JP4527527B2

JP4527527B2 - 植物での創傷誘導発現

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Publication number: JP4527527B2
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Description

発明は殺虫タンパク質の発現局所発現を誘導する創傷誘導性プロモーター、好ましくは創傷誘導性ＴＲ２’プロモーターにより制御される植物の製造方法、この方法で使用するキメラ遺伝子、およびその方法により獲得する植物、ならびに昆虫の摂食による植物の創傷から誘導される殺虫性タンパク質の局所発現により、植物に昆虫による摂食に対する耐性を獲得させるプロセスに関する。

昆虫の攻撃に耐性である植物を作製する最も効果的な方法が、殺虫毒素の高レベル発現によって得られており、またそれに依存すると信じられている（Estruchら、1997年; WitoskyおよびSiegfried、1997年）。最も具体的には、植物での発現が低いことが分かっているＢｔ毒素に関して、強力な構成的プロモーターを使用すること、およびそれらをコードしている遺伝子を修飾することによって植物に於けるこれら毒素の発現を高める努力が集中して行われている（Vack et al., 1987; Bartonら、1987年）。最近、昆虫の摂食による攻撃に感受性であるか、または昆虫の摂食がきっかけとなる感受性組織において、殺虫性タンパク質の発現を空間的に制御することが耐性管理に有益である可能性が示唆されている（PeferonおよびVan Rie、 1997年）。トランスジェニック昆虫耐性植物について法的承認を得る上で重要となる条件の一つは、昆虫耐性管理戦略の有効性である。現在よく採用されている戦略は、害虫の全生活環を通して特異的毒素および上記の高用量発現させ、これによりトランスジェニック植物に標的害虫に対し１００％毒性を獲得させることと、標的害虫集団が生存可能な非トランスジェニック植物を待避させることとの組み合わせである（De Maagdら、1999年）。このような戦略を忠実に行なうためには、昆虫耐性植物構築に強力な構成的プロモーターを用いることが奨励されている。

昆虫耐性の誘導発現は、植物に於ける天然の防御システムの一つであり、創傷によって植物全体に浸透するシグナルを確実に生じせしめるポテトプロテアーゼ阻害因子遺伝子（ｐｉｎ１およびｐｉｎ２）で検証されている（GreenおよびRyan, 1972年; Hilderら、1987年）。コメにｐｉｎ２遺伝子を導入したところ、コメ植物全体に主要な害虫に対する耐性を高めるタンパク質が高レベルに蓄積した（Duan et al., 1996年）。Breitlerら（2001年）はトウモロコシプロテアーゼ阻害因子（ＭＰＩ）遺伝子のＣ１領域の使用がコメにｃｒｙ１Ｂコード配列の創傷誘導発現を誘導したこと、および初代形質転換体がキクイムシの攻撃からコメを効果的に防御することを見出し、創傷誘導発現が局所および植物全体の両方で起こることを記載している。

小スケールの研究室実験では、ｃｒｙ１Ａｂ３遺伝子を大豆由来の誘導性ｖｓｐＢプロモーターの下流に配置して形質転換したトランスジェニックキャベツの葉が３５Ｓプロモーターの制御下にある同一遺伝子で形質転換したものと同様にコナガに対して有毒であったが、創傷誘導性は証明されていない（Jinら、2000年）。

Agrobacterium tumefaciensのマンノピン合成酵素遺伝子のＴＲ２’プロモーターは本来構成的発現を支配するものと考えられているが（Veltenら、1984年; Vaeckら、1987年）、これを用いてトマトに未変性のＣｒｙ１Ａｂ遺伝子の創傷誘導性発現を起こさせたところ、発現は比較的低く、弱い昆虫制御効果しか得られなかった（Reynaerts & Jansens, 1994年）。Ｂｔタンパク質の発現については広い応用が示唆されているが（Peferoen, 1997）、タバコおよびその他双子葉植物でのＴＲ’２プロモーターの発現パターンに関する報告には矛盾があるように思われる（Ni et al.1995年）。一般的には、単子葉植物での遺伝子の最適発現には、単子葉植物プロモーターの使用が好ましく（Shimamoto、1994年）、ある種のプロモーターが単子葉植物および双子葉植物に様々なシス−作用エレメントを有していることが見出されている（Luanら、1992年）。その活性へのＴＲ２’プロモーターの各種エレメントの関わり方については、トウモロコシのプロトプラストで研究され（Foxら、1992年）が、単子葉植物でのＴＲ２’プロモーターの発現パターンについての報告はない。さらに、最も強力な欠失突然変異体はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに比べ２０倍活性が低いことが見出された（Foxら、1992年）。

Agrobacteriumマンノピン合成酵素プロモーターは、構成的な、根特異的および組織特異的プロモーターであることを特徴とするものであり、例えば米国特許第６２９１７４５号、第６３２０１００号および第６３１３３３７８号明細書を見よ。米国特許第５６４１６６４号明細書では、形質転換双子葉植物での遺伝子の直接発現に用いられる各種構成的および器官−および組織−特異的プロモーターは、形質転換単子葉植物での使用にも適していると信じられている。この特許の中の植物細胞の形質転換に好適な外来性構成的プロモーターの一般的リストの一部として、AgrobacteriumのＴ−ＤＮＡの１’および２’をそれぞれ発現させるＴＲ１’およびＴＲ２’プロモーターが記載され、創傷誘導プロモーターと呼ばれている。この特許はＴＲ２’またはＴＲ１’プロモーターで形質転換された単子葉植物は示しておらず、またこれらプロモーターが単子葉植物の創傷誘導プロモーターであること、または単子葉植物での殺虫性タンパク質の発現にとって有用であることも示唆していない。

本発明はＴＲ２’プロモーターを単子葉植物に殺虫性タンパク質を創傷誘導発現させ、昆虫耐性を獲得する方法を記載する。ＴＲ２’プロモーターのこの様な創傷誘導発現は、強力ではあるが、局所的であるな殺虫性タンパク質発現増加をもたらす。特に同系交配を繰り返した時に、一部Ｂｔタンパク質の高レベル発現に伴い観察される（例えばＣｒｙ２Ａｂに関する国際特許出願ＷＯ００／２６３７８号）植物の活力および成長に予想される影響は、タンパク質の発現が限定的であることで、組換え穀物の品質維持に重要な機能への負荷量が軽減されることにより最小限に食い止められると考えられている。このことは各種形質（または各種Ｂｔタンパク質）の積重ねを期待する場合にも重要な要因である。標的害虫と接触することで高い用量発現レベルが獲得される場合は、かかる植物は現行のＩＲＭ戦略を遵守すべきである。さらに産生される昆虫毒素の特異性と、空間的および時間的に限定された発現パターン（即ち創傷感受性組織内に、創傷により発現する）とが組合さることで標的外の生物への暴露を小さくできると思われるが、このことは植物による毒素の構成的産生にとって有益であると考えられる。即ち、トウモロコシやコメといった主要穀物について効果的な昆虫耐性を保証する有効な制御発現システムは、規制および農業の両観点から興味深い。

本発明は単子葉植物での殺虫性タンパク質の創傷誘導発現を獲得する方法に関するものであるが、この方法はＴＲ２’プロモーターを含むプロモーター領域の制御下に殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子である外来ＤＮＡを植物ゲノム内に導入することを含む。発明の具体的実施態様によれば、殺虫性タンパク質はBacillus thuringiensis毒素である。本発明の好ましい実施態様では、殺虫性タンパク質は単子葉植物害虫に対し作用する殺虫性タンパク質であり、最も好ましくは、殺虫性タンパク質はＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ９ＣもしくはＣｒｙ２Ａｂタンパク質またはその殺虫性断片もしくは突然変異体である。

即ち、本発明の好適実施態様は、植物、植物細胞または植物組織の中に、より具体的には単子葉植物、特にイネ科植物、特にはトウモロコシの植物、植物細胞または植物組織の中に、植物、植物細胞もしくは組織に、ＴＲ２’プロモーターを含むプロモーター領域の制御下に殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む外来ＤＮＡを提供することにより、昆虫耐性、好ましくは高用量昆虫耐性を獲得する方法に関する。本発明によれば、ＴＲ２’プロモーターは創傷、例えば昆虫による摂食により殺虫性タンパク質の発現を高めるのに用いる。即ち、発明の特定実施態様によれば、創傷が無いか、または摂食されない場合には、単子葉植物での殺虫性タンパク質の発現は、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイにより温室内で測定するとき、葉では低く（即ち総可溶性タンパク質の０．００５％未満（同一形質転換イベントについて複数本、少なくとも３本、特には少なくとも５本の植物について行った多重測定の平均値）、創傷が有るか、または摂食された組織、特に葉では２４時間以内に増加し、好ましくは２倍、最も好ましくは５〜１００倍に増加する。

本発明の好ましい実施態様によれば、創傷誘導ＴＲ２’プロモーターの制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子を用いて、昆虫摂食部位に殺虫性タンパク質の局所発現を命ずることにより、単子葉植物、特にイネ科植物、最も特にはトウモロコシに昆虫耐性を付与する。即ち発明は単子葉植物に於いて創傷誘導性発現を獲得するためのキメラ遺伝子に関する。発明の具体的実施態様では（温室内で測定した場合）、創傷が無いか昆虫が付着していない植物の葉では発現が低いか、または検出できず（全可溶性タンパク質の０．００５％未満（同一形質転換イベントについて複数本、少なくとも３本、特には少なくとも５本の植物について行った多重測定の平均値）、そして感染により殺虫性タンパク質のレベル増加（少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５〜１００倍増加またはそれ以上）が、１８時間以内に、感染組織内に局所性に誘導される。発明のこの側面では、それらのゲノム中に殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む外来ＤＮＡが存在することにより昆虫耐性である、創傷組織内での発現を確実にするＴＲ’２プロモーターの制御下にある植物、より具体的には単子葉植物を提供する。発明の実施態様の一つによれば、植物での殺虫性タンパク質の発現は、植物の創傷がない時には（例えば温室内で栽培するとき）、殺虫性タンパク質の葉、茎、種子および花粉、好ましくは少なくとも葉および花粉、特には少なくとも葉での発現は低いか、または検出不能レベル（即ち全可溶性タンパク質（同一イベントについて複数、好ましくは少なくとも３個体、特には少なくとも５個体の植物より得た多重測定値の平均）の０．００５％以下）であり、昆虫による摂食によって創傷組織、好ましくは少なくとも葉に於いて摂食害虫を死滅させるのに十分なレベル、好ましくは全可溶性タンパク質の少なくとも０．０１％の濃度まで増加するものである。

発明の好適実施態様によれば、ＴＲ’２プロモーターは単子葉植物に用いられ、Ｂｔ毒素である殺虫性タンパク質の創傷誘導発現を命ずることにより、昆虫耐性を付与する。Ｂｔ毒素をコードするＤＮＡ配列の例は、当分野周知であり、本明細書に記載されている。

本発明の実施態様の一つによれば、トウモロコシでのＴＲ２’プロモーターを用いたＢｔ毒素の創傷誘導発現の使用は、標的昆虫の摂食による植物内での局所的な高用量毒素発現を基礎とする、アワノメイガ（ＥＣＢ）に対するトウモロコシの耐性の遺伝子工学に特に適している。遺伝子の中にＴＲ２’プロモーターの制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む外来ＤＮＡを含む本発明の植物または植物の一部分（細胞または組織）は、創傷によってＥＣＢの幼虫、特には本明細書に記載の昆虫効力アッセイによって決定できる第４ステージのＥＣＢ幼虫に対し毒性であるレベルの殺虫性タンパク質を産生する。好ましくは、ＥＣＢ第四段齢幼虫死亡率少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％を得る。

本発明はさらに、昆虫に対しては耐性でありながら、一方で植物の無創傷の葉では殺虫タンパク質の発現が極めて低い基礎レベルである単子葉植物に関する。本発明の特定の側面では、植物の表現形、分離、発生、活力および作物の等級を評価することで確認できる最適な作物学的特性と効果的な昆虫耐性を併せ持つと同時に、殺虫タンパク質の発現によって作物特性を犠牲にすることの無い単子葉植物、より具体的にはトウモロコシを得る。

本発明の別の側面によれば、昆虫耐性であり、そしてその他形質（例えば他のタイプの昆虫耐性、除草剤耐性または作物形質）に積重ねるのに特に好適である単子葉植物、具体的にはトウモロコシを得る。

発明の別の側面は、標的害虫に対して耐性であるが無創傷時には殺虫性タンパク質の産生が、好ましくは葉および花粉において、特に葉において検出不能なほど低く、標的外生物が殺虫性タンパク質に暴露することが限定的である単子葉植物、特にトウモロコシを提供する。

本発明によれば、上記特性を持つ植物は、単子葉植物、より具体的にはトウモロコシに於いて創傷誘導プロモーターとして機能することが実証されているＴＲ’２プロモーターの制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を植物ゲノム無いに導入することで得られる。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」とはプロモーター領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、コーディング領域（タンパク質をコードしても、またはしなくともよい）、ポリアデニル化サイトを含む非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ）といった複数の作動性に連結したＤＮＡ断片を含むＤＮＡ配列を表す。一般に植物細胞では５’ＵＴＲ、コーディング領域および３’ＵＴＲは、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、コーディング領域がタンパク質に翻訳されるＲＮＡに転写される。遺伝子は、例えばイントロンのような追加のＤＮＡを含んでもよい。本発明の形質転換に用いる遺伝子にはプロモーター領域が必要ではあり、ポリアデニル化サイトを含む３’ＵＴＲが移入遺伝子そのものの中に存在する必要はないが、ポリアデニル化サイトを含む３’ＵＴＲを含有しない遺伝子を挿入した後に上流の植物ＤＮＡ配列にポリアデニル化サイトを含む３’ＵＴＲが見いだすことができる。同様に、本発明のコーディング配列を植物ゲノム内にある既存の植物プロモーターの下流に挿入することができ、その結果発明の殺虫性タンパク質の発現は植物内のかかる再構成キメラ遺伝子より起こる（例えばプロモータータギング（promoter rtagging）実験でのように）。

用語「キメラ」とは、遺伝子またはＤＮＡ配列に関連する場合には、天然は互いに結合せず、そして／または例えば異なる供給源に由来する少なくとも２つの機能的に関連するＤＮＡ断片（プロモーター、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロンのような）を含む遺伝子またはＤＮＡ配列を意味する。「外来」とは、植物種に関連する遺伝子またはＤＮＡ配列に関連する場合には、その植物種に天然には見いだされない、あるいはその植物種の遺伝子座には天然に見いだせない遺伝子またはＤＮＡ配列を示すのに用いられる。用語「外来ＤＮＡ」は、本明細書ではその植物での形質転換の結果として植物ゲノムの中またはその植物の子孫の中に取込まれたＤＮＡ配列を表す。

ここで用いる場合、植物、植物組織または植物細胞のゲノムとは植物、植物組織または植物細胞内の遺伝物質を表し、核ならびにプラスチドおよびミトコンドリアゲノムを包含する。

本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子またはタンパク質配列の「断片」または「断端」とは、参照された元のＤＮＡまたはタンパク質配列（核酸またはアミノ酸配列）もしくはその合成体（植物での最適発現に合わせた配列のような）の一部分であって、様々な長さを有するが、その最小サイズはタンパク質が生物学的に活性であることを保証するのに十分なものであり、最大サイズは重要ではないような部分を意味する。配列の「変異体」または「突然変異体」とは、ここでは配列（核酸またはアミノ酸）が、用語が参照する配列と実質同一であるＤＮＡ分子またはタンパク質を表す。

「実質同一」である配列とは、２つの配列を並置したときに、配列同一率、即ちヌクレオチドまたはアミノ酸が同一である位置の数を、短い方の配列のヌクレオチドもしくはアミノ酸数で除したものは、７０％より高く、好ましくは８５％より高く、より好ましくは９０％より高く、特に好ましくは９５％より高く、最も好ましくは９６〜１００％の間である。２ヌクレオチド配列の並置は、WilburとLipmann (1983年）が記した、２０ヌクレオチドのウインドウサイズ、４ヌクレオチドのワード長、およびギャップペナルティー４を用いたアルゴリズムにより実施される。

ここで使用する「殺虫性」とは、トウモロコシの害虫である昆虫に対する毒性を意味する。より具体的には、本発明の流れの中では、標的昆虫はOstrinia nubilalis（アワノメイガまたはＥＣＢ）、Sesamia nonagrioides（地中海茎食いムシ）およびHelicoverpazea（オオタバコガ）といった主要な鱗翅目害虫、ならびにコーンルートワーム（Diabrotica spp.）、特にDiabrotica virgifera virgiferaおよびDiabrotica undecimpunctata howardi（コーンルーツワーム）といった主要コウチョウ目といった単子葉植物、最も特にはトウモロコシの害虫であるが、これらに限定されるものではない。

本明細書に使用する場合、「殺虫性タンパク質」または「毒素」は、昆虫に対し有毒であるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとして理解すべきである。かかる殺虫性タンパク質の例は、ＢｔＣｒｙ毒素、その突然変異体または殺虫性断片（例えばHofteとHhitely、1989年、Crcckmoreら、（1998年）によりレビューされているもの、ならびに国際特許出願番号ＷＯ００／２６３７８明細書、ＷＯ９７／４０１６２明細書、および米国特許番号第６、０２３、０１３号明細書に記載のもの）、より具体的にはＣｒｙ２Ａｅ（国際特許出願番号ＷＯ０２／０５７６６４）タンパク質、またはその殺虫性断片、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質またはその殺虫性断片、Ｃｒｙ９Ｃタンパク質またはその断片もしくは突然変異体（例えば国際特許出願番号ＷＯ９４／２４２６４明細書または国際特許出願番号ＷＯ９９／００４０７明細書）、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質またはその殺虫性断片、およびＣｒｙ１Ａｂタンパク質またはその殺虫性断片、ならびに１４９Ｂ１複合（約１４および４４キロダルトン）毒素またはその殺虫性断片、および米国特許第６、５４８、２９１号明細書、第６，０６３、５９７号明細書および第６、５０１、００９号明細書に記載のＣｒｙ３ｂタンパク質およびその殺虫性断片もしくは突然変異体。他の殺虫性タンパク質は、例えばＶＩＰ類、特にＶＩＰ３Ａ、より具体的にはＶＩＰ３Ａａ、ＶＩＰ３ＡｂおよびＶＩＰ３Ａｃタンパク質もしくはその殺虫性断片（Estruchら、1996年、国際特許出願番号ＷＯ９６・１００８３明細書、米国特許番号第６、４２９、３６０号明細書、第５、８７７、０１２号明細書）あるいはｍｉｓ、ｗａｒおよびｓｕｐ配列にコードされるタンパク質（国際特許出願番号ＷＯ９８／１８９３２明細書、国際特許出願番号ＷＯ９９／５７２８２明細書）、ならびにPhotorabudus luminescens産生毒素（Forstら、1997年）のようなXhenorabdusおよびPhotorabdus sppより単離された毒素がある。その他殺虫性タンパク質としては、ジャガイモプロテアーゼインヒビターＩおよびＩＩ、ササゲプロテアーゼインヒビター、ダイズのシステインプロテアーゼインヒビター（Zhaoら、1996年）またはコメおよびトウモロコシから単離されるシスタチンのようなシスタチン（Irieら、1996年）、コレステロール酸化酵素、キチナーゼ、ならびにレクチンを挙げることができるが、これらに限定されない。殺虫性タンパク質はプロトキシン（即ち殺虫性タンパク質をコードする全長遺伝子の一次翻訳産物）であろう。また殺虫活性を有する、上記いずれかのタンパク質の均等物および変異体、誘導体、断端またはハイブリッドも包含する。Ｂｔ毒素、またはＢｔタンパク質は、本明細書で使用する場合には、Bacillus thuringiensisが天然に産生するタンパク質より直接または間接的に誘導され、そして天然に産生するＢｔ毒素の有毒断片、または少なくともそのドメインと実質同一である配列を含む、上記殺虫性タンパク質を表す。Ｂｔ毒素またはＢｔタンパク質は、本明細書で使用する場合は、結晶タンパク質もしくはその殺虫性部分、または分泌タンパク質もしくはＢｔ株の植物期に主に産生するタンパク質のような非結晶性タンパク質、あるいは殺虫性突然変異体またはその一部分でなければならない。本明細書で使用する場合、「殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ」としては殺虫性タンパク質をコードする断端、修飾、合成または天然のＤＮＡ配列が挙げられる。

本発明の特定の実施態様では、殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡは、Ｂｔ毒素をコードするＤＮＡ配列、より好ましくは植物内での殺虫性タンパク質発現を増加するよう修飾されたＤＮＡ配列である。本発明の特定実施態様によれば、殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、少なくともHofteら（1986年）が記載のＣｒｙ１Ａｂ５タンパク質部分をコードする修飾ｃｒｙ１ＡｂＤＮＡ配列であり、好ましくはアミノ酸位置１〜２８の間にアミノ酸位置から、そのアミノ酸位置６０７〜７２５の間のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、最も好ましくはアミノ酸１〜６１６を含む。最も好ましくは、コードされた修飾型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質はＡＴＧ開始コドンの後ろにアラニンコドン（ＧＣＴ）の挿入を有する（AlaAsp2...Asp616）。

植物材料での殺虫性タンパク質の発現レベルは、例えば組織内に産生した殺虫性タンパク質をコードするｍＲＮＡの特異的プライマーを用いた定量（CornelissenとVandewiele、1989年により記載されたような）または、例えば免疫学的検出方法による、産生された殺虫性タンパク質の量を直接特異的に検出するといった当分野記載の様々な方法により決定できる。より具体的には、本発明によれば、殺虫性タンパク質の発現レベルは、可溶性タンパク質の総量（例えばBradford分析 (Bradford、1976年）により決定される）に対する、ここに記載される免疫特異的ＥＬＩＳＡにより決定される可溶性殺虫性タンパク質のパーセンテージとして表される。本発明で好ましいＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡ（Clarkら、1986年）である。

本明細書で使用する場合、「創傷誘導性」プロモーターまたは創傷誘導的である発現パターンを導くプロモーターは、少なくとも葉では、創傷によって上記プロモーター制御下にあるコーディング配列の発現を有意に増加する、即ち少なくとも２倍、好ましくは５倍の増加、最も好ましくは２０〜１００倍増加させることを意味する。ここで用いる「創傷」とは、いずれかの種類の昆虫摂食による、少なくとも植物上皮または外細胞層の機械的損傷または穿孔を意味し、またここで用いる創傷は小刀のような鋭利な道具で葉を切ることによっても模擬できる。好ましくは、本発明によれば、殺虫性タンパク質、好ましくはＢｔ殺虫性タンパク質の植物での創傷誘導発現は、Ｖ４ステージの植物の葉におけるタンパク質の基礎発現（即ち創傷のない状態で、好ましくは温室内にて測定されたもの）が低く、最も好ましくは全可溶性タンパク質含有量の０．００５％以下であり（１つの形質転換イベントについて数個体の植物について行った測定の平均値）、そして創傷により、創傷を加えさらにin vitroで数時間、例えば約１２〜約６０時間、好ましくは約１８〜約２０時間インキュベーションした後に収集した葉の部分を用いて測定したときに、好ましくは全可溶性タンパク質の総量の０．０１％より高いレベル、より好ましくは全タンパク質含有量の０．０４〜０．５％のレベル以上に上昇することを意味する。創傷後に室温にて数時間、好ましくは約１２〜６０時間、より好ましくは約１８〜２０時間、温室または生育チャンバー内で、切除した葉をin vitroアッセイして測定すると（昆虫の摂食による状態をよりよく反映するため）、植物に創傷し、切り取った葉またはその一部をin vitroインキュベーションせずに測定した場合に比べ高い発現が誘導されるだろう。創傷後の植物組織、好ましくは葉の殺虫性タンパク質濃度の測定およびここに記載の発現増加の測定に関しては、in vitroでインキュベーションを利用した切除組織、好ましくは葉のアッセイを用いるのが好ましいが、これは昆虫の摂食により組織内に誘導される実濃度をよりよく反映すると考えられるからである（コントロールの葉は、新鮮な、創傷のない、植物組織内の実濃度をよりよく反映するためのin vitroインキュベーションを行ったものである）。創傷誘導プロモーターの基礎またはバックグランド発現レベルは、本明細書で用いる場合には、温室栽培植物より採取した、新たに切除した、事前創傷のない葉材料について測定されることが好ましい。発明の特定実施態様によれば、少なくとも創傷のある葉における殺虫性タンパク質の発現は、創傷部位に於いて全可溶性タンパク質含有量の０．１％まで上昇する。昆虫の摂食活動によって昆虫が実際に摂取する、本発明による全可溶性タンパク質当たりの殺虫性タンパク質のパーセンテージは、発現が局所性であること、そして昆虫により摂取されたのは誘導（創傷）組織のみであろうという事実から、昆虫によって摂取されている植物全体またはその一部について測定されるパーセンテージより高いと信じられている。また、タンパク質濃度の測定では、植物組織の特定最低量を切除し（葉の場合、一般には創傷周囲２〜３mmを切り取る）殺虫性タンパク質含有量分析を行うため、非創傷細胞の存在によりサンプルより抽出した全可溶性タンパク質当たりの殺虫性タンパク質のパーセンテージは下がると信じられている。

この種の形質転換実験でよく観察される如く、形質転換後には広範な植物の形質転換イベントが得られることから、その後の発生（即ち、特定の生育領域に適合した好適植物系統に交配にとって）にとって最適な植物を選択する手順が選ばれる。このような選択手順では、植物組織内、好ましくは葉および花粉、最も好ましくは葉で低いか、または検出不可能なタンパク質レベルを示す植物であって、創傷誘導により植物が少なくとも５倍高い葉で発現を示す植物を選ぶ。

本明細書で使用する場合、「温室」とは通常の野外条件から植物を遮断し、昆虫、ウサギ、トリまたはその他動物による摂食、あるいは野外で作物を損傷することがある外部要因（風または嵐など）が無いか、またはほとんど無い植物にとって比較的安定した生育環境を表す。典型的な温室は、ガラスまたはプラスチックといった透明な材料を使って作られており、そのため日光が植物に到達でき、光、生育媒体（土壌または人工培養土）、水および栄養の供給ならびに／または温度制御を制御できるものである。ここで用いる温室には、正常な植物生育条件が確率できる光源および生育媒体が提供される限りにおいて、日光が入らない部屋または箱も含まれる。このように温室は、比較を目的とする、本発明の創傷誘導構築体について葉での基礎またはバックグランド（非誘導状態での）の発現レベルを測定する上で最適な場所である。

殺虫性タンパク質の同様の基礎またはバックグランド発現値は、野外の植物の葉でも見いだせるが、野外の植物に加えられる昆虫による摂食または機械的損傷、例えば乗物、ウサギまたは植物によって加えられる摂食または機械的損傷が本発明の創傷誘導性プロモーターの誘導による発現レベルを高め、その結果真の基礎レベルではない値が野外の全植物で典型的に測定されることが予想される。

本明細書において植物、好ましくは本発明の単子葉植物を参照しながら使用する場合、「高用量」発現または「高用量」昆虫耐性とは、感受性が有意に低い、好ましくは昆虫の第１幼虫期に比べ毒素に対し２５〜１００倍感受性が低く、従って標的昆虫を確実な完全制御が期待できる、発生段階の標的昆虫を死滅させる植物内の殺虫性タンパク質の濃度（ＥＬＩＳＡを用いて全可溶性タンパク質のパーセンテージとして測定し、この場合の全可溶性タンパク質は抽出緩衝液（例えばJansensら、1997年に記載の抽出緩衝液）中に可溶性タンパク質を中質した後にBradford分析（Bio-Rad、Richmond、CA; Bradford、1976年）を用いて測定する）を指し、高用量昆虫耐性は標準的な昆虫バイオアッセイに於いてかかる植物を昆虫に摂食させた後１０〜１４日目に測定した時、標的昆虫の第４幼虫齢（５幼虫齢の昆虫について）または最終幼虫齢（第４以下の昆虫齢の昆虫）の死亡率に関し少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％を獲得するのが最も好ましい。本発明の形質転換植物が高用量昆虫耐性を示す標的昆虫種（即ちある植物種または変種に商業的に重大な損害を与えることがある昆虫であり、そして典型的にはそれに対するトランスジェニック植物が開発されている昆虫）が１つ存在していれさえすれば、本発明ではその植物を「高用量」発現とする。さらに、植物内に存在するか、またはin vitro培養内に存在するかに関わらず、昆虫バイオアッセイを用いた時に上記の高用量昆虫耐性発明が示される、創傷誘導キメラ遺伝子を用い形質転換した植物細胞または植物組織、特にトウモロコシ植物細胞または植物組織も本発明に包含される。

本明細書で使用する場合、トウモロコシでのＥＣＢ制御参照時の高用量とは、ここに記載する人工的な摂食を利用した毒性アッセイにより決定できる様な量の、輪生中期段階にある植物がＬ４ステージのＥＣＢ幼虫に対し毒性である殺虫性タンパク質を産生することを意味し（European Corn Borer.Ecology and Management.1996.North Cetnral Regional Extension Publication No.327.Iowa State University, Ames, Iowa）、アッセイではＬ４幼虫に植物を摂食させた後、試験１４日目、好ましくは１０日目に少なくともＬ４のＥＣＢ幼虫の死亡率９０％、好ましくは少なくとも９７、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％を得る。驚くべきことに非誘導状態に於いては高感度ＥＬＩＳＡプロトコルにより発現が低いか検出できない例でも、ＴＲ２’プロモーターを用いて創傷誘導発現を作動した発明のトウモロコシ植物では殺虫性タンパク質の高用量発現が得られ、発現は昆虫の摂食によってのみ誘導される。植物の形質転換実験に広く見られる如く、形質転換により得た一部の植物はその後の発生に好適でないため、獲得した形質転換植物から基礎またはバックグランドの発現が低く、高用量の創傷誘導発現を示す好適植物系統を選別する必要があり、そして好ましくはそのような植物系統は殺虫性タンパク質をコードする挿入ＤＮＡを一つだけ含有する。典型的には、商業的に許容可能な植物系統は、１００を超える、好ましくは数百の初期形質転換植物から獲得する。

本発明によれば、「創傷誘導」発現はさらにプロモーターの効果が局所的である、即ち創傷の影響を直接受ける細胞または組織、または創傷組織の直近の周囲にある細胞または組織に実質制限されるという好ましい特徴を有する。これは、広範囲の効果を直接または間接的（反応カスケードを通じて）に及ぼす全身性効果、より具体的には植物の天然の防御メカニズムに含まれる広範囲のタンパク質発現とは相対するものである。好ましくは、植物の非損傷組織での殺虫性タンパク質の発現は、温室栽培植物についてＥＬＩＳＡ（上記参照）を用い測定した時に、平均で全可溶性タンパク質濃度の０．０１％を超えず、より好ましくは全可溶性タンパク質の０．００５％を超えない（１形質転換イベントについて複数、好ましくは少なくとも３、特には少なくとも５個体の植物について行った多重測定の平均値）。本発明の好適実施態様では、葉、特にトウモロコシの葉での創傷誘導プロモーター活性は創傷領域に局在しており、創傷部位から１０cmを超える、特に２cmを超え離れている植物の領域、特に葉では検出されないだろう（ＥＬＩＳＡアッセイを用いて）（例えば同一植物内でも創傷した葉より低いまたは高い位置にある葉、または同一の葉であってもお葉の創傷部位より１０cm、好ましくは２cmを超え離れている場所では検出されないだろう）。これにより植物内、特に葉、好ましくはトウモロコシの葉での発現が、発現を必要とする場所（即ち昆虫が摂食するかまたは摂食の試みによって少なくとも孔が開いた葉）に効果的に限定され、その結果高レベルの構成的発現により起こることがある植物へのストレスを最小限にとどめる。特に異なるタンパク質（例えば異なる昆虫制御タンパク質）をコードする複数の遺伝子を一つの植物に組入れる倍には、導入した遺伝子の１またはそれ以上が創傷発現することが有益であると考えられている。

別の実施態様では、本発明による殺虫性タンパク質の創傷誘導発現は、創傷後約１８〜２４時間、好ましくは１８、２０もしくは２４時間後に、葉の一部に損傷を加え、その葉を切取り、上記時間in vitroでインキュベーションするアッセイを用いたときに基礎またはバックグランドレベルからより高いタンパク質レベルに上昇（少なくともコントロールの２倍量、好ましくはコントロールの少なくとも５〜１００倍量）する、迅速な発現誘導を特徴とする（基礎またはバックグランドレベルは、新たに切出し、それまでに損傷を加えていないin vitroインキュベーションしていない葉の部分を用いて測定する）。

本明細書で用いる場合、「ＴＲ２’プロモーター」はAgrobacterium由来のＴＲ１’−ＴＲ２’二重プロモーター要素（Valtenら、1984年; Langridgeら、1989年）のＴＲ’２（またはｍａｓと略記されるマンノピン合成酵素）機能部分を含むプロモーターに関する。即ち、これはＴＲ２’要素を単独または別種ＴＲ１’要素（Guevara-Garciaら、1988年）もしくはエンハンサー領域、イントロン等を含むがこれらに限定されないその他（制御）要素とを、本発明による創傷誘導プロモーターの特性が実質的に維持される範囲で組合せて含むことができる。本発明の好適実施態様では、ＴＲ１’−ＴＲ２’二重プロモーター（またはＴＲ２’プロモーター要素を保持するその一部分）を使用する場合でも、転写はＴＲ２’プロモーター領域から始まる（即ちコーディング領域はＴＲ２’プロモーター配列と作動性に連結し、その下流に位置する）。最も具体的には、ここに使用する場合には、ＴＲ２’プロモーターは、ヌクレオチド番号１〜３３６の間のヌクレオチド位置からヌクレオチド位置４８３までの配列番号１番の断片を含む、好ましくは配列番号１のヌクレオチド９６〜４８３の配列を含む、最も好ましくは配列番号１またはその機能的均等物、即ち植物、より具体的には単子葉植物での創傷誘導発現を支配できるその修飾物を含むプロモーター領域を表す。かかる機能的均等物としては、少なくとも配列番号１のヌクレオチド３２８〜４８３を含むヌクレオチド配列（ＴＲ２’プロモーター要素を含む、Veltenら、1984年）に実質同一である配列が含まれる。かかる配列は各種Agrobacterium株から単離できる。あるいはかかる機能的均等物は、配列番号１のヌクレオチド３２８〜４８３の少なくとも約２５、好ましくは少なくとも約５０または最大１００個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼチェインリアクション反応で増幅できる配列に相当する。ＴＲ２’プロモーターの機能的均等物はまた配列番号１の配列のヌクレオチドを置換、付加、または欠失することにより獲得でき、その中には配列番号１の機能的ＴＲ２’部分を含むハイブリッドプロモーターも含まれる。かかるプロモーター配列は部分または完全合成できる。

本発明の植物は、制御量の殺虫性タンパク質の創傷誘導発現により有害昆虫から保護される。制御とは毒性（致死的）または闘争（半致死）量を表す。誘導により、高用量（上記定義）が産生されることが好ましい。同時に、植物は形態学的に正常でなければならず、そして産物の消費および／または生産を目的として通常の様式で栽培できるだろう。さらに、上記植物は実質的に化学的または生物学的殺虫剤（殺虫性タンパク質の標的となる昆虫に対する）を必要としないものとする。

植物での殺虫性タンパク質の効果は様々なアッセイを用いて測定できる。より具体的には、Ostrinia nubilalisまたはＥＣＢに対するトウモロコシ植物内に産生される殺虫性タンパク質の毒性（ここではＥＣＢ効果とも称する）は、ＥＣＢの幼虫を利用した摂食アッセイで植物から抽出したタンパク質を試験するか、またはペトリ皿の中の置いた形質転換植物の葉材料上に散布した幼虫の死亡率をスコア化することにより、in vitroでアッセイできる（いずれもJansensら、1997年により記載されたアッセイ）。野外に於いては、初回孵化ＥＣＢ幼虫（ＥＣＢ１）の摂食を葉の損傷等級付け（Guthrie、1989年）に基づいて評価したのに対し、の茎の空洞の総数および空洞長は二回目に孵化したＥＣＢ（ＥＣＢ２）の茎の摂食損傷を示すものである（茎の空洞長の分析に関しては、例えばJansensら、1997を参照）。

本発明の植物は、場合によってはそのゲノムの中に除草剤耐性をコードする遺伝子も含むだろう。より具体的には、除草剤耐性遺伝子はｂａｒまたはｐａｔ遺伝子であり、これらは植物にグルフォシネート耐性を付与し、即ち植物は除草剤Liberty（商標）に対し耐性である。Liberty（商標）の耐性は、様々に試験できる。例えば、耐性はLiberty（商標）スプレー噴霧により試験できる。最善の結果を得るには、噴霧処理はＶ２ステージの植物とＶ６ステージの植物の間に行うべきである。耐性植物は、植物に少なくとも２００グラム活性成分／ヘクタール（g.a.i./ha）、好ましくは４００g.a.i./ha、そして可能であれば１６００g.a.i/ha（正常な野外使用量の４倍）までを植物に噴霧しても植物が死滅しないことを特徴とする。散布により使用する場合は、２８〜３４オンスLiberty（商標）＋３ポンド硫酸アンモニウム／エーカーの割合で散布するものとする。葉の上に界面活性剤の痕跡が残らないようにするために、植物の輪生内に直接噴霧しないように十分注意を払いながら、フラットファン型のノズルを用いて水２０ガロン／エーカーの割合で散布するのが最もよい。除草効果は４８時間以内に現れ、５〜７日間明瞭に見ることができなければならない。他の除草剤耐性遺伝子の例は、フェンメジファンに対する耐性をコードする遺伝子（ｐｍｐｈ遺伝子、米国特許第５、３４７、０４７号；米国特許第５、５４３、３０６号のような）、グリホスフェートに対する耐性をコードする遺伝子（ＥＰＳＰＳ遺伝子、米国特許第５、５１０、４７１号のような）、ブロモキシニル耐性をコードする遺伝子（米国特許第４、８１０、６４８号に記載のような）、スルフォニル尿素に対する耐性をコードする遺伝子（ＥＰＡ０３６０７５０に記載のような）、除草剤ダラポンに対する耐性をコードする遺伝子（国際特許出願番号ＷＯ９８／２７１１６に記載のような）、およびシアナミドに対する耐性をコードする遺伝子（国際特許出願番号ＷＯ９８／４８０２３およびＷＯ９８／５６２３８に記載のような）、ならびにＰＰＴのようなグルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性をコードする遺伝子（欧州特許ＥＰ−Ａ−０２４２２３６、ＥＰ−Ａ−０２４２２４６、ＥＰ−Ａ−０２５７５４２に記載のような）である。

発明の好ましい実施態様によれば、ＴＲ２’プロモーター制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むキメラ遺伝子は、植物に別の形質を獲得するために（「積重ね」とも呼ぶ）、他のキメラ遺伝子と組み合わせて植物内に導入することができる。同様に、ＴＲ２’プロモーターの制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むキメラ遺伝子を含有する発明の植物は、他の形質との組み合わせに特に好適である。このような他の形質としては、昆虫耐性、除草剤耐性、ストレスもしくは干魃耐性を付与するキメラ遺伝子によりコードされている形質、または植物のその他作物学的特性を修飾する形質を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。かかる形質に、植物から回収される産物の合成を含めることができる。

植物、細胞または組織のゲノム内への外来ＤＮＡまたはキメラ遺伝子の導入は、様々な方法により達成でき、本発明にとっては重要でない。単子葉植物の遺伝的形質転換は、Agrobaterium介在形質転換（例えば、トウモロコシに関して、米国特許第６、０７４、８７７号または米国特許第６、１４０、５５３号に記載されているような）、マイクロプロジェクタイル爆撃（例えばChenら、1994年が記載するような）、プロトプラスト内へのＤＮＡの直接取込み（例えばDataら、1999年; Poulsen、1996年が記載するような）、およびエレクトロポレーション（D’Halluinら、1992年）を含む多くの方法により成功している。

以下の非限定的実施例は、それを用いて植物内で発現させ昆虫耐性植物を獲得することを目的とする、ＴＲ２’プロモーター制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子の構築を記載する。実施例では特に記載ない限り、全てのＤＮＡ組換え技術はAusbelら（1994年）Current Protocols in Moelcurar Biology、Current Protocols、USAのSambrookとRussel (2001年) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Third Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、Volume1および2、ならびにBrown (1998年) Molecular Biology Lab Fax、Second Edition、Academic Press (UK) のVolume IおよびIIに記載の標準的プロトコルに従い実施される。植物の分子研究に関する標準的材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK) とBlackwell Scientific Publications, UKとが共同出版した、Plant Molecular Biology Labfax (1993年）の中にR.D.D.Croyが記載している。ポリメラーゼチェインリアクションに関する標準的材料および方法は、DieffenbachとDveksler (1995) のPCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory PressおよびMcPhersonら（2000年) PCR-Basics: From Backgroud to Bench、Fist Edition, Springer Velag, Germanyに見ることができる。

記述および実施例を通して、配列表に示されている以下の配列が引用される：
配列番号１：ＴＲ２’プロモーターの好適実施多様のヌクレオチド配列
配列番号２：ｐＴＳＶＨ０２１２の配列
配列番号３：修飾ｃｒｙ１Ａｂコード配列の配列

実施例１ＴＲ２’プロモーター制御下にある外来遺伝子を用いた形質作製
ａ）形質開発
殺虫性遺伝子をコードするＤＮＡ配列の創傷誘導発現を評価するために、修飾したｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現を支配するＴＲ２’プロモーターを含む（Valtenら、1984年）プロモーター領域を含む構築体を作製した。Agrobacterium−介在形質転換に関しては、Ｔ−ＤＮＡ境界（‘ＴＲ２’−Ｃｒｙ１Ａｂ’とも呼ばれる）の間に問題の遺伝子を含むプラスミドｐＴＳＶＨ０２１２を用いた（国際特許出願番号ＷＯ９８／３７２１２）

ＰＴＳＶＨ０２１２構築体の構造を表１に示す。殺虫性タンパク質を構造的に発現する植物を制御するために、Cauliflower Mosaic Virus (Franckら、1980年）由来の３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−ｃｒｙ１Ａｂとも呼ばれる）、あるいはPetunia由来のｃａｂ２２リーダー（Harpsterら、1988年）（‘Ｇｏｓ／ｃａｂ−ｃｒｙ１Ａｂ’とも呼ばれる）またはＧＯＳ転写体の第２エクソン、第１イントロンおよび第１エクソンを含有する、コメ由来のＧＯＳ２遺伝子の５’リーダー配列（de Paterら、1992年）（‘Ｇｏｓ／ｇｏｓ−ｃｒｙ１Ａｂ’とも呼ばれる）を有するコメ由来のＧＯＳ２遺伝子のプロモーター（de Paterら、1992年）のいずれかの制御下にある修飾Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む構築体により形質転換を実施した。全ての構築体が３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子を含んだ。

再生苗木はLibertyに対する耐性に基づき選択した。

ｂ）形質評価
Agrobacterium形質転換体を、Ｔ−ＤＮＡの左境界にベクター配列が存在するか調べた。一次形質転換体（Ｔ０）の葉材料を使ってサザンブロット分析を行った。

実施例２殺虫性タンパク質の創傷誘導発現
ｉ）殺虫性タンパク質の基礎発現
修飾したＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質の発現の基礎レベルを、Jansensら、1997年記載の抽出法および緩衝液を用いて可溶性タンパク質を抽出した後、Ｃｒｙ１Ａｂに対するポリクローナルウサギ孔結成のポリ濃縮ＩｇＧ分画を第１抗体に、そしてＣｒｙ１Ａｂに対するモノクローナル抗体を第２抗体に利用するＣｒｙ１ＡｂサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。Ｖ３ステージの植物の葉、Ｒ１ステージの花粉および葉、ならびに収穫時の葉、茎および花粉のサンプルを温室栽培植物より得た（トウモロコシのステージは「How a Corn Plant Develops、Special Reprot No.48、Iowa State University of Science and Technology、Cooperative Extension Service、Ames、Iowa、1993年6月増刷」に記載されたものである；また関連情報を含むインターネットウェブサイト：http://www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agriculture/corn/corn_develop/CornGrowthStages.htmlも参照）。比較するために、Ｇｏｓ／ｇｏｓ−ｃｒｙ１Ａｂ構築体で形質転換した植物からサンプルを得た。

表２に全可溶性タンパク質（Bradfordアッセイ（Bio-Rad、Richmond、CA; Bradford、1976年）を用い測定した）当たり検出されＣｒｙ１Ａｂタンパク質のパーセンテージとして結果を示す。平均値は１つの形質転換イベントについて、複数の植物系統より得た５サンプルの平均値である。

ＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ構築体による形質転換で得た植物では、温室での修飾Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の基礎発現の平均値は、ＶＶ３ステージ、Ｒ１ステージまたは収穫時の植物より採取した全ての葉サンプルで検出限界より低いことが分かった（全可溶性タンパク質の０．００１％または０．０００％）。茎での殺虫性タンパク質の平均基礎発現は収穫時の殆どの植物について全可溶性タンパク質の約０．０１％であることが見いだされた。Ｇｏｓ／ｇｏｓ−ｃｒｙ１Ａｂ構築体を用い得た植物では、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現は全ての葉サンプルで０．２％を超え、収穫時に採取した茎サンプルの幾つかは１％を超えた。

ii）殺虫性タンパク質の創傷誘導発現
温室内にて研究を行い、非形質転換植物、ＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ構築体を利用して得た植物、およびＧｏｓ／ｇｏｓ−ｃｒｙ１Ａｂ構築体を利用して得た植物での、機械損傷時の殺虫性Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現を決定した。葉および根を切除して損傷した。創傷は完全に広げられた葉に、中央葉脈を損傷しないようメスを使って葉にそれぞれに１mmの垂直な切り込として加えられた。機械損傷前と１８時間後に葉サンプルを採取した。Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質レベルは、切出した葉部分（葉部分は創傷の周囲２〜３mmを切り取ったものであった）を、ペトリ皿の中に置かれた、Murashige and Skoog培地（ＭＳ培地、組成についてはBIOS Scientific Publications Ltd (UK) およびBlackwell Scientific Publications, UKが共同出版したR.D.D.CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993) を参照）で湿らせた濾紙の上に置いて、２０℃の栽培チャンバー内で１８時間インキュベーションしてからＥＬＩＳＡを用いて測定した−よりサイズの小さいのコントロール葉の小片を植物から切り出し、その直後にドライアイスの上に置いてタンパク質測定を行った（in vitroインキュベーションなし）。平均値は形質転換イベントあたり５個体の植物の平均である。

試験した各種ＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂを用いた形質転換でも、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現は葉、茎および穀粒のいずれについても認められないか、または検出限界付近であった。Ｖ４ステージおよび開花ステージの葉ならびに花粉では有意な発現は見いだせなかった。これら植物では、根に於いて全可溶性タンパク質の構成的発現約０．０２〜０．０３％が見いだされた。葉に機械損傷を加えると、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現が誘導され、０．０５〜０．１％になった。３５Ｓ−ｃｒｙ１Ａｂの場合は、創傷の有無に関係なくＶ３植物の葉に於いて約０．５％のＣｒｙ１Ａｂタンパク質の構成的発現が見られた。開花期および収穫期では、創傷前後に葉に於いて発現レベル約０．１〜０．２％が測定された。

同様ではあるが、創傷が温室栽培植物の植物体にあるアッセイ（切出した葉部分をin vitroインキュベーションしない）では発現値は低くかったが、創傷により発現の顕著な増加が認められた。

本アッセイでは、第２齢ＥＣＢ幼虫をＶＴステージのＷＩ６０２−０４０２のトウモロコシ植物５株に取り付けたクリップケージ内に入れた。６０時間後各植物から、サンプルケージの上下から２cmまたは１０cmの葉からクリップケージ内にある損傷した葉部分のサンプルを、そしてクリップケージのついた葉の上下にある葉からサンプルを採取した。葉サンプルはまた実験開始時にも集めた。これらサンプルについてＣｒｙ１ＡｂＥＬＩＳＡを実施し、平均値（太字）および標準偏差を計算した。結果を下表４に示す。

別のアッセイでは、イベントＷＩ６０４−１６０２およびＷＩ６０６−１２０６のＶＴステージにある５株の植物に、温室内でメスを使って損傷を加えた。５０時間後に各植物から、同じ葉の上下２cmおよび１０cmから損傷した葉部分のサンプルを、そして損傷を加えた葉の上下にある葉からもサンプルを採取した。葉のサンプルは実験開始時にも採取した。

結果を下表５に示す。

追加の野外試験での測定から（in vitroインキュベーションしない、植物より得た新鮮な葉材料を用いた）、植物でのＣｒｙ１Ａｂタンパク質の基礎発現レベルは低いことが確認された：ｐＴＲ２’−Ｃｒｙ１Ａｂ構築体を含むイベント毎５株の交配植物を用い実施した野外試験では、野外では全可溶性葉タンパク質の０．００１〜０．００３％がＣｒｙ１Ａｂタンパク質であった（５植物／イベントの平均（標準偏差は平均で０．００１〜０．００４％））。また、追加の野外試験からは、野外でＥＣＢ幼虫に人工的に摂食させたトウモロコシ植物では、昆虫非摂食植物に比べＣｒｙ１Ａｂタンパク質が多いことが示された。この試験（８植物）でＣｒｙ１Ａｂに見出された発現レベルは、平均で栄養葉では全可溶性タンパク質の０．００１〜０．００２％、Ｒ１はでは全可溶性タンパク質の０．００３〜０．０４６％であり平均であり、そしてＲ５〜６葉では全可溶性タンパク質の０．００９〜０．０１７％であった（in vitroでインキュベーションしていない植物より採取した新鮮な葉を用いた時）。予想通り、野外でも幾つかの植物では、昆虫の摂食によりＣｒｙ１Ａｂタンパク質濃度が上昇した（サンプルは植物から無作為に採取した）。

実施例３．創傷誘導発現による植物の昆虫耐性
ａ）ＥＣＢ第４齢幼虫による制御摂食に対する効果
プレキシガラス製シリンダ内に中型の輪生トウモロコシ植物を入れ、１０または１５匹の第４齢のアワノメイガ幼虫に摂食させた。１０日後、植物を切開して、植物毎に幼虫の生存率をスコア化した。結果を表６に示す。

制御摂食に於ける第４齢ＥＣＢ幼虫の制御効果は、試験したＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ植物全てで１００％であった。対照植物の死亡率は平均最大５０％であった。第４齢のＥＣＢ幼虫は初齢幼虫に比べ修飾Ｃｒｙ１Ａｂ蛋白質に２５〜１００倍感受性であると信じられていることから、創傷誘導後にこのような植物について測定した場合に発現値が比較的低いままでも、ＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ植物でのタンパク質産生レベルは「高用量」と見なすことができる。

ｂ）ＥＣＢに対する効果
温室および野外試験でＥＣＢの効果について、１４のイベントを評価した（表７）。結果は植物毎の、最大長の空洞の平均長に対する平均空洞長（ブラケット間の標準偏差値）で表している（平均値（ｓｄ）／最大長／植物）。温室では、空洞の平均長は１０植物個体の測定値より得た。野外では、ＥＣＢ効力は各群１０個体より得た３つの値の平均値として表した。５つあるシングルコピーイベント（アスタリスクで示した）の内４イベントについて、平均空洞長３．５cm未満とされる全ＥＣＢコントロールを得た。

試験したいずれの場所でも、各種ＴＲ２’イベントの第二回自家受粉（穂列間）により作物学上の性能に悪影響が及ぶことはなかった。

ｃ）Sesamia nonarioidesに対する効力
５株の中型のＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ構築体を含む輪生トウモロコシ植物それぞれに２個の卵塊を付着した。１４日後に損傷度を調べ、幼虫数を数えた。損傷度は５株の植物全てに見積もった（cmで表した植物の高さ、植物当たりの空洞の長さで示した）。結果を表８に示す。

結果からは、試験したＴＲ２’−ｃｒｙ１Ａｂ植物では地中海茎食いムシがよく防御されていることが分かる。

実施例４．比較分析
上記に用いたものと同一のＣｒｙ１Ａｂコード配列を持つトウモロコシ植物でのＭＰＩプロモーター（Breitlerら、2001年が創傷誘導プロモーターと記載している）を用いた発現分析を行い、野外での基礎（非誘導）レベルと創傷誘導とを比較した。このＭＰＩプロモーター制御下にある殺虫性Ｃｒｙ１Ａｂ蛋白質部分発現トウモロコシ植物は、温室試験では、葉の全可溶性蛋白質当たり少なくとも約０．０４％のＣｒｙ１Ａｂタンパク質の基礎平均発現レベルを示す。またイベント２ＭＰＩ−Ｃｒｙ１Ａｂを用いた最初の温室試験でも、創傷時の発現レベルに若干の変動が見られたが、これら植物より新たに得た植物材料および切り離した後in vitroでインキュベーションした葉について濃度を測定した場合（いずれのケースも濃度は創傷後２１時間および４２時間眼に各種サンプルについて測定した）には、いずれも創傷誘導によりＣｒｙ１Ａｂタンパク質発現が基礎（平均）レベルに比べて少なくとも５倍になることはなかった（機械的損傷後）。即ち、これらＭＰＩプロモーターを利用したアッセイでは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現誘導は全くないか、弱いものである。

また、比較分析では、ＴＲ２’プロモーターを用いた、発明の植物の野外での性能をＣｒｙ１Ａｂタンパク質の一部を発現する市販のトウモロコシ植物と比較した。これらアッセイでは、高い構成的発現レベルを求めて３５Ｓプロモーターを利用しており、そして高用量の昆虫耐性を供給することが知られているＭＯＮ８１０およびＢｔ１１イベントより得たトウモロコシ植物（詳しい説明については、これら認可イベントトウモロコシの公開ＵＳＤＡ申請を参照せよ）を用いている。

野外試験では、人工的にアワノメイガを寄生させた後の平均空洞長（茎当たりのcmで表し、Jansensら（1997年）の記載に従い茎を裂いてから測定した）は、５種類のイベントＣｒｙ１Ａｂ−ＴＲ２’トウモロコシではそれぞれ０、０、０．０４、０および０．２１cmであったのに対し、ＭＯＮ８１０トウモロコシの平均空洞長は０．３であり、そしてＢｔ１１トウモロコシでは０．１３であった（同一試験に於いて、非形質転換対照トウモロコシ系統では１２．２〜３９．９２cmの空洞長が認められた）。

即ち、トウモロコシに於ける創傷誘導ＴＲ２’プロモーターの比較分析からは、トウモロコシに於いてＴＲ２’プロモーター制御下にある殺虫性タンパク質の発現は、構成的プロモーターを利用した市販のイベントで獲得できるものと同等の高い昆虫耐性を提供する。

別の野外試験では、サウスウエスタンアワノメイガを人工的に寄生させた時の平均トンネル長は（茎当たりのcmで表し、Jansensら（1997年）の記載に従い茎を裂いてから測定した）、５種類のイベントＣｒｙ１Ａｂ−ＴＲ２’トウモロコシではそれぞれ０．５３、０．６８、０．３、０．６４および０．６cmであったのに対し、ＭＯＮ８１０トウモロコシの平均長は０．４３であり、そしてＢｔ１１トウモロコシでは０．１５であった（同一試験に於いて、非形質転換対照トウモロコシ系統では３２〜３９．６cmの空洞長が認められ、幾つかの系統では空洞によって茎が破壊し、自立できる植物がないものもあった）。

Claims

ＴＲ２’プロモーターを含むプロモーター領域の制御下にある殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子を含み、そのゲノム内に安定に組み込まれている、昆虫耐性トウモロコシ植物であって、高用量の該殺虫性タンパク質を発現する前記植物。
トウモロコシ植物が１０日間のバイオアッセイにて第４齢アワノメイガ幼虫の少なくとも９７％を死滅させる、請求項１記載の植物。
前記殺虫性タンパク質がBacillus Thuringiensis毒素である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の植物。
前記ＴＲ２’プロモーターが、ヌクレオチド番号１〜３３６の間のヌクレオチド位置からヌクレオチド位置４８３までの配列番号１の断片を含むプロモーター領域である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド９６〜４８３の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物。
単子葉植物の中に殺虫性毒素の創傷誘導高用量発現を獲得する方法であって、上記方法が
ａ）ｂ）に作動性に連結した、殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、
ｂ）ＴＲ２’プロモーターを含む植物発現性プロモーター領域
を含むキメラ遺伝子を植物内に導入することを含む、方法。
上記単子葉植物がトウモロコシであり、かつ上記トウモロコシ植物が１０日間のバイオアッセイにて第４齢アワノメイガ幼虫の少なくとも９７％を死滅させる、請求項７に記載の方法。
上記単子葉植物がトウモロコシであり、かつ前記創傷誘導発現が、温室栽培植物に於ける上記植物の葉での殺虫性タンパク質の平均基礎発現レベルが全可溶性タンパク質の０．００５％以下であることを特徴とする、請求項７〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、ヌクレオチド番号１〜３３６の間のヌクレオチド位置からヌクレオチド位置４８３までの配列番号１の断片を含むプロモーター領域である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド９６〜４８３の配列を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１の配列を含む、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
高用量の殺虫性タンパク質を発現する、昆虫耐性単子葉植物の作製方法であって、上記方法が
ａ）ｂ）に作動性に連結した、殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、
ｂ）ＴＲ２’プロモーターを含む植物発現性プロモーター領域
を含むキメラ遺伝子を上記植物のゲノム内に導入することを含む方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、ヌクレオチド番号１〜３３６の間のヌクレオチド位置からヌクレオチド位置４８３までの配列番号１の断片を含むプロモーター領域である、請求項１３記載の方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド９６〜４８３の配列を含む、請求項１３記載の方法。
前記ＴＲ２’プロモーターが、配列番号１の配列を含む、請求項１３記載の方法。
上記単子葉植物がトウモロコシであり、かつ上記トウモロコシ植物が１０日間のバイオアッセイにて第４齢アワノメイガ幼虫の少なくとも９７％を死滅させる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
上記単子葉植物がトウモロコシであり、かつ前記創傷誘導発現が、温室栽培植物に於ける上記植物の葉での殺虫性タンパク質の平均基礎発現レベルが全可溶性タンパク質の０．００５％以下であることを特徴とする、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
温室内の上記植物の葉での平均発現レベルが、創傷が無い場合には全可溶性タンパク質の０．００５％以下であり、そして創傷時には上記平均発現レベルが少なくとも５倍増加する、請求項７に記載の方法。
上記単子葉植物がトウモロコシであり、かつ上記トウモロコシ植物が１０日間の植物全体バイオアッセイにて第４齢アワノメイガ幼虫の少なくとも９７％を死滅させる、請求項１９に記載の方法。
上記植物がトウモロコシであり、かつ上記の０．００５％以下の基礎発現がＶ４ステージの葉で測定される、請求項１９または２０に記載の方法。
前記殺虫性タンパク質がＢｔタンパク質である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
上記Ｂｔタンパク質がＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ９ＣおよびＣｒｙ２Ａｂならびにその殺虫性断片の群から選択される、請求項２２に記載の方法。
上記タンパク質が配列番号３にコードされるタンパク質である、請求項１に記載の植物。
上記Ｂｔタンパク質が、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２ＡｅおよびＣｒｙ２Ａならびにその殺虫性断片の群より選択される、請求項３に記載の植物。