MXPA01009823A - Vectores virales de insectos y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona vectores virales de insecto utiles para transferir genes a plantas, insectos u otros huespedes.

Description

VECTORES VIRALES DE INSECTOS Y USOS DE LOS MISMOS Antecedentes de la Invención La síntesis de compuestos útiles en plantas, por ejemplo, agentes terapéuticos, materias primas químicas, cosméticos y otros bienes de consumo, y la ingeniería genética para la mejora de cultivos, por ejemplo, plantas resistentes a patógenos preparadas por ingeniería genética, son dos áreas de la biotecnología de plantas que son de importancia económica creciente y de interés en la investigación alrededor del mundo (Miele, 1997; Franken y colaboradores, 1997; Beachy, 1997; Ma y colaboradores, 1996; Estruch y colaboradores, 1997; Palmgren, 1997) . Además, la disponibilidad de las colecciones genómicas de plantas y EST, está cambiando el potencial para la biotecnología comercial de plantas (Briggs y colaboradores, 1997; McKusick, 1997; y Evans y colaboradores, 1997) . En particular, debido a que muchas características de las plantas tales como rendimiento, índice de cosecha, heterosis y tolerancia a la tensión ambiental, están reguladas por la acción concertada de diversos genes, el acceso a etiquetas de secuencia de genes y colecciones genómicas, suministra un medio de identificación, o una fuente fácil para genes que son de interés comercial.

Ref: 132266 de huésped y tienen una utilidad limitada debido a la expresión variable de genes extraños. Los Nodavirus son virus pequeños, en forma de icosaedro, no cubiertos, de origen de insectos. Los mosquitos { Culex tri taeniorhynchus , Adesa egypti , Culex Tarsalis, Aedes albopictus y Toxorhynchi tes amboinesis) , larvas de la polilla de la harina de la India y del escarabajo negro del césped { Plodia interpunctella : Lepidópteros y Attagenus piceus : Coleópteros), larvas de la polilla de la cera { Galleria mellonella : Lepidópteros) y de abejas de miel {Apis mellifera ) , son algunos de los huéspedes de insectos que se conoce que se infectan con los Nodavirus, en los cuales la infección provoca parálisis y la muerte (Tesh, 1980; Bailey and Scott, 1972) . Ejemplos de Nodavirus incluyen el virus del escarabajo negro (BBV) , el virus de los corrales de rebaños (Flock House Virus) (FHV) , el virus Boolarra (BOV) y el virus Noda ura (NOV) . Estos virus son los únicos virus conocidos de ARN de genoma bipartita en el sentido del mensajero, de animales superiores o inferiores (para una revisión, ver Hendry, 1991) . Los virus de plantas de genoma bipartita se conocen, pero sus partes de genoma están encapsuladas en viriones separados (Bruening, 1977) .

Los huéspedes naturales de los Nodavirus son insectos, sin embargo, los Nodavirus se pueden multiplicar en animales, (por ejemplo, el NOV puede infectar ratones y posiblemente cerdos, ver Bailey and Scott, 1972; Scherer and Hurlbut, 1967; Scherer y colaboradores, 1968) , y recientemente se han encontrado en peces marinos Mori y colaboradores, 1992; Nishizawa y colaboradores, 1995; Frerichs y colaboradores, 1996), aunque el FHV no se multiplica del todo en células animales superiores. Además, el FHV se multiplica fácilmente en plantas sin provocar síntomas de enfermedades (Selling y colaboradores, 1990) . El FHV se puede introducir en plantas al frotar mecánicamente las hojas, o se puede introducir al atomizar las hojas con una solución que contiene el virus. Sin embargo, el FHV se mueve pobremente o no se mueve en absoluto desde el sitio de infección. Así, lo que se necesita es un vector para transmitir local o sistémicamente, un segmento o secuencia de ácido nucleico deseado o preseleccionado a las plantas, sin provocar enfermedad a esas plantas. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un vector de transferencia de genes de base ácido nucleico viral recombinante, útil para transmitir genes a plantas y animales, por ejemplo, insectos. Preferiblemente, el vector se deriva de un virus que tienen un genoma bipartita que comprende ARN lineal de hebra simple, por ejemplo el Nodavirus (Hendry, 1991), diantovirus, tobravirus (Matthews, 1991) y similares. Así, la invención proporciona un vector de transferencia de genes biológicamente activos, que comprende secuencias ligadas de ácido nucleico. Las secuencias ligadas de ácido nucleico incluyen una secuencia de ácido nucleico derivada de la terminación 5' y de un ácido nucleico viral, por ejemplo, la terminación 5' del Nodavirus ARN-1 o Nodavirus ARN-2; una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento de ácido nucleico de interés; una secuencia de ácido nucleico derivada de la terminación 3' de un ácido nucleico viral, por ejemplo, la terminación 3' del Nodavirus ARN-1 o Nodavirus ARN-2. La secuencia de ácido nucleico que comprende el segmento de ácido nucleico de interés, codifica preferiblemente una proteína de movimiento del virus de la planta, y una proteína de recubrimiento del virus de la planta, (por ejemplo, una proteína natural de recubrimiento o una proteína modificada de recubrimiento que tiene propiedades diferentes a la proteína natural de recubrimiento) , una hormona de crecimiento, una toxina, por ejemplo, una toxina subletal, tal como una auxina o una toxina Photorhabdus, una citoquina, resistencia a la enfermedad, resistencia a las pestes, esterilidad masculina, sitios antigénicos en la superficie de un virus útiles para la producción de vacunas, o resistencia a plaguicidas, y/o comprende un gen sintético, secuencias/enzimas de ARN antisentido etiquetadas para modificar las propiedades de las plantas, un gen marcador o un marcador de selección o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, el segmento de ácido nucleico comprende secuencias modificadas para la expresión creciente en plantas. Los segmentos de ácido nucleico se unen preferiblemente de manera de resultar en un polipéptido de fusión. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican los sitios proteolíticos se pueden introducir entre cada segmento de ácido nucleico. Opcionalmente, cada segmento de ácido nucleico se puede unir operativamente a una unidad de control de la transcripción, por ejemplo un promotor. Un vector de la invención, se puede combinar con otros vectores animales de base virus, vectores de planta de base virus u otros vectores de insectos de base virus por ejemplo, el vector mosaico del tabaco de base virus (Beachy, 1997), un vector de base de baculovirus (Scheneemann y colaboradores, 1993) o un vector de base virus de vacuna (Ball, 1993) .

Un vector preferido de la invención comprende ácido nucleico del Nodavirus en las terminaciones 5' y 3' del vector y codifica una proteína de movimiento de virus en la planta (MP) . La MP ayuda en la transubicación de un virus o de una nucleoptoteína viral (material genético más una "proteína portadora") de célula de planta a célula de planta. Así, la expresión de una MP en una célula de planta que tiene un vector de la invención, conduce a la transmisión de las secuencias de vector a las células de planta circundantes lo que resulta en una transmisión local o transitoria y en la expresión de esa secuencia. Así, en donde se desea una expresión localizada o transitoria, y suficiente (como en separación por exclusión/genómica de alta producción) , la transmisión de un vector de la invención puede reducir dramáticamente el tiempo para separar por exclusión la expresión en comparación con un enfoque transgénico. Además, ya que los Nodavirus, Diantovirus y Tobravirus se puede transmitir por una simple frotación mecánica de las hojas, los vectores basados en estos virus se pueden usar en variedades existentes de plantas sin necesidad de preparar versiones transgénicas. En particular, la invención proporciona un enfoque para la mejora de cultivos, que evita los métodos caros y consumidores de tiempo requeridos para preparar cultivos transgénicos, y evita la contaminación potencial de bancos de semillas y colecciones de germoplasma con genes extraños, que se asocian con los enfoques transgénicos. La invención proporciona además, un método para introducir una secuencia preseleccionada de ácido nucleico a una célula huésped. El método comprende poner en contacto una célula huésped con un vector de la invención, en una cantidad efectiva para expresar la secuencia preseleccionada de ácido nucleico sin producir partículas infecciosas de virus. Si el huésped es un organismo, la ausencia de virus infecciosos elimina completamente la amenaza de algunas consecuencias inesperadas e indeseables para el huésped, por ejemplo, insectos o seres humanos. Preferiblemente para huéspedes de plantas, el contacto incluye la frotación mecánica, por ejemplo de las hojas. La invención también proporciona composiciones útiles para la transferencia de genes a células huésped. Una modalidad de una composición de la invención incluye (a) una cantidad de ácido nucleico que codifica una polimerasa viral (replicasa) , tal como el Nodavirus ARN- 1; y (b) una cantidad de ácido nucleico recombinante. El ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de la terminación 5' de un ácido nucleico viral, por ejemplo, la terminación 5' del Nodavirus ARN-2; la secuencia de ácido nucleico comprende al menos un segmento de ácido nucleico de interés, y una secuencia de ácido nucleico derivada de la terminación 3' de un ácido nucleico viral, por ejemplo, la terminación 3' del ARN-2 del Nodavirus. La presencia de un ácido nucleico que codifica una replicasa viral, por ejemplo el ARN-1 del Nodavirus, en una composición de la invención, permite la amplificación de moléculas de ácido nucleico que se cotransfieren a células huésped con el ácido nucleico que codifica la replicasa. Alternativamente, la replicasa se puede modificar por la célula huésped. Una secuencia preferida de ácido nucleico que codifica una replicasa incluye ARN-1 de FHV. Las moléculas de ARN se pueden separar in vitro, usando polimerasa T7, T3 o SP6, o por aislamiento del ARN de los viriones de células cultivadas, por ejemplo, células de roedores, Drosophilia o insectos que se han transfectado o puesto en contacto con moléculas de ARN o ADN, o composiciones de la invención. Si se desea la transferencia sistémica de un gen de interés, una de las secuencias de ácido nucleico en una composición de la invención, codifica preferiblemente una CP, y opcionalmente codifica también una MP, de manera que el vector se trasmite al tejido vascular (el floema) . La expresión de la CP y la MP puede permitir la síntesis de los compuestos deseados en altos rendimientos, y puede resultar en otorgar resistencia a enfermedades a todos los tejidos de planta. Como se describe de aquí en adelante, se puede preparar un vector de base FHV para la infección sistémica de plantas, e incluye la proteína de movimiento de 30 KDa del virus mosaico del tabaco (TMV MP; Deom y colaboradores, 1992) y la proteína de recubrimiento de un virus mosaico necrótico del trébol rojo (RCNMV; Xiong y colaboradores, 1993) . Para observar el movimiento del vector a través de la planta, se puede introducir un gen marcador dentro del vector, por ejemplo, un gen que codifica una proteína verde fluorescente (GFP, Epel y colaboradores, 1996; y Casper y colaboradores, 1996) . La GFP es una proteína de 238 residuos de aminoácidos aislada originalmente de la medusa Aequorea victoria (Av) . Absorbe la luz azul con una absorción máxima a 395 nm y emite luz verde con una emisión pico a 590 nm. Cuando se expresa la GFP en células procarióticas o eucarióticas, es capaz de producir una fluorescencia verde fuerte cuando se excita por la luz azul, y esta fluorescencia no requiere de su huésped productos adicionales de genes. Así, los vectores y composiciones de la invención, se pueden usar para sintetizar compuestos farmacológicos deseados u otros agentes, por ejemplo agentes que codifican la resistencia a los insectos, y para una separación por exclusión de alta producción de material genético no caracterizado, por ejemplo, material genético no caracterizado de un ácido nucleico resistente a plaguicidas de plantas o insectos que codifica una característica útil. Por ejemplo, el material genético no caracterizado de una planta resistente a plagas, se introduce dentro de un vector de la invención, y el ARN se expresa del mismo y se prepara una composición de la invención. Las plantas que son susceptibles a plagas se exponen a la composición, preferiblemente por atomización y se exponen después a la infestación de las plagas. Las hojas que muestran signos de resistencia, son indicativas de que el material genético introducido puede codificar la resistencia a las plagas. Así, la invención también proporciona un sistema de ensayo rápido para genes regulatorios y genes para resistencia a medicamentos y toxicidad en insectos y humanos . Para aplicaciones en las cuales se va a expresar una proteína recombinante y después aislarse de la planta huésped, por ejemplo un compuesto farmacéutico, la composición de la invención se aplica preferiblemente a la planta por frotación o atomización. Por ejemplo, el área en contacto de la planta puede ser tal, que solamente el follaje de la planta esté expuesto a la composición, por ejemplo, plantas tales como los tubérculos cuyo follaje no tiene valor comercial. Una vez que la proteína se expresa en la planta, la proteína recombinante se puede aislar y/o purificar de la planta o sus tejidos. También se suministra un método para la expresión de una molécula preseleccionada de ácido nucleico en una célula huésped o huésped. El método comprende poner en contacto una célula huésped o huésped con una cantidad y una composición de la invención. Las composiciones preferidas incluyen el virus recombinante, virión aislado de ARN, transcriptos de ARN preparados in vi tro o cualquier combinación de los mismos. Después, se detecta y determina la expresión del gen de interés. Así, la invención proporciona además un huésped transgénico, el genoma del cual se aumenta con el vector de la invención. Los huéspedes preferidos de plantas para los vectores de transferencia de genes y composiciones de la invención, incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas transgénicas y no transgénicas, por ejemplo, col ornamental, maíz dulce, pepino, cebada, quenopodiáceas, por ejemplo, Chenopodium Hybridum, chícharo de vaca, tabaco y Nicotiana Benthamiana y similares.

Preferiblemente, el huésped de la planta es susceptible a la infección por Nodavirus. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Organización genómica del virus de los corrales de rebaños (FHV) . El FHV es un virus pequeño en forma de icosaedro de 30 nm de diámetro con un genoma bipartita. El ARN-1 está completado y tiene alrededor de 3.1 kb de longitud y codifica una replicasa de alrededor de 112 kDa. El ARN-2 está completado, y tienen alrededor de 1.4 kb de longitud y codifica un precursor de 44 kDa del recubrimiento/proteína de la cápsida. El ARN-3 también esta completado, alrededor de 0.39 kb de longitud y codifica una proteína de 11.6 kDa. Los círculos llenos en las terminaciones 3' indican que estos extremos están enmascarados o bloqueados. Tanto el ARN-1 como el ARN-2, están formando cápsidas en el mismo virión. Figura 2. Estructura del ARN-2 del FHV e interferencia defectuosa del DI-634 del ARN. El DI-634 es un producto espontáneo de eliminación 634 b del ARN-2, que se replica eficientemente y se empaca dentro de los viriones. Los segmentos etiquetados I, II, III, corresponden a la secuencia de la terminación 5' , media y terminaciones 3' del ARN-2 FHV; las líneas delgadas representan las áreas eliminadas del ANR-2. fUÉÉññflIr ñ ti s ? ^?l Figura 3a. Secuencias que actúan en ci s requeridas para la replicación del ARN-2 del FHV. (a) las barras sólidas indican el clon de cADN de longitud completa de ARN-2 de FHV o secuencias del cADN presente en los mutantes de eliminación. Las líneas delgadas indican las bases eliminadas (?) , que se indican a la derecha de cada constructo. Las eficiencias de replicación de los mutantes eliminados en relación con el clon de longitud completa (100%) se han medido como se describe por Zhong et al. (1992) . Los mutantes con deficiencias de replicación muy pobres se indican con flechas. Figura 3b los bloques sólidos muestran los tres segmentos esenciales para la replicación del ARN-2 del FHV. Figura 4. Estructuras tallo-circuito pronosticadas por computadora, de las secuencias supuestas de formación de cápsidas en los ARN-2 de los Nodavirus. La longitud del total de los ARN-2 del FHV, BBV, BOV, y NOV son 1400, 1399, 1305 y 1355 bases, respectivamente (Dasgupta y Sgro, 1989) . Figura 5. Diagrama esquemático que muestra el procedimiento para la detección de la síntesis del FHV en plantas. Las hojas simples de una diversidad de especies de plantas se inocularon con el .ARN del FHV como se describe por Selling et al. (1990). La capacidad de infección del FHV como se detecta por el ensayo de i - placas, se encontró en la mayoría de los homogéneos derivados de la hojas inoculadas de cebada, quenopodiáceas, chícharo de vaca y Nicotiana benthamiana . Figura 6. Organización del genoma del RCNMV. El ARN- 1 y el ARN-2 se muestran como líneas sólidas con ORF identificados como cuadros abiertos. Los números arriba o abajo de los ORF, identifican las posiciones de los codones de iniciación y terminación de ORF. La región de formación de la estructura ribosomal en el ARN-1, se marca como un cuadro sombreado. Los productos de proteína pronosticados y observados se representan por cuadros negras. Las funciones conocidas de la proteína RCNMV (Matthews, 1991) se describen debajo de cada proteína. Figura 7. Estrategia general para la construcción del vector, preparación de ARN, inoculación y detección. Figura 8. Construcción de un vector de base ARN-2 del Nodavirus que codifica las proteínas de fluorescencia verde (GFP) . La secuencia de GFP se amplifica del clon de cADN del TMV p30BGFPC3 mediante PCR, usando cebadores que contienen los sitios Bsil. La digestión de este producto de PCR y el clon pB D2 del cADN del FHV con el Nsil, seguido por una unión y transformación, produce el ARN-2 del FHV: quimera pF2G3 del GFP. Se muestran las posiciones de nucleótidos y sitios únicos de restricción.

Figura 9. Construcción de un vector de base Nodavirus DI que codifica la proteína de movimiento del virus mosaico del tabaco ((TMV MP) y GFP. Las secuencias de GFP y MP se amplifican del clon del cADN del TMV p30BGFPC3 mediante PCR usando los cebadores que contienen los sitios Sac I. La digestión de este producto de PCR y del clon pD1634 de cADN de FHV DI con Sac I, seguido por la unión y transformación, produce FHV DI: TMV MP:GFP quimera pFdTmG3. Se muestran las posiciones de nucleótidos y los sitios únicos de restricción. Figura 10. Construcción de un vector basado en el Nodavirus DI que codifica la MP del TMV, proteína de recubrimiento del virus mosaico necrótico del trébol rojo (RCNMV CP) y GFP. La secuencia de la proteína de recubrimiento del RCNMV se amplifica del clon pRCl de cADN del RCNMV y se inserta entre las secuencias de MP y GFP del pFdTmG3 como se describe arriba para crear pFdTmRcG3. T3 = promotor T3, T7 = promotor T7, RBZ = ribozima . Figura 11. Monitoreo de la expresión de los constructos del vector de base FHV sobre plantas de Nicotiana benthamiana . Se inoculan las hojas al frotar las hojas con transcriptos de ARN hechos in vi tro usando la polimerasa del ARN T3 o T7. Todas las plantas se co- inoculan con ARN-1 del FHV como una fuente de la replicasa de FHV. Figura 12. RT-PCR de los ARN extraídos de hojas inoculadas y secundarias de N. benthamiana o de plantas transgénicas con MP de TMV o MP de RC?MV. Banda 1; AR?-2 del FHV (800 ng) usado como plantilla. Banda 2; hoja inoculada de imitación (amortiguador) . Banda 3; hoja inoculada de una planta de tipo silvestre (no transgénica). Banda 4; hoja secundaria no inoculada de una planta de tipo silvestre, banda 5; hoja inoculada de una planta transgénica con MP de TMV. Banda 6; hoja secundaria no inoculada de una planta transgénica con MP de TMV. Banda 7; hoja inoculada de una planta transgénica con MP de RC?MV. Banda 8; hoja secundaria no inoculada de una planta transgénica con MP de RC?MV. Banda 9; marcador. La flecha indica los productos PCR que corresponden al AR?-2 del FHV de longitud completa (1.4 kb) . La MP de TMV MP y la MP de RC?MV movilizaron el FHV para las hojas secundarias no inoculadas. Figura 13A. Hoja de una planta de N. benthamiana que expresa la GFP. Una planta transgénica de dos semanas de edad que expresa la MP de TMV, se inoculó con 1 µg de transcripto de AR? del vector de expresión de TMV 30BGFPC3 (un plásmido de 10.4 kb que contiene la replicasa de TMV, las MP GFP y CP de 30 kDa, ) . Diez días después de la inoculación, se colocó la planta entre dos lámparas UV de onda larga y se tomaron fotografías con una cámara de vídeo a color Sony 3CCD (modelo DXC-960MD) . Figura 13B. Fotografía de plantas de N. ben thamiana que expresan GFP. Las condiciones fueron las mismas que en la figura 13A excepto de que la fotografía se tomó usando una cámara Minolta MaMaxxum 7000i y una película Kodak Ectachrome de 1000 ASA. La película se expuso durante 4 segundos. Figura 14. Hoja de una planta de N. benthaniana no inoculada crecida y fotografiada bajo las mismas condiciones que se describen en la figura 12. Obsérvese que las hojas aparecen violeta debido a la luz ultravioleta pero no se observa fluorescencia verde. Figura 15. Mapa del pCG?1788A, un plásmido que contiene el gen de resistencia sistémica adquirida SAR 8.2. el fragmento BamHI-Sstl (529 bp) se introduce dentro del vector de base FHV pFdTmRcG3. Figura 16. Mapa de los cuatro lugares de la toxina Photorhabdus (Pht) : tea , teb, tec y icd. Los sitios de restricción usados para el rompimiento de los genes, se muestran debajo de cada lugar. El sombreado indica las regiones de similitud entre TcaB, TcbA y TcdA que rodean los sitios de desdoblamiento de la proteasa supuesta. Los fragmentos de los lugares tea y teb (Bowen y colaboradores, 1998) se subclonan en el vector de base FHV pFdTmRcG3 y se prueba para toxicidad. Figura 17. Rendimiento de FHV en plantas. Los rendimientos se determinan por ensayo de placas de preparaciones homogéneas de hojas sobre una monocapa de células de Drosophila . Los rendimientos se expresan en unidades formadoras de placas (pfu) por cada mg de tejido de hojas (100-500 mg) . Observar un incremento de 100 veces en las plantas transgénicas de N. benthamiana en comparación a las plantas no transformadas (de tipo silvestre) . Descripción Detallada de la Invención 1. Replicación y transmisión del ?odavirus A. Organización del genoma de los ?odavirus La estrategia del genoma de un ?odavirus representativo, FHV, se muestra en la figura 1. El AR?-1 y el AR?-2 son AR?s de sentido que forman cápsidas dentro de un virión simple. El AR?-1 del FHV (3106 bases) codifica una proteína denominada A (112 kDa) que es responsable de la actividad de la polimerasa (replicasa) . El AR?-2 del FHV (1400 bases) dirige la síntesis de un precursor de cápsida de virión denominado alfa (44 kDa), que se procesa dentro de la proteína de recubrimiento madura (referida como beta; 39 kDa) y una pequeña proteína de 4.4 kDa denominada gamma. Las células infectadas con FHV producen un mensajero adicional, ARN-3 (389 bases), que codifica una proteína denominada B (11.6 kDa) . El ARN-3, es un ARN mensajero subgenómico contenido en la terminación 3' que no forma cápsidas dentro de los viriones. La proteína B está involucrada en la función de la polimerasa. Todos los ADN nodavirales están completados (m7GpppGp) en sus terminaciones 5' y, a diferencia de otros virus de ARN conocidos, sus terminaciones 3' están enmascaradas o bloqueadas como evidencia de la resistencia a la modificación aún bajo condiciones de desnaturalización (Dasgupta y colaboradores, 1984). Los clones de cADN de ambos ARN genómicos, están disponibles y los transcriptos de ARN in vi tro hechos de estos clones son infecciosos, y producen viriones de progenie auténtica (Dasmahapatra y colaboradores, 1986) . B. infección persistente y generación de los ARN del DI. Los Nodavirus crecen vigorosamente in vi tro en células de Drosophila melanogaster (Friesen and Rueckert, 1981) y se pueden ensayar cuantitativamente por formación de placas (Selling and Rueckert, 1984). Cuando se infectan las células de Drosophila melanogaster con FHV a una multiplicidad alta o baja de infección (m.o.i), por ejemplo 0.1-10, el virus provoca un efecto citopático extensivo y muerte celular dentro de 3 días. Sin embargo, alrededor del 1% de las células infectadas sobreviven en cada ronda del ciclo de infección. Estás células son resistentes a la superinfección por FHV y otros Nodavirus relacionados como el BBV (Longworth and Archibald, 1975) y BOV (Reinganum y colaboradores, 1985) . Estas células infectadas son una fuente de virus que puede usar células frescas con una eficiencia similar. Estas células son por lo tanto, persistentemente infectadas en una forma no litica. Los ARNs virales de 10 de estas líneas de células infectadas persistentemente, se etiquetaron con 3H- uridina en presencia de actinomicina D y se analizaron sobre geles de agarosa. El autoradiograma muestra la presencia de ARNs pequeños además de los ARNs genómicos en al menos 4 de cada 10 líneas (Selling, 1986) . Algunos de estos ARNs más pequeños, se encontraron en viriones purificados de células persistentemente infectadas, indicando que estos ARNs más pequeños contienen señales para la replicación y el empaque. La transfección de células frescas de Drosophila con estos ARNs más el ARN del virión, provocaron una inhibición de mil veces en la formación de placas en comparación con los FHV de tipo silvestre. Esto sugiere que estos ARNs compiten e interfieren con la replicación de los ARNs genómicos y son probablemente mejores plantillas para la replicación y formación de cápsidas. Estos ARN se refieren como moléculas de ARN que interfieren defectuosamente (DI) . C. Estructura de los ARNs DI La formación de secuencias enzimáticas (Dasgupta y colaboradores, 1980) de los ARNs DI, mostró que retienen secuencias idénticas a las terminaciones 3' y 5' de los ARNs de virión. Los cebadores de oligonucleótidos que corresponden a las terminaciones de la secuencia de ARN-1 (Dasmahapatra y colaboradores, 1985) y ARN-2 del FHV (Dasgupta and Sgro, 1989) se usaron para hacer clones de cADN en vectores pUC13 y PBS+. Estos cADN, formaron después secuencias por el método de determinación de cadenas de nucleótido y de dideoxi usando Sequenase (United States Biochemicals, Kreaft y colaboradores, 1988) . Siete moléculas de ARN DI formaron secuencias. Seis de ellas se derivaron del ARN-2 genómico y una de ellas se derivó del ARN-1 genómico. Los ARN DI derivados del ARN-2, se diluyeron en tres grupos según sus estructuras: la forma más simple de DI (DI-634), mostrada en la figura 2, resultó de dos eliminaciones mayores en ARN-2; retuvo las primeras 249 bases de la terminación ', la mitad (bases 517-728) y la terminación 3' de ARN-2 (bases 1228-1400). No hubo rearreglo de la secuencia. ***.*****. ., *• -—- «**-*-*-*• ^?¡^x^i^.^A?j ?iAA á Otro tipo de secuencia de ARN DI derivada de ARN-2, tiene una estructura más compleja. Retuvieron las primeras 15 o 41 bases de la terminación 5' de los ARNs genómicos que siguió con las bases 75-249 y las bases 517-728 derivadas de la mitad de los ARN-2 genómicos. La mitad 3' de estas moléculas DI incluyeron rearreglos de secuencia desde la terminación 5', 3' del ARN-2. Las 48 bases de la terminación 3' (1353-1400) eran colineales con el ARN-2 genómico. Todavía otra forma del DI derivado del ARN-2 retuvo una extensión de 249 bases desde la terminación 5', y el resto de la estructura incluyó el rearreglo arriba mencionado. El ARN DI derivado del ARN-1, retuvo tres partes del ARN genómico: los dos extremos y la mitad. De manera interesante, a pesar de las variaciones en la estructura, todos estos ARN DI fueron de longitud similar, aproximadamente la mitad en longitud en comparación a sus ARNs genómicos correspondientes. Por ejemplo, los Dls derivados del ARN-2 genómico tuvieron 630-680 bases de longitud y el derivado de ARN-1 tuvo 1395 bases de longitud (ARN-1 genómico y ARN-2 tienen 3106 y 1400 bases, respectivamente) . D. Señales para la replicación y formación de cápsidas del ARN-2 del FHV.

Los clones de cADN del ARN-2 de FHV así como los ARNs DI se modificaron a través de una serie de eliminaciones y mutagénesis in vi tro, y se ensayaron para su replicación y actividades de formación de cápsidas. La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra los mutantes de eliminación construidos del clon de cADN del ARN-2. Los transcritos de estos mutantes se usaron para transfectar células de Drosophila y se midió el ARN sintetizado después de doce horas (Zhong y colaboradores, 1992). Una extensión de 60 bases desde la terminación 5', una región interna de 147 bases (bases 470-616) , y las últimas 51 bases de la terminación 3' (1350-1400) se encontraron que eran importantes para la replicación eficiente del ARN-2 del FHV (tablero B; segmentos I, II y III, respectivamente) . La replicación del ARN-2 in vivo fue muy pobre (mostrada por las flechas en la figura 3A) cuando se eliminaron estas regiones. Estudios similares sobre las señales de formación de cápsidas usando ARN DI (DI-634, mostrado en la figura 2) mostraron que una región de 32 bases de ARN-2 (bases 186- 217) se requiere para el empaque eficiente dentro de viriones. La supresión de esta región, elimina completamente el empacado del ARN DI en viriones pero no tenía efecto en la replicación. La formación de una estructura tallo-circuito mostrada en la figura 4, ha sido pronosticada para esta secuencia que se conserva en todos los ARN-2s Nodavirales (Zhong y colaboradores, 1992) . Estructuras similares tallo-circuito también se encontraron para usarse como señales de empaque en los bacteriófagos Qß y R17, los virus L-A de la levadura y en virus de Corona. E. Propagación del FHV en Plantas. La propagación de un virus en una planta o huésped, involucra el movimiento viral/replicación en un arreglo diverso de tejidos. El virus entra en una célula herida después de la infección y sintetiza sus propias proteínas. Una de las proteínas que codifican virus no estructural, la proteína del movimiento (MP) , permite que una nucleoproteína infecciosa se mueva de célula a célula hasta que la infección alcanza los tejidos vasculares. Durante la segunda etapa, conocida como movimiento vascular o de larga distancia, la planta completa se vuelve infectada, para lograr esto, la nucleoproteína infecciosa debe entrar, moverse dentro y salir de los tejidos vasculares. Los estudios muestran que la MP se requiere para el movimiento célula a célula, pero la MP solamente no es suficiente para provocar una infección sistémica. En la mayoría de los virus de plantas, la proteína de recubrimiento (CP) y los factores de huésped son necesarios para el movimiento a larga distancia (para una revisión, ver Serón y colaboradores, 1996; Deom y colaboradores, 1992) . Para determinar si el FHV se replica en una planta, la planta se inocula con ARN de FHV. Se han detectado viriones recientemente sintetizados en plantas enteras de cebada { Hordeum vulgare) , chícharo de vaca { Vigna sinensis) , quenopodiáceas { Chenopodi um hybridum) , Nicotiana benthamiana { Selling, 1990), arroz, alfalfa, maíz dulce, col ornamental, pepino y Arabidopsis (Figura 17 y datos no mostrados) , y en protoplastos derivados de hojas de cebada y tabaco (Figura 5 y Tabla 1) que se expusieron al ARN del FHV. Tabla 1 : Producción de viriones después de la exposición al virus* ;De Selling, 1990 En los protoplastos de cebada, el rendimiento del virus fue de 130 pfu por protoplasto, que representa un estimado mínimo del alrededor de 3% de protoplastos que sintetizan viriones. Los viriones producidos en plantas contenían ARN recientemente sintetizado así como proteína cápsida recientemente sintetizada. Los experimentos en el curso del tiempo mostraron que la síntesis del FHV en protoplastos de cebada es bastante comparable con la que se encuentra en el huésped de la línea de célula de insecto natural del FHV {Drosophila melanogaster) bajo condiciones comparables de transfección (Selling y colaboradores, 1990). Aproximadamente 1.4 mg de FHV se produjeron de Ig de protoplastos de cebada lo que demuestra un muy alto nivel de expresión. En dos hojas inoculadas de cebada, los rendimientos del FHV fueron de 180 y 3800 pfu (con base en el ensayo de placas estándar del FHV sobre células de Drosophila ) en una base por hoja. Un rendimiento máximo promedio de 3.4 x 105, 4.2 x 105 y 1.2 x 105 pfu por hoja se observó con la quenopodiácea, chícharo de vaca y N. benthamiana infectados con el FHV, respectivamente (Figura 17). En la N. benthamiana, los viriones que resultan de la inoculación con AR? de FHV, se detectaron no solamente en hojas inoculadas sino también en otras hojas de plantas inoculadas, sugiriendo que los viriones se podían mover en estas especies de plantas. Sin embargo, en la N. ben thamiana , el movimiento se restringió a tres hojas arriba y debajo de las hojas inoculadas. Además, hubo una disminución en la capacidad de infección con el tiempo. 5 Esto se pudo deber a la inestabilidad de los viriones en plantas y/o la distribución de los viriones fuera del sitio de inoculación. Estos resultados muestran que el medio ambiente intracelular en las plantas, es apropiado para la síntesis de un virus normalmente nativo de los insectos, aunque las proteínas virales codificadas necesarias para el movimiento célula a célula en las plantas no están probablemente codificadas por el FHV. f II. Vectores de la Invención A. Secuencias virales 15 Los vectores de la invención comprenden secuencias virales necesarias para transmisión de esas secuencias a las células, así como secuencias de interés que se unen a las secuencias virales. Así, los vectores incluyen secuencias no codificadoras que son necesarias in cis, esto es, las terminaciones 5' y 3' del ácido nucleico de los ?odavirus, Tobravirus y Dianthavirus, y secuencias que actúan en trans necesarias para la transmisión del vector a otras células, esto es, secuencias que codifican la MP viral y/O CP. Los Dianthovirus incluyen el virus de mancha de anillo del clavel, el mosaico necrótico del trébol rojo, el virus mosaico necrótico del trébol dulce, y el virus de vena necrótica de furcraea. Los Tobravirus incluyen el virus de oscurecimiento temprano del chícharo, virus de mancha de anillo del pimiento, virus de cascabel del tabaco, virus del helécho de lengua de ciervo. Para la amplificación de las secuencias del vector dentro de una célula, se puede emplear una replicasa viral. La replicasa se puede codificar con el genoma de la célula huésped, por una secuencia de ácido nucleico introducida dentro de las células huésped antes de, concurrente con o posterior a la introducción del vector, o codificada pon el vector. El vector de la invención puede codificar cualquier MP viral incluyendo, pero no limitándose a, la proteína de movimiento del virus moteado amarillo de la Commelina (CoMYV) , CaMV, virus en forma de bacilo de la caña de azúcar (ScBV) , virus en forma de bacilo tungro del arroz (RTBV) , virus de anillo grabado del clavel (CERV) , virus mosaico de la hierba del higo (FMV) , virus moteado clorótico de la soya (SoyCMV) , virus mosaico del cáñamo (Deom y colaboradores, 1997), virus de la necrosis del tabaco (Molnar y colaboradores, 1997), virus mosaico del tabaco (Slovyev y colaboradores, 1996) , geminivirus (Sung y colaboradores, 1995) , potexvirus, hordevirus y virus de amarillamiento de la remolacha ( (Agranovsky y colaboradores, 1998) , virus mosaico de la alfalfa (van der Vossen y colaboradores, 1995) , virus de vena clorótica del cacahuate (Ducasse y colaboradores, 1995) , virus de ondulamiento moteado de la alcachofa (Tavassa y colaboradores, 1994), virus mosaico de raya de la cebada ( eiland y colaboradores, 1994), virus mosaico del chícharo de vaca (Wellink y colaboradores, 1993), virus mosaico de amarillamiento de la remolacha (Karasev y colaboradores, 1992), y virus de ondulamiento del nabo (Hacker y colaboradores, 1992) . Para una infección local y/o sistémica de una planta, el vector de la invención codifica preferiblemente una CP de virus de planta. Las proteínas de recubrimiento ejemplares incluyen, pero no se limitan a, la proteína de recubrimiento del virus de atrofia del tomate (TBSV) , virus mosaico de raya de cebada (BSMV) , virus mosaico necrótico del trébol rojo (RCNMV) , virus de necrosis del pepino (CNV) , virus mosaico dorado del tomate (TGMV), virus mosaico dorado del frijol (BGMV) , virus de rizo de la hoja del tomate (TLCV) , virus de rizo de la hoja de la calabacita (SqLCV) , virus mosaico de la cazabe africana (ACMV) , potyvirus, virus mosaico de la calabacita, virus A del ajo, (Helguera y colaboradores, 1997), virus mosaico cromo de la uva (Torregrosa y colaboradores, 1997), virus Y de la papa y virus de rodillo de la hoja de papa (Zhang y colaboradores, 1997), virus enano del arroz (Zheng y colaboradores, 1997) virus de vena amarilla necrótica de la remolacha (Fecker y colaboradores, 1996) , virus enano amarillo de la cebada de Montana (Geske y colaboradores, 1996) , virus de mancha de anillo de la papaya (Scorza y colaboradores, 1995) , virus de amarillamiento temprano del chícharo (MacFarlane y colaboradores, 1995) , virus moteado amarillo del arroz (Brugidou y colaboradores, 1995) , virus del manchado en el tallo de la manzana y la pera (Jelkmann, 1994), virus de amarillamiento infeccioso de la lechuga, virus de amarillamiento de la remolacha, y virus de tristeza de los cítricos (Klassen y colaboradores, 1994), virus X de la papa (Truve y colaboradores, 1993) , virus de la viruela del ciruelo (Ravelonandro y colaboradores, 1992), virus mosaico del trébol blanco y mosaico de una variedad de orquídea tropical (cymbidium) (Chia y colaboradores, 1992), virus mosaico del pepino (Slightom, 1991), virus mosaico de la alfalfa (Neelman y colaboradores, 1991) , virus moteado clorótico del chícharo de vaca (Allison y colaboradores, 1990) , y virus mosaico de un pasto del género Bromus (Sacher y colaboradores, 1989) , virus mosaico del tabaco, virus mosaico de la coliflor, virus mosaico amarillo del nabo, virus sin esperma del tomate, virus de vena amarilla necrótico de la remolacha, virus ? ú m-? ?± de ondulamiento del nabo, virus de cascabel del tabaco, virus de mancha de anillo de una variedad de orquídea tropical (cymbidium) , virus moteado clorótico del chícharo de vaca, virus grabado del tabaco, virus amarillo occidental de la remolacha, virus mosaico de la baya del sur, virus mosaico del cáñamo, virus grabado del tabaco, virus mosaico de una variedad de baya, virus de la vena del maíz, virus de rizo superior de la remolacha y virus de rizo de la hoja del tomate (ver por ejemplo, Tablas 1, 2 y 3 de Nelson y van Bel, 1998), la descripción de los cuales se incorpora aquí como referencia) . B. Otras Secuencias para Expresión en Plantas La expresión de un gen preseleccionado en plantas, se puede aumentar por diversos elementos o mecanismos que incluyen la adición de promotores, enriquecedores, intrones, secuencias lider, y secuencias 3', así como por la substitución de los codones nativos en un gel que no es de plantas, con codones que son preferidos en las plantas (Murry y colaboradores, 1989; Perlak y colaboradores, 1991), y la eliminación de secuencias ricas en AT, separación o alteración de las secuencias poli A crípticas, y separación o alteración de las secuencias desestabilizadoras de mARN. 1. Promotores, Enriquecedores, Intrones, Secuencias Líder y otras Secuencias Regulatorias Preferiblemente, el segmento preseleccionado de ácido nucleico en un vector de la invención, se liga operativamente a un promotor, el cual suministra la expresión del segmento preseleccionado de ácido nucleico. El promotor es preferiblemente un promotor funcional en la célula huésped dentro de la cual se introduce el vector, por ejemplo, en plantas y/o semillas. Una secuencia preseleccionada de ácido nucleico, se liga operativamente al promotor cuando se localiza en la dirección 3' desde el promotor. La mayoría de los genes tienen regiones de ácido nucleico que se conocen como promotores, los cuales regulan la expresión de los genes. Para los genes codificados por el ADN genómico, las regiones del promotor se encuentran típicamente en la dirección 5' que flanquea al ADN desde la secuencia codificadora en células procarióticas y eucarióticas. Una secuencia de promotor, proporciona la regulación de la transcripción de la secuencia de genes en la dirección 3' e incluye típicamente desde alrededor de 50 hasta alrededor de 2,000 pares base de nucleótidos. Las secuencias de promotor también contienen secuencias regulatorias tales como secuencias enriquecedoras, que pueden influenciar el nivel de expresión de los genes. Algunas secuencias de promotor aisladas, pueden suministrar la expresión de i-.***?i^f*fi*u .Ap* genes de ADNs heterólogos, que es un ADN diferente del ADN nativo u homólogo. Las secuencias de promotor también se conocen por ser fuertes o débiles, o que se inducen. Un promotor fuerte proporciona un alto nivel de expresión de genes, mientras que un promotor débil proporciona un nivel muy bajo de expresión de genes. Un promotor que se induce es un promotor que suministra el encendido y apagado de la expresión de genes en respuesta a un agente agregado de forma exógena o a un estímulo ambiental o de desarrollo. Un promotor bacteriano, tal como el promotor Ptac se puede inducir hasta niveles variables de la expresión de genes, dependiendo del nivel del isotiopropilgalactosida agregada a las células bacterianas transformadas. Los promotores también puede proporcionar la regulación del tejido, de desarrollo o específica. Una secuencia de promotor aislada que es un promotor fuerte para el ácido nucleico heterólogo, es ventajosa porque suministra un nivel suficiente de expresión de genes para permitir la fácil detección y selección de las células transformadas, y suministra un alto nivel de expresión de genes cuando se desea. Los promotores de plantas preferidos incluyen, pero no se limitan a, un promotor tal como el promotor CaMV 35S (Odell y colaboradores, 1985) , un promotor enriquecido 35S (Kay y colaboradores, 1987) o otros tales como el CaMV 19S (Lawton y colaboradores, 1987), nos, Adhl (Walker y colaboradores, 1987), sintasa de sacarosa (Yang y colaboradores, 1990) , a-tubulina, ubicuitina, actina (Wang y colaboradores, 1992), cab (Sullivan y colaboradores, 1989) , PEPCasa (Hudspeth y colaboradores, 1989) o aquellos asociados con el complejo del gen R (Chandler y colaboradores, 19891) . Promotores apropiados adicionales incluyen el promotor Z4 de un gen que codifica la proteína a-zeína Z4 de 22 kD, el promotor Z10 de un gen que codifica una zeína de 10 kD, el promotor Z27 de un gen que codifica la proteína zeína de 27 kD, el promotor A20 del gen que codificla la proteína a-zeína de 19 kD, promotores que se inducen, tales como el promotor ligero que se induce derivado del gen rbcS del chícharo (Coruzzi y colaboradores, 1971) y el promotor de actina del arroz (McElroy y colaboradores, 1990) ; promotores específicos de semillas, tales como el promotor de faseolina de los frijoles, se pueden usar también (Sengupta-Gopalan, 1985) . Otros ipromotores útiles en la práctica de la invención se conocen por aquellos hábiles en el arte. Un ácido nucleico preseleccionado, por ejemplo una secuencia de ADN, se puede combinar con el promotor mediante métodos estándar como los descritos por Sambrook y colaboradores, citado supra , para producir una cinta de expresión. Brevemente, un plásmido que contiene un promotor tal como el promotor 35S CaMV se puede construir como se describe en Jefferson (1987) u obtenerse del Clontech Lab en Palo Alto California (por ejemplo, pBI121 o pBl221) . Típicamente, estos plásmidos se construyen para tener sitios múltiples de clonación que tienen especificidad para diferentes enzimas de restricción y la inducción 3' del promotor. La secuencia preseleccionada de ADN, se puede subclonar en la dirección 3' desde el promotor, usando enzimas de restricción y colocándose para asegurarse que el ADN se inserta en la orientación adecuada con respecto al promotor, de manera que el ADN se puede expresar como ARN sentido o antisentido. Una vez que la secuencia preseleccionada de ADN, se une operativamente a un promotor, la cinta de expresión aquí formada se puede subclonar en el vector de la invención. Una vez que se obtiene la secuencia preseleccionada de ADN de sentido, toda o una porción de la secuencia se puede subclonar en un vector de expresión (ver abajo) en la orientación opuesta (esto es, 3', 5'). Similarmente, toda o una porción de la secuencia preseleccionada de ADN se puede subclonar en la orientación de sentido (esto es, 5' o 3' ) . La secuencia preseleccionada de ADN se subclona en la dirección 3' desde el promotor para formar una cinta de expresión. Se pueden incluir además cuando se desean, elementos regulatorios tales como el intron 1 Adh (Callis y colaboradores, 1987), intron de la sacarosa sintasa (Vasil y colaboradores, 1989) , o el elemento omega TNV (Gallie y colaboradores, 1989) , así como secuencias virales subgenómicas, por ejemplo, secuencias virales subgenómicas de ARN. Ya que la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de la transcripción y el comienzo de la secuencia de codificación, esto es, la secuencia líder no traducida, pueden influenciar la expresión de genes, se puede desear emplear una secuencia líder particular. Las secuencias líder preferidas se contemplan para incluir aquellas que incluyen secuencias pronosticadas para dirigir la expresión óptima del gen colocado, esto es, incluir una secuencia líder de consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad del mARN y evitar la iniciación inapropiada de la traducción. La elección de tales secuencias, se conocerá por aquellos con habilidad en el arte a la luz de la presente descripción. Las secuencias que se derivan de genes, que son altamente expresados en plantas son las más preferidas.

Se contempla que los vectores para su uso de conformidad con la presente invención, se pueden construir para incluir el elemento enriquecedor oes . Este elemento se identificó primero como un enriquecedor palindrómico de 16 pb del gen de la octopina sintasa { oes) de una agrobacteria, y está presente en al menos otros 10 promotores (Bouchez y colaboradores, 1989) . Se propone que el uso de un elemento enriquecedor, tal como el elemento oes y particularmente copias múltiples del elemento, actuarán para aumentar el nivel de la transcripción de los promotores adyacentes. Finalmente, los segmentos de ácido nucleico más deseables para la introducción dentro de una planta, pueden ser genes homólogos o familias de genes que codifican una característica deseada (por ejemplo, rendimiento creciente por hectárea) y que se introducen bajo el control de promotores novedosos o enriquecedores, etcétera, o tal vez aún los promotores homólogos específicos del tejido (por ejemplo, específicos de la raíz, cuello/vaina, espiral, tallo, caña de la mazorca, grano o la hoja) o elementos de control. De hecho, se vislumbra que un uso particular de la presente invención, será el ataque de un gen en una forma específica del tejido. Por ejemplo, los genes resistentes a los insectos se pueden expresar específicamente en los tejidos de espiral y cuello/vaina que son blancos para la primera y segunda progenie respectivamente, de ECB. Similarmente, los genes que codifican proteínas con actividad particular contra los gusanos de raíz, se puede atacar directamente a los tejidos de la raíz. Los vectores para su uso en el ataque específico de tejidos de genes en plantas transgénicas, incluirán típicamente promotores específicos del tejido y pueden también incluir otros elementos de control específicos del tejido tales como secuencias enriquecedoras . Los promotores que dirigen la expresión específica o enriquecida en ciertos tejidos de plantas, se conocerán por aquellos con habilidad en el arte a la luz de la presente descripción. Estos incluyen por ejemplo, el promotor rbcS, específico para el tejido verde; los promotores oes, nos, y mas que tienen actividad superior en raíces o tejido lastimado de hojas; un promotor truncado (-90 a +8) de 35S que dirige la expresión enriquecida en raíces, un gen de a-tubulina que dirige la expresión en raíces, y promotores derivados de los genes de la proteína de almacenamiento de zeína que dirige la expresión en el endosperma. Se contempla particularmente que se puede usar ventajosamente el elemento enriquecedor oes de 16 bp del gen de la octopina sintasa { oes) (Bonchez y colaboradores, 1989) , especialmente cuando se ? ¡? ¿?h A**A1:***Í .i-.*, r.?.^..* ^ *Á?m^- ??m?.M¿»i^s^e¡A presente en copias múltiples para alcanzar una expresión enriquecida en las raíces. Se contempla también que la expresión específica del tejido se puede lograr funcionalmente al introducir un gel constitutivamente expresado (todos los tejidos) en combinación con un gen antisentido que se expresa solamente en aquellos tejidos en donde no se desea el producto de los genes. Por ejemplo, un gen que codifica la proteína de la toxina cristal del B . thuringiensis (Bt) se puede introducir de manera que se exprese en todos los tejidos usando el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor. La expresión del transcripto antisentido del gen Bt en un grano de maíz, usando por ejemplo, un promotor de zeína, evitaría la acumulación de la proteína de Bt en las semillas. Así, la proteína codificada por el gen introducido estaría presente en todos los tejidos excepto en el grano. Alternativamente, se puede desear obtener secuencias novedosas de promotores específicos del tejido para su uso de conformidad con la presente invención. Para alcanzar esto, se pueden aislar primero clones de cADN del tejido relacionado e identificar aquellos clones que se expresan específicamente en ese tejido por ejemplo, usando un manchado Northern. Preferiblemente, sería deseable identificar un gen que no esté presente en un número elevado de copias, sino que el producto del gen sea relativamente abundante en tejidos específicos. El promotor y los elementos de control de los clones genómicos correspondientes, se pueden entonces localizar usando las técnicas conocidas por aquellos con habilidad en el arte. Se contempla que la expresión de algunos genes en plantas transgénicas, será deseable solo bajo condiciones específicas. Por ejemplo, se propone que la expresión de ciertos genes que le otorgan resistencia a los factores de expresión ambientales tales como sequía, será deseable solamente bajo las condiciones reales de tensión. Se contempla que la expresión de tales genes a través del desarrollo de la planta, pueda tener efectos perjudiciales. Se conoce que un gran número de genes existe para responder al medio ambiente. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como el rbcS, que codifican la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato carboxilasa, se regula por la luz y es mediado a través de un fitocromo. Otros genes se inducen por estímulos secundarios. Por ejemplo la síntesis del ácido abscísico (ABA) se induce por ciertos factores ambientales incluyendo pero no limitado a la tensión por agua. Diversos genes han demostrado ser inducidos por el ABA (Skriver and Mundy, 1990) . También se anticipa que la expresión de los genes que otorgan resistencia a la depredación de los insectos, sería deseable solo bajo condiciones de infestación real de insectos. Por lo tanto, para algunas características deseadas, la expresión inducida de genes en plantas transgénicas será deseada. Se propone que en algunas modalidades de la presente invención, la expresión de un gen en una planta transgénica sea deseable solamente en un cierto periodo de tiempo durante el desarrollo de la planta. El tiempo de desarrollo se correlaciona frecuentemente con la expresión de genes específicos del tejido. Por ejemplo, la expresión de proteínas de almacenamiento de zeína, se inicia en el endosperma alrededor de 15 días después de la polinización. 2. Secuencias de Ataque Intracelular o Extracelular Adicionalmente, se pueden construir cintas de expresión empleadas para atacar el producto de la secuencia o el segmento preseleccionados de ácido nucleico, para un compartimiento intracelular dentro de las células de las plantas, o dirigir una proteína al medio extracelular. Esto se puede alcanzar generalmente al unir una secuencia de ADN que codifica una secuencia de péptido de señal o tránsito, a la secuencia codificadora de la secuencia preseleccionada de ADN. El péptido resultante de tránsito o de señal, transportará a la proteína hasta un destino particular intracelular o extracelular respectivamente, y puede ser separado posterior a la traducción. Los péptidos de tránsito actúan al facilitar el transporte de las proteínas a través de las membranas intracelulares, por ejemplo vacuolo, vesículas, plástidos y membranas mitocóndricas, mientras que los péptidos de señal dirigen las proteínas a través de la membrana extracelular. Al facilitar el transporte de la proteína en compartimentos dentro o fuera de las células, estas secuencias pueden incrementar la acumulación de un producto particular de genes en una ubicación particular. Por ejemplo, ver la patente U.S. No. 5,258,300. Un ejemplo particular de tal uso, se refiere a la dirección de un gen de resistencia a herbicidas, tal como el gen EPSPS, a un organelo particular tal como el cloroplasto más que al citoplasma. Esto se ejemplifica por el uso del péptido de tránsito rbcS que le confiere el ataque específico del plásmido de las proteínas. Además, se propone que sea deseable atacar ciertos genes responsables de la esterilidad masculina en la mitocondria, o dirigir genes con resistencia a organismos fitopatogénicos a los espacios extracelulares, o dirigir proteínas al vacuolo.

. También se contempla que sea útil dirigir el ADN mismo dentro de una célula. Por ejemplo, puede ser útil dirigir el ADN introducido al núcleo ya que esto puede incrementar la frecuencia de transformación. Dentro del núcleo mismo sería útil dirigir un gen con objeto de lograr una integración específica al sitio. Por ejemplo, sería útil tener un gen introducido a través de transformación y reemplazar un gen existente en la célula . 3. Secuencias 3' Cuando la cinta de expresión se va introducir dentro de una célula de plantas, la cinta de expresión puede incluir opcionalmente secuencias regulatorias de ADN no traducidas en 3', que actúan como una señal para terminar la transcripción y permiten la poliadenilación del mARN resultante. La secuencia regulatoria de ADN no traducida en 3' , incluye preferiblemente desde alrededor de 50 hasta alrededor de 1,000, más preferiblemente alrededor 100 hasta alrededor de 1,000 pares base de nucleótidos y contiene secuencias de terminación traduccional y transcripcional de plantas. Los elementos preferidos en 3' , se derivan de aquellos del gen de la nopalina sintasa del Agrobacterium tumefaciens (Bevan y colaboradores, 1983), el terminador para el transcripto T7 del gen de octopino sintasa del Agrobacterium tumefaciens, y la ¡A i terminación 3' de los genes I o II inhibidores de pfüteasa de la papa o el tomate, aunque también se pueden emplear otros elementos 3' conocidos por aquellos hábiles en el arte. Estas secuencias regulatorias no traducidas 3' , se pueden obtener como se describe en An (1987), o están ya presentes en los plásmidos disponibles de fuentes comerciales tales como Clontech, Palo Alto, California. Las secuencias regulatorias no traducidas en 3' se pueden unir operativamente a la terminación 3' de la secuencia de ADN preseleccionada por métodos estándar. 4. Marcadores de Selección o Separables por Exclusión con objeto de mejorar la capacidad para identificar transformantes, se puede desear emplear un gen marcador de selección o separable por exclusión, o además de, la secuencia o segmento preseleccionado de ácido nucleico. Los "genes marcadores" son genes que imparten un genotipo diferente a las células que expresan el gen marcador, y permiten así, que tales células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar un marcador de selección o separable por exclusión, dependiendo de si el marcador otorga una característica que uno puede "seleccionar" por medios químicos, esto es, a través del uso de una fuente de selección (por ejemplo, un herbicida, antibiótico o similares), o si es simplemente una característica que uno puede identificar a través de la observación o prueba, esto es, al "separar por exclusión" (por ejemplo, la característica en el lugar R) . Por supuesto, se conocen muchos ejemplos de los genes marcadores apropiados en el arte y se pueden emplear en la práctica de la invención. También se incluyen dentro de los términos de genes marcadores de selección o separables por exclusión, los genes que codifican un "marcador secretable" cuya secreción se puede detectar como un medio de identificación o selección de las células transformadas. Ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que se puede identificar por interacción de anticuerpos, o aún enzimas secretables que se pueden detectar por su actividad catalítica. Las proteínas secretables caen dentro de una diversidad de clases, incluyendo proteínas pequeñas, que se difunden y detectables, por ejemplo por ELISA; enzimas pequeñas activas detectables en una solución extracelular (por ejemplo a-amilasa, ß-lactamasa, fosfinotricina acetiltransferasa) ; y las proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia líder tal como aquella encontrada en la unidad de expresión de la extensina o del PR-S del tabaco) . Con respecto a los marcadores de selección secretables, se considera particularmente ventajoso el uso de un gen que codifica un polipéptido que es secuestrado en la pared celular, cuyo polipéptido incluye un epitope único. Tal marcador secretado de antígeno emplearía idealmente una secuencia de epítope que suministraría un fondo bajo en el tejido de las plantas, una secuencia líder-promotor que impartiría la expresión eficiente y la dirección a través de la membrana del plasma y produciría proteína que se enlaza en la pared celular y es todavía accesible a los anticuerpos. Una proteína de pared segregada normalmente modificada para incluir un epítope único, satisface todos esos requerimientos . Un ejemplo de una proteína apropiada para modificación de esta manera es la extensina, o la glicoproteína rica en hidroxiprolina (HPRG) . Se prefiere el uso de la HPRG del maíz (Stiefel y colaboradores, 1990) , ya que está molécula está bien caracterizada en términos de la biología molecular, expresión y estructura de la proteína. Sin embargo, cualquiera de una variedad de extensinas y/o proteínas de pared ricas en glicina (Keller y colaboradores, 1989) se puede modificar con la adición de un sitio antigénico para crear un marcador de separación por exclusión. Los elementos de la presente descripción se ejemplifican en detalle a través del uso de genes marcadores particulares. Sin embargo, a la luz de esta descripción, serán aparentes otros numerosos posibles genes marcadores de selección y/o separables por exclusión para aquellos con habilidad en el arte, además de aquel establecido de aquí en adelante. Por lo tanto se entenderá que la siguiente discusión es ejemplar más que exhaustiva. A la luz de las técnicas aquí descritas y las técnicas recombinantes generales que se conocen en el arte, la presente invención hace posible la introducción de cualquier gen, incluyendo genes marcadores, dentro de una célula receptora para generar una célula de planta transformada, por ejemplo una célula monocotiledónea. Los marcadores de selección posibles para su uso en conexión con la presente invención, incluyen pero no se limitan a, un gen neo (Potrykus y colaboradores, 1985) que codifica la resistencia a la canamicina y se puede seleccionar para usar la canamicina, el G418, un gen que codifica la resistencia a la bleomicina, y similares; un gen bar que codifica la resistencia al bialafos; un gen que codifica una proteína sintasa alterada EPSP (Hinchee y colaboradores, 1988) otorgando así resistencia al glifosato; un gen de nitrilasa tal como el bxn de la Klebsiella azaenae que otorga resistencia al bromoxinil (Stalkery colaboradores, 1988); un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS) que confiere resistencia a la imidazolinona, sulfonilurea u otros químicos que inhiben el ALS (Solicitud Europea de patente 154,204, 1985); un gen DHFR resistente al metotrexato (Thillet y colaboradores, 1988); un gen de dalapon dehalogenasa que otorga resistencia al herbicida dalapon; o un gen mutado de antranilato sintasa que otorga resistencia al 5-metil triptofano. En donde se emplea un gen mutante de EPSP sintasa, se puede dar cuenta de beneficios adicionales a través de la incorporación de un péptido apropiado de tránsito de cloroplastos, CTP (Solicitud Europea de patente 0 218 571, 1987) . Una modalidad ilustrativa de un gen marcador de selección, capaz de ser usado en sistemas para seleccionar transformantes, son los genes que codifican la enzima fosfinotricin acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces viridochromogenes (Patente U.S. 5,550,318, que se incorpora aquí como referencia). La enzima fosfinotricin acetiltransferasa (PAT) inactiva el ingrediente activo en el herbicida bialafos, fosfinotricin (PPT) . El PPT inhibe la glutamina sintetasa, (Murakami y colaboradores, 1986; Twell y colaboradores, 1989) provocando la acumulación rápida de amoniaco y muerte celular. El éxito en el uso de este sistema selectivo en conjunto con las monocotiledóneas es particularmente sorprendente debido a las dificultades importantes que se han reportado en la transformación de los cereales. (Potrykus, 1989). Los marcadores separables por exclusión que se pueden emplear incluyen, perc no se limitar a, un gen de ß-glucuronidasa o ui A que codifica una enzima para la cual se conocen diversos substratos cromogenicos; un gen de ubicación R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (coior rojo) en tejidos de plantas (Deliaporta y colaboradores, 1988); un gen de ß--lactamasa (Sutcliffe, 1978), que codifica una enzima para la cual se conocen diversos substratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cro ogénica) ; un gen ylE (Zukowsky y colaboradores, 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que se puede convertir a catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikuta y colaboradores, ]s'90); un gen de tirosinasa (Katz y colaboradores, 1983) que codifica ina enzima capaz de oxidar ia tirosina a DOPA y a ía dopaquinona que a su vez se condensa para formar al compuesto fácilmente detectable de melamina; un gen de -galactosidasa, que codifica una enzima para la cual hay substratos cromogénicos; un gen de luciferasa { lux) (Ow y colaboradores, 1986) , que permite la detección de la bioluminiscencia; o un gen de ecuorina (Prasher y colaboradores, 1985) que se puede emplear en la detección por bioluminiscencia sensible al calcio o un gen de proteína fluorescente verde (Niedz y colaboradores, 1995) . Los genes del complejo de genes R del maíz, se contemplan para ser particularmente útiles como marcadores de separación por exclusión. El complejo del gen R en el maíz, codifica una proteína que actúa para regular la producción de pigmentos de antocianina en la mayoría de las semillas y tejidos de plantas. Las cepas de maíz pueden tener uno, o hasta cuatro, alelos R que se combinan para regular la pigmentación en una forma específica del tejido y de desarrollo. Un gen del complejo de genes R, se aplicó a la transformación de maíz, debido a que la expresión de este gen en las células transformadas no daña a la célula. Así, un gen R introducido dentro de tales células provocará la expresión de un pigmento rojo y, si se incorpora de forma estable, se puede registrar visualmente como un sector rojo. Si la línea de maíz lleva alelos dominantes para los genes que codifican a los intermediarios enzimáticos en la trayectoria biosintética de la antocianina (C2, Al, A2, Bzl y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en la ubicación R, la transformación de cualquier célula de esa línea con R resultará en la formación de pigmento rojo. Las líneas ejemplares incluyen Wisconsin 22, que contiene el alelo rg-estable y el TR112, un derivado K55 que es r- g, b, Pi . Alternativamente, se puede utilizar cualquier genotipo del maíz si se introducen juntos los alelos Cl y R. Se propone además, que las regiones regulatorias del gen R se puedan emplear en constructos quiméricos con objeto de suministrar mecanismos para controlar la expresión de los genes quiméricos. Se conoce una mayor diversidad de la expresión genotípica en la ubicación R que en cualquier otra ubicación (Coe y colaboradores, 1988). Se contempla que las regiones regulatorias obtenidas de las regiones 5' para el gen estructural R, serían valiosas en dirigir la expresión de los genes, por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia a la sequía, tolerancia a herbicidas u otras regiones codificadoras de proteínas. Para los propósitos de la presente invención, se cree que cualquiera de los miembros diversos de la familia de genes R, se puede emplear exitosamente (por ejemplo, P, S, Lc, etc.). Sin embargo, será el más preferido generalmente el Sn (particularmente Sn:bol3). El Sn es un miembro dominante del complejo de genes R y es funcionalmente similar a las ubicaciones R y B en cuanto a que el Sn controla la deposición específica de tejidos de pigmentos de antocianina en ciertas células de plantas y semillas, por lo tanto, su genotipo es similar a R. Un marcador adicional de separación por exclusión contemplado para el uso en la presente invención, es la luciferasa de la luciérnaga, codificada por el gen lux . La presencia del gen lux en células transformadas, se puede detectar usando por ejemplo películas de rayos X, conteo por escintilación, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de baja luz, cámaras de conteo de fotones o luminometría multipozo. También se vislumbra que este sistema se pueda desarrollar para la separación por exclusión de la población para bioluminiscencia, tal como sobre placas de cultivo de tejidos o aún para la separación por exclusión completa de plantas. 5. Secuencias de Vectores no Virales y de plásmidos Un vector de la invención, puede además comprender ADN de plásmido. Los vectores de plásmido incluyen secuencias adicionales de ADN que suministran una fácil selección, amplificación y transformación, de la cinta de expresión en células procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, los vectores derivados de pUC tales como pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pUC23, pUC119, y pUC120, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de PSP, o vectores derivados de pBS . Las secuencias adicionales de ADN, incluyen orígenes de replicación para suministrar la replicación autónoma del vector, genes adicionales de un marcador de selección, que codifican preferiblemente una resistencia a antibióticos o herbicidas, sitios únicos de clonación múltiple que suministran los sitios múltiples para insertar secuencias de ADN o genes codificados en la cinta de expresión, y secuencias que aumentan la transformación de células procarióticas y eucarióticas. Otro vector que es útil para la expresión en células de plantas y procarióticas, es el plásmido binario Ti (como se describe en Schilperoort y colaboradores, Patente U.S. No. 4,940,383) como se ejemplifica por el vector pGA582. Este vector de plásmido binario Ti, ha sido caracterizado previamente por An, citado supra , y está disponible del doctor An. Este vector binario Ti, se puede replicar en bacterias procarióticas tales como E. coli y Agrobacterium . Los vectores del plásmido de Agrobacteri um, se pueden usar para transferir la cinta de expresión a células de plantas dicotiledóneas, y bajo ciertas condiciones, a células monocotiledóneas tales como las células del arroz. Los vectores binarios Ti, incluyen preferiblemente las fronteras derecha e izquierda del ADN de la nopalina T, para suministrar una transformación eficiente de las células de plantas, un gen marcador de selección, sitios únicos de clonación múltiple en las regiones de frontera T, la replicación del colEl de origen y un replicón de amplio intervalo de huésped. Los vectores binarios Ti que llevan una cinta de expresión de la invención, se pueden usar para transformar células procarióticas y eucarióticas, pero se usan preferiblemente para transformar células de plantas dicotiledóneas . Virtualmente, cualquier ADN, se puede usar para la entrega a células receptoras, para finalmente producir plantas transgénicas fértiles de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, se pueden emplear los segmentos de ADN en forma de vectores y plásmidos, o los fragmentos lineales de ADN, en algunos casos conteniendo solamente el elemento ADN para expresarse en la planta y similares. Los vectores, plásmidos, cósmidos, YAC (cromosomas artificiales de levadura) y segmentos de ADN para su uso en la transformación de tales células, comprenderán generalmente por supuesto, el gen o genes de cADN que se desee introducir dentro de la célula. Estos constructos de ADN, pueden además incluir estructuras tales como promotores, enriquecedores, polienlazadores o aún genes regulatorios como sea deseado. El segmento o gen de ADN escogido para la introducción celular, codificará a menudo una proteína que se expresará en la célula recombinante resultante, y resultará en una característica de selección o de separación por exclusión y/o impartirá un genotipo mejorado a la planta regenerada. Sin embargo, esto puede no ser siempre el caso, y la presente invención también abarca plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. 6. Otros Segmentos Preseleccionados de Ácido Nucleico. Una modalidad preferida de la invención, suministra un método de vector para la codificación de una propiedad agronómica deseable a una planta, tal como genes simples para la mejora de características relacionadas con la producción del cultivo. Por ejemplo, tales segmentos o "genes" de ácido nucleico se describen por ejemplo, en Lundquist y colaboradores, (Patente U.S. No. 5,484956), Lundquist et al. (Patente U.S No. 5,508,468), Dobres (Solicitud Internacional PCT/US95/11231) y por K. Weising et al. ((1988), ver tablas 1, 2, y 3), todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Sin embargo, la presente invención no se limita en alcance a los segmentos preseleccionados de ácido nucleico que codifican una propiedad agronómica deseable, cuando muchos otros segmentos preseleccionados de ácido nucleico que codifican proteínas o transcriptos de ARN que otorgan las características deseables a las plantas, están dentro del alcance de la invención. La elección de los segmentos particulares de ácido nucleico para entregarse a las células receptoras, dependerá a menudo del propósito de la transformación. Uno de los propósitos principales de la transformación de plantas de cultivo, es agregar algunas características importantes comercialmente y agronómicamente deseables a la planta. Se puede desear incorporar uno o más genes que otorguen cualquier característica o características deseables tal como por ejemplo, un gen o genes que codifican la resistencia a herbicidas. Las propiedades agronómicas preferidas codificadas por el segmento preseleccionado de ADN, incluyen pero no se limitan a, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia a herbicidas (Christou, 1997), resistencia o tolerancia a enfermedades (por ejemplo, resistencia a patógenos en el tabaco o en la papa; resistencia a virus, patógenos de hongos o de bacterias que usan por ejemplo, los genes de la endotoxina Bt (Schell, 1997; Vaeck y colaboradores, 1987; y Lundquist y colaboradores, Patente U.S. No. 5,484,956), toxina Pht secretada del Photorhabdus luminescens, o proteínas derivadas del virus para resistencia viral (Reimann-Phillip y colaboradores, 1993), tensiones del medio ambiente incluyendo pero no limitándose a, sequía, humedad en exceso, heladas, congelación, alta temperatura, sal y tensión oxidante, rendimientos crecientes, contenido y repuesto alimenticio, apariencia física, esterilidad masculina, aridez en la base, capacidad de cosecha en pie, fecundidad, propiedades de almidón, cantidad y calidad de aceite y similares. Por ejemplo, los estudios genéticos han demostrado que para que una planta resista la infección por un patógeno particular de la planta, la planta debe tener un gen de resistencia (R) que interactúa directa o indirectamente con un gen sin virulencia simple { avr) que está presente en el genoma del patógeno. Así, la introducción de un segmento preseleccionado de ADN que comprende un gen R dentro de una planta que carece del gen R, le puede otorgar resistencia a la planta, a un patógeno que expresa el gen correspondiente avr. La resistencia incrementada a infecciones por hongos, se puede obtener al introducir un segmento preseleccionado de ADN que codifica una proteína relacionada con la patogénesis dentro de una planta. Las proteínas PR, son proteínas que se sintetizan por los cereales en respuesta a la infección por algunos hongos patogénicos (Scott, 1994) . Otros genes antifungicidas incluyen pero no se limitan a, la quitinasa (por ejemplo exo-quitinasa y quitinasa G) ; glucanasa; inhibidor de la síntesis de proteínas (PSI) o proteína antifungicida (AFP) . La resistencia presente a infecciones virales, se puede obtener al introducir un segmento preseleccionado de ADN que codifica una proteína de recubrimiento viral dentro de una planta. Por ejemplo, Nelson y colaboradores, (1988) describe la expresión de la proteína de recubrimiento (TMV) del virus mosaico del tabaco en una planta de tomate, otorga tolerancia de la planta al TMV y al virus mosaico del tomate (ToMV) , un virus relacionado al TMV. Clark y colaboradores, (Solicitud Internacional PCT/EP92/03001) describen la expresión de la proteína de recubrimiento del virus mosaico enano del maíz en mazorcas, que resulta en plantas que muestran síntomas de enfermedad reducidos cuando se exponen al virus. Adicionalmente, se vislumbra que más de un segmento preseleccionado de ácido nucleico se puede introducir en una planta. Por ejemplo, un vector que contiene un gen marcador de selección y un gen que otorga resistencia a un virus particular, por ejemplo el virus enano amarillo de la cebada, virus de enrollado de hoja de la papa, o virus mosaico del tabaco, se pueden introducir dentro de las células de la planta. En ciertas modalidades, la presente invención contempla la transformación de una célula receptora con más de un transgen ventajoso. Se pueden suministrar dos o más transgenes en un evento simple de transformación, usando vectores diferentes que codifican a los transgenes o usando un vector simple que incorpora dos o más secuencia codificadoras de genes. Por ejemplo, los plásmidos que soportan las unidades de expresión jar aroA en una orientación convergente, divergente o colineal, se consideran particularmente útiles. Las combinaciones adicionales preferidas son aquellas del gen de resistencia a insectos tal como un gen Bt, junto con un gen inhibidor de la proteasa tal como el pinll, o el uso de un bar en combinación con cualquiera de los genes anteriores. Por supuesto, cualquiera de dos o más transgenes de cualquier descripción se pueden emplear como se desee, tal como aquellos que otorgan resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades (viral, bacteriana, de hongo, de nemátodos) o a la sequía, esterilidad masculina, aridez en la base, capacidad de cosecha en pie, fecundidad, propiedades de almidón, cantidad y calidad de aceite, a aquellas que incrementan el rendimiento o la calidad nutricional. a. Resistencia a herbicidas. Los genes que codifican la fosfinotricin acetiltransferasa {bar y pa t) , los genes de EPSP sintasa tolerantes al glifosato, el gen de enzima degradante de glifosato gox que codifica oxireductasa, deh (codificando una enzima de halogenasa que inactiva el dalapon) resistencia a herbicidas (por ejemplo, sulfonilurea e imidazolinona) acetolactato sintasa, y los genes bxn (que codifican una enzima de nitrilasa que degrada el bromoxinil) son buenos ejemplos de genes resistentes a los herbicidas para su uso en la transformación. Los genes bar y pa t codifican una enzima, la fosfinotricin acetiltransferasa (PAT), que inactiva al herbicida fosfinotricin y evita que este compuesto inhiba las enzimas de glutamina sintetasa. La enzima 5- enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) , se inhibe normalmente por el herbicida N- (fosfonometil) glicin (glifosato) . Sin embargo, se conoce que los genes codifican las enzimas de EPSP sintasa resistentes al glifosato. Estos genes se contemplan particularmente para su uso en la transformación de monocotiledóneas. El gen deh codifica la enzima dalapon dehalogenasa y otorga resistencia al herbicida dalapon.

El gen bxn codifica una enzima específica de nitrilasa que convierte el bromoxinil a un producto de degradación no herbicida. b. Resistencia a Insectos. Un aspecto importante de la presente invención, se refiere a la introducción de genes que otorgan resistencia a los insectos dentro de plantas monocotiledóneas tales como el maíz. Los genes potenciales de resistencia a insectos que se pueden introducir, incluyen los genes de la toxina cristal del Ba cillus thuringiensis o genes Bt (Watrud y colaboradores, 1985) . Los genes Bt pueden suministrar resistencia a plagas de lepidópteros o coleópteros tales como el barrenador europeo de la mazorca. Los genes preferidos Bt para su uso en tales modalidades incluyen los genes CrylA (b) y CrylA (c) . También se pueden emplear a este respecto, los genes de endotoxina de otras especies de B. thuringiensis, que afectan el crecimiento o desarrollo de los insectos. La expresión pobre de los genes procarióticos de la Bt toxina en plantas, es un fenómeno bien documentado, y el uso de promotores diferentes, proteínas de fusión y secuencias líder no ha conducido a incrementos significativos en la expresión de la proteína Bt (Barton y colaboradores, 1987). Por lo tanto, se contempla que los genes Bt más ventajosos para su uso en los protocolos de transformación aquí descritos, serán aquellos en los cuales la secuencia de codificación haya sido modificada para llevar a cabo la expresión creciente en plantas, y más particularmente, aquellos en los cuales se hallan usado codones preferidos de maíz. Un ejemplo de tales genes modificados de Bt toxina incluyen el gen variante Bt CrylA {b) denominado labß (Perlak y colaboradores, 1991) y los genes sintéticos de CrylA (c) denominados 1800a y 1800b. Los inhibidores de proteasa también pueden suministrar resistencia a insectos (Johnson y colaboradores, 1989) , y tendrán así utilidad en la transformación del maíz. El uso del gen II inhibidor de proteasa, pinll para el tomate y la papa se vislumbra como particularmente útil. Aún más ventajoso es el uso del gen pinll en combinación con un gen de la Bt toxina, el efecto combinado de la cual se ha descubierto por los inventores actuales para producir una actividad insecticida sinérgica. Otros genes que codifican inhibidores del sistema digestivo de los insectos, son aquellos que codifican enzimas o cofactores que facilitan la producción de inhibidores, que también pueden ser útiles. Este grupo se puede ejemplificar por inhibidores de orizacistatina y amilasa tales como aquellos del trigo y la cebada. También, los genes que codifican lectinas pueden otorgar propiedades insecticidas adicionales o alternativas. Las lectinas (originalmente denominadas fitohemaglutininas) son proteínas multivalentes de enlace a carbohidratos que tienen la capacidad de aglutinar células de glóbulos rojos de una diversidad de especies. Las lectinas se han identificado recientemente como agentes insecticidas con actividad contra gorgojos, ECB y lombrices de raíz (Murdock y colaboradores, 1990; Czapla & Lang, 1990) . Los genes de lectina contemplados para ser útiles incluyen por ejemplo la aglutinina del germen de cebada y trigo (WGA) y lectinas del arroz (Gatehouse y colaboradores, 1984), siendo preferida la WGA. Los genes que controlan la producción de polipéptidos grandes o pequeños, activos contra insectos cuando se introducen en las plagas de insectos, tales como por ejemplo, péptidos líticos, hormonas de péptidos, y toxinas y venenos, forman otro aspecto de la invención. Por ejemplo, se contempla que la expresión de la estearasa juvenil de hormona, dirigida hacia plagas puede resultar en una actividad insecticida o tal vez provocar el cese de la metamorfosis (Hammock y colaboradores, 1990) .

Los genes que expresan maíz transgénico que codifican enzimas que afectan la integridad de la cutícula de insectos, forman también otro aspecto de la invención. Tales genes incluyen aquellos que codifican por ejemplo, quitinasa, proteasas, lipasas y también genes para la producción de nicomicina, un compuesto que inhibe la síntesis de la quitina, la introducción de cualquiera de los cuales se contempla para producir plantas de maíz resistentes a los insectos. Los genes que codifican actividades que afectan la muda de los insectos, tal como aquellos que afectan la producción de la glucosil transferasa UDP ecdisteroide, también caen dentro del alcance de los transgenes útiles de la presente invención. Los genes que codifican las enzimas que facilitan la producción de compuestos que reducen la calidad nutricional de la planta huésped a las plagas de insectos, también se contemplan por la presente invención. Puede ser posible por ejemplo, otorgar una actividad insecticida en una planta al alterar su composición de esterol. Los esteróles se obtienen de los insectos a partir de su dieta y se usan para la síntesis de hormonas y la estabilidad de membrana. Por lo tanto, las alteraciones en la composición de los esteróles en la planta por la expresión de genes novedosos, por ejemplo, aquellos que promueven directamente la producción de esteróles indeseables, o aquellos que convierten esteróles deseables en formas indeseables, pueden tener un efecto negativo en el crecimiento de los insectos y/o desarrollo y dotar a la planta con actividad insecticida. Las lipoxigenasas son enzimas de plantas que se presentan naturalmente, que han demostrado exhibir efectos anti-nutricionales en los insectos y reducir la calidad nutricional de su dieta. Por lo tanto, modalidades adicionales de la invención se refieren a plantas transgénicas con actividad enriquecida de la lipoxigenasa que pueden ser resistentes a la alimentación de los insectos . La presente invención también proporciona métodos y composiciones con los cuales alcanzar cambios cualitativos o cuantitativos en metabolitos secundarios de plantas. Un ejemplo se refiere a la transformación del maíz para producir DIMBOA el cual se contempla, otorgara resistencia al barrenador Europeo de la mazorca, lombriz de raíz y otras plagas de insectos del maíz. Los genes candidatos que se consideran particularmente para su uso en este respecto, incluyen aquellos genes en la ubicación bx conocida por involucrarse en la trayectoria sintética del DIMBOA. La introducción de genes que pueden regular la producción de maizina, y los genes involucrados en la producción de durrina en el sorgo, también se contemplan para su uso en facilitar la resistencia al gusano de la mazorca y lombrices de raíz respectivamente. El Tripsacum dactyloides es una especie de pasto que es resistente a ciertos insectos incluyendo la lombriz de raíz. Se anticipa que los genes que codifican proteínas que son tóxicas para los insectos, o están involucrados en la biosíntesis de compuestos tóxicos para los insectos, se aislarán del Tripsacum y que estos genes novedosos serán útiles en otorgar resistencia a los insectos. Se conoce que la base de resistencia a los insectos en el Tripsacum es genética, ya que dicha resistencia ha sido transferida a la Zea mays por cruces sexuales (Branson and Guss, 1972). Genes adicionales que codifican proteínas caracterizados por tener una actividad potencial insecticida, se pueden usar también como transgenes de conformidad con la presente. Tales genes incluyen por ejemplo, el inhibidor de la tripsina del chícharo de vaca (CpTi; Hilder y colaboradores, 1987) que se puede usar como un freno a la lombriz de raíz; genes que codifican la avermectina {Avermectin and Abamectin . , Campbell, W.C., Ed. , 1989; Ikeda y colaboradores, 1987) que pueden ser particularmente útiles como un freno a la lombriz de raíz en la mazorca; genes de proteína que inactivan los ribosomas y aún genes que regulan las estructuras de las plantas. El maíz transgénico incluye genes de anticuerpos anti-insectos y también se contemplan los genes que codifican enzimas que pueden convertir a un insecticida no tóxico (pro-insecticida) aplicado al exterior de la planta, en un insecticida dentro de la planta. c. Resistencia a la tensión o al medio ambiente. La mejora de la capacidad del maíz para tolerar diversas tensiones del medio ambiente tales como, pero no limitadas a, sequía, humedad en exceso, heladas, congelación, alta temperatura, sal y tensión oxidante, se pueden también llevar a cabo a través de la expresión de genes novedosos. Se propone que se logren los beneficios en términos de resistencia creciente a temperaturas de congelación a través de la introducción de una proteína "anticongelante" tal como la Winter Flounder (Cutler y colaboradores, 1989) o un gen sintético derivado de la misma. La tolerancia mejorada a las heladas se puede también otorgar a través de la expresión creciente de la glicerol-3-fosfato acetiltransferasa en cloroplastos (Wolter y colaboradores, 1992) . La resistencia a la tensión oxidante (a menudo aumentada por condiciones tales como temperaturas de helada en continuación con altas intensidades de la luz) se pueden otorgar por la expresión de una superóxido dismutasa (Gupta y ,*v íu- * ** ** í, ¿taba» +— «-.»«.** -hS*aa*-A. m jgiIglu fatmA?tiiHtaBA colaboradores, 1993), y se puede mejorar por la glutation reductasa (Bowler y colaboradores, 1992). Tales estrategias pueden permitir la tolerancia a la congelación en campos recientemente emergentes así como extender variedades de alto rendimiento de madurez tardía a zonas de madurez temprana relativas. Se contempla que la expresión de genes novedosos que afectan favorablemente el contenido de agua de la planta, el potencial total de agua, potencial osmótico y turgencia, aumentará la capacidad de la planta para tolerar la sequía. Como se usa aquí, los términos "resistencia a la sequía" y "tolerancia a la sequía" se usan para referirse a la resistencia o tolerancia creciente de la planta a la tensión inducida por una reducción en la disponibilidad de agua, en comparación con circunstancias normales, y a la capacidad de la planta para funcionar y sobrevivir en medios bajos en agua. En este aspecto de la invención se propone por ejemplo, que la expresión de genes que codifican la biosíntesis de solutos osmóticamente activos, pueda impartir una protección contra la sequía. Dentro de esta clase, están los genes que codifican la manitol deshidrogenasa (Lee and Saier, 1982) y la trehalosa-6- fosfato sintasa (Kaasen y colaboradores, 1992) . A través de la acción posterior de las fosfatasas naturales en las células, o por la introducción y coexpresión de una fosfatasa específica, estos genes introducidos resultarán en la acumulación de manitol o trehalosa respectivamente, ambos de los cuales han sido bien documentados como compuestos protectores capaces de mitigar los efectos de la tensión. Se ha verificado la acumulación de manitol en el tabaco transgénico, y los resultados preliminares indican que las plantas que expresan altos niveles de este metabolito, son capaces de tolerar una función osmótica aplicada (Tarczynski y colaboradores, 1992, 1993) . Similarmente, se ha documentado la eficiencia de otros metabolitos para proteger su función de enzima (por ejemplo, la alanopina o el ácido propionico o la integridad de la membrana (por ejemplo, la alanopina) (Loomis y colaboradores, 1989) , y por lo tanto la expresión de los genes que codifican la biosíntesis de estos compuestos, puede otorgar resistencia a la sequía de una forma similar o complementaria al manitol. Otros ejemplos de metabolitos que se presentan naturalmente, que son osmóticamente activos y/o suministran algún efecto protector directo durante la sequía y/o desecación, incluyen la fructuosa, eritritol (Coxson y colaboradores, 1992) , sorbitol, dulcitol, (Karsten y colaboradores, 1992), glucosilglicerol (Redd y colaboradores, 1984; Erdmann y colaboradores, 1992), sacarosa, estaquiosa (Koster and Leopol, 1988; Blackman y colaboradores, 1992), rafinosa (Bernal-Lugo and Leopold, 1992) , prolina (Rensburg y colaboradores, 1993) y glicinbetaina (Wyn-Jones and Storey, 1982), ononitol y pinitol (Vernon and Bohnert, 1992). El crecimiento continuo de las copas de las plantas y el ajuste reproductor creciente durante los tiempos de tensión, se aumentará por la introducción y expresión de genes tales como aquellos que controlan los compuestos osmóticamente activos arriba discutidos, y otros de tales compuestos, como se representa en una modalidad ejemplar por la enzima de mioinositol o O-metiltransferasa. Se contempla que la expresión de proteínas específicas, puede también incrementar la tolerancia a la sequía. Se han asignado tres clases de proteínas embriogénicas tardías con base en similaridades estructurales (ver Dure y colaboradores, 1989) . Las tres clases de LEA, se han demostrado en semillas maduras (esto es, desecantes). Dentro de estos tres tipos de proteínas LEA, el tipo II (tipo dehidrina) ha sido implicado generalmente en la tolerancia a la sequía y/o desecación en partes vegetativas de las plantas (esto es, Mundy and Chua, 1988; Piatkowski y colaboradores, 1990; Yamaguchi-Shinozaki y colaboradores, 1992) .

Recientemente, la expresión de la LEA de tipo III (HVA-1) en el tabaco se encontró que tenia influencia en la altura de planta, madurez y tolerancia a la sequía (Fitzpatrick, 1993) . La expresión de genes estructurales de los tres grupos LEA puede por lo tanto otorgar tolerancia a la sequía. Otros tipos de proteínas inducidas durante la tensión en agua incluyen las proteasas de tiol, aldolasas y transportadores de transmembrana (Guerrero y colaboradores, 1990) , que pueden otorgar diversas funciones del tipo reparación y/o protectoras durante la tensión por sequía. También se contempla que los genes que afectan la biosíntesis de lípidos y así la composición de la membrana, pueden ser también útiles en otorgar resistencia a la sequía en la planta. Muchos de estos genes también mejoran la tolerancia a la congelación (o resistencia) , la tensiones físicas que se presentan durante la congelación y sequía son similares en naturaleza y se pueden mitigar de forma similar. El beneficio se puede otorgar por medio de la expresión constitutiva de estos genes, pero los medios preferidos de expresión de estos genes novedosos, puede ser a través del uso de un promotor inducido por la turgencia (tal como los promotores para los genes inducidos por la turgencia descritos en Guerrero y colaboradores, (1990) y Shagan y colaboradores, (1993), que se incorporan aquí como referencia) . Los patrones de expresión espacial y temporal de estos genes, pueden permitir que el maíz soporte mejor la tensión. Se propone que sería de beneficio, la expresión de los genes que están involucrados con las características morfológicas específicas que permiten extracciones crecientes de agua del suelo seco. Por ejemplo, la introducción y expresión de genes que alteran las características de la raíz pueden enriquecer la retoma de agua. También se contempla que la expresión de genes que incrementan el ajuste reproductor durante los tiempos de tensión, sería de valor significativo. Por ejemplo, sería de beneficio la expresión de genes que mejoran la sincronía del despojo del polen y la receptividad de las partes femeninas de la flor, esto es, los estigmas. Además, se propone que la expresión de los genes que minimizan el aborto del núcleo durante los tiempos de tensión, incrementaría la cantidad de grano a cosecharse y sería entonces de valor. Dado el papel global del agua en la determinación del rendimiento, se contempla que al permitir al maíz utilizar el agua más eficientemente a través de la introducción y expresión de genes novedosos, se mejorará el desempeño global aun cuando la disponibilidad de agua en el suelo no sea limitante. Se puede llevar a cabo al introducir genes que mejoren la capacidad del maíz para maximizar el uso de agua, a través de un amplio intervalo de tensiones relacionadas con la disponibilidad de agua, estabilidad del rendimiento o consistencia del desempeño del rendimiento. d. Resistencia a Enfermedades Se propone que la resistencia creciente a enfermedades, se pueda llevar cabo a través de la introducción de genes en plantas monocotiledóneas tales como el maíz. Es posible producir resistencia a enfermedades provocadas por virus, bacterias, hongos y nemátodos. Se contempla que el control de los organismos que producen micotoxina se pueda llevar a cabo a través de la expresión de los genes introducidos. La resistencia a virus se puede producir a través de la expresión de genes novedosos. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de una proteína de recubrimiento viral en una planta transgénica, puede impartir resistencia a la infección de la planta por ese virus y tal vez por otros virus cercanamente relacionados (Cuozzo y colaboradores, 1988, Hemenway y colaboradores, 1988, Abel y colaboradores, 1986) . Se contempla que la expresión de los genes antisentido dirigidos a las funciones virales esenciales, pueda impartir resistencia al virus. Por ejemplo, un gen antisentido dirigido al gen responsable de la replicación del ácido nucleico viral, puede inhibir la replicación y conducir a la resistencia al virus. Se cree que la interferencia con otras funciones virales a través del uso de genes antisentido, puede también incrementar la resistencia a los virus. Además, se propone que sea posible alcanzar resistencia a virus a través de otros enfoques, incluyendo pero no limitándose al uso de virus satélite. Se propone que la resistencia creciente a enfermedades, provocada por bacterias y hongos, se pueda llevar a cabo a través de la introducción de genes novedosos. Se contempla que serán útiles los genes que codifican los llamados "antibióticos de péptidos", proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), resistencia a las toxinas, y proteínas que afectan las interacciones huésped-patógeno, tales como las características morfológicas. El antibiótico de péptido, son secuencias de polipéptidos que inhiben el crecimiento de bacterias y otros microorganismos. Por ejemplo, las clases de péptidos referidos como cecropinas y magaininas, inhiben el crecimiento de muchas especies de bacterias y hongos. Se propone que la expresión de las proteínas PR en plantas monocotiledóneas tales como el maíz, sea útil para otorgar resistencia a las enfermedades bacterianas. Estos genes se inducen siguiendo un ataque de patógenos en una planta huésped y se han dividido en al menos 5 clases de proteínas (Bol, Linthorst, y Cornelissen, 1990) . Incluidas entre las proteínas PR están las ß-1, 3-glucanasas, quitinasas y la osmotina y otras proteínas que se cree funcionan en la resistencia a plantas para organismos y enfermedades. Se han identificado otros genes que tienen propiedades antifungicidas, por ejemplo la UDA (lectina de la ortiga urticante) y heveina (Broakaert y colaboradores, 1989; Barkai-Golan y colaboradores, 1978). Se conoce que ciertas enfermedades de las plantas son provocadas por la producción de fitotoxinas. Se propone que la resistencia a estas enfermedades se alcanzaría a través de la expresión de un gen novedoso que codifica una enzima capaz de degradar o inactivar de otra manera a la fitotoxina. También se contempla que la expresión de genes novedosos que alteran las interacciones entre la planta huésped y el patógeno, puede ser útil para reducir la capacidad del organismo de la enfermedad de invadir los tejidos de la planta huésped, por ejemplo, un incremento en la parafinidad de la cutícula de la hoja u otras características morfológicas. Los nemátodos parásitos de las plantas, son una causa de enfermedades de estas plantas incluyendo el maíz. Se propone que sería posible hacer a la planta del maíz resistente a estos organismos a través de la expresión de genes novedosos. Se anticipa que el control de infestaciones de nemátodos, se alcanzaría por la alteración de la capacidad del nemátodo para reconocer o pegarse a una planta huésped y/o permitir a la planta producir los compuestos nematicidas incluyendo pero no limitándose a las proteínas. e. Reducción/Eliminación de la Micotoxina La producción de micotoxinas, incluyendo aflatoxina y fumonisina, por los hongos asociados con las plantas monocotiledóneas tales como el maíz, es un factor significativo en la producción de granos no útiles. Estos organismos fungosos, no provocan síntomas de enfermedad y/o interfieren con el crecimiento de la planta, pero producen productos químicos (micotoxina) que son tóxicos a los animales. Se contempla que la inhibición del crecimiento de estos hongos, reduciría la síntesis de estas substancias tóxicas y reduce por lo tanto las pérdidas de granos debido a contaminación por micotoxinas. También se propone que sea posible introducir genes novedosos dentro de plantas monocotiledóneas tales como el maíz, que inhibirían la síntesis de la micotoxina sin interferir con el crecimiento de los hongos. Además, se contempla que la expresión de un gen novedoso que codifica una enzima capaz de producir la micotoxina no tóxica, sería útil con objeto de lograr una contaminación reducida del grano por micotoxina. El resultado de cualquiera de los mecanismos anteriores, sería una presencia reducida de las micotoxinas en el grano. f. Composición o Calidad del Grano Los genes se pueden introducir en plantas monocotiledóneas, particularmente en cereales comercialmente importantes como el maíz, para mejorar el grano para lo cual crece principalmente en cereal. Un amplio intervalo de plantas transgénicas novedosas producidas de esta manera, se puede vislumbrar dependiendo del uso final particular del grano. El uso principal del grano de maíz es para alimento o pienso (alimentación animal) . La introducción de genes que alteran la composición de grano, puede aumentarse de manera importante en el valor del alimento o del pienso. La composición primaría del grano de maíz es almidón, proteína y aceite. Cada uno de estos componentes primarios del grano de maíz, se pueden mejorar al alterar su nivel o composición. Se pueden mencionar diversos ejemplos para propósitos ilustrativos pero no suministran de ninguna manera una lista exhaustiva de todas las posibilidades.

La proteína de los granos de cereal incluyendo el maíz, es subóptima para propósitos de alimento y pienso, especialmente cuando se alimentan cerdos, aves y humanos. La proteína es deficiente en diversos aminoácidos que son esenciales en la dieta de estas especies, requiriendo la adición de complementos al grano. Los aminoácidos esenciales limitantes pueden incluir lisina, metionina, triptofano, treonina, valina, arginma, e histidina. Algunos aminoácidos se vuelven limitantes solamente después de que el maíz se complementa con otros insumos para formulaciones de alimento. Por ejemplo, cuando el maíz se complementa con harina de soya para satisfacer los requerimientos de lisina, la metionina se vuelve limitante. Los niveles de estos aminoácidos esenciales en semillas y granos, se puede elevar por los mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de genes que incrementan la biosíntesis de los aminoácidos, disminución de la degradación de los aminoácidos, incremento del almacenamiento de los aminoácidos en las proteínas, o incremento del transporte de los aminoácidos a las semillas o al grano. Un mecanismo para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos, es la introducción de genes que desregulan las trayectorias biosintéticas de aminoácidos de forma tal, que la planta ya no puede controlar adecuadamente los niveles que se producen. Esto se puede hacer al desregular o suprimir pasos en la trayectoria biosintética de aminoácidos que se regula normalmente por los niveles del producto final de aminoácido de la trayectoria. Ejemplos incluyen la introducción de genes que codifican versiones desreguladas de las enzimas aspartocinasa o ácido dihidrodipicolínico (DHDP) -sintasa, para incrementar la producción de lisina y treonina, y la antranilato sintasa para incrementar la producción de triptofano. La reducción del catabolismo de los aminoácidos, se puede llevar a cabo por la introducción de secuencias de ADN que reducen o eliminan la expresión de los genes que codifican las enzimas que catalizan las etapas en las trayectorias catabólicas tales como la enzima lisina-cetoglutarato reductasa. La composición de proteína del grano, se puede alterar para mejorar el balance de los aminoácidos en una diversidad de formas incluyendo la expresión elevada de proteínas naturales, y diluyendo la expresión elevada de proteínas naturales, disminuyendo la expresión de aquellas con una composición pobre, cambiando la composición de las proteínas naturales, o introduciendo genes que codifican proteínas completamente nuevas que poseen una composición superior. Por ejemplo, los ejemplos pueden incluir la introducción de ADN que ^¡^^á??i*M^M,Á,i??Á.ím*.?A*..Ai¡^&..*AA...i.A?.^.r.A'AM.. ¡ *. ffiftA. í - ¡if üüfjf rtiilÉTfr-É flfrifeTi r tlri líiMll ÍIÉGÍ disminuye la expresión de los miembros de la familia de la zeína de las proteínas de almacenamiento. Este ADN puede codificar ribozimas o secuencias antisentido dirigidas para dañar la expresión de las proteínas de zeína o la expresión de reguladores de la expresión de la zeína tal como el producto del gen 2 opaco. También se propone que la composición de la proteína del grano, se pueda modificar a través del fenómeno de cosupresión, esto es, la inhibición de la expresión de un gen endógeno a través de la expresión de un gen o fragmento de gen estructural idéntico introducido a través de la transformación (Goring y colaboradores, 1991) . Adicionalmente, el ADN introducido puede codificar enzimas que degradan la zeína. Las disminuciones en la expresión de la zeína que se alcanza, pueden acompañarse por incrementos en la proteína con una composición más deseable de aminoácidos o incrementos en otros constituyentes de la semilla tales como el almidón. Alternativamente, se puede introducir un gen quimérico que comprende una secuencia de codificación para una proteína nativa de una composición adecuada de aminoácido tal como para una de las proteínas de globulina o zeína de 10 kD del maíz y un promotor u otra secuencia regulatoria diseñada para elevar la expresión de la proteína. La secuencia de codificación del gen puede l lifrf ÜfíJflUfij*fafa*<tÉltf f-^"-t ttüüa^- a.-.to> ^?*AA.?m^*ril íí?tía d^ tíá¡ incluir los codones adicionales o de substitución para los aminoácidos esenciales. Además, se puede emplear una secuencia de codificación obtenida de otras especies, o una secuencia parcial o completamente sintética, que codifique una secuencia de péptidos completamente única diseñada para aumentar la composición de aminoácidos de la semilla. La introducción de genes que alteran el contenido de aceite del grano, puede ser de valor. Los incrementos en el contenido de aceite pueden resultar en incrementos en el contenido de la energía metabolizable y la densidad de las semillas para usos en alimentos y alimentación. Los genes introducidos pueden codificar enzimas que eliminan o reducen las limitaciones de velocidad o las etapas reguladas en la biosíntesis de lípidos o de ácidos grasos. Tales genes pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos que codifican la acetil-CoA carboxilasa, ACP- aciltransferasa, ß-cetoacil-ACP sintasa, más otras actividades biosintéticas bien conocidas de los ácidos grasos. Otras posibilidades son los genes que codifican proteínas que no poseen actividades enzimáticas tal como la proteína portadora del acilo. Los genes se pueden introducir para alterar el balance de los ácidos grasos presentes en el aceite, suministrando una materia prima alimenticia más saludable o nutritiva. El ADN introducido puede también codificar secuencias, que bloquean la expresión de enzimas involucradas en la biosíntesis de ácidos grasos, alterando las proporciones de ácidos grasos presentes en el grano tal como se describe abajo. Los genes se pueden introducir para aumentar el valor nutritivo del componente de almidón del grano, por ejemplo al incrementar el grado de modificación, resultando en una utilización mejorada del almidón en las vacas al retrasar su metabolismo. Además de afectar a los principales constituyentes del grano, los genes se pueden introducir para que afecten una variedad de otros aspectos de procesamiento, nutritivos o de calidad del grano para usarse como alimento o pienso. Por ejemplo, se puede incrementar o disminuir la pigmentación del grano. El incremento y estabilidad de la pigmentación amarilla, es deseable en algunos alimentos animales y se puede lograr por la introducción de genes que resultan en una producción enriquecida de xantofilios y caroteno, al eliminar las etapas que limitan la velocidad en su producción. Tales genes pueden codificar formas alteradas de las enzimas, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa o glicoteno sintasa. Alternativamente, el maíz blanco no pigmentado es deseable para la producción de muchos productos alimenticios, y se puede producir mediante la introducción del ADN que bloquea o elimina etapas en las trayectorias de producción del pigmento. Los alimentos o piensos que comprende principalmente maíz u otros granos cereales, poseen cantidades insuficientes de vitaminas y se deben complementar para suministrar un valor nutritivo adecuado. Se puede vislumbrar la introducción de genes que aumentan la biosíntesis de vitaminas en semillas, incluyendo por ejemplo, vitaminas A, E, B?2, colina y similares. El grano de maíz también posee suficiente contenido mineral para un valor nutritivo óptimo. Serían valiosos los genes que afecten la acumulación o disponibilidad de compuestos que contienen fósforo, azufre, calcio, manganeso, zinc y hierro entre otros. Un ejemplo puede ser la introducción de un gen que reduce la producción de ácido fítico o codifica la enzima fitasa que incrementa el rompimiento del ácido fítico. Estos genes incrementarían los niveles de fosfato disponible en la dieta, reduciendo la necesidad de complementos con el fosfato mineral. Se pueden describir otros ejemplos numerosos de mejora del maíz u otros cereales para propósito de alimentos y piensos. La mejora puede no ser aún necesaria involucrando al grano, pero puede por ejemplo mejorar el valor de un maíz para almacenamiento en silos. La introducción de ADN para llevar a cabo esto, puede incluir secuencias que alteran la producción de lignina tales como aquellas que resultan en el genotipo del "nervio central café" asociado con un valor superior de alimento para ganado. Además de la mejora directa en el valor del alimento o pienso, los genes se puede también introducir para mejorar el procesamiento del maíz y mejorar el valor de los productos que resultan del procesamiento. El método principal de procesamiento del maíz es por medio de molienda en húmedo. El maíz se puede mejorar a través de la expresión de genes novedosos que incrementen la eficiencia y reduzcan el costo de procesamiento, tal como la disminución del tiempo de impregnación. La mejora del valor de los productos de molienda en húmedo, puede incluir la alteración de la cantidad o calidad del almidón, aceite, harina de gluten de maíz, o los componentes del pienso de gluten de maíz. La elevación del almidón, se puede alcanzar a través de la identificación y eliminación de las etapas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de almidones, o por la disminución de los niveles de otros componentes en el grano que resultan en incrementos proporcionales en el almidón. Un ejemplo de lo anterior, puede ser la introducción de genes que codifican las enzimas ADP-glucosa pirofosforilasa con actividad regulatoria tak. t?iá*c^- JA?»iáA.?i.AA..! . ^aitA,.^. ^^. ¿A.--.M. — ^^.**.iA**?au?? **.--t?iÍB! -t.^ajfcAa&aa , alterada, o que se expresan a un nivel superior. Ejemplos de los últimos, pueden incluir inhibidores de selección de por ejemplo, biosíntesis de proteínas o aceites expresados durante las etapas finales del desarrollo del núcleo. Las propiedades del almidón se pueden alterar benéficamente, al cambiar la relación de amilosa a amilopectina, el tamaño de las moléculas del almidón, o su patrón de ramificación. A través de estos cambios, se pueden modificar un amplio rango de propiedades que incluyen pero no se limitan a, cambios en la temperatura de gelatinización, calor de gelatinización, claridad de las películas y pastas, propiedades reológicas y similares. Para llevar a cabo estos cambios en las propiedades, los genes que codifican una actividad de enlace de granulos o de sintasa de almidón soluble, o actividad de enzimas ramificadas, se pueden introducir solos o en combinación. El ADN tal como los constructos antisentido, se puede también usar los niveles de la actividad endógena de estas enzimas. Los genes introducidos o constructos, pueden tener secuencias regulatorias que controlan el tiempo de su expresión a intervalos específicos en la biosíntesis de almidones y el desarrollo de granulos de almidón. Además, puede valer la pena introducir y expresar genes, que resulten en la derivación in vivo u otra modificación, de las porciones de glucosa de la molécula de almidón. La colocación covalente de cualquier molécula se puede vislumbrar, limitada solamente por la existencia de enzimas que catalicen las derivaciones, y la accesibilidad de substratos apropiados en el granulo del almidón. Ejemplos de tales derivaciones importantes pueden incluir la adición de grupos funcionales tales como amina, carboxilo, o grupos fosfato que suministran sitios para derivaciones posteriores in vi tro, o que afecten las propiedades del almidón a través de la introducción de carga iónica. Ejemplos de otras modificaciones, pueden incluir cambios directos de las unidades de glucosa tales como la pérdida de grupos hidroxilo o su oxidación a grupos aldehido o carboxilo. El aceite es otro producto de la molienda húmeda del maíz, el valor del cual se puede mejorar por la introducción y expresión de genes. La cantidad de aceite que se puede extraer por molienda húmeda, se puede elevar mediante los enfoques descritos para los forrajes y alimentos anteriores. Las propiedades del aceite se pueden también alterar para mejorar su desempeño en la producción y uso de aceite para cocina, materias grasas, lubricantes u otros productos derivados del aceite, o la mejora de sus atributos de salud cuando se usan en aplicaciones relacionadas con alimentos. Se pueden también sintetizar ácidos grasos novedosos, los cuales con la extracción pueden servir como materiales de partida para síntesis química. Los cambios en las propiedades del aceite, se pueden lograr al alterar el arreglo del tipo, nivel o lípido de los ácidos grasos presentes en el aceite. Esto a su vez, se puede llevar a cabo por la adición de genes que codifiquen enzimas que catalicen la síntesis de ácidos grasos novedosos y los lípidos que los poseen, o al aumentar los niveles de ácidos grasos naturales mientras que se reducen posiblemente los niveles de los precursores. Alternativamente, se pueden introducir secuencias de ADN que disminuyan o bloqueen los pasos en la biosíntesis de ácidos grasos resultando en un incremento en los intermediarios precursores de ácidos grasos. Los genes que se pudieran agregar incluyen desaturasas, epoxidasas, hidratasas, dehidratasas y otras enzimas que catalizan las reacciones que involucran los intermediarios de ácidos grasos. Ejemplos representativos de las etapas catalíticas que se pueden bloquear, incluyen las desaturaciones del ácido esteárico al oleico y del oleico al linoléico, resultando en las acumulaciones respectivas del ácido esteárico y ácidos oleicos. Otro ejemplo es el bloqueo de las etapas de prolongación que resultan en la acumulación de ácidos grasos saturados C8 a Ci2. Se pueden también alcanzar mejoras en otros productos principales de la molienda húmeda del maíz, harina de gluten de maíz y forraje de gluten de maíz, con la introducción de genes para obtener plantas novedosas de maíz. Las posibilidades representativas incluyen, pero no se limitan a aquellas arriba descritas para la mejora del valor de los alimentos y los forrajes. Además, se puede además considerar que la planta de maíz se use para la producción o fabricación de compuestos biológicos útiles, que se produjeron o no se produjeron del todo, o no se produjeron al mismo nivel previamente en la planta de maíz. Las plantas novedosas del maíz que producen estos compuestos, se hacen posible por la introducción y expresión de genes mediante métodos de transformación del maíz. La gran diversidad de posibilidades incluyen pero no se limitan a cualquier compuesto biológico que esté actualmente producido por cualquier organismo tales como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos primarios o intermediarios, polímeros de carbohidratos, etcétera. Los compuestos se pueden producir por la planta, extraerse con la cosecha y/o procesamiento, y usarse para cualquier propósito útil reconocido actualmente tal como productos farmacéuticos como fragancias, enzimas industriales por nombrar unos cuantos . Posibilidades adicionales de ejemplificar el intervalo de características o propiedades de los granos, codificados potencialmente por genes introducidos en plantas transgénicas, incluyen granos con una menor susceptibilidad al rompimiento para propósitos de exportación, o un tamaño más grande de maíz a medio moler cuando se procesa por molienda seca, a través de la introducción de genes que enriquezcan la síntesis de la ?-zeína, maíz palomero con calidad mejorada y volumen de expansión, a través de genes que incrementan el espesor del pericarpio, maíz con un grano más blanco para usos en alimentación, a través de la introducción de genes que bloquean efectivamente la expresión de las enzimas involucradas en las trayectorias de producción de pigmentos, y calidad mejorada para bebidas alcohólicas o maíz dulce a través de la introducción de genes que afectan el sabor tales como el gen del encogimiento (codificado por la sacarosa sintasa) para el maíz dulce. g. Características Agronómicas de la Planta Dos de los factores que determinan en donde debe crecer el maíz, son la temperatura diaria promedio durante la estación de crecimiento y la duración de tiempo entre las heladas. Dentro de las áreas en donde es posible crecer maíz, hay diferentes limitaciones en el tiempo máximo que se permite para crecer hasta la madurez y ser cosechado. El maíz para crecer en un área particular, se selecciona por su capacidad de madurar y secar hasta un nivel de contenido de humedad cosechable dentro del periodo de tiempo requerido con el máximo rendimiento posible. Por lo tanto, maíz de diferentes grados de madurez se desarrolla para diferentes ubicaciones de crecimiento. Además de la necesidad de secar lo suficientemente para permitir la cosecha, se desea tener un secado máximo que tenga lugar en el campo, para minimizar la cantidad de energía requerida por secado adicional por cosecha. También, entre más fácilmente se puede sacar el grano, más tiempo habrá disponible para crecimiento y relleno del núcleo. Se considera que los genes que influencian la madurez y/o el secado se pueden identificar e introducir dentro de líneas de maíz usando técnicas de transformación, para crear nuevas variedades de maíz adaptadas a diferentes ubicaciones de crecimiento, o la misma ubicación de crecimiento, pero tienen una relación mejorada de rendimiento a humedad en la cosecha. La expresión de genes que se involucran en la regulación del desarrollo de la planta, pueden ser especialmente útiles, por ejemplo, los genes de vaina áspera y sin lígula que se han identificado en el maíz. Se contempla que los genes se puedan introducir dentro del maíz, lo que mejoraría la capacidad de cosecha en pie y otras características de crecimiento de la planta. La expresión de genes novedosos que otorgan tallos más fuertes, sistemas de raíz mejorados, o evitan o reducen la caída de las espigas, sería de gran valor para los agricultores. Se propone que sería ventajosa la introducción y expresión de genes que incrementen la cantidad total de fotoasimilado disponible por, por ejemplo, un incremento en la distribución de luz y/o intercepción. Además, la expresión de genes que incrementen la eficiencia de la fotosíntesis y/o las copas de las hojas, incrementaría ganancias adicionales en productividad. Tales enfoques permitirían poblaciones crecientes de plantas en el campo. El retraso de la senectud vegetativa en la estación tardía, incrementaría el flujo de asimilado dentro del grano e incrementaría así el rendimiento. Se propone que la sobreexpresión de genes dentro del maíz que se asocia con la "permanencia verde" o la expresión de algún gen que retrase la senectud sería ventajosa. Por ejemplo, un mutante no amarillante se ha identificado en la Festuca pra tensis (Davies y colaboradores, 1990) . La expresión de este gen así como otros, puede evitar el rompimiento prematuro de la clorofila y mantener así la función de las copas de las hojas. h. Utilización de Nutrientes 5 La capacidad de utilizar los nutrientes disponibles, puede ser un factor limitante en el crecimiento de plantas monocotiledóneas como el maíz. Se propone que sea posible alterar la retoma de nutrientes, tolerar extremos de pH, la movilización a través de la planta, depósitos de almacenamiento, y disponibilidad para actividades metabólicas mediante la introducción de genes novedosos. Estas modificaciones permitirían a una planta tal como el maíz, utilizar más efectivamente los nutrientes disponibles. Se contempla que un incremento en la actividad de por ejemplo, una enzima que esté normalmente presente en las plantas e involucrada en la utilización de nutrientes, incrementaría la disponibilidad de un nutriente. Un ejemplo de tal enzima sería la fitasa. También se contempla que la expresión de un gen novedoso pueda hacer disponible a una fuente de nutrientes y que estaba previamente no accesible, por ejemplo, una enzima que libere un componente de valor nutriente a partir de una molécula más compleja, tal vez una macromolécula. i. Esterilidad Masculina La esterilidad masculina es útil en la producción de semillas híbridas. Se propone que la esterilidad masculina se pueda producir a través de la expresión de genes novedosos. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de genes que codifican proteínas, que interfieren con el desarrollo de la inflorescencia masculina y/o el gametofito, resultan en una esterilidad masculina. Los genes quiméricos de ribonucleasa, que se expresan en las anteras del tabaco transgénico y en la semilla oleaginosa de colza, se ha demostrado que conducen a una esterilidad masculina (Mariani y colaboradores, 1990) . Diversas mutaciones se descubrieron en el maíz, que otorgan una esterilidad masculina citoplásmica. Una mutación en particular, referida como el citoplasma también se co-relaciona con la sensibilidad a la producción de roya en la hoja de maíz Southern. Una secuencia de ADN, designada como TURF-13 (Leaving, 1990) se identificó que se correlaciona con el citoplasma T. Se propone que sería posible a través de la introducción del TURF-13 por medio de la transformación, separar la esterilidad masculina de la sensibilidad a las enfermedades. Ya que es necesario ser capaz de restablecer la fertilidad masculina para propósitos de cruza y para producción de granos, se propone que los genes que codifican la restauración de la fertilidad masculina se puedan también introducir. j . Marcadores de Selección Negativos La introducción de genes que codifican características que se pueden seleccionar en contra, pueden ser útiles para eliminar genes indeseables unidos. Se contempla que cuando dos o más genes se introducen juntos por transformación, los genes se unirán juntos en el cromosoma del huésped. Por ejemplo, un gen que codifica un gen Bt que otorga resistencia a los insectos en la planta, se puede introducir dentro de una planta junto con un gen bar que es útil como un marcador de selección y otorga resistencia al herbicida Ignite en la planta. Sin embargo, puede no ser deseable tener una planta resistente a los insectos que sea también resistente al herbicida Ignite. Se propone que se pueda también introducir un gen ¿?ar antisentido, que se exprese en aquellos tejidos en donde no se desea la expresión del gen bar, por ejemplo, en partes completas de la planta. Así, aunque el gen bar se expresa y es útil como un marcador de selección, no es útil para otorgar resistencia a los herbicidas en la planta completa. El gen antisentido bar, es un marcador de selección negativo.

También se contempla que una selección negativa es necesaria con objeto de separar por exclusión una población de transformantes, para recombinantes homólogos raros generados a través del direccionamiento de genes. Por ejemplo, un recombinante homólogo se puede identificar a través de la inactivación de un gen que fue previamente expresado en esa célula. El gen antisentido para la neomicin fosfotransferasa II (nptll) ha sido investigado como un marcador de selección negativo en el tabaco { Nicotiana tabacum) y en la Arabidopsis thaliana (Xiang, C. y Guerra, D.J. 1993). En este ejemplo, los genes de npt II sentido y antisentido, se introducen en una planta a través de transformación, y las plantas resultantes son sensibles al antibiótico de canamicina. Un gen introducido que se integra dentro del cromosoma de la célula huésped en el sitio del gen antisentido npt II, e inactiva al gen antisentido, hará resistente a la planta a la canamicina y a otros antibióticos de aminoglicósidos . Por lo tanto, se pueden identificar recombinantes raros específicos del sitio mediante separación por exclusión para resistencia a antibióticos. Similarmente, se puede usar como un marcador de selección negativo, cualquier gen nativo de la planta o introducido a través de transformación que cuando sea inactivado otorgue resistencia a un compuesto.

«* W.-A, Se contempla que los marcadores de selección negativos puedan ser útiles en otras formas. Una aplicación es construir líneas transgénicas en las cuales se pueda seleccionar por transposición a sitios no 5 enlazados. En el proceso de etiquetado, es más común para el elemento de transposición moverse a un sitio ligado genéticamente en el mismo cromosoma. Sería útil un marcador de selección para recuperación de plantas raras en el cual haya sucedido una transposición a una ubicación no ligada. Por ejemplo, puede ser útil la enzima citosina deaminasa para este propósito (Stouggard, J., 1993). En presencia de esta enzima, el compuesto 5- fluorocitosina se convierte a 5-fluorouracilo que es tóxico para la planta y las células animales. Si se liga un elemento de transposición al gen para la enzima citosina deaminasa, se puede seleccionar la transposición a sitios no ligados al seleccionar eventos de transposición en los cuales la planta resultante sea resistente ahora a la 5-fluorocitosina. Las plantas padre y las plantas que contienen transposiciones a sitios enlazados permanecerán sensibles a la 5-fluorocitosina . La resistencia a la 5-fluorocitosina se debe a la pérdida del gen de citosina deaminasa, a través de la segregación genética del elemento de transposición y al gen de citosina deaminasa. Otros genes que codifican proteína .jWtofita » que hacen sensible a la planta hasta un cierto compuesto serán también útiles en este contexto. Por ejemplo, el gen 2 del T-ADN del Agrobacterium tumefaciens, codifica una proteína que cataliza la conversión del a-naftalen acetamida (NAM) a a-naftalen ácido acético (NAA) resulta en células de plantas sensibles a altas concentraciones de NAM. También se contempla que los marcadores de selección negativos pueden ser útiles en la construcción de líneas de etiquetado de transposones. Por ejemplo, al marcar un elemento de transposición autónomo tal como el Ac, Master Mu, o En/Spn con un marcador de selección negativo, se pueden seleccionar los transformantes en los cuales el elemento autónomo no está integrado de forma estable dentro del genoma. Se propone que este sería deseable, por ejemplo, cuando la expresión transitoria del elemento autónomo se desee para activar in trans la transposición de un elemento defectuoso de transposición, tal como Ds, pero la integración estable del elemento autónomo no se desee. La presencia del elemento autónomo, puede no desearse con objeto de estabilizar el elemento defectuoso, esto es evitar una transposición posterior. Sin embargo, se propone que si la integración estable de un elemento autónomo de transposición se desea en una planta, la presencia de un marcador de selección negativo puede hacer posible eliminar al elemento autónomo durante el proceso de cruza. k. Secuencias No Expresantes de Proteínas 1. Expresión del ARN Se puede producir el ácido nucleico dentro del maíz y otras monocotiledóneas, para el propósito de expresar transcriptos de ARN que funcionen para afectar el genotipo de la planta aunque no se traduzcan en proteínas. Dos ejemplos son el ARN antisentido y el ARN con actividad de ribosima. Ambos pueden servir para una función posible de reducción o eliminación de la expresión de los genes de planta nativos o introducidos. Los genes se pueden construir o aislar, los cuales cuando se transcriben, producen un ARN antisentido que es complementario a todo o parte del mensajero del ARN dirigidos. El ARN antisentido reduce la producción del producto del polipéptido de un ARN mensajero. El producto de polipéptidos, puede ser cualquier proteína codificada por el genoma de planta. Los genes arriba mencionados se referirán como genes antisentido. Un gen antisentido puede entonces introducirse en una planta por métodos de transformación, para producir una planta transgénica novedosa con una expresión reducida de una proteína seleccionada de interés. Por ejemplo, la proteína puede ser una enzima que cataliza una reacción en la planta. La reducción de la actividad de la enzima, puede reducir o eliminar productos de reacción lo que incluye cualquier compuesto sintetizado enzimáticamente en la planta, tal como ácidos grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y similares. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína de almacenamiento tal como una zeína, o una proteína estructural, la expresión disminuida de la cual puede conducir a cambios en la composición de aminoácidos en la semilla o a cambios morfológicos en las plantas respectivamente. Las posibilidades arriba citadas se suministran solo a manera de ejemplo y no representan el amplio rango de aplicaciones . Los genes se pueden construir o aislar, los cuales cuando se transcriben producen enzimas de ARN o ribozimas, que pueden actuar como endoribonucleasas y catalizan el desdoblamiento de moléculas de ARN con secuencias seleccionadas. El desdoblamiento del ARN mensajero seleccionado, puede resultar en la producción reducida de sus productos codificados de polipéptidos. Estos genes se pueden usar para preparar plantas transgénicas novedosas que los poseen. Las plantas transgénicas pueden poseer niveles reducidos de polipéptidos incluyendo, pero no limitándose a, los polipéptidos arriba citados que pueden afectarse por el ARN antisentido. También es posible que los genes se puedan introducir para producir plantas transgénicas novedosas, que tienen expresión reducida de un producto gen nativo mediante un mecanismo de cosupresión. Se ha demostrado en el tabaco, tomate y petunia (Goring y colaboradores, 1991., Smith y colaboradores, 1990, Napoli, C. y colaboradores, 1990, van der Kroi y colaboradores, 1990) que la expresión del transcripto de sentido de un gen nativo, reducirá o eliminará la expresión del gen natural de una forma similar a aquella observada en los genes antisentido. El gen introducido puede codificar todo o una parte de la proteína natural dirigida, pero su traducción puede no requerirse para la reducción del nivel de esa proteína natural. 2. Expresión no ARN Por ejemplo, los elementos de ADN que incluyen aquellos de los elementos de transposición tales como Ds, Ac, o Mu, se pueden insertar dentro de un gen y provocar mutaciones. Estos elementos de ADN, se pueden insertar, con objeto de inactivar (o activar) un gen y por lo tanto "etiquetar" una característica particular. En este caso, el elemento de transposición no provoca inestabilidad de la mutación etiquetada, ya que la utilidad del elemento no depende de su capacidad para mover el genoma. Una vez que se etiqueta la característica deseada, la secuencia introducida de ADN se puede usar para clonar el gen correspondiente, por ejemplo, usando la secuencia introducida de ADN como un cebador PCR junto con técnicas de clonación de genes PCR (Shapiro, 1983; Dellaporta y colaboradores, 1988) . Una vez identificado, el gen o genes completos para la característica particular, incluyendo regiones de control o regulatorias en donde se desea, se puede aislar, clonar y manipular como sea deseado. La utilidad de los elementos de ADN introducidos dentro de un organismo para propósitos de etiquetado del gen, es independiente de la secuencia de ADN y no depende de alguna actividad biológica de la secuencia de ADN, esto es, la transcripción en ARN o la traducción en una proteína. La función única del elemento del ADN es romper la secuencia de ADN del gen. Se contempla que secuencias no expresadas de ADN, incluyendo secuencias sintéticas novedosas, se puedan introducir en las células como "etiquetas" propias de aquellas células y plantas y semillas de las mismas. Sería necesario para un elemento de etiqueta de ADN, romper la función de un gen endógeno al organismo huésped, ya que la función única de este ADN sería identificar el origen del organismo. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia única de ADN dentro de una planta y este elemento de ADN identificaría todas las células, plantas y progenie de estas células como aparecieran de la fuente etiquetada. Se propone que la inclusión de ADNs de etiqueta, permitiría distinguir germoplasma propio o germoplasma derivado de germoplasma no etiquetado. Otro elemento posible que se puede introducir, es un elemento de matriz de una región de colocación (MAR) , tal como el elemento A de la lisozima de pollo (Stief, 1989), que se puede colocar alrededor de un gen expresable de interés, para efectuar un incremento en la expresión global del gen y disminuir los efectos dependientes de la posición con la incorporación del genoma de la planta (Stief y colaboradores, 1989; Phi-Van y colaboradores, 1990) . La expresión de los segmentos novedosos preseleccionados de ADN, que afectan favorablemente el contenido de agua de la planta, el potencial total de agua, potencial osmótico y la turgencia, pueden enriquecer la capacidad de la planta para tolerar la sequía. Como se usa aquí, los términos "resistencia a la sequía" y "tolerancia a la sequía", se usan para referirse a la resistencia o tolerancia a la tensión creciente de la planta, inducida por una reducción en la disponibilidad de agua, en comparación con las circunstancias normales, y a la capacidad de la planta J. &H?. tAlri?*&. la. jSJjlfe.-.a^ lftfa^ para funcionar y sobrevivir en medios de baja agua, y desempeñarse en una forma relativamente superior. En este aspecto de la invención se propone por ejemplo, que la expresión de un segmento preseleccionado de ADN que codifica la biosíntesis de solutos osmóticamente activos, puede impartir protección contra la sequía. Dentro de esta clase de segmentos preseleccionados de ADN, están los ADN que codifican la manitol deshidrogenasa (Lee y Saier, 1982) y la trehalosa-6-fosfato sintasa (Kaasen y colaboradores, 1992) . A través de la acción posterior de las fosfatasas naturales en la célula o por la introducción y co-expresión de una fosfatasa específica, estos ADN preseleccionados introducidos, resultaran en la acumulación, de manitol o trehalosa, respectivamente, ambos de los cuales han sido bien documentados como compuestos protectores capaces de mitigar los efectos de la tensión. La acumulación de manitol en el tabaco transgénico ha sido verificada y los resultados preliminares indican que las plantas que expresan altos niveles de este metabolito, son capaces de tolerar una tensión osmótica apropiada (Tarczynski y colaboradores, citado supra (1992), (1993)). Similarmente, la eficacia de estos metabolitos para la protección de la función enzima (por ejemplo, alanopina o ácido propiónico) o la integridad de la membrana (por ejemplo, alanopina) ha sido documentada (Loomis y colaboradores, 1989) , y por lo tanto, la expresión de un segmento preseleccionado de ADN que codifica la biosíntesis de estos compuestos, puede otorgar resistencia a la sequía de una forma similar o complementaria al manitol. Otros ejemplos de metabolitos que se presentan naturalmente, que son osmóticamente activos y/o suministran algún efecto protector directo durante la sequía y/o la desecación, incluyen azúcares y derivados del azúcar tal como la fructuosa, eritritol (Coxson y colaboradores, 1992) ; sorbitol, dulcitol (Karsen y colaboradores, 1992) ; glucosilglicerol (Reed y colaboradores, 1984); (Erdmann y colaboradores, 1992); sacarosa, estaquiosa (Koster and Leopold, 1988); (Blackman y colaboradores, 1992); ononitol y pinitol (Vernon and Bohnert, (1992); y rafinosa (Bernal-Lugo and Leopold, 1992) . Otros solutos osmóticamente activos que no son azúcares incluyen, pero no se limitan a, prolina (Rensburg y colaboradores, 1993) , y glicina-betaina (Wyn- Jones and Storey, 1981) . El crecimiento continuo de las copas de las plantas y el ajuste reproductor creciente durante los periodos de tensión, se puede aumentar con la introducción y expresión de segmentos preseleccionados de ADN, tales como aquellos que controlan los compuestos osmóticamente activos arriba discutidos y otros de tales compuestos, como se representa en una modalidad ejemplar por la enzima mionositol 0-metiltransferasa. Se contempla que la expresión de las proteínas específicas pueda también incrementar la tolerancia a la sequía. Se han asignado tres tipos de proteínas embriogénicas tardías con base en similitudes estructurales (ver Dure y colaboradores, 1989) . Las tres clases de estas proteínas, se ha demostrado en semillas de maduración (esto es, desecación) . Dentro de estos tres tipos de proteína, el tipo II (tipo dehidrina) ha sido generalmente implicada en la tolerancia a la sequía y/o desecación en partes de plantas vegetativas (esto es, Mundy and Chua, (1988); Piatkowski y colaboradores, 1990); Yamaguchi-Shinozaki y colaboradores, (1992). Recientemente, la expresión de la LEA de Tipo III (HVA-1) en el tabaco se encontró que tenía influencia en la altura de la planta, madurez y tolerancia a la sequía (Fitzpatrick, (1993) . La expresión de los genes estructurales de todos los tres grupos puede por lo tanto otorgar una tolerancia a la sequía. Otros tipos de proteínas inducidas durante la tensión con agua incluyen las proteasas de tiol, aldolasas y transportadores de transmembrana (Guerrero y colaboradores, 1990) , que pueden otorgar diversas funciones del tipo reparación y/o protectoras durante la tensión por sequía. La expresión de un segmento preseleccionado de ADN que afecta la biosíntesis de lípidos, y por lo tanto la composición de membranas, puede ser también útil en otorgar resistencia a la sequía sobre la planta. Muchos genes que mejoran la resistencia a la sequía tienen modos complementarios de acción. Así, las combinaciones de estos genes pueden tener efectos aditivos y/o sinérgicos en la mejora de la resistencia a la sequía en el maíz. Muchos de estos genes también mejoran la tolerancia a la congelación (o resistencias) , las tensiones físicas en que se incurre durante la congelación y la sequía, son similares en la naturaleza y se pueden mitigar de forma similar. El beneficio se puede otorgar por medio de la expresión constitutiva de estos genes, pero los medios preferidos de expresión de estos genes novedosos, puede ser a través del uso de un promotor inducido por la turgencia (tal como los promotores para los genes inducidos por la turgencia descritos en Guerrero y colaboradores, (1990) y Shagan y colaboradores, (1993), que se incorporan aquí como referencia) . Los patrones de expresión espacial y temporal de estos genes, pueden permitir que el maíz soporte mejor la tensión. Se propone que sería de beneficio la expresión de los genes que están involucrados con las características t t|-Í? mÍ¿ I I -f ?Má ?m**m rr.?l.A .?. morfológicas específicas que permiten extracciones crecientes de agua del suelo seco. Por ejemplo, la introducción y expresión de genes que alteran las características de la raíz, puede enriquecer la retoma de agua. También se contempla que sería de valor significativo la expresión de los ADN que enriquecen el ajuste reproductor durante los periodos de tensión. Por ejemplo, sería de beneficio la expresión de los ADNs que mejoren la sincronía del gen de polen y la receptividad de las partes femeninas de la planta, esto es, los estigmas. Además, se propone que la expresión de los genes que minimizan el aborto del núcleo durante los periodos de tensión, incrementaría la cantidad de grano a cosecharse y sería de valor. Se contempla además que la regulación de los niveles de citoquinina en las monocotiledóneas tales como el maíz, por la introducción y expresión de un gen de isopentenil transferasa con secuencias regulatorias apropiadas, pueden mejorar la resistencia de la monocotiledónea a la tensión y el rendimiento (Gan y colaboradores, Science, 270, 1986 (1995) ) . Dado el papel global del agua en la determinación del rendimiento, se contempla que permitir al maíz utilizar el agua más eficientemente a través de la introducción y expresión de genes novedosos, mejorará el desempeño global aun cuando la disponibilidad de agua en el suelo no sea limitante. Se puede llevar a cabo al introducir genes que mejoren la capacidad del maíz para maximizar el uso de agua, a través de un intervalo completo de tensiones relacionadas con la disponibilidad de agua, estabilidad del rendimiento o consistencia del desempeño del rendimiento. III. Introducción de un Vector de la Invención a una Célula Huésped. La presente invención incluye generalmente etapas dirigidas a la introducción de una secuencia preseleccionada de ácido nucleico dentro de una célula receptora, por ejemplo, una célula de planta para crear una célula transformada. Aunque se prefiere que el vector o composición de la invención esté en contacto con una planta, parte de la planta o tejido de la planta por atomización o frotación, se puede introducir el vector o la composición a las células de la planta in vi tro por otros métodos. Para este propósito, las células de la fuente de tejido de planta son preferiblemente células embriogénicas o líneas de células que pueden regenerar plantas transgénicas fértiles y/o semillas. Las células se pueden derivar de monocotiledóneas o dicotiledóneas. Ejemplos apropiados de especies de plantas incluyen trigo, arroz, Arabidopsis, tabaco, maíz, soya y similares. El tipo preferido de célula es una célula monocotiledónea tal como una célula de maíz, que puede estar en un cultivo de células en suspensión o puede estar en una parte intacta de la planta, tal como un embrión inmaduro, o en un tejido especializado de planta tal como un callo, tal como el callo tipo I o tipo II. La transformación de las células de una fuente de tejido de plantas, se puede llevar a cabo por alguno de la diversidad de métodos conocidos por aquellos hábiles en el arte. Ejemplos son: la transformación por transferencia directa de ADN en células de plantas por electroforación (Patente U.S. No. 5,384,253 y patente U.S. No. 5,472,869, que se incorporan aquí como referencia; Dekeyser y colaboradores, 1990) ; transferencia directa de ADN a las células de las plantas por precipitación PEG (Hayashimoto y colaboradores, 1990) ; transferencia directa de ADN a las células de las plantas por bombardeo con microproyectiles (McCabe y colaboradores, 1988; Gordon-Kamm y colaboradores, 1990; Patente U.S. No. 5,489,520; Patente U.S. No. 5,538,877; y Patente U.S. No. 5,538,880, que se incorporan aquí como referencia) ; liposomas y transferencia de ADN a las células de las plantas por medio de infección con Agrobacteri um . Se pueden llevar a cabo métodos tales como el bombardeo con microproyectiles o la electroforación j lili il t i i i iiárfl jit i fjÉiíif T i - - -i - r,*-..í&A con ADN "desnudo" en donde la cinta de expresión puede llevarse simplemente sobre un vector de clonación plásmido derivado de E. coli . En el caso de los vectores virales, es deseable que el sistema retenga funciones de replicación, pero carezca de funciones para la inducción de la enfermedad. Un método preferido para la transformación de dicotiledóneas, es por medio de la infección de células de planta con Agrobacterium Tumefaciens usando el protocolo de hojas-disco (Horsch y colaboradores, 1985) . Monocotiledóneas como la Zea mays, se pueden transformar por medio de bombardeo con microproyectiles o tejidos de callo embriogénico o embriones inmaduros, o por la electroforación que sigue a una degradación parcial enzimática de la pared celular, con una enzima que contiene pectinasa (Patente U.S. No. 5,384,253; y Patente U.S. No. 5,472,869). Por ejemplo, las líneas de célula embriogénica derivadas de embriones inmaduros de Zea mays, se pueden transformar por un tratamiento acelerado con partículas como se describe por Gordon-Kamm y colaboradores, (1990) o Patente U.S. No. 5,489,520; Patente U.S. No. 5,538,877 y Patente U.S. No. 5,538,880, arriba mencionadas. Se pueden también usar embriones inmaduros extirpados, como el objetivo para la transformación antes de la inducción, selección y regeneración del cultivo de tejido como se describe en la solicitud U.S. No. de serie 08/112,245 y la publicación PCT WO 95/06128. Adicionalmente, han sido descritos métodos para la transformación de plantas monocotiledóneas utilizando AgroJac eriujn Tumefa ciens por Hiei y colaboradores, (Patente Europea 0 604 662, 1994) y Saito y colaboradores, (Patente Europea 0 672 752, 1995) . Los métodos tales como el bombardeo con microproyectiles o la electroforación, se llevan a cabo con ADN "desnudo" en donde la cinta de expresión puede simplemente llevarse en un vector de clonación de un plásmido derivado de E. coli . En el caso de los vectores virales, es deseable que el sistema conserve funciones de replicación, pero carezca de funciones para la inducción de enfermedades. Para efectuar la transformación por electroforación, se pueden emplear tejidos friables tales como cultivos de células en suspensión o callos embriogénicos, o alternativamente, se pueden transformar embriones inmaduros u otros tejidos organizados directamente. Las paredes celulares de las células u órganos preseleccionados, se pueden degradar parcialmente al exponerlas a enzimas degradadoras con pectina (pectinasas o pectoliasas) o envolverlas mecánicamente de una forma controlada. Tales células serían entonces receptivas a una retoma de ADN por electroforación que se puede llevar a cabo en esta etapa, y las células transformadas se identifican después por un protocolo apropiado de selección o de separación por exclusión dependiendo de la naturaleza del ADN recientemente incorporado. Un método ventajoso adicional para suministrar segmentos transformantes de ADN a células de plantas, es el bombardeo con microproyectiles. En este método, las micropartículas se pueden recubrir con ADN y suministrarse en células mediante una fuerza propulsora. Las partículas ejemplares incluyen aquellas que comprenden tungsteno, oro, platino y similares. Se contempla que en algunos casos, la precipitación del ADN sobre partículas de metal no sería necesaria para el suministro de ADN a una célula receptora usando un bombardeo con microproyectiles. También se contempla que las partículas puedan contener ADN más que recubrirse con ADN. Así, se propone que las partículas puedan incrementar el nivel de la entrega de ADN pero no son, dentro y por sí mismas, necesarias para introducir el ADN en las células de las plantas. Una ventaja del bombardeo con microproyectiles, además de ser un medio efectivo para transformar de forma reproducible y estable a las monocotiledóneas, es que se requiere el aislamiento de los protoplastos (Christou y j i.*.,.... 0utmaAvtaA,A...*?. ..jaffc.^.^-j^.^jj^nn^ colaboradores, 1988), la formación de células parcialmente degradada, o la susceptibilidad de la infección por Agrobacterium . Una modalidad ilustrativa de un método para el suministro de ADN en células de maíz, por aceleración, es un Sistema de Biolístico de Entrega de Partículas que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de un filtro cubierto con células de maíz cultivadas en suspensión (Gordon-Kamm y colaboradores, 1990) . El tamiz dispersa las partículas de manera que no se suministran a las células receptoras en agregados grandes. Se cree que la intervención de un tamiz entre el aparato de proyectiles y las células a ser bombardeadas, reduce el tamaño del agregado de proyectil y puede contribuir a una secuencia superior de transformación, al reducir el daño infringido en la célula receptora por un proyectil agregado. Para el bombardeo, se concentran preferiblemente las células en suspensión sobre filtros o un medio de cultivo sólido. Alternativamente, se pueden colocar sobre un medio de cultivo sólido los embriones inmaduros u otras células objetivo. Las células a ser bombardeadas, se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención del macroproyectil . Si se desea, se pude *l^AA.tAA .¿^^A-kA*^ ^ »»i-~*»L*^.mA jj también colocar uno o más tamices entre el dispositivo de aceleración y las células a ser bombardeadas. A través del uso de las técnicas establecidas hasta aquí se pueden obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan transitoriamente un gen marcador. El número de células en un foco que expresa el producto del gen exógeno 48 horas posterior al bombardeo, a menudo está en el intervalo desde alrededor de 1 a 10 y en promedio alrededor de 1 a 3. En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo prebombardeo y los parámetros de bombardeo para producir un número máximo de transformantes estables. Los parámetros físicos y biológicos del bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son aquellos que involucran la manipulación de precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan la trayectoria y velocidad de los macro o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas involucradas en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células objetivo para ayudar a aliviar los traumas asociados con el bombardeo, y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o ADN intacto de plásmido con sobre espiral. Se cree que las manipulaciones prebombardeo son especialmente importantes para la transformación exitosa de los embriones inmaduros. De esta manera, se contempla que se puede desear ajustar diversos de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Se puede desear particularmente ajustar los parámetros físicos tales como distancia de espacio, distancia de tejidos y presión de helio. Se pueden también minimizar los factores de reducción de traumas (TRFs) al modificar las condiciones que tienen de influencia en el estado fisiológico de las células receptoras y que pueden por lo tanto tener influencia en las eficiencias de transformación e integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación de tejidos y la etapa de subcultivo o ciclo celular de la célula receptora, se puede ajustar para una transformación óptima. Los resultados de los estudios de optimización a pequeña escala, se describen aquí y la ejecución de otros ajustes de rutina se conocerá por aquellos hábiles en el arte a la luz de la presente descripción. La elección de la fuente de tejido de planta para la transformación, dependerá de la naturaleza de la planta huésped y del protocolo de transformación. Las fuentes útiles de tejidos incluyen callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, segmentos de hojas, segmentos fft-'ffiiTÍ* lt*i?^í*i^&^ de tallos, borla, polen, embriones, hipocotilos, como segmentos del tubérculo, regiones meriestemáticas y similares. La fuente de tejido se selecciona y se transforma de manera que conserva la capacidad para regenerar plantas fértiles completas, después de la transformación, esto es, que contengan células totipotentes . Los callos de maíz embriónico tipo I o tipo II y los embriones inmaduros son fuentes preferidas de tejidos de Zea mays . La selección de fuentes de tejido para la transformación de monocotiledóneas, se describe en detalle en la solicitud U.S. número de serie 08/112,245 y la publicación PCT WO 95/06128 (que se incorpora aquí como referencia) . La transformación se lleva a cabo bajo condiciones dirigidas al tejido de plantas de elección. Las células o tejidos de plantas se exponen al ADN que lleva las secuencias preseleccionadas de ADN por un periodo efectivo de tiempo. Esto puede ir desde menos de un segundo de pulso de electricidad para electroforación hasta 2-3 días de co-cultivo en presencia de células de Agrobacteri um que soportan al plásmido. Las soluciones amortiguadoras y los medios usados, también variarán con la fuente de tejido de plantas y el protocolo de transformación. Diversos protocolos de transformación emplean una capa alimentadora de células de cultivo suspendidas (tabaco o maíz dulce mexicano negro, por ejemplo) en la superficie de placas sólidas de medios, separadas por un disco de papel filtro de las células o tejidos de plantas que se transformen. Un método preferido para transferir una secuencia preseleccionada de ácido nucleico a una planta, es mediante atomización o frotación de la planta o de una parte de la planta con una composición de la invención. Las plantas monocotiledóneas preferidas incluyen maíz dulce, avena, arroz, maíz, trigo, alfalfa, trébol, pastos del género Festuca , sorgo, mijo, cebada, centeno o pasto Timothy. Las plantas dicotiledóneas preferidas incluyen col ornamental, pepino, tabaco, papa, tomate, colza, fresa, soya, girasol, arabidopsis, petunia, guisantes, cánola, frijol, lechuga, espinaca, alfalfa, algodón, altramuces y zanahorias. IV. Detección de los segmentos Preseleccionados de Ácido Nucleico. Para confirmar la presencia de un segmento o segmentos preseleccionados de ácido nucleico o "transgene (s) ", en plantas regenerativas, se pueden llevar a cabo una diversidad de ensayos. Tales ensayos incluyen por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por aquellos con habilidad en el arte, tales como el manchado Southern y Northern, hibridación in si tu y métodos de amplificación basados en ácidos nucleicos tales como PCR o RT-PCR; ensayos "bioquímicos" tales como la detección de la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISAS y manchados Western) o por función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces; y también por el análisis del fenotipo de una planta regenerada completa, por ejemplo, para resistencia a plagas o enfermedades. El ADN se puede aislar de las líneas de células o de cualquier parte de plantas para determinar la presencia de un segmento preseleccionado de ácido nucleico, a través del uso de técnicas bien conocidas por aquellos hábiles en el arte. Observar que las secuencias intactas, no siempre estarán presentes, debido presumiblemente al rearreglo o eliminación de secuencias en las células. La presencia de elementos de ácido nucleico introducidos a través de los métodos de esta invención, se puede determinar por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Usando esta técnica, se amplifican fragmentos discretos de ácido nucleico y se detectan por electroforesis de gel. Este tipo de análisis, permite determinar si un segmento preseleccionado de ácido nucleico está presente en un transformante estable, pero no suministra la integración del segmento preseleccionado introducido de ácido nucleico dentro del genoma de la célula huésped. Además, no es posible usar técnicas PCR para determinar si los transformantes tienen genes exógenos introducidos dentro de sitios diferentes en el genoma, esto es, si los transformantes son de origen independiente. Se contempla que con el uso de técnicas PCR, sería posible clonar fragmentos del ADN genómico del huésped adyacente a un segmento preseleccionado o introducido de ADN. La prueba positiva de la integración del ADN dentro del genoma del huésped y las identidades independientes de los transformantes, se pueden determinar usando la técnica de hibridación Southern. Usando esta técnica, se pueden identificar secuencias específicas de ADN que se introdujeron dentro del genoma del huésped y en las secuencias de flanqueo de ADN del huésped. Así, el patrón de hibridación Southern de un transformante dado, sirve como una característica identificadora de ese transformante. Además, es posible mediante la hibridación Southern demostrar la presencia de segmentos introducidos preseleccionados de ADN en ADN de alto peso molecular, esto es, confirmar que el segmento introducido preseleccionado de ADN, se ha integrado dentro del genoma de la célula huésped. La técnica de hibridación Southern suministra información que se obtiene usando PCR, por ejemplo, la presencia de un segmento preseleccionado de ADN, pero también demuestra la integración dentro del genoma y caracteriza cada transformante individual. Se contempla que con el uso de las técnicas de hibridación por manchado de ranura o punto, que son modificaciones de las técnicas de hibridación Southern, se podría obtener la misma información que se deriva de PCR, por ejemplo, la presencia de un segmento preseleccionado de ADN. Las técnicas de hibridación Southern y de PCR, se pueden usar para demostrar la transmisión de un segmento preseleccionado de ADN a la progenie. En la mayoría de los casos, el patrón característico de hibridación Southern para un transformante dado, segregará la progenie como uno o mas genes mendelianos (Spenser y colaboradores, 1992; Laursen y colaboradores, 1994) indicando una herencia estable del gen. La naturaleza no quimérica del callo y los transformantes padres (R0) se sugiere por la transmisión de la línea de germen y los patrones de hibridación idénticos del manchado Southern, y las intensidades de ADN transformante en el callo, plantas R0 y progenie Ri que se segrega por el gen transformado. Mientras que las técnicas de análisis de ADN se pueden llevar a cabo usando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN solamente se puede expresar en células particulares o tipos de tejido y por lo tanto será necesario preparar el ARN para análisis a partir de estos tejidos. Se pueden también usar técnicas de PCR para la detección y cuantificación del ARN producido de los segmentos introducidos preseleccionados de ADN. En esta aplicación del PCR, primero es necesario transcribir de forma inversa el ARN en ADN, usando enzimas tales como la transcriptasa inversa, y después a través del uso de técnicas convencionales de PCR amplificar eL ADN. En la mayoría de los casos las técnicas de PCR aunque útiles, no demostrarán la integridad del producto de ARN. Información adicional acerca de la naturaleza del producto de ARN se puede obtener mediante el manchado Northern. Esta técnica demostrará la presencia de una especie de ARN y dará información sobre la integridad de ese ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN, se puede también determinar usando hibridaciones Northern de manchado de ranura o punto. Estas técnicas son modificaciones del manchado Northern y solamente demostraran la presencia o ausencia de una especie de ARN. Aunque el manchado Southern y el PCR se pueden usar para detectar el segmento preseleccionado de ADN en cuestión, no suministran información en cuanto a si está llÉiiiÉlTf I- * **~*——~*~? rMn i lifHi f JilrMifMiItltitlfffititiil -ffliñi-ilrl f 'Él i ll expresándose el segmento preseleccionado de ADN. La expresión se puede evaluar mediante la identificación específica de los productos de proteína, de los segmentos de ADN preseleccionados introducidos o evaluando los cambios fenotípicos resultado de su expresión. Los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas, pueden hacer uso de propiedades fisicoquímicas, estructurales, funcionales u otras propiedades de las proteínas. Las propiedades únicas fisicoquímicas o estructurales, permiten a las proteínas separarse e identificarse por procedimientos de electroforesis, tales como la electroforesis de gel nativa o desnaturalizante o el enfoque isoeléctrico, o por técnicas de cromatografía tales como intercambio de iones o cromatografía por exclusión de gel. Las estructuras únicas de las proteínas individuales, ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos, para detectar su presencia en formatos tales como el ensayo ELISA. Las combinaciones de enfoques se pueden emplear con una especificidad aún mayor tal como el manchado Western, en el cual los anticuerpos se usan para localizar productos individuales de genes que han sido separados por técnicas de electroforesis. Se pueden emplear técnicas adicionales para confirmar absolutamente la identidad del producto de interés, tal como la evaluación por formación de secuencias de aminoácidos que sigue a la purificación. Aunque estos están entre los más comúnmente empleados, se pueden adicionalmente usar otros procedimientos . Los procedimientos de ensayo se pueden también usar para identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad, especialmente la capacidad de las enzimas para catalizar reacciones químicas específicas que involucran substratos y productos específicos. Estas reacciones pueden seguirse al suministrar y cuantificar la pérdida de substratos o la generación de productos de las reacciones por procedimientos físicos o químicos. Los ejemplos son tan variados como la enzima a ser analizada, y pueden incluir ensayos por actividad enzimática PAT al seguir la producción de fosfinotricina acetilada radioetiquetada a partir de fosfinotricina y 14C-acetil CoA o por la actividad de la antranilato sintasa que sigue a la pérdida de fluorescencia del antranilato, por nombrar dos. Muy frecuentemente, la expresión de un producto de genes se determina al evaluar los resultados fenotípicos de su expresión. Estos ensayos también pueden tomar muchas formas, incluyendo pero no limitándose a, cambios de análisis en la composición química, morfología o propiedades fisiológicas de la planta. La composición '.'?! química se puede alterar por la expresión de segmentos preseleccionados de ADN que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento, que cambian la composición de aminoácidos y se pueden detectar por análisis de aminoácidos, o por enzimas que cambian la cantidad de almidón que se puede analizar por espectrometría de reflectancia cercana al infrarrojo. Sus cambios morfológicos pueden incluir un tamaño mayor o tallos más gruesos. Los cambios más frecuentes de las plantas o partes de plantas en respuesta a los tratamientos impuestos, se evalúan bajo condiciones cuidadosamente controladas denominadas bioensayos. Las plantas transgénicas aquí producidas, se espera que sean útiles para una variedad de propósitos comerciales y de investigación. Las plantas transgénicas se pueden crear para su uso en agricultura tradicional y poseen características benéficas para el agricultor (por ejemplo, características agronómicas tales como resistencia a deficiencias de agua, resistencia a plagas, resistencia a herbicidas o rendimiento aumentado) , benéficas al consumidor del grano cosechado de la planta (por ejemplo, contenido nutritivo o mejorado en alimento humano o forraje animal) , o benéficas para el procesador de alimentos (por ejemplo características mejoradas de procesamiento) . En tales usos, las plantas generalmente crecen para usar su grano en alimentos humanos o animales. Sin embargo, otras partes de las plantas, incluyendo tallos, cascaras, partes vegetales y similares, pueden también tener utilidad incluyendo su uso como parte de ensilamiento animal o para propósitos ornamentales. A menudo, los constituyentes químicos (por ejemplo, aceites o almidones) del maíz y de otros cultivos, se extraen para alimentos o uso industrial, y se pueden crear plantas transgénicas que tengan niveles enriquecidos o modificados de tales componentes. Las plantas transgénicas también pueden encontrar uso en la fabricación comercial de proteínas u otras moléculas, en donde las moléculas de interés se extraen o purifican de partes de plantas, semillas y similares. Las células o tejidos de las plantas, también se puede cultivar, crecer in vi tro o fermentar para la fabricación de tales moléculas. Las plantas transgénicas se pueden también usar en programas de cruza comercial, o se pueden cruzar o reproducir con plantas de especies relacionadas de cultivos. Las mejoras codificadas por el segmento preseleccionado de ADN, se pueden transferir por ejemplo, de células de maíz a células de otras especies, por ejemplo, mediante fusión de protoplastos.

Las plantas transgénicas pueden tener muchos usos en investigación o en reproducción, incluyendo la creación de nuevas plantas mutantes a través de la mutagénesis de inserción, con objeto de identificar mutantes benéficos que puedan posteriormente crearse por mutación y selección tradicional. Un ejemplo sería la introducción de una secuencia recbmbinante de ADN, que codifica un elemento de transposición que se puede usar para generar la variación genética. Los métodos de la invención pueden también usarse para crear plantas que tengan "secuencias de firma" únicas u otras secuencias de marcador que se puedan usar para identificar líneas o variedades propias. La invención se describirá además por los siguientes ejemplos que no se pretenden para limitar el alcance de la invención. Ejemplo 1 Vector de expresión de base FHV para la distribución local o sistémica en plantas. Para superar los problemas asociados con los vectores de base virus que existen en las plantas, y desarrollar un sistema vector viral altamente eficiente para la expresión de genes en plantas, se preparó un vector de base Nodavirus. El vector (figura 8) incluye secuencias de ARN-2 del FHV en el cual, un gen marcador denominado proteína de fluorescencia verde (GFP; Epel y colaboradores, 1996; Casper y colaboradores, 1996) se introdujo en el sitio de desdoblamiento (beta/gamma, figura 1) del precursor de la cápsida de manera que la expresión y movimiento del FHV o de un complejo de nucleoproteína de ARNs de FHV: proteína de recubrimiento de FHV: GFP, se pudiera observar al medir la fluorescencia verde en hojas inoculadas en intervalos diferentes de tiempos. La GFP, es una proteína de 238 residuos de aminoácido originalmente aislada de la medusa Aquorea vi ctoria (Av) . Absorbe la luz azul con una absorción máxima a 395 nm y emite luz verde con una emisión pico a 509 nm. Cuando se expresa la GFP en células procarióticas o eucarióticas, es capaz de producir una fluorescencia verde fuerte cuando se excita por la luz azul (luz ultravioleta) y esta fluorescencia no requiere productos adicionales de genes de su huésped. Para construir el vector pF2G3 (figura 8), se usó un clon de cADN de ARN-2 de FHV (pBWD2) en el vector fagémido Bluescript (Stratagene, California) . Se abrió el plásmido en el sitio de desdoblamiento con la enzima de restricción Nsil. La secuencia de GFP (GFP de ciclo 3, 707 bp, optimizada para expresión en plantas) se amplificó por PCR a partir de un cADN de TMV, clon p30BGFPC3 (que contenía las secuencias de ARN del TMV más las secuencias de GFP en un vector fagémido pUC19) usando los cebadores específicos que contenían los sitios Nsil. El producto de PCR se purificó e insertó en los sitios Nsil del pBWD2 (figura 8). Se inocularon plantas de Nicotiana ben thamiana de dos semanas de edad, tanto de tipo silvestre (TRS1) y transgénicas que expresaban la MP del TMV (H3NB3) o la MP del RCNMV, con 100 µl de 10 ng/µl de ARN del FHV o con 100 µl de transcriptos de ARN de 50 ng/µl preparados a partir del pF2G3 más 10 ng/µl del ARN-1 del FHV como una fuente de la replicasa del FHV. Los ARNs transcritos in vi tro se prepararon a partir del ADN del vector usando la polimerasa de ARN T3 o T7. Se emplearon plantas transgénicas de N. ben thamiana con MP de TMV ya que se había determinado que la inoculación de las plantas transgénicas de N. ben thamiana que expresaban la MP de TMV con AR?s de FHV, resultaban en una acumulación de FHV en un nivel 100 veces mayor en hojas transgénicas de N. benthamiana , en comparación con los controles (figura 17) . Este resultado sugiere que la MP de TMV facilite el movimiento célula a célula del FHV. La RT-PCR del AR? total confirmó este resultado. Las plantas crecieron en una cámara de crecimiento a 23-25°C con un periodo de luz de 12 horas. Se corrió un experimento de control en paralelo, en donde se inoculaban las hojas con transcriptos de AR? hechos de p30BGFPC3. Las hojas se monitorearon para la síntesis de ARNs del FHV así como para GFP por (1) reacción de cadena de polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) del ARN total extraído de las hojas y por (2) medición de la fluorescencia verde en intervalos diferentes de tiempo con lámparas brillantes manuales de UV sobre las hojas. Se cosecharon las hojas 15 días después de la inoculación, y se extrajeron los ARNs totales de 100 mg de hojas (congeladas en nitrógeno liquido) por homogenización seguida por extracción con fenol caliente (Verwoerd y colaboradores, 1989) . La transcripción inversa (RT) al cADN y la amplificación por PCR se llevaron a cabo con SuperscriptII (Gibco/BRL, Bethesda, MD) y polimerasa Taq (Promega, Madison, Wl), respectivamente. Las reacciones RT se llevaron a cabo a 42°C durante 1 hora. Los parámetros del ciclo para PCR fueron: 1 minuto a 94°C, seguido por 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante 1.5 minutos y después un ciclo de 72°C durante 2 minutos. Los cebadores empleados fueron FHV2R1400 (SEQ ID NO:l; ACCTTAGTCTGTTGAC) y FHV2F1 (SEQ ID NO: 2; GTAAACAATTCCAAG) . Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% (figura 12). Como se describió arriba, se había observado un incremento de 100 veces en la titulación del FHV en plantas transgénicas con MP de TMV. Este resultado se confirmó por el análisis RT-PCR del ARN de plantas transgénicas inoculadas con MP de TMV y MP de RCNMV. La MP de TMV y la MP de RCNMV, movilizaron el FHV hasta las hojas secundarias no inoculadas (figura 12, pistas 5-8) . En plantas no transgénicas, solamente se detectaron las secuencias FHV en la hoja inoculada no en las hojas secundarias no inoculadas (Figura 12, pistas 3 y 4) . Cuando se observó la síntesis del ARN de FHV en tiempos diferentes posteriores a la inoculación, la presencia de la secuencia de FHV en plantas de tipo silvestre tuvo un pico en 7 dpi, pero fue prácticamente indetectable en 14 y 21 dpi. Esto se debió probablemente a la desactivación del virus o a la nucleoproteína viral en ausencia del movimiento célula a célula. En plantas transgénicas sin embargo, continuó la síntesis desde 10 hasta 21 dpi debido al movimiento de FHV a través de la hoja inoculada. La inoculación de las mitades de hojas con ARNs de FHV seguida por el monitoreo por RT-PCR, también mostró que las secuencias de FHV se mueven a la mitad no inoculada en plantas transgénicas, pero muy pobremente en comparación con aquella de plantas de tipo silvestre. La presencia de secuencias de FHV en plantas, por RT-PCR se determinó usando cebadores específicos para el ARN-1 del FHV así como el ARN-2 de FHV.

El análisis RT-PCR se empleó también para detectar la replicación del NOV en células de N. benthamiana y en la hoja primaria (infectada) . Las plantas de tipo silvestre y transgénicas que expresan la MP del RC?MV, se inocularon con AR? de ?OV y las hojas primarias, secundarias y terciarias, se recolectaron 7-10 días después. ?o se detectó virus en las hojas secundarias o terciarias, aunque la hoja primaria de las plantas transgénicas mostró cantidades superiores del virus en relación con las plantas no transgénicas (aproximadamente 5-10 veces mayor que aquel de las no transgénicas) . La medición de la GFP por fluorescencia verde, mostró áreas pequeñas de fluorescencia verde irregular en hojas inoculadas con transcriptos de AR? hechos del F2G3 (ver figura 8) comenzando desde el día 10 dpi. En contraste, la planta no inoculada no mostró ninguna fluorescencia. Los vectores capaces de expresión alta de GFP, por ejemplo, vectores basados en DI 634 de FHV, han sido construidos (figuras 7 y 9) . El desarrollo de la fluorescencia verde (como se muestra en la figura 13, una hoja de una planta inoculada con transcriptos de AR? del 30BGFPC3; comparar con la hoja no inoculada de la figura 14) con estos constructos, es evidencia de que las secuencias de FHV así como la MP y GFP se expresan en tales plantas.

El movimiento a larga distancia de los virus de plantas a través de la planta, se ha demostrado que es dependiente de las proteínas de recubrimiento. Por lo tanto, la distribución sistémica del vector de base FHV, se puede enriquecer además al introducir la proteína de recubrimiento (CP) de un virus de planta dentro del vector. El Cp del virus mosaico necrótico del trébol rojo (RCNMV) , un virus de planta que tiene una estrategia de genoma similar al FHV, se puede así introducir dentro del pF2TmG3 resultando en el pFdTmRcG3 (figura 10) . El RCNMV, es un virus de planta esférico cuyo genoma se divide en dos ARNs mensajeros (Xiong y colaboradores, 1993) . El ARN-1 del RCNMV (3.9 kb) codifica la proteína de recubrimiento (CP, 37 kDa) y el ARN-2 (1.5 kb) codifica la proteína de movimiento del RCNMV (35 kDa) . Las secuencias de MP de TMV, CP de RCNMV y GFP, en los vectores de base FHV, se pueden expresar como proteínas de fusión. Alternativamente, se pueden introducir secuencias de desdoblamiento proteolítico entre estos genes, de manera que las proteínas expresadas se procesen en proteínas individuales posteriores a la traducción. Inicialmente, se colocan las secuencias GFP en la terminación 3', de manera que la expresión de la GFP sea una indicación de la expresión completa de las secuencias en la dirección 5' (esto es, MP de TMV y CP de RCNMV) . Sin embargo, la invención no se limita a ningún orden particular de los genes introducidos. Ejemplo 2 Uso del vector de base FHV para introducir resistencia a enfermedades en las plantas. La resistencia sistémica adquirida (SAR) es uno de los muchos mecanismos de las plantas, que se usa para resistir la infección por patógenos. En el tabaco se inducen de forma coordinada durante el SAR, nueve familias de genes que codifican las proteínas relacionadas con el patógeno (PR) (para una revisión ver Ryals y colaboradores, 1996) . Ciertas proteínas relacionadas con el SAR (PR1 y SAR 8.2) han demostrado suprimir las enfermedades de las plantas en el tabaco provocados por los oomicetos Phytophtora parasí tica (Alexander y colaboradores, 1992; Alexander y colaboradores, 1993, Alexander y colaboradores, 1993) y Pythium torulosum . Así, la introducción de proteínas relacionadas con el SAR por medio de un vector de la invención al tabaco o a la papa, puede ser útil para suprimir o evitar enfermedades de plantas en el tabaco o la papa (por ejemplo, la enfermedad tardía de marchitado que se provoca por el Phytophtora infestans) provocados por los oomicetos.

Para introducir los genes SAR dentro de un vector de la invención, se puede emplear un clon de cADN del gen SAR 8.2 en un plásmido (pCGN1788A) con una secuencia conocida y sitios de restricción (figura 15) . Se amplifica por PCR un fragmento BamHI-SstI de este plásmido que contiene el gen SAR 8.2 (529 bp) y el producto PCR se liga dentro de un vector de base FHV. Las hojas de tabaco o papa de 3-6 semanas de edad, se co- transfectan con ARN derivado del vector y ARN-1 del FHV. La expresión de una proteína de fusión CP:MP: SAR8.2 :GFP, se monitorea a intervalos regulares por la medición de la fluorescencia y RT-PCR. Al comienzo de la expresión del SAR, se inoculan las plantas empapando el suelo o atomizando las hojas con zoosporas de Pythium o Phytophthora (300 esporas por ml)en agua destilada (Alexander y colaboradores, 1993; Chen y colaboradores, 1996) . Las plantas de control que no se transfectan con la quimera FHV-SAR8.2, también se inoculan con zoosporas de una forma similar. Las plantas infectadas se mantienen durante 7-9 días en un invernadero mantenido a una temperatura de 23-25°C con un periodo de luz de 12 horas, y se comparan para la supresión de síntomas de la enfermedad tales como falta de humedad, marchitado o acrobacia .

Ejemplo 3 Uso de un vector derivado del FHV para un mapeo del dominio de una proteína insecticida. El campo emergente de los genómicos funcionales, demanda sistemas de alta producción para prueba de las funciones biológicas supuestas de codificación y secuencias reguladoras de genes. Tres técnicas para las cuales son particularmente útiles los genómicos, incluyen el tratamiento agónico antisentido, interferencia de ARN (cosupresión) y mapeo de dominio de genes mayores (Briggs y colaboradores, 1997; McKusick, 1997; Evans y colaboradores, 1997) . Cuatro genes Pht (una proteína insecticida secretada por la bacteria Photorhabdus luminescens) , de 7-10 kb de longitud, han sido asociados con las propiedades de la toxina pero no se han identificado las secuencias mínimas necesarias para toxicidad. Se conoce el mapa genético de los lugares del complejo de cuatro toxinas tea , teb, tec y ted, (figura 16) . Para determinar cuales regiones de estos genes son necesarias para toxicidad, se introducen secuencias específicas de los genes Pht y combinaciones de los mismos, en un vector de base FHV para separar por exclusión los dominios funcionales de Pht (Bowen y colaboradores, 1988) . En particular, como se ha demostrado la eliminación de tea y teb para eliminar la toxicidad (Bowen, 1988), estos genes se subclonan dentro de un vector derivado del FHV. Inicialmente, se introducen aproximadamente 500-1500 bp fragmentos de genes tea y ted producidos por digestión de restricción parcial o completa dentro del vector. Las plantas de N. ben thamiana , se inoculan con los transcriptos de AR? hechos a partir de estos constructos y la expresión de los genes de toxina se monitorea por la alimentación de partes de las plantas a los insectos {Manduca sexta ) , seguido por la medición de la disminución en el peso de los insectos dentro de 48 horas. Ejemplo 4 Uso de los vectores de la invención para genómicos funcionales de insectos. Con objeto de emplear líneas de célula de insectos o insectos como huéspedes para los vectores de la invención, se seleccionan virus modificados, líneas modificadas de células de insectos o huéspedes de insectos no nativos, por ejemplo, moscas de la fruta, para resistencia al efecto citopático, esto es, lisis después de la infección o transfección. La atenuación del virus por mutación o por pasaje múltiple es uno de los enfoques. Otro enfoque, es seleccionar líneas de células que sobreviven a la lisis. Aproximadamente 1% de las células de Drosophila sobreviven a la lisis después de la infección con FHV y se vuelven persistentemente infectadas. Las células supervivientes que llevan FHV, son resistentes a la sobreinfección por nodavirus y son capaces de multiplicarse en células frescas (Dasgupta y colaboradores, 1994). El análisis de secuencias de los ARNs genómicos del FHV, no muestra mutación en genomas virales durante el establecimiento de la infección persistente, indicando que la modificación en las células de Drosophila (1% de la población total) no en el genoma viral, puede haber conducido a una infección persistente. Un enfoque alternativo es construir un virus híbrido que utiliza secuencias de proteína de recubrimiento del FHV y el NOV. Los ARNs del NOV, se pueden multiplicar en células transfectadas de insectos sin producir los efectos citopáticos (Ball y colaboradores, 1992) . La polimerasa codificada por el ARN-1, reconoce secuencias del FHV o del NOV. Para cualquiera de estos enfoques, un vector de base FHV que tiene un gen de interés o una colección de genes, se introduce dentro de las células huésped por infección/transfección y se detecta un cambio en el fenotipo. Por ejemplo, los genes cuyos productos de proteína conducen al enriquecimiento o eliminación de una enfermedad, cambios en la forma y color de los botones, desarrollo, crecimiento y cambio corporal, y similares, se pueden así identificar y analizar en un periodo corto de tiempo. Ejemplo 5 Referencias Abel y colaboradores, Science, 232:738 (1986). Agranovsky y colaboradores, J. Gen. Virol., 79:889 (1998) . Alexander y colaboradores, Mol. Plant-Microbe Interact, 5:513 (1992). Alexander y colaboradores, Proc, Nati. Acad. Sci. USA, 90:7327 (1993). Alexander y colaboradores, In: Advances in Molecular Genetics of Plant Microbe Interactions . Kluwer Academic Publishers, Netherlands 3:527 (1993). Allison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:1820 (1990) . Bailey and Scott, Nature, 241:545 (London) (1972). Bailey y colaboradores, J. Gen. Virol., 26:15 (1975). Balil, J. Virol., 66:2335 (1992). Barkai-Golan y colaboradores, Arch. Microbiol., 116:119 (1978) . Ball y colaboradores, J. Virol., 66:2326 (1992). Barton y colaboradores, Plant Physiol., 85:1103 (1987). Beachy, Curr. Opm. Biotechnol., 8:187 (1997). Bernal-Lugo and Leopold, Plant Physiol., 98:1207 (1992).

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Claims (64)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un vector recombinante de transferencia de genes que comprende secuencias unidas de ácido nucleico caracterizado porque comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico desde la terminación 5' del ARN-1 del Nodavirus o el ARN-2 del Nodavirus; (b) una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento de ácido nucleico de interés, en donde el segmento de ácido nucleico de interés no es del Nodavirus y comprende una estructura de lectura abierta que codifica una proteína de movimiento del virus de la planta, una proteína de recubrimiento del virus de la planta, una hormona de crecimiento, una toxina, una citoquina, resistencia a la enfermedad, resistencia a las plagas, esterilidad masculina, sitios antigénicos en la superficie de un virus útiles para la producción de vacunas, resistencia a plaguicidas, un gen sintético, una secuencia antisentido de ARN, o una enzima antisentido de ARN y (c) una secuencia de ácido nucleico desde la terminación 3' del ARN-1 del Nodavirus o ARN-2 del
2. Nodavirus, en donde las secuencias unidas se expresan en una célula de plantas, de manera de producir un producto de estructura de lectura abierta o se pueda replicar en presencia del Nodavirus en una célula de planta. 2. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) comprende además un segmento de ácido nucleico que tiene sitios múltiples de clonación.
3. 3. El vector de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una proteína de movimiento del virus de la planta .
4. 4. El vector de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una proteína de recubrimiento del virus de la planta.
5. 5. El vector de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) comprende además un gen marcador o un marcador de selección.
6. 6. El vector de conformidad con la reivindicación 3 o 4 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) comprende además un gen marcador o un marcador de selección.
7. 7. El vector de conformidad con la reivindicación 3 o 5 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) comprende además el ácido nucleico que codifica una proteína de recubrimiento del virus de la planta.
8. 8. El vector de conformidad con la reivindicación 4 o 5 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína de movimiento del virus de la planta.
9. 9. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una proteína de movimiento del virus de la planta.
10. 10. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una proteína de recubrimiento del virus de la planta.
11. 11. El vector de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de (b) codifica un polipéptido de fusión.
12. 12. El vector de conformidad con la reivindicación 7 caracterizado porque el ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión.
13. 13. El vector de conformidad con la reivindicación 8 caracterizado porque el ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión.
14. 14. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque es ARN.
15. 15. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la estructura de lectura abierta está en una orientación antisentido en relación a la secuencia de ácido nucleico de (a) y (c) .
16. 16. El vector de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de movimiento del virus mosaico del tabaco.
17. 17. El vector de conformidad con la reivindicación 8 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de movimiento del virus mosaico del tabaco.
18. 18. El vector de conformidad con la reivindicación 9 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de movimiento del virus mosaico del tabaco.
19. 19. El vector de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una toxina.
20. 20. El vector de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una toxina Photorhabdus Luminiscens, toxina Xenorhabdus, toxina Botulinum o toxina cholera .
21. 21. Una composición de ácido nucleico caracterizada porque comprende : (a) una cantidad de ARN-1 del Nodavirus; y (b) una cantidad del vector de la reivindicación 14.
22. 22. Una composición de ácido nucleico caracterizada porque comprende: (a) una cantidad de ARN-1 del Nodavirus; y (b) una cantidad de una molécula recombinante de ARN que comprende secuencias unidas de ARN que comprenden: ARN de la terminación 5' del ARN-1 del Nodavirus o ARN-2 del Nodavirus; ARN que codifica una proteína de movimiento del virus de la planta; y ARN de la terminación 3' del ARN-1 del Nodavirus o el ARN-2 del nodavirus.
23. 23. Una composición de ácido nucleico caracterizada porque comprende: (a) una cantidad de ARN-1 del Nodavirus; y (b) una cantidad de una molécula recombinante de ARN que comprende secuencias unidas de ARN que comprenden: ARN de la terminación 5' del ARN-1 del Nodavirus o ARN-2 del Nodavirus; ARN que codifica una proteína de recubrimiento del virus de la planta; y ARN de la terminación 3' del ARN-1 del Nodavirus o el ARN-2 del Nodavirus.
24. 24. Un método para la expresión de una proteína codificada por una molécula de ARN recombinante en una célula huésped, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la célula huésped con una cantidad de la composición de la reivindicación 22 o 23; y (b) detectar o determinar si la proteína se expresa.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la célula huésped es una célula dicotiledónea .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la célula huésped es una célula monocotiledónea .
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la célula huésped es una célula de insectos.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque la célula huésped es una célula animal.
29. 29. Un método de expresión de una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento de ácido nucleico en una célula huésped, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la célula huésped con una cantidad del vector de la reivindicación 1; y (b) detectar o determinar si el segmento de ácido nucleico se expresa.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29 caracterizado porque la célula huésped es una célula dicotiledónea.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29 caracterizado porque la célula huésped es una célula monocotiledónea .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29 caracterizado porque la célula huésped es una célula de insecto.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29 caracterizado porque la célula huésped es una célula animal .
34. 34. Un método de introducción de una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento de ácido nucleico dentro de una planta, caracterizado porque comprende: poner en contacto una planta con una cantidad del vector de la reivindicación 1 de manera de producir una planta, las células de la cual comprenden al vector de la reivindicación 1.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34 caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una hormona de crecimiento, una toxina, una citoquina, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, esterilidad masculina o resistencia a plaguicidas.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34 caracterizado porque la planta se pone en contacto por atomización o frotación.
37. 37. Un método para introducir una molécula recombinante de ARN dentro de una planta, caracterizado porque comprende: poner en contacto una planta con una cantidad de la composición de la reivindicación 22 o 23, de manera de resultar una planta, las células de la cual comprenden la molécula recombinante de ARN.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37 caracterizado porque la molécula de ARN recombinante codifica una hormona de crecimiento, una toxina, una citoquina, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, esterilidad masculina o resistencia a plaguicidas .
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 37 caracterizado porque la planta se pone en contacto por atomización o frotación.
40. 40. Un método para introducir un segmento de ácido nucleico a una célula animal caracterizado porque comprende : (a) hacer contacto de una célula animal con una cantidad del vector de la reivindicación 1; y (b) detectar o determinar la presencia de un segmento de ácido nucleico en la célula animal.
41. 41. Un método para introducir un segmento de ácido nucleico a una célula de insecto caracterizado porque comprende : (a) hacer contacto de una célula de insecto con una cantidad del vector de la reivindicación 1; y (b) detectar o determinar la presencia del segmento de ácido nucleico en la célula de insecto.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40 o 41, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica una hormona de crecimiento, una toxina o una citoquina.
43. 43. Un Nodavirus recombinante, caracterizado porque comprende: una primera molécula de ARN que es infecciosa; y una segunda molécula recombinante de ARN que codifica una proteína de recubrimiento viral, una proteína de movimiento viral o una combinación de las mismas.
44. 44. Una planta transgénica, el genoma de la cual está caracterizado porque aumenta con el vector de la reivindicación 1.
45. 45. Una parte de planta de la planta de la reivindicación 44.
46. 46. La parte de planta de la reivindicación 45 caracterizada porque es una semilla.
47. 47. Una planta caracterizada porque es producida por la semilla de la reivindicación 46.
48. 48. Una planta, caracterizada porque se produce por el método de la reivindicación 34.
49. 49. Una parte de planta, caracterizada porque se produce por la planta de la reivindicación 48.
50. 50. La parte de planta de la reivindicación 49 caracterizada porque es una semilla.
51. 51. Una planta, caracterizada porque se produce por la semilla de la reivindicación 50.
52. 52. Una planta, caracterizada porque se produce por el método de la reivindicación 35.
53. 53. Una parte de planta, caracterizada porque se produce por la planta de la reivindicación 52.
54. 54. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque es una semilla.
55. 55. Una planta, caracterizada porque se produce por la semilla de la reivindicación 54.
56. 56. El vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de recubrimiento del virus mosaico necrótico del trébol rojo.
57. 57. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de recubrimiento del virus mosaico necrótico del trébol rojo.
58. 58. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico codifica la proteína de recubrimiento del virus mosaico necrotico del trébol rojo.
59. 59. Una planta transgénica que hace contacto con un Nodavirus, caracterizada porque el genoma de la planta se aumenta con una proteína de recubrimiento del virus mosaico del tabaco que codifica el ADN.
60. 60. Una planta transgénica que hace contacto con el vector de la reivindicación 1, caracterizada porque el genoma de la planta se aumenta con una proteína de recubrimiento del virus mosaico del tabaco que codifica el ADN.
61. 61. Una planta transgénica que hace contacto con un Nodavirus, caracterizada porque el genoma de la planta se aumenta con una proteína de recubrimiento del virus mosaico necrótico del trébol rojo que codifica el ADN.
62. 62. Una planta transgénica que hace contacto con el vector de la reivindicación 1, caracterizada porque el genoma de la planta se aumenta con una proteína de recubrimiento del virus mosaico del tabaco que codifica el ADN.
63. 63. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 59, 60, 61 o 62, caracterizada porque es Nicotiana benthamiana .
64. 64. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 59 o 61, caracterizada porque hace contacto con un nodavirus.