA-2의 5' 및 3' 말단으로부터의 서열 재배열을 포함하였다. 3' 말단에 있는 48 개의 염기(1353 내지 1400)는 게놈 RNA-2와 대응직선을 이루었다.

또다른 형태의 RNA-2 유래 DI는 5' 말단으로부터 연속적인 249개 염기를 보유하였고, 나머지 구조는 상술한 재배열을 포함하였다.

RNA-1로부터 유래된 DI RNA는 게놈 RNA의 세 부분, 즉, 두 개의 말단 및 중간을 보유하였다. 흥미롭게도, 구조의 변화에도 불구하고, 상기 DI RNA 모두는 대응 게놈 RNA 길이의 약 절반으로 길이가 유사하였다. 예를 들면, 게놈 RNA-2로부터 유래된 DI는 길이가 630 내지 680개 염기였고, RNA-1으로부터 유래된 하나의 DI는 길이가 1395개 염기였다 (게놈 RNA-1 및 RNA-2는 각각 3106 및 1400개 염기로 됨).

D. FHV RNA-2의 복제 및 캡시드화에 대한 신호

일련의 결실 및 시험관내 돌연변이유발을 통해 DI RNA 뿐만 아니라 FHV RNA-2의 cDNA 클론을 변경하고, 이의 복제 및 캡시드화 활성을 분석하였다. 도 3은 RNA-2의 cDNA 클론으로부터 구성된 결실 돌연변이체를 나타내는 도식도이다. 이들 돌연변이체로부터 유래된 전사체를 사용하여 초파리 세포를 감염시키고, 12 시간후 합성된 RNA를 측정하였다 (Zhong 등, 1992). 5' 말단으로부터 연속적인 60개 염기, 147개 염기의 내부 영역(염기 470 내지 616) 및 3' 말단에서의 마지막 51개 염기 (염기 1350 내지 1400)가 FHV RNA-2의 효율적인 복제에 중요한 것으로 발견되었다 (패널 B; 각각 단편 I, II 및 III). 이들 영역이 결실되었을 때, 시험관내 RNA-2의 복제가 매우 불량하였다 (도 3A에서 화살표로 나타냄).

DI RNA (도 2에 나타낸 DI-634)를 사용하여 캡시드화 신호에 대한 유사한 연구를 한 결과, RNA-2의 32개 염기의 영역(염기 186 내지 217)이 비리온으로의 효율적인 압축을 위해 요구된다는 것을 발견하였다. 이 영역의 결실은 DI RNA의 비리온으로의 압축을 완전히 제거하였으나, 복제에는 영향을 미치지 않았다. 이 서열에 대해 도 4에 나타낸 머리핀 구조의 형성이 예상되었고, 모든 노다바이러스 RNA-2는 이러한 구조를 보존한다 (Zhong 등, 1992). 유사한 머리핀 구조가 박테리오파아지 Qβ및 R17, 효모의 L-A 바이러스 및 코로나바이러스에서 압축 신호로 또한 사용되는 것이 발견되었다.

E. 식물에서 FHV의 번식

숙주 식물에서 바이러스의 번식은 다양한 조직에서 바이러스의 이동/복제를 포함한다. 바이러스는 감염 후 손상된 세포에 들어가서 자신의 단백질을 합성한다. 비구조적 바이러스 코딩 단백질 중의 하나인 이동 단백질(MP)은 감염이 관다발 조직에 이를 때까지 감염성 핵단백질을 세포에서 세포로 이동시킨다.

관다발 또는 장거리 이동으로 알려진 제2 단계 중, 전체 식물이 감염된다. 이를 달성하기 위해, 감염성 핵단백질이 관다발 조직에 들어가서, 관다발 조직 내에서 이동하고, 관다발 조직을 떠나야 한다. 연구에 의하면, MP가 세포 대 세포 이동을 위해 요구되나, MP 단독으로는 전신 감염을 일으키기에 충분하지 않다. 대부분의 식물 바이러스에서, 외피 단백질(CP) 및 숙주 인자가 장거리 이동에 필요하다 (Seron 등, 1996; Deom 등, 1992 참조).

FHV가 식물에서 복제하는지의 여부를 결정하기 위해, FHV RNA를 사용하여 식물을 접종시킨다. 보리 (Hordeum vulgare), 코우피 (Vigna sinensis), 케노포디움 (Chenopodium hybridum), 니코티아나 벤타미아나 (Selling, 1990), 쌀, 알팔파, 사탕 옥수수, 브라시카, 오이 및 아라비돕시스의 온전한 식물(도 17; 데이타는 나타내지 않음), 및 FHV RNA에 노출된 보리 및 담배 잎(도 5 및 표 1)으로부터 유래된 원형질체에서 새로 합성된 비리온이 검출되었다.

바이러스 노출 후 비리온 생성 (Selling, 1990)

종	용균반을 생성하는 균질화액의 비율
보리 (H. vulgare)	6/7
케노포디움 히브리둠	6/6
코우피 (V. sinensis)	7/7
니코티아나 벤타미아나	30/30
담배 (N. tabacum)	1/8

보리 원형질체에서, 바이러스의 수율은 단위 원형질체 당 130 pfu였고, 이것은 원형질체 중 최소 약 3%가 비리온을 합성한다는 것을 나타낸다. 식물에서 생성된 비리온은 새로 합성된 캡시드 단백질 뿐만 아니라 새로 합성된 RNA를 함유하였다. 시간의 경과에 따른 실험에서, 보리 원형질체에서 FHV의 합성은 필적하는 감염 조건하에서 FHV의 자연 곤충 세포주 숙주(드로소필라 멜라노가스터)에서 발견되는 것에 매우 필적하다는 것을 나타내었다 (Selling 등, 1990). 보리 원형질체 1 g으로부터 FHV 약 1.4 mg이 생성되었으며, 이것은 매우 높은 수준의 발현을 나타낸다.

두 개의 접종된 보리 잎에서, FHV 수율은 잎 당 180 및 3800 pfu (초파리 세포에 대한 표준 FHV 용균반 분석을 기초로 함)였다. FHV 감염 케노포디움, 코우피 및 니코티아나 벤타미아나에서 관찰된 최대 평균 수율은 각각 잎 당 3.4 x 10⁵, 4.2 x 10⁵및 1.2 x 10⁵pfu였다 (도 17).

니코티아나 벤타미아나에서, FHV RNA를 사용한 접종에 기인한 비리온이 접종된 잎에서 뿐만 아니라 접종된 식물의 다른 잎에서도 검출되었으며, 이것은 비리온이 이 식물 종에서 이동할 수 있었음을 암시한다. 그러나, 니코티아나 벤타미아나에서, 상기 이동은 접종된 잎의 위 및 아래 세개의 잎으로 제한되었다. 게다가, 시간의 경과에 따라 감염도가 감소되었다. 이것은 식물에서 비리온의 불안정성 및(또는) 접종 부위로부터 비리온의 퍼짐에 기인할 수 있다. 이러한 결과는 식물에서 세포 대 세포 이동에 필요한 바이러스 코딩 단백질이 아마도 FHV에 의해 코딩되지 않음에도 불구하고, 식물에서 세포내 환경이 정상적으로는 곤충에만 고유한 바이러스의 합성에 적합하다는 것을 나타내었다.

II. 본 발명의 벡터

A. 바이러스 서열

본 발명의 벡터는 세포에 전이하기 위해 필요한 바이러스 서열, 및 바이러스서열에 연결된 관심있는 서열을 포함한다. 따라서, 상기 벡터는 시스(cis) 작용에 필요한 비코딩 서열, 즉, 노다바이러스, 토브라바이러스 또는 디안토바이러스 핵산의 5' 및 3' 말단, 및 벡터를 다른 세포에 전이하기 위해 필요한 트랜스 작용 서열, 즉, 바이러스 MP 및(또는) CP를 코딩하는 서열을 포함한다. 디안토바이러스는 카아네이션 둥근무늬 바이러스, 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스, 스위트 클로버 괴사 모자이크 바이러스 및 푸르크라에(furcraea) 괴사 줄무늬 바이러스를 포함한다. 토브라바이러스는 완두 조기 갈변 바이러스, 후추 둥근무늬 바이러스, 담배 래틀(rattle) 바이러스 및 골고사리 양치류 바이러스를 포함한다. 세포 내에서 벡터 서열을 증폭시키기 위해 바이러스 복제효소를 사용할 수 있다. 이 복제효소는 숙주 세포 게놈에 의해 코딩되거나, 벡터의 도입 전, 도입과 함께 또는 도입 후 숙주 세포에 도입된 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는 벡터에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 벡터는 코멜리나(Commelina) 노란 얼룩 바이러스(CoMYV), CaMV, 사탕수수 간상 바이러스(ScBV), 라이스 툰그로(rice tungro) 간상 바이러스(RTBV), 카아네이션 부식환 바이러스(CERV), 피그워트(figwort) 모자이크 바이러스(FMV), 대두 엽록 얼룩 바이러스(SoyCMV), 선-헴프 모자이크 바이러스(Deom 등, 1997), 담배 괴사 바이러스(Molnar 등, 1997), 담배 모자이크 바이러스(Slovyev 등, 1996), 이가염색체바이러스(Sung 등, 1995), 포텍스바이러스, 호르데바이러스 및 사탕무우 노랑 바이러스(Agranovsky 등, 1998), 알팔파 모자이크 바이러스(van der Vossen 등, 1995), 땅콩 엽록 줄무늬 바이러스(Ducasse 등, 1995), 아르티코크(artichoke)얼룩 주름 바이러스(Tavassa 등, 1994), 보리 줄무늬 모자이크 바이러스(Weiland 등, 1994), 코우피 모자이크 바이러스(Wellink 등, 1993), 사탕무우 황색 모자이크 바이러스(Karasev 등, 1992) 및 무우 주름 바이러스(Hacker 등, 1992)의 이동 단백질을 포함(이에 한정하는 것은 아님)하는 어떠한 바이러스 MP라도 코딩할 수 있다.

식물의 전신 및(또는) 국소 감염을 위해, 본 발명의 벡터는 바람직하게는 식물 바이러스 CP를 코딩한다. 외피 단백질의 예로는 토마토 덤불성장 위축 바이러스(TBSV), 보리 줄무늬병 모자이크 바이러스(BSMV), 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스(RCNMV), 오이 괴사 바이러스(CNV), 토마토 골든(golden) 모자이크 바이러스(TGMV), 콩 골든 모자이크 바이러스(BGMV), 토마토 잎말림 바이러스(TLCV), 호박 잎말림 바이러스(SqLCV), 아프리카 카사바(cassava) 모자이크 바이러스(ACMV), 포티바이러스, 호박 모자이크 바이러스, 마늘 바이러스 A(Helguera 등, 1997), 포도 크롬(chrome) 모자이크 바이러스(Torregrosa 등, 1997), 감자 바이러스 Y 및 감자 잎말림 바이러스(Zhang 등, 1997), 벼 위축 바이러스(Zheng 등, 1997), 무우 괴사 노란 입맥 바이러스(Fecker 등, 1996), 몬태나 보리 노랑 위축 바이러스(Geske 등, 1996), 파파야 둥근무늬 바이러스(Scorza 등, 1995), 완두 조기 갈변 바이러스(MacFarlane 등, 1995), 벼 노랑 얼룩 바이러스(Brugidou 등, 1995), 사과 및 배 줄기 피팅(pitting) 바이러스(Jelkmann, 1994), 상치 감염성 노랑 바이러스, 무우 노랑 바이러스 및 감귤 트리스테자 바이러스(Klassen 등, 1994), 감자 바이러스 X(Truve 등, 1993), 플럼 폭스(plum pox) 바이러스(Ravelonandro 등, 1992), 심비디움 모자이크 및 흰 토끼풀 모자이크 바이러스(Chia 등, 1992), 오이 모자이크 바이러스(Slightom, 1991), 알팔파 모자이크 바이러스(Neelman 등, 1991), 코우피 엽록 얼룩 바이러스(Allison 등, 1990) 및 브롬 모자이크 바이러스(Sacher 등, 1989), 담배 모자이크 바이러스, 꽃양배추 모자이크 바이러스, 무우 노랑 모자이크 바이러스, 토마토 무정자증 바이러스, 사탕무우 괴사 노란 입맥 바이러스, 무우 주름 바이러스, 담배 래틀 바이러스, 심비디움 둥근무늬 바이러스, 코우피 엽록 얼룩 바이러스, 담배 부식 바이러스, 무우 웨스턴 노랑 바이러스, 서던 콩 모자이크 바이러스, 선헴프 모자이크 바이러스, 담배 부식 바이러스, 코우피 모자이크 바이러스, 옥수수 줄무늬병 바이러스, 무우 말림 탑(top) 바이러스 및 토마토 잎말림 바이러스의 외피 단백질이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다 (예를 들면, 문헌[Nelson 및 van Bel, 1998]의 표 1, 2 및 3 참조; 이 문헌의 내용은 본원 명세서에 참고로 인용됨).

B. 식물에서 발현을 위한 다른 서열

식물에서 미리 선택된 유전자의 발현은 프로모터, 인핸서, 인트론, 선도 서열 및 3' 서열의 첨가 뿐만 아니라, 비식물 유전자의 선천성 코돈의 식물에서 바람직한 코돈으로의 치환(Murry 등, 1989; Perlak 등, 1991), AT가 풍부한 서열의 제거, 잠재 폴리 A 서열의 제거 또는 변화, 및 mRNA 불안정화 서열의 제거 또는 변화를 포함하여 다수의 요소 또는 기전에 의해 증진될 수 있다.

1. 프로모터, 인핸서, 인트론, 선도 서열 및 기타 조절 서열

바람직하게는, 본 발명의 벡터에서 미리 선택된 핵산 단편은 미리 선택된 핵산 단편의 발현을 제공하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 프로모터는바람직하게는 벡터가 도입되는 숙주 세포(예, 식물 및(또는) 종자)에서 기능성인 프로모터이다. 미리 선택된 핵산 서열은 프로모터의 하류에 위치할 때 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

대부분의 유전자는 유전자 발현을 조절하는 프로모터로 알려진 핵산 영역을 갖는다. 게놈 DNA에 의해 코딩된 유전자에 있어서, 프로모터 영역은 전형적으로 원핵 및 진핵 세포 모두에서 코딩 서열로부터 상류의 플랭킹(flanking) DNA에서 발견된다. 프로모터 서열은 하류의 유전자 서열의 전사를 조절하고, 전형적으로 약 50 내지 약 2,000 개의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함한다. 프로모터 서열은 또한 유전자 발현 수준에 영항을 미칠 수 있는 인핸서 서열과 같은 조절 서열을 함유한다. 일부 단리된 프로모터 서열은 선천성 또는 상동 DNA와 다른 DNA인 이종 DNA의 유전자 발현을 제공할 수 있다.

프로모터 서열은 또한 강하거나 약하거나, 또는 유도되는 것으로 알려져 있다. 강한 프로모터는 높은 수준의 유전자 발현을 제공하는 반면, 약한 프로모터는 매우 낮은 수준의 유전자 발현을 제공한다. 유도 프로모터는 외부에서 첨가한 물질, 또는 환경 또는 발생 자극에 반응하여 유전자 발현을 실행 및 비실행시키는 프로모터이다. P_tac프로모터와 같은 박테리아 프로모터는 형질전환 박테리아 세포에 첨가된 이소티오프로필갈락토사이드의 수준에 따라 유전자 발현의 수준을 변화시키도록 유도될 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 또는 발생적 조절을 제공할 수 있다. 이종 핵산에 대해 강한 프로모터인 단리된 프로모터 서열은 충분한 수준의 유전자 발현을 제공하여 형질전환 세포의 용이한 검출 및 선택을 가능하게 하고 필요한 경우 높은 수준의 유전자 발현을 제공하므로 유리하다.

바람직한 식물 프로모터는 CaMV 35S 프로모터(Odell 등, 1985), 증진된 35S 프로모터(Kay 등, 1987), 또는 CaMV 19S(Lawton 등, 1987), nos, Adhl(Walker 등, 1987), 설탕 합성효소(Yang 등, 1990), α-튜불린, 유비퀴틴, 액틴(Wang 등, 1992), cab(Sullivan 등, 1989), PEPCase(Hudspeth 등, 1989) 또는 R 유전자 복합체와 관련된 것(Chandler 등, 1989)과 같은 기타 프로모터를 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 보다 적합한 프로모터는 Z4 22 kD α-제인 단백질을 코딩하는 유전자로부터의 Z4 프로모터, 10 kD의 제인 단백질을 코딩하는 유전자로부터의 Z10 프로모터, 27 kD의 제인 단백질을 코딩하는 유전자로부터의 Z27 프로모터, 19 kD의 α-제인 단백질을 코딩하는 유전자로부터의 A20 프로모터, 완두 rbcS 유전자로부터 유래된 광선 유도 프로모터(Coruzzi 등, 1971)와 같은 유도 프로모터, 및 벼로부터의 액틴 프로모터(McElroy 등, 1990)를 포함한다. 콩으로부터의 파세올린(phaseolin) 프로모터와 같은 종자 특이적 프로모터를 또한 사용할 수 있다 (Sengupta-Gopalan, 1985). 본 발명의 실시에 유용한 다른 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.

미리 선택된 핵산(예, DNA 서열)은 상기에서 인용한 문헌[Sambrook 등]에 기술된 표준 방법에 의해 프로모터와 결합하여 발현 카세트를 얻을 수 있다. 즉, 35S CaMV 프로모터와 같은 프로모터를 함유하는 플라스미드는 문헌[Jefferson, 1987]에 기술된 바와 같이 구성할 수 있거나, 또는 클론테크 랩(Clontech Lab, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)으로부터 얻을 수 있다 (예, pBI121 또는 pBI221). 전형적으로는, 이들 플라스미드는 프로모터의 하류의 상이한 제한 효소에 대한 특이성을 갖는 다수의 클로닝 부위를 갖도록 구성된다. 미리 선택된 DNA 서열은 제한 효소를 사용하여 프로모터 하류에서 서브클로닝될 수 있고, DNA가 프로모터에 대해 적합한 방향에 삽입되는 것을 보장하도록 위치되어 센스 또는 안티센스 RNA로 발현될 수 있다. 일단 미리 선택된 DNA 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되면, 이렇게 형성된 발현 카세트는 본 발명의 벡터로 서브클로닝될 수 있다.

미리 선택된 센스 DNA 서열이 얻어지면, 이 서열의 전부 또는 일부는 역 방향 (즉, 3' 에서 5')으로 발현 벡터(하기 참조)로 서브클로닝될 수 있다. 마찬가지로, 미리 선택된 DNA 서열의 전부 또는 일부는 센스 방향(즉, 5' 에서 3')으로 서브클로닝될 수 있다. 미리 선택된 DNA 서열은 프로모터의 하류에서 서브클로닝되어 발현 카세트를 형성한다.

필요한 경우, 바이러스 서브게놈 서열(예, 바이러스 서브게놈 RNA 서열) 뿐만 아니라, Adh 인트론 1(Callis 등, 1987), 설탕 합성효소 인트론(Vasil 등, 1989) 또는 TMV 오메가 인자(Gallie 등, 1989)와 같은 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다.

전사 개시 부위와 코딩 서열의 시작점 사이에 있는 DNA 서열, 즉, 비해독 선도 서열은 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있으므로, 특별한 선도 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 선도 서열은 부착 유전자의 최적의 발현을 지시하도록 예정된 서열을 포함하는 것을 포함하도록, 즉, mRNA 안정성을 증가 또는 유지시키고 부적절한 해독의 개시를 방지할 수 있는 바람직한 공통 선도 서열을 포함하도록 고려된다. 이러한 서열의 선택은 본 발명의 개시에 의하여 당업자에게 공지될 것이다. 식물에서 고도로 발현되는 유전자로부터 유래된 서열이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 사용을 위한 벡터는 ocs 인핸서 인자를 포함하도록 구성될 수 있을 것으로 고려된다. 이 인자는 아그로박테리움의 옥토파인 합성효소(ocs) 유전자로부터 16 bp 회문식 인핸서로서 처음 확인되었고, 10 개 이상의 다른 프로모터에 존재한다 (Bouchez 등, 1989). ocs 인자 및 특히 상기 인자의 다수의 카피(copy)와 같은 인핸서 인자의 사용은 인접한 프로모터로부터의 전사의 수준을 증가시킬 것으로 제안된다.

궁극적으로, 식물로의 도입을 위한 가장 바람직한 핵산 단편은, 목적하는 형질(예, 에이커 당 증가된 수확량)을 코딩하고, 신규한 프로모터 또는 인핸서 등 또는 심지어는 상동 조직 특이적 (예, 뿌리, 경령/껍질, 윤생체, 줄기, 이어생크(earshank), 씨 또는 잎 특이적) 프로모터 또는 조절 인자의 조절하에서 도입되는 상동 유전자 또는 유전자 패밀리일 수 있다. 실제로, 본 발명의 특별한 용도는 유전자를 조직 특이적 방식으로 표적화하는 것일 것이다. 예를 들면, 곤충 저항성 유전자는 각각 ECB의 제1 및 제2 품종의 표적인 윤생체 및 경령/껍질 조직에서 특이적으로 발현될 수 있다. 마찬가지로, 뿌리벌레에 특별한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 직접 뿌리 조직으로 표적화할 수 있다.

형질전환 식물에서 유전자의 조직 특이적 표적화에 사용하기 위한 벡터는 전형적으로 조직 특이적 프로모터를 포함할 것이고, 또한 인핸서 서열과 같은 다른 조직 특이적 조절 인자를 포함할 수 있다. 어떤 식물 조직에서 특이적 또는 증폭된 발현을 지시하는 프로모터는 본원의 개시에 의해 당업자에게 공지될 것이다. 이들은 예를 들면, 녹색 조직에 특이적인 rbcS 프로모터; 뿌리 또는 손상된 잎 조직에서 더 높은 활성을 갖는 ocs, nos 및 mas 프로모터; 뿌리에서 발현을 지시하는 α-튜불린 유전자인 증진된 발현을 지시하는 절단 (-90 내지 +8) 35S 프로모터, 및 배젖에서 발현을 지시하는 제인 저장 단백질 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 뿌리에서 증진된 발현을 달성하기 위해, 특히 다수의 카피로 존재할 때 옥토파인 합성효소(ocs) 유전자로부터의 16 bp ocs 인핸서 인자(Bronchez 등, 1989)를 유리하게 사용할 수 있을 것으로 고려된다.

또한, 구조적으로 발현된 유전자(모든 조직)를 상기 유전자 생성물이 바람직하지 않은 조직에서만 발현되는 안티센스 유전자와 조합하여 도입함으로써 조직 특이적 발현을 기능적으로 달성할 수 있을 것으로 고려된다. 예를 들면, 비. 투린지엔시스(B. thuringiensis, Bt)로부터 결정 독소 단백질을 코딩하는 유전자를 그것이 꽃양배추 모자이크 바이러스로부터의 35S 프로모터를 사용하여 모든 조직에서 발현되도록 도입할 수 있다. 예를 들면 제인 프로모터를 사용하여 옥수수 씨에서 Bt 유전자의 안티센스 전사체를 발현시키는 것은, 종자에서 Bt 단백질의 축적을 방지할 것이다. 따라서, 도입된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 씨를 제외한 모든 조직에 존재할 것이다.

별법으로, 본 발명에 따른 사용을 위한 신규한 조직 특이적 프로모터 서열을얻고자 할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 우선 관련 조직으로부터 cDNA 클론을 단리하고, 예를 들면 노던 블롯팅을 사용하여 그 조직에서 특이적으로 발현되는 cDNA 클론을 확인할 수 있다. 바람직하게는, 높은 카피 수로 존재하지 않으나, 유전자 생성물이 특별한 조직에서 비교적 풍부한 유전자를 확인할 수 있다. 이어서, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 대응하는 게놈 클론의 프로모터 및 조절 인자를 국소화할 수 있다.

형질전환 식물에서 일부 유전자의 발현은 특정 조건하에서만 바람직할 것으로 고려된다. 예를 들면, 가뭄과 같은 환경 스트레스 인자에 저항성을 부여하는 일부 유전자의 발현은 실제적인 스트레스 조건하에서만 바람직할 것으로 제안된다. 이러한 유전자가 식물의 발생을 통해 발현되는 것은 해로운 영향을 미칠 수 있을 것으로 고려된다. 환경에 반응하는 다수의 유전자가 존재하는 것은 공지되어 있다. 예를 들면, 리불로오스 비스포스페이트 카르복시화효소의 작은 소단위를 코딩하는 rbcS와 같은 일부 유전자의 발현은 피토크롬(phytochrome)을 통해 매개되는 바와 같이 빛에 의해 조절된다. 다른 유전자들은 이차 자극에 의해 유도된다. 예를 들면, 아브시스산(ABA)의 합성은 수분 스트레스를 포함하여(이에 한정되지 않음) 일정 환경 인자에 의해 유도된다. 다수의 유전자가 ABA에 의해 유도되는 것으로 나타났다 (Skriver 및 Mundy, 1990). 또한, 곤충 포식에 저항성을 부여하는 유전자의 발현은 실제적인 곤충 감염의 조건 하에서만 바람직할 것으로 기대된다. 따라서, 어떤 목적하는 형질에 있어서는, 형질전환 식물에서 유전자의 유도 발현이 바람직할 것이다.

본 발명의 일부 실시태양에서는, 형질전환 식물에서 유전자의 발현이 식물의 발생 중 일정 시기에서만 바람직할 것으로 제안된다. 발생적 타이밍은 자주 조직 특이적 유전자 발현과 상호관련된다. 예를 들면, 제인 저장 단백질의 발현은 수분 후 약 15일 째에 배젖에서 개시된다.

2. 세포내 또는 세포외 표적화 서열

또한, 발현 카세트는 미리 선택된 핵산 서열 또는 단편의 생성물을 식물 세포내의 세포내 구획으로 표적화하거나 또는 단백질을 세포외 환경으로 보내도록 구성되고 사용될 수 있다. 이것은 일반적으로 전이 또는 신호 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 미리 선택된 DNA 서열의 코딩 서열에 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 생성된 전이 또는 신호 펩티드는 단백질을 각각 특정 세포내 또는 세포외 목적지로 운반할 것이고, 해독 후 제거될 수 있다. 전이 펩티드는 세포내 막, 예를 들면, 액포, 소포, 색소체 및 미토콘드리아 막을 통한 단백질의 운반을 촉진하는 반면, 신호 펩티드는 세포외 막을 통해 단백질을 내보낸다. 이들 서열은 단백질의 세포내 또는 세포외 구획으로의 운반을 촉진함으로써, 특정 위치에서 특정 유전자 생성물의 축적을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,258,300호를 참조한다.

이러한 용도의 구체적인 예는 EPSPS 유전자와 같은 제초제 저항성 유전자를 세포질이 아닌 엽록체와 같은 특정 세포 소기관으로 보내는 것이다. 이것은 단백질에 색소체 특이적 표적화를 부여하는 rbcS 전이 펩티드의 사용에 의해 입증된다. 또한, 웅성 불임성을 담당하는 일정 유전자를 미토콘드리아로 표적화하거나 식물병원성 생물에 대한 저항성을 위한 유전자를 세포외 공간으로 표적화하거나, 또는 단백질을 액포로 표적화하는 것이 바람직할 수 있을 것으로 제안된다.

또한, DNA 자체를 세포 내에서 표적화하는 것이 유용할 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들면, 도입된 DNA를 핵으로 표적화하는 것은 형질전환의 빈도를 증가시킬 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 부위 특이적 통합을 달성하기 위해 핵 자체 내에서 유전자를 표적화하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 세포 내에 현존하는 유전자를 형질전환을 통해 도입된 유전자로 치환하는 것이 유용할 것이다.

3. 3' 서열

발현 카세트가 식물 세포에 도입될 때, 발현 카세트는 또한 전사를 종결시키기 위한 신호로 작용하고 형성된 mRNA을 아데닐산 중합시키는 3' 비해독 조절 DNA 서열을 임의적으로 포함할 수 있다. 3' 비해독 조절 DNA 서열은 바람직하게는 약 50 내지 약 1,000 개, 더 바람직하게는 약 100 내지 약 1,000 개의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함하고, 식물 전사 및 해독 종결 서열을 함유한다. 바람직한 3' 인자는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Bevan 등, 1983)의 노팔린(nopaline) 합성효소 유전자로부터 유래되는 것, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인(octopine) 합성효소 유전자로부터의 T7 전사체에 대한 종결자, 및 감자 또는 토마토로부터의 단백질분해효소 억제제 I 또는 II 유전자의 3' 말단으로부터 유래되나, 당업자에게 공지된 다른 3' 인자를 또한 사용할 수 있다. 이들 3' 비해독 조절 서열은 문헌[An, 1987]에 기술된 바와 같이 얻을 수 있거나 또는 클론테크(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수가능한 플라스미드에 이미 존재한다. 3' 비해독 조절 서열은 표준 방법에 의해 미리 선택된 DNA 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결될 수 있다.

4. 선택 또는 선별 표지

형질전환체를 확인할 수 있는 능력을 개선하기 위해, 미리 선택된 핵산 서열 또는 단편으로서, 또는 이에 부가하여 선택 또는 선별 표지를 사용하고자 할 수 있다. "표지 유전자"는 표지 유전자를 발현하는 세포에 독특한 표현형을 부여하는 유전자이고, 따라서 이러한 형질전환 세포를 표지를 가지지 않는 세포와 구별할 수 있게 한다. 이러한 유전자는 상기 표지가 화학적 수단, 즉, 선택적인 약물(예, 제초제, 항생제 등)의 사용을 통해 '선택'할 수 있는 형질을 부여하는지 또는 단지 관찰 또는 시험, 즉, '선별'을 통해 확인할 수 있는 형질(예, R-좌위 형질)인지에 따라 선택 또는 선별 표지를 코딩할 수 있다. 물론, 다수의 적합한 표지 유전자의 예는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.

분비가 형질전환 세포를 확인하거나 또는 선택하는 수단으로서 검출될 수 있는 "분비 표지"를 코딩하는 유전자도 또한 용어 선택 또는 선별 표지 유전자 내에 포함된다. 예로는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 분비 항원을 코딩하는 표지, 또는 심지어 촉매 활성에 의해 검출될 수 있는 분비 효소가 포함된다. 분비 단백질은 예를 들면, ELISA에 의해 검출가능한 확산가능한 소단백질; 세포외 용액에서 검출가능한 활성 소효소(예, α-아밀라아제, β-락타마제, 포스피노트리신 아세틸전이효소); 및 세포벽에 삽입되거나 또는 트랩되는 단백질(예, 익스텐신(extensin) 또는 담배 PR-S의 발현 단위에서 발견된 것과 같은 선도 서열을 포함하는 단백질)을 포함하여, 다수의 분류에 해당된다.

선택 분비 표지에 있어서, 유일한 항원 결정부를 포함하고 세포벽에 격리되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 사용하는 것은 특히 유리할 것으로 고려된다. 이러한 분비된 항원 표지는 이상적으로는 식물 조직에서 낮은 백그라운드(background)를 제공하는 항원 결정부 서열, 및 효율적인 발현 및 원형질막을 가로지르는 표적화를 부여하고 세포벽에 결합되나 여전히 항체에 접근가능한 단백질을 생성하는 프로모터-선도 서열을 사용할 것이다. 유일한 항원 결정부를 포함하기 위해 변형된 정상적으로 분비된 벽 단백질은 이러한 모든 요구사항을 만족시킬 것이다.

이러한 방식의 변형에 적합한 단백질의 한 예는 익스텐신 또는 히드록시프롤린이 풍부한 당단백질(HPRG)이다. 옥수수 HPRG(Stiefel 등, 1990)분자 생물학, 발현 및 단백질 구조의 면에서 잘 특성화 되었기 때문에, 옥수수 HPRG을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 다양한 익스텐신 및(또는) 글리신이 풍부한 벽 단백질(Keller 등, 1989) 중 어느 것이라도 항원성 부위의 첨가에 의해 변형되어 선별 표지를 생성할 수 있다.

본원 개시의 인자는 구체적인 표지 유전자의 사용을 통해 자세하게 예시될 것이다. 그러나, 본원 개시에 의해, 하기에 나타낸 것에 부가하여 다수의 다른 가능한 선택 및(또는) 선별 표지 유전자가 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 하기 설명은 완전한 것이라기 보다는 예시적인 것이라는 것을 이해해야 할 것이다. 본원에 개시된 기술 및 당업계에 공지된 일반적인 재조합 기술에 의해, 본 발명은표지 유전자를 포함한 어떠한 유전자라도 수용 세포에 도입되어 형질전환 식물 세포(예, 외떡잎류 세포)의 생산을 가능하게 한다.

본 발명과 관련하여 사용가능한 선택 표지는 가나마이신 저항성을 코딩하고 가나마이신을 사용하여 선택할 수 있는 neo 유전자(Potrykus 등, 1985), G418, 블레오마이신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 등; 비알라포스(bialaphos) 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 변형된 EPSP 합성효소 단백질(Hinchee 등, 1988)을 코딩함으로써 글리포세이트(glyphosate) 저항성을 부여하는 유전자; 브로목시닐(Stalker 등, 1988)에 대한 저항성을 부여하는 크렙시엘라 오자에나에(Klebsiella ozaenae)로부터의 bxn과 같은 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논, 술포닐우레아 또는 다른 ALS-억제 화학물질(유럽 특허 출원 제154,204호, 1985)에 대한 저항성을 부여하는 아세토락테이트 합성효소 유전자(ALS)의 돌연변이체; 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자(Thillet 등, 1988); 제초제인 달라폰에 대한 저항성을 부여하는 달라폰 탈할로겐효소 유전자; 또는 5-메틸 트립토판에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이형 안트라닐레이트 합성효소 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 돌연변이형 EPSP 합성효소 유전자를 사용하는 경우, 적합한 엽록체 형질 펩티드(CTP)를 혼입함으로써 부가의 이익을 얻을 수 있다 (유럽 특허 출원 제0 218 571호, 1987).

형질전환체를 선택하기 위한 시스템에 사용될 수 있는 선택 표지 유전자의 예시적인 태양은 포스피노트리신 아세틸전이효소를 코딩하는 유전자, 예를 들면, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터의 bar 유전자 또는 스트렙토마이세스 비리도크로모젠(Streptomyces viridochromogenes)으로부터의 pat 유전자이다 (본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,550,318호). 포스피노트리신 아세틸전이효소(PAT)는 제초제인 비알라포스의 활성성분인 포스피노트리신(PPT)를 불활성화시킨다. PPT는 글루타민 합성효소를 억제하여(Murakami 등, 1986; Twell 등, 1989) 암모니아의 급속한 축적 및 세포 치사를 일으킨다. 외떡잎류와 관련하여 이 선택 시스템을 사용하는 것에 있어서의 성공은 곡물의 형질전환에서 많은 어려움이 보고되었기 때문에(Potrykus, 1989) 특히 놀랍다.

사용될 수 있는 선별 표지는 다양한 색소생산성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자(GUS); 식물 조직에서 안토시아닌 안료(적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-좌위 유전자 (Dellaporta 등, 1988); 다양한 색소생산성 기질(예, 색소생산성 세팔로스포린인 PADAC)이 알려져 있는 효소를 코딩하는 β-락타마제 유전자(Sutcliffe, 1978); 색소생산성 카테콜을 전환할 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자(Zukowsky 등, 1983); 티로신을 DOPA, 및 축합하여 쉽게 검출가능한 화합물인 멜라닌을 형성하는 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나아제 유전자(katz 등, 1983); 색소생산성 기질이 존재하는 효소를 코딩하는 β-갈락토시다제 유전자; 생물발광에 의해 검출되는 발광효소(lux) 유전자(Ow 등, 1986); 또는 칼슘 감작 생물발광 검출에서 사용될 수 있는 에쿠오린 유전자(Prasher 등, 1985) 또는 녹색 형광 단백질 유전자(Niedz 등, 1995)를 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

옥수수 R 유전자 복합체로부터의 유전자는 선별 표지로서 특히 유용할 것으로 고려된다. 옥수수에 있는 R 유전자 복합체는 대부분의 종자 및 식물 조직에서안토시아닌 색소의 생산을 조절하는 단백질을 코딩한다. 옥수수 계통은 한 개, 또는 많게는 4 개의 대립형질을 가질 수 있고, 이것은 결합하여 발생 및 조직 특이적 방식으로 색소화를 조절한다. R 유전자 복합체로부터의 유전자는 형질전환 세포에서 이 유전자의 발현이 세포에 해를 주지 않으므로 옥수수 형질전환에 사용되었다. 따라서, 이러한 세포에 도입되는 R 유전자는 적색 안료의 발현을 일으킬 것이고, 안정하게 혼입된다면 육안으로 적색 영역으로 평가될 수 있다. 옥수수 계통이 안토시아닌 생합성 경로에서 효소 중간체를 코딩하는 유전자에 대한 우성 대립형질(C2, A1, A2, Bz1 및 Bz2)을 가지나 R-좌위에서 열성 대립형질을 가진다면, R을 갖는 옥수수 계통으로부터의 세포의 형질전환은 적색 안료를 형성할 것이다. 상기 계통의 예로는 rg-Stadler 대립형질, 및 r-g, b, Pl인 K55 유도체 TR112를 함유하는 위스콘신 22가 포함된다. 별법으로, C1 및 R 대립형질이 함께 도입될 경우, 옥수수의 어떠한 유전자형이라도 이용할 수 있다.

나아가, 키메라 유전자의 발현을 조절하기 위한 기전을 제공하기 위해, 키메라 구조체에 R 유전자 조절 영역을 사용할 수 있을 것으로 제안된다. 어떠한 다른 좌위에서보다 R 좌위에서 표현형 발현이 더 다양한 것으로 알려져 있다 (Coe 등, 1988). R 구조 유전자의 5' 영역으로부터 얻어진 조절 영역이 유전자(예, 곤충 저항성, 가뭄 저항성, 제초제 내성 또는 다른 단백질 코딩 영역)의 발현을 지시하는데 유용할 것으로 고려된다. 본 발명의 목적을 위해, 어떠한 다양한 R 유전자 패밀리 구성원도 성공적으로 사용할 수 있다고 믿어진다 (예, P, S, Lc 등). 그러나, 일반적으로 Sn (특히, Sn:bol3)이 가장 바람직하다. Sn은 R 유전자 복합체의우성 구성원이고, Sn이 일부 묘목 및 식물 세포에서 안토시아닌 색소의 조직 특이적 침착을 조절한다는 점에서 R 및 B 좌위와 기능적으로 유사하고, 따라서 표현형이 R과 유사하다.

본 발명에서의 사용을 위해 고려되는 추가의 선별 표지는 lux 유전자에 의해 코딩되는 반딧불 발광효소이다. 형질전환 세포에서 lux 유전자의 존재는 예를 들면, X-선 필름, 섬광 계수기, 형광 분광광도계, 저광 비데오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 멀티웰(multiwell) 발광계를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 이 시스템은 예를 들면, 조직 배양판 상에서의 생물발광을 위한 대중적인 선별, 또는 심지어 전체 식물 선별을 위해 개발될 수 있을 것으로 생각된다.

5. 플라스미드 및 비바이러스 벡터 서열

본 발명의 벡터는 또한 플라스미드 DNA를 추가로 포함할 수 있다. 플라스미드 벡터(예, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pUC23, pUC119 및 pUC120과 같은 pUC 유래 벡터, pSK 유래 벡터, pGEM 유래 벡터, pSP 유래 벡터 또는 pBS 유래 벡터)는 원핵세포 및 진핵세포에서 발현 카세트의 용이한 선택, 증폭 및 형질전환을 제공하는 부가의 DNA 서열을 포함한다. 상기 부가의 DNA 서열은 벡터의 자율적인 복제를 제공하기 위한 복제 기점, 바람직하게는 항생제 또는 제초제 저항성을 코딩하는 부가의 선택 표지 유전자, 발현 카세트에서 코딩되는 DNA 서열 및 유전자를 삽입하기 위해 중복 부위를 제공하는 특이한 다수의 클로닝 부위, 및 원핵세포 및 진핵세포의 형질전환을 증진시키는 서열을 포함한다.

식물 및 원핵 세포 모두에서의 발현에 유용한 다른 벡터는문헌[Schilperoort 등, 미국 특허 제4,940,838호]에 기술된 바와 같은 이원 Ti 플라스미드이고, 예로는 벡터 pGA582가 있다. 이 이원 Ti 플라스미드는 상기 인용한 안(An)에 의해 이미 특성화되었고, 안으로부터 입수가능하다. 이 이원 Ti 벡터는 대장균 및 아그로박테리움과 같은 원핵 박테리아에서 복제될 수 있다. 아그로박테리움 플라스미드 벡터는 발현 카세트를 쌍떡잎류 식물 세포로 전달하는데 사용될 수 있고, 어떤 조건하에서는 벼 세포와 같은 외떡잎류 세포로 전달하는데 사용될 수 있다. 이원 Ti 벡터는 바람직하게는 효율적인 식물 세포 형질전환을 제공하기 위한 노팔린 T DNA 우측 및 좌측 연변부, 선택 표지 유전자, T 연변부 영역에 있는 특이한 다수의 클로닝 부위, colE1 복제 기점 및 야생 숙주 범위 복제단위를 포함한다. 본 발명의 발현 카세트를 갖는 이원 Ti 벡터는 원핵세포 및 진핵세포 모두를 형질전환하는데 사용될 수 있으나, 바람직하게는 쌍떡잎류 식물 세포를 형질전환하는데 사용된다.

사실상 궁극적으로 본 발명에 따른 수정성 형질전환 식물을 생성하기 위해 어떠한 DNA도 수용 세포에 전달하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 벡터 및 플라스미드 형태의 DNA 단편, 또는 선형 DNA 단편 (어떤 경우에서는 식물에서 발현될 DNA 인자만을 함유함) 등을 사용할 수 있다.

물론, 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용하기 위한 벡터, 플라스미드, 코스미드, YAC(yeast artificial chromosome) 및 DNA 단편은 cDNA, 일반적으로 세포에 도입하고자 하는 유전자 또는 유전자들을 포함할 것이다. 이들 DNA 구조체는 프로모터, 인핸서, 다연결자, 또는 필요한 경우 조절 유전자까지도 추가로 포함할수 있다. 세포 도입을 위해 선택된 DNA 단편 또는 유전자는 종종 생성된 재조합 세포에서 발현되어, 선별 또는 선택 형질을 초래하고(하거나) 개량된 표현형을 재생된 식물에 부여할 단백질을 코딩할 것이다. 그러나, 항상 그렇지만은 않으며, 본 발명은 또한 비발현 형질전환 유전자를 함유하는 형질전환 세포를 포괄한다.

6. 미리 선택된 다른 핵산 단편

본 발명의 바람직한 실시태양은 식물에게 바람직한 작물학적 성질을 코딩하기 위한 벡터 방법, 예를 들면, 농작물 생산과 관련된 형질의 개량을 위한 단일 유전자를 제공한다. 예를 들면, 이러한 핵산 단편 또는 "유전자"는 예를 들면 문헌[Lundquist 등 (미국 특허 제5,484,956호), Lundquist 등 (미국 특허 제5,508,468호), Dobres (국제 출원 제PCT/US95/11231호) 및 Weising 등 (1998, 표 1, 2 및 3 참조); 모든 문헌은 본원에 참고로 인용됨]에 기술되어 있다. 그러나, 식물에 바람직한 특성을 부여하는 단백질 또는 RNA 전사체를 코딩하는 다수의 다른 미리 선택된 핵산 단편이 본 발명의 범위내에 있는 바와 같이, 본 발명의 범위는 바람직한 작물학적 성질을 코딩하는 미리 선택된 핵산 단편에 한정되지 않는다.

수용 세포에 전달될 특정 핵산 단편의 선택은 종종 형질전환의 목적에 의존할 것이다. 농작물 식물을 형질전환하는 주요 목적 중의 하나는 상업적으로 바람직하고, 작물학적으로 중요한 일정 형질을 식물에 첨가하는 것이다. 예를 들면, 제초제 저항성을 코딩하는 유전자 또는 유전자들과 같은 임의의 이러한 바람직한 형질 또는 형질들을 부여하는 하나 이상의 유전자를 혼입하고자 할 수 있다. 미리 선택된 DNA 단편에 의해 코딩되는 바람직한 작물학적 성질로는 곤충 저항성 또는내성, 제초제 저항성 또는 내성(Christou, 1997), 질병 저항성 또는 내성 (예, 담배 또는 감자에서 병원체 저항성, 예를 들면 Bt 엔도톡신 유전자(Schell, 1997; Vaeck 등, 1987; 및 Lundquist 등, 미국 특허 제5,484,956호), 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)로부터 분비된 Pht 독소, 또는 바이러스 저항성을 위한 바이러스 유래 단백질(Reimann-Phillip 등, 1993)을 사용하는 바이러스, 진균 또는 박테리아 병원체에 대한 저항성), 가뭄, 과도한 습기, 추위, 동결, 고온, 염 및 산화적 스트레스를 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 환경 스트레스에 대한 저항성, 증가된 수확량, 식품 함량 및 메이크업(makeup), 물리적 외양, 웅성 불임성, 드라이다운(drydown), 입모성, 다산, 녹말 성질, 오일 함량 및 품질 등을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 유전자 연구로부터 식물이 특정 식물 병원체에 의한 감염에 저항하기 위해서는, 식물이 병원체의 게놈에 존재하는 단일 비병원성 (avr) 유전자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 저항(R) 유전자를 가져야 한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, R 유전자를 포함하는 미리 선택된 DNA 단편을 R 유전자가 없는 식물에 도입함으로써, 식물에 대응하는 avr 유전자를 발현하는 병원체에 대한 저항성을 부여할 수 있다.

병원성 관련(PR) 단백질을 코딩하는 미리 선택된 DNA 단편을 식물에 도입함으로써 진균 감염에 대한 증가된 저항성을 얻을 수 있다. PR 단백질은 일부 병원성 진균에 의한 감염에 반응하여 곡물에 의해 합성되는 단백질이다 (Scott, 1994). 다른 항진균 유전자로는 키티나아제(예, 엑소-키틴 가수분해 효소 및 키티나아제 G), 글루카나아제, 단백질 합성 억제제(PSI) 또는 항진균 단백질(AFP)이 포함되나,이에 한정하는 것은 아니다.

바이러스 외피 단백질을 코딩하는 미리 선택된 DNA 단편을 식물에 도입함으로써 바이러스 감염에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Nelson 등, 1998]에는 토마토 식물에서 담배 모자이크 바이러스(TMV) 외피 단백질의 발현이 식물에 TMV 및 TMV에 관련된 바이러스인 토마토 모자이크 바이러스(ToMV)에 대한 내성을 부여한다고 기술되어 있다. 문헌[Clark 등, 국제 출원 제PCT/EP92/03001호]에는 옥수수에서 옥수수 위축 모자이크 바이러스 외피 단백질이 발현됨으로써 그 바이러스에 노출되었을 때 식물의 질병 증후가 감소되었다고 기술되어 있다.

또한, 하나 이상의 미리 선택된 핵산 단편을 식물에 도입할 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들면, 선택 표지 유전자, 및 특정 바이러스(예, 보리 노랑 위축 바이러스, 감자 잎말림 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스)에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 함유하는 벡터를 식물 세포에 도입할 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 하나를 초과하는 유리한 형질전환 유전자로 수용 세포를 형질전환하는 것을 고려한다. 별개의 형질전환 유전자 코딩 벡터들 또는 두 개 이상의 유전자 코딩 서열을 함유하는 단일 벡터를 사용하여 두 개 이상의 형질전환 유전자를 한 번의 형질전환으로 공급할 수 있다. 예를 들면, 수렴, 발산 또는 대응직선 방향으로 bar 및 aroA 발현 단위를 함유하는 플라스미드가 특히 유용한 것으로 고려된다. Bt 유전자와 같은 곤충 저항성 유전자와 pinII와 같은 단백질분해 억제제 유전자의 조합, 또는 bar를 상기 유전자의 어느 한 쪽과 조합하여 사용하는 것은 더 바람직하다. 물론, 필요한 경우, 예를 들면 제초제, 곤충, 질병(바이러스, 박테리아, 진균, 선충) 또는 가뭄 저항성, 웅성 불임성, 드라이다운, 입모성, 다산, 녹말 성질, 오일 함량 또는 품질을 부여하는 형질전환 유전자, 또는 수확량 또는 영양 품질을 증가시키는 형질전환 유전자와 같은 어떠한 2 개 이상의 형질전환 유전자라도 사용할 수 있다.

a. 제초제 저항성

포스피노트리신 아세틸전이효소를 코딩하는 유전자(bar 및 pat), 글리포세이트 내성 EPSP 합성효소 유전자, 글리포세이트 산화환원효소를 코딩하는 글리포세이트 분해 효소 유전자 gox, 달라폰을 불활성화시키는 데할로게나아제를 코딩하는 deh, 제초제 저항성(예, 술포닐우레아 및 이미다졸리논) 아세토락테이트 합성효소 , 및 브로목시닐을 분해하는 니트릴라아제를 코딩하는 bxn 유전자는 형질전환에서의 사용을 위한 제초제 저항성 유전자의 좋은 예이다. bar 및 pat 유전자는, 제초제인 포스피노트리신을 불활성화시켜서 이 화합물이 글루타민 합성효소를 억제하는 것을 방지하는 포스피노트리신 아세틸전이효소(PAT)를 코딩한다. 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSP 합성효소)는 정상적으로는 제초제인 N-(포스포노메틸)글리신 (글리포세이트)에 의해 억제된다. 그러나, 글리포세이트 저항성 EPSP 합성효소를 코딩하는 유전자가 공지되어 있다. 이들 유전자는 특히 외떡잎류 형질전환에서의 사용을 위해 고려된다. deh 유전자는 달라폰 데할로게나아제를 코딩하여, 제초제인 달라폰에 대한 저항성을 부여한다. bxn 유전자는 브로목시닐을 비제초제 분해 생성물로 전환시키는 특별한 니를 코딩한다.

b. 곤충 저항성

본 발명의 중요한 측면은 곤충 저항성을 부여하는 유전자를 옥수수와 같은 외떡잎류 식물에 도입하는 것이다. 도입될 수 있는 잠재적 곤충 저항성 유전자로는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 결정 독소 유전자 또는 Bt 유전자가 포함된다 (Watrud 등, 1985). Bt 유전자는 유럽 옥수수 천공충(ECB)과 같은 나비 또는 딱정벌레에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 이러한 실시태양에서의 사용을 위한 바람직한 Bt 유전자로는 CrylA(b) 및 CrylA(c) 유전자가 포함된다. 이러한 측면에서, 곤충 성장 및 발생에 영향을 미치는 바실루스 투린지엔시스의 다른 종으로부터의 엔도톡신 유전자를 또한 사용할 수 있다.

식물에서 원핵 Bt 독소 유전자의 발현이 불량한 것은 널리 보고된 현상이고, 별개의 프로모터, 융합 단백질 및 선도 서열의 사용은 Bt 단백질 발현을 유의하게 증가시키지 못했다 (Barton 등, 1987). 따라서, 본원 명세서에서 기술된 형질전환 프로토콜에서의 사용을 위한 가장 유리한 Bt 유전자는 코딩 서열이 식물에서 증가된 발현을 달성하도록 변형된 것, 더 구체적으로는, 옥수수 선호 코돈이 사용된 것일 것이다. 이러한 변형된 Bt 독소 유전자의 예로는 IAb6라고 하는 변이형 Bt CrylA(b) 유전자(Perlak 등, 1991), 및 1800a 및 1800b라고 하는 합성 CrylA(c) 유전자가 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다.

단백질분해효소 억제제는 또한 곤충 저항성을 제공할 수 있고(Johnson 등, 1989), 따라서 옥수수 형질전환에 유용할 것이다. 토마토 또는 감자로부터의 단백질분해효소 억제제 II 유전자 pin II의 사용은 특히 유용할 것으로 생각된다. 본원 발명자들이 발견한 바와 같이, pin II 유전자와 Bt 독소 유전자의 조합은 살충 작용을 상승시키므로 pin II 유전자를 Bt 독소 유전자와 함께 사용하는 것은 더욱 더 유리하다. 곤충의 소화계의 억제제를 코딩하는 다른 유전자, 또는 억제제의 생산을 촉진하는 효소 또는 보조인자를 코딩하는 유전자도 또한 유용할 수 있다. 밀 및 보리로부터 얻을 수 있는 것과 같은 오리자시스타틴(oryzacystatin) 및 아밀라제 억제제는 이 군의 예일 수 있다.

또한, 렉틴을 코딩하는 유전자는 부가적으로 또는 다른 식으로 살충 성질을 부여할 수 있다. 렉틴(원래 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)으로 명명됨)은 일정 범위의 종으로부터의 적혈구를 응집시킬 수 있는 다가의 탄수화물 결합 단백질이다. 렉틴은 최근 바구미, ECB 및 뿌리벌레에 대한 작용을 갖는 살충제로 확인되었다 (Murdock 등, 1990; Czapla & Lang, 1990). 유용한 것으로 고려되는 렉틴 유전자로는 예를 들면, 보리 및 밀 배아 응집소(WGA) 및 벼 렉틴(Gatehouse 등, 1984)이 포함되고, WGA가 바람직하다.

해충에 도입될 때 곤충에 대해 활성인 크거나 작은 폴리펩티드(예, 분해 펩티드, 펩티드 호르몬, 및 독소 및 독액)의 생산을 조절하는 유전자는 본 발명의 다른 특징을 형성한다. 예를 들면, 특별한 해충을 목표로 하는 유충 호르몬 에스테라아제의 발현은 살충 작용을 야기하거나 또는 변태의 중지를 일으킬 것이다 (Hammock 등, 1990)

곤충 각피의 본래 상태에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 형질전환 옥수수 발현 유전자는 본 발명의 또다른 특징을 형성한다. 이러한 유전자로는 키티나아제, 단백질분해효소, 지질 가수분해효소를 코딩하는 유전자, 및 키틴 합성을 억제하는 화합물인 니코마이신의 생산을 위한 유전자가 포함되고, 이 중 어느 유전자의 도입도 곤충 저항성 옥수수 식물을 생산할 것으로 고려된다. 곤충 탈피에 영향을 미치는 활성을 코딩하는 유전자 (예, 엑디스테로이드 UDP-글루코스 전이효소의 생산에 영향을 미치는 유전자)도 또한 본 발명의 유용한 형질전환 유전자의 범위에 해당된다.

해충에 대한 숙주 식물의 영양 품질을 감소시키는 화합물의 생산을 촉진하는 효소를 코딩하는 유전자도 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 스테롤 조성을 변화시킴으로써 식물에 살충 활성을 부여할 수 있다. 곤충은 식이에 의해 스테롤을 얻어 호르몬 합성 및 막 안정성을 위해 사용한다. 따라서, 예를 들면, 바람직하지 못한 스테롤의 생산을 직접 촉진하거나 또는 바람직한 스테롤을 바람직하지 못한 형태로 전환하는 새로운 유전자의 발현에 의한 식물 스테롤 조성의 변화는 곤충 성장 및(또는) 발생에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 따라서 식물에 살충 활성을 부여한다. 지방 산화효소는 곤충에서 영양 저항성 효과를 나타내고 식이의 영양 품질을 감소시키는 것으로 밝혀진 천연 식물 효소이다. 따라서, 본 발명의 추가의 태양은 곤충 먹이공급에 저항할 수 있는, 증진된 지방 산화효소 활성을 갖는 형질전환 식물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 식물 이차성 대사물의 질적 또는 양적 변화를 달성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 한 예는 유럽 옥수수 천공충, 뿌리벌레 및 여러 다른 옥수수 해충에 대한 저항성을 부여하는 것으로 생각되는 DIMBOA을 생산하도록옥수수를 형질전환하는 것이다. 이러한 사용을 위해 특히 고려되는 후보 유전자로는 DIMBOA 합성 경로에 관련된 것으로 알려진bx좌위에 있는 유전자가 포함된다. 메이신(maysin)의 생산을 조절할 수 있는 유전자, 및 수수에서 두린(dhurrin)의 생산에 관련된 유전자의 도입도 각각 흙벌레 및 뿌리벌레에 대한 저항성을 촉진하는데 유용할 것으로 고려된다.

트립사쿰 닥틸로이데스(Tripsacum dactylroides)는 뿌리벌레를 포함하여 일부 곤충에 저항하는 잔디의 일종이다. 곤충에 유독하거나 또는 곤충에 유독한 화합물의 생합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 트립사쿰으로부터 단리될 것이고, 이 새로운 유전자가 곤충에 대한 저항성을 부여하는데 유용할 것으로 기대된다. 상기 저항성이 제아 마이스(Zea mays)로 전이되었기 때문에, 트립사쿰에서 곤충 저항성의 기초는 유전적인 것으로 공지되어 있다 (Branson 및 Guss, 1972).

잠재적 살충 활성을 갖는 것으로 특성화된 단백질을 코딩하는 추가의 유전자도 또한 본원 발명에 따른 형질전환 유전자로서 사용될 수 있다. 이러한 유전자로는 예를 들면, 뿌리벌레 저해제로 사용될 수 있는 코우피 트립신 억제제 (CpTI; Hilder 등, 1987); 옥수수 뿌리벌레 저해제로 특히 유용할 수 있는 아버멕틴(Avermectin and Abamectin., Campbell, W.C. 편저, 1989; Ikeda 등, 1987)을 코딩하는 유전자; 리보솜 불활성화 단백질 유전자; 및 식물 구조를 조절하는 유전자가 포함된다. 항곤충 항체 유전자, 및 식물의 외부에서 적용한 비독성 살충제(전구 살충제)를 식물 내부에서 살충제로 전환할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 옥수수도 또한 고려된다.

c. 환경 또는 스트레스 저항성

옥수수의 가뭄, 과도한 습기, 추위, 동결, 고온, 염 및 산화적 스트레스(이에 한정하는 것은 아님)와 같은 다양한 환경 스트레스를 견디는 능력의 개선은 또한 신규한 유전자의 발현을 통해 달성할 수 있다. 윈터 플로운더(Winter Flounder; Cutler 등, 1989) 또는 이의 합성 유전자 유도체와 같은 "항동결" 단백질의 도입을 통해 동결 온도에 대한 증가된 저항의 면에서 이익을 얻을 수 있을 것으로 제안된다. 또한, 엽록체에서 글리세롤-3-포스페이트 아세틸전이효소의 증가된 발현을 통해 개선된 추위 내성을 부여할 수 있다 (Wolter 등, 1992). 산화 스트레스에 대한 저항성은 과산화물 불균등화효소의 발현에 의해 부여될 수 있고 (Gupta 등, 1993), 글루타치온 환원효소에 의해 개선될 수 있다 (Bowler 등, 1992). 이러한 전략은 후기 성숙 고수율 변종을 초기 성숙 영역으로 확장하는 것 뿐만 아니라 새로 출현된 분야에서 동결에 대한 저항성을 허용할 수 있다.

식물 수분 함량, 총 수분 전위, 삼투 전위 및 팽압을 유리하게 달성하는 신규한 유전자의 발현은 식물의 가뭄에 견디는 능력을 증진시킬 것으로 고려된다. 본원 명세서에서 사용될 때, 용어 "가뭄 저항성" 및 "가뭄 내성"은 정상적인 환경과 비교시 수분 이용가능성의 감소에 의해 유발된 스트레스에 대한 식물의 증가된 저항성 또는 내성, 및 낮은 수분 환경에서 기능하고 생존하는 식물의 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 예를 들면 삼투압적으로 활성인 용질의 생합성을 코딩하는 유전자의 발현이 가뭄에 대한 보호를 부여할 수 있을 것으로 제안된다. 이러한 부류로는 만니톨 탈수소효소(Lee 및 Saier, 1982) 및 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(Kaasen 등, 1992)을 코딩하는 유전자가 있다. 세포에서 선천성 인산가수분해 효소의 후속 작용을 통해 또는 특별한 인산 가수분해효소의 도입 및 동시발현에 의해, 이들 도입된 유전자는 각각 만니톨 또는 트레할로스(모두 스트레스의 영향을 완화시킬 수 있는 보호 화합물로 널리 보고되었음)의 축적을 야기할 것이다. 형질전환 담배에서 만니톨 축적이 입증되었고, 예비적 결과로부터 이 대사물질을 높은 수준으로 발현하는 식물은 적용된 삼투압 스트레스를 견딜 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Tarczynski 등, 1992, 1993).

마찬가지로, 효소 기능 (예, 알라노핀 또는 프로피온산) 또는 막의 원래 상태(예, 알라노핀)를 보호하는데 있어서 다른 대사물질의 효율이 보고되었고, 따라서, 이들 화합물의 생합성을 코딩하는 유전자의 발현이 만니톨과 유사하거나 또는 보충적인 방식으로 가뭄 저항성을 부여할 것이다. 삼투압적으로 활성이고(이거나) 가뭄 및(또는) 건조 중에 어느 정도 직접적인 보호 효과를 제공하는 천연 대사물질의 다른 예로는 과당, 에리스리톨(Coxson 등, 1992), 소르비톨, 둘시톨(Karsten 등, 1992), 글루코실글리세롤(Reed 등, 1984; Erdmann 등, 1992), 설탕, 스타키오스(Koster 및 Leopold, 1998; Blackman 등, 1992), 라피노오스(Bernal-Lugo 및 Leopold, 1992), 프롤린(Rensburg 등, 1993), 글리신베타인(Wyn-Jones 및 Storey, 1982), 오노니톨 및 피니톨(Vernon 및 Bohnert, 1992)이 포함된다. 한 예시적 실시태양에서 미오이노시톨 o-메틸 전이효소에 의해 나타난 바와 같이, 스트레스 동안 수관 연속 성장 및 증가된 번식 적응도는 상술한 삼투압적으로 활성인 화합물 또는 다른 유사 화합물을 조절하는 것과 같은 유전자의 도입 및 발현에 의해 증가될 것이다.

특정 단백질의 발현도 가뭄 내성을 증가시킬 수 있을 것으로 고려된다. 후기 배형성 단백질은 구조적 유사성에 기초하여 새 개의 부류로 지정되었다 (Dure 등, 1989 참조). LEA의 세 부류 모두 성숙(즉, 건조) 종자에서 입증되었다. 이들 세 유형의 LEA 단백질에서, 타입-II가 일반적으로 식용 식물 부분에서 가뭄 및(또는) 건조 내성에 관련되어 있다 (즉, Mundy 및 Chua, 1998; Piatkowski 등, 1990; Yamaguchi-Shinozaki 등, 1992). 최근, 담배에서 타입-III LEA(HVA-1)의 발현이 식물의 키, 성숙도 및 가뭄 내성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 (Fitzpatrick, 1993). 따라서, 세 개의 LEA 군으로부터의 구조 유전자의 발현은 가뭄 내성을 부여할 수 있다. 수분 스트레스 동안 유도된 다른 유형의 단백질로는 티올 단백질분해효소, 알돌라아제 및 막통과 운반체가 포함되고 (Guerrero 등, 1990), 이들은 가뭄 스트레스 동안 다양한 보호 및(또는) 회복과 같은 기능을 부여할 수 있다. 또한, 지질 생합성 및 따라서 막 조성에 영향을 미치는 유전자도 식물에서 가뭄 내성을 부여하는데 유용할 것으로 고려된다.

이들 유전자 중 다수는 또한 동결 내성(또는 저항성)을 개선한다. 동결 및 가뭄 중 일어나는 물리적 스트레스는 성격상 유사하고, 유사한 방식으로 완화될 수 있다. 이들 유전자의 구조성 발현은 유리할 수 있으나, 이들 신규한 유전자를 발현시키는 바람직한 수단은 팽압 유발 프로모터(예, 본원에 참고로 인용한 문헌[Guerrero 등, 1987 및 Shagan 등, 1993]에 기술된 팽압 유발 유전자에 대한 프로모터)의 사용에 의한 것일 수 있다. 옥수수는 이들 유전자의 공간적 및 시간적 발현 패턴에 의해 스트레스를 더 잘 견딜 수 있다.

건조한 토양으로부터 물의 추출을 증가시키는 특별한 형태적 형질에 관련된 유전자의 발현이 유익할 것으로 제안된다. 예를 들면, 뿌리 특성을 변화시키는 유전자의 도입 및 발현이 물의 흡수를 증진시킬 수 있다. 또한, 스트레스 중 번식 적응도를 증진시키는 유전자의 발현은 상당히 유용할 것으로 고려된다. 예를 들면, 꽃가루의 떨어뜨림과 자성 꽃 부분 즉, 실크(silk)의 수용의 공시태상(共時態相)을 개선시키는 유전자의 발현은 유익할 것이다. 게다가, 스트레스 중 낟알 낙태를 최소화하는 유전자의 발현은 곡립 수확량을 증가시킬 것이고, 따라서 유용할 것으로 제안된다.

수확량을 결정하는 물의 전체적인 역할에 비추어, 신규한 유전자의 도입 및 발현을 통해 옥수수로 하여금 물을 더 효율적으로 이용하게 하는 것은 토양의 물 이용가능성이 제한되지 않은 경우에서도 전체적인 성능을 개선시킬 것이다. 물의 이용가능성과 관련된 전 범위의 스트레스에 걸쳐 물의 이용을 최대화하는 옥수수의 능력을 개선시키는 유전자를 도입함으로써, 수확량 안정성 또는 수확 성능의 일관성을 실현할 수 있다.

d. 질병 저항성

옥수수와 같은 외떡잎류 식물에 유전자를 도입함으로써 질병 저항성을 증가시킬 수 있을 것으로 제안된다. 바이러스, 박테리아, 진균 및 선충류에 의해 발생된 질병에 대한 저항성을 생성하는 것이 가능하다. 또한, 도입된 유전자의 발현을 통해 진균독소를 생성하는 생물을 조절할 수 있을 것으로 고려된다.

바이러스에 대한 저항성은 신규한 유전자의 발현을 통해 생성될 수 있다. 예를 들면, 형질전환 식물에서 바이러스 외피 단백질의 발현이 당해 바이러스 및 다른 밀접하게 관련된 바이러스의 감염에 대한 저항성을 부여할 수 있다는 것이 입증되었다 (Cuozzo 등, 1988, Hemenway 등, 1988, Abel 등, 1986). 필수적인 바이러스 기능을 표적화한 안티센스 유전자의 발현은 상기 바이러스에 대한 저항성을 부여할 수 있을 것으로 고려된다. 예를 들면, 바이러스 핵산의 복제를 담당하는 유전자를 표적화한 안티센스 유전자는 상기 복제를 저해하여 당해 바이러스에 대한 저항성을 가져올 수 있다. 안티센스 유전자의 사용을 통한 다른 바이러스 감염의 방해도 바이러스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다고 믿어진다. 나아가, 부수체 바이러스의 사용을 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 다른 방법을 통해 바이러스에 대한 저항성을 달성할 수 있을 것으로 제안된다.

신규한 유전자의 도입을 통해 박테리아 및 진균에 의해 발생된 질병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있을 것으로 제안된다. 소위 "펩티드 항생제", 병원 관련(PR) 단백질, 독소 저항성, 및 형태적 특성과 같은 숙주-병원체 상호작용에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 유전자가 유용할 것으로 고려된다. 펩티드 항생제는 박테리아 및 다른 미생물의 성장을 억제하는 폴리펩티드 서열이다. 예를 들면, 세크로핀(cecropin) 및 마가이닌(magainin)으로 지칭되는 펩티드 부류는 다수 종의 박테리아 및 진균의 성장을 억제한다. 옥수수와 같은 외떡잎류 식물에서 PR 단백질의 발현은 박테리아 질병에 대한 저항성을 부여하는 데 유용할 수 있을 것으로 제안된다. 이러한 유전자는 병원체의 숙주 식물에 대한 공격 후 유발되고, 5개 이상의 부류의 단백질로 분류되었다 (Bol, Linthorst, 및 Cornelissen, 1990). β-1,3-글루카나아제, 키티나아제, 및 질병 생물에 대한 식물 저항성에서 기능하는 것으로 믿어지는 오스모틴(osmotin) 및 다른 단백질이 PR 단백질에 포함된다. 항진균 성질을 갖는 다른 유전자, 예를 들면 UDA(쐐기풀 렉틴) 및 헤베인 (Broakaert 등, 1989; Barkai-Golan 등, 1978)이 확인되었다. 일부 식물 질병은 식물독소에 의해 발병하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 질병에 대한 저항성은 식물독소를 분해하거나 아니면 불활성화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 신규한 유전자의 발현을 통해 달성될 것으로 제안된다. 또한, 숙주 식물과 병원체의 상호작용(예, 잎 각피의 밀랍성의 증가 또는 다른 형태적 특성)을 변화시키는 신규한 유전자의 발현은 숙주 식물의 조직에 침입하는 질병 생물의 능력을 감소시키는데 유용할 수 있을 것으로 제안된다.

식물 기생성 선충류는 옥수수를 포함하여 많은 식물에서 질병의 원인이다. 신규한 유전자의 발현을 통해 옥수수 식물이 이들 생물에 대해 저항성을 갖게 할 수 있을 것으로 제안된다. 숙주 식물을 인식하거나 또는 숙주 식물에 부착하는 선충류의 능력을 변화시키고(변화시키거나), 식물로 하여금 단백질을 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 살선충 화합물을 생산하도록 함으로써 선충류 감염을 조절할 수 있을 것으로 기대된다.

e. 진균독소의 감소 및(또는) 제거

아플라톡신(aflatoxin) 및 푸모니신(fumonisin)을 포함하여, 옥수수와 같은 외떡잎류 식물에 관련된 진균에 의한 진균독소의 생산은 곡립을 유용하지 못하게하는 중요한 인자이다. 이들 진균 생물은 질병 증후를 일으키지 않고(않거나) 식물의 성장을 방해하지 않으나, 동물에 독성인 화학물질(진균독소)을 생산한다. 이들 진균의 성장의 억제는 이들 독성 물질의 합성을 감소시키고, 따라서 진균독소 오염에 기인한 곡립 손실을 감소시킬 것으로 고려된다. 또한, 옥수수와 같은 외떡잎류 식물에 진균 성장을 방해하지 않으면서 진균독소 합성을 억제하는 신규한 유전자를 도입하는 것이 가능할 것으로 제안된다. 나아가, 진균독소를 비독성으로 할 수 있는 효소를 코딩하는 신규한 유전자의 발현은 곡립의 진균독소 오염을 감소시키는데 유용할 것으로 고려된다. 상기 기전의 어느 것도 곡립에서 진균독소의 존재를 감소시킬 것이다.

f. 곡립 조성 또는 품질

곡물 성장의 우선적 목표인 곡립을 개선하기 위해, 외떡잎류 식물 특히, 옥수수와 같은 상업적으로 중요한 곡물에 유전자를 도입할 수 있다. 곡립의 구체적인 최종 용도에 따라, 이러한 방식으로 생산된 넓은 범위의 신규한 형질전환 식물을 생각할 수 있다.

옥수수 곡립의 가장 큰 용도는 사료용 또는 식품용이다. 곡립의 조성을 변화시키는 유전자의 도입은 사료 또는 식품의 가치를 크게 증진시킬 수 있다. 옥수수 곡립의 주요 조성은 녹말, 단백질 및 오일이다. 이들 옥수수 곡립의 각 주요 성분은 그 양 또는 조성을 변화시킴으로써 개선할 수 있다. 예시로써 몇가지 예를 언급할 수 있으나, 모든 가능성을 완전히 열거하는 것은 아니다.

옥수수를 포함하는 곡립의 단백질은 특히 돼지, 가금류 및 사람에게 공급될때 사료 및 식품의 목적으로 최적이지 않다. 상기 단백질은 이들 종의 식이에 필수적인 몇몇 아미노산이 결핍되어 있어서 곡립에 보조제의 첨가를 요구한다. 제한 필수 아미노산으로는 라이신, 메티오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린, 아르기닌 및 히스티딘이 포함될 수 있다. 어떤 아미노산은 옥수수에 다른 사료 제제용 투입물을 보충한 후에만 제한된다. 예를 들면, 라이신 요구를 만족시키기 위해 옥수수에 콩가루를 보충할 때, 메티오닌이 제한된다. 아미노산 생합성의 증가, 아미노산 분해의 감소, 단백질에서 아미노산 저장의 증가, 또는 아미노산의 종자 또는 곡립으로의 운반 증가를 위한 유전자의 도입을 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 기전에 의해 종자 및 곡립에서 이들 필수 아미노산의 양을 높일 수 있다.

아미노산의 생합성을 증가시키기 위한 한 기전은 아미노산 생합성 경로를 통제하지 않는 유전자를 도입해서 식물이 생산되는 양을 더이상 충분히 조절할 수 없도록 하는 것이다. 이것은 아미노산 최종 생산물의 양에 의해 정상적으로 조절되는 아미노산 생합성 경로에서 단계를 통제하지 않거나 우회함으로써 수행될 수 있다. 예로는 라이신 및 트레오닌 생산을 증가시키기 위한 아스파르토키나제 또는 디히드로디피콜린산(DHDP)-합성효소의 비통제 형태를 코딩하는 유전자의 도입이 포함된다. 이화작용 경로에서 단계를 촉매하는 라이신-케토글루타레이트 환원효소와 같은 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 DNA 서열을 도입함으로써 아미노산 이화작용을 감소시킬 수 있다.

아미노산의 균형을 개선하기 위해, 선천적 단백질 발현의 증가, 불량한 조성을 갖는 선천적 단백질 발현의 감소, 선천적 단백질 조성의 변화, 또는 우수한 조성을 갖는 완전히 새로운 단백질을 코딩하는 유전자의 도입을 포함하는 다양한 방법으로 곡립의 단백질 조성을 변화시킬 수 있다. 예로는 저장 단백질 중 제인 패밀리의 구성원의 발현을 감소시키는 DNA의 도입이 포함될 수 있다. 이 DNA는 제인 단백질의 발현 또는 오파크(opaque)-2 유전자 생성물과 같은 제인 발현 조절자의 발현을 감소시키는 리보자임 또는 안티센스 서열을 코딩할 수 있다. 또한, 동시억제 현상, 즉, 형질전환을 통해 도입된 동일 구조 유전자 또는 유전자 단편의 발현을 통한 내인성 유전자의 발현의 억제를 통해 곡립의 단백질 조성을 변화시킬 수 있을 것으로 제안된다 (Goring 등, 1991). 또한, 도입된 DNA는 제인을 분해하는 효소를 코딩할 수 있다. 달성된 제인 발현의 감소는 더 바람직한 아미노산 조성을 갖는 단백질의 증가 또는 녹말과 같은 다른 종자 구성물질의 증가를 수반할 수 있다. 별법으로, 글로불린 단백질 중 하나 또는 옥수수의 제인(10 kD)과 같은 적합한 아미노산 조성을 갖는 선천성 단백질을 위한 코딩 서열, 및 상기 단백질의 발현을 높이기 위해 디자인된 프로모터 또는 다른 조절 서열을 포함하는 재조합 유전자를 도입할 수 있다. 상기 유전자의 코딩 서열은 필수 아미노산을 위한 첨가 또는 대체 코돈을 포함할 수 있다. 나아가, 다른 종으로부터 얻은 코딩 서열, 또는 종자의 아미노산 조성을 증진시키도록 디자인된 완전히 특이한 펩티드 서열을 코딩하는 부분 또는 완전 합성 서열을 사용할 수 있다.

곡립의 오일 함량을 변화시키는 유전자의 도입은 유용할 수 있다. 오일 함량의 증가는 사료 및 식품에서의 사용을 위한 대사가능 에너지의 함량 및 밀도의 증가를 가져올 수 있다. 도입된 유전자는 지방산 또는 지질 생합성에서 속도 제한또는 조절 단계를 제거하거나 또는 감소시키는 효소를 코딩할 수 있다. 이러한 유전자로는 아세틸-CoA 카르복시화효소, ACP-아실전이효소, β-케토아실-ACP 합성효소 및 다른 잘 알려진 지방산 생합성 활성을 코딩하는 유전자가 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 아실 운반체 단백질과 같은 효소적 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자도 가능하다. 오일에 존재하는 지방산의 균형을 변화시키는 유전자를 도입하여 더 건강에 좋거나 또는 영양있는 사료를 제공할 수 있다. 도입된 DNA는 또한 하기하는 바와 같은 곡립에 존재하는 지방산의 비율을 변화시키면서 지방산 생합성에 관련된 효소의 발현을 차단하는 서열을 코딩할 수 있다.

예를 들면, 분지도를 증가시킴으로써 곡립의 녹말 성분의 영양가를 증진시키는 유전자를 도입하여 녹말 대사를 지연시킴으로써 소에서 녹말의 이용을 개선할 수 있다.

곡립의 주요 구성성분에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 사료 또는 식품으로 사용되는 곡립의 다양한 다른 자양 상태, 가공 또는 품질 특성에 영향을 미치는 유전자를 도입할 수 있다. 예를 들면, 곡립의 착색을 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다. 어떤 동물 사료에서는 황색 색소의 증가 및 안정성이 바람직하고, 이것은 크산토필(xanthophyll) 및 카로틴(carotene) 생산에서 속도 제한 단계를 제거함으로써 그들의 생산을 증진시키는 유전자를 도입함으로써 달성할 수 있다. 이러한 유전자는 피토엔(phytoene) 합성효소, 피토엔 탈포화효소 또는 리코펜(lycopene) 합성효소의 변화된 형태를 코딩할 수 있다. 별법으로, 비착색 백색 옥수수는 다수의 식품의 제조에 바람직하고, 이는 색소 생산 경로에서 단계를 차단하거나 또는 제거하는 DNA의 도입에 의해 생성될 수 있다.

주로 옥수수 또는 다른 곡립을 포함하는 사료 또는 식품은 비타민의 양이 불충분하므로, 적당한 영양가를 제공하기 위해 보충되어야 한다. 예를 들면, 비타민 A, E, B₁₂, 콜린 등을 포함하여 종자에서 비타민 생합성을 증진하는 유전자의 도입을 생각할 수 있다. 옥수수 곡립은 또한 최적의 영양가를 위한 충분한 양의 무기질을 함유하지 못한다. 인, 황, 칼슘, 망간, 아연 및 철을 함유하는 화합물의 축적 또는 이용가능성에 영향을 미치는 유전자는 유용할 것이다. 예로는 피트산(phytic acid) 생산을 감소시키거나 또는 피트산 분해를 증진시키는 효소인 피타제(phytase)를 코딩하는 유전자의 도입을 들 수 있다. 이러한 유전자는 식이에서 이용가능한 인산염의 양을 증가시켜, 무기질 인산염의 보충 필요성을 감소시킬 것이다.

사료 및 식품용 옥수수 또는 다른 곡물을 개량하는 다른 다수의 예가 기술될 것이다. 이 개량은 반드시 곡립을 포함하는 것은 아닐 수 있으나, 예를 들면 저장 목초를 위한 옥수수의 가치를 개선할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 소를 위한 우수한 사료 가치와 관련된 "갈색 중앙맥" 표현형을 가져오는 것과 같은 리그닌 생산을 변화시키는 서열을 포함하는 DNA를 도입할 수 있다.

사료 또는 식품 가치의 직접적인 개선 이외에, 옥수수의 가공 및 상기 가공에 기인하는 생산물의 가치를 개선하는 유전자를 또한 도입할 수 있다. 주요한 옥수수 가공법은 웨트밀링(wetmilling)이다. 예를 들면 침지 시간을 감소시킴으로써효율을 증가시키고 가공 단가를 감소시키는 신규한 유전자의 발현을 통해 옥수수를 개량할 수 있다.

웨트밀링 생산물의 가치를 개선하는 것은 녹말, 오일, 옥수수 글루텐 밀(gluten meal)의 양 또는 품질, 또는 옥수수 글루텐 사료의 성분을 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 녹말 생합성에서 속도 제한 단계를 확인하고 제거함으로써, 또는 곡립의 다른 성분의 양을 감소시켜 녹말의 비율을 증가시킴으로써 녹말을 증가시킬 수 있다. 전자의 예로는, 변화된 조절 활성을 갖거나 또는 높은 수준으로 발현되는 ADP-포도당 가피로인산분해효소를 코딩하는 유전자의 도입을 들 수 있다. 후자의 예로는, 예를 들면 씨 발생의 후기 단계 중 발현되는 단백질 또는 오일 생합성의 선택적 억제제가 포함될 수 있다.

아밀로펙틴에 대한 아밀로오스의 비율, 녹말 분자의 크기 또는 분지 패턴을 변화시킴으로써 녹말의 성질을 유리하게 변화시킬 수 있다. 이러한 변화를 통해 젤라틴화 온도, 젤라틴화 열, 필름 및 페이스트의 투명성, 유동 성질 등의 변화를 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 넓은 범위의 성질을 개질할 수 있다. 이들 성질의 변화를 달성하기 위해, 과립 결합성 또는 용해성 녹말 합성효소 활성, 또는 분지 효소 활성을 코딩하는 유전자를 단독으로 또는 혼합하여 도입할 수 있다. 안티센스 구조체와 같은 DNA도 또한 이들 효소의 내인성 활성의 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 도입된 유전자 또는 구조체는 녹말 생합성 및 녹말 과립 발생에서 그의 발현을 특정 간격에 맞추는 조절 서열을 함유할 수 있다. 또한, 녹말 분자의 포도당 잔기의 생체내 유도체화, 또는 다른 변경을 야기하는 유전자를 도입하고 발현시키는 것은 유용할 수 있다. 유도체화를 촉매하는 효소의 존재 및 녹말 과립에서 적당한 기질의 접근성으로 제한한다면, 어떠한 분자의 공유적 부착도 고려할 수 있다. 중요한 유도체화의 예로는, 후속적인 생체내 유도체화를 위한 부위를 제공하거나 또는 이온성 전하의 도입을 통해 녹말 성질에 영향을 미치는 아민, 카르복실 또는 포스페이트기와 같은 관능기의 첨가가 포함될 수 있다. 다른 변경의 예로는, 히드록실기의 손실, 또는 히드록실의 알데히드 또는 카르복실기로의 산화와 같은 포도당 단위의 직접적인 변화가 포함될 수 있다.

오일은 옥수수의 웨트밀링의 또다른 생산물이며, 유전자의 도입 및 발현에 의해 그 가치를 개선할 수 있다. 웨트밀링에 의해 추출될 수 있는 오일의 양은 사료 및 식품에 대해 상술한 바와 같은 방법에 의해 증가시킬 수 있다. 또한, 쿠킹 오일, 쇼트닝, 윤활제 또는 다른 오일 유래 생산물의 생산 및 사용에 있어서의 성능을 개선하기 위해 또는 식품 관련 응용 분야에 사용시 건강 속성을 개선하기 위해 오일 성질을 변화시킬 수 있다. 또한, 추출시 화학적 합성을 위한 출발 물질로서 작용할 수 있는 신규한 지방산을 합성할 수 있다. 오일에 존재하는 지방산의 유형, 양 또는 지질 배열을 변화시킴으로써 오일 성질을 변화시킬 수 있다. 이것은 신규한 지방산 및 이를 함유하는 지질의 합성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자를 첨가하거나, 또는 가능하게는 전구체의 양을 감소시키면서 선천성 지방산의 양을 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 별법으로, 지방산 생합성에서 단계를 저속화하거나 또는 차단하여 전구체 지방산 중간체를 증가시키는 DNA 서열을 도입할 수 있다. 첨가될 수 있는 유전자로는 데새츄라타아제 (desaturatase), 에폭시다아제(epoxidase), 히드라타아제 (hydratase), 데히드라타아제 (dehydratase), 및 지방산 중간체를 포함하는 반응을 촉매하는 다른 효소가 포함된다. 차단될 수 있는 촉매 단계의 대표적인 예로는, 각각 스테아르산 및 올레산의 축적을 가져오는 스테아르산으로부터 올레산으로의 불포화 및 올레산으로부터 리놀렌산으로의 불포화가 포함된다. 다른 예로는, 신장 단계를 차단하여 C₈내지 C₁₂포화 지방산의 축적을 야기하는 것이다.

신규한 옥수수 식물을 얻기 위한 유전자를 도입함으로써, 옥수수 웨트밀링의 다른 주요 생산물인 옥수수 글루텐 밀 및 옥수수 글루텐 사료를 또한 개선할 수 있다. 가능한 대표적인 것으로는 식품 및 사료 가치의 개선에 대해 상술한 것을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 종래의 옥수수 식물에서 전혀 생산되지 않았거나 또는 동일한 수준으로 생산되지 않았던 유용한 생물학적 화합물의 생산 또는 제조에 옥수수 식물을 사용하는 것을 추가로 고려할 수 있다. 이들 화합물을 생산하는 신규한 옥수수 식물은 옥수수 형질전환 방법에 의해 유전자를 도입하고 발현시킴으로써 가능해진다. 가능성이 높은 것으로는 단백질, 핵산, 초기 및 중간 대사 물질, 탄수화물 중합체 등과 같은 현재 생물체에 의해 생산되는 어떠한 생물학적 화합물도 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 화합물은 식물에 의해 제조되고 수확 및(또는) 가공시 추출되어, 몇몇 거론하자면, 약물, 방향제, 산업적 효소와 같은 현재 인정되고 있는 임의의 유용한 목적을 위해 사용될 수 있다.

추가로, 형질전환 식물에서 도입된 유전자에 의해 잠재적으로 코딩되는 곡립 형질 또는 성질 범위를 예시하는 가능한 예로는, γ-제인 합성을 증진시키는 유전자의 도입을 통해 수출 목적을 위한 감소된 절단 감수성 또는 건조 밀링에 의한 가공시 더 큰 그릿(grit) 크기를 갖는 곡립, 과피 두께를 증가시키는 유전자를 통해 개선된 팝핑(popping) 품질 및 팽창 용적을 갖는 팝콘, 색소 생산 경로에 관련된 효소의 발현을 효과적으로 차단하는 유전자의 도입을 통한 식품 및 개선된 품질의 알콜성 음료수를 위한 보다 백색인 곡립을 갖는 옥수수, 또는 사탕 수수의 위축 유전자(설탕 합성효소를 코딩함)와 같은 향미에 영향을 미치는 유전자의 도입을 통한 사탕 수수가 포함된다.

g. 식물의 작물학적 특성

옥수수가 성장할 수 있는 장소인지를 결정하는 2 개의 인자는 성장 시기 중 평균 일일 온도, 및 서리 사이의 기간이다. 옥수수의 성장이 가능한 지역내에는 옥수수가 성숙하여 수확되는 최대 시간에 대한 다양한 제한이 존재한다. 특별한 지역에서 성장될 옥수수는 가능한 최대의 수확량으로 요구되는 기간내에 성숙하고, 수확가능한 수분 함량으로 건조될 수 있는 능력으로 선택된다. 따라서, 상이한 성장 지역을 위한 다양한 성숙도를 갖는 옥수수가 개발되고 있다. 수확하기에 충분히 건조될 필요성 이외에, 수확 후 추가의 건조를 위해 요구되는 에너지의 양을 최소화하기 위해 최대한의 건조가 들판에서 일어나는 것이 바람직하다. 또한, 곡립이 더 쉽게 건조될수록, 성장 및 씨의 충실을 위해 더 많은 시간이 이용가능하다. 상이한 성장 지역에 적합한, 또는 동일 성장 지역에 적합하나 수확시 개선된 수확량 대 수분 비를 갖는 신규한 옥수수 변종을 탄생시키기 위해, 성숙 및(또는) 건조에 영향을 미치는 유전자를 확인하여 형질전환 기술을 통해 옥수수계에 도입할 수 있을 것으로 고려된다. 식물 발생의 조절에 관련된 유전자(예, 옥수수에서 확인된, 엽설이 없고 거친 엽초 유전자)의 발현은 특히 유용할 것이다.

입모성 및 다른 식물 성장 특성을 개선하는 유전자를 옥수수에 도입할 수 있을 것으로 고려된다. 더 강한 줄기, 개선된 뿌리계를 부여하거나, 또는 이삭 탈락을 방지하거나 감소시키는 신규한 유전자의 발현은 농부에게 매우 유용할 것이다. 예를 들면, 빛 분포 및(또는) 차단을 증가시킴으로써 이용가능한 광동화의 총량을 증가시키는 유전자의 도입 및 발현이 유리할 것으로 제안된다. 또한, 광합성의 효율 및(또는) 잎 수관을 증가시키는 유전자의 발현은 곡립의 생산성을 더욱 증가시킬 것이다. 상기 방법들은 들판에서 식물 개체수를 증가시킬 것이다.

후 시기(late season) 식물 노화의 지연은 곡립으로의 동화의 흐름을 증가시켜 수확량을 증가시킬 것이다. 옥수수내에서 "스테이 그린(stay green)"과 관련된 유전자의 과다 발현, 또는 노화를 지연시키는 어떠한 유전자의 발현도 유리할 것으로 제안된다. 예를 들면, 페스투카 프라텐시스(Festuca pratensis; Davies 등, 1990)에서 비황색화 돌연변이체가 확인되었다. 이 유전자 뿐만 아니라 다른 유전자의 발현도 엽록체의 미성숙 분해를 방지하여 수관 기능을 유지할 수 있다.

h. 영양물 이용성

이용가능한 영양물을 이용하는 능력은 옥수수와 같은 외떡잎류 식물의 성장에서 제한 인자가 될 수 있다. 신규한 유전자의 도입에 의해 영양물 흡수 허용,pH 극치, 식물을 통한 이동, 저장소, 및 대사 활성을 위한 이용가능성을 변화시킬 수 있을 것으로 제안된다. 이러한 변형을 통해 옥수수와 같은 식물은 이용가능한 영양물을 더 효율적으로 이용할 것이다. 예를 들면, 식물에 정상적으로 존재하고 영양물 이용에 관련된 효소의 활성의 증가는 영양물의 이용가능성을 증가시킬 것으로 고려된다. 이러한 효소의 예로는 피타제를 들 수 있다. 또한, 신규한 유전자의 발현은 이전에는 접근하지 못했던 영양 공급원(예, 더 복잡한 분자, 아마도 거대 분자로부터 영양가가 있는 성분을 유리하는 효소)을 이용가능하게 할 수 있을 것으로 고려된다.

i. 웅성 불임성

웅성 불임성은 잡종 종자의 생산에 유용하다. 신규한 유전자의 발현을 통해 웅성 불임성을 생성할 수 있을 것으로 제안된다. 예를 들면, 웅성 꽃 및(또는) 배우체의 발생을 방해하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현은 웅성 불임성을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 형질전환 담배 및 오일종자 채종의 꽃밥에서 발현되는 키메라 리보핵산 가수분해효소 유전자는 웅성 불임성을 초래하는 것으로 입증되었다 (Mariani 등, 1990).

옥수수에서 세포질성 웅성 불임성을 부여하는 다수의 돌연변이가 발견되었다. 특히, T 세포질로 지칭되는 한 돌연변이는 또한 서던 옥수수 잎 마름병에 대한 감수성과 상호관련이 있다. T 세포질과 상호관련된 TURF-13(Levings, 1990)으로 지명된 DNA 서열이 확인되었다. 형질전환을 통해 TURF-13을 도입함으로써 질병 감수성으로부터 웅성 불임성을 분리하는 것이 가능할 것으로 제안된다. 번식 및곡립 생산을 위해 웅성 수정능력을 회복할 수 있는 능력이 필요할 때는, 웅성 수정능력의 회복을 코딩하는 유전자를 도입할 수 있음이 제안된다.

j. 음성 선택 표지

역선택될 수 있는 형질을 코딩하는 유전자의 도입은 바람직하지 못한 연관 유전자를 제거하는데 유용할 것이다. 공동형질전환에 의해 2 이상의 유전자가 도입될 때, 이 유전자들이 숙주 염색체 상에서 함께 연관될 것으로 고려된다. 예를 들면, 식물에 곤충 저항성을 부여하는 Bt 유전자를 코딩하는 유전자는, 선택 표지로서 유용하고 식물에 제초제인 이그나이트(Ignite, 등록상표)에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자와 함께 식물에 도입될 수 있다. 그러나, 식물이 제초제인 이그나이트에 저항성이면서 또한 곤충 저항성인 것은 바람직하지 않을 것이다. 또한, 예를 들면 식물 전체에서 bar 유전자의 발현을 원하지 않을 경우, 그러한 조직에서 발현되는 안티센스 bar 유전자를 도입할 수 있을 것으로 제안된다. 따라서, 상기 bar 유전자는 발현되어 선택 표지로서 유용하나, 식물 전체에 제초제 저항성을 부여하는데는 유용하지 않다. 상기 bar 안티센스 유전자는 음성 선택 표지이다.

또한, 유전자 표적화를 통해 생산된 희귀 상동성 재조합체를 위해 형질전환체 집단을 선별하기 위해서는 음성 선택이 필요한 것으로 고려된다. 예를 들면, 상동성 재조합체는 그 세포에서 이전에 발현된 유전자의 불활성화를 통해 확인할 수 있다. 네오마이신 인산전달효소 II (npt II)에 대한 안티센스 유전자는 담배 (Nicotiana tabacum) 및 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana; Xiang, C. 및 Guerra, D.J. 1993)에서 음성 선택 표지로 연구되었다. 이 예에서 센스 및 안티센스 npt II 유전자를 형질전환을 통해 식물에 도입하였고, 생성된 식물은 카나마이신 항생제에 감수성을 나타내었다. 안티센스 nptII 유전자 부위에서 숙주 세포 염색체로 통합되어 안티센스 유전자를 불활성화시키는 도입된 유전자는 식물에 카나마이신 및 다른 아미노글리코시드 항생제에 대한 저항성을 부여할 것이다. 따라서, 항생제 저항성을 선별함으로써 희귀 부위 특이성 재조합체를 확인할 수 있다. 마찬가지로, 불활성화시 화합물에 대한 저항성을 부여하는, 식물에 선천성이거나 또는 형질전환을 통해 도입된 어떠한 유전자도 음성 선택 표지로서 유용할 것이다.

음성 선택 표지는 또한 다른 방법으로도 유용할 것으로 고려된다. 하나는 비연관 부위로의 전좌를 선택할 수 있는 형질전환계를 구성하는데 사용하는 것이다. 태깅(tagging) 과정에서, 전이성 인자가 동일 염색체 상의 유전적 연관 부위로 이동하는 것은 가장 흔한 것이다. 비연관 좌위에 전좌가 일어난 희귀종 식물의 회복을 위한 선택 표지는 유용할 것이다. 예를 들면, 시토신 탈아미노효소는 이러한 목적에 유용할 것이다 (Stouggard, J., 1993). 이 효소의 존재 하에서, 5-플루오로시토신은 식물 및 동물 세포에 유독한 5-플루오로우라실로 전환된다. 만일 전이성 인자가 시토신 탈아미노효소에 대한 유전자에 연관된다면, 생성된 식물이 5-플루오로시토신에 저항성인 전좌를 선택함으로써 비연관 부위로의 전좌를 선택할 수 있다. 모 식물 및 연관 부위로의 전좌를 함유하는 식물은 여전히 5-플루오로시토신에 감수성을 나타낼 것이다. 5-플루오로시토신에 대한 저항성은 전이성 인자 및 시토신 탈아미노효소 유전자의 유전적 분리를 통한 시토신 탈아미노효소 유전자의 손실에 기인한다. 이러한 맥락에서 식물이 어떤 화합물에 감수성이게 하는 단백질을 코딩하는 다른 유전자도 또한 유용할 것이다. 예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 T-DNA 유전자 2는 α-나프탈렌 아세트아미드(NAM)의 α-나프탈렌 아세트산(NAA)으로의 전환을 촉매하는 단백질을 코딩하여, 식물 세포가 고농도의 NAM에 감수성이게 한다.

또한, 음성 선택 표지는 전이인자 태깅계의 구성에 유용할 것이다. 예를 들면, Ac, Master Mu 또는 En/Spn과 같은 자율 전이성 인자를 음성 선택 표지로 표지함으로써, 자율 인자가 게놈으로 안정하게 통합되지 않은 형질전환체를 선택할 수 있다. 이것은 예를 들면, Ds와 같은 결손 전이성 인자의 전좌를 트랜스로 활성화시키기 위해 자율 인자의 일시적 발현이 요구되나 자율 인자의 안정한 통합은 요구되지 않을 때, 바람직할 것으로 제안된다. 결손 인자를 안정화시키기 위해 즉, 더이상 전이되는 것을 방지하기 위해 자율 인자의 존재가 바람직하지 않을 수 있다. 그러나, 만일 식물에서 자율 전이성 인자의 안정한 통합이 요구된다면, 음성 선택 표지의 존재는 번식 과정 중 자율 인자의 제거를 가능하게 할 수 있다는 것이 제안된다.

k. 비단백질 발현 서열

1. RNA 발현

식물 표현형에 영향을 미치나 단백질로 해독되지 않는 RNA 전사체를 발현하기 위해 핵산을 옥수수 및 다른 외떡잎류에 도입할 수 있다. 두 가지 예로는, 안티센스 RNA 및 리보자임 활성을 갖는 RNA이다. 양자는 선천성이거나 또는 도입된식물 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다.

전사시 표적 전령 RNA의 전부 또는 일부에 상보적인 안티센스 RNA를 생성하는 유전자를 구성하거나 또는 단리할 수 있다. 안티센스 RNA는 전령 RNA의 폴리펩티드 생성물의 생산을 감소시킨다. 폴리펩티드 생성물은 식물 게놈에 위해 코딩된 단백질일 수 있다. 상술한 유전자는 안티센스 유전자로 지칭될 것이다. 따라서, 안티센스 유전자는 형질 전환 방법에 의해 식물에 도입되어 관심있는 선택 단백질의 발현이 감소된 신규한 형질전환 식물을 생산할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 식물에서 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 효소 활성의 감소는 지방산, 아미노산, 탄수화물, 핵산 등과 같은 식물에서 효소적으로 합성된 화합물을 포함하는 반응 생성물을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 별법으로, 단백질은 제인과 같은 저장 단백질 또는 구조 단백질일 수 있고, 이들의 감소된 발현은 각각 종자 아미노산 조성의 변화 또는 식물 형태적 변화를 초래할 수 있다. 상기에서 인용된 가능성들은 예시적인 것으로만 제공되며, 본원의 전 범위를 나타내는 것은 아니다.

또한, 전사시 RNA 효소, 또는 내인성 리보핵산 가수분해효소로 작용하여 선택 서열을 갖는 RNA 분자의 절단을 촉매할 수 있는 리보자임을 생성하는 유전자를 구성하거나 또는 단리할 수 있다. 선택 전령 RNA의 절단은 코딩된 폴리펩티드 생성물의 생산을 감소시킬 수 있다. 이들 유전자는 그들을 함유하는 신규한 형질전환 식물을 제조하는데 사용될 수 있다. 형질전환 식물에서는 안티센스 RNA에 의해 영향을 받을 수 있는 상기에서 인용된 폴리펩티드를 포함하는(이에 한정하는 것은 아님) 폴리펩티드의 양이 감소될 수 있다.

또한, 유전자를 도입하여 공동억제 기전에 의해 선천성 유전자 생성물의 발현이 감소된 신규한 형질전환 식물을 생산하는 것도 가능하다. 담배, 토마토 및 피튜니아(Goring 등, 1991; Smith 등, 1990; Napoli, C. 등, 1990; van der Krol 등, 1990)에서 선천성 유전자의 센스 전사체의 발현이 안티센스 유전자에 대해 관찰된 것과 유사한 방식으로 선천성 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거할 것이라는 것이 입증되었다. 도입된 유전자는 표적 선천성 단백질의 전부 또는 일부를 코딩할 것이나, 이의 해독은 선천성 단백질의 수준의 감소에 요구되지 않을 수 있다.

2. 비RNA 발현

Ds, Ac 또는 Mu와 같은 전이성 인자의 DNA 인자를 포함하는 DNA 인자를 유전자에 삽입하여 돌연변이를 일으킬 수 있다. 유전자를 불활성화(또는 활성화)하여 특별한 형질을 "태그"하기 위해 상기 DNA 인자를 삽입할 수 있다. 이 경우에 이 인자의 유용성은 인자가 게놈에서 이동할 수 있는 능력에 의존하지 않기 때문에, 전이성 인자는 태그된 돌연변이의 불안정화를 일으키지 않는다. 일단 목적하는 형질이 태그되면, 도입된 DNA 서열은 예를 들면, PCR 유전자 클로닝 기술과 함께 도입된 DNA 서열을 PCR 전구체로 사용하여 대응하는 유전자를 클로닝하는데 사용될 수 있다 (Shapiro, 1983; Dellaporta 등, 1988). 일단 확인되면, 필요한 경우, 조절 영역을 포함하여 특정 형질을 위한 유전자 전체를 단리하여 클로닝할 수 있고, 목적하는 바대로 조작할 수 있다. 유전자 태그를 위해 생물체에 도입된 DNA 인자의 유용성은 DNA 서열에 비의존적이고, DNA 서열의 어떠한 생물학적 활성 즉, RNA로의 전사 또는 단백질로의 해독에도 의존하지 않는다. DNA 인자의 고유한 기능은 유전자의 DNA 서열을 붕괴시키는 것이다.

신규한 합성 서열을 포함하여 비발현 DNA 서열을 세포, 그의 식물 및 종자의 독점적인 "라벨"로서 세포에 도입할 수 있을 것으로 고려된다. 이 DNA의 고유한 기능은 생물의 기원을 확인하는 것일 것이기 때문에, 라벨 DNA 인자가 숙주 생물에 내인성인 유전자의 기능을 반드시 붕괴시킬 필요는 없을 것이다. 예를 들면, 식물에 특이 DNA 서열을 도입할 수 있고, 이 DNA 인자는 라벨원으로부터 유래된 모든 세포, 식물 및 이들 세포의 자손을 동정할 것이다. 라벨 DNA의 삽입을 통해 독점적 생식질 또는 이들로부터 유래된 생식질을 비라벨 생식질과 구별할 수 있을 것으로 제안된다.

도입될 수 있는 다른 가능한 인자로는, 관심있는 발현가능한 유전자 주위에 위치하여 유전자의 전체적인 발현을 증가시키고 식물 게놈으로의 혼입시 위치 의존적 영향을 감소(Stief 등, 1989; Phi-Van 등, 1990)시킬 수 있는 치킨 리소자임 A 인자(Stief, 1989)와 같은 매트릭스 부착 영역 인자(MAR)가 있다.

식물 수분 함량, 총 수분 전위, 삼투 전위 및 팽압을 유리하게 달성하는 신규한 미리 선택된 DNA 단편의 발현은 식물의 가뭄에 대한 내성을 증진시킬 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "가뭄 저항성" 및 "가뭄 내성"은 정상적인 환경에 비교하여 물의 이용가능성이 감소됨으로써 유발된 스트레스에 대한 식물의 저항성 또는 내성의 증가, 및 낮은 수분 환경에서 기능하고 생존하며 상대적으로 뛰어난 방식으로 수행하는 식물의 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 예를 들면 삼투압적 활성 용질의 생합성을 코딩하는 미리 선택된 DNA 서열의 발현은 가뭄에 대한 보호를 부여할 수 있다. 만니톨 탈수효소(Lee 및 Saier, 1982) 및 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(Kassen 등, 1992)를 코딩하는 DNA가 이러한 종류의 미리 선택된 DNA 단편에 포함된다. 세포에서 선천성 인산 가수분해 효소의 후속적인 작용을 통해 또는 특정 인산 가수분해 효소의 도입 및 동시발현에 의해, 상기 도입된 미리 선택된 DNA는 각각 스트레스의 효과를 완화시킬 수 있는 보호 화합물로서 잘 알려진 만니톨 또는 트레할로스의 축적을 초래할 것이다. 형질전환 담배에서 만니톨의 축적이 입증되었고, 예비 결과로부터 상기 대사 물질을 높은 수준으로 발현하는 식물은 삼투적 스트레스에 견딜 수 있다는 것이 밝혀졌다 (상기 인용된 Tarczynski 등, 1992, 1993).

마찬가지로, 다른 대사 물질의 효소 기능(예, 알라노핀 또는 프로피온산) 또는 막의 원래 상태(예, 알라노핀)의 보호에 대한 효능이 보고 되었고 (Loomis 등, 1989), 따라서, 이들 화합물의 생합성을 코딩하는 미리 선택된 DNA 단편의 발현은 만니톨과 유사하거나 또는 보충적인 방식으로 가뭄 저항성을 부여할 수 있다. 삼투 활성이고(이거나) 가뭄 및(또는) 건조 중 어떤 직접적인 보호 효과를 제공하는 천연 대사 물질의 다른 예로는 당, 및 과당, 에리트리톨(Coxson 등, 1992); 소르비톨, 둘시톨(Karsten 등, 1992); 글루코실글리세롤(Reed 등, 1984; Erdmann 등, 1992); 설탕, 녹말(Koster 및 Leopold, 1988; Blackman 등, 1992); 오노니톨, 피니톨(Vernon 및 Bohnert, 1992); 및 라피노스(Bernal-Lugo 및 Leopold, 1992)와 같은 당 유도체가 포함된다. 당이 아닌 기타 삼투압적으로 활성인 용질로는프롤린(Rensburg 등, 1993) 및 글리신-베타인(Wyn-Jones 및 Storey, 1981)이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 스트레스 중 수관의 연속 성장 및 증가된 번식 적응도는 한 실시태양에서 미오이노시톨 O-메틸 전이효소에 의해 밝혀진 바와 같이, 상술한 삼투압적으로 활성인 화합물 및 이러한 다른 화합물을 조절하는 것과 같은 미리 선택된 DNA 단편의 도입 및 발현에 의해 증진될 수 있다.

특정 단백질의 발현도 가뭄 내성을 증가시킬 수 있을 것으로 고려된다. 후기 배발생 단백질은 구조적 유사성에 기초하여 세 부류로 지정되었다 (Dure 등, 1989 참조). 상기 단백질의 세 부류 모두는 성숙(즉, 건조) 종자에서 입증되었다. 상기 단백질의 세 부류에서, 타입-II (데히드린-타입)는 일반적으로 식용 식물에서 가뭄 및(또는) 건조 내성에 관련되어 있다 (Mundy 및 Chuna, 1988; Piatkowski 등, 1990; Yamaguchi Shinozaki 등, 1992). 최근, 담배에서 타입-III LEA (HVA-1)의 발현이 식물의 키, 성숙 및 가뭄 내성에 영향을 미친다는 것이 발견되었다 (Fitzpatrick, 1993). 따라서, 세 군으로부터의 구조 유전자의 발현은 가뭄 내성을 부여할 수 있다. 수분 스트레스 중 유발된 다른 유형의 단백질로는 티올 단백질분해효소, 알돌라아제 및 막통과 운반체(Guerero 등, 1990)가 포함되고, 이들은 가뭄 스트레스 중 다양한 보호 및(또는) 회복 기능을 부여할 수 있다. 지질 생합성, 따라서 막 조성에 영향을 미치는 미리 선택된 DNA 단편의 발현도 식물에 가뭄 저항성을 부여하는데 유용할 수 있다.

가뭄 저항성을 개선하는 다수의 유전자는 보충적인 작용 양식을 갖는다. 따라서, 이들 유전자의 조합은 옥수수에서 가뭄 저항성을 개선하는데 있어서 부가및(또는) 상승 효과를 가질 수 있다. 이들 유전자 중 다수는 또한 동결 내성(또는 저항성)을 개선한다. 동결 및 가뭄 중 유발된 물리적 스트레스는 성질이 비슷하고 유사한 방식으로 완화될 수 있기 때문이다. 이들 유전자의 구조적 발현이 유익할 수 있으나, 이들 신규한 유전자를 발현시키는 바람직한 수단은 문헌[Guerrero 등, 1990; Shagan 등, 1993, 이들 문헌은 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 팽압 유발 유전자에 대한 프로모터와 같은 팽압 유발 프로모터의 사용을 통해서일 것이다. 옥수수는 이들 유전자의 시간적 및 공간적 발현 패턴을 통해 수분 스트레스를 더 잘 견딜 수 있다.

건조 토양으로부터 수분 추출을 증가시키는 특정 형태학적 형질에 관련된 유전자의 발현은 유익할 것으로 제안된다. 예를 들면, 뿌리 특성을 변화시키는 유전자의 도입 및 발현은 물의 흡수를 증진할 수 있다. 또한, 스트레스 중 번식 적응도를 증진시키는 DNA의 발현은 매우 유용할 것으로 고려된다. 예를 들면, 꽃가루 떨어뜨림과 자성 꽃 부분 즉, 실크의 수용의 공시태양을 개선하는 DNA의 발현은 유익할 것이다. 뿐만 아니라, 스트레스 중 씨 낙태를 최소화하는 유전자의 발현은 수확될 곡립의 양을 증가시키므로 유용할 것으로 제안된다. 나아가, 옥수수와 같은 외떡잎류에서 적당한 조절 서열을 갖는 이소펜테닐 전이효소 유전자의 도입 및 발현에 의한 시토키닌 수준의 조절은 외떡잎류의 스트레스 저항성 및 수확량을 개선할 수 있다 (Gan 등,Science,270, 1986 (1995)).

수확량을 결정하는데 있어서 수분의 전체적인 역할을 고려할 때, 신규한 유전자의 도입 및 발현을 통해 옥수수가 물을 더 효과적으로 이용할 수 있게 하는 것은 토양의 수분 이용가능성이 제한되지 않은 경우에서도 전체적인 성능을 개선시킬 것으로 고려된다. 수분의 이용가능성과 관련된 전 범위의 스트레스에 걸쳐서 수분 이용을 최대화할 수 있는 옥수수의 능력을 개선하는 유전자를 도입함으로써, 수확량의 안정성 또는 수확의 일관성을 실현할 수 있다.

III. 본 발명의 벡터의 숙주 세포로의 도입

본 발명은 일반적으로 미리 선택된 핵산 서열을 식물 세포와 같은 수용 세포에 도입하여 형질전환 세포를 만드는 단계를 포함한다. 본 발명의 벡터 또는 조성물을 분무 또는 마찰에 의해 식물, 식물의 부분 또는 식물 조직과 접촉시키는 것이 바람직하나, 다른 방법에 의해 시험관 내에서 상기 벡터 또는 조성물을 식물 세포에 도입할 수 있다. 이러한 목적상, 식물 조직원의 세포는 바람직하게는 수정성 형질전환 식물 및(또는) 종자를 재생할 수 있는 배발생 세포 또는 세포주이다. 상기 세포는 외떡잎류 또는 쌍떡잎류로부터 유래될 수 있다. 적합한 식물 종의 예로는 밀, 벼, 아라비돕시스, 담배, 옥수수, 콩 등이 포함된다. 바람직한 세포 유형은 옥수수 세포와 같은 외떡잎류 세포이며, 이것은 현탁 세포 배양의 형태일 수 있거나, 또는 완전한 식물 부분 (예, 미성숙 배) 또는 칼루스와 같은 특정 식물 조직(예, 타입 I 또는 타입 II 칼루스)의 형태일 수 있다.

당업자에게 공지된 다수의 방법 중 어느 한 방법에 의해 식물 조직원의 세포를 형질전환할 수 있다. 예로는, 전기천공법에 의한 DNA의 식물 세포로의 직접 전이에 의한 형질전환 (미국 특허 제5,384,253호 및 미국 특허 제5,472,869호, 본원에 참고로 인용됨; Dekeyser 등, 1990); PEG 침전에 의한 DNA의 식물 세포로의 직접적 전이 (Hayashimoto 등, 1990); 마이크로프로젝트 충격(McCabe 등, 1988; Gordon-Kamm 등, 1990; 미국 특허 제5,489,520호; 미국 특허 제5,538,877호; 및 미국 특허 제5,538,880호, 본원에 참고로 인용됨)에 의한 DNA의 식물 세포로의 직접 전이; 리포좀; 및 아그로박테리움으로의 감염을 통한 DNA의 식물 세포로의 전이가 있다. 전기천공법 또는 마이크로프로젝트 충격과 같은 방법은 발현 카세트가 대장균 유래의 플라스미드 클로닝 벡터 상에서 간단히 운반될 수 있는 "나출된(naked)" DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 바이러스 벡터의 경우에는, 시스템이 복제 기능을 보유하나 질병 유도를 위한 기능은 결핍되어 있는 것이 바람직하다.

쌍떡잎류의 형질전환을 위한 바람직한 방법은 엽-디스크 프로토콜(leaf-disk protocol; Horsch 등, 1985)을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스로 식물 세포를 감염시키는 것이다. 제아 마이스(Zea mays)와 같은 외떡잎류는 배발생 칼루스 조직 또는 미성숙 배의 마이크로프로젝트 충격에 의해, 또는 펙틴 가수분해 효소 함유 효소를 사용하여 세포벽을 부분적으로 효소 분해한 후 전기천공법에 위해 형질전환될 수 있다 (미국 특허 제5,384,253호 및 미국 특허 제5,472,869호). 예를 들면, 미성숙 제아 마이스 배로부터 유래된 배발생 세포주는 문헌[Gordon-Kamm 등 (1990) 또는 미국 특허 제5,489,520호; 미국 특허 제5,538,877호 및 미국 특허 제5,538,880호, 상기 인용됨]에 기술된 가속 입자 처리에 의해 형질전환될 수 있다. 절개된 미성숙 배는 또한 문헌[미국 특허 출원 제08/112,245호 및 PCT 공개 제WO 95/06128호]에 기술된 바와 같이, 조직 배양 유도, 선택 및 재생 전 형질전환을 위한 표적으로 사용될 수 있다. 또한, 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한외떡잎류 식물의 형질전환 방법이 문헌[Hiei 등 (유럽 특허 제0 604 662호, 1994) 및 Saito 등 (유럽 특허 제0 672 752호, 1995)]에 기술되어 있다.

마이크로프로젝트 충격 또는 전기천공법과 같은 방법은 발현 카세트가 임의의 대장균 유래의 플라스미드 클로닝 벡터상에서 간단히 운반될 수 있는 "나출된" DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 바이러스 벡터의 경우에는, 시스템이 복제 기능을 보유하나 질병 유도를 위한 기능은 결핍되어 있는 것이 바람직하다.

전기천공법에 위한 형질전환을 달성하기 위해, 현탁 세포 배양물과 같은 취약 조직 또는 배발생 칼루스를 사용하거나, 또는 미성숙 배 또는 다른 유기 조직을 직접 형질전환할 수 있다. 미리 선택된 세포 또는 기관의 세포벽을 펙틴 분해 효소(펙티나제(pectinase) 또는 펙톨리아제(pectolyase))에 노출시키거나 또는 조절된 방식으로 기계적으로 손상시킴으로써 부분적으로 분해시킬 수 있다. 그 후, 상기 세포는 이 단계에서 수행될 수 있는 전기천공법에 의해 DNA 흡수에 대해 수용성이 될 것이고, 형질전환 세포는 새로 혼입된 DNA의 성질에 따른 적합한 선택 또는 선별 프로토콜에 의해 확인할 수 있다.

형질전환 DNA 단편을 식물 세포에 전달하기 위한 더 유리한 방법은 마이크로프로젝트 충격이다. 이 방법에서, 미소입자는 DNA를 사용하여 코팅될 수 있고, 추진력에 의해 세포에 전달될 수 있다. 입자의 예로는 텅스텐, 금, 백금 등으로 구성된 것이 포함된다.

어떤 경우에는, 마이크로프로젝트 충격을 사용하여 수용 세포로의 DNA 전달을 위해 금속 입자로의 DNA 침전이 필요하지 않을 것이라고 고려된다. 또한, 입자는 DNA로 코팅되기 보다는 DNA를 함유할 수 있을 것으로 고려된다. 따라서, 입자는 DNA 전달의 수준을 증가시킬 수 있으나, 원래 DNA를 세포에 도입하는데 필수적인 것은 아니다.

외떡잎류를 재현가능하고 안정하게 형질전환시키는 유효한 수단이라는 것 이외에, 마이크로프로젝트 충격의 장점은 원형질체의 단리(Christou 등, 1988), 부분적으로 분해된 세포의 형성 또는 아그로박테리움 감염에 대한 이환성이 요구된다는 것이다. 가속에 의해 DNA를 옥수수 세포로 전달하는 방법의 예로는, DNA로 코팅된 입자 또는 세포를 스테인레스강 또는 니텍스(Nytex) 스크린과 같은 스크린을 통해 현탁 배양된 옥수수 세포로 덮인 여과기 표면상으로 밀어내는데 사용될 수 있는 바이오리스틱스 (Biolistics) 입자 전달 시스템이 있다 (Gordon-Kamm 등, 1990). 이 스크린은 입자가 큰 응집체로 수용 세포에 전달되지 않도록 입자들을 분산시킨다. 발사 기구와 충격을 가할 세포 사이에 끼인 스크린은 발사 응집체의 크기를 감소시키고, 응집된 발사체에 의해 수용 세포에 가해질 손상을 감소시킴으로써 더 높은 빈도로 형질전환시키는데 기여할 수 있을 것으로 믿어진다.

충격을 위해서, 바람직하게는 현탁 세포를 여과기 또는 고체 배지상에서 농축한다. 별법으로, 미성숙 배 또는 다른 표적 세포를 고체 배지상에 배열할 수 있다. 충격을 가할 세포를 마이크로프로젝트 정지판(stopping plate) 아래로 적당히 떨어진 곳에 위치시킨다. 필요하다면, 하나 이상의 스크린을 가속 기구와 충격을 가할 세포 사이에 위치시킨다. 본원에 기재한 기술을 사용하여, 표지 유전자를 일시 발현하는 세포의 병소를 최대 1,000 개 이상 얻을 수 있다. 충격을 가한 후 48시간에 외부 유전자 생성물을 발현하는 한 병소의 세포 수는 종종 약 1 내지 10이고, 평균 약 1 내지 3이다.

충격 형질전환에서, 충격 전 배양 조건 및 충격 파라미터를 최적화하여 최대 갯수의 안정한 형질전환체를 얻을 수 있다. 이 기술에서는 충격을 위한 물리적 및 생물학적 파라미터 모두가 중요하다. 물리적 인자로는 DNA 및(또는) 미소발사체 침전물을 조작하는 것을 포함하는 것, 또는 거대 또는 미소발사체의 경로 및 속도에 영향을 미치는 것이 있다. 생물학적 인자로는 충격 전 및 충격 직후에 세포의 조작에 관련된 모든 단계, 충격에 관련된 손상을 경감시키는데 도움을 주는 표적 세포의 삼투적 조절, 및 선형 DNA 또는 원래의 초코일 플라스미드 DNA와 같은 형질전환 DNA의 성질이 포함된다. 미성숙 배의 성공적인 형질전환에 있어서 충격전 조작이 특히 중요한 것으로 믿어진다.

따라서, 조건을 충분히 최적화하기 위해 소규모의 연구로 다양한 충격 파라미터를 조절하는 것이 고려된다. 특히, 갭 거리, 비행 거리, 조직 거리 및 헬륨 압력과 같은 물리적 파라미터를 조절하고자 할 수 있다. 또한, 수용 세포의 생리학적 상태에 영향을 미침으로써 형질전환 또는 통합 효율에 영향을 미치는 조건을 조절함으로써, 손상 감소 인자(TRF)를 최소화할 수 있다. 예를 들면, 최적의 형질전환을 위해 수용 세포의 삼투 상태, 조직 수화, 및 계대배양 단계 또는 세포 주기를 조절할 수 있다. 이러한 소규모의 최적화 연구의 결과는 본원에 개시되어 있고, 다른 통상의 조절의 수행은 본원의 개시에 의해 당업자에게 공지될 것이다.

형질전환을 위한 식물 조직원의 선택은 숙주 식물의 성질 및 형질전환 프로토콜에 달려 있다. 유용한 조직원으로는 칼루스, 현탁 배양 세포, 원형질체, 잎 단편, 줄기 단편, 숫꽃대, 꽃가루, 배, 배축, 괴경, 분열조직 등이 포함된다. 조직원은 형질전환 후 완전한 수정성 식물을 재생할 수 있는 능력을 보유(예, 분화전능 세포를 함유)하도록 선택되고, 형질전환 된다. 타입 I 또는 타입 II 배 옥수수 칼루스 및 미성숙 배는 바람직한 제아 마이스 조직원이다. 외떡잎류의 형질전환을 위한 조직원의 선택은 미국 특허 출원 제08/112,245호 및 국제 공개 제WO 95/06128호(본원에 참고로 인용됨)에 상세하게 기술되어 있다.

형질전환은 선택된 식물 조직에 따른 조건하에 수행된다. 식물 세포 또는 조직을 미리 선택된 DNA 서열을 갖는 DNA에 유효한 기간 동안 노출시킨다. 이것은 전기천공법에 있어서 1초 미만의 펄스의 전류에서부터 플라스미드 함유 아그로박테리움 세포의 존재에서 2 내지 3일간 공동배양까지의 범위일 수 있다. 사용된 완충액 및 배지도 식물 조직원 및 형질전환 프로토콜에 따라 변화할 수 있다. 다수의 형질전환 프로토콜에서는 고체 배지판의 표면상에 형질전환시킬 식물 세포 또는 조직으로부터 멸균 여과지에 의해 분리된 현탁 배양 세포(예, 담배 또는 블랙 맥시칸 사탕 옥수수)의 공급 층이 사용된다.

미리 선택된 핵산 서열을 식물에 전이하는 바람직한 방법은 본 발명의 조성물을 사용하여 식물 또는 식물의 일부를 분무 또는 마찰하는 것이다. 바람직한 외떡잎류 식물에는 사탕 옥수수, 귀리, 벼, 옥수수, 밀, 알팔파, 토끼풀, 김의털, 수수, 기장, 보리, 호밀 또는 티모티 그라스(timothy grass)가 포함된다. 바람직한 쌍떡잎류 식물에는 브라시카, 오이, 담배, 감자, 토마토, 평지, 딸기, 대두, 해바라기, 아라비돕시스, 피튜니아, 완두, 카놀라(canola), 콩, 상치, 시금치, 알팔파, 목화, 루핀(rupine) 및 당근이 포함된다.

IV. 미리 선택된 핵산 단편의 검출

재생 식물에서 미리 선택된 핵산 단편(들) 또는 "형질전환 유전자(들)"의 존재를 확인하기 위해, 다양한 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석으로는 예를 들면, 서던 흡입 및 노던 흡입, 제자리 혼성화, 및 PCR 또는 RT-PCR과 같은 핵산 기초 증폭 방법과 같은 당업자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 분석; 예를 들면, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 흡입) 또는 효소 기능에 의해 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 수단; 잎 또는 뿌리 분석과 같은 식물 부분 분석; 및 예를 들면, 질병 또는 해충 저항성에 대한 완전히 재생된 식물의 표현형의 분석이 포함된다.

당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 미리 선택된 핵산 단편의 존재를 결정하기 위해, 세포주 또는 식물의 부분으로부터 DNA를 단리할 수 있다. 아마도 세포에서 서열의 재배열 또는 결실에 기인하여 원래의 서열이 항상 존재하는 것은 아닐 것이다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 본 발명의 방법을 통해 도입된 핵산 인자의 존재를 결정할 수 있다. 이 기술을 사용하여 핵산의 별개의 단편들을 증폭시키고, 겔 전기영동법에 의해 검출한다. 이러한 종류의 분석을 통해 미리 선택된 핵산 단편이 안정한 형질전환체에 존재하는지 결정할 수 있으나, 도입된 미리 선택된 핵산 단편의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 입증할 수는 없다. 또한, PCT 기술을 사용하여, 형질전환체가 게놈의 상이한 부위에 도입된 외인성 유전자를 가지는지, 즉, 형질전환체가 독립 기원을 가지는지 결정할 수 없다. PCR 기술을 사용하여, 도입된 미리 선택된 DNA 단편에 인접한 숙주 게놈 DNA 단편을 클로닝할 수 있을 것으로 고려된다.

서던 혼성화 기술을 사용하여 DNA의 숙주 게놈으로의 통합의 단정적인 증거 및 독립적인 개별 형질전환체를 결정할 수 있다. 이 기술을 사용하여 숙주 게놈 및 플랭킹 숙주 DNA 서열에 도입된 특정 DNA 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 주어진 형질전환체의 서던 혼성화 패턴은 형질전환체의 특성을 확인하는데 알맞다. 또한, 서던 혼성화를 통해 도입된 미리 선택된 DNA 단편이 고분자량 DNA에 존재함을 증명할 수 있다. 즉, 도입된 미리 선택된 DNA 단편이 숙주 세포 게놈에 통합되었는지를 확인할 수 있다. 서던 혼성화 기술은 예를 들면, 미리 선택된 DNA 단편의 존재와 같은 PCR을 사용하여 얻어지는 정보를 제공할 뿐만 아니라, 게놈으로의 통합을 증명하고, 각각의 개별 형질전환체를 특성화한다.

서던 혼성화 기술을 변형한 도트(dot) 또는 슬롯 블롯(slot blot) 혼성화 기술을 사용하여 예를 들면, 미리 선택된 DNA 단편의 존재와 같은 PCR로부터 유래된 것과 동일한 정보를 얻을 수 있다.

PCR 및 서던 혼성화 기술은 미리 선택된 DNA 단편의 자손으로의 전이를 증명하는데 사용할 수 있다. 대부분의 경우에, 주어진 형질전환체에 대한 특징적인 서던 혼성화 패턴은 자손에서 하나 이상의 멘델리안(Mendelian) 유전자로서 분리될 것이고(Spencer 등, 1992; Laursen 등, 1994), 이것은 유전자의 안정한 유전을 나타낸다. 생식계통 전이, 동일한 서던 흡입 혼성화 패턴, 및 칼루스, 모형질전환체 (R₀) 식물 및 형질전환 유전자로 분리된 R₁자손에서 형질전환 DNA의 양에 의해 칼루스 및 모형질전환체의 비키메릭 성질이 암시되었다.

DNA 분석 기술은 식물의 부분으로부터 단리된 DNA를 사용하여 수행될 수 있지만, RNA는 특정 세포 또는 조직에서만 발현될 수 있으므로, 분석을 위해 이들 조직으로부터 RNA를 제조할 필요가 있을 것이다. PCR 기술은 또한 도입된 미리 선택된 DNA 단편으로부터 생성된 RNA의 검출 및 정량에 사용될 수 있다. PCR을 이와 같이 실시할 때, 우선 역전사효소와 같은 효소를 사용하여 RNA를 DNA로 역전사시킬 필요가 있고, 다음으로 통상의 PCR 기술을 사용하여 DNA를 증폭시킨다. 대부분의 경우에서 PCR 기술은 유용하나, RNA 생성물의 완전성을 입증하지 못할 것이다. RNA 생성물의 성질에 관한 추가의 정보는 노던 흡입에 의해 얻을 수 있다. 이 기술은 RNA종의 존재를 증명하고, 그 RNA의 완전성에 관한 정보를 제공할 것이다. RNA종의 존부는 또한 도트 또는 슬롯 블롯 노던 혼성화를 사용하여 결정할 수 있다. 이 기술은 노던 흡입을 변형한 것으로서, RNA종의 존부만을 입증할 것이다.

서던 흡입 및 PCR은 문제의 미리 선택된 DNA 단편을 검출하는데 사용할 수 있으나, 미리 선택된 DNA 단편이 발현될지에 관한 정보를 제공하지 못한다. 발현은, 도입된 미리 선택된 DNA 단편의 단백질 생성물을 확인하거나 또는 그의 발현에 의해 야기된 표현형의 변화를 평가함으로써 평가할 수 있다.

특정 단백질의 생성 및 확인을 위한 분석은 단백질의 물리화학적, 구조적,기능적 성질 또는 기타 성질을 이용할 수 있다. 특이한 물리화학적 또는 구조적 성질을 통해 단백질을 분리할 수 있고, 천연 또는 변성 겔 전기영동, 또는 등전점 전기영동과 같은 전기영동법, 또는 이온 교환 또는 겔 배제 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술에 의해 확인할 수 있다. 각 단백질의 특이한 구조는 특정 항체를 사용하여 ELISA 분석과 같은 포맷에서 그것의 존재를 검출하는 기회를 제공한다. 전기영동 기술에 의해 분리된 각 유전자 생성물의 위치를 결정하기 위해 항체를 사용하는 웨스텐 흡입과 같은 훨씬 더 큰 특이성을 갖는 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 관심있는 생성물의 정체를 완전히 확인하기 위해, 정제 후 아미노산 서열화에 의한 평가와 같은 부가의 기술을 사용할 수 있다. 이들은 가장 일반적으로 사용되는 것들이나, 다른 방법도 부가적으로 사용할 수 있다.

기능성, 특히 특정 기질 및 생성물을 포함하는 특정 화학반응을 촉매하는 효소의 능력에 의해 단백질의 발현을 확인하는 분석 방법을 또한 사용할 수 있다.

이들 반응에 이어 물리적 또는 화학적 반응에 의한 기질의 손실 또는 반응 생성물의 생산을 제공하고, 이를 정량할 수 있다. 분석되는 효소만큼 다양한 예가 존재하나, 두 가지를 언급한다면, 포스피노트리신 및¹⁴C-아세틸 CoA로부터 방사성표지 아세틸화 포스피노트리신의 생성에 의한 PAT 효소 활성, 또는 안트라닐레이트의 형광 손실에 의한 안트라닐레이트 합성효소 활성에 대한 분석이 포함될 수 있다.

유전자 생성물의 발현은 매우 자주 그 발현의 표현형 결과를 평가함으로써결정된다. 이들 분석은 또한 식물의 화학적 조성, 형태 또는 생리적 성질의 변화를 분석하는 것을 포함(이에 한정하는 것은 아님)하는 많은 형태를 취할 수 있다. 화학적 조성은 아미노산 조성을 변화시키는 효소 또는 저장 단백질을 코딩하는 미리 선택된 DNA 단편의 발현에 의해 변화될 수 있고, 아미노산 분석, 또는 근적외선 반사 분광계에 의해 분석될 수 있는 녹말 양을 변화시키는 효소에 의해 검출될 수 있다. 형태학적 변화로는 더 큰 키 또는 더 두꺼운 줄기가 포함될 수 있다. 식물 또는 식물 부분의 부과된 처리에 대한 반응의 변화는 매우 자주 생물분석이라고 하는 조심스럽게 조절된 조건하에 평가된다.

본원에서 생성된 형질전환 식물은 다양한 상업적 및 연구 목적에 유용할 것으로 기대된다. 전통적인 농경에서의 사용을 위해 재배자에게 유익한 형질(예, 수분 결핍에 대한 저항성, 해충 저항성, 제초제 저항성 또는 증가된 수확량과 같은 작물학적 형질), 식물로부터 수확되는 곡립의 소비자에게 유익한 형질(예, 식품 또는 사료의 개선된 영양물 함량) 또는 식품 가공자에게 유익한 형질(예, 개선된 가공 형질)을 가지는 형질전환 식물을 만들 수 있다. 이러한 용도에 있어서, 식물은 일반적으로 성장하여 그들의 곡립이 식품 또는 사료에 사용된다. 그러나, 줄기, 껍질, 식용부분 등을 포함하여 식물의 다른 부분도 동물 목초의 일부로서의 사용 또는 관상용을 포함하는 유용성을 가질 수 있다. 종종, 옥수수 및 다른 농작물의 화학적 구성성분(예, 오일 또는 녹말)은 식품 또는 산업적 용도로 추출되고, 이러한 성분의 양이 증가되거나 또는 개질된 형질전환 식물을 만들 수 있다.

형질전환 식물은 또한 관심있는 분자가 식물의 일부, 종자 등으로부터 추출되거나 또는 정제되는, 단백질 또는 다른 분자의 상업적 제조에 사용될 수 있다. 식물로부터의 세포 또는 조직을 배양하거나, 시험관 내에서 성장시키거나 또는 발효시켜 이러한 분자를 제조할 수 있다.

형질전환 식물은 또한 상업적 번식 프로그램에 사용되거나, 또는 관련 농작물 종의 식물에 교배되거나 번식될 수 있다. 미리 선택된 DNA 단편에 의해 코딩되는 개량점은 예를 들면, 원형질체 융합에 의해 예를 들면, 옥수수 세포에서 다른 종의 세포로 전이될 수 있다.

나중에 전통적인 돌연변이 및 선택에 의해 생성될 수 있는 유익한 돌연변이체를 확인하기 위해, 형질전환 식물은 삽입 돌연변이유발을 통한 새로운 돌변변이체 식물의 생성을 포함하여 연구 또는 번식에 있어서 다양한 용도를 가질 수 있다. 예로는 유전적 변화를 일으키는데 사용될 수 있는 전이성 인자를 코딩하는 재조합 DNA 서열의 도입을 들 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 독점적 계통 또는 변종을 확인하는데 사용될 수 있는 특이 "기호 서열" 또는 다른 표지 서열을 갖는 식물을 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 실시예에 의해 더 설명되어질 것이나, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

식물에서 국소 또는 전신 퍼짐을 위한 FHV 발현 벡터

현존하는 식물 바이러스 벡터와 관련된 문제점을 극복하고 식물에서 유전자를 발현시키기 위한 매우 유효한 바이러스 벡터 시스템을 개발하기 위해, 노다바이러스 벡터를 제조하였다. 이 벡터(도 8)는, 녹색 형광 단백질(GFP; Epel 등, 1996; Casper 등, 1996)로 지칭되는 표지 유전자가 캡시드 전구체의 절단 부위(베타/감마, 도 1)에 도입되어, 상이한 시간 간격으로 접종된 잎에서 녹색 형광을 측정함으로써 FHV, 또는 핵단백질 복합체 FHV RNA:FHV 외피 단백질:GFP의 발현 및 이동을 모니터할 수 있는 FHV RNA-2 서열을 포함하였다. GFP는 원래 해파리 아쿠오레아 빅토리아(Av)로부터 단리된 238 개의 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다. 이것은 395 nm에서 최대 흡광도를 갖는 청색 광을 흡수하고, 509 nm에서 피크 방출을 갖는 녹색 광을 방출한다. GFP가 원핵 또는 진핵 세포에서 발현될 때, 이것은 청색 광(자외선)에 의한 여기시 강한 녹색 형광을 생성하고, 이 형광은 숙주로부터 어떠한 부가의 유전자 생성물도 요구하지 않는다.

벡터 pF2G3(도 8)을 구성하기 위해, 블루스크립트 파아지미드(Bluescript phagemid) 벡터(Stratagene, 캘리포니아)에서의 FHV RNA-2 (pBWD2)의 cDNA 클론을 사용하였다. 제한효소인 NsiI을 사용하여 절단 부위에서 플라스미드를 개방하였다. NsiI 부위를 함유하는 특이 프라이머를 사용하여 TMV cDNA 클론 p30BGFPC3(pUC19 파지미드 벡터에 TMV RNA 서열 및 GFP 서열을 함유함)으로부터 GFP(주기 3 GFP, 707 bp, 식물에서 발현을 위해 최적화됨) 서열을 PCR 증폭하였다. PCR 생성물을 정제하고, pBWD2의 NsiI 부위에 삽입하였다 (도 8).

2주령의 니코티아나 벤타미아나 식물의 야생형(TRS1), 및 TMV MP(H3NB3) 또는 RCNMV MP를 발현하는 형질전환형 모두를 FHV 복제효소원으로서 10 ng/㎕ FHVRNA 100 ㎕, 또는 pF2G3 및 10 ng/㎕ FHV RNA-1으로부터 제조된 50 ng/㎕ RNA 전사체 100 ㎕를 사용하여 접종하였다. T3 또는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 벡터 DNA로부터 시험관내 전사된 RNA를 제조하였다. TMV MP를 발현하는 형질전환형 니코티아나 벤타미아나 식물을 FHV RNA로 접종시킬 경우 대조군과 비교하여 형질전환형 니코티아나 벤타미아나 잎에서 FHV가 100배 더 높은 수준으로 축적되었기 때문에(도 17), TMV MP 형질전환형 니코티아나 벤타미아나를 사용하였다. 이 결과로부터 TMV MP가 FHV의 세포 대 세포 이동을 촉진한다는 것이 제안되었다. 총 RNA의 RT-PCR로 이 결과를 확인하였다.

식물을 12 시간의 광기(light period)로 23 내지 25℃의 생장 챔버에서 증식시켰다. 이와 함께 p30BGFPC3로부터 제조된 RNA 전사체를 사용하여 잎을 접종시키는 대조 실험을 실시하였다. (1) 잎으로부터 추출된 총 RNA의 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해, (2) 잎에 수동 UV 램프를 비춰줌으로써 상이한 시간 간격으로 녹색 형광을 측정하는 것에 의해, 잎에서 FHV RNA 및 GFP의 합성을 모니터하였다.

접종 후 15 일에 잎을 수확하였고, 균질화에 이어 핫 페놀 추출(Verwoerd 등, 1989)함으로써 잎(액화 질소에서 동결) 100 mg으로부터 총 RNA를 추출하였다. 수퍼스크립트II (SuperscriptII; 매릴랜드주 베데스다 소재, Gibco/BRL) 및 타크(Taq) 중합효소(위스콘신주 매디슨 소재, Promega)를 각각 사용하여 cDNA로의 역전사(RT) 및 PCR에 의한 증폭을 수행하였다. 42℃에서 1 시간 RT 반응을 수행하였다. PCR에 대한 사이클링 파라미터는 94℃에서 1분 후, 94℃에서 30초, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1.5분으로 35 사이클 후, 72 ℃에서 2분 동안 1 사이클을 수행하였다. 사용한 프라이머는 FHV2R1400(SEQ ID NO:1; ACCTTAGTCTGTTGAC) 및 FHV2F1(SEQ ID NO:2; GTAAACAATTCCAAG)였다. PCR 생성물을 1% 아가로오스 겔 상에서 전기영동하였다 (도 12).

상술한 바와 같이, TMV MP 형질전환 식물에서 FHV의 역가가 100배 증가하는 것이 관찰되었다. 이 결과는 접종된 TMV MP 및 RCNMV MP 형질전환 식물로부터의 RNA를 RT-PCR 분석함으로써 확인되었다. TMV MP 및 RCNMV MP 모두 FHV를 비접종된 이차성 잎으로 이동시켰다 (도 12, 5 내지 8 레인). 비형질전환 식물에서, FHV 서열은 접종된 잎에서만 검출되었고, 비접종된 이차성 잎에서는 검출되지 않았다 (도 12, 3 및 4 레인). 접종 후 상이한 시간에서 FHV RNA의 합성을 모니터했을 때, 야생형 식물에서 FHV 서열의 존재는 7 dpi에서 최대였으나, 14 및 21 dpi에서는 실제적으로 검출이 불가능하였다. 이것은 아마도 세포 대 세포 이동의 부재시에 바이러스 또는 바이러스 핵단백질이 불활성화되었기 때문일 것이다. 그러나, 형질전환 식물에서는, 접종된 잎을 통한 FHV의 이동에 기인하여 10 내지 21 dpi에서 합성이 계속되었다. FHV RNA로 잎의 절반을 접종시키고 RT-PCR에 의해 모니터한 결과, 형질전환 식물에서는 FHV 서열이 비접종된 잎으로 이동하였으나, 야생형 식물에 비교하여 매우 빈약하였다. 식물에서 FHV 서열의 존재는 FHV RNA-1 및 FHV RNA-2에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 결정하였다.

또한, 니코티아나 베타미아나 세포 및 일차성(감염된) 잎에서 NOV 복제를 검출하기 위해 RT-PCR 분석을 사용하였다. RCNMV MP를 발현하는 야생형 및 형질전환식물을 NOV RNA로 접종시키고, 7일 내지 10일 후에 일차성, 이차성 및 삼차성 잎을 회수하였다. 이차성 또는 삼차성 잎에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았으나, 형질전환 식물로부터의 일차성 잎에서는 비형질전환 식물에 비하여 더 많은 양의 바이러스가 검출되었다 (비형질전환형보다 약 5 내지 10배 더 높음임).

녹색 형광에 의해 GFP를 측정한 결과, 10 dpi에서부터 시작하여 F2G3(도 8)로부터 제조된 RNA 전사체로 접종된 잎에서 더덕더덕 붙인 모양의 녹색 형광을 갖는 소영역이 관찰되었다. 이와 반대로, 비접종된 식물에서는 이와 같은 어떠한 형광도 관찰되지 않았다. GFP를 고도로 발현할 수 있는 벡터, 예를 들면, FHV DI 634 기재의 벡터를 구성하였다 (도 7 및 9).

이러한 구조체를 사용하여 녹색 형광이 나타났다 (도 13에 나타낸 바와 같은 30BGFPC3로부터의 RNA 전사체로 감염된 식물의 잎; 도 14의 접종되지 않은 잎과 비교)는 것은 상기 식물에서 MP 및 GFP 뿐만 아니라 FHV도 발현된다는 것을 입증한다.

식물을 통한 식물 바이러스의 장거리 이동은 외피 단백질에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, FHV 벡터의 전신 퍼짐은 식물 바이러스의 외피 단백질(CP)을 벡터에 도입함으로써 더욱 증가시킬 수 있다. 따라서, FHV와 유사한 게놈 전략을 갖는 식물 바이러스인 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스(RCNMV)의 CP를 pFdTmRcG3에 도입하여 pFdTmRcG3를 생성할 수 있었다 (도 10). RCNMV는 게놈이 두 개의 전령 RNA로 분리된 구형의 식물 바이러스이다 (Xiong 등, 1993). RCNMV RNA-1(3.9 kb)은 외피 단백질(CP, 37 kDa)을 코딩하고, RNA-2(1.5 kb)는 RCNMV 이동 단백질(35 kDa)을 코딩한다.

FHV 벡터에서 TMV MP, RCNMV CP 및 GFP 서열은 융합 단백질로 발현될 수 있다. 별법으로, 단백분해 절단 서열을 이들 유전자 사이에 도입하여, 발현된 단백질을 전사 후 개별 단백질로 가공할 수 있다. 처음에, GFP 발현이 상류 서열(즉, TMV MP 및 RCNMV CP)의 완전한 발현을 나타낼 수 있도록 GFP 서열을 3' 말단에 놓는다. 그러나, 본 발명은 도입된 유전자의 어떤 특정 순서에 한정되지 않는다.

실시예 2

식물에 질병 저항성을 도입하기 위한 FHV 벡터의 용도

전신 후천성 저항(SAR)은 식물이 병원체 감염에 저항하기 위해 사용하는 많은 기전 중의 하나이다. 담배에서는, SAR 중 병원체 관련(PR) 단백질을 코딩하는 9 개의 유전자 패밀리가 대등하게 유발된다 (Ryals 등, 1996 참조). 어떤 SAR 관련 단백질(PR1a 및 SAR 8.2)은 담배에서 난균강 피토프토라 파라지티카 (Phytophthora parasitica; Alexander 등, 1992; Alexander 등, 1993) 및 피티움 토룰로숨(Pythium torulosum)에 의해 유발된 식물 질병을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 벡터를 통해 SAR 관련 단백질을 담배 또는 토마토에 도입하는 것은 담배 또는 토마토에서 난균강에 의해 유발된 식물 질병(예, 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 의해 유발된 후기 마름병)을 억제하거나 또는 방지하는데 유용할 수 있다.

본 발명의 벡터에 SAR 유전자를 도입하기 위해, 공지의 서열 및 제한 부위를 갖는 플라스미드(pCGN1788A)에서 SAR 8.2 유전자의 cDNA 클론(도 15)을 사용할 수있다. SAR 8.2 유전자(529 bp)를 함유하는 상기 플라스미드로부터의 BamHI-SstI 단편을 PCR 증폭시키고, PCR 생성물을 FHV 벡터에 연결시켰다. 3 내지 6주령 식물의 담배 또는 토마토 잎을 상기 벡터로부터 유래된 RNA 및 FHV RNA-1으로 동시감염시켰다. CP:MP:SAR 8.2:GFP 융합 단백질의 발현을 형광 측정 및 RT-PCR에 의해 규칙적인 간격으로 모니터하였다. SAR 발현이 개시될 때, 증류수 중의 피티움(Pythium) 또는 피토프토라(Phytophthora) 유주자(ml 당 300 포자)를 사용하여 토양을 적시거나 또는 잎에 분무함으로써 식물을 접종시켰다 (Alexander 등, 1993; Chen 등, 1996). FHV-SAR 8.2 키메라로 감염되지 않은 대조 식물도 마찬가지로 유주자를 사용하여 접종시켰다. 감염된 식물을 12 시간의 광기로 23 내지 25 ℃의 온도로 유지된 온실에서 7 내지 9일 동안 유지시키고, 모잘록병, 입고병 또는 왜화병과 같은 질병 징후의 억제를 비교하였다.

실시예 3

살충 단백질의 영역 지도작성을 위한 FHV 벡터의 용도

기능적인 유전학의 새로운 분야는 코딩 및 유전자 조절 서열의 가공의 생물학적 기능을 시험하기 위한 고효율의 시스템을 요구하고 있다. 유전학이 특히 유용한 세 가지 기술로는 안티센스 노크아웃(knockout), RNA 간섭(공동억제) 및 큰 유전자의 영역 지도작성이 포함된다 (Briggs 등, 1997; Mckusick, 1997; Evans 등, 1997). 7 내지 10 kb 길이의 4 개의 Pht (포토랍두스 루미네센스 박테리아에 의해 분비된 살충 단백질) 유전자가 독성에 관련되었으나, 독성에 필요한 최소 서열은 확인되지 않았다. 4 개의 독소 복합체 좌위인 tca, tcb, tcc 및 tcd의 유전적 지도는 공지되어 있다 (도 16). 이들 유전자 중 어떤 영역이 독성에 필요한지를 결정하기 위해, Pht 유전자의 특이 서열 및 이들의 조합을 FHV 벡터에 도입하여 Pht의 기능적 영역을 선별하였다 (Bowen 등, 1998). 특히, tca 및 tcd의 결실이 독성을 없애는 것으로 밝혀졌기 때문에(Bowen, 1998), 이들 유전자를 FHV 유래의 벡터로 서브클로닝하였다. 처음에, 부분 또는 완전 제한 소화에 의해 생성된 약 500 내지 1500 bp의 tca 및 tcd 유전자 단편을 벡터에 도입하였다. 니코티아나 벤타미아나 식물을 이들 구조체로부터 제조된 RNA 전사체로 접종시키고, 식물의 부분들을 곤충(만두카 섹스타(Manduca sexta))에 공급하고 48 시간 이내에 곤충의 중량 감소를 측정함으로써 독소 유전자의 발현을 모니터하였다.

실시예 4

곤충 기능성 유전학을 위한 본 발명의 벡터의 용도

본 발명의 벡터를 위한 숙주로서 곤충 세포주 또는 곤충을 사용하기 위해, 변형된 바이러스, 변형된 곤충 세포주 또는 비선천성 곤충 숙주(예, 과실 파리)를 감염, 또는 형질감염 후 세포변성 효과, 즉, 용해에 대한 저항성으로 선택하였다. 돌연변이 또는 복수의 패시징(passaging)에 의해 바이러스를 약화시키는 것이 한 방법이다. 다른 방법은 용해를 견뎌서 생존하는 세포주를 선택하는 것이다. FHV에 의한 감염 후 초파리 세포의 약 1%가 용해에 견뎌서 생존하고, 지속적으로 감염된다. 생존 세포는 FHV를 가지며, 노다바이러스에 의한 중복감염에 저항성이고, 새로운 세포에서 복제할 수 있다 (Dasgupta 등, 1994). FHV 게놈 RNA의 서열 분석으로부터 지속적인 감염 중 바이러스 게놈에서는 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았으며, 이것은 바이러스 게놈에서가 아니라 초파리 세포에서의 돌연변이(총 집단 중 1%)가 지속적인 감염을 초래할 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 방법은 FHV 및 NOV로부터의 외피 단백질 서열을 사용하여 잡종 바이러스를 구성하는 것이다. NOV RNA는 세포변성 효과를 일으키지 않으면서 감염된 곤충 세포에서 복제할 수 있다 (Ball 등, 1993). RNA-1에 의해 코딩된 중합효소는 FHV 또는 NOV로부터의 서열을 인식한다.

이들 방법 중 어느 것에 있어서도, 관심있는 유전자 또는 유전자 라이브러리를 갖는 FHV 벡터를 감염 및(또는) 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입하고, 표현형의 변화를 측정한다. 따라서, 예를 들면, 그의 단백질 생성물이 질병의 증진 또는 억제, 눈의 형상 및 색깔, 발생, 성장 및 체중 등의 변화를 초래하는 유전자를 동정하고, 단시간에 이를 분석할 수 있다.

실시예 5

모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 본원 명세서에 참고로 인용하였다. 상기 명세서에서 일부 바람직한 실시태양과 관련하여 본 발명을 기술하였고 예시를 위해 다수의 세부사항을 기재하였으나, 본 발명은 부가의 실시태양으로 실시될 수 있고 본원 명세서에 기술된 일부 세부사항은 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않고 신중하게 변화될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (65)

1. (a) 노다바이러스(Nodavirus) RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 5' 말단으로부터 유래된 핵산 서열;

   (b) 관심있는 핵산 단편 하나 이상을 포함하는 핵산 서열; 및

   (c) 노다바이러스 RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 3' 말단으로부터 유래된 핵산 서열

   을 포함하는, 연결된 핵산 서열을 포함하는 생물학적 활성 유전자 전이 벡터.
2. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 다수의 클로닝 부위를 갖는 핵산 단편을 포함하는 벡터.
3. 제 2항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 제2 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
4. 제 2항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 제2 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
5. 제 2항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 표지 유전자 또는 선택 표지를 포함하는 제2 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
6. 제 3항 또는 4항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 표지 유전자 또는 선택 표지를 포함하는 제3 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
7. 제 3항 또는 5항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 제3 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
8. 제 4항 또는 5항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 제3 핵산 단편을 추가로 포함하는 벡터.
9. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 포함하는 벡터.
10. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 표지 유전자 또는 선택 표지를 포함하는 핵산 단편을 포함하는 벡터.
11. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 식물 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 포함하는 벡터.
12. 제 6항에 있어서, 핵산 단편들이 융합 폴리펩티드를 얻도록 연결된 벡터.
13. 제 7항에 있어서, 핵산 단편들이 융합 폴리펩티드를 얻도록 연결된 벡터.
14. 제 8항에 있어서, 핵산 단편들 융합 폴리펩티드를 얻도록 연결된 벡터.
15. 제 1항에 있어서, RNA인 벡터.
16. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 안티센스(antisense) 핵산 단편을 포함하는 벡터.
17. 제 3항에 있어서, 핵산 단편이 담배 모자이크 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 벡터.
18. 제 8항에 있어서, 핵산 단편이 담배 모자이크 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 벡터.
19. 제 9항에 있어서, 핵산 단편이 담배 모자이크 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 벡터.
20. 제 1항에 있어서, (b)의 핵산 서열이 독소를 코딩하는 핵산 단편을 포함하는 벡터.
21. 제 20항에 있어서, 핵산 단편이 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens) 독소, 제노랍두스(Xenorhabdus) 독소, 보툴리눔(Botulinum) 독소 또는 콜레라 독소를 코딩하는 벡터.
22. (a) 노다바이러스 RNA-1 일정량; 및

    (b) 제 15항 기재의 벡터 일정량

    을 포함하는 핵산 조성물.
23. (a) 노다바이러스 RNA-1 일정량; 및

    (b) 노다바이러스 RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 5' 말단으로부터 유래된 RNA; 식물 바이러스 이동 단백질을 코딩하는 RNA; 및 노다바이러스 RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 3' 말단으로부터 유래된 RNA를 포함하는 연결된 RNA 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자 일정량

    을 포함하는 핵산 조성물.
24. (a) 노다바이러스 RNA-1 일정량; 및

    (b) 노다바이러스 RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 5' 말단으로부터 유래된RNA; 식물 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 RNA; 및 노다바이러스 RNA-1 또는 노다바이러스 RNA-2의 3' 말단으로부터 유래된 RNA를 포함하는 연결된 RNA 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자 일정량

    을 포함하는 핵산 조성물.
25. (a) 숙주 세포를 제 23항 또는 24항 기재의 조성물 일정량과 접촉시키고,

    (b) 단백질이 발현되는지를 검출 또는 결정하는

    것을 포함하는, 숙주 세포에서 재조합 RNA 분자에 의해 코딩된 단백질을 발현시키는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 쌍떡잎류 세포인 방법.
27. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 외떡잎류 세포인 방법.
28. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
29. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 동물 세포인 방법.
30. (a) 숙주 세포를 제 1항 기재의 벡터 일정량과 접촉시키고,

    (b) 핵산 단편이 발현되는지를 검출 또는 결정하는

    것을 포함하는, 숙주 세포에서 핵산 단편을 포함하는 핵산 서열을 발현시키는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 숙주 세포가 쌍떡잎류 세포인 방법.
32. 제 30항에 있어서, 숙주 세포가 외떡잎류 세포인 방법.
33. 제 30항에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
34. 제 30항에 있어서, 숙주 세포가 동물 세포인 방법.
35. 식물을 제 1항 기재의 벡터 일정량과 접촉시켜서 제 1항 기재의 벡터를 포함하는 세포를 갖는 식물을 얻는 것을 포함하는, 식물에 핵산 단편을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 방법.
36. 제 35항에 있어서, 핵산 단편이 성장 호르몬, 독소, 사이토카인, 질병 저항성, 해충 저항성, 웅성 불임성 또는 살충제 저항성을 코딩하는 방법.
37. 제 35항에 있어서, 식물이 분무 또는 마찰에 의해 접촉되는 방법.
38. 식물을 제 23항 또는 24항 기재의 조성물 일정량과 접촉시켜서 재조합 RNA 분자를 포함하는 세포를 갖는 식물을 얻는 것을 포함하는, 재조합 RNA 분자를 식물에 도입하는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 재조합 RNA 분자가 성장 호르몬, 독소, 사이토카인, 질병 저항성, 해충 저항성, 웅성 불임성 또는 살충제 저항성을 코딩하는 방법.
40. 제 38항에 있어서, 식물이 분무 또는 마찰에 의해 접촉되는 방법.
41. (a) 동물 세포를 제 1항 기재의 벡터 일정량과 접촉시키고,

    (b) 동물 세포에 핵산 단편이 존재하는지를 검출 또는 결정하는

    것을 포함하는, 핵산 단편을 동물 세포에 도입하는 방법.
42. (a) 곤충 세포를 제 1항 기재의 벡터 일정량과 접촉시키고,

    (b) 곤충 세포에 핵산 단편이 존재하는지를 검출 또는 결정하는

    것을 포함하는, 핵산 단편을 곤충 세포에 도입하는 방법.
43. 제 41항 또는 42항에 있어서, 핵산 단편이 성장 호르몬, 독소 또는 사이토카인을 코딩하는 방법.
44. 감염성 제1 RNA 분자; 및

    바이러스 외피 단백질, 바이러스 이동 단백질 또는 이의 조합을 코딩하는 제2 재조합 RNA 분자

    를 포함하는 재조합 노다바이러스.
45. 게놈이 제 1항 기재의 벡터로 증대되는 형질전환 식물.
46. 제 45항 기재의 식물로부터 유래된 식물 부분.
47. 제 46항에 있어서, 종자인 식물 부분.
48. 제 47항 기재의 종자에 의해 생산된 식물.
49. 제 35항 기재의 방법에 의해 생산된 식물.
50. 제 49항 기재의 식물에 의해 생산된 식물 부분.
51. 제 50항에 있어서, 종자인 식물 부분.
52. 제 51항 기재의 종자에 의해 생산된 식물.
53. 제 36항 기재의 방법에 의해 생산된 식물.
54. 제 53항 기재의 식물에 의해 생산된 식물 부분.
55. 제 54항에 있어서, 종자인 식물 부분.
56. 제 55항 기재의 종자에 의해 생산된 식물.
57. 제 3항에 있어서, 핵산 단편이 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 벡터.
58. 제 8항에 있어서, 핵산 단편이 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 벡터.
59. 제 9항에 있어서, 핵산 단편이 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 벡터.
60. 식물의 게놈이 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 DNA로 증대된, 노다바이러스와 접촉된 형질전환 식물.
61. 식물의 게놈이 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 DNA로 증대된, 제 1항 기재의 벡터와 접촉된 형질전환 식물.
62. 식물의 게놈이 붉은 토끼풀 괴사 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 DNA로 증대된, 노다바이러스와 접촉된 형질전환 식물.
63. 식물의 게놈이 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 DNA로 증대된, 제 1항 기재의 벡터와 접촉된 형질전환 식물.
64. 제 60항, 61항, 62항 또는 63항에 있어서, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)인 형질전환 식물.
65. 제 61항 또는 63항에 있어서, 노다바이러스와 접촉된 형질전환 식물.