BR102021008065A2

BR102021008065A2 - Polinucleotídeo, pares de iniciadores, métodos de detecção de material vegetal, construção genética, kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal, evento ctc75064-3, planta resistente a insetos, produto de comódite, método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente

Info

Publication number: BR102021008065A2
Application number: BR102021008065-5A
Authority: BR
Inventors: Antonio Adalberto Kaupert Neto; Ana Carolina Vieira Zakir Pereira; Lucas Cutri; Agustina Gentile; Maria Lorena Sereno; Wladecir Salles De Oliveira; Adriana Cheavegatti Gianotto; Karina Yanagui De Almeida
Original assignee: Ctc - Centro De Tecnologia Canavieira S.A.
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2022-11-08
Also published as: WO2022226617A1

Abstract

A presente invenção está relacionada à área de biotecnologia. Mais precisamente, é descrita uma construção genética e método para a produção de um evento de planta transgênica, especialmente de um evento de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), o qual é resistente à infestação pela praga Diatraea saccharalis, popularmente conhecida como broca comum, broca-da-cana ou apenas broca. A invenção descreve o evento, os métodos para identificação do evento, bem como métodos de detecção das inserções baseados nas regiões de intersecção entre o inserto e o genoma hospedeiro e as regiões flanqueadoras que o caracterizam.

Description

POLINUCLEOTÍDEO, PARES DE INICIADORES, MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MATERIAL VEGETAL, CONSTRUÇÃO GENÉTICA, KIT PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA EM UMA AMOSTRA DE MATERIAL VEGETAL, EVENTO CTC75064-3, PLANTA RESISTENTE A INSETOS, PRODUTO DE COMÓDITE, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE CANA-DE-AÇÚCAR RESISTENTE A INSETO E USO DE UMA PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU SEMENTE

Campo Técnico

[001] A presente invenção está relacionada à área de biotecnologia. Mais precisamente, é descrita uma construção genética e método para a produção de um evento de planta transgênica, especialmente de um evento de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), o qual expressa a toxina Cry1Ac apresentando resistência à infestação pela praga Diatraea saccharalis, popularmente conhecida como broca comum, brocada-cana ou apenas broca. A invenção descreve métodos para detecção do evento e de material derivado do evento resistente à infestação por broca-da-cana, assim apresenta polinucleotídeos iniciadores, sondas e as regiões flanqueadoras identificadoras de tal evento.

Descrição do Estado da Técnica

[002] A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma planta gramínea pertencente à família botânica Poaceae, sendo originária do Sudeste Asiático, mais precisamente da grande região central da Nova Guiné e Indonésia. Ela é uma das mais importantes espécies vegetais cultivadas nas regiões tropicais e subtropicais, com uma área maior que 23 milhões de hectares distribuídos em 121 países (FAO Statistical Yearbook 2012 p. 233).

[003] A cana-de-açúcar é fonte de matéria prima para a produção de açúcar, vinho, melaço, rum, cachaça (o destilado nacional do Brasil) e etanol para combustível. O bagaço que produzido após a moagem da cana-de-açúcar pode ser utilizado para enfardamento e fornecimento de energia calorífica, usada no moinho, e eletricidade, que é tipicamente vendida para a grade elétrica do consumidor, ou ainda como matéria prima para produção de etanol de segunda geração (BR 11 2014 02385-1). Desta forma, a agroindústria canavieira, responsável por gerar milhões de empregos na área, tem uma grande importância econômica e social, com geração de divisas por meio da comercialização de açúcar e etanol e pelo aproveitamento racional da biomassa vegetal.

[004] Mais recentemente, com o advento do tema aquecimento global e uso de fontes alternativas a combustíveis fósseis (biocombustíveis), o interesse mundial por cana-de-açúcar tem aumentado de maneira significativa. O uso do etanol derivado da cana de açúcar como fonte de energia renovável tem sido considerado de extrema importância para redução dos gases de efeito estufa e da dependência aos combustíveis fósseis, tendo sido considerado uma das peças chaves dentre os esforços para controle das mudanças climáticas mundiais (Savage, 2011).

[005] Devido à importância econômica e social da cana-deaçúcar, observa-se um grande esforço em pesquisas com o objetivo de definir melhores práticas agrícolas para o seu cultivo e de melhorar a qualidade das variedades cultivadas. Os esforços para melhoramento das características agronômicas da cana de açúcar têm focado no aumento da produção e acúmulo de açúcares, aumento da tolerância a estresses bióticos e abióticos, resistência e tolerância a pragas e patógenos, e desenvolvimento de tecnologias alternativas para a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (PI 0802153-8; PI 0904538-4; PI 1101295-1)

[006] A complexidade do genoma poliploide e aneuploide das variedades modernas de cana-de-açúcar, somada a sua base genética relativamente restrita e a baixa fertilidade, impõem grandes dificuldades e inúmeras limitações na seleção das plantas com as características agronômicas desejáveis por técnicas do melhoramento convencional (Souza et al, 2011; D´Hont & Glaszmann, 2005, Basel, v. 109, n. 1-3, p. 27-33; Cheavegatti-Gianotto et al., 2011), demandando grandes investimentos, mão de obra intensiva e prazos muito longos para serem considerados razoáveis considerando o contexto e demanda atual do mercado global.

[007] O aumento da produção de cana de açúcar observada nos últimos 20 anos é resultado não apenas do aumento da produtividade dos canaviais, mas também da diversificação das variedades cultivadas, o que permitiu a expansão da área cultivada de cana de açúcar para outras regiões geográficas. Essa expansão geográfica demanda o desenvolvimento de variedades adaptadas a diferentes condições edafoclimáticas, garantindo a sustentabilidade do mercado de cana de açúcar através do fornecimento contínuo de novos germoplasmas melhor adaptados às condições locais e capazes de controlar doenças e pragas.

[008] O melhoramento convencional é importante para o suprimento contínuo de variedades, mas não suficiente para atender o mercado atual já que parte das características desejáveis e necessárias para os cultivos modernos não pode ser encontrada no background genético das espécies, sendo fundamental o desenvolvimento de técnicas para a introdução de genes exógenos. Devido às limitações dos métodos de melhoramento convencional e da necessidade crescente de incorporar com celeridade e eficiência características desejáveis em diferentes variedades, o uso de técnicas de engenharia genética (biotecnologia) nos programas de melhoramento genético de cana-de-açúcar ganhou destaque, em especial devido ao sucesso comercial da incorporação de características agronômicas desejáveis por meio de engenharia genética em outras espécies vegetais (soja, milho, canola, beterraba e algodão, por exemplo).

[009] A engenharia genética de plantas envolve a transferência de genes de interesse para dentro de células vegetais (transformação genética), de tal maneira que uma progênie fértil e agronomicamente superior mantenha e expresse de forma estável o gene responsável pela característica desejada.

[0010] Apesar de comprovada a possibilidade de alteração genética (incorporação de características desejáveis) de cana-de-açúcar por meio de engenharia genética [resistência a vírus (Guo et al., 2015; Zhu et al., 2011), insetos (Kalunke, Kolge, Babu, & Prasad, 2009; Weng et al., 2011), herbicidas (Enrıquez-Obregon, Vazquez-Padron, PrietoSamsonov, De la Riva, & Selman- Housein, 1998; van der Vyver, Conradie, Kossmann, & Lloyd, 2013), tolerância a seca (Molinari et al., 2007; Reis et al., 2014), salinidade (Kumar, Uzma, Khan, Abbas, & Ali, 2014) e toxicidade a alumínio (Ribeiro, 2016), aumento da produção e acúmulo de açúcar (Bewg, Poovaiah, Lan, Ralph, & Coleman, 2016; Mudge et al., 2013)] , essa abordagem também é limitada por características intrínsecas da cana-de-açúcar, que apresenta respostas genótipo-dependentes à aplicação de técnicas de cultura de tecidos, baixa taxa de indução e regeneração de calos embriogênicos, além da impossibilidade de usar o embrião zigótico como tecido alvo na transformação genética, ao contrário de milho, arroz, trigo e outros cereais comerciais [(Anderson & Birch, 2012; Basnayake, Moyle, & Birch, 2011; Molinari et al., 2007)] . É frequente a obtenção de uma baixa taxa de eficiência de transformação, sendo observado alta variabilidade entre genótipos, havendo ainda inúmeros desafios a serem transpostos para a incorporação de características agronômicas desejáveis por meio de engenharia genética em cana-de-açúcar.

[0011] A cana-de-açúcar é tida como uma espécie recalcitrante para transformação genética e, apesar de terem sido avaliadas diversas abordagens de engenharia genética para essa espécie, ainda não há protocolos padrões que garantam a produção de eventos transgênicos (Smith et al. 1992; Rathius & Birch. 1992.; Chen et al. 1987; Arencibia. 1998; Manickavasagam et al. 2004.; Elliott et al. 1998)

[0012] Somada às limitações inerentes da espécie para a aplicação das técnicas existentes de engenharia genética devido à complexidade do genoma da cana-de-açúcar (alto grau de ploidia, aliado à presença de aneuploidia), não existem programas de introgressão de características de interesse agronômico em cultivares de cana de açúcar através de retrocruzamentos (reconstituição de um genótipo específico), como é comumente realizado em outras culturas de interesse comercial. Desta forma, para a "introdução" de uma mesma característica em mais de um germoplasma, possibilitando ganhos em produtividade em diferentes regiões de cultivo, é necessário realizar nova transformação genética, incorrendo nos mesmos custos e riscos associados ao primeiro evento obtido para aquela característica. Ainda hoje há muito pouca previsibilidade de sucesso para a introdução de uma mesma característica em diferentes variedades de cana de açúcar, sendo um processo extremamente genótipo-dependente, o que torna desafiador a construção de um portfólio de produtos geneticamente modificados para esta espécie.

[0013] A complexidade genotípica da cana de açúcar também impacta significativamente a caracterização dos eventos gerados de forma a garantir as características necessárias para a sua comercialização. A identificação inequívoca dos eventos transgênicos é fundamental para assegurar a sua rastreabilidade e monitoramento, sendo exigência regulatória para sua comercialização. A alta poliploidia do genoma da cana-de-açúcar e o alto número de regiões repetidas, associado a pouca informação existente sobre a sua organização e estrutura, constituem desafios para a caracterização dos eventos transgênicos gerados.

[0014] Existem diversos desafios técnicos a serem transpostos no campo do melhoramento genético de cana-de-açúcar para aumento da previsibilidade sobre os resultados esperados, mesmo quando aplicadas técnicas convencionais e/ou moleculares/genéticas amplamente conhecidas. Ainda assim, não restam dúvidas da urgência na obtenção de variedades melhoradas que apresentem características que impactem significativamente a produtividade da cultura e, portanto, o seu mercado.

[0015] Historicamente, as pragas agrícolas são um dos principais fatores que acarretam prejuízos na agricultura. No Brasil, a principal praga da cana-de-açúcar é a espécie Diatraea saccharalis Fabricius, 1794 (Lepidoptera: Crambidae), popularmente conhecida como broca comum, broca-da-cana ou apenas broca. Esta é encontrada em praticamente toda extensão cultivada da cultura, cuja área é de aproximadamente 10 milhões de hectares na atual safra 2019/20 (CONAB, 2019).

[0016] Após o acasalamento, a fêmea da broca-da-cana deposita de 200 a 400 ovos, em ambas faces e também nas bainhas das folhas verdes. Após a eclosão dos ovos, as larvas neonatas alimentam-se do parênquima foliar, migrando para a região da bainha à procura de abrigo. Permanecem nesta região por 7 a 10 dias, alimentando-se pela raspagem da bainha da folha ou da casca dos entrenós jovens. Após uma ecdise, as lagartas perfuram a casca do colmo, penetrando em seu interior. O inseto abre galerias no interior dos colmos, geralmente no sentido ascendente, à medida que se alimenta. No interior do colmo a lagarta passa por, aproximadamente, seis ecdises antes de se tornar adulto alado (DINARDO-MIRANDA, 2014). Esta é a fase do desenvolvimento em que o inseto provoca os danos econômicos à cultura (Figura 1).

[0017] O ataque da broca-da-cana também causa graves danos secundários à qualidade da matéria-prima utilizada para a produção do açúcar e do álcool pois a perfuração do colmo da cana-de-açúcar pela broca cria condições para entrada de fungos e bactérias oportunistas, especialmente Fusarium moniliforme e Colletotrichum falcatum, causando a podridão vermelha. O complexo broca/podridão vermelha provocam deterioração fisiológica, microbiológica e tecnológica da cana-de-açúcar. As bactérias associadas à matéria-prima com podridãovermelha produzem fermentações indesejáveis, resultando em produtos estranhos à fermentação alcoólica do processamento industrial. Além disso, estas bactérias também produzem ácidos orgânicos e gomas (dextranas) a partir dos açúcares contidos no mosto, que afetam negativamente a viabilidade das células de leveduras, requerendo sua substituição nas dornas de fermentação (PRECETTI e TERÁN, 1983; PRECETTI et al., 1988; BOTELHO e MACEDO, 2002). Outro problema decorrente da presença de bactérias nas dornas de fermentação é a possibilidade de ocorrência de floculação do fermento. Neste caso, as bactérias contaminantes formam uma mucilagem que agrega as células da levedura, provocando sua floculação. Além da perda de leveduras e da produtividade de açúcar, plantas atacadas por broca/podridão-vermelha também apresentam altos teores de compostos fenólicos (METCALF e LUCKMANN, 1994; PRICE, 1997).

[0018] Utilizando valores médios de perdas agrícola e no processo industrial de produção de açúcar e etanol causadas pela broca, e um índice de Intensidade de Infestação de 4%, muito comum nos canaviais brasileiros, somados aos custos de controle usados, estima-se que esta praga causa perdas econômicas da ordem de mais de R$ 5 bilhões por ano ao setor sucroenergético brasileiro.

[0019] A broca da cana-de-açúcar é uma praga de difícil controle por inseticidas químicos, devido ao comportamento alimentar da larva no colmo, impedindo o contato efetivo do inseticida com o inseto. Alternativamente aos inseticidas químicos, as proteínas inseticidas, identificadas principalmente a partir da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), têm sido utilizadas com grande efetividade para o controle de pragas agrícolas, dentre elas Diatraea sp. Dentre as proteínas inseticidas derivadas de cepas Bt, as proteínas cristalinas Cry destacam-se pela toxicidade específica às larvas de espécies de lepidópteros, dípteros e coleópteros comuns como pragas agrícolas. Essas proteínas, produzidas como protoxinas (65-149 KDa), são solubilizadas e ativadas no intestino dos insetos suscetíveis por proteólise e se ligam à membrana das células intestinais, induzindo à lise osmótica do epitélio, o que ocasiona a morte do inseto.

[0020] As proteínas Cry são classificadas em diversos grupos de acordo com a homologia de suas sequências, dentre eles, o grupo de proteínas classificado como Cry1 apresenta alta especificidade contra insetos lepidópteros, sendo um excelente candidato para manipulação genética dos germoplasmas de cana-de-açúcar para produção de variedades resistentes à broca da cana. A expressão heteróloga de proteínas Cry1 em variedades de cana-de-açúcar, apesar de desafiadora, possui grande potencial para o controle da broca da cana, reduzindo as perdas econômicas do setor sucroalcooleiro, assim como a liberação de inseticidas químicos no meio ambiente.

[0021] Persiste, portanto, a necessidade de desenvolvimento de estratégias para mitigar os danos causados à cultivos de cana-deaçúcar pela infestação de pragas, principalmente pela infestação pela praga broca-da-cana. Ao oferecer aos produtores de cana-de-açúcar variedades de alto potencial de produção para diferentes ambientes edafoclimáticos, aliada a uma característica de resistência à broca, a biotecnologia agrícola confere importante contribuição ao setor sucroenergético e aos plantadores de cana-de-açúcar.

[0022] O evento de cana-de-açúcar geneticamente modificado CTC75064-3 apresentado pela presente invenção tem como objetivo fornecer aos produtores de cana-de-açúcar brasileiros uma cultivar que possui o background genético da cultivar RB 867515 (Certificado de proteção de cultivar № 271) e é resistente à broca da cana de açúcar. Na safra 2018/2109, a variedade RB 867515 foi plantada em aproximadamente 1.730 mil hectardes na região Centro-Oeste do Brasil. O cultivo dessa variedade na região nordeste do Brasil foi de aproximadamente 57 mil hectares. Considerando a área total de cana cultivada (CONAB, 2019), essa variedade possui um market share no Brasil de cerca de 21%.

Objetivos da invenção

[0023] É um primeiro objetivo prover polinucleotídeos que identifiquem de maneira inequívoca o evento CTC75064-3.

[0024] É um segundo objetivo descrever pares de iniciadores e sondas capazes de identificar os polinucleotídeos que caracterizam o evento CTC75064-3.

[0025] É um terceiro objetivo fornecer métodos de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3.

[0026] Como um quarto objetivo a presente invenção descreve um kit para detecção da presença do evento CTC75064-3 em uma amostra de material vegetal.

[0027] Como um quinto objetivo da presente invenção, descrevese uma construção genética capaz de conferir a uma planta de canade-açúcar (Saccharum spp.), resistência à infestação por inseto, particularmente pela praga Diatraea saccharalis.

[0028] É um sexto objetivo da invenção prover uma cana-de-açúcar geneticamente modificada, uma parte de planta, uma célula de planta, um tecido de planta ou uma semente compreendendo a construção genética de interesse localizada em sítios definidos no genoma da planta de cana de açúcar transformada, caracterizada por sequências flanqueadoras específicas.

[0029] O sétimo objetivo da presente invenção é prover um produto de comódite

[0030] Um oitavo objetivo da presente invenção se dá por meio de uma planta resistente à insetos.

[0031] Finalmente, como um nono e décimo objetivos, a invenção ainda fornece como um método de produção e cultivo de uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e/ou uso de tal planta, célula de planta, parte de planta ou semente. Adicionalmente, provê um método para cultivar uma planta de cana de açúcar em um ambiente de infestação de insetos, um método para controle de insetos e um método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo.

Breve Descrição da Invenção

[0032] O primeiro objetivo é alcançado por meio de polinucleotídeos que compreendem pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, e SEQ ID NO: 22.

[0033] O segundo objetivo da invenção é alcançado por meio de pares de iniciadores em que o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 6 e o iniciador antissenso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 7 e/ou o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 8 e o iniciador antissenso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 9.

[0034] O terceiro objetivo é alcançado por um método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 caracterizado por compreender as etapas de:

a) a obtenção de uma amostra para análise;
b) a extração do DNA da amostra;
c) o fornecimento de pares de iniciadores compreendendo pelo menos um iniciador senso e outro antissenso;
d) a amplificação da região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
e) detecção da presença de produto da amplificação.

[0035] Ainda para atingir o terceiro objetivo, os pares de iniciadores da etapa c) são desenhados para se ligarem a um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um par de iniciadores compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

[0036] Em continuidade para alcançar o terceiro objetivo, a presente invenção descreve um método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 caracterizado por compreender as etapas de:

a) obter uma amostra para análise;
b) extrair o DNA ou RNA da amostra;
c) fornecer uma sonda planejada ou uma combinação de sondas planejadas para se ligar a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39;
d) hibridizar a dita sonda com o material extraído da amostra da etapa (II), e
e) detectar a sonda hibridizada.

[0037] O quarto objetivo da invenção evidencia-se por meio de um kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado do evento CTC75064-3 caracterizado por compreender um meio para detecção da presença em uma amostra de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 e/ou uma proteína Cry.

[0038] O quinto objetivo é alcançado através de construção genética, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 14.

[0039] Já o sexto objetivo concretiza-se por meio do evento CTC75064-3, o qual é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. Adicionalmente, o evento CTC75064-3 é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22.

[0040] Adicionalmente, a invenção também provê uma planta, parte da planta, célula da planta, tecido da planta ou semente de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. Adicionalmente, a invenção também provê uma planta, parte da planta, célula da planta, tecido da planta ou semente de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22;

[0041] O produto de comódite do sétimo objetivo da invenção é alcançado a partir da cana-de-açúcar geneticamente modificada da presente invenção.

[0042] O oitavo objetivo da presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto compreendendo a SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21. A invenção também provê um método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto compreendendo cruzar uma primeira planta de cana-deaçúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC75064-3.

[0043] A presente invenção ainda fornece um método para produzir uma planta resistente a inseto caracterizado por compreender introduzir uma modificação genética em uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp) compreendendo SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 22, para produzir uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp) do evento CTC75064-3. Adicionalmente, a presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada resistente a inseto compreendendo inserir um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido entre as sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24 através de recombinação homóloga. Preferivelmente, o referido método é para produzir uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada resistente a inseto do evento CTC75064-3.

[0044] Por fim, o décimo objetivo da invenção descreve o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente caracterizada por compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19 para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta. Preferivelmente, a invenção descreve o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente caracterizada por compreender o evento CTC75064-3 para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta. Adicionalmente, a presente invenção descreve um método para cultivar uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada compreendendo crescer uma planta de cana de açúcar compreendendo a SEQ ID NO 2 sob condições compreendendo infestação de insetos. Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para controle de insetos compreendendo disponibilizar uma planta, tecido, parte da planta, células ou sementes de cana de açúcar geneticamente modificada, caracterizada por compreender a SEQ ID NO 2, para alimentação do inseto. Adicionalmente, a invenção ainda fornece um método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo, caracterizado por compreender cultivar uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada caracterizada por compreender a SEQ ID NO 2.

Descrição sumarizada das Figuras

[0045] A Figura 1 exemplifica o dano as plantas de cana de açúcar causado pela Diatrea saccharalis (broca da cana).

[0046] A Figure 2 exemplifica o complexo da broca-podridão vermelha causado pela infestação de Diatrea saccharalis (broca da cana).

[0047] A Figura 3 representa o mapa do T-DNA introduzido no evento da presente invenção.

[0048] A Figura 4 representa o plasmídeo utilizado como base para construção do plasmídeo utilizado na presente invenção.

[0049] A Figura 5 representa o plasmídeo resultante, utilizado para a obtenção do evento de interesse.

[0050] A Figura 6 representa um dos gráficos de amplificação da qPCR via Taqman® (fluorescência relativa x ciclo) para o evento de interesse.

[0051] A Figura 7 representa as curvas de melting da qPCR via SYBR GREEN™ (fluorescência relativa x temperatura) para o evento de interesse. As setas indicam o pico específico de amplificação do evento de interesse bem como as linhas basais indicativas de ausência de amplificação para os demais eventos e controles negativos.

[0052] A Figura 8 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folhas (Tecido Fresco) do evento CTC75064-3 durante o ciclo da cana de açúcar. Análise conjunta para Barrinha, Piracicaba, Valparaiso (SP), Quirinópolis (-GO), Mandaguaçu (PR) e Juazeiro (BA). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0053] A Figura 9 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folhas (tecido seco) do evento CTC75064-3 para ciclo da cana de açúcar. Análise conjunta para Barrinha, Piracicaba, Valparaiso (SP), Quirinópolis (GO), Mandaguaçu (PR) e Juazeiro (BA). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0054] A Figura 10 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folha, colmo e raiz do evento CTC75064-3 (tecido fresco e tecido seco). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão.

[0055] A Figura 11 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em folhas (tecido fresco) do evento CTC75064-3 para ciclo de cana. Análise conjunta para Barrinha, Piracicaba, Valparaiso (SP), Quirinópolis (GO), Mandaguaçu (PR) e Juazeiro (BA). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0056] A Figura 12 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em folhas (Tecido seco) do evento CTC75064-3 para ciclo de cana de açúcar. Análise conjunta para Barrinha, Piracicaba, Valparaiso (SP), Quirinópolis (-GO), Mandaguaçu (PR) e Juazeiro (BA). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0057] A Figura 13 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em colmo, folha e raiz do evento CTC75064-3 (tecido fresco e tecido seco). Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão.

[0058] A Figura 14 é o resultado da metodologia Western blot para identificação da proteína Cry1Ac. M: Marcador de peso molecular (KDA). R1 a R4: repetições biológicas do evento CTC75064-3. WT (Controle negativo): proteína total extraída da cultivar parental RB867515. CP (Controle positivo): 1ng de proteína Cry1Ac; WT+CP: 1ng de proteína Cry1Ac purificada diluída em proteínas totais extraídas da cultivar parental. Ø: Poço vazio.

[0059] A Figura 15 é o resultado da metodologia Western blot para identificação da proteína NptII. M: marcador de peso molecular (kDa). R1 e R2: repetições biológicas do evento CTC75064-3. CP (controle positivo): 5 ng de proteína NptII; WT+CP: 5 ng de proteína NptII diluída em proteínas totais extraídas da cultivar parental. WT: proteína total extraída da cultivar parental.

[0060] A Figura 16 representa A) Índice de infestação (I.I.%), B) Comprimento relativo do dano no evento CTC75064-3 e nos controles (plantas de primeiro corte). As letras representam o resultado da análise de variância pelo teste T e as barras se referem ao erro padrão.

[0061] A Figura 17 representa Eficácia relativa do controle da broca pelo evento CTC75-064-3 em 4 locais (I.I% = índice de infestação). As barras se referem ao erro padrão da análise.

[0062] A Figura 18 demonstra A: mortalidade larval no ensaio de disco foliar com material vegetal do evento resistente a inseto (broca da cana de açúcar) CTC75064-3 em comparação com o material parental (sem modificação genética) CTC75-TC (cultivar RB867515); B: Eficácia relativa do controle da broca da cana de açúcar pelo CTC75- 064-3; C: exemplos de tamanhos de larvas (desenvolvimento larval) após sete dias de alimentação no ensaio de disco foliar. Na esquerda estão exemplos de larvas que se alimentaram com material vegetal de planta resistentes a inseto do evento CTC75064-3, e na direita estão exemplos de larvas que se alimentaram com material vegetal de planta da cultivar parental (sem modificação genética) CTC75-TC (cultivar RB867515).

[0063] Figura 19 apresenta exemplos de cassetes de expressão para geração do evento CTC75064-3 através de edição genômica. O cassete A compreende Cas9 com códon otimizados para cana de açúcar com expressão dirigida através do promotor pZmUbi e pelo terminator T-35s; o Cassete B compreende crRNA para Cas9 com a expressão dirigida pelo promotor U3 de trigo e o Cassete C compreende o molde HR compreendendo a região de T-DNA do evento CTC75064- 3 (SEQ ID NO 2) com braços homólogos (sequências flanqueadoras) para integração sítio específica.

[0064] Figura 20 representa um exemplo de construção de edição genômica compreendendo os cassetes “Cas 9” e “crRNA”.

[0065] A Figura 21 demonstra um exemplo de construção de edição genômica compreendendo o molde HR CTC75064-3 compreendendo a região de T-DNA do evento CTC75064-3 (SEQ ID NO 2) com braços homólogos (sequências flanqueadoras) para integração sítio específica.

[0066] A Figura 22 representa uma construção de edição genômica compreendendo todos os cassetes para a geração do evento CTC75064-3: o cassete do Cas9 com códon otimizados para cana de açúcar com expressão dirigida através do promotor pZmUbi e pelo terminador T-35s; o cassete crRNA para Cas9 com a expressão dirigida pelo promotor U3 de trigo e o cassete do molde HR compreendendo a região de T-DNA do evento CTC75064-3 (SEQ ID NO 2) com braços homólogos (sequências flanqueadoras) para integração sítio específica.

[0067] A Figura 23 A) apresenta uma representação esquemática da estratégia de Southern blot utilizando duas enzimas de restrição HindIII e EcoRV para identificação do T-DNA inserido no evento CTC75064-3. Linhas cinzas abaixo da representação esquemática do T-DNA indicam os tamanhos esperados dos fragmentos de T-DNA do evento CTC75064-3 gerados. B) é uma representação esquemática da estratégia de Southern blot para detecção de fragmentos do vetor (backbone) usando a enzima de restrição SphI.

[0068] A Figura 24 apresenta resultados de Southern blot utilizando as enzimas de restrição HindIII (esquerda) e EcoRV (direita). Resultados para a hibridização com a sonda Cry que reconhece o gene cry1Ac. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia. T0: cana planta (primeiro corte). T1: soca 1 (segundo corte); T2: soca (terceiro corte) 2; T3: soca 3 (quarto corte).

[0069] A Figura 25 apresenta resultados de Southern blot utilizando as enzimas de restrição EcoRV (esquerda) e HindIII (direita). Resultados para a sonda 35s que reconhece o promotor 35s. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia. T0: cana planta (primeiro corte). T1: soca 1 (segundo corte); T2: soca (terceiro corte) 2; T3: soca 3 (quarto corte).

[0070] A Figura 26 apresenta resultados de Southern blot utilizando as enzimas de restrição HindIII (esquerda) e EcoRV (direita). Resultados para a sonda nptII que reconhece o gene nptII. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia. T0: cana planta (primeiro corte). T1: soca 1 (segundo corte); T2: soca (terceiro corte) 2; T3: soca 3 (quarto corte).

[0071] Figura 27 A) representa os resultados de Southern blot usando as enzimas de restrição SphI e as sondas do vetor (backbone) BB1 e BB3. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia com pCTC146; 1C*: controle positivo 1 cópia com pCTC302. BB1: controle positivo com a sonda backbone 1; BB2: controle positivo com a sonda backbone 2; BB3: controle positivo com a sonda backbone 3. As linhas vermelhas indicam duas repetições do evento CTC75064-3. Poço (Lane) 1: outros eventos. B) usando as enzimas de restrição SphI e a sonda do vetor (backbone) BB2. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia com pCTC146; 1C*: controle positivo 1 cópia com pCTC302. BB1: controle positivo com a sonda backbone 1; BB2: controle positivo com a sonda backbone 2; BB3: controle positivo com a sonda backbone 3. As linhas vermelhas indicam duas repetições do evento CTC75064-3. Poço (Lane) 1: outros eventos.

[0072] Figura 28 demonstra a confirmação de integridade das regiões flanqueadoras do T-DNA inserido no evento CTC75064-3. (A) Confirmação da integridade da borda esquerda (5'). (B) Confirmação da integridade da borda direita (3'). Evento: DNA do evento CTC75064-3; WT: DNA CT 7515 parental (cultivar RB 867515); C-: controle negativo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0073] Inicialmente, considera-se como "evento" a planta geneticamente modificada produzida por qualquer método de modificação e/ou transformação genética que expresse de forma significativa e constante a característica que se desejava incluir nesta, a qual é conferida pelo transgene introduzido. Mais particularmente, no presente caso, considera-se "evento" a planta geneticamente modificada, preferencialmente uma planta geneticamente modificada de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) que, após modificação genética, expressa a característica de resistência à praga, particularmente à praga Diatraea saccharalis (broca-da-cana). Em um escopo preferido, a cana de açúcar geneticamente modificada produzida por transformação genética é designada “CTC75064-3” e pode alternativamente ser referida como “evento CTC75064-3”.

[0074] Ainda, para fins de referência, a não ser que expressamente mencionado ao contrário, por região LB entende-se a borda esquerda de transferência do T-DNA (5'), e por região RB entende-se a borda direita de transferência do T-DNA (3').

[0075] Adicionalmente, todas as sequências biológicas aqui descritas, exceto onde explicitamente mencionado o contrário, englobam também sequências possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências a que se referem.

[0076] Por fim, por material vegetal entende-se todo e qualquer tecido vegetal ou derivado deste, tais como, mas não limitados a, sementes, troncos, caules, colmos, folhas, palhas, cascas, raízes, células, moléculas de origem vegetal, entre outros, e ainda todo e qualquer produto de uma planta ou derivado deste, por exemplo, mas não limitado a, seiva, açúcar, etanol, entre outros.

[0077] A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o isolamento de genes e sua inserção estável em um genoma hospedeiro. Esta técnica, também chamada de transformação genética, pode ser definida como a introdução controlada de ácidos nucleicos ("DNA" ou ADN) em um genoma receptor, excluindo-se a introdução por fecundação. É um processo controlado, onde normalmente apenas o fragmento definido de DNA é introduzido no genoma do hospedeiro, ou genoma receptor, devendo ser a ele integrado. A inserção estável dessas moléculas em um genoma hospedeiro dá origem a um indivíduo igual ou substancialmente igual ao receptor da molécula recombinante, porém acrescido de característica nova e particular. Por "substancialmente igual" entende-se como um organismo que possui mais do que 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade em relação ao organismo receptor.

[0078] Existem diversas técnicas de transformação genética de plantas, as quais podem, de maneira geral, serem agrupadas em duas categorias principais: transferência indireta e direta de genes. A transferência indireta é aquela em que o DNA exógeno é inserido no genoma pela ação de um vetor biológico ou qualquer outro tipo de molécula carreadora, sendo a sua inserção facilitada por mecanismos endógenos ou exógenos, enquanto que a direta é baseada principalmente em processos físico-bioquímicos.

[0079] Os tecidos e/ou células a serem transformados podem variar de acordo com técnicas de transformação genética utilizada e de acordo com a espécie ou genótipo a ser transformado. De maneira geral, esses tecidos incluem, sem limitação, calos embriogênicos, calos, protoplastos, embriões, embriões somáticos, tecidos meristemáticos, e qualquer parte, tecido ou célula vegetal que possui capacidade regenerativa.

[0080] A transformação indireta baseia-se principalmente no sistema mediado por bactérias do gênero Agrobacterium e tem sido o método mais utilizado para obtenção de plantas transgênicas, por apresentar algumas vantagens como, por exemplo, a possiblidade de transferência de segmentos de DNA relativamente longos com nenhum rearranjo e integração de baixo número de cópias dos transgenes, garantindo maior estabilidade genotípica para os eventos gerados. Diversas espécies e linhagens de Agrobacterium, plasmídeos e protocolos têm sido desenvolvidos e adaptados para a transformação genética de diversas espécies de plantas. As vantagens do método de transformação mediado por Agrobacterium incluem a maior probabilidade de inserções cópia única, a integração estável e herança genética das características introduzidas, assim como expressão gênica consistente através das gerações, além de menores chances de silenciamento gênico

[0081] Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias fitopatogênicas de solo, gram negativas, pertencentes à família Rhizobiaceae, que causam doenças em dicotiledôneas, conhecidas como galhas da coroa e raiz em cabeleira, respectivamente. Nesta interação planta-patógeno ocorre um processo de transferência natural de genes entre a agrobactéria e a célula vegetal, quando fragmentos de DNA bacteriano são transferidos para dentro da célula vegetal (T-DNA), integrando-se ao genoma nuclear. Em sua forma natural, a bactéria transfere o T-DNA ("transferred DNA"), que é parte do plasmídeo bacteriano denominado Ti ("tumour-inducing"), e este se integra ao genoma das células de plantas infectadas. No fragmento de T-DNA que é transferido para a célula vegetal estão os genes envolvidos na biossíntese constitutiva de fitohormônios (auxinas e citocininas) que alteram o programa de desenvolvimento normal do tecido infectado, ocasionando a formação do tumor. Além disso, contém também oncogenes para a síntese de açúcares e aminoácidos denominados de opinas, que são responsáveis pela sobrevivência da bactéria, que os utilizam como fonte de carbono e nitrogênio (Oger et al. 1997). Extremidades repetidas de 25 pares de base (pb) nas bordas direita e esquerda delimitam o T-DNA, e são imprescindíveis para sua transferência. Compostos fenólicos liberados pelos tecidos vegetais lesionados ativam regiões especificas (regiões vir), iniciando o processo de transferência do TDNA para a célula vegetal. A Agrobacterium possui também genes cromossomais (chv) que garantem a ligação entre as células bacteriana e hospedeira, permitindo a formação do poro de passagem do complexo contendo o T-DNA (Sheng & Citovsky. 1996).

[0082] Uma vez que o segmento a ser transferido (transgene) é definido por suas bordas, qualquer sequência flanqueada pelas bordas pode ser transferida para uma planta por meio da agrobacteria, possibilitando a manipulação dessas sequências para transferência de sequências codificadoras de interesse. A substituição ou eliminação das regiões codificadoras do T-DNA do tipo selvagem (oncogenes), permitem a geração de linhagens de Agrobacterium não oncogênicas (desarmadas) e carreadoras das sequências de interesse, sem prejuízo a transferência do T-DNA para as plantas desde que os genes de virulência (região vir) sejam mantidos.

[0083] Adicionalmente, o sistema de transformação indireta por Agrobacterium permite o uso de construções artificiais de plasmídeos para a transferência de genes para as plantas desde que os mesmos contenham tais bordas de T-DNA, possibilitando uma grande flexibilidade para uso das ferramentas moleculares e materiais disponíveis e desenvolvidos para outras cepas bacterianas.

[0084] Estas construções artificiais de plasmídeos possuem promotores de diversas origens, entre eles promotores de genes de plantas, promotores virais, bacterianos e/ou quiméricos, além de genes que conferem resistência a antibióticos, resistência a herbicidas ou que possuam atividade enzimática (phosphomannose isomerase (PMI)/mannose (Man)) de forma a fazer com que estes marcadores possam ser usados para a seleção de células ou plantas transformadas.

[0085] Adicionalmente, essas construções podem conter genes auxiliares que interferem em vias de sinalização relevantes para a morfogênese de tecidos vegetais, aumentando a eficiência do processo de modificação genética e regeneração. Destacam-se, sem limitações: LEAFY COTYLEDON1 (Lotan et al., 1998), Lec1 (Lowe et al., 2002), LEAFY COTYLEDON2 (Stone et al., 2001), WUSCHEL (WUS; Zuo et al., 2002), e BABY BOOM (BBM; Boutilier et al., 2002), entre outros.

[0086] Em um primeiro aspecto da presente invenção, o DNA estranho ou exógeno que será introduzido na planta é clonado em um plasmídeo binário, entre as sequências consenso das bordas esquerda e direita (T-DNA). O plasmídeo binário é transferido para uma célula de Agrobacterium, que é subsequentemente utilizada para infectar o tecido vegetal. A região do T-DNA do vetor que compreende o DNA exógeno é inserida no genoma da planta. O cassete de expressão com o gene marcador e o cassete de expressão com o gene da característica podem estar presentes na mesma região do T-DNA, em regiões diferentes do T-DNA no mesmo plasmídeo, ou ainda em regiões diferentes do T-DNA em plasmídeos diferentes. Em uma modalidade da presente invenção, os cassetes estão presentes na mesma região do T-DNA. O versado na técnica está familiarizado com os métodos de transformação indireta por Agrobacterium.

[0087] Ainda de modo alternativo, a transferência direta do DNA pode ser utilizada para introduzir o DNA diretamente em uma célula vegetal. Esses métodos oferecem uma alternativa para a integração de um gene de interesse com toxicidade celular mínima em locais aleatórios do genoma. Nesses casos a introdução do DNA exógeno é realizada sem o auxílio de um vetor. Um método adequado de transferência direta do DNA pode ser o bombardeio de células vegetais com um vetor que compreende o DNA para a inserção utilizando uma pistola de partículas (transformação por biolística mediada por partículas). Outros métodos para transformação de células vegetais incluem a transformação de protoplastos (opcionalmente na presença de polietilenoglicóis); o tratamento com ultra-som de tecidos, células ou protoplastos vegetais em um meio compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor; sonicação, a microinjeção do polinucleotídeo ou do vetor no material vegetal; macroinjeção, eletroporação de células vegetais e similares, infiltração a vácuo, uso de fibras de carboneto de silício, transformação química mediada por polietileno glicol (PEG), entre outros. Dentre as desvantagens associadas aos métodos de transformação direta estão os desafios relacionadas a regeneração e baixa expressão dos transgenes.

[0088] Ainda de modo alternativo, a transformação genética pode ser realizada de maneira sítio dirigida através da recombinação homóloga auxiliada por nucleases (edição genômica). Nos últimos anos, a tecnologia de edição genômica baseada no uso de nucleases "engenheiradas" ou quiméricas tem ganhado destaque, possibilitando a geração de organismos geneticamente modificados de maneira mais precisa e específica. Nesse caso, a introdução de genes exógenos ocorre através de mecanismos de recombinação homóloga através da introdução de um molde de recombinação homóloga (HR) contendo o DNA de interesse ligado a um fragmento de DNA homólogo ao genoma do organismo receptor. Dentre as ferramentas disponíveis estão o sistema enzimático quimérico CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) - Cas, além das nucleases Zinc finger (ZFN) e TAL effector nucleases (TALENs). Os sistemas CRISPR/Cas são sistemas enzimáticos que compreendem 2 componentes principais: uma endonuclease (Cas) e um RNA guia (single-guide RNA - sgRNA). O RNA guia compreende 2 partes principais: "crispr RNA" (crRNA), uma sequência de 17-20 nucleotídeos complementar a sítios específicos no DNA genômico; "tracr RNA", um molde para ligação da nuclease Cas, responsável por guiar a endonuclease para o local específico de clivagem. A clivagem específica realizada pela endonuclease e direcionada pelo RNA guia pode ser reparada através de recombinação homóloga, integrando de maneira sítio dirigida o DNA exógeno flanqueado por sequências homólogas ao sítio de clivagem. A introdução desse sistema enzimático na célula pode ocorrer de diversas maneiras, utilizando plasmídeos, através de transformação direta ou indireta, ou ainda utilizando-se de proteínas e outras moléculas carregadoras. A expressão dos componentes do sistema pode ocorrer de forma transiente ou estável utilizando a maquinaria celular do organismo receptor ou ainda ser realizada de maneira exógena, e nesse caso, os componentes do sistema são entregues na célula "prontos para uso" (endonucleases + sgRNAs transcritos in vitro e combinados antes da sua introdução na célula). A descrição aqui apresentada não deve ser considerada exaustiva e, portanto, o uso de tais métodos de edição genômica dentro do escopo da presente invenção não deve ser limitado à descrição apresentada, estando contemplado a aplicação de variações desses sistemas e métodos, conforme conhecidas no Estado da Arte, bem como aquelas que ainda estão por serem descobertas.

[0089] Após a transformação, as plantas transgênicas devem ser regeneradas partindo do tecido vegetal transformado e a progênie que possui DNA exógeno selecionada utilizando um marcador apropriado tal como a resistência à canamicina, geneticina ou glufosinato de amônio. O versado na técnica está familiarizado com a composição de meios de regeneração adequados.

[0090] Alternativamente, outros métodos de seleção podem ser aplicados, sem a necessidade da introdução no organismo receptor de um marcador de seleção conforme acima exemplificado.

[0091] Em uma modalidade preferida, a transformação genética é mediada por meio de uma bactéria do gênero Agrobacterium.

[0092] Em uma modalidade ainda mais preferida, a transformação genética é mediada por Agrobacterium tumefasciens.

[0093] O evento CTC75064-3 exibe um novo genótipo que compreende dois cassetes de expressão. O primeiro cassete de expressão compreende um promotor adequado para a expressão em plantas ligado de forma operacional a um gene que codifica uma toxina inseticida Cry1Ac, útil no controle de pragas de insetos lepidópteros e um sinal de poliadenilação adequados. O segundo cassete de expressão compreende um promotor adequado para a expressão em plantas ligado de forma operacional a um gene que codifica uma proteína utilizada como marcador seletivo na obtenção do evento da presente invenção.

[0094] Os promotores adequados podem ser isolados ou expressos, entre outros organismos, em plantas. Vários promotores foram isolados ou desenvolvidos incluindo promotores constitutivos, do tipo "liga e desliga", responsivos a estresses abióticos, específicos aos tecidos, entre outros. Muitos desses promotores possuem sequências intrônicas descritas como relevantes para uma expressão adequada dos genes. Em um aspecto preferido da invenção, os promotores são promotores constitutivos e podem ser selecionados do grupo não limitante consistindo em CaMV 35S, CoYMV (Commelina yellow mottle virus), FMV (Figwort mosaic virus) 35S, Ubiquitina, promotor de Actina de arroz 1 (Act-1), promotor de Actina de arroz 2 (Act-2), promotor da nopalina sintase (NOS), promotor da octopina sintase (OCS), promotor da desidrogenase alcoólica de milho (Adh-1), PvUbi1, entre outros.

[0095] Elementos adicionais tais como sequências intensificadoras e direcionadores (transportadores) também podem ser incorporadas no cassete de expressão com a finalidade de melhorar os níveis de expressão gênica, por exemplo, intensificadores de transcrição ou tradução, tais como, os intensificadores CaMV 35S, FMV 35S, Nos, supP, sequências líderes não transcritas do Polipeptídeo de ligação a Clorofila a/b principal de trigo (L-Cab), sequências kosak 5' upstream do sítio de início da tradução, entre outras.

[0096] Em uma modalidade da invenção, o promotor é o promotor do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35s (CaMV 35Ss). Em uma modalidade ainda mais preferida, o promotor CaMV 35s possui a sequência enhancer duplicada (2xCaMV35s).

[0097] Em um escopo da invenção, a sequência Kosak 5' upstream do sítio de início da tradução e o intron de Actina 1 de arroz (Oryza sativa Actin 1 intron; OsACT1) são contemplados na região promotora CaMV 35s. Adicionalmente, a sequência líder L-Cab também está contemplada na região promotora CaMV 35s.

[0098] Em um escopo preferido, a expressão gênica do cry1Ac é regulada pela combinação de elementos selecionado do grupo consistindo em promotor do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35s com sequência enhancer duplicada (2xCaMV35s), sequência líder não transcrita do Polipeptídeo de ligação a Clorofila a/b principal de trigo (LCab), intron de Actina 1 de arroz (Oryza sativa Actin 1 intron; OsACT1) e sequência Kosak 5' upstream do sítio de início da tradução. Em um escopo preferido, a expressão gênica do cry1Ac é regulada pela região promotora do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35s com sequência enhancer duplicada (2xCaMV35s), sequência líder não transcrita do Polipeptídeo de ligação a Clorofila a/b principal de trigo (L-Cab), intron de Actina 1 de arroz (Oryza sativa Actin 1 intron; OsACT1) e sequência Kosak 5' upstream do sítio de início da tradução.

[0099] Em um outro escopo, a região promotora é a do gene da Ubiquitina de milho (pUBI). Em um escopo preferido, a região promotora é a do gene da Ubiquitina de milho (pUBI) contém um íntron na sequência 5' do RNA líder.

[00100] A região promotora (UBI-1) da presente invenção possui 1992 pares de bases que são subdivididas em: fragmento promotor (899 bases), primeiro éxon do gene da poliubiquitina-1 (83 bases) e primeiro íntron (1.010 bases).

[00101] Em um escopo, a expressão do gene nptII é regulada pelo promotor da ubiquitina de milho (pUBI). Em um escopo preferido, a expressão do gene nptII é regulada pelo promotor da ubiquitina de milho (pUBI) contendo um intron na sequência 5' do RNA líder. Em um escopo específico, a expressão do gene nptII é regulada pela região promotora (UBI-1) da presente invenção possui 1992 pares de bases que são subdivididas em: fragmento promotor (899 bases), primeiro éxon do gene da poliubiquitina-1 (83 bases) e primeiro íntron (1.010 bases).

[00102] As sequências terminadoras também estão contempladas no cassete de expressão. Exemplos de sinais de poliadenilação adequados e funcionais nas plantas incluem o proveniente do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens, o proveniente do gene do inibidor II da proteinase, rbcS (pea ribulose‐1,5‐bisphosphate carboxylase small subunit), Lhcb1 (tobacco chlorophyll a/b‐binding proteins), CaMV 35S, octopina sintase, o proveniente do gene da alfatubulina, entre outros.

[00103] Em um escopo da presente invenção, o sinal de poliadenilação é derivado do gene CaMV 35s (T35s). Em uma modalidade da presente invenção, o sinal de poliadenilação é aquele proveniente do gene nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens

[00104] Preferivalmente, o sinal de poliadenilaçãopara o cassete cry1Ac é o terminador CaMV 35s (T-35s) e o sinal de poliadenilação para o gene nptII é terminador de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens - NOS.

[00105] O gene cry1Ac codifica uma toxina de 615 aminoácidos com peso molecular estimado de 68 KDa, originária de Bacillus thuringiensis serovar kustaki (estirpe HD73) que confere resistência à Diatraea saccharalis (broca-da-cana). A presente invenção contempla modificações do gene para a expressão apenas do núcleo tríptico ativo da proteína Cry1Ac nativa. Assim, em uma modalidade preferida da presente invenção, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Ac é truncado, codificando o núcleo tríptico inseticida de 52 KDa. Em uma modalidade preferida, a proteína Cry1Ac é a SEQ ID NO 34. A presente invenção também contempla sequências compreendendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 34. O núcleo tríptico é responsável pela atividade inseticida da proteína, ligando-se a proteínas específicas do intestino do inseto levando à disrupção da integridade funcional e anatômica deste órgão que altera a absorção de nutrientes e rápida toxicidade e morte do inseto.

[00106] De acordo com a invenção, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Ac pode ter códons otimizados ou alterados de outra maneira para melhora da sua expressão no material vegetal. Tal otimização de códons pode ser utilizada para alterar a estrutura secundária prevista do produto da transcrição de RNA produzido em qualquer célula transformada ou para destruir os elementos da instabilidade crípticos de RNA presentes no produto da transcrição não alterado, aumentando assim a estabilidade e/ou a disponibilidade do produto da transcrição na célula transformada.

[00107] Preferivelmente, o gene cry1Ac presente no evento da invenção corresponde a uma sequência de DNA sintética, truncada e otimizada com códons preferidos de cana-de-açúcar. Em um aspecto ainda mais preferido da presente invenção, o gene cry1Ac apresenta a sequência SEQ ID NO: 20. A presente invenção também contempla sequências compreendendo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 20.

[00108] Vários genes marcadores para seleção de eventos em plantas já foram caracterizados, incluindo alguns que conferem tolerância a antibióticos e outros que conferem resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores que podem ser selecionados para uso na presente invenção incluem aqueles que conferem resistência ou tolerância a higromicina, canamicina, gentamicina, glifosato, glufosinato de amônio ou resistência a toxinas tais como a eutipina. Também estão disponíveis outras formas de seleção tais como os sistemas de seleção baseados em hormônio, seleção visual através da expressão de proteínas fluorescentes, manose isomerase, xilose isomerase, entre outros. Em uma modalidade da presente invenção, o gene marcador para seleção do evento da presente invenção é um que confere tolerância à antibióticos da classe dos aminoglicosídeos. Em um escopo da presente invenção, o gene do marcador de seleção do evento confere tolerância a kanamicina e geneticina.

[00109] Em uma modalidade preferida da invenção, o gene marcador utilizado no segundo cassete de expressão é o gene nptII, o qual codifica a enzima neomicina fosfotransferase II (nptII) de 265 aminoácidos com peso molecular estimado de 29,2KDa. Em um aspecto ainda mais preferido da presente invenção, o gene nptII apresenta a sequência SEQ ID NO 21. A neomicina fosfotransferase II confere resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, como a canamicina e a geneticina. O gene nptII utilizado como marcador de seleção na obtenção dos eventos transformados é derivado do transposon Tn5 de Escherichia coli como descrito por BECK et al. (1982). A proteína NptII é produzida por vários procariontes amplamente encontrados no meio ambiente, tanto em habitats aquáticos e terrestres, como na microflora intestinal humana e animal. A proteína NptII inativa antibióticos aminoglicosídicos como neomicina, gentamicina, paromicina e canamicinas A, B e C utilizando-se de adenosina-trifosfato (ATP) para fosforilá-los, evitando assim que causem injúrias às células quando expostas aos antibióticos mencionados. Esse mecanismo possibilita seu uso como marcador de seleção de plantas transformadas. Em uma modalidade preferida, a proteína NptII é a SEQ ID NO 35. A presente invenção também contempla sequências possuindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 35.

[00110] O uso de genes marcadores de seleção, como o gene nptII, é importante para selecionar as células transformadas no processo de modificação genética (HORSCH et al., 1985). O objetivo da inserção do gene nptII no evento da presente invenção foi, portanto, a seleção de células transformadas com o gene cry1Ac.

[00111] Além dos cassetes de expressão descritos, cassetes de expressão adicionais são opcionalmente compreendidos no evento CTC75064-3

[00112] O primeiro e segundo cassetes de expressão compreendidos no evento CTC75064-3 podem ser introduzidos na planta no mesmo ou em plasmídeos diferentes. Se o primeiro e segundo cassetes de expressão estiverem presentes no mesmo plasmídeo e foram introduzidos na planta por meio de um método de transformação mediado por Agrobacterium, podem estar presentes dentro das mesmas ou de regiões diferentes do T-DNA. Em uma modalidade da presente invenção, o primeiro e o segundo cassete de expressão estão presentes na mesma região do T-DNA.

[00113] Mais particularmente, o evento da presente invenção foi obtido por transformação mediada por Agrobacterium tumefasciens com uma construção genética compreendendo um fragmento de DNA (T-DNA) contendo os cassetes de expressão dos genes cry1Ac e nptII (Figura 1). Preferivelmente, a construção genética da presente invenção é caracterizada pelo fato de que compreende a sequência nucleotídica possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:1.

[00114] O evento da presente invenção foi obtido por transformação mediada por Agrobacterium tumefasciens compreendendo o fragmento de T- DNA conforme definido acima (SEQ ID NO:1).

[00115] Este fragmento de T-DNA foi inserido dentro de um plasmídeo binário que contém em seu espectro de hospedeiro as bactérias Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens. Os elementos genéticos específicos, as origens dos componentes do plasmídeo binário original da presente invenção são apresentadas na Figura 4.

[00116] O plasmídeo binário compreendendo a construção da presente invenção é representado na Figure 5. Em uma modalidade preferida, a construção genética da presente invenção é caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:14.

[00117] A referida construção genética é inserida por choque térmico na cepa de DH5α de Escherichia coli. Uma colônia isolada contendo a construção (SEQ ID NO 14) foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 150 μg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C, com agitação à 250 rpm por um período de 16 horas. Prepararam-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer -80°C. A partir da mesma suspenção bacteriana extraiu-se DNA plasmidial utilizando-se QIAGEN Plasmid Giga Kit segundo as recomendações do fabricante (Qiagen, Alemanha).

[00118] A construção SEQ ID NO 14 foi então transferida para uma cepa de Agrobacterium tumefaciens (vetor) por meio de técnicas conhecidas por um técnico no assunto, como por exemplo, eletroporação, choque térmico, entre outras. Preferivelmente, a construção é transferida para uma cepa de Agrobacterium tumefaciens por meio de eletroporação. Uma colônia isolada de agrobactéria contendo a construção é inoculada em meio LB líquido suplementado com 100 μg/ml de espectinomicina e 50 μg/ml de rifampicina e incubada a 28°C, com agitação de 200 rpm por um período de 24 horas. Estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) são preparados e armazenados em ultrafreezer -80°C. Esses estoques são utilizados nos experimentos de transformação genética.

[00119] Em uma modalidade ainda mais preferida, o vetor é uma cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.

[00120] É ainda descrito um método para produção de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada resistente a inseto. Em uma modalidade preferida, o referido método compreende as etapas de:

a) Introdução da construção genética em uma cepa de Agrobacterium;
b) Obtenção de calos embriogênicos de palmitos de uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.);
c) Co-cultivo dos calos embriogênicos com a Agrobacterium da etapa I;
d) Seleção de células transformadas que contém o fragmento funcional em meio de cultura contendo antibióticos aminoglicosídicos; e
e) Regeneração de plantas de cana-de-açúcar transformadas.

[00121] Em um aspecto da presente invenção, o método para a produção de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp..) é baseado ou idêntico ao descrito pelo BR 11 2017 005441, cujos ensinamentos são incorporados à presente invenção. Em um aspecto adicional, a etapa a) do método para a produção de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.) do evento CTC75064-3 compreende a introdução de uma construção genética compreendendo a SEQ ID NO 20 e SEQ ID 21 em uma linhagem de Agrobacterium. Em um outro aspecto, a etapa d) compreende a seleção de células transformadas contendo um fragmento funcional em um meio de cultura contendo geneticina. Adicionalmente, a etapa e) desse método compreende regenerar plantas de cana de açúcar transformadas, onde as plantas de cana de açúcar transformadas compreendem SEQ ID NO 20 e SEQ ID NO 21. Preferivelmente, o método para a produção de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp) descrito é para produção do evento de interesse, CTC75064-3. A invenção também contempla uma parte de planta, uma célula de planta, um tecido de planta, ou uma semente das plantas de cana de açúcar geneticamente modificadas produzidas pelo método descrito acima.

[00122] O versado na técnica está familiarizado com a composição de meios de cultura adequados para a geração de calos embriogênicos (etapa b), assim como dos meios das etapas de co-cultivo (etapa c: co-cultivo + descanso), seleção (etapa d) e regeneração (etapa e; regeneração + elongação). Preferencialmente, os meios de cultura utilizados são baseados em composições compreendo ingredientes tais como, os sais MS (Murashige e Skoog, 1962), sacarose, vitaminas B5 e, opcionalmente: aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina; hidrolisado de caseína; ácido cítrico; manitol; sulfato de cobre; glicina; agente gelificante; auxinas; antibióticos; acetoseringona; e agentes de seleção. Destaca-se o uso de auxinas nos meios de geração de calos embriogênicos, co-cultivo e seleção, assim como geneticina no meio de seleção.

[00123] A etapa de "co-cultivo" refere-se à incubação do tecido de planta infectado ou que entrou em contato com Agrobacterium, de forma a permitir a transferência de T-DNA da Agrobacterium para as células de plantas. Esta etapa corresponde ao período entre o momento logo após a inoculação (contato da Agrobacterium com o tecido vegetal) até o momento em que a bactéria é retirada ou inativada.

[00124] O tecido inoculado pode ser co-cultivado por cerca de 1 a 30 dias, preferencialmente de 1 a 20, mais preferencialmente de 1 a 10 dias.

[00125] Durante a etapa de co-cultivo, a temperatura pode ser qualquer temperatura adequada para a planta alvo conhecida na técnica. Ilustrativamente, para cana-de-açúcar, a temperatura pode variar entre cerca de 15ºC a cerca de 30ºC e de cerca de 16ºC a cerca de 29ºC. Em algumas concretizações, a etapa de co-cultivo ocorre na ausência de luz.

[00126] Após o co-cultivo com Agrobacterium, o meio é retirado e as células são transferidas para um meio de cultura na ausência de Agrobacterium, sendo incubadas no escuro, à temperatura de 20ºC a cerca de 26ºC, por um período de 1 a 20 dias.

[00127] O método aqui provido ainda inclui selecionar as células compreendendo pelo menos uma cópia da sequência genética de interesse. "Selecionar", como aqui utilizado, significa a situação em que é utilizado um agente seletivo para os transformantes, onde o dito agente seletivo irá permitir o crescimento preferencial de células de plantas contendo pelo menos uma cópia do gene marcador posicionado dentro do T-DNA e transferido pela Agrobacterium em detrimento daquelas células que não foram transformadas. Como indicado acima, qualquer marcador de seleção adequado pode ser utilizado. Preferencialmente, o gene marcador de seleção é utilizado é o gene nptII, o qual codifica uma enzima que confere resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, como a canamicina e a geneticina.

[00128] Em algumas concretizações, é adicionado também um agente que inibe o crescimento de Agrobacterium após a etapa c.

[00129] A seleção pode ocorrer em condições de claro ou escuro, dependendo da espécie de planta sendo transformada, e do genótipo, por exemplo. Em alguns casos, os calos embriogênicos ou outros tecidos submetidos à transformação podem ser sub-cultivados em intervalos regulares ou irregulares no mesmo meio. No caso de transformação de calos, é possível manter calos individuais separados para garantir que apenas uma planta seja regenerada por calo e, portanto, todas as plantas regeneradas são derivadas de eventos de transformação independentes. Em uma concretização preferida, a etapa de seleção ocorre no escuro, por cerca de 1 a 10 semanas, mais preferencialmente de 2 a 5 semanas.

[00130] Após o período de seleção, o tecido vegetal que continuou crescendo em presença do agente de seleção, e que, portanto, foi geneticamente modificado, pode ser manipulado e regenerado, colocando-o em meios de cultura e condições de crescimento adequados. As plantas transgênicas assim obtidas podem ser testadas para a presença do DNA de interesse. O termo "regenerar", para fins desta invenção, refere-se à formação de uma planta, que inclui uma parte aérea e raízes. As plantas regeneradas podem ser plantadas em substrato adequado, como por exemplo, solo e serem transferidas para a casa de vegetação. Como aqui usado, "geneticamente modificado" ou "transgênico" ou "estavelmente transformado" significa uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta que compreende uma sequência de DNA de interesse que é introduzida dentro do seu genoma por meio de transformação.

[00131] Em uma modalidade, a bactéria é do gênero Agrobacterium.

[00132] Em uma modalidade mais preferida, a bactéria é a Agrobacterium tumefaciens.

[00133] Em uma modalidade ainda mais preferida, a bactéria é uma cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.

[00134] A presente invenção também se refere a caracterização do evento selecionado (CTC75064-3) e métodos de detecção de material vegetal derivado do mesmo. Os métodos analíticos para detecção e caracterização de plantas transgênicas incluem métodos indiretos (métodos de detecção baseados em proteínas) ou métodos diretos (métodos de detecção baseados em DNA)

[00135] A definição do sítio de integração estável do T-DNA no genoma das células hospedeiras e caracterização das sequências flanqueadoras é necessária para o desenvolvimento e validação de metodologias para a identificação e caracterização inequívoca do evento.

[00136] Para identificar as regiões flanqueadoras das extremidades dos insertos de T-DNA presentes no evento CTC75064-3, foram realizados vários experimentos de amplificação e sequenciamento de DNA. Ensaios de PCR reverso (iPCR) foram realizados para ambas extremidades das sequências de T-DNA com o objetivo de isolar e clonar as regiões flanqueadoras dos insertos. Posteriormente, os fragmentos obtidos e isolados foram sequenciados por Sanger para validação dos resultados obtidos por iPCR. O mapa das inserções genéticas presentes no evento CTC75064-3 é representado na Figura 3 (SEQ ID NO 2). As sequências flanqueadoras do evento CTC75064-3 são caracterizadas por compreender nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24. Em um escopo preferido, as sequências flanqueadoras do evento CTC75064-3 são caracterizadas pelas SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24.

[00137] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da sequência SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 18. Em um aspecto adicional da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 13.

[00138] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 19. Em um aspecto da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 12.

[00139] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 3. Em um mesmo aspecto da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 4. Em um aspecto adicional é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 5. Ainda em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 22.

[00140] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 18. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 18. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 18. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 13.

[00141] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 19. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 12.

[00142] Adicionalmente, a dita planta é uma cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp). Adicionalmente, a dita planta é resistente a insetos e é caracterizada por compreender uma sequência com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 5. Ainda em um aspecto adicional, a planta resistente a insetos da presente invenção é caracterizada por compreender uma sequência com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 22. Em uma modalidade da presente invenção, a dita planta é uma planta de cana-de-açúcar. Em uma modalidade adicional, a dita planta é uma planta de cana-de-açúcar inseticida que é o evento CTC75064-3 ou uma planta derivada da mesma.

[00143] Em um aspecto da invenção, é fornecido o evento CTC75064-3 caracterizado pelo fato de ser uma variedade de canade-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19. Adicionalmente, o evento CTC75064- 3 é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo a SEQ ID NO 5. Em um aspecto adicional, o evento CTC75064-3 é caracterizado pelo fato de compreender a SEQ ID NO 22.

[00144] É ainda desejável um método para detecção e caracterização inequívoca do evento de interesse (evento específico). Em um aspecto, a presente invenção fornece um método específico de detecção e identificação do evento CTC75064-3.

[00145] Em um aspecto, a invenção fornece um método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3, caracterizado por compreender as etapas de:

a) obter uma amostra do material vegetal para análise;
b) extrair o DNA da amostra;
c) fornecer pares de iniciadores compreendendo pelo menos um iniciador senso e outro antissenso;
d) amplificar a região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
e) detectar a presença de produto da amplificação.

[00146] Em um escopo, pares de iniciadores (etapa c) de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo nucleotídeos contíguos de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 36.

[00147] Em um outro escopo, os pares de iniciadores da etapa c) são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um (1) par de iniciadores compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

[00148] Em um escopo, os pares de iniciadores acima (etapa c) are desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos 1(um) par de iniciadores compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Em um escopo, os pares de iniciadores são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Adicionalmente, os pares de iniciadores são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

[00149] Ainda em um aspecto adicional, pares de iniciadores de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 e um segundo iniciador compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36.

[00150] Em um aspecto, pares de iniciadores de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Ainda em um aspecto adicional, pares de iniciadores de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Adicionalmente, pares de iniciadores de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36.

[00151] Em uma modalidade, os pares de iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, os pares de iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39. Adicionalmente, os pares de iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, os pares de iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos 1(um) par de iniciador compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39

[00152] Em um aspecto, pares de iniciadores de acordo com o método de detecção descrito são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 e um segundo iniciador compreendendo nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Em um aspecto adicional, pares de iniciadores são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Em um aspecto, pares de iniciadores são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36. Adicionalmente, pares de iniciadores são desenhados para se ligarem a polinucleotídeos compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um (1) par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 e um segundo iniciador compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 36.

[00153] Preferivelmente, o método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 da presente invenção compreende:

a) a obtenção de uma amostra de material vegetal para análise;
b) a extração do DNA da amostra;
c) o fornecimento de pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29;
d) a amplificação da região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
e) detecção da presença do produto da amplificação, onde, o produto de amplificação é caracterizado por compreender nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33.

[00154] Conforme o método de detecção descrito, os pares iniciadores (etapa c) são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 29. Adicionalmente, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde, o produto de amplificação detectado na etapa e) é caracterizado por compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33. Em um aspecto adicional, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde, o produto de amplificação detectado na etapa e) é caracterizado por compreender nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39. Em um aspecto relacionado, o produto de amplificação detectado na etapa e) é caracterizado por compreender pelo menos 104 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO38, SEQ ID NO 39.

[00155] Em uma modalidade, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37. Em uma modalidade adicional, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37. Adicionalmente, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde, o produto de amplificação detectado na etapa e) é caracterizado por compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33. Em mais uma modalidade, a invenção escreve pares iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 37, onde, o produto de amplificação detectado na etapa e) é caracterizado por compreender pelo menos 104 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39.

[00156] Em uma modalidade, pares de iniciadores são fornecidos pela presente invenção e caracterizados pelo fato de serem selecionados do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Em um aspecto particular, os pares de iniciadores utilizados na etapa c) do método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC75064-3 são caracterizados pelo fato de serem selecionados do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Adicionalmente, os pares de iniciadores utilizados na etapa c) do método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC75064-3 compreendem sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Ainda, em uma modalidade preferida, pares de iniciadores são fornecidos, onde o iniciador sense consiste em SEQ ID NO: 6 e o antisense de SEQ ID NO: 7 e/ou, o iniciador sense consiste em SEQ ID NO: 8 e o antisense de SEQ ID NO: 9.

[00157] Em uma modalidade da presente invenção, são fornecidos pares de iniciadores para a detecção de material vegetal derivado do evento de cana de açúcar geneticamente modificado CTC75064-3 caracterizados pelo fato de que o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 6 e o iniciador antissenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 7 e/ou o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 8 e o iniciador antissenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade preferida, os pares de iniciadores são caracterizados pelo iniciador senso compreender a SEQ ID NO: 6 e o iniciador antissenso compreender a SEQ ID NO: 7 e/ou o iniciador senso compreender a SEQ ID NO: 8 e o iniciador antissenso compreender a SEQ ID NO:9.

[00158] Em uma modalidade ainda mais específica, o produto de amplificação (ou amplicom) produzido pelos iniciadores do método de detecção descrito está entre 100 e 1000 pares de base de comprimento. Em um escopo preferido, o amplicon produzido pelos iniciadores do método de detecção descrito está entre 100 e 300 pares de base de comprimento. Ainda mais preferivelmente, o amplicom obtido utilizando pares de iniciadores compreendendo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 12 e o produto de amplificação (ou amplicon) produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 13.

[00159] É de conhecimento geral, em especial aos versados na técnica, que a molécula de DNA (ou ADN) é constituída por duas cadeias ou fitas de nucleotídeos que se mantêm unidas por pontes de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos. O pareamento ocorre de acordo com a complementariedade das bases, seguindo a regra geral de: Adenina com Timina e Citosina com Guanina. Assim, apesar da representação das sequências nucleotídicas ser realizada apenas para uma das fitas, a sua fita complementar ou sequência complementar está incluída no escopo dessa invenção, sendo considerada para a definição das sequências iniciadoras e sondas aqui descritas.

[00160] Os métodos para obtenção de amostras para extração de DNA para análises moleculares são amplamente conhecidos por um técnico no assunto e incluem a coleta de qualquer material vegetal derivado do evento transgênico CTC75064-3, como por exemplo colmo, raízes e folhas. Preferencialmente, as amostras são obtidas de folhas intactas. Métodos de extração de DNA vegetal incluem, sem limitação, aqueles baseados no uso do detergente CTAB (Alianabi et al., 1999), seguidos ou não de purificação posterior da amostra com cloreto de césio ou acetato de amônio, além dos métodos comerciais disponíveis.

[00161] Pares de iniciadores adequados para uso neste método de detecção podem ser planejados utilizando parâmetros bemconhecidos pelos versados na técnica da biologia molecular agora que as SEQs IDs da presente invenção ficaram disponíveis, em especial, as SEQ IDs Nos 2, 3, 4, 5,18, 19, 22, 23, 24, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 38 e 39.

[00162] Por exemplo, um ou ambos os iniciadores do par podem ser planejados para serem específicos a construção, específicos ao gene da característica, específicos ao promotor, específicos à sequência da junção entre o DNA inserido e o DNA genômico e/ou específicos às sequências flanqueadoras.

[00163] Há muitos métodos de amplificação que podem ser utilizados de acordo com este aspecto da invenção. O princípio básico, uma das técnicas conhecida pelos versados na arte, é a reação em cadeia da polimerase (PCR). O produto da amplificação de uma reação da PCR pode ser visualizado através da coloração da cadeia nucleotídica, com, por exemplo, brometo de etídio, e a excitação com luz UV, tipicamente após a separação em tamanhos utilizando a eletroforese em gel de agarose.

[00164] Uma das modalidades da presente invenção usa variações do princípio da PCR como, por exemplo, PCR quantitativo em tempo real, PCR aninhadas (nested PCR), PCR inversa (iPCR), PCR digital, Long PCR, Touchdown PCR, Hot Start PCR, Multiplex PCR, entre outros. O produto da amplificação também pode ser detectado por diferentes metodologias, as quais estão contempladas na presente invenção, como por exemplo, o sistema de SYBR Green™, o qual emite fluorescência quando este reagente se liga ao DNA de fita dupla e o sistema Taqman®, onde a detecção é baseado na interação de sondas fluorescentes. A metodologia Taqman® usa uma sonda que é complementar ao segmento do produto da PCR pretendido, localizada entre os iniciadores da reação. Desta forma, também é considerado como um aspecto da presente invenção sequências de nucleotídeos de filamento único, complementares a polinucleotídeos compreendendo nucleotídeos contíguos de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38 e SEQ ID NO. 39. Durante a etapa de hibridização do ciclo da PCR a sonda está ligada ao DNA-alvo, e durante a extensão da Taq polimerase, através da sua atividade de 5'- exonuclease, remove a sonda, liberando o fluorocromo apresentador, permitindo a emissão de sua fluorescência. Modalidades adicionais desse aspecto da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: amplificação isotermal em loop ("loop-mediated isothermal amplification - LAMP"), eletroforese capilar em gel ("capillary gel electrophoresis – CGE"), "microarray", tecnologia Luminex, "DNA walking" e "Next Generation Sequencing (NGS), método de Sanger, Illumina, entre outros.

[00165] A presente invenção descreve uma metodologia de detecção específica baseada na técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) conhecida como "Plus-Minus" ou "Presença–Ausência", sendo apresentado duas variações da metodologia: via SYBR GREEN™ e via tecnologia Taqman®.

[00166] Assim, é um aspecto da presente invenção que a detecção dos produtos de amplificação (ou amplicons) obtidos através do uso dos pares de iniciadores selecionados do grupo possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 é realizada através da hibridização de sonda selecionada do grupo consistindo em, respectivamente, SEQ ID NO 10 e SEQ ID NO 11. Adicionalmente, o produto de amplificação (ou amplicom) produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 é visualizado através de uma sonda marcada compreendendo a sequência SEQ ID NO. 10. O produto de amplificação (ou amplicom) produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 é visualizado através de uma sonda marcada compreendendo a sequência SEQ ID NO. 11. Ainda é um aspecto da presente invenção que a detecção do produto de amplificação obtido com o uso dos iniciadores SEQ ID NO: 6 eSEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 é realizada através da hibridização com uma sonda compreendendo as sequências SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.

[00167] As Figuras 6 (reação de detecção específica para o evento da invenção via Taqman®) e 7 (ensaio via SYBR GREEN™), representam a validação de ambos os Métodos.

[00168] Os iniciadores e sondas descritos na presente invenção podem ser utilizados em combinação para detectar o evento CTC75064-3. Assim, uma modalidade adicional da presente invenção envolve o uso de PCR multiplex para identificação do material vegetal do evento CTC75064-3.

[00169] Iniciadores e sondas alternativos para auxiliar a detecção e caracterização do evento CTC75064-3 estão incluídos na invenção. Esses e outras variações podem ser utilizados com qualquer um dos métodos de detecção direta descritos acima, mas não limitados a estes.

[00170] Adicionalmente, o evento CTC75064-3 pode ser detectado de material vegetal através da hibridização de amostras de DNA com as sondas. Especificamente, a presente invenção descreve um método para detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 que compreende:

a) a obtenção de uma amostra para análise;
b) a extração do DNA ou RNA da amostra;
c) o fornecimento de uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos contíguos de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39, onde o dito polinucleotídeo possui filamento simples;
d) a hibridização da dita sonda ou combinação de sondas com a amostra, e
e) a detecção da sonda hibridizada ou combinação de sondas.

[00171] Opcionalmente, o método de detecção através do uso de sondas contempla uma etapa adicional (b1) compreendendo a obtenção de produto de amplificação do material da Etapa b) através dos iniciadores descritos pela presente invenção. Tal produto de amplificação é utilizado nas etapas posteriores de hibridização e detecção da sonda hibridizada (c – e).

[00172] Em um escopo preferido, na etapa c) do método descrito é fornecido uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Adicionalmente, a etapa c) do método descrito é caracterizada por compreender o fornecimento de uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em outro aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em um aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. De acprdp com outro aspecto, a etapa c) compreende uma sonda ou combinação de sondas planejadas para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende pelo menos 26 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33.

[00173] A sonda pode ser, por exemplo, um produto da PCR ou um fragmento da digestão de restrição. Em uma modalidade adicional, a sonda como descrito aqui pode ser marcada com uma marcação fluorescente, radioativa, enzimática, ou outra adequada para possibilitar que a hibridização possa ser detectada. O versado na técnica saberá agora como planejar sonda adequadas, agora que possui vantagem da presente divulgação.

[00174] Em uma modalidade adicional, é fornecido um método de hibridização de uma sonda à amostra sob condições estringentes (alta especificidade). As condições de hibridização estringentes são bem conhecidas pelo versado na técnica e compreendem por exemplo: a hibridização a uma temperatura de aproximadamente 65°C em uma solução contendo 6x SSC, 0,01% de SDS e 0,25% de leite em pó desnatado, seguida pela lavagem na mesma temperatura em uma solução contendo 0,2 x SSC e 0,1% de SDS.

[00175] As técnicas adequadas para a detecção específica do material vegetal derivado do evento CTC75064-3 com base no princípio de hibridização incluem, mas não estão limitadas a Southern Blots e à hibridização in situ. O versado na técnica está familiarizado com técnicas tais como estas.

[00176] Tipicamente, estes envolvem a incubação de uma sonda com uma amostra, a lavagem para remoção da sonda não ligada e a detecção do fato da sonda ter se hibridizado. O dito método de detecção é dependente do tipo demarcação ligada à sonda – por exemplo – uma sonda marcada radioativamente pode ser detectada através da exposição a e do desenvolvimento do filme de raios-X. Alternativamente, uma sonda marcada enzimaticamente pode ser detectada através da conversão de um substrato para efetuar uma alteração de cor.

[00177] Adicionalmente, outro aspecto da invenção contempla um método para detecção do material vegetal derivado do evento CTC75064-3 que compreende a obtenção de uma amostra para análise; o fornecimento de um anticorpo planejado para se ligar a uma proteína Cry ou NptII contida dentro de uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO. 18 e/ou SEQ ID NO 19; a incubação do dito anticorpo com a amostra; e a detecção do fato do anticorpo ter se ligado. Em uma modalidade da presente invenção, a dita proteína Cry é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 20 e a proteína NptII é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 21. Em um aspecto adicional, a proteína Cry compreende a SEQ ID NO: 34 e a proteínas NptII compreende a SEQ ID NO: 35.

[00178] Os métodos adequados para a detecção do material vegetal derivado do evento CTC75064-3 baseados na dita ligação de anticorpos incluem, mas não estão limitados a western blots, a ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays") e à espectrometria de massa (SELDI – "Surface-enhanced laser desorption/ionization" ou MALDI – "matrix-assisted laser desorption/ionization"). O versado na técnica está familiarizado a estas técnicas imunológicas. As etapas típicas incluem a incubação de uma amostra com um anticorpo que se liga a proteína Cry ou NptII, a lavagem para a remoção de anticorpo não ligado e a detecção do fato do anticorpo ter se ligado. Muitos de tais métodos de detecção se baseiam em reações enzimáticas – por exemplo, o anticorpo pode estar ligado com uma enzima tal como a peroxidase e na aplicação de um substrato adequado, é detectada uma modificação da cor. Tais anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais.

[00179] Em um outro aspecto a invenção contempla um método para detecção do material vegetal derivado do evento CTC75064-3 que compreende a obtenção de uma amostra para análise; o fornecimento de um extrato de proteínas da amostra; o fornecimento de tiras de teste planejadas para detectar a presença de uma proteína Cry ou NptII contida dentro de uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO. 19; a incubação das tiras de teste com a amostra; e a detecção. Em uma modalidade da presente invenção, a dita proteína Cry é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 20 e a proteína NptII é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 21. Em um aspecto adicional, a proteína Cry compreende a SEQ ID NO: 34 e a proteínas NptII compreende a SEQ ID NO: 35.

[00180] Em uma modalidade da invenção, é fornecido um método para a detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 que compreende a obtenção de uma amostra derivada do evento CTC75064-3 e uma amostra de uma espécie não transgênica de canade-açúcar para análise (controle); submeter um ou mais insetos da espécie Diatraea saccharallis (susceptível à Cry1Ac) às amostras; detectar nas amostras efeito inseticida sobre os insetos. Nesse aspecto da invenção, "Inseticida" se refere a qualquer efeito inibidor sobre o inseto, incluindo, mas não se limitando à alimentação reduzida, ao crescimento retardado, à fecundidade reduzida, à paralisia, à morte.

[00181] O método de detecção do material vegetal do evento CTC75064-3 inclui, mas não está limitado aos ensaios biológicos de alimentação com folhas em que uma folha ou outra parte adequada da planta do evento CTC75064-3 ou qualquer material vegetal derivado do evento CTC75064-3, é infestado com uma ou mais pragas de insetos. A detecção pode ser feita através da avaliação dos danos na folha ou na parte vegetal após períodos de tempo ajustados, da avaliação da mortalidade ou de um outro efeito inseticida sobre os insetos. Tais ensaios biológicos podem ser realizados no campo ou em estufa e podem ser submetidos à infestação natural ou artificial de insetos.

[00182] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado do evento CTC75064-3 que compreende um meio para a detecção da presença de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 e/ou uma proteína Cry. Em uma modalidade da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por amplificação do DNA tal como a PCR, qPCR ou Taqman®. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por hibridização de sondas tais como Southern Blots ou a Hibridização in situ. Em um aspecto, a detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado de uma cana de açúcar transgênica compreendendo a proteína Cry1Ac (evento CTC75064-3) compreende pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29. Adicionalmente, a detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado de uma cana de açúcar transgênica compreendendo a proteína Cry1Ac (evento CTC75064-3) compreende pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos um iniciador compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31. Adicionalmente, a detecção da tal amostra compreende pares de iniciadores onde o iniciador senso compreende SEQ ID NO: 6 e o iniciador antissenso compreende SEQ ID NO: 7, ou o iniciador senso compreende SEQ ID NO: 8 e o iniciador antissenso compreende SEQ ID NO: 9. Em um outro aspecto, a detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado de uma cana de açúcar transgênica compreendendo a proteína Cry1Ac (evento CTC75064-3) compreende uma sonda compreendendo sequências selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO 10 e SEQ ID NO 11. Em uma outra modalidade da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por ligação a anticorpos tais como western blots, ELISAs, além de espectrometria de massa (SELDI ou MALDI) ou tiras de teste. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por ensaio biológico com insetos tais como os ensaios biológicos de alimentação com folhas ou ensaios biológicos de mortalidade. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender qualquer combinação das tecnologias de detecção mencionadas acima.

[00183] O evento transgênico como descrito na presente invenção, possui um efeito sobre insetos de uma ou mais espécies do grupo que compreende insetos da ordem Lepidoptera. Como um resultado, um número reduzido de sprays inseticidas é necessário durante o cultivo da dita planta comparado com uma planta de cana-de-açúcar nãotransgênica da mesma variedade.

[00184] A presente invenção não está vinculada por si só ao evento CTC75064-3, mas é adicionalmente estendida para incluir qualquer material vegetal derivado do mesmo, incluindo semente, contanto que contenham pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção. Em um aspecto, a presente invenção compreende uma parte de planta, uma célula de planta, um tecido de planta, ou uma semente de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.), onde a dita planta, parte de planta, célula de planta, tecido de planta, ou semente compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19. Em um escopo, a invenção compreende planta, parte de planta, célula de planta, tecido de planta, ou semente compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13. Adicionalmente, a invenção inclui planta, parte de planta, célula de planta, tecido de planta, ou semente compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22. A presente invenção inclui, mas não está limitada às plantas que são derivadas de cruzamentos de linhagens com o evento CTC75064-3 ou um derivado do mesmo através de métodos de cruzamento convencional ou outros. Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se ao uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.), como descrito acima, caracterizada por compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19, para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta. Preferivelmente, a invenção descreve o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente caracterizada por compreender o evento CTC75064-3 para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.

[00185] Adicionalmente, a presente invenção descreve um método para cultivar uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada, compreendendo crescer uma planta de cana de açúcar compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 2 sob condições compreendendo infestação de insetos. Preferivelmente, a presente invenção descreve um método para cultivar uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada, compreendendo crescer uma planta de cana de açúcar caracteriza por compreender a SEQ ID NO 5 e/ou a SEQ ID NO 22, sob condições compreendendo infestação de insetos. Em um aspecto ainda mais preferido, a invenção apresenta um método para cultivar uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3, compreendendo crescer uma planta de cana de açúcar caracterizada por compreender a SEQ ID NO 5 e/ou SEQ ID NO 22, sob condições compreendendo infestação de insetos. Preferivelmente, o inseto é Diatrea Saccharalis.

[00186] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para controle de insetos compreendendo disponibilizar uma planta, tecido, parte da planta, células ou sementes de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3 para alimentação do inseto. A presente invenção ainda fornece um método para controle de insetos compreendendo disponibilizar uma planta, tecido, parte da planta, células ou sementes de cana de açúcar geneticamente modificada caracterizada por compreender a SEQ ID NO 2 para alimentação do inseto. Em um escopo preferido, o referido método compreende disponibilizar uma planta, tecido, parte da planta, células ou sementes de cana de açúcar geneticamente modificada caracterizada por compreender a SEQ ID NO 5 e/ou SEQ ID NO 22 para alimentação do inseto. Preferivelmente, o inseto é Diatrea Saccharalis.

[00187] A invenção ainda fornece um método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo caracterizado por compreender cultivar uma planta cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3. A presente invenção ainda fornece um método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo caracterizado por compreender cultivar uma planta cana de açúcar geneticamente modificada caracterizada por compreender a SEQ ID NO 2. Em um escopo preferido, método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo caracterizado por compreender cultivar uma planta cana de açúcar geneticamente modificada caracterizada por compreender a SEQ ID NO 5 e/ou SEQ ID NO 22. Preferivelmente, o inseto é Diatrea Saccharalis.

[00188] A presente invenção também contempla a cultura de tecido de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.) compreendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19. Em um escopo adicional, a presente invenção contempla a cultura de tecido de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.) compreendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13. Também contemplado na presente invenção está a cultura de tecidos cultura de tecido de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22. Adicionalmente, uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada regenerada da cultura de tecidos descrita acima também está incluída na presente invenção, onde a planta regenerada compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19. Exemplos de células de plantas, partes de plantas, incluem, mas nã estão limitados a: células em suspensão, calos, embriões somáticos, tecido meristemático, haste ou colmo superior, haste ou colmo, caule, folha, disco foliar, brotos, entre outros. Um outro aspecto contempla um método para produzir uma planta de cana-deaçúcar resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma primeira planta de cana-de-açúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC75064-3 e produzir uma prole de plantas de cana de açúcar resistente a insetos. A planta compreendendo o evento CTC75064-3 é uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19. A presente invenção também contempla uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) e parte da planta, células, tecidos e sementes da mesma geradas pelo método de produzir uma cana de açúcar resistente a insetos, conforme acima descrito.

[00189] Ainda sob esse aspecto, a presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto compreendendo inserir pelo menos um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido entre as sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24 através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a invenção fornece um método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto compreendendo inserir pelo menos um fragmento de T DNA selecionado do grupo consistindo em uma sequência possuindo pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO 2, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO 2, em sítio específico do genoma compreendido entre as sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24 através de recombinação homóloga. Em um aspecto adicional, a inserção do fragmento de T-DNA conforme acima descrito ocorre de maneira a compreender, após a inserção, pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19. A presente invenção também contempla uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) e parte da planta, células, tecidos e sementes da mesma geradas pelo método de produzir uma cana de açúcar resistente a insetos, conforme acima descrito. Preferivelmente, o referido método é para produzir uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada resistente a inseto do evento CTC75064-3.

[00190] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um produto de comódite, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC75064-3. Assim, a invenção inclui um produto comódite, produzido a partir de uma planta de cana geneticamente modificada (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19. Em um escopo adicional, a presente invenção contempla um produto comódite, produzido a partir de uma planta geneticamente modificada (Saccharum spp.) compreendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13. Também contemplado na presente invenção está um produto comódite, produzido a partir de uma planta geneticamente modificada (Saccharum spp.) compreendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22. Exemplos de produtos comódite incluem, mas não se limitam a: bagaço, suco de cana de açúcar, xarope, etanol de primeira geração (produzido a partir do suco da cana de açúcar), etanol de segunda geração (etanol celulósico produzido a parti da biomassa), biomassa, açúcar, açúcar bruto, açúcar refinado, melaço, vinhaça e fibra.

[00191] A invenção inclui ainda material vegetal derivado do evento CTC75064-3 que pode compreender sequências de polinucleotídeos adicionais, modificadas ou menores comparado com o evento CTC75064-3 ou exibir outras características fenotípicas. Por exemplo, pode ser desejável transformar o material vegetal derivado do evento CTC75064-3 para gerar um novo evento que possui uma característica adicional, tal como um segundo gene de resistência a insetos. Este processo é conhecido como empilhamento de genes. O segundo gene de resistência a insetos pode codificar, por exemplo, lectinas inseticidas, inibidores da protease inseticidas e outras proteínas inseticidas derivadas das espécies de Bacillus thuringiensis.

[00192] A presente invenção fornece ainda um método de controle de insetos que compreende o fornecimento do material vegetal derivado do evento CTC75064-3 em um local onde os ditos insetos se alimentam. A invenção fornece ainda adicionalmente um método de controle de insetos que compreende o fornecimento do material vegetal derivado do CTC75064-3 no local em que os ditos insetos se alimentam e a aplicação de outros reagentes agroquímicos ou biológicos ao dito material vegetal tais como herbicidas, fungicidas e outros.

[00193] Em um outro escopo, a invenção descreve um método para produzir uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum spp.) do evento CTC75064-3, compreendendo introduzir uma modificação genética a uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22 para produzir uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada do evento CTC75064-3, onde a planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada possui resistência a insetos melhorada quando comparada a uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) sem a modificação genética. Em um escopo adicional, a invenção fornece um método para cultivo de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada do evento CTC75064-3, compreendendo crescer uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22 sob condições compreendendo infestação de insetos, onde a planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada possui resistência a insetos aumentada quando comparada com uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) sem a modificação genética crescendo sob as mesmas condições. A invenção também fornece uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada caracterizada por compreender pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19. Em um aspecto adicional, a invenção contempla uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 12 e SEQ ID NO 13. Ainda em um escopo relacionado, a invenção apresenta uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 22, onde a planta é resistente a inseto. Preferivelmente, a planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada é do evento CTC75064-3.

Descrição da Cana de açúcar Transgênica CTC75064-3

[00194] As plantas do evento transgênico de cana de açúcar 'CTC75064-3' são substancialmente equivalentes geneticamente e fenotipicamente similares a variedade parental 'RB 867515' (Certificado de proteção de cultivar № 271), mas com uma nova e particular característica (Cry1Ac expression.), a qual garante a resistência ao inseto da broca da cana de açúcar, Diatrea saccharalis (Lepidoptera). Da mesma forma que a sua variedade parental RB 867515, a CTC75064- 3 é um híbrido moderno de cana de açúcar que possui muitas características agronômicas desejáveis como por exemplo, potencial genético para alto vigor de brotação de cana-soca, alta produtividade, excelente perfilhamento, maturidade de média-tardia, alto conteúdo de sacarose e tolerâncias a escaldadura, ferrugem alaranjada e mosaico da canade-açúcar.

[00195] Resumidamente, as plantas do evento 'CTC75064-3' são caracterizadas por pelos colmos de coloração roxa quando exposto ao sol e verde-púrpura quando na sombra. As plantas 'CTC75064-3' exibem entrenós curvos de tamanho médio a longo e anéis de crescimento amarelo esverdeados de largura média. Os entrenos são de aspecto liso e sem fissuras de crescimento, com cerosidade média. As plantas 'CTC75064-3' exibem gemas de formato obovado com uma pubescência na posição apical da gema. A arquitetura da folha é ereta com pontas curvadas. A aurícula média é lanceolada, apresentando lígula em forma de crescente.

[00196] Características agronômicas e fenotípicas de plantas do evento CTC75064-3 foram avaliadas em comparação à variedade parental RB `867515' e três cultivares referências comerciais, em 6 locais representativos da área de cultivo da variedade parental. A média da altura da planta (medidas realizadas a 330 Dias após plantio – DAP, exceto em Juazeiro, onde a medida foi realizada a 210 DAP), diâmetro do colmo (medidas realizadas a 330 Dias após plantio – DAP, exceto em Juazeiro, onde a medida foi realizada a 210 DAP); número de perfilhos (medidas realizadas a 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 e 330 DAP; ensaio não realizado em Juazeiro-BA), peso da parcela (medidas realizadas a 330 Dias após plantio – DAP, exceto em Juazeiro, onde a medida foi realizada a 210 DAP), conteúdo de açúcar (BRIX %; medidas realizadas a 330 Dias após plantio – DAP, exceto em Juazeiro, onde a medida foi realizada a 210 DAP), florescimento (observações durante todo o ciclo de desenvolvimento até 330 DAP, exceto em Juazeiro, onde as observações foram realizadas até 210 DAP) e toneladas de pol% (% de sacarose no suco da cana) por hectare (TPH; medidas realizadas a 330 Dias após plantio – DAP, exceto em Juazeiro, onde a medida foi realizada a 210 DAP) foram avaliadas. O TPH é calculado de acordo com a fórmula:

[00197] Para cada conjunto de dados, os dados de todos os locais foram combinados para análise estatística. A Análise combinada foi realizada através do seguinte modelo estatístico:

onde yijk medida da repetição j no local i para o tratamento k; μ é a média geral; Si efeito do local i, i = 1 a 6; Bj efeito da repetição j, j = 1 a 4; B(S)ij efeito da repetição j dentro do local i (j=1 a 4); Gk é o efeito do tratamento k, k = 1 a 7; (SG)ik interação entre o local i e o tratamento k; εijk é erro do resíduo experimental.

[00198] As principais análises de efeito e modelos de interação são realizadas conforme descrito Kuznetsova et al. (2017). Todas as informações foram analisadas usando modelo linear misto através do lme4 (Bates et al., 2015).

[00199] Os resultados da análise das características agronômicas e fenotípicas são mostrados na tabela abaixo e corroboram a conclusão de que o evento 'CTC75064-3' é similar à sua variedade parental (´RB867515´).

[00200] Outros estudos composicionais foram realizados e também demonstram que 'CTC75064-3' é similar a sua variedade parental ('RB 867515') [parâmetros composicionais relacionados a nutrição e uso da cana de açúcar na dieta, conforme definido pelo guia OECD Guidance Document (OECD, 2011)] . Baseado nos resultados da análise conjunta (6 localização representativas de regiões de cultivo de cana de açúcar no Brasil), sugere-se que a presença das proteínas Cry1Ac e NptII presentes nas amostras analisadas não interferem significativamente na composição bromatológica do evento CTC75064-3 comparada com a variedade parental RB 867515, e que a equivalência composicional observada para os 11 parâmetros avaliados corroboram coma premissa de que há uma alta similaridade entre o evento CTC75064-3 e a sua variedade parental RB 867515.

Exemplos Exemplo 1. Geração do Evento CTC75064-3 – Transformação por Agrobacterium.

[00201] O evento CTC75064-3 foi obtido por transformação genética mediada por Agrobacterium tumefasciens da cultivar RB 867515.

[00202] A cultivar RB 867515 é um híbrido comercial que é doador do genótipo para o evento CTC75064-3 (background genético); desta forma, ela representa a variedade não transformada de referência para o evento CTC75064-3. Essa cultivar possui maturação média a tardia e tem sido plantada especialmente no centro-sul do Brasil. Assim, como os outros híbridos comerciais, é um material com alta ploidia e com muitos cromossomos derivados de duas variedades parentais: S. officinarum e S. spontaneum (DANIELS e ROACH, 1987; SREENIVASAN et al., 1987).

[00203] O evento CTC75064-3 possui o gene cry1Ac, que expressa uma toxina para controle da D. saccharalis, e o gene nptII, utilizado como marcador de seleção durante o processo de modificação genética. O desenvolvimento do evento CTC75064-3 foi proposto para controle da broca da cana. É esperado que após a eclosão das larvas dos ovos nas folhas do evento CTC75064-3, as larvas jovens comecem a se alimentar e, ao ingerirem a proteína Cry1Ac, sejam controladas antes de penetrarem no colmo das plantas do evento CTC75064-3, evitando o dano econômico da praga ao cultivo. A expressão do gene cry1Ac é regulada pela região promotora compreendendo promotor CaMV 35s com enhacer duplicado (2xCaMV35s), sequência líder LCab de trigo, íntron de Actina de arroz (OsACT1) e sequência Kosak 5' upstream do sítio de início da transcrição. A expressão do gene nptII é regulada pelo promotor do gene da ubiquitina do milho - UBI-1 (que possui um intron endógeno). O cassete de expressão do cry1Ac utiliza o terminador CaMV 35S e o cassete do nptII usa o terminador da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (nos).

1.1 Desenvolvimento da Construção contendo os genes cry1Ac e nptII (Figura 5; SEQ ID NO 14).

[00204] Técnicas convencionais de clonagem gênica, utilizando plasmídeos bacterianos comerciais e digestão e ligação de fragmentos através do uso de enzimas de restrição e ligases foram utilizadas para construir a construção da presente invenção (Figura 5).

[00205] A construção da presente invenção foi desenvolvida por meio da junção dos cassetes 2xCaMV35s-cry1Ac-T35s e UBI-nptIITNOS. O T-DNA contendo ambos os cassetes, foi transferido por clonagem tradicional para o plasmídeo base (Figura 4; vetor plasmidial binário, que contém em seu espectro de hospedeiro as bactérias Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens), gerando o plasmídeo binário contendo a construção da presente invenção (Figura 5; SEQ ID NO 14).

[00206] Após a clonagem final da construção (SEQ ID NO 14), a mesma foi inserida por choque térmico na cepa de Escherichia coli TOP10. Uma colônia isolada contendo a construção, a qual foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 150 µg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C, com agitação de 250 rpm por um período de 16 horas. Preparou-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer - 80°C.

[00207] A construção da presente invenção foi então transferida de E. coli para a cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens através do isolamento e purificação do DNA plasmidial e transformação da Agrobacterium por eletroporação. Uma colônia isolada de agrobactéria contendo o vetor desejado foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 100 μg/ml de espectinomicina e 50 μg/ml de rifampicina e incubada a 28°C, com agitação de 200 rpm por um período de 24 horas. Preparou-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer -80°C. Esses estoques foram utilizados nos experimentos de transformação genética que deram origem ao evento CTC75064-3.

1.2 Transformação das plantas mediada por Agrobacterium

[00208] Para obtenção de calos embriogênicos, folhas jovens enroladas (palmitos) de cana-de-açúcar da variedade RB 867515, desenvolvidas no campo ou casa de vegetação por até 12 meses, foram coletadas para isolamento dos explantes iniciais.

[00209] Após desinfecção superficial, secções transversais com cerca de 0,05-5mm de espessura foram cortadas da região acima do meristema, em condições assépticas. As secções foram colocadas na superfície do meio de cultura de indução de calos [Sais MS - Murashige e Skoog, 1962; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina, hidrolisado de caseína, ácido cítrico, manitol, sulfato de cobre, glicina,agente gelificante, 2,4D] . As culturas foram mantidas no escuro à temperatura de 26°C± 2°C, sendo subcultivado a cada 15 dias, por três a cinco ciclos de 7-28 dias cada. Uma semana antes da transformação, os calos foram novamente selecionados para as características embriogênicas (nodular, compacto, opaco e ligeiramente amarelado).

[00210] A cultura de Agrobacterium, compreendendo a cepa EHA105 transformada com o plasmídeo binário da presente invenção, foi iniciada a partir de um estoque de glicerol e mantida no escuro a 28°C por dois a três dias. A suspensão de Agrobacterium para infectar o material vegetal foi preparada ressuspendendo a cultura em meio líquido MS acrescido de acetoseringona, ajustando para uma OD600 final de 0,1-1,0 (sais MS, sacarose e vitaminas B5).

[00211] Os calos com características embriogênicas foram selecionados visualmente e diretamente transferidos para a suspensão de Agrobacterium, onde permaneceram por 30 minutos, no escuro com agitação constante de 50 rpm.

[00212] Após esse período, os calos foram separados da suspensão de Agrobacterium e o excesso da suspensão foi removido. Em seguida, os calos foram cultivados por 1 -5 dias em semissólido (sais MS, sacarose, vitaminas B5, ácido cítrico, agente gelificante, 2,4D e acetoseringona) a 22°C no escuro.

[00213] Após o co-cultivo, os calos foram transferidos para meio de descanso DT (Sais MS; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina, hidrolisado de caseína, ácido cítrico, sulfato de cobre, glicina, agente gelificante, 2,4D, timetina] ) e mantidos por 5-14 dias a 26°C no escuro.

[00214] As células transformadas foram selecionadas por sucessivos subcultivos em meio de cultura de seleção contendo fitorreguladores e o agente seletivo, geneticina (meio de seleção com geneticina, Sais MS; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina, hidrolisado de caseína, sulfato de cobre, glicina, agente gelificante, 2,4D, timetina). Os calos permaneceram nesta condição por 21 dias a 26°C no escuro. Em seguida, os calos foram transferidos para o meio de regeneração (equivalente ao meio de seleção com ausência de 2,4D) e posteriormente para o meio de elongação (Sais MS; sacarose, vitaminas B5, hidrolisado de caseína, agente gelificante, timetina), e para um fotoperíodo de 16 horas a 4.000 lux. Plantas regeneradas na presença do antibiótico utilizado como agente seletivo foram multiplicadas, enraizadas e aclimatadas antes da transferência para casa-de-vegetação, dentre elas, o clone que posteriormente originou o evento CTC75064-3, para o qual abaixo descreve-se os métodos para sua caracterização.

Exemplo 2. Caracterização Molecular do evento CTC75064-3 2.1 Extração de DNA.

[00215] Foi utilizado aproximadamente 10 mg de tecido foliar do evento CTC75064-3. A extração do DNA genômico foi realizada no extrator de ácidos nucleicos BioSprint 96 (Quiagen, GER) com o kit de extração BioSprint 96 DNA Plant Kit (Quiagen, GER), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA obtido foi normalizado para a concentração de 10 ng/µL em espectrômetro Multiskan GO (Thermo Scientific, EUA).

2.2 Determinação do número de cópias do transgene inseridas no germoplasma da planta hospedeira.

[00216] O número de cópias dos genes cry1Ac e nptII inseridos no evento CTC75064-3 foi avaliado inicialmente por meio de PCR quantitativo via Taqman® (qPCR/Taqman®), sendo seus resultados confirmados posteriormente via Southern blot e/ou sequenciamento.

[00217] As reações de PCR em tempo real via Taqman® foram realizadas utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, EUA) em seu modo Fast. Os conjuntos de primers e sondas utilizados encontram-se descritos na TABELA 3.

[00218] Como controle endógeno das reações para cry1Ac e nptII, visando confirmar a presença e qualidade do DNA utilizado, bem como a efetividade da reação, foi utilizado o gene da poliubiquitina de canade-açúcar [Iniciador sense: 5 'ACCATTACCCTGGAGGTTGAGA 3 ' (SEQ ID NO: 15); antisense primer: 5 'GTCCTGGATCTTCGCCTTCA 3' (SEQ ID NO: 16); sonda: VIC -5 'CTCTGACACCATCGAC 3'-MGB (SEQ ID NO:17)] , em um modo multiplex.

[00219] As reações de qPCR utilizaram 1X TaqMan® Fast PCR Master Mix II (Applied Biosystems, EUA), 300 nM de cada iniciador e 200 nM das sondas correspondentes. A ciclagem utilizada foi: um ciclo de 50°C por 2 minutos para ativação da uracil-N-glicosilase, um ciclo de 95°C por 20 segundos para ativação da DNA polimerase, 40 ciclos de 95°C por 3 segundos (desnaturação) e 60°C por 30 segundos (anelamento e extensão).

[00220] A análise de dados foi realizada pela inserção manual do limiar (threshold) na fase exponencial da curva de amplificação. Para os genes cry1Ac e nptII, o número de cópias foi inferido a partir da análise de DeltaCt (dCt), na qual o Ct (ciclo no qual o sinal de fluorescência emitido pelo produto da amplificação atinge o limiar) do gene endógeno é subtraído do Ct do gene alvo. Neste tipo de análise, considera-se que o número de cópias dobra a cada Ct e toma-se como referência o número de cópias de controles da mesma variedade cujo valor é conhecido. Adicionalmente, o número de cópias para o gene cry1Ac foi confirmado pelo cálculo de delta-Ct (dCt), utilizando como referência controles internos da própria variedade, cujo resultado é expresso em números exponenciais (1, 2, 4, 8, 16 cópias)

[00221] Os resultados dos ensaios indicam a presença de 1 cópia do gene cry1Ac e 1 cópia do gene nptII presentes no genoma do evento CTC75064-3.

[00222] Para o ensaio de Southern blot, 10 µg do DNA genômico do evento CTC75064-3 foi digerido separadamente com enzimas de restrição distintas (EcoRV, HindIII e ShpI), seguido pelo procedimento de marcação a frio da sonda (Digoxigenin - DIG). Resumidamente, os DNAs genômicos do evento CTC75064-3 e da variedade parental RB 867515 foram extraídos usando NucleoSpin® Plant II kit em tubos, seguindo as recomendações do fabricante (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG,Germany). A qualidade do DNA extraído foi verificada em gel de agarose a 1% em tampão TAE 1X (Tris-Acetate EDTA) e 10 μg de DNA foram digeridos usando 100 unidades da enzima de restrição (10 U/μg de gDNA) por amostra, em um volume final de 400 μl de reação.

[00223] A reação enzimática foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher, USA). O produto da digestão foi precipitado em 2 volumes de etanol e 10% 7,5 M acetato de amônio, e incubado por 48 h a -20 °C. O DNA precipitado foi centrifugado a 14,000 x g por 30 min e o pellet formado foi resuspendido em 35 μl de água milli-Q até a dissolução completa. A qualidade da digestãofoi visualizada em gel de agarose 1% com tampão 1X TAE (Tris-Acetato - EDTA). As enzimas EcoRV e HindIII foram usadas para detectar os cassetes contendo cry1Ac e nptII genes (Figura 23 A). A enzima SphI foi usada para detectar o backbone do vector (Figura 23 B).

[00224] Sondas foram desenhadas para detectar o gene cry1Ac (sonda Cry1Ac - 1,079 bp), nptII gene (sonda nptII 579 bp), e região promotora CaMV 35s (promotor CaMV 35s e íntron de OsACT; sonda 35S - 904 bp), presentes no evento CTC75064-3. As sondas para detectar fragmentos do vetor (backbone) foram desenhadas através do vetor, cobrindo ~ 98% do backbone (sonda BB1 – 1.875 bp; sonda BB2 -2.305 bp; sonda BB3 -2.282 bp; Figura 23 B). As sondas foram preparadas e usadas para detectar alvos usando os reagentes do PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche, cat # 11636090910, Switzerland). Cerca de 100 pg do vetor linearizado foram usados como molde para a amplificação de regiões de interesse e incorporação da molécula de digoxigenin (DIG; marcação) por PCR para uso como sonda. Os iniciadores usados para a produção das sondas, as temperaturas de hibridização (Thyb) e o tamanho esperado de cada amplicon são listados na Tabela 04.

[00225] O DNA da variedade RB 867515 foi usado como controle negativo. Como controle positivo, o DNA plasmidial contendo a construção usada para obter o evento CTC75064-3 foi adicionado ao DNA genômico da RB 867515. O DNA plasmidial foi previamente linearizado com a enzima de restrição usada em cada ensaio.

[00226] A transferência do DNA digerido para a membrana de nylon foi realizada de acordo com protocolos bem estabelecidos. Resumidamente, a eletroforese de DNA digerido em agarose gel 1% com tampão TAE 1X for realizado a 40 V por aproximadamente 20 horas, usando SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen # S33102, USA) como agente intercalante. Posteriormente, o gel de agarose foi tratado com quatro diferentes soluções na seguinte ordem:

• Solução de Depurinação (1,1% HCL); 10-15 min;
• Solução de Denaturação (0,5 N NaOH; 1,5 M NaCl); 30-40 min;
• Solução de Neutralização (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris); 30-40 min;
• SSC 20x (Citrato de sódio salino); 20 min

[00227] A transferência do DNA para a membrana de nylon foi realizada usando TurboBlotter Transfer System 20 x 25 (Sigma # WHA10416324, USA) de acordo com instruções do fabricante. A membrana com as amostras do DNA transferido foi colocada em um equipamento UV Crosslinker (UVP- Analytik-Jena, Germany) para fixação do DNA (2 ciclos de 700 x 100 µJ/cm²). Pré-hibridização e hibridização foram então realizadas.

[00228] O tratamento de Prehibridização consiste em incubação da membrana com solução DIG Easy Hyb (Roche # 11603558001, Switzerland) a 40 °C por 3 horas, com DNA de esperma de salmão desnaturado na concentração final de 100 µg.mL-1 e rotação constante (0,5 x g). Após, a hibridização foi realizada com a mesma solução de Prehibridização (DIG Easy Hyb com DNA de esperma de salmão) adicionada à sonda marcada com DIG e desnaturada. A concentração usada para as sonda foi de 65 µg.mL-1. A temperatura de hibridização foi 50 °C.

[00229] A hibridização foi realizada em um forno de hibridização de aproximadamente 16 horas com rotação constante (0,5 x g). As membranas hibridizadas foram lavadas e bloqueadas. Após, a solução de bloqueio foi descartada e a membrana foi encoberta com uma nova solução de bloqueio com Anti-Digoxigenin AP fragments (Roche # 11093274910, Switzerland) diluídos em uma razão de 1:20.000. A membrana foi então incubada por 30 min a temperatura ambiente e suavemente agitada. A solução de anticorpo foi descartada e a membrana foi lavada e incubada com o tampão de detecção Detection buffer (Roche # 11585762001, Switzerland) plus CDP-Star ready to use (Roche # 12041677001, Switzerland) em uma concentração final de 1X, de acordo com instruções do fabricante. Um filme fotográfico foi adicionado para detectar quimiluminescência (Roche # 11666657001, Switzerland), mantido em contato com a membrana por pelo menos 16 hours e posteriormente imerso em 1x Developing Solution (Kodak # 1900943, USA) para visualização das bandas. A solução de fixação (1x) (Kodak # 1901875, USA) foi usada para fixar as imagens das bandas detectadas.

[00230] Na hibridização com as sondas Cry1Ac e 35S, para os materiais digeridos com HindIII, uma única banda com cerca de 8,5 kb é observada em todas as amostras do evento CTC75064-3 (Figura 24 - esquerda; Figura 25 - direita). Para as mesmas sondas, as amostras digeridas com EcoRV apresentam fragmentos com cerca de 2,79 kb em todas as amostras do evento CTC75064-3 (Figura 24 - direita; Figura 25 - esquerda). A hibridização com a sonda nptII, em materiais digeridos com HindIII, um fragmento com tamanho esperado de ~ 3,5 kb é observado em todas as amostras do evento CTC75064-3 (Figura 26 - esquerda). Para a enzima EcoRV, um fragmento > 12 kb é observado (Figura 26 - direita).

[00231] Os resultados de Southern blot, usando as enzimas EcoRV e HindIII em combinação com as sondas que reconhecem os genes cry1Ac, nptII e o promotor 35s, confirmam os resultados obtidos usando qPCR, os quais indicam que o evento CTC75064-3 possui apenas uma única integração do T-DNA, com uma única cópia do gene cry1Ac e uma única cópia do gene nptII no genoma. Adicionalmente, a presença dos mesmos fragmentos em todas as gerações do evento CTC75064-3, de amostras provenientes de gerações vegetativas consecutivas (T0 – T3; Figuras 24, 25 e 26), confirmam a estabilidade genética da inserção do evento ao longo de 4 gerações de multiplicação vegetativa. Sequências do backbone do vetor não foram detectadas no evento CTC75064-3 (Figura 27).

2.3 Definição das sequências flanqueadoras.

[00232] Para isolar as regiões flanqueadoras às extremidades dos insertos de T-DNA presentes no evento CTC75064-3, foram realizados vários experimentos de sequenciamento de DNA. O mapa da inserção genética presente no evento CTC75064-3 resultante dos dados gerados por estes experimentos é apresentado na FIGURA 3

[00233] Ensaios de PCR reverso (iPCR) foram realizados para ambas extremidades do T-DNA com o objetivo de isolar e clonar as regiões flanqueadoras do inserto. A metodologia de iPCR é baseada na digestão do DNA genômico utilizando enzimas que clivam a sequência do T-DNA e uma sequência aleatória do genoma do evento. Os produtos da clivagem são circularizados e submetidos a múltiplos ciclos de PCR aninhadas (nested PCR), utilizando primers para regiões conhecidas do T-DNA (TABELA 5). A partir do isolamento, sequenciamento e análise das bandas amplificadas nas reações de iPCR por metodologia Sanger, uma sequência consenso das regiões flanqueadoras foi definida (SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24).

[00234] Em paralelo, como não há atualmente nenhum genoma completamente sequenciado que pudesse ser utilizado como referência para o germoplasma RB 867515, uma metodologia de sequenciamento por captura foi adotada como forma de esforço adicional para o isolamento do T-DNA inserido no evento CTC75064-3 e de suas regiões flanqueadoras. Nesta estratégia, pequenos fragmentos de polinucleotídeos sobrepostos (sondas) foram desenvolvidos de modo a cobrir toda a sequência do T-DNA. Essas sondas foram hibridizadas com o DNA genômico fracionado de ambas cultivares, RB 867515 e CTC75064-3, e as sequências híbridas foram isoladas. Os fragmentos isolados foram então sequenciados utilizando tecnologia Illumina® de acordo com protocolo padrão. Os dados obtidos foram alinhados com a sequência de T-DNA presente no vetor de transformação e, em conjunto com os dados obtidos por iPCR mencionados anteriormente, a sequência consenso da inserção de T-DNA (SEQ ID NO 2) presente no evento CTC75064-3 foi definida, bem como as suas sequências flanqueadoras (SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24) e as sequências da junção entre as extremidades dos insertos e o genoma de cana de açúcar do evento CTC75064-3 (SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19). Desta forma, as sequências consenso do evento CTC75064-3 foram definidas (SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22).

2.4 Método de detecção e caracterização do evento CTC75064-3 - ensaio evento-específico.

[00235] Para a validação da metodologia, foram utilizadas amostras de folha do evento oriundas de Piracicaba) Como controles experimentais, foram utilizados outros eventos geneticamente modificados que possuem a mesma construção e plantas controles não transformados (WT). A extração do DNA ocorreu conforme descrito acima.

[00236] A partir da caracterização molecular das sequências flanqueadoras da inserção do T-DNA no genoma no evento CTC75064-3 de cana-de-açúcar geneticamente modificada, foi possível desenhar e validar ensaios de PCR em tempo real para a identificação inequívoca do evento. Para o desenvolvimento de metodologia de detecção específica optou-se pela técnica de PCR em tempo real (qPCR) conhecida como "Plus-Minus" ou "Presença–Ausência", sendo validadas as duas variações da metodologia: via SYBR GREEN e via tecnologia Taqman®. Dois pares de iniciadores de amplificação (primers) específicos foram desenhados para gerar informação a respeito das inserções do T-DNA em ambas metodologias, de modo que, para cada par de primer, um iniciador se ancora na região espaçadora e um segundo iniciador se ancora no genoma. Para o uso da tecnologia Taqman®, sondas específicas foram desenhadas entre os iniciadores.

[00237] Em uma modalidade preferida da invenção, os iniciadores desenhados são caracterizados conforme definidos nas SEQ ID Nos: 6 a 9, onde o Iniciador SEQ ID NO: 6 é o iniciador senso da borda direita e o iniciador de sequência SEQ ID NO: 7 é o iniciador antissenso da borda direita, o iniciador SEQ ID NO: 8 é o iniciador senso da borda esquerda e o iniciador de sequência SEQ ID NO: 9 é o iniciador antissenso da borda esquerda (Tabela 06).

[00238] Em uma modalidade preferida da invenção, a sonda empregada no PCR via tecnologia Taqman® para identificação do evento CTC75064-3 compreende a SEQ ID NO: 10 na borda direita (RB border) e/ou a SEQ ID NO: 11 na borda esquerda (LB border).

[00239] As reações de PCR em tempo real via Taqman® foram realizadas utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) em seu modo Fast.

[00240] Como controle endógeno de reação, visando confirmar a presença e qualidade do DNA utilizado, foi utilizado o gene da poliubiquitina de cana-de-açúcar (iniciador senso: SEQ ID NO: 15; iniciador anti-senso: SEQ ID NO: 16; sonda: SEQ ID NO: 17) em multiplex com o ensaio desenvolvido para o evento.

[00241] As reações de qPCR utilizaram 1X TaqMan® Fast PCR Master Mix II (Applied Biosystems, USA), 150 nM de cada iniciador específico para o evento da invenção e 100 nM da sonda correspondente, 300 nM dos iniciadores para o gene endógeno poli-ubiquitina e 200 nM da sua sonda, 100-200 ng de DNA e água suficiente para completar o volume de 20 µL. A ciclagem utilizada foi: um ciclo de 50°C por 2 minutos para ativação da uracil-N-glicosilase, um ciclo de 95°C por 20 segundos para ativação da DNA polimerase, 40 ciclos de 95°C por 3 segundos (desnaturação) e 60°C por 1 minuto (anelamento e extensão).

[00242] As reações de qPCR utilizando SYBR GREEN foram realizadas também utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), em seu modo padrão para esse tipo de ensaio. As reações foram realizadas utilizando 1 X o QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN™), 150 nM do primer sense e 150 nM do primer anti-sense, 20 ng de DNA e água em quantidade suficiente para um volume final de 25 μL. Foram realizadas utilizando o evento da invenção e, como controles negativos, os outros eventos transformados com a mesma construção do evento da invenção (controles negativos), além de amostras de cana-de-açúcar selvagem (WT) e controles experimentais (branco de extração e reação).

[00243] Os parâmetros de ciclagem utilizados foram: um ciclo de desnaturação do DNA a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos de anelamento dos iniciadores e amplificação a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto e um ciclo de dissociação para geração do "pico de melting" (95ºC por 15 seg, 60ºC por 1 min, 95ºC por 15 seg). A reação com SYBR safe não permite a utilização de multiplex, sendo necessário o preparo de nova reação de amplificação de gene endógeno, utilizando o mesmo DNA, para a eliminação de falsos negativos.

[00244] Como resultado, foi possível validar a reação de detecção específica para o evento da invenção via Taqman® com alta acurácia, como ilustrado na Figura 6. As sondas da tecnologia Taqman® se ligam especificamente ao DNA e são liberadas durante a amplificação do DNA, gerando um sinal de fluorescência capturado pelo equipamento durante o processo.

[00245] Reações de qPCR multiplex, compreendendo os iniciadores e sondas de todas as regiões flanqueadoras que caracterizam o evento, assim como o controle endógeno da poli-ubiqutitina, podem ser realizadas para a identificação do evento. Da mesma forma que também são suficientes para identificar de forma inequívoca o evento as reações específicas para cada região flanqueadora realizadas apenas em multiplex com o gene de poli-ubiquitina.

[00246] As amostras correspondentes ao evento da invenção apresentaram amplificação específica, com formação de curva de amplificação bem definida, com formato sigmoide característico, enquanto as amostras dos outros eventos, bem como WT e brancos da extração e reação, não apresentaram amplificação de evento-específico. O controle endógeno apresentou amplificação para todas as amostras, exceto brancos de extração e reação, como esperado, evidenciando a qualidade do DNA utilizado na reação, bem como a qualidade da reação e ciclagem.

[00247] O ensaio via SYBR GREENTM, por sua vez, apresentou amplificação específica das amostras do evento da invenção na temperatura de melting esperada. As amostras dos demais eventos, bem como WT e brancos não apresentaram pico de amplificação (Figura 7).

Exemplo 3. Reconstrução do evento CTC75064-3 através de técnicas de inserção sítio dirigido (Edição Genômica).

[00248] O evento CTC75064-3 pode ser gerado utilizando ferramentas de edição genômica (EG), recriando o evento inicialmente desenvolvido através de método de transformação genética mediados por Agrobacterium, conforme apresentado pela presente invenção.

[00249] Desse modo, o evento CTC75064-3 é recriado através da inserção do gene Cry1Ac na mesma localização no genoma da cultivar RB 867515 conforme descrição apresentada para o evento CTC75064-3. A expressão do gene Cry1Ac é regulada por um promotor ou uma região promotora e um terminador capaz de dirigir a expressão da proteína Cry1Ac a níveis suficientes para controlar a infestação da praga alvo. Adicionalmente, um gene marcador ou um sistema de seleção também é inserido (transientemente ou estavelmente) para permitir a seleção do evento. Preferivelmente, o T-DNA da presente invenção (SEQ ID NO: 2) é inserido no(s) sítio específico do genoma conforme descrito para o evento CTC75064-3. Desta forma, o evento CTC75064-3 é recriado com a inserção do gene cry1Ac gene, o qual expressa a toxina que controla D. saccharalis, e o gene nptII. A expressão de cry1Ac pela região promotora compreendendo promotor CaMV35s com enhancer duplicado, sequência líder L-Cab de trigo, intron de OsACT1 e sequência Kosak 5' upstream do sítio de início da transcrição. A expressão dos genes nptII é regulada pelo promotor de milho ubiquitina 1 (UBI-1), o qual possui um intron endógeno. O cassete de expressão do cry1Ac possui o terminador CaMV35s (T35s) e o cassete de expressão do nptII usa terminador de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (nos).

[00250] Caso a estratégia de EG definida para a geração do evento CTC75064-3 resultar em uma baixa eficiência de integração do T-DNA no sítio específico de inserção do CTC75064-3, genes de desenvolvimento, morfogenes ou outros elementos reguladores podem ser utilizados em conjunto com os reagentes de Edição Genômica (EG) para melhoria da eficiência de integração.

3.1 Desenvolvimento das Construções

[00251] Técnicas de clonagem gênica convencionais utilizando plasmídeos comerciais, digestão por enzimas de restrição, ligação de fragmentos através de ligases e outras metodologias conhecidas são usadas para desenvolver as construções (plasmídeos) da presente invenção.

[00252] Os reagentes de GE podem ser entregues em múltiplas construções (plasmídeos), cada um compreendendo um elemento do complexo enzimático (endonuclease, crRNA ou RNA guia, e o template de recombinação homóloga- HR).

[00253] Em uma modalidade da presente invenção, a construção do molde de recombinação homóloga (RH ou HR) compreende o T-DNA (SEQ ID NO 2), flanqueado por fragmentos de DNA homólogos às sequências flanqueadoras do evento CTC75064-3 (SEQ ID Nos: 23 e SEQ ID Nos: 24), localizados em ambos os lados do T-DNA. Assim, é um aspecto da presente invenção uma construção compreendendo a sequência de T-DNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e flanqueada nas extremidades 5' e 3' por sequências de DNA homologas as sequências flanqueadoras que caracterizam o evento CTC75064-3, as quais são selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 23 e SEQ ID Nos: 24. A orientação das sequências é definida pela orientação do T-DNA no genoma do evento CTC75064-3 de tal forma que o molde de recombinação homóloga caracteriza-se por compreender sequência idêntica ou substancialmente idêntica à SEQ ID NO 22. Em um escopo preferido a construção do molde de recombinação homóloga (HR) compreende a SEQ ID NO: 26 (Figura 21).

[00254] A invenção também compreende uma segunda construção compreendendo um cassete de expressão de uma endonuclease. Em um escopo preferido, o cassete de expressão da endonuclease compreende a sequência de uma endonuclease Cas9. Em um escopo ainda mais preferido a sequência da endonuclease é códon otimizada para expressão em cana de açúcar. Uma terceira construção também está contemplada na presente invenção compreendendo apenas o cassete de expressão do RNA guia/crRNA também está contemplada na presente invenção. Em um aspecto alternativo da invenção, a construção contendo a endonuclease Cas 9 compreende adicionalmente a sequência do RNA guia/crRNA. Preferencialmente, a construção de Cas 9 compreende a sequência crRNA SEQ ID NO: 28. Em um escopo mais específico, a construção do Cas9 compreende a SEQ ID NO: 27 (Figura 20). Uma terceira construção compreendendo apenas o cassete de expressão do RNA guia também está contemplada na presente invenção e compreende a SEQ ID NO: 28

[00255] Em um escopo adicional, os reagentes de edição genômica podem ser entregues em um único plasmídeo (construção) o qual compreende os cassetes de expressão da endonuclease, do RNA guia (sgRNA) e do molde de recombinação homóloga contendo a(s) sequências de interesse. Em um escopo da invenção, a construção única compreende a sequência de T-DNA da presente invenção (SEQ ID NO: 2), flanqueada nas extremidades 5' e 3' por sequências de DNA homólogas as sequências flanqueadoras que caracterizam o evento CTC75064-3, as quais são selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 23 e SEQ ID No 24 localizadas em ambas as extremidades do T-DNA. Em um escopo preferido, a construção compreende a SEQ ID NO: 25 (Figura 22). A orientação das sequências é definida pela orientação do T-DNA no genoma do evento CTC75064-3 de tal forma que o molde de recombinação homóloga caracteriza-se por compreender sequência idêntica ou substancialmente idêntica à sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 22.

[00256] Opcionalmente, as construções também compreendem marcadores de seleção/fluorescentes e/ou outros sistemas de engenharia genética para remoção dos marcadores de seleção e/ou dos cassetes de nucleases, como por exemplo, o sistema de recombinação homóloga Cre/loxP do bacteriófago P1. Nesse caso, o cassete de expressão do marcador/nuclease, o qual deve ser deletado, é flanqueado por regiões LoxP, enquanto a Cre recombinase remove esse fragmento durante a sua expressão transiente.

3.2 Entrega Direta

[00257] Em um aspecto, o evento da invenção é gerado usando metodologias para a entrega direta de proteínas, RNA ou plasmídeos. As metodologias para entrega direta são selecionadas do grupo consistindo em bombardeamento de partículas, eletroporação, lipofecção e transfecção de protoplastos; entretanto, outras metodologias conhecidas por um técnico no assunto também podem ser usadas.

3.2.1 Entrega Direta – estratégia RNP (ribonucleoproteína)

[00258] Em uma modalidade preferida, o evento da presente invenção pode ser gerado utilizando ribonucleoproteínas (RNP) ou a entrega direta de sgRNA para a células ou tecido vegetal a ser transformado. Dentre as metodologias preferidas para a entrega direta do complexo RNP/sgRNA estão o bombardeamento de partículas de calos de cana de açúcar e a transfecção de protoplastos, sem, no entanto, estarem limitadas a estas, sendo possível o uso de outras metodologias para o transporte transmembrana de moléculas, como é de conhecimento no Estado da Técnica. Além disso, outros tipos de celulares podem ser usados para transformação, incluindo, sem estar limitado a: discos foliares, meristema, calo e células em suspensão.

[00259] Nessa modalidade, as endonucleases e o crRNA ou o RNA guia são entregues diretamente à célula vegetal na forma de uma RNP, separadas do molde de recombinação homóloga (RH), o qual é entregue através de um plasmídeo.

[00260] O RNA guia deve ser preliminarmente produzido por transcrição in vitro ou ser quimicamente sintetizado como um ribooligonucleotídeo, enquanto a nuclease correspondente pode ser produzida in vivo e posteriormente purificada (expressão bacteriana) ou adquirida de fabricante desses produtos. Em um escopo da invenção, a nuclease é a Cas9.

[00261] O complexo ribonucleoproteico pronto para uso (RNP) consistindo da nuclease correspondente e do RNA guia, e o plasmídeo contendo o molde de RH são absorvidos em partículas de ouro e entregues diretamente ás células ou tecidos.

3.2.2 Entrega Direta - Plasmídeos

[00262] Em uma outra modalidade, o evento CTC75064-3 é recriado através da entrega direta de plasmídeos contendo as sequências necessárias para a expressão dos componentes dos sistemas CRISPR-Cas e disponibilização do molde para a recombinação homóloga utilizando a maquinaria da própria célula/tecido vegetal, os quais devem ser expressos de maneira transiente para a síntese do complexo enzimático capaz de realizar a clivagem sítio específica para a recombinação homóloga. As metodologias para a entrega dos plasmídeos são selecionadas do grupo consistindo em bombardeamento de partículas (biolística) de calos de cana de açúcar e transformação de protoplastos com polietilenoglicol; entretanto, outras metodologias de transformação conhecidas no Estado da técnica podem ser utilizadas, assim como podem ser utilizados outros tecidos além de calos como por exemplo: protoplastos, discos foliares, meristemas, células finas em suspensão, entre outras.

[00263] Ainda em uma modalidade adicional, o evento da invenção pode ser gerado através do uso de plasmídeos, onde os componentes do complexo enzimática encontram-se estavelmente inseridos no genoma do organismo receptor (RB 867515), sendo expressos e necessariamente excisados após a transformação através, por exemplo, do uso de sistema do tipo Cre/Lox ou equivalente. A escolha dessa alternativa pode gerar a permanência de sítios LoxP inseridos no genoma da planta. Outras estratégias de excisão do DNA conhecidas do Estado da Técnica podem ser utilizadas para a remoção do reagente de EG do DNA do genoma da planta do evento CTC75064-3. Os reagentes de edição genômica podem ser entregues em múltiplos plasmídeos, mas, preferivelmente são entregues em um único plasmídeo, o qual compreende sítios LoxP, um marcador de seleção, a sequência da endonuclease, sgRNA, e o molde de recombinação homóloga.

3.3 Entrega indireta

[00264] Em um escopo, o evento da presente invenção é gerado usando metodologias de entrega indireta de plasmídeos, como por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes podem ser usadas. Vírus de plantas também podem ser usados para a entrega indireta dos plasmídeos às células de plantas e tecidos. Por exemplo, geminivirus geneicamente modificados possibilitam alcançar uma alta eficiência de trasnformação, especialmente se a estratégia considerada não comtemplar a inserção estável das construções no genoma. Além disso, diferentes tecidos e tipos celulares podem ser usados para transformação incluindo, mas não se limitando a: calus, protoplastos, discos foliares, meristemas, e células em suspensão derivados de calus.

[00265] Em um escopo preferido, a transformação mediada por Agrobacterium é realizada como descrita no Exemplo 1.

[00266] Em um outro escopo preferido, o evento da invenção é gerado através da entrega do plasmídeo pela transformação mediada por Agrobacterium, onde os reagentes de EG são expressos de uma maneira transiente, alcançando a integração sítio-dirigida do CTC75064-3 sem a integração de transgenes adicionais associados com a estratégia de EG.

[00267] Os reagentes de EG podem ser entregues em múltiplos plasmídeos, mas preferivelmente, em um único plasmídeo. Em um escopo preferido, a construção é a SEQ ID NO: 25 e compreende um marcador de seleção, uma nuclease, o RNA guia/crRNA, e o molde de recombinação homóloga (RH; Figura 22). O molde de recombinação homóloga compreende uma sequência de T-DNA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e flanqueada nas extremidades 5' e 3' por sequências de DNA homologas as sequências flanqueadoras que caracterizam o evento CTC75064-3, as quais são selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 23 e SEQ ID Nos: 24 e localizadas em ambos os lados do T-DNA. A orientação das sequências é definida pela orientação do T-DNA no genoma do evento CTC75064-3 de tal forma que o molde de recombinação homóloga caracteriza-se por compreender sequência idêntica ou substancialmente idêntica à sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24.

[00268] Em um escopo, o evento da invenção é gerado usando a entrega indireta através de plasmídeos onde os reagentes de EG são estavelmente expressos, assim, necessitam da excisão dos reagentes de EG e/ou dos marcadores de seleção integrados através, por exemplo do sistema Cre/Lox. A escolha dessa alternativa pode gerar a permanência de sítios LoxP inseridos no genoma da planta. Outras estratégias de excisão do DNA conhecidas do Estado da Técnica podem ser utilizadas para a remoção do reagente de EG do DNA do genoma da planta do evento CTC75064-3.

[00269] Genes morfogenéticos ou outros elementos regulatórios podem estar contemplados em qualquer uma das estratégias acima descritas, possibilitando melhorias da eficiência de transformação (entrega e integração genômica).

[00270] Considerando qualquer um dos processos de transformação descrito acima, as células transformadas resultantes serão regeneradas para formar uma planta idêntica ou substancialmente idêntica ao evento da presente invenção.

3.4 Caracterização Molecular

[00271] O evento gerado através do uso de Edição genômica, é avaliado pela incorporação exata do T-DNA nos sítios de inserção que caracterizam o evento CTC75064-3, através dos iniciadores (SEQ ID NO: 6-9) e sondas (SEQ ID NO:10-11) descritos na presente invenção.

[00272] Pares de iniciadores desenhados para amplificar sequências próximas aos sítios de inserção do molde de recombinação homóloga podem ser utilizados para confirmar a integridade do sítio de recombinação (Tabela 7, Figura 28). Adicionalmente, reações de amplificação utilizando iniciadores específicos para a amplificação das sequências dos reagentes de edição genômica deve ser realizada para confirmar a ausência desses componentes do genoma da planta regenerada.

[00273] Reações de PCR usam 0,2 µM dos iniciadores (Tabela 7), 20ng de DNA, 1X Dream Taq- Thermo Fisher buffer (Thermo Fisher Scientific Inc - USA), Taq polymerase (final volume 20 µL). Condições de reação: 1 ciclo a 94°C por 1 min; 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 65°C por 45 segundos e 72°C por 3 min; e 1 ciclo de extensão a 72°C por 7 minutos. Para Amplicons com mais de 2kb, as reações são realizadas com 1U de Takara LA Taq enzima – Takara (Takara Bio IncUSA), 1 X LA PCR Buffer (Takara Bio Inc - USA), 2,5 mM MgCl2, 2,5mM dNTP, 0,5 µM de iniciadores e 200 ng de DNA (volume final de 50 µL).

[00274] Os amplicons obtidos pelas reações de PCR com a combinação dos iniciadores “T-DNA” e “Regiões flanqueadoras” da TABELA 07, devem ser submetidos posteriormente ao sequenciamento, por exemplo sequenciamento Sanger, usando os pares de iniciadores desenhados nas regiões internas do T-DNA do evento CTC75064-3 para, após o alinhamento e geração da sequência consenso final, confirmar a integridade da região genômica modificada e das sequências inseridas (TABELA 08).

Exemplo 4. Avaliação do produto da expressão do gene inserido no evento da invenção.

[00275] O produto da expressão dos genes no evento da presente invenção foi detalhadamente caracterizado por meio do emprego de metodologia ELISA, para determinação da concentração das proteínas Cry1Ac e NptII, e Western blot, para comprovação das identidades dessas proteínas heterólogas. A expressão dos genes cry1Ac e nptII no evento CTC75064-3 foi caracterizada em diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento da cultura e localidades de plantio.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

[00276] Para a produção das amostras de tecidos do evento CTC75064-3 e do controle (variedade parental) para realização dos ensaios ELISA, foram realizados experimentos em localidades representativas das áreas de cultivo da cultivar parental RB 867515, a saber, Piracicaba, Barrinha e Valparaíso (SP), Quirinópolis (GO) e Juazeiro (BA) e Mandaguaçu (PR) (TABELA 09). Em cada local, os experimentos foram conduzidos em delineamento em blocos completos casualizados com 4 repetições. As parcelas foram compostas por 10 linhas de 8 metros, com espaçamento de 1,5 metros entre as linhas.

[00277] A análise de expressão das proteínas Cry1Ac e NptII no evento CTC75064-3 foi investigada em diferentes tecidos e em diferentes períodos do desenvolvimento dos ciclos de cultivo. Os tecidos e tempos avaliados (± 5 dias) foram:
1) Folhas ao longo do ciclo de cultivo do evento CTC75064-3 (100, 200 e 300 Dias Após o Plantio (DAP);
2) Folhas, colmos e raízes ao final do ciclo de cultivo (330 DAP) do primeiro corte da cana. Em Juazeiro o material foi avaliado aos 210DAP.

[00278] A amostras de folhas foram coletadas nas parcelas dos tratamentos experimentais nos ensaios de AGRO/PHENO a 100, 200, 300 e 330DAP. Colmos e raízes foram coletados somente a 330 DAP. As amostras de 330DAP foram coletadas aos 210 DAP em Juazeiro. Após a coleta, as amostras foram enviadas para a análise de ELISA para determinar a expressão das proteínas Cry1Ac e NptII no evento CTC75064-3.

[00279] Amostras de Folhas: foram coletados 30 cm de tecidos a partir da ponta de 5 a 10 folhas "diagnóstico" nas linhas 2 e 3 em ziguezague evitando folhas doentes. Após a retirada da nervura central as folhas foram picadas em pedaços, homogeneizadas e acondicionadas em sacos plásticos tipo "ziplock" previamente identificados.

[00280] Amostras de Colmos: foram coletadas 10 canas inteiras em ziguezague. Após retiras as folhas secas e ponteiros, as canas foram cortadas em pequenos toletes, homogeneizadas e acondicionadas em embalagens previamente identificadas.

[00281] Amostras de Raízes: foi coletada uma touceira representativa das linhas 2 e 3 da parcela experimental. O solo foi esboroado e as raízes lavadas com água limpa para a retirada do excesso de solo. Em seguida, as raízes limpas foram picadas em pedaços, homogeneizadas e acondicionadas em sacos plásticos previamente identificados.

[00282] Todas as amostras de tecidos (folha, colmo e raízes) foram transferidas para a caixa de isopor com gelo seco em até 15 min após a coleta. A identidade genética de todas as touceiras amostradas foi confirmada por meio de ensaio evento-específico conforme descrito na presente invenção.

[00283] Para a análise da proteína Cry1Ac foram utilizados 30 ± 1 mg de folha, 200 ± 1 mg de colmo e 20 ± 1 mg de raízes congelados em gelo seco ou nitrogênio líquido. A maceração foi realizada no equipamento TissueLyser. Ao tecido macerado de folha adicionaram-se 750 μL de tampão de extração fosfato salino (PBS) suplementado com Tween20 (NaCl 0,138 M; KCl 0,027 mM; Tween20 0,05%, pH 7,4) diluído de acordo com as instruções do fabricante (Envirologix™ EUA). No caso de colmo foram utilizados 375 μL, e para raízes 1,500 μL, do mesmo tampão.

[00284] Para análise da proteína NptII em folhas foram pesados 40 ±1 mg do tecido macerado, e para colmo e raiz foram pesados 200 ±1 mg. Similarmente, nas amostras de tecido foliar foram adicionados 750 μL do tampão de extração; enquanto nas amostras de colmo e raiz foram adicionados 1,500 μL. O tampão de extração utilizado neste caso foi o PEB1 1x (pH 7,0), que acompanha o kit utilizado para a quantificação da proteína NPTII: PathoScreen® Kit for NPT II (Agdia, EUA).

[00285] Em todos os casos, após a adição do tampão nas amostras de folha, efetuou-se a homogeneização com vortex. A homogeneização foi seguida por centrifugação por 20 minutos a 4000 ×g. O sobrenadante resultante foi coletado e seguiu para a etapa de quantificação de proteínas totais pelas metodologias de Bradford (Cry1Ac) ou BCA (NPTII).

[00286] Os padrões utilizados para a obtenção da curva de calibração para quantificação das proteínas foram os padrões comerciais já previamente diluídos (Albumin Standard Thermo Scientific, cat#23209). Calibradores na concentração de 2000, 1000, 500, 250, 125 e 0 µg/mL (preparados em tampão PBST) foram usados. 10 µL de cada calibrador padrão foi adicionado em triplicada aos poços nas placas. No total, 6 curvas foram geradas de diluições independentes. Para as amostras, 10μL de 3 extrações de proteínas individuais foram usados em cada poço. Posteriormente, 200μL de Coomassie Plus Reagent Solution foi adicionado em cada poço contendo os calibradores e as amostras. As placas foram cobertas e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente. Absorbância foi lida a 595 nanometros (nm) usando SoftmaxPro 7.0 software (Molecular Device, US).

[00287] As proteínas totais foram obtidas em triplicatas para cada amostra estudada. Após a quantificação de proteínas totais, escolheuse a amostra com menor variação do valor mediano da quantificação. Após a quantificação, as amostras de folhas foram diluídas como segue: amostras de folhas para análise de Cry1Ac foram diluídas 2.500x, exceto as amostras de 100 DAP que foram diluídas 3.500x; as amostras de colmos para análise de Cry1Ac foram diluídas 2,500x; enquanto, amostras de raízes para análise de Cry1Ac foram diluídas 200x. Todas as amostras (folha, raíz, e colmo) para análise de NptII foram diluídas 8x.

[00288] A obtenção de resultados para as proteínas Cry1Ac e NptII foi feita por espectrometria em placas de 96 poços com leitura em dois comprimentos de onda diferentes: 450 nm e 630 nm em leitora de Placa SpectraMax (Molecular Devices, EUA). Para a detecção e quantificação da proteína Cry1Ac foi utilizado o kit AP003 CRBS (Envirologix, EUA), seguindo as recomendações do fabricante. Para a detecção e quantificação da proteína NptII foi utilizado o kit PathoScreen® Kit for NPT II (Agdia, EUA), seguindo as recomendações do fabricante.

[00289] A análise baseou-se na associação dos valores de absorbâncias das amostras testes com os valores preditos em uma equação estimada pela medida de absorbância de uma curva padrão. As proteínas sintéticas foram diluídas para as concentrações desejadas em tampão PBST. As análises foram realizadas em duplicata experimental para cada amostra. As concentrações das proteínas Cry1Ac e NptII foram apresentadas com base em Proteína Total (µg/mg), Peso Fresco – PF (μg/g) e Peso Seco – PS (μg/g).

[00290] Os resultados das análises estatísticas de quantificação as proteínas Cry1Ac e NptII são encontrados nas Tabelas 10 e 11, respectivamente. Os resultados de expressão de proteína foram obtidos da média de quatro replicatas biológicas (parcelas experimentais) em duplicata. Tabela 10 apresenta os resultados das análises individuais e conjuntas por localidade para a expressão da proteína Cry1Ac, em folhas de cana de açúcar coletadas ao longo de 1 ano de cultivo (100, 200 e 300 DAP). Tabela 11 demonstra os resultados das análises para a proteína NptII, nas mesmas condições.
TABELA 10: Comparação das médias de expressão de Cry1Ac em folhas do evento CTC75064-3 ao longo de um ano de cultivo de canaplanta (100 DAP, 200 DAP e 300 DAP). Análise estatística individual e conjunta para os 6 locais ensaiados. Resultados não disponíveis para Juazeiro (BA) Em 300DAP. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. Ep: Erro Padrão.

[00291] Os resultados da análise conjunta para 6 localidades, referentes à expressão de Cry1Ac em folha (µg/g Tecido Fresco e Seco) ao longo do ciclo de 1 ano de cultivo estão apresentados na TABELA 10 e FIGURA 8 (µg proteína /g tecido fresco) e FIGURA 9 (µg proteína/g tecido seco). Os resultados da análise conjunta para 6 localidades, referentes à expressão de NptII em folha (µg/g Tecido Fresco e Seco) ao longo do ciclo de 1 ano de cultivo estão apresentados na TABELA 11 e FIGURA 11 (µg proteína /g tecido fresco) e FIGURA 12 (µg proteína/g tecido seco).

[00292] A expressão média da proteína Cry1Ac em folhas do evento CTC75064-3 ao longo do ciclo de 1 ano de cultivo da cana de açúcar em todas as localidades (com exceção de Juazeiro à 300DAP – sem resultados) foi de 125,18 µg/g de tecido fresco e 423,75 µg/g de tecido seco. Para NptII, expressão média da proteína em folhas do evento CTC75064-3 ao longo do ciclo de 1 ano de cultivo da cana de açúcar em todas as localidades (com exceção de Juazeiro à 300DAP – sem resultados) foi 1,401 µg/g de tecido fresco e de 6,370 µg/g de tecido seco.

[00293] Os resultados de expressão da proteína Cry1Ac em folhas do evento CTC75064-3 coletada a 330 DAP (210 DAP para Juazeiro) são apresentados na TABELA 12 e Figura 10 (em µg proteína/g tecido fresco e seco).

[00294] Os resultados da expressão da proteína NptII em folhas do evento CTC75064-3 coletadas a 330 DAP (210 DAP para Juazeiro) são apresentados na Tabela 13 e Figura 13 (µg proteína/g de tecido fresco e seco).

[00295] Os resultados da expressão da proteína Cry1Ac em colmo de amostras do evento CTC75064-3 coletadas a 330 DAP são apresentados na Tabela 14 e Figura 10 (µg/g tecido fresco e seco).

[00296] Os resultados da expressão da proteína NptII em colmo de amostras do evento CTC75064-3 coletadas a 330 DAP são apresentados na Tabela 15 e Figura 13 (µg/g tecido fresco e seco).

[00297] Os resultados da expressão da proteína Cry1Ac em raiz de amostras do evento CTC75064-3 coletadas a 330 DAP são apresentados na Tabela 16 e Figura 10 (µg/g tecido fresco e seco).

[00298] Os resultados da expressão da proteína NptII em raiz de amostras do evento CTC75064-3 coletadas a 330 DAP são apresentados na Tabela 17 e Figura 13 (µg/g tecido fresco e seco)

[00299] A expressão média da proteína Cry1Ac em colmos do evento CTC75064-3 nas localidades avaliadas foi de 42,94 µg/g de tecido fresco e 173,54 µg/g de tecido seco. Para NptII, a expressão média em colmos do CTC75064-3 em todas as localidades foi de 0,138 µg/g de tecido fresco e de 0,558 µg/g de tecido seco.

[00300] A expressão média da proteína Cry1Ac em raízes do evento CTC75064-3 nas localidades avaliadas foi de 10,21 µg/g de tecido fresco e 46,30 µg/g tecido seco. Para NptII, a expressão média em raízes do CTC75064-3 em todas as localidades foi de 0,092 µg/g tecido fresco e de 0,422 µg/g tecido seco.

[00301] Os resultados obtidos em folha, colmo e raízes indicam que o evento da invenção possui níveis de expressão da proteína Cry1Ac muito maiores do que a expressão de NptII.

[00302] A concentração média de Cry1Ac em folhas do evento da invenção a 100 DAP é mais baixa do que a concentração média a 200 e 300 DAP. Para NptII, a expressão média em folhas ao longo do ciclo da cana de açúcar permanece constante.

[00303] Os níveis de expressão das proteínas Cry1Ac e NptII no evento CTC75064-3 a 330 DAP foram muito maiores em folhas do que em colmos e raízes. Os resultados de expressão da proteína Cry1Ac também apresentaram diferenças significativas entre colmos e raízes, com raízes demonstrando a expressão proteica mais baixa. Para NptII, a expressão média da proteína em colmos e raízes não difere significativamente.

[00304] Observa-se que os níveis de expressão das proteínas Cry1Ac e NptII do evento da invenção foram caracterizados em diferentes idades de cultivo, tecidos e localidades. Para Cry1Ac, os níveis de expressão proteica, especialmente em folhas do evento da invenção, mantêm-se altos ao longo de todo o ciclo de cultivo, garantindo o efeito desejado de resistência a infestação por Diatraea saccharalis.

Western blot

[00305] Para identificação das proteínas heterólogas expressas no evento da invenção, foram utilizadas 50 mg (±0,5 mg) de folha congeladas em nitrogênio líquido para Cry1Ac e 300mg (±0,5 mg) para NptII. A maceração foi realizada no equipamento TissueLyser, durante 1 minutos à 25 Hz, com a adição de três esferas de aço (3 mm – Qiagen). Ao tecido macerado, adicionou-se 500 µL do tampão de extração fosfato salino (PBS) suplementado com Tween 20 (NaCl 0,138 M; KCl – 0,027 mM; Tween 20 – 0,05%, pH 7,4) diluído de acordo com as instruções do fabricante (Envirologix™, EUA). Após a adição do tampão efetuou-se a homogeneização com vortex e centrifugação por 20 minutos, a 4.000rpm a 4ºC. O sobrenadante resultante foi coletado e seguiu para a etapa de quantificação de proteínas totais.

[00306] A quantificação adotada para as análises das proteínas Cry1Ac e NptII foi executada de acordo com as recomendações do ThermoScientific ™ Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Kit (23236) - Procedimento em microplaca e BCA. Para a proteína NptII, utilizou-se o método de quantificação de proteínas totais denominado BCA. A quantificação com o método BCA foi executada de acordo com as recomendações do fabricante do kit: PierceTM BCA Protein Assay Kit (23225). Assim, os padrões utilizados para a obtenção da curva de calibração foram os padrões comerciais já diluídos de BSA (Pré-Diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin (BSA) set23208, (Thermo Scientific, EUA) na concentração de 2,000, 1,500, 1000, 750, 500, 250, 125 e 0 μg/mL, preparados em tampão PBST. Foram adicionados 10 μL de cada calibrador padrão em poços triplicados na placa. As placas foram cobertas e incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. A absorbância foi lida em 595 nanômetros (nm) usando o software SoftmaxPro 7.0 (Molecular Device). Após a extração de proteínas totais, 3 µg de extrato proteico foram misturadas ao tampão de amostra 2X Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad, EUA) e submetidos à desnaturação via aquecimento à 100°C por 5 minutos para identificação da proteína Cry1Ac presente na amostra. No caso da detecção e identificação da proteína NptII, primeiro foi realizada a concentração do extrato de proteínas totais utilizando colunas Amicon® Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices (3000 NMWL) seguindo as recomendações do fabricante. Foram utilizados 40 μg de extrato proteico, misturados com o tampão de amostras como descrito para Cry1Ac.

[00307] Para o controle negativo da presença das proteínas heterólogas, foram utilizados 3 µg de extrato proteico extraído da variedade convencional parental RB 867515 foi usado nos experimentos com Cry1Ac e 40 µg para os ensaios de NptII. Adicionalmente, foram preparados controles positivos para detectar as proteínas Cry1Ac e NptII, sendo 0,5 ng das proteínas Cry1Ac de ~69 kDa (GenScript, USA) ou NptII de ~29 kDa (Bon Opus Biosciences, USA) purificadas, diluídos na solução de proteínas totais extraídas de folhas de plantas da variedade convencional RB 867515. O segundo controle positivo foi obtido através da diluição de 1ng da proteína Cry1Ac purificada ou 5ng da proteína NptII puirificada em tampão de extração PBST.

[00308] As amostras foram desnaturadas e aplicadas em gel de poliacrilamida 4-20% (Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gel) submerso em tampão Tris/glycine/SDS running buffer (Bio-Rad, EUA) e separadas por eletroforese a 50 V por 5 minutos e depois a 120 V por, aproximadamente, 90 minutos. Na sequência, os géis de poliacrilamida foram equilibrados em Tampão de Transferência Tris/Glycine Buffer (Bio-Rad, EUA), o qual foi adicionado de 20% de metanol, por 10 - 15 minutos. A membrana de PVDF foi tratada com metanol absoluto. O sistema para transferência foi montado em cuba preenchida com o Tampão de Transferência gelado para a transferência sob imersão ("transferência molhada"), à voltagem constante de 50V durante 3 horas. Após concluída a transferência, a membrana foi bloqueada durante 16 horas a 4°C, sob agitação constante, em solução de bloqueio [5% de leite em pó desnatado (Bio-Rad, EUA) e TBS/T (20mM Tris, 150mM NaCl, 1% Tween20] para prevenir possíveis ligações inespecíficas à membrana.

[00309] Na etapa seguinte, a membrana foi incubada com o anticorpo primário durante 90 minutos para detecção e confirmação da presença e integridade das proteínas Cry1Ac e NptII. Os anticorpos policlonais utilizados neste ensaio foram o Anti-Cry1Ab (Fitzgerald, EUA) produzido em coelho e que reage com as proteínas Cry1Ac e Cry1Ab; e o Anti-NptII (Rhea, BRA IM0770-18088), também produzido em coelho, e que reage com a proteína NptII, diluídos na concentração de 1:500 em TBS/T (v/v).

[00310] A membrana foi lavada em 3 ciclos de 5 minutos (3x5) em TBS/T e incubada com anticorpo secundário Anti-Rabbit conjugado com HRP produzido em cabras (Sigma), na concentração de 1:20.000 ou Fitzgerald, na concentração de 1:5.000 – v/v) por 60 minutos. Após as incubações, a membrana foi novamente lavada com TBS/T (3x5 minutos) e a reação imunoenzimática verificada em filmes de raio-X Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare, EUA) através da reação com substrato Clarit Western ECL Substrate Kit (Biorad, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A exposição do filme de raio-X a membrana variou de 15 segundos até 3 minutos.

[00311] Os resultados revelaram que o perfil de expressão da proteína Cry1Ac se apresenta como uma banda imunorreativas de peso molecular ~66 kDa (Figura 14). Ambas as amostras (R1-R4) são repetições biológicas do evento da invenção CTC75064-3, obtidas de quatro parcelas experimentais distintas no Polo Piracicaba. Como esperado, o controle negativo (WT) não apresentou imunoreatividade. O controle negativo consistiu em amostras de proteínas totais extraídas da variedade parental RB 867515 não transformada. O controle positivo (WT+CP) onde a proteína Cry1Ac foi adicionada ao extrato proteico total da variedade RB 867515 convencional apresentou duas bandas reativas. Nesse caso (WT+CP), é comumente conhecido como doublet e aceito como um produto clivagens proteolíticas intracelulares da proteína Cry em folhas de plantas geralmente produzidas através da remoção de resíduos de aminoácidos terminais por proteases liberadas durante o processamento do tecido vegetal, assim como as outras bandas de pesos moleculares menores (~20 e 10 kDa) visualizadas nas amostras.

[00312] A detecção da proteína expressa pelo gene de seleção nptII também foi realizada pelo ensaio de Western blot. Mesmo sendo expressa em níveis mais baixos do que a proteína Cry1Ac, os ensaios de Western blot demonstraram a presença de uma banda imunorreativa no tamanho esperado de ~29 kDa, em todas as repetições biológicas utilizadas do evento CTC75064-3 (FIGURA 15). Dois controles positivo e um controle negativo foram adicionados à membrana. O controle positivo (CP) corresponde a 0,5 ng de proteína NptII purificada (~29 kDa, Bon Opus Biosciences, USA), e um segundo controle positivo (WT+CP) correspondendo a 0,5 ng de proteína NptII purificada e diluída em extrato proteico de cana-de-açúcar convencional (RB 867515). O Controle negativo corresponde ao extrato proteico da variedade parental. A banda diagnóstico correspondente a proteína NptII está presente no controle positivo na altura esperada e é idêntica à banda presente no evento CTC75064-3, confirmando a identidade da mesma.

[00313] Os resultados dos ensaios de Western blot confirmaram a presença e integridade das ambas as proteínas Cry1Ac e NptII e a ausência de formas alternativas não esperadas dessas proteínas, no evento geneticamente modificado CTC75064-3.

[00314] Conclui-se que a identidade das proteínas Cry1Ac e NptII expressas pelo evento da invenção foi confirmada por meio de western blot. As proteínas expressas pelo evento da invenção apresentam o tamanho esperado e não foi encontrado evidências de proteínas truncadas/fusionadas sendo expressas pelo referido evento.

Exemplo 5. Ensaios biológicos: Resistência à broca-da-cana (D. saccharalis)

[00315] Ensaios Biológicos (bioensaios) com a praga alvo da cultura, D. saccharalis (broca-da-cana), também podem ser utilizados para a detecção e caracterização do evento CTC75064-3, demonstrando a eficácia de controle proporcionada pela proteína inseticida Cry1Ac expressa. Diferentes Bioensaios podem ser contemplados no escopo da presente invenção, como por exemplo, Ensaio de Disco Foliar, Ensaios de Eficácia em Telado, Ensaios de Diluição em Tecido, entre outros.

[00316] No caso de ensaio de disco foliar, amostras de folhas do evento CTC75064-3 são coletadas, cortadas em discos e em seguida mantidas úmidas. Em seguida, os discos foliares são distribuídos em placas de cultura contendo meio sólido (ágar), infestados com lagartas neonatas (0-24h de idade) de D. saccharalis e incubadas a uma temperatura de 27±1°C, umidade relativa 60±10% e fotoperíodo 12:12 (luz:escuro), por um período de 7 dias. Ao final da incubação, avalia-se a mortalidade das larvas e a inibição do desenvolvimento larval dos indivíduos sobreviventes, sendo calculado a partir disso a eficácia relativa através da fórmula:

Legenda: Eficácia relativa de LDA, larvas vivas do evento, larvas vivas do controle)

[00317] As larvas sobreviventes são submetidas a análise de imagem para avaliação do estágio larval baseado no tamanho da cápsula cefálica. As larvas que não alcançam o primeiro instar são consideradas mortas. Variedades de cana de açúcar não transgênica geneticamente muito similares ao evento transgênico da invenção podem ser usadas como controles do ensaio.

[00318] Para caracterizar a eficácia do evento no controle da D. saccharalis em laboratório, ensaios de disco foliar foram realizados em tecido vegetal foliar do evento CTC75064-3 (30 DAP). A cana de açúcar não transgênica RB 867515 foi usada como controle (CTC75-TC). O desenho experimental foi completamente randomizado com 4 replicatas por tratamento. Uma média de 98,2% de taxa de mortalidade foi observada quando comparadas a variedade convencional (CT75-TC) e o evento CTC75064-3 após 7 dias de alimentação com os discos foliares. Baseado nas medidas de tamanho da cápsula cefálica, foi observado que 100% dos indivíduos sobreviventes não se desenvolvem além do primeiro instar, evidenciando uma alta supressão no desenvolvimento de D. saccharalis após alimentação com o evento transgênico (Figura 18).

[00319] Para ensaios de diluição em tecido, as folhas do evento CTC75064-3 foram amostradas em campos de ensaio Agro/pheno em Piracicaba, Valparaíso, Barrinha (SP) e Quirinópolis (GO), com pontos de coleta em 100, 200 e 300 DAP. Essas amostras foram cortadas, desidratadas, congeladas e então maceradas para obter um pó verde uniforme. Para preparar as placas dos bioensaios, cada quadrante com 16 células recebeu uma amostra diluída 25x com dieta MS (Multiple Species), preenchendo aproximadamente 1 mL por célula. Para infestação, 2 larvas neonatas (0-24h de idade) foram transferidas em cada célula (32 larvas por quadrante). As placas foram identificadas e incubadas a temperatura de 27 ± 1 ° C, umidade relativa de 60 ± 10% e fotoperíodo de 12:12 (claro: escuro), por um período de 10 dias. No final da incubação, cada quadrante foi avaliado para cálculo da mortalidade efetiva e média de massa de larvas. A mortalidade efetiva foi calculada através da equação:

Legenda: Mortalidade efetiva, n larvas mortas + n larvas no primeiro instar / número total de larvas vivas

[00320] A eficácia relativa para os testes de diluição foi calculada através da equação:

Legenda: Eficácia relativa na diluição, Larvas vivas do evento, larvas vivas do controle

[00321] Através da análise de diluição de tecidos de amostras dos campos de Agro/pheno, foi possível verificar a eficácia, tanto a mortalidade efetiva e a redação de massa de larvas, é 51% e 94%, respectivamente.

[00322] Já no ensaio de Eficácia em Telado, mudas do evento transgênico são plantadas em um viveiro telado, onde as plantas são plantadas no solo e ficam em condições ambientais compatíveis com as condições naturais, porém com restrição a entrada ou saída de formas biológicas, como Diatraea saccharalis, garantir a não ocorrência de infestações naturais. São realizadas pelo menos 5 infestações, contendo de 20-35 ovos de Diatraea saccharalis por perfilho. As avaliações ocorrem quando todos os colmos infectados são colhidos e rachados longitudinalmente para quantificar o dano. A intensidade de infestação é calculada dividindo o número de entrenós com dano pelo número de entrenós totais e o resultado é multiplicado por 100 (Intensidade de Infestação). A porcentagem de dano efetivo foi calculada considerando o total de entrenós com dano causado pelo inseto dividido pelo número total de colmos avaliados na parcela.

[00323] Os ensaios em telado foram realizadas para caracterizar a eficácia do evento CTC75064-3 no controle do ataque da broca em comparação com a sua variedade parental RB 867515 (WT; nãotransgênica) em um desenho experimental em blocos randomizados, com 4 replicatas. Cada parcela experimental foi composta por oito touceiras de cana-planta que receberam 10 infestações artificiais com aproximadamente 30 ovos de D. saccharalis a cada 15 dias. Após oito meses, o índice de infestação e o dano efetivo para ambas as variedades foi calculado. A eficácia relativa foi calculada de acordo com a fórmula abaixo:

Legenda: eficácia relativa, média do evento, média dos controles

[00324] Sobre infestação artificial o evento CTC75064-3 apresentou eficácia relativa no controle da infestação por D. saccharalis de 98,8% e controle do dano nos colmos (comprimento) superior a 99,9% em relação a variedade parental não transgênica RB 867515 (Controle). O dano causado pela D. saccharalis nos colmos do evento CTC75064-3 foi visivelmente menor do que na cana de açúcar não transgênica convencional RB 867515. Há diferenças estatísticas significativas (t-test, P < 0,05) entre CTC75064-3 e a variedade não transgênica RB 867515 em ambos os parâmetros avaliados (df = 16; P < 0,0001), demonstrando que sob infestação massiva com D. Saccharalis o evento impede os danos causados por essa praga (Figura 16).

[00325] Nos plantios comerciais de cana de açúcar D. saccharalis é considerado controlada quando a intensidade de infestação está abaixo de 3% (Gallo et al., 2002). Para CTC75064-3, a intensidade de infestação foi inferior a 0,01%, reforçando a eficácia do evento no controle dessa praga.

[00326] A observação e análise das infestações artificiais ou naturais em áreas de plantio também permitem a caracterização da eficácia dos materiais contra D. saccharalis. A I.I (Intensidade de infestação), por exemplo, pode ser calculado através da avaliação de infestações naturais através da definição de uma área experimental para coleta dos colmos e abertura longitudinal para contagem dos entrenós totais e os entrenós brocados (com danos causados pela broca), obtendo-se assim o índice de infestação (I.I).

[00327] Para caracterizar a eficácia do evento CTC75064-3 contra a praga alvo em campo, foram instalados experimentos em 4 localidades (Piracicaba-SP, Barrinha-SP, Valparaíso-SP e Quirinópolis-GO). Os campos foram delineados em 4 parcelas por evento testado em blocos casualizados. A variedade convencional RB 867515 (parental; não trasngênica) foi usada como controle. Esse ensaio ilustra a resistência do evento CTC75064-3 a infestação por D. saccharalis em comparação com a variedade parental (RB 867515): foi observado uma menor intensidade de infestação para plantas do evento CTC75064-3 em comparação com a variedade parental (RB 867515) em todas as quatro áreas experimentais (Análise conjunta; Figura 17). O evento CTC75064-3 eficácia relativa no controle da infestação por D. saccharalis de 100% em todas as localidades, exceto para Valparaiso, a qual demonstrou 99,1% eficácia, muito próximo de 100%. Assim, o evento da presente invenção foi, em média nas 4 localidades, 99,7% mais efetivo do que a plantas não transgênicas (materiais convencionais), para controle de Diatrea saccharallis (Figura 17).

[00328] Os exemplos descritos representam os escopos preferidos, devendo ser compreendido que o escopo da presente invenção contempla outras variações possíveis, sendo limitado apenas pelo conteúdo das reivindicações, incluindo os equivalentes possíveis.

Claims

Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 18.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 18.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 18.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 18.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 13.
Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 19.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 19.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 12.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 5.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 22.
Pares de Iniciadores, caracterizados pelo fato de que o iniciador senso possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 6 e o iniciador antissenso possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7 e/ou o iniciador senso possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 8 e o iniciador antissenso possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:9.
Método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3, caracterizado pelo fato que compreende as etapas de:
- a) obter uma amostra de material vegetal para análise;
- b) extrair o DNA da amostra;
- c) fornecer pares de iniciadores compreendendo pelo menos um iniciador senso e outro antissenso;
- d) amplificar a região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
- e) detectar a presença de produto da amplificação.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de pares de iniciadores na etapa c) planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos um dos iniciadores compreende nucleotídeos contíguos de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de pares de iniciadores na etapa c) planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 29, onde pelo menos um par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 e um segundo iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 36.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de pares de iniciadores na etapa c) planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um par de iniciadores compreende nucleotídeos contíguos de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de pares de iniciadores na etapa c) planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 37, onde pelo menos um par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 e um segundo iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 36.
Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde, o produto de amplificação detectado na etapa e) compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33.
Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o produto de amplificação detectado na etapa e) compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39.
Método, de acordo com a reivindicação 14, em que os pares de iniciadores utilizados na etapa c) são caracterizados pelo fato de que são selecionados do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os produtos da amplificação obtidos são selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO 12 e SEQ ID NO 13.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a detecção do produto da amplificação é realizada através da hibridização de sonda selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 10 e SEQ ID NO 11.
Método de detecção de material vegetal derivado de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
- a) obter uma amostra de material vegetal para análise;
- b) extrair o DNA ou RNA da amostra;
- c) fornecer uma sonda planejada ou uma combinação de sondas planejadas para se ligar a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39;
- d) hibridizar a dita sonda com o material extraído da amostra da etapa (b), e
- e) detectar a sonda hibridizada.
Construção genética, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
Construção genética, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2
Construção genética de acordo com as reinvindicações 25 e 26, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:14
Kit para detecção da presença de uma amostra de material vegetal de uma cana de açúcar transgênica compreendendo uma proteína Cry1Ac (evento CTC75064-3), caracterizado pelo fato de que compreende um meio para detecção da presença de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO 33 e/ou uma proteína cristal pesticida (Cry).
Kit de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o meio para detecção compreende pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 29, onde pelo menos um dos iniciadores compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.
Kit de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o meio para detecção compreende uma sonda selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 10 e SEQ ID NO 11.
Planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19.
Planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 12 e SEQ ID NO 13.
Planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22, onde a planta é resistente a inseto.
Evento CTC75064-3, caracterizado pelo fato de que é uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19.
Evento CTC75064-3, caracterizado pelo fato de que é uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22.
Planta resistente a insetos, caracterizada pelo fato de que é uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19.
Planta resistente a insetos, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22.
Parte de planta, célula de planta, tecido de planta ou semente de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende, pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19.
Cultura de tecidos, caracterizada pelo fato de que é de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada como definida na reivindicação 31.
Planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada regenerada a partir de uma cultura de tecidos como definida na reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a planta regenerada compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 19.
Produto de comódite, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta de cana-de-açúcar como definida na reivindicação 31.
Método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma primeira planta de cana-de-açúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC75064-3, produzindo uma prole de plantas de cana de açúcar resistente a inseto.
Parte de planta, células de planta, tecido de planta ou semente de uma planta de cana de açúcar, caracterizada pelo fato de que é produzida de acordo com o método da reivindicação 42.
Método para produzir uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp) geneticamente modificada resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:
- a) introduzir uma construção genética compreendendo SEQ ID NO 20 e SEQ ID NO 21 em uma cepa de Agrobacterium;
- b) obter de calos embriogênicos de palmitos de uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.);
- c) co-cultivar os calos embriogênicos com a Agrobacterium da etapa a);
- d) selecionar as células transformadas que contém o fragmento funcional em meio de cultura contendo antibióticos aminoglicosídicos; e
- e) regenerar as plantas de cana-de-açúcar geneticamente modificadas compreendendo as SEQ ID NO 20 e SEQ ID NO 21.
Parte de planta, células de planta, tecido de planta ou semente de uma planta de cana de açúcar, caracterizada pelo fato de que é produzida de acordo com o método da reivindicação 44.
Método para produzir uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada do evento CTC75064-3, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma modificação genética a uma planta de cana de açúcar compreendendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 22, onde a planta de cana de açúcar geneticamente modificada possui resistência a inseto melhorada quando comparada com a cana de açúcar sem modificação genética.
Método para produzir uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende a inserção de um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido entre as sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO 23 e SEQ ID NO 24 através de recombinação homóloga.
Parte de planta, células de planta, tecido de planta ou semente de planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada resistente a inseto, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 46 e 47.
Método de cultivo de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada (Saccharum ssp.), caracterizado pelo fato de que compreende crescer uma planta de cana de açúcar compreendendo a SEQ ID NO 2 sob condições de infestação de insetos, onde a cana de açúcar geneticamente modificada possui uma resistência a insetos aumentada em relação à cana de açúcar sem a modificação genética crescendo sob as mesmas condições.
Uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente de uma planta de cana de açúcar (Saccharum spp.) geneticamente modificada como definida nas reivindicações 42, 44, 46 e 46, caracterizado pelo fato de que é para regenerar uma planta, plantar, produzir sementes, crescer ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.
Método para controle de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende disponibilizar uma planta, tecido, parte da planta, células ou semente de uma cana de açúcar geneticamente modificada, definida por compreende a SEQ ID NO 2, para alimentação do inseto.
Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende planta, tecido, parte da planta, células ou sementes de uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3.
Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que os insetos são da espécie Diatrea saccharalis.
Método para aumentar a produção de cana de açúcar no campo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma lanta de cana de açúcar geneticamente modificada definida por compreender a SEQ ID NO 2.
Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que compreende uma planta de cana de açúcar geneticamente modificada do evento CTC75064-3.