BRPI0309874B1 - método para obtenção de expressão induzida por ferimento de uma toxina inseticida em uma planta de milho, para fabricação de uma planta de milho resistente a insetos, e para obtenção de expressão aumentada de uma proteína inseticida em uma planta de milho quando ferida. - Google Patents

Abstract

"expressão ferimento-induzível em plantas". a presente invenção refere-se a um método para a produção de plantas no qual a expressão de uma proteína inseticida é regulada por um promotor ferimento-induzido que induz à expressão local, de preferência o promotor ferimento-induzível tr2<39>, aos genes quiméricos usados no presente método e à plantas obtidas por meio do mesmo e aos processos para obtenção de resistência contra insetos que se alimentam sobre as plantas através de expressão localizada de uma proteína inseticida induzida quando de ferimento das plantas através de alimentação pelos insetos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA OBTENÇÃO DE EXPRESSÃO INDUZIDA POR FERIMENTO DE UMA TOXINA INSETICIDA EM UMA PLANTA DE MILHO, PARA FABRICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE A INSETOS, E PARA OBTENÇÃO DE EXPRESSÃO AUMENTADA DE UMA PROTEÍNA INSETICIDA EM UMA PLANTA DE MILHO QUANDO FERIDA".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método para a produção de plantas no qual a expressão de uma proteína inseticida é regulada por um promotor feri mento-induzido que induz à expressão local, de preferência o promotor ferimento-induzível TR2\ aos genes quiméricos usados no presente método e a plantas obtidas por meio do mesmo e aos processos para obtenção de resistência contra insetos que se alimentam sobre as plantas através de expressão localizada de uma proteína inseticida induzida quando de ferimento das plantas através de alimentação pelos insetos.

Antecedentes da Técnica A maioria das tentativas com sucesso para fazer plantas que são resistentes a ataque de insetos tem sido obtida por, e acredita-se dependendo de, expressão em alto nível de toxinas inseticidas (Estrudh e outros, 1997; Witowsky & Siegfried, 1997). Mais parti cuia rmente com relação a toxinas Bt as quais descobriu-se que, como proteínas de comprimento total, são expressas deficientemente em plantas, os esforços têm se concentrado no aumento da expressão dessas toxinas em plantas através do uso de promotores constitutivos fortes e através de modificação dos genes que codificam os mesmos (Vaeck e outros, 1987; Barton e outros, 1987). Mais recentemente, a regulação espacial da expressão da proteína inseticida naqueles tecidos suscetíveis ao ataque ou disparados pela alimentação do inseto tem sido sugerida como proporcionando, possivelmente, vantagens com relação ao gerenciamento da resistência (Peferoen & Van Rie, 1997). Uma das principais condições para obtenção de aprovação regulatória para plantas trans-gênicas resistentes a insetos é a disponibilidade de uma estratégia de gerenciamento da resistência a insetos. A estratégia presente mente favorecida Segue-se folha 1 a é a combinação de 100% de toxicidade das plantas transgênicas à peste(s) alvo, obtida através de expressão em alta dose de uma toxina específica e isso durante o ciclo de vida todo da peste, com o uso de refugos de plantas não-transgênicas, o que permite a manutenção da população da peste alvo (De Maagd e outros, 1999). De forma a ser capaz de se conformar a tal estratégia, o uso de promotores constitutivos fortes na engenharia de plantas resistentes a insetos tem sido ainda encorajado. A expressão induzível de resistência a insetos foi examinada, primariamente, com relação aos genes inibidores da proteinase de batata (pin1 e pin2), os quais são parte do sistema de defesa natural em plantas e, quando de ferimento, asseguram a geração de um sinal sistêmico através das plantas (Green e Ryan, 1972; Hilder e outros, 1987). A introdução do gene pin2 em arroz resultou em um acúmulo sistêmico em alto nível da proteína em plantas de arroz, as quais mostraram resistência aumentada às principais pestes (Duan e outros, 1996). Breitler e outros (2001) descrevem o uso da região C1 do inibidor do gene da proteinase de milho (MPI) para acionar a expressão ferimento-induzível da seqüência de codificação cry1B em arroz e verificou-se que os primeiros transformantes eram eficazmente protegidos contra ataque por brocas do caule, a expressão ferimento-induzível sendo descrita como sendo local e sistêmica.

Em um experimento em pequena escala em laboratório, folhas de repolho transgênico transformado com o gene cry1Ab3 colocado sob o controle do promotor induzível vspB de soja eram tóxicas à lagarta diaman-te-negro, assim como aqueles transformados com o mesmo gene sob o controle do promotor 35S, mas a característica ferimento-induzível não foi demonstrada (Jin e outros, 2000). O promotor TR2’ do gene da sintase de manopina de Agrobacte-rium tumefaciens, originalmente considerado como dirigindo a expressão constitutiva (Velten e outros, 1984; Vaeck e outros, 1987), foi usado para direcionar a expressão ferimento-induzível de um gene CrylAb nativo em tomate, o que levou a uma expressão relativamente baixa e um controle de insetos apenas moderado (Reynaerts & Jansens, 1994). Embora uma ampla aplicação possível para a expressão de proteínas Bt tenha sido sugerida (Peferoen,1997), parecem existir discrepâncias entre os relatos sobre o padrão de expressão do promotor TR2’ em tabaco e outras dicotiledôneas (Ni e outros, 1995). Em geral, o uso de promotores de monocotiledônea é preferi- do para expressão ótima de genes em monocotiledôneas (Shimamoto, 1994) e verificou-se que determinados promotores têm diferentes elementos de cis-atuação em monocotiledôneas e dicotiledôneas (Luan e outros, 1992). A contribuição de diferentes elementos do promotor TR2’ sobre sua atividade foi investigada em protoplastas de milho (Fox e outros, 1992), mas não existem relatos sobre o padrão de expressão do promotor TR2’ em uma planta monocotiledônea. Além disso, descobriu-se que o mutante com dele-ção mais forte é 20 vezes menos ativo do que o promotor 35S de CaMV (Fox e outros, 1992).

Promotores da sintase de manopina de Agrobacterium foram caracterizados como sendo promotores constitutivos, raiz-específicos e teci-do-específicos, veja, por exemplo, patentes US 6291745, 6320100 e 63133378. Na patente US 5641664, acredita-se que vários promotores constitutivos e órgão- e tecido-específicos que são usados para direcionar a expressão de genes em plantas dicotiledôneas transformadas também sejam adequados para uso em monocotiledôneas transformadas. Como parte de uma lista geral de promotores constitutivos estranhos adequados para a transformação de células de plantas nessa patente, são mencionados os promotores TR1' e TR2', os quais acionam a expressão dos genes 1' e 2', respectivamente, do T-DNA de Agrobacterium e são mencionados como sendo promotores ferimento-induzidos. Essa patente não mostra nenhuma planta monocotiledônea transformada com o promotor TR2’ ou TR1’, nem existe qualquer sugestão de que esses promotores são promotores ferimento-induzidos em plantas monocotiledôneas ou são úteis para a expressão de uma proteína inseticida em uma planta monocotiledônea. A presente invenção descreve como o promotor TR2' pode ser usado para direcionar a expressão ferimento-induzida de uma proteína inseticida em plantas monocotiledôneas a fim de se obter resistência a insetos. Tal expressão ferimento-induzida do promotor TR2' leva a um aumento forte, mas localizado, de expressão da proteína inseticida. O efeito putativo sobre o vigor e crescimento da planta, observado com expressão em alto nível de algumas proteínas de Bt, particularmente quando de endogamia repetida (tal como reportado no WO 00/26378 com relação à Cry2Ab), é provavelmente reduzido, uma vez que a expressão limitada da proteína deverá minimizar qualquer carga sobre funções importantes para manutenção das qualidades agronômicas da safra manipulada. Isso também é um fator importante quando de empilhamento de diferentes características (ou diferentes proteínas de Bt) é pretendido. Uma vez que níveis de expressão em alta dose são obtidos quando de contato com a peste alvo, tais plantas deverão se conformar às estratégias atuais da IRM. Adicionalmente, é provável que a combinação da especificidade da toxina de inseto produzida com um padrão de expressão espacial e temporariamente espaçado (isto é, em tecidos suscetíveis a ferimento, quando de ferimento) reduza a exposição de organismos não-alvo, o que pode ser considerado vantajoso com relação a produção constitutiva da toxina pelas plantas. Assim, um sistema eficaz de expressão regulada assegurando resistência eficaz contra insetos para as principais safras, tais como milho e arroz, é de interesse dos pontos de vista das normas governamentais e agrícola.

Sumário da Invenção A presente invenção se refere a um método para obtenção de expressão ferimento-induzida de uma proteína inseticida em uma planta mo-nocotiledônea, método o qual compreende introdução, no genoma da planta, de um DNA estranho o qual é um gene quimérico compreendendo uma se-qüência de DNA que codifica a proteína inseticida sob o controle de uma região promotora compreendendo o promotor TR2'. De acordo com uma concretização particular da invenção, a proteína inseticida é uma toxina de Bacillus thuringiensis. Em uma concretização preferida da presente invenção, a proteína inseticida é uma proteína inseticida ativa contra pestes de plantas monocotiledôneas, mais preferivelmente a proteína inseticida pode ser uma proteína CrylAb, Cry1F, Cry2Ae, Cry9C ou Cry2Ab ou um fragmento inseticida ou mutante das mesmas.

Assim, uma concretização preferida da presente invenção se refere a um método para obtenção de resistência a insetos, de preferência resistência a insetos em alta dose, em plantas, células de plantas ou tecidos de plantas, mais particularmente em monocotiledôneas, especialmente gra-míneas, particularmente plantas, células de plantas ou tecidos de plantas de milho, através do fornecimento, às plantas, células de plantas ou tecidos de plantas, de um DNA estranho compreendendo uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob controle de uma região promotora compreendendo o promotor TR2’. De acordo com a presente invenção, o promotor TR2' é usado para aumentar a expressão da proteína inseticida quando de ferimento, por exemplo, através de alimentação por insetos. Assim, de acordo com uma concretização em particular da invenção, a expressão da proteína inseticida em plantas monocotiledôneas, de preferência medida na estufa através de um ensaio ELISA, é baixa (isto é, abaixo de 0,005% de proteína total solúvel (valor médio de medições múltiplas tomadas de várias, de preferência pelo menos 3, particularmente pelo menos 5 plantas do mesmo evento de transformação) em folhas, na ausência de ferimento ou infestação e é aumentada, de preferência pelo menos duplicada, mais preferivelmente aumentada 5 a 100 vezes, nos tecidos feridos ou infestados, particularmente folhas, dentro de 24 horas.

De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, um gene quimérico compreendendo uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2' ferimento-induzido é usada para conferir resistência a insetos a plantas monocotiledôneas, especialmente a gramíneas, mais particularmente a milho, através de direcionamento da expressão local da proteína inseticida no local de alimentação por insetos. Assim, a invenção se refere a genes quiméricos para a obtenção de expressão ferimento-induzida em plantas monocotiledôneas. Em uma concretização particular da invenção, a expressão (conforme medido na estufa) é baixa ou não-detectável (menos de 0,005% da proteína solúvel total (valor médio de medições múltiplas tomadas de várias, de preferência pelo menos 3, particularmente pelo menos 5 plantas do mesmo evento)) em folhas de plantas não-feridas, não-infectadas e, quando de infecção, níveis aumentados de proteína inseticida (pelo menos duplicados, de preferência um aumento de pelo menos de 5 a 100 vezes ou mais) são induzidos localmente nos tecidos infectados, dentro de 18 horas. De acordo com esse aspecto da invenção, plantas, mais particularmente são proporcionadas plantas monocotiledôneas, que são resistentes a insetos devido à presença, em seu genoma, de um DNA estranho compreendendo uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2', o qual assegura expressão em tecidos feridos. De acordo com uma concretização da invenção, a expressão de uma proteína inseticida nas plantas é tal que, na ausência de ferimento da planta (por exemplo, quando desenvolvida em uma estufa), a proteína inseticida é expressa em níveis baixos ou inde-tectáveis (isto é, abaixo de 0,005% de proteína solúvel total (valor médio de medições múltiplas tomadas de várias, de preferência 3, particularmente pelo menos 5 plantas do mesmo evento) em folhas, caule, semente e pólen, de preferência pelo menos em folhas e pólen, particularmente pelo menos em folhas e, quando de alimentação por insetos, é aumentada no tecido ferido, de preferência nas folhas, para um nível o qual é suficiente para matar a peste que está se alimentando, de preferência para uma concentração de pelo menos 0,01 % da proteína solúvel total.

De acordo com uma concretização preferida da invenção, o promotor TR2' é usado em plantas monocotiledôneas para conferir resistência a insetos através de direcionamento da expressão ferimento-induzida de uma proteína inseticida a qual é uma toxina de Bt. Exemplos de tais seqüên-cias de DNA de toxinas de Bt são bem-conhecidos na técnica e são descritos aqui.

De acordo com uma concretização da presente invenção, o uso do promotor TR2' em milho para direcionar a expressão ferimento-induzida de uma toxina de Bt é particularmente adequado para manipular a resistência do milho contra a Broca do Milho Europeu (ECB), baseado na expressão local em alta dose da toxina na planta quando de alimentação por insetos alvo. As plantas ou partes de plantas (células ou tecidos) da presente invenção compreendendo em seu genoma um DNA estranho compreendendo uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob controle do promotor TR2', quando de ferimento, produzem níveis de proteína inseticida que são tóxicos às larvas de ECB, incluindo particularmente larvas de ECB do quarto estágio, conforme pode ser determinado por meio dos ensaios de eficácia contra insetos descritos aqui. De preferência, taxas de mortalidade de larvas de ECB no quarto estágio larval de pelo menos 97%, de preferência pelo menos 99%, mais preferivelmente de 100%, são obtidas. A presente invenção ainda se refere a plantas monocotiledôneas que são resistentes a insetos, ao mesmo tempo em que expressam níveis basais muito baixos de proteína inseticida em folhas não-feridas da planta. De acordo com um aspecto particular da presente invenção, são obtidas plantas monocotiledôneas, mais particularmente milho, as quais combinam resistência a insetos eficaz com características agronômicas ótimas, sem penalidade sobre os desempenhos agronômicos devido à expressão da proteína inseticida, conforme pode ser determinado através de avaliação do fenótipo da planta, classificações de segregação, emergência, vigor e agronômicas.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, são obtidas plantas monocotiledôneas, particularmente plantas de milho, que são resistentes a insetos e particularmente adequadas para empilhamento com outras características (por exemplo, outros tipos de resistência a insetos, resistência a herbicidas ou características agronômicas).

De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionadas plantas monocotiledôneas, particularmente plantas de milho, as quais são resistentes a (a) peste(s) alvo, mas nas quais a produção da proteína inseticida é de baixa a indetectável, de preferência em folhas e pólen, particularmente em folhas, na ausência de ferimento, limitando a exposição de organismos não alvo à proteína inseticida.

De acordo com a presente invenção, as plantas com as características descritas acima são obtidas através de introdução, no genoma da planta, de uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2', o qual foi demonstrado como funcionando como um promotor ferimento-induzido em plantas monocotiledôneas, mais particularmente em plantas de milho.

Descrição Detalhada O termo "gene, conforme usado aqui, se refere a qualquer se-qüência de DNA compreendendo vários fragmentos de DNA operavelmente ligados, tais como uma região promotora, uma região não-traduzida 5’ (a 5’UTR), uma região de codificação (a qual pode ou não codificar uma proteína) e uma região não-traduzida 3' (3'UTR) compreendendo um local de poli-adenilação. Tipicamente, em células de planta, a 5’UTR, a região de codificação e a 3’UTR são transcritas em um RNA do qual, no caso de um gene que codifica uma proteína, a região de codificação é traduzida em uma proteína. Um gene pode incluir fragmentos de DNA adicionais tais como, por exemplo, íntrons. Embora uma região promotora seja requerida em um gene usado para a transformação na presente invenção, a 3'UTR compreendendo um local de poliadenilação não precisa estar presente no gene transferido em si, mas pode ser encontrada nas seqüências de DNA da planta a montante após inserção de um gene que não contém uma 3'UTR compreendendo um local de poliadenilação. Similarmente, uma seqüência de codificação da presente invenção pode ser inserida no genoma da planta a jusante de um promotor de planta existente, de modo que a expressão da proteína inseticida da invenção ocorre a partir de tal gene quimérico na planta (por exemplo, como em experimentos de tagging de promotor). O termo "quimérico", quando de referência a um gene ou uma seqüência de DNA, se refere a um gene ou seqüência de DNA a qual compreende pelo menos dois fragmentos de DNA funcionalmente relevantes (tais como promotor, 5'UTR, região de codificação, 3'UTR, íntron) que não são naturalmente associados uns aos outros e/ou se originam, por exemplo, de diferentes fontes. "Estranho", com referência a um gene ou seqüência de DNA com relação a uma espécie de planta, é usado para indicar que o gene ou seqüência de DNA não é naturalmente encontrada nessa espécie de planta ou não é naturalmente encontrada nesse local genético nessa espécie de planta. O termo "DNA estranho" será usado aqui para se referir a uma seqüência de DNA que tenha sido incorporada no genoma de uma planta como um resultado de transformação nessa planta ou em uma planta a partir da qual ela é uma prole.

Um genoma de uma planta, tecido de planta ou célula de planta, conforme usado aqui, se refere a qualquer material genético na planta, tecido de planta ou célula de planta e inclui o genoma nuclear e o plastídico e mitocondrial.

Um "fragmento" ou "truncamento" de uma molécula de DNA ou seqüência de proteína, conforme usado aqui, se refere a uma porção do DNA ou proteína original (seqüência de ácido nucléico ou aminoácido) referente a ou uma versão sintética da mesma (tal como uma seqüência a qual é adaptada para expressão ótima em plantas), a qual pode variar quanto ao comprimento, mas da qual o tamanho mínimo é suficiente para assegurar que a proteína (codificada) seja biologicamente ativa, o tamanho máximo não sendo crítico. Uma "variante" ou "mutante" de uma seqüência é usado aqui para indicar uma molécula de DNA ou proteína da qual a seqüência (ácido nucléico ou aminoácido) é essencialmente idêntica à seqüência a qual o termo se refere.

Seqüências as quais são "essencialmente idênticas" significa que quando duas seqüências são alinhadas, o percentual de identidade de seqüência, isto é, o número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos divido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das seqüências, é maior do que 70%, de preferência é maior do que 85%, mais preferivelmente é maior do que 90%, especialmente de preferência é maior do que 95%, mais preferivelmente está entre 96 e 100%. O alinhamento de duas seqüências de nucleotídeo é realizado através do algoritmo conforme descrito por Wilbur e Lipmann (1983) usando-se um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, uma extensão de palavra de 4 nucleotídeo e uma penalidade por gap de 4. 'Inseticida' é usado aqui para significar tóxico aos insetos os quais são pestes de safras. Mais particularmente, no contexto da presente invenção, insetos alvo são as pestes de plantas monocotiledôneas, mais particularmente de milho, tais como Ostrinia nubilalis (broca do milho Europeu ou ECB), Sesamia nonagríoides (broca do caule do Mediterrâneo) e He- licoverpa zea (lagarta do milho) e as principais pestes de coleópteros, tais como insetos Diabrotica spp., particularmente Diabrotica virqifera virqifera e Diabrotica undecimpunctata howardi (lagarta da raiz do milho).

Uma 'proteína inseticida' ou 'toxina', conforme usado aqui, deverá ser compreendido como uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo o qual é tóxico aos insetos. Exemplos de tais proteínas inseticidas são as toxinas Cry de Bt, mutantes ou fragmentos inseticidas das mesmas (tais como aqueles revistos por Hõfte e Whiteley, 1989, em Crickmore e outros (1998) e descrito no WO 00/26378, WO 97/40162 e US 6.023.013), mais particularmente a proteína Cry2Ae (WO 02/057664) ou um fragmento inseticida da mesma, a proteína Cry2Ab ou um fragmento inseticida da mesma, a proteína Cry9C ou fragmentos ou mutantes da mesma (por exemplo, conforme descrito no W094/24264 ou W099/00407), a proteína Cry1F ou um fragmento inseticida da mesma e a proteína CrylAb ou um fragmento inseticida da mesma, bem como as toxinas 149B1 combinadas (cerca de 14 e 44 quilodáltons) ou fragmentos inseticidas das mesmas e a proteína Cry3Bb e fragmentos inseticidas ou mutantes da mesma, conforme descrito nas patentes US 6.548.291, 6.063.597 e 6.501.009. Outras proteínas inseticidas são, por exemplo, as proteínas VIPs, particularmente VIP3A, mais particularmente VIP3Aa, VIP3Ab e VIP3Ac ou fragmentos inseticidas das mesmas (Estruch e outros, 1996, WO 96/10083, patentes US 6.429.360, 5.877.012) ou as proteínas codificadas pelas seqüências mis, war e sup (W098/18932, W099/57282) e as toxinas isoladas de Xhenorabdus e Photorabdus ssp., tais como aquelas produzidas por Photorabdus luminescens (Forst e outros, 1997). Outras proteínas inseticidas incluem, mas não estão limitadas, aos inibidores I e II de proteinase de batata, o inibidor da proteinase de feijão-de-corda, o inibidor da protease de cisteína de soja (Zhao e outros, 1996) ou as cistatinas, tais como aquelas isoladas de arroz e milho (Irie e outros, 1996), oxidases de colesterol, quiti-nases e lecitinas. Uma proteína inseticida pode ser uma pró-toxina (isto é, o produto primário da tradução de um gene de comprimento total que codifica uma proteína inseticida). Também incluídos estão equivalentes e variantes, derivados, truncamentos ou híbridos de qualquer uma das proteínas acima, os quais têm atividade inseticida. Uma toxina de Bt ou proteína de Bt, conforme usado aqui, se refere a uma proteína inseticida, conforme previamente definido, a qual é direta ou indiretamente derivada (por exemplo, modificada de modo a melhorar a expressão em plantas ou toxicidade aos insetos) de uma proteína naturalmente produzida por Bacillus thuringiensis e compreende uma seqüência a qual é essencialmente idêntica ao fragmento tóxico de uma toxina de Bt naturalmente produzida ou a pelo menos um domínio do mesmo. Uma toxina de Bt ou uma proteína de Bt, conforme usado aqui, pode ser uma proteína de cristal ou uma parte inseticida da mesma, ou pode ser uma proteína de não-cristal, tal como uma proteína secretada ou uma proteína produzida principalmente durante a fase vegetativa de um gênero de Bt ou pode ser um mutante inseticida ou parte do mesmo. Um 'DNA que codifica uma proteína inseticida’, conforme usado aqui, inclui uma seqüência de DNA truncada, modificada, sintética ou que ocorre naturalmente, que codifica uma proteína inseticida.

Em uma concretização particular da presente invenção, o DNA que codifica uma proteína inseticida é uma seqüência de DNA que codifica uma toxina de Bt, mais preferivelmente uma seqüência de DNA modificada para aumentar a expressão da expressão da proteína inseticida em plantas. De acordo com uma concretização particular da presente invenção, a seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida é uma seqüência de DNA crylAb modificada a qual codifica pelo menos parte da proteína Cry1Ab5 descrita por Hõfte e outros (1986), de preferência uma seqüência de DNA que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoáci-dos a partir de uma posição de aminoácidos entre as posições de aminoácidos 1-28 a um aminoácido entre as posições de aminoácidos 607-725 da mesma, mais preferivelmente compreendendo os aminoácidos 1-616. Mais preferivelmente, a proteína CrylAb modificada codificada tem uma inserção de um códon de alanina (GCT) atrás do códon inicial ATG (AlaAsp2...Asp616). O nível de expressão de uma proteína inseticida no material da planta pode ser determinado através de uma série de formas descritas na técnica, tais como através de quantificação do mRNA que codifica a proteína inseticida produzida no tecido usando-se vários iniciadores (tal como descrito por Comelissen & Vandewiele, 1989) ou detecção direta específica da quantidade de proteína inseticida produzida, por exemplo, através de métodos de detecção imunológica. Mais particularmente, de acordo com a presente invenção, o nível de expressão de proteína inseticida é expresso como o percentual de proteína inseticida solúvel, conforme determinado através de ELISA imunoespecífico, conforme descrito aqui com relação ao número total de proteína solúvel (conforme determinado, por exemplo, através de análise de Bradford (Bradford, 1976)). Um ELISA preferido na presente invenção é um ELISA em sanduíche (Clark e outros, 1986).

Um promotor 'ferimento-induzido' ou um promotor que direciona um padrão de expressão o qual é ferimento-induzível, conforme usado aqui, significa que, pelo menos nas folhas quando de ferimento, a expressão da seqüência de codificação sob o controle do promotor é significativamente aumentada, isto é, é pelo menos duplicada, de preferência 5 vezes aumentada, mais preferivelmente 20 a 100 vezes aumentada. 'Ferimento', conforme usado aqui, se destina a significar dano mecânico ou perfuração de pelo menos a epiderme da planta ou camada de células externas de qualquer tipo de alimentação por insetos, ferimento conforme usado aqui também pode ser simulado através de corte de uma folha com um instrumento pontiagudo, tal como um bisturi. De preferência, de acordo com a presente invenção, expressão ferimento-induzível de uma proteína inseticida, de preferência uma proteína inseticida de Bt, em uma planta significa que a expressão basal (isto é, na ausência de ferimento, de preferência quando medida na estufa) da proteína nas folhas da planta no estágio V4 é baixa, mais, preferivelmente abaixo de 0,005% do teor de proteína solúvel total (valor médio de medições tomadas de várias plantas de um evento de transformação) e, quando o ferimento surge, de preferência para um nível acima de 0,01% da proteína solúvel total, mais preferivelmente a um nível de 0,04% a 0,5% do teor de proteína solúvel total ou maior, conforme medido usando-se uma parte de folha que foi solta após ferimento e, então, incubada in vitro durante várias horas, por exemplo, cerca de 12 a cerca de 60 horas, de preferência cerca de 18 a cerca de 20 horas. Medições feitas usando-se um ensaio de folha excisada in vitro (em tal ensaio, uma folha excisada ou parte da mesma é incubada in vitro (por exemplo, em um disco de petri sobre papel filtro úmido) em uma estufa ou câmara de crescimento em temperatura ambiente durante várias horas, de preferência cerca de 12 a 60 horas, mais preferivelmente cerca de 18 a 20 horas, após ferimento (para refletir melhor as condições quando de alimentação por insetos), tipicamente, proporcionarão uma indução maior de expressão do que as medições após ferimento in planta sem incubação in vitro de uma folha solta ou uma parte da mesma. Os níveis de proteína ferimento-induzida são, tipicamente, menores (mas ainda significativamente maiores do que os níveis de base não-induzidos) quando medidos em torno de 12 a 60 horas, mais preferivelmente em torno de 18 a 20 horas, após ferimento de uma folha de planta sem excisão da parte da folha para incubação in vitro. Para qualquer uma das medições sobre a concentração de proteína inseticida em tecido de planta, de preferência folhas, após ferimento e para medição do aumento na expressão conforme descrito aqui, é preferido usar o ensaio com tecido solto, de preferência folha, com incubação in vitro, uma vez que esse, provavelmente, reflete melhor a concentração real induzida no tecido quando de alimentação do inseto (folhas de controle são frescas, não-feridas e não sofrem incubação in vitro para refletir melhor a concentração real nos tecidos da planta). Os níveis de expressão basal ou de base de um promotor ferimento-induzido, conforme usado aqui, são medidos, de preferência, a partir de material de folha recentemente ex-cisado, não previamente ferido, de plantas desenvolvidas em estufa. De acordo com uma concretização particular da invenção, a expressão da proteína inseticida pelo menos nas folhas feridas dá origem a 0,1% do teor de proteína solúvel total no local de ferimento. Acredita-se que o percentual de proteína inseticida por proteína solúvel total de acordo com a invenção que é realmente ingerido por um inseto quando de alimentação do inseto é maior do que o percentual medido na planta ou parte da mesma, devido à expressão localizada e ao fato de que apenas tecido induzido (ferido) será ingerido pelo inseto. Também, para medição da concentração de proteína, uma de- terminada quantidade mínima de tecido de planta é excisada (tipicamente cerca de 2-3 mm em tomo da ferida são excisados para folhas), para realizar a análise do teor de proteína inseticida, conseqüentemente, acredita-se que a presença de células não-feridas diminua o percentual de proteína inseticida por proteína solúvel total extraída da amostra.

Conforme tipicamente observado em experimentos de transformação desse tipo, uma faixa de diferentes eventos de transformação de planta é obtida após transformação e um procedimento de seleção é preferido para selecionar as melhores plantas para desenvolvimento adicional (isto é, para cruzamento em linhagens de plantas adequadas adaptadas para uma determinada região de crescimento). Em tal procedimento de seleção, são selecionadas plantas mostrando níveis baixos ou indetectáveis de proteína no tecido da planta, de preferência em folhas e pólen, mais preferivelmente em folhas, plantas as quais, quando de ferimento-indução, mostram pelo menos um aumento de 5 vezes na expressão em folhas.

Uma "estufa'', conforme usado aqui, se refere a um ambiente de crescimento relativamente estável para plantas o qual protege as plantas das condições normais no campo, com nenhuma ou pouca infestação por insetos, coelhos, pássaros ou outros animais ou fatores externos (tais como vento ou temporais) os quais podem danificar uma planta de safra no campo. Uma estufa típica é feita, em sua maioria, de materiais transparentes, tais como vidro ou plástico, de modo a permitir que a luz do dia natural atinja as plantas e pode ter luz regulada, meio de desenvolvimento (solo ou um meio artificial), água e suprimento de nutrientes em particular controle de temperatura. Uma estufa, conforme usado aqui, também inclui salas ou caixas sem nenhuma luz do dia, na medida em que uma fonte de luz e um meio de crescimento seja proporcionado de modo que condições normais de crescimento da planta sejam estabelecidas. Como tal, uma estufa é o local mais adequado para medir os níveis de expressão basal ou de base em folhas com relação às estruturas ferimento-induzidas da presente invenção (em um estado não-induzido), para fins comparativos.

Embora valores de expressão basais ou de base da proteína inseticida possam ser encontrados em folhas de plantas em um campo, espera-se que a infestação por insetos ou dano mecânico, por exemplo, por veículos, coelhos ou pássaros, às plantas em um campo venham a aumentar o nível de expressão através de indução do promotor ferimento-induzido da presente invenção e, conseqüentemente, não é um nível basal real que será, tipicamente, medido em todas as plantas em um campo.

Expressão em 'alta dose' ou resistência a insetos em 'alta dose', conforme usado aqui quando de referência a uma planta, de preferência uma planta monocotiledônea de acordo com a presente invenção, se refere a uma concentração da proteína inseticida em uma planta (medida através de ELISA como um percentual da proteína solúvel total, proteína solúvel total a qual é medida após extração de proteínas solúveis em um tampão de extração (por exemplo, o tampão de extração descrito em Jansens e outros, 1997) usando-se análise de Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)) a qual mata um estágio de desenvolvimento do inseto alvo o qual é significativamente menos suscetível, de preferência entre 25 a 100 vezes menos suscetível à toxina do que o primeiro estágio larval do inseto e pode, assim, ser esperado que assegure controle total do inseto alvo, mais preferivelmente uma resistência a insetos em alta dose é a obtenção de pelo menos 97 por cento, de preferência pelo menos 99 por cento, mais preferivelmente 100 por cento de mortalidade com relação ao quarto estágio larval (para insetos tendo 5 estágios larvais) ou o último estágio larval (para insetos tendo 4 ou menos estágios larvais) de um inseto alvo, conforme medido 10 a 14 dias após infestação de tal planta pelo inseto em bioensaios padrão com insetos, de preferência bioensaios com plantas íntegras, de uma planta tendo expressão em alta dose ou resistência a insetos em alta dose. A existência de uma espécie de inseto alvo (isto é, uma espécie de inseto a qual pode causar dano comercialmente significativo a uma espécie ou variedade de planta e o qual é, tipicamente, um inseto para o qual uma planta transgê-nica é desenvolvida) para a qual uma planta transformada de acordo com a presente invenção proporciona uma resistência a insetos em alta dose é suficiente para que uma planta seja designada como proporcionando expres- são em "alta dose" de acordo com a presente invenção. Também incluídas na presente invenção estão células de planta ou tecidos de planta, particularmente células de planta ou tecidos de planta de milho, quer contidos em uma planta ou presentes em uma cultura in vitro, transformados com o gene quimérico ferimento-induzido da invenção, que têm uma resistência a insetos em alta dose, conforme descrito acima, usando-se bio-ensaios com insetos.

Alta dose, quando de referência ao controle de ECB em milho, conforme usado aqui, se refere à produção de proteína inseticida pela planta no estágio de espiralamento mediano em uma quantidade a qual é tóxica para larvas de ECB no estágio L4 (Broca do Milho Europeu. Ecology and Management. 1996. North Central Regional Extension Publication N- 327. lowa State University, Ames, lowa), conforme pode ser determinado através de ensaios de toxicidade com infestação artificial conforme descrito aqui, em que uma mortalidade de pelo menos 90%, de preferência pelo menos 97, mais preferivelmente pelo menos 99%, ainda mais preferivelmente 100% das larvas de ECB em L4 é obtida em um teste 14 dias, de preferência 10 dias, após infestação das plantas com larvas L4. Surpreendentemente, uma expressão em alta dose de uma proteína inseticida é obtida nas plantas de milho da invenção usando-se o promotor TR2' para acionar a expressão fe-rimento-induzida, mesmo quando a expressão é baixa ou indetectável por protolocos ELISA sensíveis em um estado não-induzido e a expressão é induzida apenas quando de alimentação por insetos. Conforme é comum em experimentos de transformação de plantas, algumas das plantas obtidas após transformação não serão adequadas para desenvolvimento adicional e linhagens de plantas adequadas com baixa expressão basal.ou de base precisarão ser selecionadas a partir dos eventos de transformação obtidos e, de preferência, tais linhagens de plantas contêm apenas um DNA inserido que codifica uma proteína inseticida. Tipicamente, linhagens de plantas comercialmente aceitáveis são obtidas de uma centena, de preferência de várias centenas, de plantas iniciais transformadas.

De acordo com a presente invenção, expressão 'ferimento-induzida' é, além disso, de preferência, caracterizada pelo fato de que o efeito do promotor é local, isto é, está limitado essencialmente àquelas células ou tecidos diretamente afetados pelo ferimento ou que circundam imediatamente o tecido ferido. Isso está em oposição a um efeito sistêmico, o qual assegura, direta ou indiretamente (através de uma cascata de reações), um efeito disseminado, mais particularmente a expressão disseminada de proteínas envolvidas nos mecanismos de defesa natural da planta. De preferência, a expressão da proteína inseticida em tecidos não-danificados da planta, em média, não é maior do que 0,01% da concentração de proteína solúvel total, mais preferivelmente não maior do que 0,005% da proteína solúvel total (valor médio de medições múltiplas tomadas de várias, pelo menos 3, particularmente pelo menos 5, plantas de um evento de transformação), conforme medido através de ELISA (veja acima) em plantas desenvolvidas em estufa. Em uma concretização preferida da presente invenção, a atividade do promotor ferimento-induzida em folhas, particularmente folhas de milho, está localizada na região do ferimento e não deverá ser detectada (usando-se ensaios ELISA) em uma região da planta, particularmente a folha, mais de 10 cm, particularmente mais de 2 cm distante do local do ferimento (por exemplo, não mais abaixo ou acima da folha do que a folha ferida na mesma planta, nem na mesma folha mais de 10 cm, particularmente mais de 2 cm, distante do local do ferimento sobre a folha). Isso limita eficazmente a expressão na planta, particularmente nas folhas, de preferência folhas de milho, àqueles locais onde a expressão é necessária (isto é, onde um inseto se alimenta ou pelo menos perfura o tecido da folha em uma tentativa de se alimentar) e, conseqüentemente, minimiza o estresse que podería ser causado sobre a planta através de expressão constitutiva em alto nível. Particularmente quando de empilhamento de vários genes que codificam diferentes proteínas (por exemplo, diferentes proteínas de controle de insetos) em uma planta, acredita-se que a expressão ferimento-induzida de um ou mais dos gene seja benéfica.

Em outra concretização, a expressão ferimento-induzida de uma proteína inseticida de acordo com a presente invenção é caracterizada por uma indução rápida de expressão, elevando de um nível basal ou de base para um nível maior de proteína (pelo menos auas vezes a quantiaaae nos controles, de preferência pelo menos 5 a 100 vezes a quantidade nos controles) em torno de 18 a 24 horas, de preferência a 18, 20 ou 24 horas, após ferimento usando-se um ensaio em que uma parte da folha é ferida, cortan-do-se a folha e incubando-se in vitro durante esse período de tempo (o nível basal ou de base é medido em partes de folha recentemente excisadas e não previamente feridas, as quais não são incubadas in vitro). O "promotor TR2", conforme usado aqui, se refere a qualquer promotor compreendendo a parte TR2' funcional (ou sintase de manopina, abreviada como mas) do elemento promotor duplo TR1’-TR2’ de Agrobacterium (Velten e outros, 1984; Langridge e outros, 1989). Assim, esse pode compreender o elemento TR2’ quer sozinho ou em combinação com o elemento TR1' divergente (Guevara-Garcia e outros, 1998) ou outros elementos (re-gulatórios) incluindo, mas não-limitado, a regiões intensificadoras, íntrons e semelhantes, na medida em que as características do promotor ferimento-induzidas de acordo com a presente invenção sejam substancialmente retidas. Em uma concretização preferida da presente invenção, a transcrição é dirigida a partir da região do promotor TR2' (e a sequência de codificação está, conseqüentemente, operavelmente ligada a e a jusante da seqüência do promotor TR2'), mesmo se o promotor duplo TR1’-TR2’ (ou qualquer parte do mesmo retendo o elemento promotor TR2') é usado. Mais particularmente, o promotor TR2', conforme usado aqui, se refere a uma região promotora compreendendo um fragmento de SEQ ID NO:1 abrangendo de uma posição de nucleotídeo entre as posições de nucleotídeos 1 e 336 à posição do nucleotídeo 483, de preferência compreendendo a seqüência de nucleotídeos 96 a 483 de SEQ ID NO:1, mais preferivelmente compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou um equivalente funcional da mesma, isto é, uma modificação da mesma capaz de direcionar a expressão ferimento-induzida em plantas, mais particularmente em plantas monocotiledôneas. Tais equivalentes funcionais incluem seqüências as quais são essencialmente idênticas a uma seqüência de nucleotídeo compreendendo pelo menos os nucleotídeos 328 a 483 (compreendendo o elemento promotor TR2', Velten e ou- tros, 1984) de SEQ ID NO: 1. Tais seqüências podem ser isoladas de diferentes gêneros de Agrobacterium. Altemativamente, tais equivalentes funcionais correspondem à seqüências as quais podem ser amplificadas usando-se iniciadores de oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 25, de preferência pelo menos cerca de 50 ou até 100 nucleotídeos consecutivos de nucleotídeos 328 a 483 de SEQ ID NO:1 em uma reação em cadeia de polimerase. Equivalentes funcionais do promotor TR2’ também podem ser obtidos através de substituição, adição ou deleção de nucleotídeos da se-qüência de SEQ ID NO:1 e incluem promotores híbridos compreendendo a parte TR2' funcional de SEQ ID NO:1. Tais seqüências promotoras podem ser parcial ou completamente sintetizadas.

As plantas da presente invenção são protegidas contra pestes de insetos através da expressão ferimento-induzida de uma quantidade de controle de proteína inseticida. Por controle entende-se uma quantidade tóxica (letal) ou combativa (subletal). De preferência, quando de indução, uma alta dose (conforme aqui antes definido) é produzida. Ao mesmo tempo, as plantas deverão ser morfologicamente normais e podem ser cultivadas da maneira usual para consumo e/ou produção de produtos. Além disso, as referidas plantas deverão eliminar substancialmente a necessidade de inseticidas químicos ou biológicos (com relação aos insetos objetivados pela proteína inseticida).

Diferentes ensaios podem ser usados para medir o efeito da expressão da proteína inseticida na planta. Mais particularmente, a toxicidade da proteína inseticida produzida em uma planta de milho à Ostrínia nubilalis ou ECB (também referido aqui como eficácia contra ECB) pode ser ensaiada in vitro através de testagem da proteína extraída da planta em bioensaios de alimentação com larvas de ECB ou através de classificação da mortalidade de larvas distribuídas sobre material de folha de plantas transformadas em um disco de petri (ambos os ensaios descritos por Jansens e outros, 1997). No campo, a infestação com larvas de ECB da primeira geração (ECB1) é avaliada baseado em classificações de danos na folha (Guthrie, 1989), enquanto que a avaliação do número total de túneis no caule por planta e ex- tensão do túnel no caule são indicativos de dano por alimentação no caule por ECB da segunda geração (ECB2) (veja, por exemplo, Jansens e outros, 1997 para análises da extensão de túneis no caule).

As plantas da presente invenção também compreendem, opcionalmente, em seu genoma um gene que codifica resistência a herbicidas. Mais particularmente, o gene da resistência a herbicidas é o gene bar ou o pat, o qual confere resistência ao glufosinato à planta, isto é, as plantas são tolerantes ao herbicida Liberty™. A tolerância ao Liberty™ pode ser testada de diferentes formas. Por exemplo, a tolerância pode ser testada através de aplicação do Liberty™ por meio de pulverização. Tratamentos por pulverização deverão ser feitos entre os estágios V2 e V6 das plantas para melhores resultados. Plantas tolerantes são caracterizadas pelo fato de que a pulverização das plantas com pelo menos 200 gramas de ingrediente ativo/hectare (g.a.i./ha), de preferência 400 g.a.i./ha e possivelmente até 1600 g.a.i./ha (4X a taxa normal no campo), não mata as plantas. Uma aplicação disseminada deverá ser aplicada em uma taxa de 28-34 oz de LibertyTM + Sulfato de Amônio 31b por acre. É melhor aplicar em um volume de 20 galões de água por acre usando-se um bocal do tipo ventilador plano, ao mesmo tempo em que se toma cuidado para não direcionar as aplicações de pulverização diretamente sobre a espiga das plantas para evitar queima por tensoati-vo sobre as folhas. O efeito do herbicida deverá aparecer dentro de 48 horas e é claramente visível dentro de 5-7 dias. Exemplos de outros genes de resistência a herbicida são os genes que codificam a resistência ao phenmedipham (tal como o gene pmph, US 5.347.047; US 5.543.306), os genes que codificam a resistência ao glifosato (tais como os genes EPSPS,. US 5.510.471), genes que codificam a resistência à bromoxinila (tal como descrito na US 4.810.648) genes que codificam a resistência à sulfoniluréia (tal como descrito no EPA 0 360 750), genes que codificam a resistência ao herbicida dalapon (tal como descrito no WO 99/27116) e genes que codificam a resistência à ciana-mida (tal como descrito no WO 98/48023 e WO 98/56238) e genes que codificam a resistência a inibidores da sintetase de glutamína, tal como PPT (tal como descrito no EP-A-0 242 236, EP-A-0 242 246, EP-A-0 257 542).

De acordo com uma concretização preferida da invenção, o gene quimérico compreendendo um DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2' pode ser introduzido (simultaneamente ou seqüencialmente) em combinação com outros genes quiméricos em uma planta, de modo a se obter diferentes características na planta (também referido como 'empilhamento'). Similarmente, a planta da invenção contendo um gene quimérico compreendendo um DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2' é particularmente adequada para combinação com outras características. Essas outras características incluem, mas não estão limitadas, a características tais como aquelas codificadas por genes quiméricos os quais conferem resistência a insetos, resistência a herbicidas, tolerância a estresse ou estiagem ou características as quais modificam outras características agronômicas da planta. Tal característica pode também abranger a síntese de um produto a ser recuperado da planta. A introdução de um DNA estranho ou um gene quimérico no ge-noma de uma planta, célula ou tecido pode ser obtido de diferentes formas e não é crítica para a presente invenção. A transformação genética com sucesso de monocotiledôneas foi obtida através de uma série de métodos, incluindo transformação Agrobacterium-mediada (conforme descrito, por exemplo, com relação ao milho na US 6.074.877 ou US 6.140.553), bombardeamento de micro-projétil (conforme descrito, por exemplo, por Chen e outros, 1994), captação direta de DNA em protoplastas (conforme descrito, por exemplo, por Data e outros, 1999; Poulsen, 1996) e eletroporação (D’Halluin e outros, 1992).

Os exemplos não limitativos a seguir descrevem a construção de genes quiméricos compreendendo uma seqüência de DNA que codifica uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2’, para expressão em plantas e plantas resistentes a insetos obtidas a partir da mesma. A menos que de outro modo especificado nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão conforme descrito em Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, nos Vo- lumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Bio-logy, Current Protocols, USA e nos Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Os materiais padrão e métodos para trabalho molecular com plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Cray, conjuntamente publicado pela BIOS Scientific Publications Ltda. (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Materiais padrão e métodos para reações em cadeia de polimerase podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Iniciador: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e em McPherson e outros (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeiro Edição, Springer Verlag, Alemanha.

No decorrer da descrição e nos Exemplos, referência é feita às seguintes seqüências representadas na listagem de seqüência: SEQ ID NO:1 : seqüência de nucleotídeos de uma concretização preferida do promotor TR2' SEQ ID NO:2 : seqüência do pTSVH0212 SEQ ID NO:3 : seqüência de uma seqüência de codificação crylAb modificada.

Exemplos Exemplo 1. Geração de Eventos com um gene estranho sob o controle do promotor TR2’. a) Desenvolvimento de eventos Para a avaliação da expressão ferimento-induzida de uma seqüência de DNA que codifica um gene inseticida, uma estrutura foi feita compreendendo uma região promotora compreendendo o. promotor TR2’ (Velten e outros, 1984) direcionando a expressão de uma proteína CrylAb modificada. O plasmídeo pTSVH0212 contendo os genes de interesse colocados entre as bordas de T-DNA (também referido como ‘TR2’-Cry1Ab’) foi usado para transformação Agrobacterium-mediada (WO 98/37212). PTSVH0212 ^nos-bar-pSSSSxT^-modcrylAb-Sbcs (SEQ ID NO:2) A arquitetura da estrutura PTSVH0212 é proporcionada na Tabela 1. Para plantas de controle com expressão constitutiva da proteína in- seticida, as transformações foram realizadas com estruturas compreendendo uma seqüência de DNA que codifica a proteína CrylAb modificada sob o controle do promotor 35S do Vírus Mosaico da Couve-Flor (Franck e outros, 1980)(referida como 35S-cry1Ab) ou o promotor do gene GOS2 de arroz (de Pater e outros, 1992) com o líder cab22 de Petúnia (Harpster e outros, 1988)(também referido como ‘Gos/cab-cry1Ab’) ou a seqüência líder 5’ do gene GOS2 de arroz, contendo o segundo éxon, o primeiro íntron e o primeiro éxon do transcrito GOS (de Pater e outros, 1992)(referida como ‘Gos/gos-crylAb’). Todas as estruturas incluíam o gene 35S-bar.

Mudas regeneradas foram selecionadas baseado na tolerância ao Liberty. b) Avaliação de eventos Os transformantes de Agrobacterium foram verificados com relação à presença da seqüência do vetor na borda esquerda do T-DNA. Análises por Southern blot foram realizadas com material da folha dos transformantes primários (TO).

Exemplo 2. Expressão ferimento-induzida de uma proteína inseticida, i) expressão basal da proteína inseticida O nível basal de expressão da proteína inseticida CrylAb modificada foi determinado através de ELISA em sanduíche da CrylAb com uma fração de IgG policondensada de um anti-soro policlonal de coelho contra CrylAb como primeiro anticorpo e um anticorpo monoclonal contra a CrylAb como um segundo anticorpo, após extração da proteína solúvel usando-se o método de extração e o tampão descritos em Jansens e outros, 1997. Amostras de folhas de plantas no estágio V3, pólen e folhas de plantas no estágio R1 e folhas, caule e pólen na colheita foram tomadas de plantas na estufa (os estágios do milho são conforme determinado em ‘How a Com Plant Develops, Special Report NQ 48, lowa State University of Science and Technology, Cooperative Extension Service, Ames, lowa, Reimpresso em Junho de 1993; veja também o website na internet contendo a informação rele-vanteem: http://www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agriculture/com/com_develop/ ComGrowthStages.html:). Como uma comparação, amostras foram tomadas de plantas transformadas com as estruturas Gos/gos-cry1Atx Os resultados são proporcionados na Tabelâ 2 como um percentual de proteína CrylAb detectada por proteína solúvel total (medido usando-se o ensaio de Bradford (Bio-rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)). O valor médio representa a média de 5 amostras tomadas de diferentes linhagens de plantas de um evento de transformação.

Tabela 2. Expressão de proteína CrylAb em diferentes tecidos de plantas transformadas com as estruturas TR2’-cry1Ab e Gos/gos-cry1Ab Para as plantas obtidas da transformação com a estrutura TR2’-crylAb, verificou-se que os valores médios para a expressão basal da proteína CrylAb modificada na estufa estavam abaixo do limite de detecção (0,001% ou 0,000 % da proteína solúvel total) em todas as amostras de folha tomadas de plantas no estágio V3, no estágio R1 ou na colheita. Descobriu-se que a expressão basal média da proteína inseticida no caule estava em torno de 0,01 % do teor de proteína solúvel total para a maioria das plantas na colheita. Em plantas obtidas com a estrutura Gos/gos-cry1 Ab, a expressão da proteína CrylAb estava acima de 0,2% em todas as amostras de folha e até mais de 1 % em algumas das amostras de caule tomadas na colheita. ii) expressão ferimento-induzida da proteína inseticida Foram realizados estudos na estufa para determinar a expressão da proteína inseticida CrylAb sobre o dano em plantas não-transformadas, plantas obtidas com a estrutura TR2’-cry1Ab e plantas obtidas com a estrutura Gos/cab-cry1Ab. Folhas e raízes foram danificadas através de corte. O ferimento foi feito sobre folhas totalmente expandidas, cada corte perpendicular em mm foi feito com um bisturi sobre a folha sem danificar a estria mediana. Amostras de folha foram tomadas antes de 18 horas após dano mecânico. Os níveis de proteína CrylAb foram medidos através de ELISA (Tabela 3) sobre partes excisadas de folhas (partes de folha foram cortadas 2 a 3 mm em torno do ferimento) que foram incubadas durante 18 horas em uma câmara de desenvolvimento a 20 °C em um disco de petri sobre um papel filtro umedecido com meio Murashige e Skoog (meio MS, veja Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D.. Cray, conjuntamente publicado pela BIOS Scientific Publications Ltda. (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido, para composição) - pedaços de folha de controle de tamanho similar foram cortados de plantas e foram colocados imediatamente sobre gelo seco para medição da proteína (sem incubação in vitro). As médias representam médias de 5 plantas por evento de transformação.

Tabela 3. Expressão de proteína inseticida em diferentes partes da planta antes e após ferimento mecânico A expressão da proteína CrylAb estava novamente ausente ou em torno dos limites de detecção em folhas, caules e sementes dos diferentes eventos de TR2’-cry1Ab testados. Nenhuma expressão significativa foi encontrada em folhas e pólen no estágio V4 e em plantas com floração. Expressão constitutiva em torno de 0,02-0,03% da proteína solúvel total foi observada nas raízes dessas plantas. Quando as folhas são mecanicamente danificadas, expressão da proteína CrylAb é induzida e vai para 0,05-0,1%. Os eventos de 35S-cry1Ab mostraram expressão constitutiva da proteína CrylAb em tomo de 0,5% nas folhas de plantas V3, a despeito do ferimento. Durante floração e colheita, níveis de expressão em torno de 0,1-0,2% foram medidos antes e após ferimento.

Um ensaio similar, em que o ferimento era in planta (sem incubação in vitro de uma parte excisada da folha) sobre plantas desenvolvidas em estufa, resultou em valores de expressão menores, com um aumento ainda acentuado na expressão sobre o ferimento mostrado. Nesse ensaio, larvas de ECB no segundo estágio larval foram colocadas em gaiolas com grampo sobre cinco plantas de milho de WI602-0402 no estágio VT. Sobre cada planta, sessenta horas depois, amostras foram tomadas da área da folha danificada na gaiola com grampo, de folhas 2 cm ou 10 cm para cima e para baixo da gaiola com grampo e de uma folha acima e abaixo da folha com a gaiola com grampo. Amostras de folhas foram também coletadas no início do experimento. ELISA da CrylAb foi realizado sobre as amostras, a média (negrito) e desvio padrão foram calculados. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Concentração de CrylAb em linhagens de plantas TR2’-Cry1Ab (ferimento através de alimentação por insetos).

Em um outro ensaio, cinco plantas no estágio VT de eventos WI604-1602 e WI606-1206 foram danificadas com um bisturi na estufa. De cada planta, quarenta horas depois, amostras foram tomadas da área da folha danificada (tipicamente, 2 a 3 mm em torno do local do ferimento), da mesma folha 2 cm e 10 cm para acima e para baixo da área danificada e de uma folha acima e abaixo da folha ferida. Amostras de folha também foram coletadas no início do experimento. Elisa da CrylAb foi realizado sobre as amostras, média (negrito) e o desvio padrão foram calculados.

Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5. Concentração de CrylAb em linhagens de plantas TR2’-Cry1Ab (ferimento através de um bisturi).

Tabela 5. -continuação- Medições em experimentos adicionais no campo confirmaram que os baixos níveis de expressão basal da proteína CrylAb em plantas (usando-se material fresco de folha tomado das plantas, não incubado in vitro)\ em um experimento no campo com 5 linhagens de plantas endogâmi-cas por evento compreendendo a estrutura pTR2’-Cry1Ab, entre 0,001 e 0,003% da proteína solúvel total da folha era proteína CrylAb (média de 5 plantas por eventos (desvio padrão médio de 0,001 a 0,004 %)) no campo. Também, um experimento adicional no campo mostrou que a maioria da proteína CrylAb é encontrada em plantas de milho artificialmente infestadas por larvas de ECB no campo do que em plantas não-infestadas com insetos. Os níveis de expressão com relação à CrylAb encontrados nesse experimentos (8 plantas) estavam, em média, entre 0,001 e 0,002% da proteína solúvel total em folha vegetativa, entre 0,003 e 0,046% da proteína solúvel total em folhas R1 e entre 0,009 e 0,017 % da proteína solúvel total em fo- lhas R5-6 (usando-se material fresco de folha tomado das plantas, não incubado in vitro). Conforme esperado, a infestação por insetos no campo proporcionou concentração aumentada de proteína CrylAb em algumas plantas (amostras foram tomadas de plantas aleatoriamente) Exemplo 3. Resistência de plantas com expressão ferimento-induzível contra insetos a) Eficácia contra infestação controlada por larvas de ECB no quarto estágio larval Plantas de milho espiralado foram colocadas em um cilindro de plexiglass e infestadas com 10 ou 15 larvas da broca do milho Europeu no quarto estágio larval. Após 10 dias, as plantas foram dissecadas e a sobrevivência percentual das larvas foi classificada por planta. Os resultados são proporcionados na Tabela 6.

Tabela 6. Eficácia contra larvas de ECB no quarto estágio larval Descobriu-se que a eficácia do controle de larvas de ECN no quarto estágio larval em infestação controlada era de 100% para todas as plantas TR2’-cry1Ab testadas. As plantas de controle mostram uma média de mortalidade máxima de 50%. Como acredita-se que as larvas de ECB no quarto estágio larval sejam entre 25 e 100 vezes menos suscetíveis à proteína CrylAb modificada do que larvas no primeiro estágio larval, o nível de proteína produzido nas plantas TR2’-cry1Ab pode ser considerado como 'alta dose', mesmo embora valores de expressão, conforme medido em tais plantas por ferimento-indução, ainda sejam, tipicamente, relativamente baixos.

b) Eficácia contra ECB

Catorze eventos foram avaliados com relação à eficácia contra ECB em experimentos na estufa e no campo (Tabela 7). Os resultados são apresentados como a extensão média de túneis (com valor de desvio padrão entre parênteses) sobre a extensão máxima de túneis por cada planta (média (sd)/extensão max/pl). Na estufa, a extensão média dos túneis foi tomada de medições sobre 10 plantas. No campo, a eficácia contra ECB é expressa como a média de 3 valores obtidos para diferentes grupos de 10 plantas. Quatro dos cinco eventos de cópia-única (indicados por um asterisco) proporcionaram controle total contra ECB2, determinado como uma extensão média do túnel de menos de 3,5 cm.

Tabela 7: eficácia contra ECB em experimentos na estufa e no campo Nenhuma penalidade sobre o desempenho econômico foi observada para as plantas após o segundo cultivo (espiga por fileira) de diferentes eventos de TR2’ em qualquer um dos locais testados. c) Eficácia contra Sesamia nonagrioides Cinco plantas de milho espiralado compreendendo a estrutura TR2’-cry1Ab foram, cada uma, infestadas com 2 massas de ovos. O dano foi classificado após 14 dias e o número de larvas contado. Foi realizada a classificação média dos danos (expressas em altura da planta e extensão de túneis por planta em cm) nas cinco plantas. Os resultados são fornecidos na Tabela 8.

Tabela 8 Evento Número de larvas Altura da planta Túneis por planta por planta em cm em cm WI600-0802 0,6(1,3) 198(8,4) 0 B73 Controle 197,2(14,0) 84(5,5) 70(9,4) Os resultados indicam que existe também um bom controle da broca do caule do Mediterrâneo nas TR2’-cry1Ab testadas.

Exemplo 4. Análise Comparativa.

Análise da expressão usando-se o promotor MPI (descrito por Breitler e outros, 2001 como sendo um promotor ferimento-induzido) em plantas de milho com a mesma seqüência de codificação CrylAb conforme usado acima é feita para comparar os níveis basais (não-induzidos) e a feri-mento-indução no campo. Plantas de milho expressando a porção de proteína inseticida CrylAb sob o controle desse promotor MPI mostra um nível médio de expressão basal de pelo menos cerca de 0,04% a proteína CrylAb por proteína solúvel total em folhas em testes na estufa. Também, em testes iniciais na estufa usando-se 2 eventos de MPI-Cry1Ab, alguma variação nos níveis de expressão quando de ferimento é encontrada, mas um aumento ferimento-induzido na expressão da proteína CrylAb (média) de pelo menos 5 vezes aquele do nível basal (média) não é observado nesses eventos (após ferimento mecânico), quando de medição da concentração em materi- al da planta recentemente tomado dessas plantas e em partes de folhas soltas que são incubadas in vitro (em ambos os casos, a concentração é medida em diferentes amostras a 21 horas e 24 horas após ferimento). Con-seqüentemente, não existe nenhuma ou apenas uma indução fraca de expressão da proteína CrylAb (comparado ao nível de expressão basal de proteína) nesses ensaios com o promotor MPI.

Também, em análise comparativa, o desempenho no campo das plantas da invenção usando-se o promotor TR2', é comparado a plantas de milho comercialmente disponível expressando uma porção de proteína CrylAb. Nesses ensaios, plantas de milho obtidas de eventos MON810 e Bt11 (veja petições publicadas da USDA desses eventos de milho aprovados para uma descrição detalhada), os quais usam um promotor 35S para altos níveis de expressão constitutiva e os quais são conhecidos por proporcionar alta dose de resistência a insetos, são usadas.

Em um experimento no campo, a extensão média do túnel (em cm por caule, medida após divisão do caule conforme descrito em Jansens e outros (1997)) com relação à infestação artificial pela broca do milho Europeu é de 0, 0, 0,04, 0 e 0,21 cm, respectivamente, para 5 eventos diferentes de milho Cry1Ab-TR2’, enquanto que a extensão média do túnel com relação ao milho MON810 é de 0,3 e com relação ao milho Bt11 de 0,13 (em linhagens de milho de controle não-transformado, extensões de túnel de 12,2 a 39,92 cm são encontradas no mesmo experimento). Conseqüentemente, análise comparativa do promotor TR2’ ferimento-induzível em milho mostra que a expressão de uma proteína inseticida sob o controle do promotor TR2’ em milho proporciona alto nível de resistência a insetos comparável àquela obtenível com eventos comercialmente disponíveis com promotores constitutivos.

Em outro experimento no campo, a extensão média do túnel (em cm por caule, medida após divisão do caule conforme descrito em Jansens e outros (1997)) com relação à infestação artificial com a broca do milho do Sudeste é de 0,53, 0,68, 0,3, 0,64 e 0,6 cm, respectivamente, para os 5 eventos diferentes em milho Cry1Ab-TR2’, enquanto que a extensão média com relação ao milho MON810 é de 0,43 e para o milho Bt11 de 0,15 (em linhagens de milho de controle não-transformadas, extensões do túnel de 32 a 39,6 cm são encontradas no mesmo experimento, alguns não tinham mais sustentação das plantas em virtude de quebra do caule devido aos túneis).

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<120> MÉTODOS PARA OBTENÇÃO DE EXPRESSÃO INDUZIDA POR FERIMENTO DE UMA TOXINA INSETICIDA EM UMA PLANTA DE MILHO, PARA FABRICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE A INSETOS, E PARA OBTENÇÃO DE EXPRESSÃO AUMENTADA DE UMA PROTEÍNA INSETICIDA EM UMA PLANTA DE MILHO QUANDO FERIDA <130> WINEXP WOl <140> PI0309874-5 <141> 29/04/2003 <150> US 10/137,325 <151> 03/05/2002 <160> 3 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 1 tttcacgtgt ggaagatatg aatttttttg agaaactaga taagattaat gaatatcggt 60 gttttggttt tttcttgtgg ccgtctttgt ttatattgag atttttcaaa tcagtgcgca 120 agacgtgacg taagtatccg agtcagtttt tatttttcta ctaatttggt cgtttatttc 180 ggcgtgtagg acatggcaac cgggcctgaa tttcgcgggt attctgtttc tattccaact 240 ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt tgaatagata cgctgacacg ccaagcctcg 300 ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta cagcaagaac ggaatgcgcg tgacgctcgc 360 ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg ataaatagcc ttgcttccta ttatatcttc 420 ccaaattacc aatacattac actagcatct gaatttcata accaatctcg atacaccaaa 480 tcg 483 <210> 2 <211> 13199 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência do plasmideo pTSVH0212 <220> <221> característica variada <222> (1)..(25) <223> Sequência da borda esquerda de TL-DNA de pTiB6S3 <220> <221> polyA_sinal <222> (56)..(316) <223> Fragmento contendo sinais de poliadenilação a partir da região não-traduzida 3' do gene nopalina sintase do T-DNA de pTiT37 <220> <221> característica variada <222> (336)..(887) <223> Sequência de codificação de fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces hygroscopicus <220> <221> promotor <222> (888) .. (1720) <223> Região promotora de transcrição 35S do vírus do mosaico da couve-flor (P35S) <220> <221> promotor <222> (1770) .. (2252) <223> Fragmento de promotor TR2' derivado do T-DNA direito da cepa ACH5 de Agrobacterium do tipo octopina ACH5 <220> <221> característica variada <222> (2261) .. (4114) <223> Sequência de codificação de parte da proteína CrylAb5 (crylAb modificada) <220> <221> polyA_sinal <222> (4128) .. (4422) <223> Fragmento contendo sinais de poliadenilação a partir da região não-traduzida 3' do gene octopina sintase do TL-DNA de pTiAchõ <220> <221> característica variada <222> (4470) .. (4446) <223> Sequência da borda direita de TL-DNA de pTiB6S3 <400> 2 cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60 tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120 ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180 taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240 gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300 tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360 ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420 ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480 atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540 gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600 cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660 gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720 cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780 aagttgaccg tgcttgtctc 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ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 5040 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 5100 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 5160 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 5220 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 5280 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 5340 cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 5400 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 5460 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 5520 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 5580 tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 5640 agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca 5700 cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 5760 acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 5820 acgcgcgagg cagggtgcct 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ctagcctggt cactgtcaca acgtcgccag ggcgtaggtg 9240 gtcaagcatc ctggccagct ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct tctcggaaaa 9300 cagcttggtg cagccggccg cgtgcagttc ggcccgttgg ttggtcaagt cctggtcgtc 9360 ggtgctgacg cgggcatagc ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca tggcgtaatg 9420 tctccggttc tagtcgcaag tattctactt tatgcgacta aaacacgcga caagaaaacg 9480 ccaggaaaag ggcagggcgg cagcctgtcg cgtaacttag gacttgtgcg acatgtcgtt 9540 ttcagaagac ggctgcactg aacgtcagaa gccgactgca ctatagcagc ggaggggttg 9600 gatcgatccc tgctcgcgca ggctgggtgc caagctctcg ggtaacatca aggcccgatc 9660 cttggagccc ttgccctccc gcacgatgat cgtgccgtga tcgaaatcca gatccttgac 9720 ccgcagttgc aaaccctcac tgatccgtcg acgcgtttaa tgaccagcac agtcgtgatg 9780 gcaaggtcag aatagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 9840 gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 9900 ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 9960 tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 10020 cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 10080 acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 10140 cgggaaacgt cttgctcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg 10200 tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg 10260 aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt 10320 acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag 10380 cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca 10440 gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca 10500 gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagccgcgta 10560 tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt 10620 gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg 10680 ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt 10740 gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac 10800 caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 10860 ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg 10920 ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca gagcattacg 10980 ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc 11040 agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca 11100 ccaactggtc cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg 11160 atgatggggc gattcaggcc tggtatgagt cagcaacacc ttcttcacga ggcagacctc 11220 agcgctattc tgaccttgcc atcacgactg tgctggtcat taaacgcgtc gacccgttcc 11280 atacagaagc tgggcgaaca aacgatgctc gccttccaga aaaccgagga tgcgaaccac 11340 ttcatccggg gtcagcacca ccggcaagcg cccggacggc cgaggtcttc cgatctcctg 11400 aagccagggc agatccgtgc acagcacttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc 11460 tgacgatgcg tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg 11520 acttcgctgc tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga 11580 acccagtgga cataagcctg ttcggttcgt aagctgtaat gcaagtagcg tatgcgctca 11640 cgcaactggt ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc 11700 atggcttgtt atgactgttt ttttggggta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa 11760 gcgcgttacg ccgtgggtcg atgtttgatg ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag 11820 ggcagtcgcc ctaaaacaaa gttaaacatc atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg 11880 actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc 11940 gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg 12000 ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt 12060 ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt 12120 gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga 12180 gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat 12240 ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg 12300 gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta 12360 acgctatgga actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg 12420 tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac 12480 tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct 12540 tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc 12600 cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aatgtctaac aattcgttca 12660 agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaac tcaagcgtta gatgcactaa gcacataatt 12720 gctcacagcc aaactatcag gtcaagtctg cttttattat ttttaagcgt gcataataag 12780 ccctacacaa attgggagat atatcatgaa aggctggctt tttcttgtta tcgcaatagt 12840 tggcgaagta atcgcaacat ccgcattaaa atctagcgag ggctttacta agctagcttg 12900 cttggtcgtt ccggtaccgt gaacgtcggc tcgattgtac ctgcgttcaa atactttgcg 12960 atcgtgttgc gcgcctgccc ggtgcgtcgg ctgatctcac ggatcgactg cttctctcgc 13020 aacgccatcc gacggatgat gtttaaaagt cccatgtgga tcactccgtt gccccgtcgc 13080 tcaccgtgtt ggggggaagg tgcacatggc tcagttctca atggaaatta tctgcctaac 13140 cggctcagtt ctgcgtagaa accaacatgc aagctccacc gggtgcaaag cggcagcgg 13199 <210> 3 <211> 1854 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência que codifica a proteína crylAb modificada <400> 3 atggctgaca acaaccccaa catcaacgag tgcatcccct acaactgcct gagcaaccca 60 gaggtggagg tgctgggtgg tgagaggatc gagaccggtt acacccccat cgacatcagc 120 ctgagcctga cccagttcct gctgagcgag ttcgtgcctg gtgctggctt cgtgctggga 180 ctagtggaca tcatctgggg catcttcggt cccagccagt gggatgcctt cctggtgcag 240 atcgaacagt taattaacca aagaatagaa gaattcgcta ggaaccaagc catctctaga 300 ctggagggcc tgagcaacct gtaccagatc tacgccgaga gcttccgcga gtgggaggct 360 gaccccacca acccagccct gcgcgaggag atgcgcatcc agttcaacga catgaactct 420 gccctgacca ccgccatccc actcttcgct gtccagaact accaggtccc tctcctgtct 480 gtctatgtgc aagctgccaa cctccatctc agcgtccttc gcgacgtgag cgtctttggg 540 cagaggtggg ggttcgacgc tgccaccatc aacagccgct acaacgacct gacgcgtctg 600 atcggcaact acaccgacca cgcagtgaga tggtacaaca ctgggcttga gagggtctgg 660 ggtcccgaca gccgcgactg gatcaggtac aaccagttca ggcgtgaact cactctcacc 720 gtcttggata tcgtcagtct cttccccaac tacgacagca ggacctaccc tatccggact 780 gtgagccagc tgacccgcga gatctacacc aaccccgtgc tggagaactt cgacggcagc 840 ttcaggggct ctgcccaggg catcgagggc agcatccgca gcccccacct gatggacatc 900 ctgaacagca tcaccatcta cactgacgcc cacaggggtg agtactactg gtctggccac 960 cagatcatgg cttctcccgt gggcttcagc ggtcccgagt tcaccttccc cctgtacggc 1020 acaatgggca acgctgcccc acagcagagg atcgtggccc agctgggcca gggcgtgtac 1080 cgcaccctga gcagcaccct gtacaggagg cccttcaaca tcggcatcaa caaccagcag 1140 ctgagcgtgc tggatggcac cgagttcgcc tacggcacca gcagcaacct gcccagcgcc 1200 gtataccgca agagcggcac tgtggacagc ctggacgaga tcccacccca gaacaacaac 1260 gtgcccccta ggcaggggtt ctctcatcgc ctctcacacg tgagcatgtt ccgcagcggc 1320 ttcagcaaca gcagcgtgag catcatcagg gctcccatgt tcagctggat ccaccgcagc 1380 gctgagttca acaacatcat tccaagtagc cagatcactc agatcccact caccaagagc 1440 accaacctgg gctccgggac tagcgttgtc aagggaccag ggttcactgg aggcgacatc 1500 ctgaggagga ccagcccagg ccagatcagc accttaaggg tgaacatcac cgctcccctc 1560 agccaacgct acagggtcag gatcaggtac gcttccacca ccaacctgca gttccacacc 1620 agcatcgacg gcaggcccat caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc 1680 aacctgcaga gcggaagctt ccgcactgtg ggcttcacta ccccattcaa cttctccaac 1740 ggcagcagcg tgttcaccct gtctgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc 1800 gacaggatcg agtttgtccc agctgaggtg accttcgaag ctgagtacga ctga 1854 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas. Código de Controle Outras Informações: - Nome do Arquivo: P129134 25301675_1.txt - Data de Geração do Código: 13-07-2015 - Hora de Geração do Código: 08:22:45 - Código de Controle: - Campo 1: C7BF84B4D9B2C58F

- Campo 2: C76936D00698B8AA

Claims (8)

1. Método para obtenção de expressão induzida por ferimento de uma toxina inseticida em uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução na planta de um DNA exógeno compreendendo um gene quimérico compreendendo: (a) uma sequência de DNA que codifica uma proteína inseticida, e (b) uma região promotora expressável em planta compreendendo o promotor TR2’, e sendo que a referida planta de milho mata pelo menos 97% das larvas da broca do milho Europeu no quarto estágio larval em um bio-ensaio de 10 dias, e sendo que o referido promotor TR2’ é SEQ ID NO: 1.

2. Método, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida expressão induzida por ferimento apresenta um nível médio de expressão basal da proteína inseticida em folhas da referida planta na ausência de ferimento de 0,005 por cento da proteína solúvel total ou menos em plantas desenvolvidas em estufa.

3. Método para fabricação de uma planta de milho resistente a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução no genoma da referida planta de um DNA exógeno que compreende um gene quimérico compreendendo: (a) uma sequência de DNA que codifica uma proteína inseticida, e (b) uma região promotora expressável em planta compreendendo o promotor TR2’, sendo que a referida planta de milho mata pelo menos 97% das larvas da broca do milho Europeu no quarto estágio larval em um bio-ensaio de 10 dias, e sendo que o referido promotor TR2’ é SEQ ID NO: 1.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida expressão induzida por ferimento apresenta um nível médio de expressão basal da proteína inseticida em folhas da referida planta na ausência de ferimento de 0,005 por cento da proteína solúvel total ou menos em plantas desenvolvidas em estufa.

5. Método para obtenção de expressão aumentada de uma proteína inseticida em uma planta de milho quando ferida, caracterizado pelo fato de que o nível médio de expressão basal em folhas da referida planta na estufa, na ausência de ferimento, é de 0,005% da proteína solúvel total ou menos e, quando ferida, o referido nível médio de expressão aumenta pelo menos 5 vezes, o referido método compreendendo introdução no genoma da referida planta de um DNA exógeno que compreende um gene quimérico compreendendo: (a) uma sequência de DNA que codifica uma proteína inseticida, e (b) uma região promotora expressável em planta compreendendo o promotor TR2’, e sendo que o referido promotor TR2’ é SEQ ID NO: 1.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida expressão basal de 0,005% ou menos é medida em folhas no estágio V4.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida é uma proteína de Bt.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida proteína de Bt é selecionada do grupo consistindo em CrylAb, Cry1F, Cry2Ae, Cry9C e Cry2Ab e fragmentos inseticidas das mesmas.