BR102013031734B1 - método para controlar athetis lepigone - Google Patents
método para controlar athetis lepigone Download PDFInfo
- Publication number
- BR102013031734B1 BR102013031734B1 BR102013031734-9A BR102013031734A BR102013031734B1 BR 102013031734 B1 BR102013031734 B1 BR 102013031734B1 BR 102013031734 A BR102013031734 A BR 102013031734A BR 102013031734 B1 BR102013031734 B1 BR 102013031734B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- cry1fa
- athetis lepigone
- seq
- plant
- Prior art date
Links
- 241000013228 Athetis lepigone Species 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 177
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 128
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 102
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 100
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 95
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 45
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 40
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 37
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 29
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 29
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 27
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 105
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 59
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 20
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 17
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 9
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 8
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 6
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 6
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 6
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 4
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 3
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 3
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000747028 Cestrum yellow leaf curling virus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102100025022 Mannose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001457070 Mirabilis mosaic virus Species 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 2
- GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N (1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)-trimethylazanium Chemical compound CC1(C)CC([N+](C)(C)C)CC(C)(C)N1[O] GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005972 6-Benzyladenine Substances 0.000 description 1
- 101150103244 ACT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039601 ARF GTPase-activating protein GIT1 Human genes 0.000 description 1
- 101710194905 ARF GTPase-activating protein GIT1 Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001033883 Cenchritis muricatus Protease inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000233838 Commelina Species 0.000 description 1
- 241000701515 Commelina yellow mottle virus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000518484 Cotton leaf curl virus Species 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-N Dalapon Chemical compound CC(Cl)(Cl)C(O)=O NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048726 E9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101150111720 EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000565359 Fraxinus chinensis Species 0.000 description 1
- 101150104463 GOS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710081758 High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018650 Pinus massoniana Species 0.000 description 1
- 235000011609 Pinus massoniana Nutrition 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004127 Quercus ilex Species 0.000 description 1
- 235000016979 Quercus ilex Nutrition 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100084449 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP4 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010021384 barley lectin Proteins 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 235000012785 bread rolls Nutrition 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000006253 efflorescence Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 206010021654 increased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006506 pH homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 230000029264 phototaxis Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 101150082349 pmi gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000000457 tarsus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
Abstract
MÉTODO PARA O CONTROLE DE PRAGA. A presente invenção refere-se a um método para controlar Athetis lepigone, que compreende contatar Athetis lepigone com proteína Cry1F. A presente invenção obtém o controle de Athetis lepigone permitindo-se que as plantas produzam proteína Cry1F in vivo, o que é letal para Athetis lepigone. Em comparação com métodos de controle agrícola e químico correntes, o método da presente invenção pode controlar Athetis lepigone por todo o período de crescimento das plantas e fornece as plantas com uma proteção total. Adicionalmente, o método é estável, completo, simples, conveniente, econômico, isento de poluição e isento de resíduo.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para o controle de praga, especificamente um método para impedir que Athetis lepigone cause danos às plantas pela proteína Cry1F expressada nesta.
[002] Athetis lepigone pertence a Lepidoptera, Noctuidae. Como uma praga onívora, ela principalmente alimenta-se de milho. Ela principalmente habita no distrito agrícola do milho no verão da região de Huang-Huai-Hai na China, e também foi encontrada tal como no Japão, Coreia, Rússia e Europa. Ela causa danos principalmente em raízes aéreas do milho no soro arável, come raízes escoras e caules do milho, deforma ou ainda mata as plantas do milho. O campo de milho danificado apresentará áreas vazias grandes ou ainda tornam-se estéreis se sob ataques severos.
[003] O milho é uma cultura agrícola principal na China. Em 9 de Julho de 2011, a "News Broadcast" de CCTV primeiramente relatou explosões de Athetis lepigone na China. A partir do outono de 2011 até 31 de maio de 2012, várias análises de campo conduzidas pelo Pest Prevention and Control Laboratory of National Maize Industry descobriram que Athetis lepigone no ano de 2012 compreendeu um número grande de populações no inverno de tamanho grande com uma densidade alta de larvas, indicando que a explosão de Athetis lepigone é provável de explodir subitamente novamente na região de Huang- Huai-Hai. Existem dois métodos comumente usados para controlar Athetis lepigone, os métodos de controle agrícola e de controle químico.
[004] O método de controle agrícola é um manejo integrado e coordenado de múltiplos fatores para o ecossistema inteiro da terra cultivável, que regula safras, pragas e fatores ambientais e estabelece um ecossistema de terra cultivável conducente para o crescimento da safra mas desfavorável para Athetis lepigone. Por exemplo, as remoções imediatas de palhas, ervas daninhas e outras coberturas das raízes de mudas de milho para um espaço maior entre linhagens de milho longe das plantas de modo a expor o solo são comumente usadas, de modo a garantir que a próxima etapa de pulverização de pesticida possa ter um contato direto a Athetis lepigone. Entretanto, visto que o controle agrícola deve obedecer aos requisitos para as condições da safra e aumentar a produção, tal método tem aplicações limitadas e não pode ser usado como uma medida de emergência quando Athetis lepigone explode.
[005] O método de controle químico, também conhecido como controle com pesticida, é para matar pragas usando-se pesticidas. Como um meio importante para o manejo abrangente do controle, este é um método rápido, conveniente, simples e altamente eficaz de custo. Particularmente, o mesmo pode ser usado como uma prática de emergência essencial para reduzir a densidade de Athetis lepigone antes que os danos tenham feito. Correntemente, as medidas principais do controle químico incluem isca venenosa, solo envenenado, assim como banho e pulverização de pesticida. Entretanto, o controle químico tem suas limitações: seu uso inadequado pode causar consequências devastadoras, tais como envenenamento das safras, resistência à praga, predadores mortais e poluição do ambiente de modo a destruir ecossistemas de terra cultivável; resíduos de pesticida apresentam uma ameaça para a segurança de seres humanos e animais de criação no local; e como Athetis lepigone prefere um micro-habitat úmido e escuro, ela geralmente esconde-se sob coberturas tais como palhas de trigo ou abaixo do solo arável, tornando o contato direto entre produtos químicos e Athetis lepigone difícil, o que torna o controle químico ineficaz.
[006] Para superar as limitações dos métodos de controle agrícola e de controle químico em aplicações, os pesquisadores descobriram que inserir genes que codificam proteínas pesticidas no genoma da planta pode produzir plantas resistentes à praga. A proteína Cry1F pesticida, entre um grupo grande de proteínas pesticidas, é uma proteína de cristal paraesporal insolúvel produzida por Bacillus thuringiensis.
[007] A proteína Cry1F, se ingerida por pragas, é dissolvida no ambiente alcalino do intestino intermediário das pragas e libera protoxina, um precursor para uma toxina. Além disso, a protease alcalina digere a protoxina em seu término N e C e produz um fragmento ativo, que subsequentemente se ligaria a um receptor de membrana de células epiteliais do intestino intermediário das pragas e inseriria na membrana intestinal, resultando na perfuração da membrana celular, desequilibrando a homeostase do pH e pressão osmótica através da membrana celular, interrompendo a digestão da praga, e eventualmente levando à morte das pragas.
[008] Foi confirmado que plantas transgênicas com Cry1F podem resistir às pragas de Lepidoptera tais como Agrotis ypsilon Rottemberg. Entretanto, até aqui não existe nenhum relato sobre o controle de Athetis lepigone gerando-se plantas transgênicas que produzem proteína Cry1F.
[009] O propósito da presente invenção é fornecer um método de controle de praga pela primeira vez usando uma planta transgênica que expressa proteína Cry1F para controlar o dano causado por Athetis lepigone. O dito método eficazmente supera limitações técnicas dos métodos de controle agrícola, controle químico e controle biológico.
[0010] Para obter o propósito como mencionado acima, a presente invenção fornece um método para controlar Athetis lepigone, o dito método compreende contatar Athetis lepigone com proteína Cry1F.
[0011] Adicionalmente, a presente invenção fornece uma planta transgênica que expressa a proteína Cry1F e seu material reprodutivo, tal como sementes, mudas e semelhantes.
[0012] Preferivelmente, a proteína Cry1F é proteína Cry1Fa.
[0013] Além disso, a proteína Cry1Fa está presente em uma célula que expressa a dita proteína de uma planta, e ela é contatada com Athetis lepigone por ingestão da célula.
[0014] Além disso, a proteína Cry1Fa está presente em uma planta transgênica que expressa a proteína Cry1Fa, e Athetis lepigone contata com a proteína Cry1Fa por ingestão de um tecido da planta transgênica. Como uma consequência, o crescimento de Athetis lepigone é inibido, levando à morte de Athetis lepigone eventualmente, e depois o dano de Athetis lepigone à planta é controlado.
[0015] A planta transgênica pode estar em qualquer período de crescimento.
[0016] O tecido da planta transgênica pode ser raízes, folhas, caules, corutos, espigas, anteras ou filetes.
[0017] O controle do dano de Athetis lepigone à planta não depende da localização do plantio.
[0018] O controle do dano de Athetis lepigone à planta não depende do tempo de plantio.
[0019] A planta é milho.
[0020] Antes da etapa de contato deve-se plantar uma muda transgênica que contém um polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Fa.
[0021] Preferivelmente, a sequência de aminoácido da proteína CrylFa compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2. A sequência de nucleotídeo que codifica a proteína CrylFa compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4.
[0022] Com base nas soluções técnicas mencionadas acima, a planta pode expressar ainda pelo menos um dos nucleotídeos secundários, que são diferentes da proteína Cry1Fa.
[0023] Além disso, o nucleotídeo secundário codifica uma proteína pesticida semelhante a Cry, uma proteína pesticida semelhante a Vip, um inibidor de protease, lectina, α-amilase ou peroxidase.
[0024] Preferivelmente, o nucleotídeo secundário codifica proteína Cry1Ab, proteína Cry1Ac, proteína Cry1Ba ou proteína Vip3A.
[0025] Além disso, o nucleotídeo secundário compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6.
[0026] Opcionalmente, o nucleotídeo secundário é dsRNA, que inibe um gene importante de uma praga-alvo.
[0027] Na presente invenção, a expressão da proteína Cry1F em uma planta transgênica pode ser acompanhada pela expressão de uma ou mais proteínas pesticidas semelhantes a Cry e/ou proteínas pesticidas semelhantes a Vip. Tal coexpressão de mais do que uma toxina pesticida na mesma planta transgênica pode ser obtida por engenharia genética para preparar a planta contendo e expressando genes de interesse. Além disso, uma planta (o precursor primário) expressa proteína Cry1F por engenharia genética, enquanto uma outra planta (o precursor secundário) expressa uma proteína pesticida semelhante a Cry e/ou uma proteína pesticida semelhante a Vip por engenharia genética. Cruzando o precursor primário com o precursor secundário obtém plantas de progênie que expressam todos os genes introduzidos no precursor primário e no precursor secundário.
[0028] Interferência de RNA (RNAi) é referida como um fenômeno de degradação altamente específica e eficiente de mRNA homólogo induzido por um RNA de filamento duplo (dsRNA), que é altamente conservado durante a evolução. Portanto, a presente invenção pode usar RNAi para especificamente eliminar ou encerrar a expressão de genes de pragas alvos.
[0029] Embora tais Athetis lepigone e Agrotis ypsilon Rottemberg pertençam à ordem Lepidoptera da família Noctuidae, e elas tenham alvos similares e morfologia quase igual, elas são claramente duas espécies distintas na biologia. Athetis lepigone e Agrotis ypsilon Rottemberg têm pelo menos as diferenças seguintes: 1. Hábitos de alimentação diferentes. Além de dano severo ao milho de verão, Athetis lepigone também apresenta uma ameaça sobre amendoim e soja. Ao passo que Agrotis ypsilon Rottermberg, como uma praga polífaga, não apenas causa dano no milho, sorgo e painço, mas também causa dano sério a uma faixa ampla de mudas incluindo lariço, pinheiro, cinzas chinesas e noz da Manchúria no nordeste, pinheiro de Masson, abeto, amoreira e chá no sul, assim como pinheiro vermelho chinês, azambujeiro e outras árvores frutíferas no noroeste. 2. Habitações geográficas diferentes. Correntemente Athetis lepigone foi principalmente encontrada no distrito do milho de verão de Huang- Huai-Hai incluindo seis províncias de Hebei, Shandong, Henan, Shanxi, Jiangsu e Anhui, um total de 47 metrópoles e 297 cidades. Ao passo que Agrotis ypsilon Rottermberg é principalmente encontrada em lugares com clima úmido e chuva abundante na China, tal como o Changjiang River Valley, costa sudeste, e áreas úmidas orientais e meridionais do Nordeste da China. 3. Hábitos de infestação diferentes. Athetis lepigone causa um problema sério em alguns dos distritos de milho de verão de Hebei, particularmente em campos interplantados com trigo. Suas larvas escondem-se sob a palha de trigo comprimida adjacente de mudas de milho ou cavam em 2 a 5 cm do soro arável para danificar mudas de milho. Existem normalmente 1 a 2 e até 10 a 20 larvas por muda individual. Quando mudas de milho estão no estágio foliar 3 a foliar 5, as larvas alimentam-se principalmente de sua base do caule e deixa para trás furos redondos ou ovais de 3 a 4 mm em tamanho, resultando na interrupção do transporte de nutrição às folhas e eventualmente na murchidão e morte das folhas interiores acima do solo. Quando do alvejamento de mudas de milho de estágio foliar 8 ao estágio foliar 10, as larvas principalmente alimentam-se de raízes, incluindo raízes aéreas e raízes principais, resultando em acamamento ou ainda morte das plantas. As plantas danificadas somam 1% a 5% geralmente e atingem até 15% a 20% em canteiros mais seriamente danificados. Larvas de Agrotis ypsilon Rottermberg em torno dos ínstares 1 a 2 podem aglomerar-se nas folhas de topo de mudas dia e noite e alimentam-se delas, mas dispersarão depois do ínstar 3. As larvas são ágeis e têm um hábito de fingir a morte. Elas são extremamente sensíveis à luz, e aninharão por si só quando perturbadas. Durante o dia elas escondem entre as camadas do soro arável úmido e seco, ao passo que elas podem escavar do solo à noite para morder as mudas e arrastar as plantas prejudicadas nos furos subterrâneos, ou morder as sementes desenterradas. Sobre o talo das mudas tornam-se mais duras, elas se alimentarão de folhas frescas e pontos em crescimento. Entretanto, quando carecem de alimento ou encontrando os sítios de inverno seguintes, a migração ocorre a elas. 4. Características morfológicas diferentes 1) Morfologia diferente dos ovos: ovos de Athetis lepigone estão na forma de pãozinho cozido a vapor com um sulco longitudinal. Ovos recentemente postos são amarelo-esverdeados e mudam para cor cáqui em estágios mais tardios. Ovos de Agrotis ypsilon Rottermberg também estão na forma de pãozinho cozido a vapor mas com carina cruzada. Os ovos recentemente postos são brancos cremosos e gradualmente tornam-se amarelos, e uma mancha preta emergiria em um topo dos ovos antes da incubação. 2) Morfologia diferente das larvas: larvas maduras de Athetis lepigone são cerca de 20 mm de comprimento com corpo amarelo claro e cabeça marrom. Larvas recentemente incubadas são de 14 a 18 mm em comprimento e amarelo-cinza ou marrom escuro em cor. As características notáveis destas são uma mancha marrom escura em forma de triângulo invertido sobre somitos individuais e duas linhas dorsais marrons do abdome dorsal ao segmento torácico. Ao contrário, as larvas de Agrotis ypsilon Rottermberg estão na forma de cilindro, e as larvas maduras destas são de 37 a 50 mm de comprimento e de cabeça marrom com listras reticuladas marrons escuras irregulares. Elas têm corpo cinza-amarronzado ou marrom-acinzentado e superfície áspera pontilhadas com partículas classificadas diferentes. Sua linha dorsal, linha subdorsal e linha espiracular são todas pretas-marrons, o protórax é marrom-acinzentado, o pigídio é marrom-amarelado com duas faixas verticais marrons escuras distintas, e os baenopoda e pseudópodos são marrom-amarelados. 3) Morfologia diferente das pupas: as pupas de Athetis lepigone são cerca de 10 mm em comprimento, tendo um cor do corpo castanho- amarelada no estágio inicial depois gradualmente mudando para marrom, e larvas maduras entram em estado de pupa ocultamente no casulo. Ao contrário, pupas de Agrotis ypsilon Rottermberg são de 18 a 24 mm em comprimento e castanho-avermelhado claro em cor. A parte bucal é alinhada com a extremidade dos embriões alados, ambos atingindo a extremidade do quarto segmento abdominal. O centro da parte dianteira de 4 a 7 segmentos abdominais é marrom escuro com manchas grossas, e tem manchas bilaterais como estanho estendidas ao espiráculo. A parte anterior de 5 a 7 segmentos abdominais também tem manchas como estanho. A extremidade do abdome tem um par de suportes de topo curtos. 4) Morfologia diferente do imago: Athetis lepigone adulto é de 10 a 12 mm de comprimento e 20 mm com envergadura. A fêmea é levemente maior do que o macho. Sua cabeça, tórax e abdome são cinza- amarronzados. Suas asas dianteiras são também cinza-amarronzadas mas com marcas mais escuras, linhas divisórias interiores e exteriores marrom-acinzentadas, marcas anulares de uma mancha preta e padrões reniformes pequenos. Pontos pretos estão presentes na borda da concavidade externa com uma mancha branca. A linha divisória exterior é ondulada; a borda das asas tem uma mancha preta. Suas asas traseiras são brancas e levemente marrons, e gradualmente tornam-se marrom-acinzentadas na borda. Seu abdome é cinza- amarronzado. As valvas da genitália do macho é semiaberta ou toda aberta, a margem dorsal é côncava com um úncus protuberante no centro, e o edeago tem dentro agulhas pontudas. Ao contrário, Agrotis ypsilon Rottermberg adulto é de 17 a 23 mm em comprimento, 40 a 54 mm com envergadura. Sua cabeça e a parte posterior do tórax são marrom-acinzentados, e os pés são marrons. A tíbia da pata dianteira e borda do tarso são cinza-amarronzados, e o término de cada segmento das patas medianas e meta-patas tem faixas anulares cinza- amarronzadas. Suas asas dianteiras marrons têm áreas anteriores pretas-marrons, margens externas marrom-acinzentadas, linhas de base marrons claras e linhas transversais internas onduladas pretas de linha dupla. Existe um ponto cinza redondo dentro das faixas anulares pretas. A forma anular reniforme é preta e tem borda preta. O centro do exterior da forma anular reniforme tem forma anular preta cuneiforme, que atinge as linhas transversais externas. A linha transversal mediana é da forma ondulada marrom-acinzentada. As linhas transversais externas onduladas de linha dupla são marrons. A linha divisória subexterna é da forma de dente de serra irregular e cinza, o centro da margem interna da qual tem três dentes pontudos. Existem pontos pretos pequenos em cada nervura entre a linha divisória subexterna e a linha transversal externa. A linha divisória externa é preta. A cor entre a linha transversal externa e a linha divisória subexterna é marrom claro. A cor além da linha divisória subexterna é preta-marrom. As asas traseiras são brancas. A nervura longitudinal e a linha divisória são marrons. A parte posterior do abdome é cinza. 5. Hábito de crescimento e padrão de erupção diferentes. Larvas de Athetis lepigone têm 6 ínstares durando cerca de 18 dias e elas têm uma resistência forte à tensão. A erupção dos adultos tem dois picos distintos. O primeiro ocorre antes do começo de Julho enquanto o segundo é dos meados de Julho a meados de Agosto. Os adultos têm uma capacidade reprodutiva forte: cada fêmea tem uma produção de 300 a 500 ovos em média e o período de postura dos ovos dura 3 a 7 dias, enquanto a taxa de incubação pode atingir até 100%. Eles causam mais dano no plantio rotativo do campo de milho depois do plantio contínuo do algodão, coberto com farelo de trigo do que sem farelo de trigo, semeando de forma tardia do que semeando precocemente, e tendo umidade de campo alta do que tendo umidade de campo baixa. Athetis lepigone se favorece do ambiente escuro e úmido e frequentemente esconde-se sob a palha ou solo, causando uma grande inconveniência para a pulverização de pesticidas. Ao contrário, Agrotis ypsilon Rottermberg tem 3 a 4 gerações em um ano. Larvas maduras ou pupas passam o inverno no solo e imagos começam a aparecer em Março. Geralmente, dois picos de traça ocorrerão: um no final de Março e o outro em meados de Abril. Adultos são inativos durante o dia e tornam-se ativos ao anoitecer até a meia-noite. Eles têm fototaxia e favorecem fermentações azedas, doces, vinosas, e vários tipos de néctares. As larvas passam através de seis ínstares: nos ínstares 1 e 2, larvas se escondem dentro das ervas daninhas ou folhas internas de plantas, alimentam-se por si só dia e noite mas com pouco apetite, e assim causam poucos danos; depois do ínstar 3, elas se escondem sob o soro arável durante o dia e saem para alimento à noite; nos ínstares 5 e 6, as larvas começam a ter um apetite significantemente aumentado e cada indivíduo pode quebrar 4 a 5 mudas em média, até 10 em casos extremos; e desde o ínstar 3, sua resistência pesticida significantemente aumenta. O dano mais severo causado pela primeira geração de larvas ocorre entre o final de Março e os meados de Abril. Gerações ocorrem de Outubro a Abril do ano seguinte e causam danos. O número de gerações em um ano varia geograficamente: 2 a 3 gerações no nordeste, 2 a 3 gerações no norte da Great Wall, 3 gerações na área entre o sul da Great Wall e no norte do Yellow River, 4 gerações na área entre o sul de Yellow River e Yangtze River, 4 a 5 gerações no sul de Yangtze River, e 6 a 7 gerações na área tropical na Ásia do sul. Entretanto, apesar da diferença no número de gerações em um ano, o dano mais severo é sempre causado pelas larvas da primeira geração. Imagos da geração que passa o inverno meridional aparecem em Fevereiro. Entretanto, o pico de eclosão normalmente ocorre do final de Março aos meados de Abril na maioria do país exceto Ningxia e Inner Mongolia, em que ele ocorre no final de Abril. Os Imagos de Agrotis ypsilon Rottermberg são mais prováveis a iniciar a eclosão de 15:00 a 22:00. Eles escondem sob os fragmentos e quebram durante o dia e tornam-se ativos depois do anoitecer, voo e procura de alimento. Depois de 3 a 4 dias, eles começam a acasalar e por ovos. Os ovos são principalmente postos sobre as ervas daninhas e mudas de densidade alta, curtas e algumas vezes em folhas mortas e fendas. A maioria dos ovos estão perto do solo. Cada fêmea pode por 800 a 1000 ovos, ou ainda até 2000 durante seu período de oviposição de cerca de 5 dias. O estágio larval consiste em 6 ínstares, e alguns indivíduos podem atingir 7 a 8 ínstares. O estágio larval varia em locais diferentes, mas normalmente dura 30 a 40 dias para a primeira geração. Uma vezes que completamente amadurecidos, eles se desenvolvem em pupas em uma câmara terrestre em torno de 5 cm ocultamente e o estágio pupal é de 9 a 19 dias. Temperatura alta é prejudicial para o desenvolvimento e reprodução de Agrotis ypsilon Rottemberg, assim menos deles aparecem durante o verão. A temperatura de sobrevivência ideal é de 15°C a 25°C. A mortalidade de larvas de Agrotis ypsilon Rottemberg aumenta quando a temperatura do inverno é muito baixa, e diminui em locais onde o terreno é baixo, úmido e têm chuva abundante. Adicionalmente, condições conducentes à oviposição e alimentação larval tal como chuva abundante no outono, umidade alta do solo e erva daninha crescida em excesso podem levar a uma explosão no ano seguinte. Entretanto, chuva excessiva e muita umidade são ruins para o desenvolvimento larval visto que larvas de primeiro ínstar podem afogar muito facilmente em tal ambiente. Regiões tendo 15 a 20% de teor de umidade do solo durante o período de pico de oviposição sofreriam danos mais severos. O solo franco arenoso é mais adaptado do que o solo argiloso e solo arenoso à reprodução de Agrotis ypsilon Rottemberg, devido à sua melhor permeabilidade em água e drenagem rápida.
[0030] Coletivamente, é evidente que Athetis lepigone e Agrotis ypsilon Rottemberg são duas espécies distintas de pragas e não podem cruzar.
[0031] Na presente invenção, o genoma de plantas, tecidos vegetais ou células vegetais refere-se a qualquer material genético nas plantas, tecidos ou células, incluindo núcleo, plastídeo e genoma mitocondrial.
[0032] Na presente invenção, polinucleotídeos e/ou nucleotídeos constituem um "gene" completo que codifica uma proteína ou polipeptídeo em células hospedeiras desejadas. A pessoa habilitada na técnica reconhecerá facilmente que os polinucleotídeos e/ou nucleotídeos podem ser colocados sob o controle de sequências reguladoras de hospedeiros alvos.
[0033] Seria bem conhecido para a pessoa habilitada na técnica que DNA normalmente existe em uma forma conhecida como estrutura de filamento duplo. Neste arranjo, um filamento é complementar com um outro filamento, e vice versa. O filamento complementar é gerado durante a replicação de DNA em plantas, assim a presente invenção inclui o uso dos polinucleotídeos e seus filamentos complementares que são exemplificados na listagem de sequência. "Filamento de codificação" comumente usado na técnica refere-se ao filamento que liga-se ao filamento de antissentido. De modo a expressar proteínas in vivo, um filamento de DNA é tipicamente transcrito em um filamento complementar como mRNA, que é usado como um padrão para traduzir na proteína. De fato, mRNA é transcrito do filamento de "antissentido" de DNA. Filamento de "sentido" ou "codificação" tem uma série de códons (um códon contém três nucleotídeos, que codificam um aminoácido específico), e o filamento pode ser usado como uma fase de leitura aberta (ORF) para transcrever em uma proteína ou peptídeo. A presente invenção também abrange RNA e ácido nucleico peptídico (PNA), que têm funções consideráveis como o DNA exemplificado.
[0034] Na presente invenção, as moléculas de ácido nucleico ou fragmentos destas hibridizam com o gene Cry1Fa da presente invenção sob condições severas. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença do gene Cry1Fa da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico ou fragmentos destas em certos casos podem ser especificamente hibridizados com outras moléculas de ácido nucleico. Na presente invenção, se duas moléculas de ácido nucleico podem formar uma estrutura de ácido nucleico de filamento duplo antiparalela, nós podemos dizer que estas duas moléculas de ácido nucleico podem ser especificamente hibridizadas entre si. Se duas moléculas de ácido nucleico exibem complementaridade completa, uma molécula de ácido nucleico é chamada o "complemento" da outra molécula. Na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é complementar ao nucleotídeo correspondente de uma outra molécula de ácido nucleico, estas duas moléculas são chamadas para exibir "complementaridade completa". Se duas moléculas de ácido nucleico podem hibridizar entre si em um estado eficientemente estável, e ligam entre si depois da hibridação sob condições de "severidade baixa" pelo menos convencionais, estas duas moléculas de ácido nucleico são chamadas de "complementaridade mínima". Do mesmo modo, se duas moléculas de ácido nucleico podem hibridizar entre si em um estado eficientemente estável, e ligam-se entre si depois da hibridação sob condições de "severidade alta" convencionais, estas duas moléculas de ácido nucleico são chamadas para ter "complementaridade". Desvio da complementaridade completa é aceitável contanto que tal desvio não impeça completamente que as duas moléculas formem uma estrutura de filamento duplo. De modo a permitir que uma molécula de ácido nucleico possa ser usada como um iniciador ou sonda, sua sequência deve ter complementaridade suficiente de modo que ela possa formar uma estrutura de filamento duplo estável em solventes e concentrações de sal especiais.
[0035] Na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucleico, que, sob condições altamente severas, pode ser especificamente hibridizada com o filamento complementar emparelhado da outra molécula de ácido nucleico. As condições severas adequadas para hibridização de DNA seriam bem conhecidas à pessoa habilitada na técnica, por exemplo, processando com 6,0x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45°C, e depois lavando com 2,0x SSC a 50°C. Por exemplo, durante a etapa de lavagem a concentração de sal pode ser selecionada de uma condição de severidade baixa de cerca de 2,0x SSC a uma condição altamente severa de cerca de 0,2x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma condição de severidade baixa da temperatura ambiente em torno de 22°C a uma condição altamente severa de cerca de 65°C. Tanto a temperatura quanto a concentração de sal são mutáveis, ou uma pode permanecer intacta embora uma outra possa ser mudada. Preferivelmente, as condições severas de acordo com a invenção são: hibridização específica com a SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4 em uma solução de 6x SSC, 0,5% de SDS a 65°C, e depois lavagem de membrana com 2x SSC, 0,1% de SDS e 1x SSC, 0,1% de SDS uma vez cada.
[0036] Portanto, sequências tendo atividade resistente à praga e capaz de hibridizar com a SEQ ID N°: 3 e/ou SEQ ID N°: 4 sob condições severas são abrangidas na presente invenção. Estas sequências são pelo menos de cerca de 40% a 50% homólogas às sequências da presente invenção, cerca de 60%, 65% ou 70% homólogas, ou ainda pelo menos de cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogas às sequências da presente invenção.
[0037] Os genes e proteínas descritos na presente invenção incluem não apenas as sequências especificamente exemplificadas, mas também as porções e/fragmentos (incluindo aqueles tendo supressões internas e/ou terminais em comparação com as proteínas de tamanho natural), variantes, mutantes, substitutos (proteínas com aminoácidos substituídos), proteínas quiméricas e de fusão destes tendo a atividade pesticida das proteínas exemplificadas. Os "mutantes" ou "variante" referem-se a sequências de nucleotídeo que codificam a mesma proteína ou proteína equivalente com a atividade pesticida. A "proteína equivalente" refere-se a uma proteína que apresenta a mesma ou substancialmente a mesma atividade biológica de resistência a Athetis lepigone como as proteínas reivindicadas.
[0038] O "fragmento" ou "truncamento" de sequências de DNA ou proteína descritas na presente invenção referem-se a uma parte ou uma forma artificialmente modificada (tais como sequências adequadas para a expressão na planta) das sequências de DNA ou proteína originais (nucleotídeos ou aminoácidos). O comprimento das sequências acima pode ser variável, mas ele deve ser suficiente para assegurar a proteína (codificada) como uma toxina de praga.
[0039] Variantes de gene podem ser facilmente modificadas e construídas por técnicas padrão. Por exemplo, a tecnologia de mutação de ponto é bem conhecida na técnica. Um outro exemplo com base na Patente U.S. No 5605793 descreve um método que o DNA pode ser aleatoriamente fraturado e reagrupado para gerar a diversidade molecular. Endonucleases comerciais podem ser usadas para compor fragmentos de genes de tamanho natural, e exonucleases podem ser usadas de acordo com procedimentos padrão. Por exemplo, enzimas tais como Bal31 ou mutagênese sítio-dirigida podem ser usadas para remover sistemicamente nucleotídeos da extremidade destes genes. Uma variedade de endonucleases de restrição pode ser usada para obter genes que codificam fragmentos ativos. Também, proteases podem ser usadas para obter fragmentos ativos destas toxinas diretamente.
[0040] Na presente invenção, equivalentes de proteína e/ou genes que codificam estes equivalentes de proteína podem ser derivados de isolados de B.t. e/ou bibliotecas de DNA. Existem vários modos para obter as proteínas pesticidas da presente invenção. Por exemplo, anticorpos de proteínas pesticidas divulgadas e reivindicadas pelo presente invenção podem ser usados para identificar e isolar outras proteínas de uma mistura de proteínas. Em particular, as partes mais constantes e mais diferentes de outras proteínas de B.t. podem produzir anticorpos. Por imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou western blot, estes anticorpos podem ser usados para identificar especificamente equivalentes de proteína com atividades características. Procedimentos padrão na técnica podem ser usados para preparar anticorpos das proteínas, equivalentes ou fragmentos destes divulgados na presente invenção. Também, os genes que codificam estas proteínas podem ser obtidos de microorganismos.
[0041] Devido à redundância de códigos genéticos, uma variedade de sequências de DNA diferentes pode codificar a mesma sequência de aminoácido. A pessoa habilitada na técnica seria capaz de gerar sequências de DNA alternativas para codificar a mesma ou substancialmente a mesma proteína. Estas sequências de DNA diferentes são incluídas dentro do escopo da presente invenção. "Substancialmente as mesmas" sequências incluindo fragmentos com atividade pesticida, referem-se às sequências com substituição, supressão, adição ou inserção de aminoácido mas a atividade pesticida destas não é essencialmente afetada.
[0042] Na presente invenção, as substituições, supressões ou adições em sequências de aminoácido são técnicas convencionais no ramo. Preferivelmente, as alterações de sequências de aminoácido são: uma mudança leve de características, isto é, substituições de aminoácido conservadoras que não significantemente afetam a dobragem e/ou atividade de proteínas; uma supressão curta, usualmente de 1 a 30 aminoácidos; uma extensão amino- ou carboxila- terminal pequena, tal como uma extensão amino-terminal de um resíduo de metionina; um ligador de peptídeo pequeno com um comprimento de cerca de 20 a 25 resíduos por exemplo.
[0043] Exemplos de substituições conservadoras são selecionados dos grupos seguintes de aminoácidos: aminoácidos básicos, tais como arginina, lisina e histidina; aminoácidos ácidos, tais como ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos polares, tais como glutamina, asparagina; aminoácidos hidrofóbicos, tais como leucina, isoleucina e valina; aminoácidos aromáticos, tais como fenilalanina, triptofano e tirosinel; e aminoácidos de molécula pequena, tais como glicina, alanina, serina, treonina e metionina. Tipicamente, as substituições de aminoácido sem atividades específicas mutáveis são bem conhecidas na técnica, e elas foram descritas em outra parte, por exemplo, em "Protein" de N. Neurath e R. L. Hill em 1979, publicado por Academic Press, New York. As substituições mais comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu e Asp/Gly, assim como as substituições opostas destas.
[0044] Seria óbvio para a pessoa habilitada na técnica que, estas substituições podem ocorrer fora das regiões que desempenham papéis importantes sobre as funções moleculares mas ainda produzem um polipeptídeo ativo. De acordo com a presente invenção, os resíduos de aminoácido dos polipeptídeos que são necessários para sua atividade e assim são selecionados não para serem substituídos podem ser identificados pelos métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (referindo-se a Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Esta técnica deve introduzir mutação(ões) a cada resíduo de carga positiva em uma molécula e detectar atividade resistente à praga dos mutantes resultantes, e depois determinar que resíduos de aminoácido são importantes para a atividade da molécula. Sítios de interação de substrato-enzima podem ser identificados pela análise de suas estruturas tridimensionais que podem ser determinadas ainda por análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulagem por fotoafinidade, etc (referindo-se a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
[0045] Na presente invenção, as proteínas Cry1F incluem, mas não são limitadas a, proteínas Cry1Fa2, Cry1Fa3, Cry1Fb3, Cry1Fb6 ou Cry1Fb7, fragmentos pesticidas ou regiões funcionais que são pelo menos 70% homólogas às sequências de aminoácido das proteínas mencionadas acima, e elas têm a atividade pesticida para Athetis lepigone.
[0046] Portanto, sequências de aminoácido com certa homologia à SEQ ID N°: 1 e/ou 2 são também incluídas na presente invenção. Tipicamente, a homologia/similaridade/identidade destas sequências às sequências da presente invenção é maior do que 60%, preferivelmente maior do que 75%, mais preferivelmente maior do que 80%, ainda mais preferivelmente maior do que 90% e pode ser maior do que 95%. Também, polinucleotídeos e proteínas preferidos da presente invenção podem ser definidos por uma faixa mais particular de identidade e/ou similaridade e/ou homologia, por exemplo, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade e/ou similaridade e/ou homologia às sequências exemplificadas da presente invenção.
[0047] As sequências reguladoras descritas na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, promotores, peptídeos de transição, terminadores, realçadores, sequências líderes, íntrons e outras sequências reguladoras que podem ser operativamente ligadas à proteína Cry1F.
[0048] Os promotores são aqueles exprimíveis em plantas; os "promotores exprimíveis em plantas" referem-se aos promotores que garantem a expressão de sequências de codificação conectadas a estes em células vegetais. Os promotores exprimíveis em plantas podem ser promotores constitutivos. Exemplos dos promotores que conduzem a expressão constitutiva em plantas incluem, mas não são limitados a, promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, promotor Ubi, promotor do gene GOS2 do arroz, etc. Alternativamente, os promotores exprimíveis em plantas podem ser específicos de tecido, isto é, a expressão de sequências de codificação conduzida por tais promotores em alguns tecidos vegetais, tais como tecidos verdes, é mais alta do que aquela em outros tecidos, como determinado por testes de RNA de rotina, por exemplo, promotor de PEP carboxilase. Alternativamente, os promotores exprimíveis em plantas podem ser promotores induzíveis por ferimento. Promotores induzíveis por ferimento ou promotores que conduzem padrões de expressão induzidos por ferimento referem-se a qual a expressão de sequências de codificação regulada por tais promotores é significantemente mais alta em plantas que sofrem de ferimento mecânico ou ferimento causado pela mastigação da praga do que em plantas sob condições de crescimento normal. Exemplos dos promotores induzíveis por ferimento incluem, mas não são limitados a, promotores de genes inibidores de protease de batata e tomate (pin I e pin II) e de gene inibidor de protease do milho (MPI).
[0049] Os peptídeos de transição, também conhecidos como sequências de sinal secretórias ou sequências de guia, podem direcionar produtos transgênicos a organelas ou compartimentos celulares específicos. Os peptídeos de transição podem ser heterólogos para as proteínas alvo. Por exemplo, as sequências que codificam o peptídeo de transição de cloroplasto são usados para alvejar cloroplasto, ou sequências que retêm ‘KDEL' são usadas para alvejar o retículo endoplasmático, ou CTPP do gene de lectina de cevada são usados para alvejar vacúolos.
[0050] As sequências líderes incluem, mas não são limitadas a, sequências líderes de vírus de RNA pequeno, tal como sequência líder de EMCV (região que não de codificação 5'-terminal de EMCV (vírus da encefalomiocardite)); sequências líderes de potyvírus, tal como sequência líder de MDMV (vírus do mosaico anão do milho); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP); sequência líder não traduzida de mRNA de capsídeo do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA4); e sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV).
[0051] Os realçadores incluem, mas não são limitados a, realçador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), realçador do vírus do mosaico de escrofulária (FMV), realçador do vírus do anel da eflorescência do cravo (CERV), realçador do vírus do mosaico das nervuras da mandioca (CsVMV), realçador do vírus do mosaico de mirabilis (MMV), realçador do vírus do encrespamento de folha amarela de cestrum (CmYLCV), realçador do vírus do encrespamento de folha do algodão de Multan (CLCuMV), realçador do vírus do mosqueado amarelo de commelina (CoYMV) e realçador do vírus do risco nas folhas cloróticas do amendoim (PCLSV).
[0052] Para aplicações na monocotiledônea, íntrons incluem, mas não são limitados a, íntron hsp70 do milho, íntron de ubiquitina do milho, íntron 1 de Adh, íntron de sacarose sintase ou íntron Act1 do arroz. Para aplicações na dicotiledônea, íntrons incluem, mas não são limitados a, íntron de CAT-1, íntron de pKANNIBAL, íntron de PIV2 e íntron de "super ubiquitina".
[0053] Os terminadores podem ser sequências de sinal adequadas para a poliadenilação e funcionamento em plantas, incluem mas não são limitados a, sequências de sinal de poliadenilação derivadas de gene de nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, do gene inibidor de protease II (pin II), do gene ssRUBISCO E9 da ervilha e do gene de α-tubulina.
[0054] As "conexões eficazes" descritas na presente invenção significam as conexões de sequências de ácido nucleico e as conexões permitem que as sequências forneçam funções desejadas para sequências conectadas. As "conexões eficazes" descritas na presente invenção podem ser a conexão entre promotores e sequências de interesse, e por meio das quais a transcrição das sequências de interesse é controlada e regulada pelos promotores. Quando as sequências de interesse codificam proteínas e a expressão das proteínas é desejada, as "conexões eficazes" significam que os promotores são conectados com as sequências em um tal modo que torna os transcritos resultantes traduzidos com uma eficiência alta. Se as conexões dos promotores e as sequências de codificação resultam em transcritos de fusão e a expressão das proteínas codificada é desejada, tais conexões permitem que o códon de início dos transcritos resultantes seja o códon inicial das sequências de codificação. Alternativamente, se as conexões de promotores e sequências de codificação resultam em traduções de fusão e a expressão das proteínas é desejada, tais conexões permitem que o primeiro códon de início contido nas sequências não traduzidas 5' seja conectado com os promotores, e os produtos de tradução resultados estejam em estrutura em relação às fases de leitura abertas das proteínas desejadas. Sequências de ácido nucleico para "conexões eficazes" incluem, mas não são limitadas a, sequências fornecendo genes com função de expressão, isto é, elementos de expressão de gene, tais como promotores, região não traduzida 5', íntrons, regiões de codificação de proteína, regiões não traduzidas 3', sítios de poliadenilação e/ou terminadores de transcrição; sequências fornecendo transferência e/ou integração de DNA, isto é, sequências de margem de T-DNA, sítios de reconhecimento de recombinase sítio-específica, sítios de reconhecimento de integrase; sequências que fornecem seleção, isto é, marcadores de resistência a antibiótico, genes biossintéticos; sequências fornecendo um marcador de contagem e operações de assistência in vitro ou in vivo, isto é, sequências multiligadoras, sequências de recombinação sítio-específicas; e sequências que fornecem replicação, isto é, origens bacterianas de replicação, sequências autonomamente de replicação e sequências de centrômero.
[0055] O "pesticida" descrito na presente invenção significa que ele é tóxico às pragas da safra, e mais especificamente a Athetis lepigone.
[0056] Na presente invenção, a proteína Cry1F exibe citotoxicidade a Athetis lepigone. As plantas transgênicas, especialmente milho e sorgo, em que seus genomas contêm DNA exógeno compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam proteína Cry1F, podem levar à supressão do crescimento e morte eventual de Athetis lepigone por seu contato com a proteína depois da ingestão dos tecidos vegetais. Supressão refere-se a letal ou sub-letal. Entretanto, as plantas devem ser morfologicamente normais e podem ser cultivadas por métodos convencionais para o consumo e/ou geração de produtos. Além disso, as plantas transgênicas podem terminar basicamente o uso de pesticidas químicos ou biológicos que são alvejados em Cry1F para Athetis lepigone.
[0057] O nível de expressão de proteínas de cristal pesticidas (ICP) em tecidos vegetais pode ser determinado por uma variedade de métodos na técnica, por exemplo, quantificação de mRNA que codifica as proteínas pesticidas por iniciadores específicos, ou quantificação direta de proteínas pesticidas.
[0058] Vários testes podem ser aplicados para determinar os efeitos pesticidas de ICP em plantas. O alvo principal desta presente invenção é Athetis lepigone.
[0059] Na presente invenção, a proteína Cry1F pode ter as sequências de aminoácido mostradas como SEQ ID N°: 1 e/ou SEQ ID N°: 2 na listagem de sequência. Além da região de codificação de proteína Cry1F, outros componentes, tais como regiões que codificam uma proteína marcadora de seleção, podem ser contidos.
[0060] Além disso, o cassete de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeo que codifica proteína Cry1A pode expressar adicionalmente pelo menos uma ou mais genes que codificam proteínas com resistência a herbicida. Os genes com resistência a herbicida incluem, mas não são limitados a, genes com resistência a glufosinato tais como gene bar e gene pat; genes com resistência a fenmedifam, tal como gene pmph; genes com resistência a glifosato, tal como gene EPSPS; genes com resistência a bromoxinil; genes com resistência a sulfonilurea; genes com resistência ao herbicida dalapon; gentes com resistência a cianamida; ou genes com resistência ao inibidor de glutamina sintetase tais como PPT, desse modo obtendo plantas transgênicas tendo tanto atividade pesticida quanto resistência a herbicida altas.
[0061] Na presente invenção, DNA estrangeiro é introduzido em plantas; por exemplo, genes ou cassetes de expressão ou vetores recombinantes que codificam a proteína Cry1F são introduzidos em células vegetais. Métodos de transformação convencionais incluem, mas não são limitados a, transformação mediada por Agrobacterium, bombardeamento de micro-emissão, captação de DNA direta de protoplastas, eletroporação, ou introdução de DNA mediada por filamento de silício.
[0062] A presente invenção fornece um método para controlar pragas, com as vantagens seguintes: 1. Controle interno. Tecnologias existentes são principalmente através de ações externas, isto é fatores externos para controlar a infestação de Athetis lepigone, tais como controle agrícola e controle químico. Embora a presente invenção seja através da proteína Cry1F produzida em plantas para matar Athetis lepigone e subsequentemente controlar Athetis lepigone, isto é, através de fatores internos de controle. 2. Nenhuma poluição e nenhum resíduo. O controle químico na técnica desempenha um certo papel no controle de Athetis lepigone, mas ele traz poluição, destruição e resíduos às pessoas, animais de criação e ecossistema de terra cultivável. O método para controlar Athetis lepigone da presente invenção pode eliminar as consequências adversas acima. 3. Controle por todo o período de crescimento. Os métodos para controlar Athetis lepigone na técnica são graduais, embora a presente invenção forneça plantas com a proteção por todo seu período de crescimento. Isto é, as plantas transgênicas (com Cry1F) da germinação, crescimento, até a floração, frutificação podem evitar o dano a partir de Athetis lepigone. 4. Controle de plantas individuais integrais. Os métodos para controlar Athetis lepigone na técnica, por exemplo pulverização foliar, são principalmente localizados. Embora a presente invenção forneça uma proteção para as plantas individuais integrais, por exemplo, as raízes, folhas, caules, corutos, espigas, anteras, filetes, etc. das plantas individuais transgênicas (com Cry1F) são resistentes a Athetis lepigone. 5. Efeitos estáveis. Os métodos correntes de pulverização de pesticida requerem pulverização direta à superfície das safras, que é provável causar pulverização heterogênea ou nenhuma pulverização. A presente invenção gera plantas que expressam a proteína Cry1F com nível constante in vivo. Também, as plantas transgênicas (proteína Cry1F) têm um efeito constantemente estável de controle em locais diferentes, tempo diferente e bases genéticas diferentes. 6. Simples, conveniente e econômico. Devido à ocorrência dissimulada particular e dano de Athetis lepigone, seu monitoramento e prevenção é difícil, causando um custo de plantio substancialmente aumentado. Ao contrário, a presente invenção apenas requer plantas transgênicas que expressam proteína Cry1F, assim ela economiza muita mão-de-obra, materiais e recursos financeiros. 7. Efeito completo. Métodos para controlar Athetis lepigone na técnica não são completamente eficientes, e apenas reduzem levemente o dano. Ao contrário, as plantas transgênicas (com Cry1F) na presente invenção podem levar a 100% de morte das larvas recentemente incubadas de Athetis lepigone. As larvas raras podem sobreviver, mas elas são muito pequenas devido ao subdesenvolvimento óbvio ou ainda desenvolvimento com interrupção e dificilmente causam quaisquer danos às plantas de milho.
[0063] A presente invenção será descrita em detalhes através dos desenhos e exemplos seguintes.
[0064] A Figura 1 é um fluxograma para construir vetor de clonagem recombinante DBN01-T compreendendo a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01 no método de controle de praga da presente invenção;
[0065] A Figura 2 é um fluxograma para construir vetor de expressão recombinante DBN100014 compreendendo a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01 no método de controle de praga da presente invenção;
[0066] A Figura 3 mostra danos às folhas das plantas de milho transgênicas com inoculação de Athetis lepigone no método de controle de praga da presente invenção;
[0067] A Figura 4 mostra o desenvolvimento de larvas de Athetis lepigone que são inoculadas às plantas de milho transgênicas no método de controle de praga da presente invenção.
[0068] Os exemplos ilustrando o método para o controle de praga da presente invenção são descritos como segue.
[0069] A sequência de aminoácido (605 aminoácidos) da proteína pesticida Cry1Fa-01 é mostrada como SEQ ID N°: 1 na listagem de sequência; a sequência de nucleotídeo (1818 nucleotídeos) de Cry1Fa- 01 que codifica a dita sequência de aminoácido (605 aminoácidos) da proteína pesticida Cry1Fa-01 é mostrada como SEQ ID N°: 3 na listagem de sequência. A sequência de aminoácido (1148 aminoácidos) da proteína pesticida Cry1Fa-02 é mostrada como SEQ ID N°: 2 na listagem de sequência; a sequência de nucleotídeo (3447 nucleotídeos) de Cry1Fa-02 que codifica a sequência de aminoácido (1148 aminoácidos) da proteína pesticida Cry1Fa-02 é mostrada como SEQ ID N°: 4 na listagem de sequência.
[0070] A sequência de nucleotídeo (1848 nucleotídeos) de Cry1Ab que codifica a sequência de aminoácido (615 aminoácidos) da proteína pesticida CrylAb é mostrada como SEQ ID N°: 5 na listagem de sequência; a sequência de nucleotídeo (2370 nucleotídeos) de Vip3A que codifica a sequência de aminoácido (789 aminoácidos) da proteína pesticida Vip3A é mostrada como SEQ ID N°: 6 na listagem de sequência.
[0071] As sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01 (mostrada como SEQ ID N°: 3 na listagem de sequência), Cry1Fa-02 (mostrada como SEQ ID N°: 4 na listagem de sequência), CrylAb (mostrada como SEQ ID N°: 5 na listagem de sequência) e Vip3A (mostrada como SEQ ID N°: 6 na listagem de sequência) são sintetizadas por Nanjing GenScript Ltd.; a extremidade 5' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Cry1Fa-01 (SEQ ID N°: 3) é conectada ao sítio de restrição de AscI, a extremidade 3' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Cry1Fa-01 (SEQ ID N°: 3) é conectada ao sítio de restrição de BamHI; a extremidade 5' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Cry1Fa-02 (SEQ ID N°: 4) é conectada ao sítio de restrição de AscI, a extremidade 3' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Cry1Fa-02 (SEQ ID N°: 4) é conectada ao sítio de restrição de BamHI; a extremidade 5' da sequência de nucleotídeo sintetizada da CrylAb (SEQ ID N°: 5) é conectada ao sítio de restrição de NcoI, a extremidade 3' da sequência de nucleotídeo sintetizada da CrylAb (SEQ ID N°: 5) é conectada ao sítio de restrição de SwaI; a extremidade 5' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Vip3A (SEQ ID N°: 6) é conectada ao sítio de restrição de ScaI, a extremidade 3' da sequência de nucleotídeo sintetizada da Vip3A (SEQ ID N°: 6) é conectada ao sítio de restrição de SpeI.
[0072] Como mostrado na Figura 1, a sequência de nucleotídeo sintetizada de Cry1Fa-01 foi ligada com o vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT: A3600) de acordo com o protocolo do fabricante para gerar o vetor de clonagem recombinante DBN01-T. (Nota: Amp representa gene de resistência à Ampicilina; f1 ori representa a origem de replicação do fago f1; LacZ é o códon de início de LacZ; SP6 é o promotor de SP6 RNA polimerase; T7 é o promotor de T7 RNA polimerase; Cry1Fa-01 é a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01 (SEQ ID N°: 3); e MCS é um sítio de clonagem múltipla).
[0073] A próxima etapa foi para transformar o vetor de clonagem recombinante DBN01-T em células competentes T1 de E. coli (Transgen, Beijing, China, CAT: CD501) através de um método de choque térmico. Especificamente, 50 μl de células competentes T1 de E. coli foram misturados com 10 μl de DNA plasmídico (o vetor de clonagem recombinante DBN01-T), incubados em um banho de água a 42°C por 30 segundos e depois em um banho de água a 37°C por uma hora (em um agitador a 100 rpm). A mistura depois cresceu durante a noite em uma placa LB (triptona a 10 g/L, extrato de levedura a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, ágar a 15 g/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) com Ampicilina (100 mg/l), do qual a superfície foi revestida com IPTG (isopropil-tio-β-D-galactosideo) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D-galactosideo). Colônias brancas foram obtidas e cultivadas ainda a 37°C durante a noite em meio LB (triptona a 10 g/L, extrato de levedura a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, Ampicilina a 100 mg/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 com NaOH). Os plasmídeos foram extraídos por um método alcalino. Especificamente, as bactérias cultivadas no meio foram centrifugadas a 12000 rpm por 1 min. O sobrenadante foi descartado e as células precipitadas foram recolocadas em suspensão em 100 μl de solução I gelada (25 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA (ácido etilenodiamino tetraacético), 50 mM de glicose, pH 8,0). A seguir da adição de 150 μl de solução II recentemente preparada (0,2 M de NaOH, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio)), o tubo foi invertido por quatro vezes e colocado em gelo por 3 a 5 min. 150 μl de solução III gelada (4 M de acetato de potássio, 2 M de ácido acético) foram adicionados à mistura, misturados imediatamente e completamente e depois colocados em gelo por 5 a 10 min, seguido por uma centrífuga a 12000 rpm por 5 min a 4°C. O sobrenadante foi adicionado em 2 volumes de etanol anidro, misturado completamente e depois incubado por 5 min na temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm por 5 min a 4°C e o sobrenadante foi descartado. A pelota foi lavada com etanol a 70% (V/V) e depois seca ao ar, seguido adicionando-se 30 μl de TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) contendo RNase (20 μg/ml) para dissolver a pelota e digerindo-se o RNA em um banho de água a 37°C por 30 minutos. Os plasmídeos obtidos foram armazenados a - 20°C antes do uso.
[0074] AscI e BamHI foram usados para identificar os plasmídeos extraídos, e clones positivos foram verificados ainda por sequenciamento. Os resultados mostraram que, a sequência de nucleotídeo inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01-T foi Cry1Fa-01 mostrada como SEQ ID N°: 3 na listagem de sequência, indicando a inserção apropriada da sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01.
[0075] Como o método acima para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeo sintetizada de Cry1Fa-02 foi ligada com o vetor de clonagem pGEM-T para gerar o vetor de clonagem recombinante DBN02-T, em que, Cry1Fa-02 é a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02 (SEQ ID N°: 4). Digestão enzimática e sequenciamento foram usados para verificar a inserção apropriada da sequência de nucleotídeo Cry1Fa-02 no vetor de clonagem recombinante DBN02-T.
[0076] De acordo com o método de construção mencionado acima do vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeo sintética de Cry1Ab foi ligada com o vetor de clonagem pGEM-T para gerar o vetor de clonagem recombinante DBN03-T, em que, CrylAb é a sequência de nucleotídeo de CrylAb (SEQ ID N°: 5). Digestão enzimática e sequenciamento foram usados para verificar a inserção apropriada da sequência de nucleotídeo Cry1Ab no vetor de clonagem recombinante DBN03-T.
[0077] Como o método acima para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeo sintetizada de Vip3A foi ligada com o vetor de clonagem pGEM-T para gerar o vetor de clonagem recombinante DBN04-T, em que, Vip3A é a sequência de nucleotídeo de Vip3A (SEQ ID N°: 6). Digestão enzimática e sequenciamento foram usados para verificar a inserção apropriada da sequência de nucleotídeo de Vip3A no vetor de clonagem recombinante DBN04-T.
[0078] Métodos para construir vetores por digestão enzimática convencional são bem conhecidos na técnica. Como mostrado na Figura 2, o vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-01 (Estrutura principal do vetor: pCAMBIA2301 (disponível da CAMBIA institution)) foram digeridos respectivamente pelas enzimas de restrição AscI e BamHI; e o fragmento resultante da sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01 depois foi inserido no vetor de expressão DBNBC-01 digerido entre os sítios AscI e BamHI para gerar o vetor de expressão recombinante DBN100014. (Nota: Kan representa o gene de Canamicina; RB representa margem direita; Ubi representa o promotor do gene de ubiquitina do milho (SEQ ID N°: 7); Cry1Fa-01 representa a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01 (SEQ ID N°: 3); Nos representa o terminador do gene de nopalina sintase (SEQ ID N°: 8); PMI representa o gene de fosfomanose isomerase (SEQ ID N°: 9); e LB representa a margem esquerda).
[0079] O vetor de expressão recombinante DBN100014 foi transformado em células competentes T1 de E. coli através de um método de choque térmico. Especificamente, 50 μl de células competentes T1 de E. coli foram misturados com 10 μl de DNA plasmídico (o vetor de expressão recombinante DBN1000124), incubado em um banho de água a 42°C por 30 segundos e depois em um banho de água a 37°C por uma hora (em um agitador a 100 rpm). A mistura depois cresceu a 37°C por 12 horas em uma placa LB (triptona 10 g/L, extrato de levedura a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, ágar a 15 g/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) com 50 mg/L de Canamicina. Colônias brancas foram obtidas e cultivadas ainda a 37°C durante a noite em meio LB (triptona a 10 g/L, extrato de levedura a 5 g/L, NaCl a 10 g/L, Canamicina a 50 mg/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 com NaOH). Os plasmídeos foram extraídos por um método alcalino. A digestão enzimática com AscI e BamHI foi usada para identificar os plasmídeos extraídos, e os clones positivos foram verificados ainda por sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeo inserida no vetor de clonagem recombinante DBN0100124 entre os sítios AscI e BamHI foi Cry1Fa-01 mostrada como SEQ ID N°: 3 na listagem de sequência.
[0080] Como o método acima para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100014, os vetores de clonagem recombinantes DBN01-T e DBN03-T foram enzimaticamente digeridos por AscI e BamHI, NcoI e SwaI respectivamente para gerar as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01 e Cry1Ab, que foram inseridas no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100012. Como verificado pela digestão enzimática e sequenciamento, o vetor de expressão recombinante DBN100012 incluiu as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01 e Cry1Ab mostradas como SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 5 na listagem de sequência.
[0081] Como o método acima para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100014, os vetores de clonagem recombinantes DBN02-T e DBN04-T foram enzimaticamente digeridos por AscI e BamHI, ScaI e SpeI respectivamente para gerar as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-02 e Vip3A, que foram inseridas ainda no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100276. Como verificado por digestão enzimática e sequenciamento, o vetor de expressão recombinante DBN100276 incluiu as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-02 e Vip3A mostradas como SEQ ID N°: 4 e SEQ ID N°: 6 na listagem de sequência.
[0082] Os vetores de expressão recombinantes corretamente construídos, DBN100014, DBN100012 e DBN100276, foram transformados em LBA4404 de Agrobacterium (Invitrgen, Chicago, USA; Cat No 18313-015) através de um método com nitrogênio líquido. Especificamente, 100 μL de LBA4404 de Agrobacterium e 3 μL de DNA plasmídico (os vetores de expressão recombinantes) foram colocados em nitrogênio líquido por 10 minutos, seguido por incubação em um banho de água a 37°C por 10 minutos. O LBA4404 de Agrobacterium transformado foi inoculado em um tubo LB e depois cultivado a 28°C, 200 rpm por 2 horas. Subsequentemente, a cultura foi aplicada a uma placa LB contendo 50 mg/L de Rifampicina e 100 mg/L de Canamicina até que os clones individuais positivos crescessem. Os clones individuais foram selecionados para cultura adicional para extrair os plasmídeos. Os vetores de expressão recombinantes foram identificados por digestão enzimática, isto é, os vetores de expressão recombinantes DBN100014 e DBN100012 foram digeridos com as enzimas de restrição AhdI e XbaI, enquanto o vetor de expressão recombinante DBN100276 foi digerido com enzimas de restrição AhdI e AatII indicando a construção correta dos vetores de expressão recombinantes, DBN100014, DBN100012 e DBN100276.
[0083] De acordo com o método convencional de infecção por Agrobacterium, os embriões imaturos cultivados estéreis do Milho Z31 foram cultivados com cepas de Agrobacterium obtidas em III, Exemplo 2. Os T-DNAs (compreendendo a sequência promotora de gene de ubiquitina do milho, a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02, a sequência de nucleotídeo de Cry1Ab, a sequência de nucleotídeo de Vip3A, gene PMI e a sequência terminadora de Nos) dos vetores de expressão recombinantes DBN100014, DBN100012 e DBN100276, que foram construídos em II, Exemplo 2, foram transferidos no genoma do milho para gerar as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A. As plantas do milho do tipo selvagem foram usadas como controle.
[0084] O processo de transformação mediada por Agrobacterium do milho foi brevemente descrito como segue. Os embriões imaturos isolados do milho foram contatados com a suspensão de Agrobacterium, por meio da qual as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01, Cry1Fa-01-Cry1Ab e/ou Cry1Fa-02-Vip3A foram liberadas em pelo menos uma célula de qualquer embrião imaturo por Agrobacterium (etapa 1: Infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram preferivelmente imersos em suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,4 a 0,6, meio de infecção (sal de MS a 4,3 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 68,5 g/L, glicose a 36 g/L, Acetosiringona (AS) a 40 mg/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg/L, pH 5,3)) para iniciar a inoculação. Os embriões imaturos foram cultivados com cepas de Agrobacterium por um período de tempo (3 dias) (etapa 2: Co-cultura). Preferivelmente, depois da etapa of infecção, os embriões imaturos foram cultivados em um meio sólido (sal de MS a 4,3 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 20 g/L, glicose a 10 g/L, Acetosiringona (AS) a 100 mg/L, ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg/L, ágar a 8 g/L, pH 5,8). Depois da etapa de co-cultura, uma etapa de "recuperação" é opcional, em que existe pelo menos um antibiótico conhecido como inibir o crescimento de Agrobacterium (Cefalosporinas) e nenhum agente de seleção para transformantes de planta no meio de recuperação (sal de MS a 4,3 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 30 g/L, ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg/L, ágar a 8 g/L, pH 5,8) (etapa 3: Recuperação). Preferivelmente, os embriões imaturos foram cultivados no meio sólido com um antibiótico mas sem agentes de seleção para eliminar Agrobacterium e fornecer um período de recuperação para células transformadas. Em seguida, os embriões imaturos inoculados foram cultivados no meio com um agente de seleção (manose) e os calos transformados crescentes foram selecionados (etapa 4: Seleção). Preferivelmente, os embriões imaturos foram cultivados em um meio de seleção sólido com um agente de seleção (sal de MS a 4,3 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 5 g/L, manose a 12,5g/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg/L, ágar a 8 g/L, pH 5,8), o que resultou em um crescimento seletivo de células transformadas. Além disso, os calos regeneraram em plantas (etapa 5: Regeneração). Preferivelmente, os calos cultivados no meio com o agente de seleção foram cultivados em um meio sólido (meio de diferenciação de MS e meio de enraizamento de MS) para regenerar plantas.
[0085] Os calos resistentes selecionados foram transferidos sobre o meio de diferenciação de MS (sal de MS a 4,3 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 30 g/L, 6-benziladenina a 2 mg/L, manose a 5 g/L, ágar a 8 g/L, pH 5,8), e cultivados para a diferenciação a 25°C. As mudas diferenciadas foram transferidas sobre o meio de enraizamento de MS (sal de MS a 2,15 g/L, vitaminas de MS, caseína a 300 mg/L, sacarose a 30 g/L, ácido indol-3-acético a 1 mg/L, ágar a 8 g/L, pH 5,8), e cultivados a 25°C até a altura de cerca de 10 cm. As mudas foram depois transferidas em uma estufa e cresceram até a frutificação. Durante a cultura na estufa, as mudas foram incubadas a 28°C por 16 horas e depois incubadas a 20°C por 8 horas todo dia.
[0086] Usando cerca de 100 mg de folhas de cada uma das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A como amostras, o DNA genômico foi extraído com DNeasy Plant Maxi Kit da Qiagen, e os números de cópia do gene Cry1F, gene Cry1Ab e gene Vip3A foram determinados pelo método de PCR quantitativo de fluorescência com sonda Taqman. As plantas do milho do tipo selvagem foram analisadas como controle de acordo com o método mencionado acima. Os experimentos foram repetidos por 3 times e os resultados foram ponderados.
[0087] O protocolo detalhado para determinar os números de cópia do gene Cry1F, gene Cry1Ab e gene Vip3A foi como segue:
[0088] Etapa 11: 100 mg das folhas de cada uma das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A, e aquela das plantas do milho do tipo selvagem foram experimentados e homogeneizados em um almofariz com nitrogênio líquido. Cada amostra foi em triplicata.
[0089] Etapa 12: O DNA genômico das amostras mencionadas acima foi extraído com DNeasy Plant Maxi Kit da Qiagen, e o método detalhado refere-se ao protocolo do fabricante.
[0090] Etapa 13: NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) foi utilizado para medir as concentrações de DNA genômico das amostras mencionadas acima.
[0091] Etapa 14: As concentrações de DNA genômico das amostras mencionadas acima foram ajustadas para as mesmas concentrações em uma faixa de 80 a 100 ng/μl.
[0092] Etapa 15: Os números de cópia das amostras foram determinados por um método de PCR quantitativo de fluorescência com sonda Taqman. Uma amostra que teve um número de cópia conhecido foi usada como padrão, e uma amostra das plantas do milho do tipo selvagem foi usada como controle. Cada amostra foi triplicada e os resultados foram ponderados. Os iniciadores e sondas usados no método de PCR quantitativo de fluorescência são como segue.
[0093] Os iniciadores e sondas seguintes foram usados para detectar a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01:
[0094] Iniciador 1 (CF1): CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG, mostrado como a SEQ ID N°: 10 na listagem de sequência;
[0095] Iniciador 2 (CR1): ACGCGAATGGTCCTCCACTAG, mostrado como a SEQ ID N°: 11 na listagem de sequência;
[0096] Sonda 1 (CP1): CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC, mostrada como a SEQ ID N°: 12 na listagem de sequência;
[0097] Os iniciadores e sondas seguintes foram usados para detectar a sequência de nucleotídeo de Cry1Ab:
[0098] Iniciador 3 (CF2): TGGTGGAGAACGCATTGAAAC, mostrado como a SEQ ID N°: 13 na listagem de sequência;
[0099] Iniciador 4 (CR2): GCTGAGCAGAAACTGTGTCAAGG, mostrado como a SEQ ID N°: 14 na listagem de sequência;
[00100] Sonda 2 (CP2): CGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTG, mostrada como a SEQ ID N°: 15 na listagem de sequência;
[00101] Os iniciadores e sondas seguintes foram usados para detectar a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02:
[00102] Iniciador 5 (CF3): CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG, mostrado como a SEQ ID N°: 16 na listagem de sequência;
[00103] Iniciador 6 (CR3): ACGCGAATGGTCCTCCACTAG, mostrado como a SEQ ID N°: 17 na listagem de sequência;
[00104] Sonda 3 (CP3): CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC, mostrada como a SEQ ID N°: 18 na listagem de sequência;
[00105] Os iniciadores e sondas seguintes foram usados para detectar a sequência de nucleotídeo de Vip3A:
[00106] Iniciador 7 (CF4): ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG, mostrado como a SEQ ID N°: 19 na listagem de sequência;
[00107] Iniciador 8 (CR4): GCTGCCAGTGGATGTCCAG, mostrado como a SEQ ID N°: 20 na listagem de sequência;
[00108] Sonda 4 (CP4): CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC, mostrada como a SEQ ID N°: 21 na listagem de sequência; Sistema de reação de PCR: JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) 10 μl Mistura em 50* de iniciadores/sondas 1 μl DNA genômico 3 μl Água (ddH2O) 6 μl
[00109] A mistura em 50* de iniciadores/sondas, contendo 1 mM de cada iniciador a 45 μl, 100 μM das sondas a 50 μl e 1 x tampão de TE a 860 μl, foi armazenada a 4°C em um tubo âmbar. Condições de PCR foram como segue: Etapa Temperatura Tempo 21 95°C 5 min 22 95°C 30 s 23 60°C 1 min 24 voltando para a etapa 22, repetir 40 vezes
[00110] Os dados foram analisados pelo software SDS2.3 (Applied Biosystems).
[00111] Como mostrado pelos resultados, as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01, Cry1Fa-01-Cry1Ab e Cry1Fa-02-Vip3A foram integradas com êxito nos genomas das plantas do milho detectadas respectivamente. As plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A obtiveram uma cópia única de gene Cry1F, gene Cry1Ab e/ou gene Vip3A.
[00112] As soluções envolvidas neste experimento foram como segue:
[00113] Tampão de extração: 8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,9 g/L de Na2HPO4^12H2O, 0,2 g/L de KCl, 5,5 ml/L de Tween-20, pH 7,4;
[00114] Tampão de lavagem PBST: 8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,9 g/L de Na2HPO4^12H2O, 0,2 g/L de KCl, 0,5 ml/L de Tween-20, pH 7,4;
[00115] Solução de terminação: HCl 1M.
[00116] 3 mg de folhas frescas de cada uma das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A foram experimentados e homogeneizados com nitrogênio líquido, seguido pela adição de 800 μl do tampão de extração. A mistura foi centrifugada a 4000 rpm por 10 min, depois o sobrenadante foi diluído 40 vezes com o tampão de extração e 80 μl de sobrenadante diluído foram usados para o teste ELISA. Kits de ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima) (ENVIRLOGIX Company, Kits de Cry1Fa, Cry1Fa/Cry1Ac e Vip3A) foram utilizados para determinar a razão do teor de proteínas pesticidas (proteínas Cry1Fa, Cry1Ab e Vip3A) dividida pelo peso das folhas frescas. O método detalhado refere-se ao protocolo do fabricante.
[00117] Entretanto, as plantas do milho do tipo selvagem e as plantas do milho não transgênicas identificadas por Taqman foram usadas como controles, e a determinação seguiu os métodos como descrito acima. Para três linhagens transformadas com Cry1Fa-01 (S1, S2 e S3), com Cry1Fa-01-Cry1Ab (S4, S5 e S6) e com Cry1Fa-02-Vip3A (S7, S8 e S9), uma linhagem identificada como planta não transgênica (NGM) por Taqman e uma linhagem como (CK) do tipo selvagem, três plantas para cada linhagem foram usadas e cada planta foi repetida seis vezes.
[00118] Resultados experimentais dos teores de proteína pesticida Cry1Fa em plantas transgênicas foram mostrados na tabela 1. Resultados experimentais dos teores de proteína pesticida Cry1Ab em plantas transgênicas foram mostrados na tabela 2. Resultados experimentais dos teores de proteína pesticida Vip3A em plantas transgênicas foram mostrados na tabela 3. As razões das expressões ponderadas da proteína pesticida Cry1Fa divididas pelo peso das folhas frescas das plantas do milho transformadas com as sequências de nucleotídeo de Cry1Fa-01, Cry1Fa-01-Cry1Ab e Cry1Fa-02-Vip3A foram determinadas como 3475,52, 3712,48 e 3888,76 respectivamente; a razão das expressões ponderadas da proteína pesticida Cry1Ab divididas pelo peso das folhas frescas nas plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01- Cry1Ab foi 8234,7, e a razão das expressões ponderadas da proteína pesticida Vip3A dividida pelo peso das folhas frescas nas plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02- Vip3A foi 3141,02. Estes resultados sugerem que as plantas do milho transgênicas receberam uma expressão relativamente alta e estável de proteína Cry1Fa, proteína Cry1Ab e proteína Vip3A. Tabela 1. A quantidade média de proteína CrylFa expressada nas plantas do milho transgênicas
Tabela 2. A quantidade média de proteína CrylAb expressada nas plantas do milho transgênicas 
Tabela 3. A quantidade média de proteína Vip3A expressada nas plantas do milho transgênicas 
[00119] As plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A, as plantas do milho do tipo selvagem e as plantas do milho não transgênicas confirmadas por Taqman foram detectadas quanto à sua resistência a Athetis lepigone.
[00120] Folhas frescas das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A, e aquelas das plantas do milho do tipo selvagem e das plantas do milho identificadas como plantas não transgênicas (estágio V3-V4) por Taqman foram experimentadas respectivamente. As folhas foram enxaguadas com água estéril e a água nas folhas foi totalmente seca por gaze. As nervuras das folhas foram removidas, e as folhas foram cortadas em tiras de aproximadamente 1 cm x 2 cm. Duas tiras das folhas foram colocadas em papel de filtro umedecido com água destilada no fundo de placas de Petri plásticas redondas. 10 cabeças de Athetis lepigone (larvas recentemente incubadas) foram colocadas em cada placa, e as placas com as pragas foram cobertas com tampas e colocadas a 25 a 28°C, umidade relativa de 70% a 80% e fotoperíodo (luz/escuro) 16:8 por 3 dias. De acordo com três indicadores, o progresso de desenvolvimento, mortalidade e taxa de dano à folha das larvas de Athetis lepigone, a contagem de resistência foi adquirida: contagem = 100 x mortalidade + [100 x mortalidade + 90 x (o número de pragas recentemente incubadas/o número total de pragas inoculadas) + 60 x (o número de pragas recentemente incubadas - o número de pragas de controle negativo/o número total de pragas inoculadas) + 10 x (o número de pragas de controle negativo/o número total de pragas inoculadas)] + 100 x (1 - taxa de dano à folha). Três linhagens foram transformadas com Cry1Fa-01 (S1, S2 e S3), e 3 linhagens foram transformadas com Cry1Fa-01- Cry1Ab (S4, S5 e S6), e 3 linhagens foram transformadas com Cry1Fa- 02-Vip3A (S7, S8 e S9), e 1 linhagem foi identificada como planta não transgênica (NGM) por Taqman, e 1 linhagem foi do tipo selvagem (CK); 3 plantas foram escolhidas para o teste de cada linhagem, repetido seis vezes por plantas. Os resultados foram mostrados na tabela 4, Figura 3 e Figura 4. Tabela 4. A resistência à praga das plantas do milho transgênicas inoculadas com Athetis lepigone
[00121] Como mostrado na tabela 4, as contagens das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e das plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A foram principalmente de mais do que 280; enquanto a contagem das plantas do milho do tipo selvagem foi geralmente de cerca de 150 ou menos.
[00122] Como mostrado na Figura 3 e Figura 4, comparado com as plantas do milho do tipo selvagem, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A mataram aproximadamente 100% da Athetis lepigone recentemente incubada, e inibiram muito o desenvolvimento de larvas que raramente sobreviveram de modo que as larvas ainda permaneceram no estado recentemente incubado depois de 3 dias. Adicionalmente, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A apenas tiveram um dano menor, apresentando uma quantidade muito pequena de danos semelhantes a furo feito por alfinete em algumas folhas que podem apenas ser observados sob um ampliador.
[00123] Assim, é provado que as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e as plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A todas mostraram resistência alta a Athetis lepigone, que é suficiente para causar efeitos adversos sobre o crescimento de Athetis lepigone de modo que os mesmos possam ser controlados.
[00124] Os resultados acima também mostraram que o controle eficaz de Athetis lepigone resultou da proteína Cry1F produzida pelas plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01, pelas plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-01-Cry1Ab e pelas plantas do milho transformadas com a sequência de nucleotídeo de Cry1Fa-02-Vip3A. Seria bem conhecido à pessoa habilitada na técnica que, plantas transgênicas similares que podem expressar Cry1F podem ser produzidas para controlar Athetis lepigone, com base no mesmo efeito tóxico da proteína Cry1F à Athetis lepigone. Proteínas Cry1F descritas na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, proteínas Cry1F mostradas nas modalidades específicas pelas sequências específicas. As plantas transgênicas também podem gerar pelo menos um tipo de proteína pesticida adicional que é diferente de Cry1F, por exemplo, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ba e Vip3A.
[00125] Em conclusão, a presente invenção pode controlar Athetis lepigone permitindo-se que as plantas produzam proteína Cry1F in vivo, o que é tóxico para Athetis lepigone. Em comparação com métodos de controle agrícola e químico correntes, os método descritos pela presente invenção podem controlar Athetis lepigone por todo o período de crescimento das plantas e fornecer uma proteção total às plantas. Adicionalmente, o método é estável, completo, simples, conveniente, econômico, isento de poluição e isento de resíduo.
[00126] Finalmente, deve ser observado que, as modalidades acima ilustram meramente as soluções técnicas da presente invenção e não devem ser limitadas a estas, embora as modalidades preferidas com referência à presente invenção tenham sido descritas em detalhe, a pessoa habilitada na técnica deveria avaliar que as soluções técnicas da presente invenção podem ser modificadas ou equivalentemente substituídas sem divergir do espírito e escopo das soluções técnicas da invenção.
Claims (10)
1. Método para controlar Athetis lepigone, o método compreendendo contatar Athetis lepigone com proteína Cry1F, em que a proteína Cry1F é uma proteína Cry1Fa; em que a proteína Cry1Fa está presente em uma célula de planta que expressa a proteína Cry1Fa, e Athetis lepigone contata com a proteína Cry1Fa por ingestão da célula de planta, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da proteína Cry1Fa compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2; e a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cry1Fa compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína Cry1Fa está presente em uma planta transgênica que expressa a proteína Cry1Fa, e Athetis lepigone contata com a proteína Cry1Fa por ingestão de um tecido da planta transgênica; posteriormente, o crescimento de Athetis lepigone é suprimido, e este eventualmente leva à morte de Athetis lepigone e consegue controlar o dano de Athetis lepigone à planta.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica está em quaisquer períodos de crescimento.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tecido da planta transgênica é raízes, folhas, caules, corutos, espigas, anteras ou filetes.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o controle do dano de Athetis lepigone à planta não depende da localização do plantio.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o controle do dano de Athetis lepigone à planta não depende do tempo de plantio.
7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta é milho.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que antes da etapa de contato, o método compreende uma etapa para plantar uma muda transgênica que contém um polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Fa.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um nucleotídeo secundário expresso pela planta codifica proteína Cry1Ab, proteína Cry1Ac, proteína Cry1Ba ou proteína Vip3A, e o nucleotídeo secundário compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo secundário é dsRNA, que inibe um gene importante de uma praga alvo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210533772.2A CN102972427B (zh) | 2012-12-11 | 2012-12-11 | 控制害虫的方法 |
| CN201210533772.2 | 2012-12-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102013031734A2 BR102013031734A2 (pt) | 2014-09-02 |
| BR102013031734B1 true BR102013031734B1 (pt) | 2020-12-01 |
| BR102013031734B8 BR102013031734B8 (pt) | 2022-12-20 |
Family
ID=47847002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR102013031734A BR102013031734B8 (pt) | 2012-12-11 | 2013-12-10 | Método para controlar athetis lepigone |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140165233A1 (pt) |
| CN (1) | CN102972427B (pt) |
| AR (1) | AR093884A1 (pt) |
| BR (1) | BR102013031734B8 (pt) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103688974B (zh) * | 2013-11-11 | 2015-07-15 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN103719137B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-05-13 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN103719136A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-04-16 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN103718895B (zh) * | 2013-11-18 | 2016-05-18 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN103636653B (zh) * | 2013-11-21 | 2015-07-15 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN111606984B (zh) * | 2020-05-19 | 2021-08-06 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种植物抗虫蛋白及其编码基因和应用 |
| CN116782768A (zh) * | 2021-01-22 | 2023-09-19 | 先正达生物科技（中国）有限公司 | 夜蛾科、草螟科和螟蛾科有害生物的控制 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0413019T3 (da) * | 1989-02-24 | 2001-11-12 | Monsanto Technology Llc | Syntetiske plantegener og fremgangsmåde til fremstilling af disse |
| US6218188B1 (en) * | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
| US20080256669A1 (en) * | 2007-04-16 | 2008-10-16 | Monsanto Company | Plants with Multiple Transgenes on a Chromosome |
| US8609936B2 (en) * | 2007-04-27 | 2013-12-17 | Monsanto Technology Llc | Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis |
| WO2009132850A1 (en) * | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Bayer Bioscience N.V. | Armyworm insect resistance management in transgenic plants |
| CN101768558B (zh) * | 2008-12-29 | 2013-08-07 | 行政院农业委员会农业药物毒物试验所 | 抗害虫的新颖苏云金芽孢杆菌菌株 |
| US9663795B2 (en) * | 2009-12-16 | 2017-05-30 | Dow Agrosciences Llc | Use of Cry1Ab in combination with Cry1Be for management of resistant insects |
-
2012
- 2012-12-11 CN CN201210533772.2A patent/CN102972427B/zh active Active
-
2013
- 2013-12-09 AR ARP130104590A patent/AR093884A1/es unknown
- 2013-12-10 BR BR102013031734A patent/BR102013031734B8/pt active IP Right Grant
- 2013-12-10 US US14/101,426 patent/US20140165233A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR102013031734B8 (pt) | 2022-12-20 |
| BR102013031734A2 (pt) | 2014-09-02 |
| US20140165233A1 (en) | 2014-06-12 |
| AR093884A1 (es) | 2015-06-24 |
| CN102972427A (zh) | 2013-03-20 |
| CN102972427B (zh) | 2014-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103718895B (zh) | 控制害虫的方法 | |
| WO2015070778A1 (zh) | 控制害虫的方法 | |
| BR102013031734B1 (pt) | método para controlar athetis lepigone | |
| BR102013031016A2 (pt) | gene pesticida e uso do mesmo | |
| CN104621172B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| US20140154224A1 (en) | Method of Pest Control | |
| CN103719137B (zh) | 控制害虫的方法 | |
| BR102013031014B1 (pt) | método para o controle de athetis lepigone | |
| BR102013031822B1 (pt) | método para o controle de sesamia inferens | |
| CN103688974A (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN106497966A (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| CN104286014B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| BR112021009540B1 (pt) | Método para combate da praga helicoverpa gelotopoeon por meio do contato da dita praga com a proteína vip3aa e uso da dita proteína vip3aa no combate à praga helicoverpa gelotopoeon | |
| BR102014003618A2 (pt) | Métodos para controle de pragas | |
| CN104621171B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| CN103734169A (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN103636653A (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN104604924B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| US20140161778A1 (en) | Method of Pest Control | |
| CN105660674A (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| CN104255771B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| BR102022025270A2 (pt) | Métodos para controlar uma praga de tripes, para produzir uma planta ou uma semente de planta para controlar uma praga de tripes e para cultivar uma planta para controlar uma praga de tripes | |
| CN114317578A (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| CN114304191A (zh) | 杀虫蛋白的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06I | Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA. |
|
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 10/12/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP CO., LTD. (CN) ; BEIJING GREEN AGROSINO PLANT PROTECTION TECHNOLOGY CO., LTD. (CN) ; BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. (CN) |
|
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: BEIJING DABEINONG TECHNOLOGY GROUP CO., LTD. (CN) ; BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. (CN) ; BEIJING GREEN AGROSINO CROP SCIENCE CO., LTD. (CN) |
|
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. (CN) |