CN114457088A - 事件ctc75064-3，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域。更确切地说，一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，其抵抗害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis)的侵染，后者作为害虫被广泛知晓，描述为普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫。本发明描述了该事件、事件鉴定的方法，以及插入检测方法，以在插入部分和宿主基因组之间交叉的独特区域和特征性的侧翼区域为基础。

Description

事件CTC75064-3，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，描述了一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，该事件表达了赋予对害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫)侵染抗性的Cry1Ac毒素。本发明描述了一种检测抗甘蔗螟虫侵染的事件和来自该事件的材料，以及识别这种事件的多核苷酸、引物、探针和侧翼区的方法。本发明具体地涉及用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC75064-3，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法。
背景技术
甘蔗(Saccharum spp.)是一种属于植物禾本科的草本植物，原产于东南亚，更精确地说，是产于新几内亚和印度尼西亚的广大中部地区。它是热带和亚热带地区生长的最重要的植物品种之一，其面积超过2,300万公顷，分布在121个国家(粮农组织2012年统计年鉴第233页)。
甘蔗是生产糖、酒、糖蜜、朗姆酒、卡莎萨(巴西的国家蒸馏酒)和燃料乙醇的原材料来源。甘蔗碾磨后产生的甘蔗渣可用于打捆、提供热能、在工厂加工、生产电力(通常卖给用户电网)，或作为生产甘蔗第二代乙醇的原料(BR 11 2014 02385-1)。因此，甘蔗农业产业通过由糖和乙醇的商业化以及植物生物质的可持续优化利用为该地区创造了数百万个工作岗位，并促进了外汇的增长，具有巨大的经济和社会意义。
最近，随着全球变暖的出现，以及随之而来的对化石燃料(生物燃料)替代品的渴望，全世界对甘蔗的兴趣大大增加。以甘蔗为基础的乙醇作为一种可再生能源，被认为对减少温室气体和对化石燃料的依赖极为重要，从而使其成为控制全球气候变化的一个关键因素(Savage，2011年)。
由于甘蔗的经济和社会意义，越来越多的研究被用于确定甘蔗种植的最佳农业实践和提高种植品种的质量。改善甘蔗农艺特性的努力集中在提高糖的产量和积累、提高对生物和非生物胁迫的耐受性、对病虫害和病原体的抗性和耐受性，以及开发利用木质纤维素生物质生产甘蔗乙醇的替代技术(PI 0802153-8；PI 0904538-4；PI 1101295-1)。
现代甘蔗品种的多倍体和非整倍体基因组的复杂性，连同其相对有限的遗传基础和低生育率，给利用常规育种选择具有合乎需求的农艺特性的植株带来了很大的困难和许多限制(Souza等人，2011年；D′Hont和Glaszmann，2005年，Basel，第109卷，第1-3期，第27-33页；Cheavegatti-Gianotto等人，2011年)。因此，生产成本高、必须使用手工劳动、产品上市时间线长，可能会阻碍甘蔗产业满足全球市场日益增长的需求。
在过去的20年里，甘蔗产量的增加不仅是种植园生产力提高的结果，也是种植品种多样性增加的结果，使得种植面积扩大到其他地理区域。这种地理扩张要求开发对不同气候条件的适应品种，使甘蔗市场的可持续性得到不断向市场提供新的和当地适应性种质的支持，同时得到控制病虫害的能力的支持。
传统的育种方法对于不断提供新品种是很重要的，但不足以满足现代市场的需求，因为部分特征不是建立在品种的遗传背景上的，最根本的是开发有效的方法以引入外源基因。由于传统育种方法的局限性，以及对快速有效纳入合乎需求的性状的日渐增长的需求，基因工程(生物技术)在甘蔗育种计划中的应用已经变得越来越突出，特别是由于通过基因工程整合合乎需求的农艺性状在其他植物品种(例如大豆、玉米、油菜籽、甜菜和棉花)获得了商业成功。
植物基因工程涉及将目的基因转移到植物细胞中(基因转化)，以这样的方式：使可育性和农艺上优越的后代保持并稳定地表达负责所需性状的基因。
尽管甘蔗具有通过基因工程进行基因改造(整合入合乎需求特性)的潜力[病毒抗性(Guo等，2015；Zhu等，2011)、昆虫(Kalunke，Kolge，Babu，&Prasad，2009；Weng等,2011)、除草剂(Enríquez-Obregon，Vazquez-Padron，Prieto-Samsonov，De la Riva，&Selman-Housein，1998；van der Vyver，Conradie，Kossmann，&Lloyd，2013)、耐旱性(Molinari等人,2007；Reis等，2014)、盐度(Kumar，Uzma，Khan，Abbas，&Ali，2014)和铝毒性(Ribeiro，2016)、糖分的产量和积累提升(Bewg，Poovaiah，Lan，Ralph，&Coleman，2016；Mudge等，2013)]，这种方法受到甘蔗内在特性的限制。与玉米、水稻、小麦和其他商业谷物不同，甘蔗在组织培养繁殖方面表现出困难，胚性愈伤组织的诱导和再生率低，并且不可能将合子胚作为基因转化的靶组织[(Anderson&Birch，2012；Basnayake，Moyle，&Birch，2011；Molinari等，2007)]。经常观察到甘蔗基因型之间转化效率低和变异性高，为了成功地利用基因工程将合乎需求的农艺性状引入甘蔗中，仍有许多挑战需要克服。
甘蔗被认为是对遗传转化顽抗的物种，尽管已经对该物种的几种遗传工程方法进行了评估，但仍然没有标准的方案以确保转基因事件的产生(Smith等人，1992；Rathius&Birch.1992；Rathius&Birch 1992.；Chen等人，1987；Arencibia 1998；Manickavasagam等人。2004；Elliott等人，1998).
除了该物种的固有限制阻止了现有基因工程技术的应用外，甘蔗基因组的复杂性(高倍性水平和非整倍性)阻止了通过回交(特定基因型的重组)将性状的基因掺入到特定栽培品种中，如同通常在其他商业利益作物中进行的那样。因此，为了在一个以上的种质中"插入"相同的性状而使不同地理区域的生产力得到提高，有必要实行新的遗传转化，承担与为该性状而获得的第一次事件相关的相同的成本和风险。即使在今天，在不同品种的甘蔗中插入相同的特性，成功的可预测性也很低，是一个极度依赖基因型的过程，这使得该物种的转基因产品组合的构建具有挑战性。
该物种的基因型复杂性也极大地影响了对所产生事件的表征(为确保其商业化所必需的特征的存在)。转基因事件的明确识别是确保其可追溯性和监测的根本，这是其商业化的监管要求。甘蔗基因组的高度多倍性和大量的重复区域，连同关于其组织和结构的信息的缺乏，使得对所产生的转基因事件的表征更加困难。
在甘蔗育种领域，即使应用广为人知的常规和/或分子/遗传技术，要提高结果的可预测性，还有一些技术挑战需要克服。尽管在获得更高产的甘蔗品种方面存在着各种技术挑战，但毫无疑问，获得具有显著影响作物产量从而影响其市场的特性的改良品种是非常迫切的。
历史上，农业害虫是造成农业损失的主要因素之一。在巴西，主要的甘蔗害虫是物种小蔗螟Diatraea saccharalis(1794年由Fabricius首次描述)，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫或仅称为螟虫。它是草螟科和鳞翅目的成员。该螟虫几乎在所有该作物的地方都有发现，这个面积在2019/20作物季约为1000万公顷(CONAB，2019)。
雌性甘蔗螟虫交配后，产卵200～400粒，分布在叶片两侧以及叶鞘上。孵化后，新生幼虫以叶实质为食，迁移到叶鞘区躲避。它们在此区域停留7至10天，通过刮取叶鞘或年轻节间的树皮取食。蜕皮后，毛虫刺穿茎秆，钻入内部。该虫在茎内制造隧道，通常在取食时向上钻。在秆内，毛虫在成为有翅成虫之前，大约要经历六次蜕皮(DINARDO-MIRANDA，2014)。这是该虫的发育阶段，其对作物造成经济损失(图1)。
甘蔗螟虫的攻击还对用于制糖、制酒的原料的质量造成严重的二次损害，因为螟虫对甘蔗茎的钻蛀，为真菌进入和条件致病菌，特别是造成赤腐病(图2)的镰形刺盘孢菌(Colletotrichum falcatum)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliform)，创造了有利条件。与赤腐病原材料相关的细菌会产生不良的发酵作用，带来工业酒精发酵的异物产物。此外，这些细菌还从麦芽汁中含有的糖类中产生有机酸和胶质(葡聚糖)，对酵母细胞的活力产生负面影响，需要在发酵反应器中替换它们(Prececti和Terán，1983；Prececti等，1988；BOTELHO和MACEDO，2002)。细菌在发酵反应器中存在的另一个问题是发生酵母絮凝的可能性。在这种情况下，污染的细菌形成粘液，聚集酵母细胞，导致它们絮凝。最后，被螟虫/赤腐复合病攻击的植物也有高水平的酚类化合物(METCALF和LUCKMANN，1994；PRICE，1997)。
假设有4％的螟虫感染指数(巴西甘蔗田的典型情况)、平均农业损失和害虫控制成本，估计螟虫每年给糖和乙醇生产行业造成的经济损失超过50亿雷亚尔。
甘蔗螟虫由于幼虫在茎秆中的取食行为阻止了杀虫剂有效接触该虫，因此化学杀虫剂难以控制。作为化学杀虫剂的替代品，主要从苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)中鉴定的杀虫蛋白已被用于防治包括Diatraea sp在内的农业害虫，在从Bt菌株中提取的杀虫蛋白中，Cry结晶蛋白因其对常见的鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的特定毒性而脱颖而出。这些蛋白质以原毒素(65-149KDa)形式产生，在易感昆虫的肠道中通过蛋白水解而溶解和活化，并与肠细胞膜结合，诱导上皮细胞渗透性溶解，这导致昆虫死亡。
Cry蛋白根据序列同源性分为若干组，其中，被归为Cry1的蛋白组对鳞翅目昆虫表现出高特异性，使其成为引入甘蔗种质中培育甘蔗螟虫抗性品种的优良候选者。在甘蔗品种中异源表达Cry1蛋白，虽然具有一定的挑战性，但对甘蔗螟虫的防治，减少甘蔗产业的经济损失，以及在环境中免除化学杀虫剂，具有很大的潜力。
因此，仍然需要制定策略来减轻害虫侵染特别是甘蔗螟虫的侵染对甘蔗作物造成的损害。通过向甘蔗种植者提供对于不同的风土环境具有高产和抗螟虫性状的品种，农业生物技术为甘蔗产业和甘蔗种植者作出重要贡献。
本发明中公开的事件CTC75064-3的产生是为了向甘蔗种植者提供一个新品种，其抗甘蔗螟虫害，遗传背景为RB 867515(植物品种保护/PVP-协议号-21806.000439/2000-45；PVP Certificate№271)。在2018/19季，RB867515甘蔗品种在巴西中南地区的种植面积约为173万公顷。该品种在东北地区的种植面积约为5.7万公顷。按甘蔗种植面积(CONAB，2019)考虑，该品种在巴西的市场份额约为21％。
实施方案
在第一实施方案中，本发明提供了能够明确识别事件CTC75064-3的多核苷酸。
本发明还确定了能够识别表征事件CTC75064-3的多核苷酸的引物对和探针。
在第三个实施方案中，本发明提供了检测源自CTC75064-3事件的植物材料的方法。
本发明的其它实施方案定义了一种用于检测植物材料样品中存在事件CTC75064-3的试剂盒。
本发明的第五个实施方案是一种能够赋予甘蔗(Saccharum spp.)植物对昆虫侵染，特别是被Diatraea saccharalis害虫侵染的抗性的基因构建体。
另外，本发明还提供了一种转基因甘蔗、植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其包含定位于转化的甘蔗植物基因组中定义的位点的目的基因构建体，其特征在于特定的侧翼序列。
本发明的第七个实施方案是提供一种商品产品。
本发明的第八个实施方案是生产一种抗虫植物的方法。
最后，本发明的第九和第十个实施方案是提供一种制作和培育抗虫甘蔗植物和/或植物细胞、植物部分或种子的方法。
发明简述
第一实施方案是通过提供包含选自由以下组成的组的序列的至少14至26个连续的核苷酸的多核苷酸来实现的：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。
本发明的第二实施方案通过提供引物对来实现，其中正向引物由SEQ ID NO:6组成且反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物由SEQ ID NO:8组成且反向引物由SEQ IDNO:9组成。
第三实施方案是通过检测源自事件CTC75064-3的植物材料的方法实现的，包括以下步骤：
a)获得用于分析的样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且检测扩增产物的存在。
同样为了实现第三实施方案，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
仍然为了实现第三种实施方案，本发明描述了一种检测源自事件CTC75064-3的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得分析用的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸的互补物结合，所述多核苷酸包含选自SEQID NO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少14个连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；以及
e)检测探针的实际杂交情况。
本发明的第四个实施方案由检测植物样品中事件CTC75064-3的存在的试剂盒证明，该试剂盒包含用于检测多核苷酸的存在的手段，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸，和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
第五个实施方案是通过提供包含SEQ ID NO:1或2的基因构建体实现的。
第六个实施方案是通过包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物、植物部分、植物细胞、植物组织或种子来实现的。
第七个实施方案是通过提供由本发明的转基因甘蔗生产的商品产品来实现的。
第八个实施方案是通过产生包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的抗虫植物的方法实现的。
本发明的第九个实施方案提供了一种制作抗虫甘蔗植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以生产事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。
最后，本发明的第十个实施方案描述了一种培育事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括在包括昆虫侵染的条件下种植包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:22的CTC75064-3的转基因甘蔗植物。
附图简要说明
图1体现了由D.saccharalis(甘蔗螟虫)引起的对甘蔗茎秆的损害。
图2说明了由于D.saccharalis(甘蔗螟虫)的攻击而造成的赤腐-螟害复合病。
图3表示本发明事件中引入的T-DNA的图谱。
图4表示作为构建本发明中使用的质粒的基础使用的质粒。
图5表示所得到的质粒，用于获得目的事件。
图6是经由
Figure BDA0002770643210000071
(相对荧光强度x循环)对目的事件进行qPCR扩增的曲线图。
图7是经由SYBR GREENTM(相对荧光强度x温度)对于目的事件的qPCR熔解曲线。箭头指示了目的事件的特定扩增峰和阴性事件和对照的无扩增的基线指示。
图8是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(新鲜组织)中Cry1Ac蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002770643210000072
(PR)和Juazeiro(BA)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形图表示了SE。
图9是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(干燥组织)中Cry1Ac蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002770643210000073
(PR)和Juazeiro(BA)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形图表示了SE。
图10是CTC75064-3事件的Cry1Ac蛋白在茎、叶和根组织的新鲜(A)和干基(B)中的表达均值。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形代表平均值±标准误差。
图11是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(新鲜组织)中NptII蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002770643210000074
(PR)和Juazeiro(BA)地点的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。
图12是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(干燥组织)中NptII蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002770643210000075
(PR)和Juazeiro(BA)地点的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。
图13是CTC75064-3事件的NptII蛋白在茎、叶和根组织的新鲜(A)和干基(B)中的表达均值。同一字母下的条形图在5％的概率水平下通过T检验没有差异。条形代表平均值±标准误差。
图14是Western blot方法鉴定Cry1Ac蛋白的结果。M：分子量标记(kDa)。R1-R4：本发明的事件的生物重复；WT(1)：阴性对照-从亲本栽培品种中提取的总蛋白。CP:1ng纯化的Cry1Ac蛋白；WT+CP:1ng纯化的Cry1Ac蛋白稀释在WT的总蛋白中；
Figure BDA0002770643210000081
空道。
图15是Western blot方法鉴定NptII的结果。M蛋白：分子量标记(kDa)。R1和R2：本发明事件的生物重复。CP:5ng NptII蛋白；WT+CP。5ng NptII蛋白稀释在从亲本栽培品种提取的总蛋白中。WT：从亲本栽培品种中提取的总蛋白。
图16表示：A)侵染指数(I.I.％)，B)来自事件CTC75064-3和来自对照(第一次收获的植物)的损害相对长度。字母代表通过T检验进行方差分析的结果，条形指标准误差。
图17表示来自4个地点的事件CTC75064-3的螟虫控制效果(I.I％＝侵染指数)。条形指出分析的标准误差。
图18在A中显示：与亲本非转基因CTC75-TC(RB867515)相比，抗虫(甘蔗螟虫)的CTC75064-3事件的植物材料在叶盘测定中的幼虫死亡率；B。事件CTC75064-3的螟虫防治效果(Borer Control Effectiveness)；C：在叶盘测定中幼虫在喂食七天后大小和发育的示范性结果。左边是用抗虫CTC75064-3事件的植物材料喂养的示范性幼虫，右边(B)是用亲本非遗传修饰的CTC75-TC(RB867515)的植物材料喂养的示范性幼虫。
图19展示了通过基因编辑方式生成事件CTC75064-3的盒(cassette)的例子。盒A包括由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的甘蔗密码子优化的Cas9；盒B包括由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA，盒C包括HR模板，HR模板包含CTC75064-3 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)的，具有同源臂，用于位点定向整合。
图20表示包含Cas 9和crRNA盒的基因编辑结构的一个例子。
图21表示了一个基因编辑构建的实例，其包含HR模板，HR模板包含CTC75064-3 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)，具有同源臂进行位点定向整合。
图22表示基因编辑构建，包括用于产生事件CTC75064-3的所有盒：由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的密码子优化的Cas9；由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA和HR模板，包含CTC75064-3 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)，具有同源臂用于位点定向整合。
图23A)是使用HindIII和EcoRV限制性酶鉴定事件CTC75064-3中插入的T-DNA的Southern印迹策略的示意图。T-DNA方案下面的灰色箭头表示从CTC75064-3事件产生的T-DNA片段的预测大小。B)是使用限制性酶SphI检测载体(骨干)片段的Southern印迹策略的示意图。
图24表示使用限制性酶HindIII(左)和EcoRV(右)的Southern印迹。识别cry1Ac基因的cry探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份。T0：来自第1次收获的植株。T1：来自第2次收获的植株；T2：来自第3次收获的植株；T3：来自第4次收获的植株。
图25表示使用限制性酶EcoRV(左)和HindIII(右)进行Southern印迹。识别35s启动子的35s探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份。T0：来自第1次收获的植株。T1：来自第2次收获的植物；T2：来自第3次收获的植物；T3：来自第4次收获的植物。
图26表示使用限制性酶HindIII(左)和EcoRV(右)的Southern印迹。识别nptII基因的nptII探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份；T0：来自第1次收获的植物。T1：来自第2次收获的植株；T2：来自第3次收获的植株；T3：来自第4次收获的植株。
图27A)表示使用限制性酶SphI和骨干(backbone)探针BB1和BB3的Southern印迹。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1拷贝，用pCTC146；1C*：阳性对照1拷贝，用pCTC302。BB1：探针骨干1的阳性对照；BB2：探针骨干2的阳性对照；BB3：探针骨干3的阳性对照。红色箭头表示CTC75064-3事件的两次重复。道1：其他事件。B)代表使用SphI限制性酶和BB2骨干探针的Southern印迹。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份与pCTC146；1C*：阳性对照1份与pCTC302。BB1：探针骨干1的阳性对照；BB2：探针骨干2的阳性对照；BB3：探针骨干3的阳性对照。红色箭头表示CTC75064-3事件的两次重复。道1为其他事件。
图28表示在CTC75064-3事件中插入的T-DNA的侧翼区域的完整性的确认。(A)确认左侧边界(5')的完整性。(B)确认右侧边界(3')的完整性。事件：来自事件CTC75064-3的DNA；WT：DNA CT 7515亲本(RB867515品种)；C-：阴性对照。
发明详述
首先，术语"事件"是指通过遗传转化产生的转基因植物，该转基因植物稳定地表达由引入的转基因赋予的所需性状。更具体地，在本例中，术语"事件"被认为是转基因植物，优选是甘蔗转基因植物(Saccharum spp.)，该植物在经过遗传改造后，表达了抗害虫的特性，特别是对害虫Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。在一个优选的实施方案中，通过遗传转化产生的转基因甘蔗被指定为'CTC75064-3'，并且可以交替地称为"CTC75064-3事件"。
另外，为参考目的，除非另有明确提及，"LB区域"是指转移的T-DNA(5')的左边界(边缘)，而"RB区域"是指转移的T-DNA(3')的右边界(边缘)。
此外，除另有明确说明外，本文描述的所有生物序列都涵盖与所描述序列具有至少80％、优选85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的序列。
最后，"植物材料"是指任何和所有植物组织或其衍生物，诸如但不限于种子、茎、茎秆、叶、秸秆、树皮、根、细胞、植物来源的分子，等等。此外，"植物材料"可以包括植物的任何产品或其衍生物，例如但不限于汁液、糖、乙醇，等等。
重组DNA技术已使基因的分离及其稳定插入宿主基因组成为可能。这种技术也称为基因转化，可以定义为将核酸("DNA"或DNA)受控制地引入到受体基因组中，不包括通过受精引入。这是一个受控的过程，在这个过程中，确定的DNA片段被引入宿主(或受体)基因组，并且必须整合到其中。将这些分子稳定地插入到宿主基因组中，就会产生一个基因组与重组分子的受体(宿主)相等或实质上相等，但具有新的特殊特征的个体。"实质上相等"是指基因组相对于受体具有80％以上，最好是85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
有几种植物基因转化技术可归纳为两大类：间接和直接基因转移。间接转移是指通过生物载体的作用将外源DNA插入基因组，而直接转移则是基于物理生化过程。
根据基因转化技术和根据要转化的物种或基因型，可以使用不同的组织和/或细胞。一般来说，这些组织或细胞包括但不限于胚胎愈伤组织、愈伤组织、原生质体、胚胎、体细胞胚胎、分生组织、和具有再生能力的植物的任何其它部分、组织或细胞。
间接转化是以农杆菌(Agrobacterium)属的细菌介导系统为基础，一直是获得转基因植物最广泛使用的方法。这种方法的优点包括能够转移相对较长的DNA片段而不发生重排，同时保持转基因的低拷贝数整合，从而保证生成事件的基因型更加稳定。一些农杆菌的种和株、质粒和程序方案已经被开发并适应于几种植物物种的基因转化。这些方法的优点包括对于单拷贝事件更高的概率，稳定的整合，和引入的遗传性状的遗传继承，以及，世世代代的一致的基因表达和更低的基因沉默率。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是属于根瘤菌科的革兰氏阴性土壤植物病原菌，分别引起双子叶植物的病害，即所谓的冠瘤和毛状根球。在这种植物与病原体的相互作用中，农杆菌与植物细胞之间有一个自然基因转移的过程，其中细菌DNA的片段被转移到植物细胞中(T-DNA)，与核基因组整合。在其自然形式下，细菌转移T-DNA("转移的DNA")，它是称为Ti("诱导肿瘤的")的细菌质粒的一部分，并整合到感染的植物细胞的基因组中。转移到植物细胞中的T-DNA片段由参与植物激素(茁长素和细胞分裂素)组成性生物合成的基因组成，这些基因改变了感染组织的正常发育程序，并导致肿瘤的形成。此外，它还包含用于合成糖和可作为细菌的碳和氮源的称为冠瘿碱的氨基酸的癌基因(Oger等人,1997)。左右边界25个碱基对(bp)的重复末端划定了T-DNA的界限，对其转移至关重要。受伤植物组织释放的酚类化合物激活特定区域(vir区域)，启动T-DNA向植物细胞转移的过程。农杆菌还具有染色体(chv)基因，促进细菌与宿主细胞之间的结合，使含T-DNA复合物的孔道形成(Sheng&Citovsky.1996).
由于要转移的片段是由其边界确定的，任何由该边界侧翼的序列都可以通过农杆菌转移到植物上，使得操纵这些序列以转移目的编码序列成为可能。替换或删除野生型T-DNA的编码区(致癌基因)，就可以产生非致癌(缴械)的农杆菌菌株，这些菌株可以携带目的序列。修饰后的T-DNA能够将目的序列转移到植物上，因为毒力基因(vir区域)保持完整。
此外，只要构建体包含这种T-DNA边界，农杆菌间接转化系统就允许将人工质粒构建体转移到植物上，这实现了使用为其它细菌菌株开发的分子工具和材料的灵活性。
这些人工质粒构建体除了具有赋予抗生素抗性、除草剂抗性或耐受性或酶活性(磷酸甘露糖异构酶(PMI)/甘露糖(Man))的基因外，还具有来自不同来源的启动子，例如植物启动子、病毒启动子、细菌启动子和或嵌合启动子，因此这些标记可用于转化细胞或植物的选择。
这些构建还可以包含辅助基因，其干扰相关的形态发生信号通路，提高遗传转化过程的效率和植物组织的再生。包括但不限于LEAFY COTYLEDON1(Lotan等，1998)、Lec1(Lowe等，2002)、LEAFY COTYLEDON2(Stone等，2001)、WUSCHEL(WUS；Zuo等，2002)、e BABYBOOM(BBM；Boutilier等，2002)，等等。
在本发明的第一方面，要引入植物的外来或外源DNA被克隆到二元质粒中，左、右边界共有序列(T-DNA)之间。将二元质粒转移到农杆菌细胞中，随后用于感染植物组织。将包含外源DNA的载体的T-DNA区域插入到植物基因组中。标记基因表达盒和特征基因表达盒可以存在于T-DNA的同一区域，也可以存在于同一质粒上T-DNA的不同区域，或者存在于不同质粒上T-DNA的不同区域。在本发明的一个实施方案中，盒体存在于与T-DNA相同的区域。本领域的技术人员熟悉通过农杆菌间接转化的方法。
另外，可以使用直接DNA转移来直接将DNA引入植物细胞中。直接DNA转移的一种方法是用粒子枪将包含DNA的载体轰击植物细胞进行插入(粒子介导的基因枪转化)。转化植物细胞的其它方法包括原生质体转化(可选地在聚乙二醇的存在下)；在包含多核苷酸或载体的培养基中对植物组织、细胞或原生质体进行超声处理；将多核苷酸或载体显微注射到植物材料中；显微注射、真空渗透、超声处理、使用碳化硅、用PEG进行化学转化、植物细胞电穿孔等。介于直接转化的缺点之间的是与植物组织的再生和转基因表达量低有关的挑战。
此外，还可以通过核酸酶介导的同源重组进行位点直接插入进行基因转化(基因组编辑)。近年来，基于使用工程核酸酶或嵌合核酸酶的基因组编辑技术使转基因生物的生成更加精确和特异。外源基因或外来基因的引入由同源重组实现，通过引入具有与与受体生物基因组同源的DNA片段连接的外源DNA的同源重组模板(HR)。现有的工具之间有嵌合酶系统CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats成簇的规律间隔的短回文重复序列)-Cas，锌指(ZFN)核酸酶和TAL效应核酸酶(TALENs)。Crispr-Cas系统是由两个主要成分组成的酶系统：内切酶(Cas)和引导RNA(单引导RNA-sgRNA；朝向Cas内切酶的特定切割位点的向导)。引导RNA也可以包括两个成分：Crispr RNA(crRNA)--与特定DNA基因组序列互补的17-20mer的序列，以及任选的tracr RNA。由sgRNA引导和内切酶所进行的特异性切割将被同源重组进行修复，特别是将侧翼是同源序列的外源DNA插入到切割位点。将该酶系统引入细胞可以通过几种方式进行，使用质粒，通过直接或间接转化，或使用载体如蛋白质和其他化学试剂。该系统组分的表达将以瞬时或稳定的方式发生，使用受体生物体的细胞机制或以外源方式实现，在体外，将所有准备好使用的组分(内切酶+sgRNA，在细胞递送前体外转录和组合)递送到靶细胞或组织。本文所列出的描述并非详尽无遗，不应限制使用本发明范围内已知的、甚至尚未发现的基因组编辑的不同变体、系统和方法。
转化之后，从转化的植物组织中再生转基因植物，并且可以使用适当的标记如卡那霉素、遗传霉素或草铵膦抗性来选择具有外源DNA的后代。本领域的技术人员熟悉合适的再生培养基的组成。
另外，可以应用其它选择方法，而不需要如前所述在宿主基因组(受体生物体)中插入任何基因标记。
在一个优选的实施方案中，遗传转化是通过农杆菌属的细菌来介导的。
在一个更优选的实施方案中，遗传转化是通过根癌农杆菌介导的。
CTC75064-3事件表现出包括两个表达盒的新基因型。第一表达盒包括适合植物表达的启动子，该启动子与编码在控制鳞翅目昆虫害虫中有用的Cry1Ac杀虫毒素的基因和合适的多腺苷酸化信号可操作地连接。第二表达盒包括适合植物表达的启动子，该启动子可操作地连接到编码用于获得本发明事件的选择性标记的蛋白质的基因。
适合植物表达的启动子可以从植物或其他生物体中分离出来。已经分离或开发了几种启动子，包括组成型启动子、"开和关"启动子和对组织特异性非生物胁迫有反应的启动子等。这些启动子中的许多具有被描述为与适当基因表达相关的内含子序列。在本发明的一个优选方面，启动子是组成型启动子，可以选自CaMV 35s、CoYMV(鸭跖草黄斑驳病毒，Commelina yellow mottle virus)、FMV 35s、泛素(Ubiquitin)、Actin Rice Promoter(Act-1)、Act-2、胭脂碱合成酶启动子(NOS)、章鱼碱合成酶启动子(OCS)、玉米乙醇脱氢酶启动子(Adh-1)、PvUbi1等等组成的非限制性组。
为了增强基因表达水平，还可以将额外的元件如内含子、增强子序列和转运子加入到表达盒中，例如转录或翻译增强子，如CaMV 35s增强子、FMV 35s、Nos、supP、来自小麦主要叶绿素a/b-结合多肽(L-Cab)的非翻译前导序列、翻译起始位点上游5'的kozak序列等等。
在本发明的一个实施方案中，启动子是花椰菜花叶病毒35s(CaMV35s)。在一个更优选的实施方案中，启动子CaMV 35s是双倍增强的CaMV 35s启动子(2xCaMV35s)。
在本发明的一个实施方案中，在CaMV 35s启动子区域中考虑了翻译起始位点上游5'的Kozak序列和水稻肌动蛋白第一(Oryza sativa Actin 1,OsACT1)内含子。此外，L-Cab前导序列也被考虑在CaMV 35s启动子区域中。
在一个优选的实施方案中，cry1Ac基因的表达通过选自由双倍增强型启动子CaMV35s、小麦主要叶绿素a/b-结合多肽的非翻译前导序列(L-Cab)、OsACT1内含子和翻译起始位点上游5'的Kozak序列组成的组中的元素组合调节。在一个优选的实施方案中，cry1Ac基因的表达通过启动子区域调节，该启动子区域包括双倍增强型启动子CaMV 35s、小麦前导序列L-Cab、OsACT1内含子和从翻译起始位点上游5'的Kosak序列。
在另一个实施方案中，启动子是玉米泛素(pUBI)基因启动子。在一个更优选的实施方案中，玉米泛素启动子在前导RNA的5'序列中包含一个内含子。
本发明的启动子区域(UBI-1)有1992个碱基对，这些碱基对被细分为：启动子片段(899个碱基)、多泛素-1(polyubiquitin-1)基因的第一外显子(83个碱基)和第一内含子(1,010个碱基)。
在一个实施方案中，nptII基因的表达由玉米泛素(pUBI)基因启动子调节。在一个优选的实施方案中，nptII基因的表达由玉米泛素启动子调控，该启动子在前导RNA的5'序列中包含一个内含子。在一个具体的实施方案中，nptII基因的表达由玉米泛素(pUBI)基因启动子区域调节，该启动子区域包含1992个碱基对，该区域被细分为：启动子片段(899个碱基)、多泛素-1基因的第一外显子(83个碱基)和第一内含子(1,010个碱基)。
在表达盒上还考虑了终止子序列。合适的和功能性的植物多聚腺苷酸化信号的实例包括那些来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nopaline synthase,nos)基因、蛋白酶抑制剂II基因rbcS(豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基,pea ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase small subunit)、Lhcb1(烟草叶绿素a/b结合蛋白)、CaMV 35s、章鱼碱(octopine)合成酶、α-微管蛋白基因，等等的。
在本发明的一个实施方案中，多腺苷酸化信号是来自CaMV 35s基因(T35s)的信号。在本发明的另一个实施方案中，多腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(T Nos)基因的信号。
优选地，cry1Ac盒的多腺苷酸化信号为CaMV 35s终止子(T-35s)，nptII基因的多腺苷酸化信号为根癌农杆菌的胭脂碱合成酶合成酶终止子-NOS。
cry1Ac基因编码一种615个氨基酸的毒素，估计分子量为68KDa，来源于苏云金芽孢杆菌serovar kustaki(菌株HD73)，它赋予了对Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。本发明考虑了对仅表达原生Cry1Ac蛋白的活性胰蛋白酶核心(active trypticnucleus)进行基因修饰。因此，在本发明的一个优选实施方案中，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸是截断的，编码52kDa的胰蛋白酶杀虫核(tryptic insecticide nucleus)。在一个更优选的实施方案中，Cry1Ac蛋白是SEQ ID NO 34。本发明还考虑了与SEQ ID NO:34的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100
％的同一性的序列。胰核负责蛋白质的杀虫活性，与昆虫肠道的特定蛋白质结合，导致该器官的功能和解剖学完整性的破坏。目标昆虫摄取Cry1Ac蛋白后，会引起营养吸收的改变，从而导致昆虫迅速中毒并随后死亡。
根据本发明，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸可以具有优化(或以其他方式改变)的密码子，以改善在植物材料中的表达。这种密码子优化可用于改变在任何转化细胞中产生的RNA转录产物的预测的二级结构，或破坏存在于未改变的转录产物中的隐性RNA不稳定元件，从而提高转录产物在转化细胞中的稳定性和/或可用性。
优选地，在本发明事件中存在的cry1Ac基因对应于经优选甘蔗密码子优化的截断合成DNA序列。在本发明的更优选方面，cry1Ac基因具有序列SEQ ID NO:20。本发明还考虑了与SEQ ID NO:20的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100％的同一性的序列。
已经表征了几种用于植物事件选择的标记基因，包括一些赋予抗生素耐受性的基因和其他赋予除草剂抗性的基因。在本发明中可以选择使用的标记基因的例子包括赋予对潮霉素(hygromycin)、卡那霉素、庆大霉素、遗传霉素(geneticin)、草甘膦、草铵膦的抗性或耐受性或对毒素如eutypine的抗性的那些基因。还可以采用其它形式的选择，如基于激素的选择系统、通过表达荧光蛋白的视觉选择、甘露糖异构酶、木糖异构酶等等。在本发明的一个实施方案中，事件选择标记基因是赋予卡那霉素和遗传霉素耐受性的基因。
在本发明的一个优选实施方案中，第二表达盒中使用的标记基因是nptII基因，该基因编码265个氨基酸的新霉素磷酸转移酶II(NptII)酶，估计分子量为29.2KDa。在本发明的更优选方面，nptII基因具有SEQ ID NO21的序列。新霉素磷酸转移酶II赋予对氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素和遗传霉素的抗性。在获得转化事件中用作选择标记的nptII基因来自大肠杆菌Tn5转座子，如BECK等人(1982)所述。NptII蛋白由几种广泛存在于环境中的原核生物产生，水生和陆生栖息地中均存在，以及人和动物肠道微生物群。NptII蛋白利用三磷酸腺苷(ATP)使氨基糖苷类抗生素如新霉素、庆大霉素、遗传素、巴龙霉素和卡那霉素A、B、C等磷酸化，使其失去活性，从而防止它们在接触上述抗生素时对细胞造成伤害。这种机制使其可以作为选择转化植物的标记物。在本发明的一个优选方面，NptII蛋白具有SEQ IDNO 35的序列。
使用选择标记基因，如nptII基因，对于选择在遗传修饰过程中转化的细胞很重要(HORSCH等，1985)。因此，在本发明的事件中插入nptII基因的目的是选择用cry1Ac基因转化的细胞。
除所述表达盒外，还可在事件CTC75064-3中使用另外的表达盒。
事件CTC75064-3中包含的第一和第二表达盒可以在相同或不同质粒上引入植物。如果第一和第二表达盒位于同一质粒上并通过农杆菌介导的转化方法引入植物，它们可以存在于T-DNA的相同或不同区域内。在本发明的一个实施方案中，第一和第二表达盒存在于T-DNA的同一区域内。
更具体地，本发明的事件是通过根癌农杆菌介导的转化，用包含含有cry1Ac和nptII基因表达盒的DNA片段(T-DNA)的遗传构建体获得的。优选地，本发明的遗传构建体包含序列SEQ ID NO:1的核苷酸。
本发明的事件是通过含有上述定义的T-DNA片段(SEQ ID NO:1)的根癌农杆菌介导的转化获得的。
该T-DNA片段插入到二元质粒中，该质粒的宿主谱中含有大肠杆菌和根癌农杆菌。本发明原始二元质粒的具体遗传元件和成分来源如图4所示。图5中描述了包含本发明构建体的二元质粒。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因构建体包含SEQ ID NO:14的序列。
所述构建体是通过本领域普通技术人员已知的技术，如电穿孔或热休克(thermalshock)等，转移到根癌农杆菌(载体)菌株上。
在一个更优选的实施方案中，载体是根癌农杆菌肿菌株EHA105。
进一步描述了一种产生目的事件的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤。
a)将基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有氨基糖苷类抗生素的培养基中选择含有功能片段的转化细胞；以及
e)再生转化的甘蔗植物。
在一个实施方案中，生产事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法的步骤a)包括将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中。在另一个实施方案中，步骤d)包括在含有遗传霉素的培养基中选择含有功能片段的转化细胞。此外，所述方法的步骤e)包括再生转化甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。本发明还考虑了，由本文所述方法产生的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
本领域的技术人员熟悉用于生成胚胎愈伤组织(b阶段)的合适的培养基的组成，以及共培养阶段(c阶段：共培养+静息)、选择(d阶段)和再生(e阶段；再生+延伸)的手段。优选地，所使用的培养基是基于包含诸如MS盐(Murashige和Skoog，1962)、蔗糖和维生素B5等成分的组合物。可选地，还可以加入以下：选自脯氨酸和天冬酰胺的氨基酸；酪蛋白水解物；柠檬酸；甘露醇；硫酸铜；甘氨酸；胶凝剂；茁长素；抗生素；乙酰丁香酮；和选择剂。茁长素的使用，在胚胎愈伤组织的生成、共培养和选择中尤为重要，在选择培养基中使用氨基糖苷类抗生素，优选是遗传霉素，也很重要。
"共培养"步骤是指对已经感染或接触过农杆菌(使农杆菌T-DNA转移到植物细胞中)的植物组织进行孵化。该阶段对应于从接种(农杆菌与植物组织接触)后立即一直到菌体被去除或失活的时刻。
接种的组织可以共培养约1至30天，优选1至20天，更优选1至10天。
在共培养步骤中，温度可以是本技术中已知的任何适合目标植物的温度。示例性地，对于甘蔗，温度可以在约15℃至约30℃和约16℃至约29℃范围之间。在一些实施方案中，共栽培步骤在没有光照的情况下进行。
在与农杆菌共培养之后，除去培养基，并将细胞转移到没有农杆菌的培养基中。然后将细胞在约20℃和约26℃之间的温度下在黑暗中培养1至20天。
本文提供的方法还包括选择包含至少一个拷贝的目的遗传序列的细胞。本文使用的"选择"是指其中对转化体使用选择剂的情况，其中所述选择剂将允许含有至少一个定位在T-DNA内的标记基因拷贝的植物细胞优先生长。而那些未转化的细胞将不含有允许在选择剂中生存的标记基因。如上所述，可以使用任何合适的选择标记物。优选地，使用的选择标记基因是nptII基因，该基因编码一种赋予对氨基糖苷类抗生素如遗传霉素的抗性的酶。
在一些实施方案中，还加入抑制农杆菌生长的药剂。
选择可以在光照或黑暗条件下进行，例如，这取决于被转化的植物种类和基因型等。在某些情况下，进行转化的胚胎愈伤组织或其它组织可在同一培养基中定期或不定期地进行传代培养。在愈伤组织转化的情况下，可以将各个愈伤组织分开，以确保每个愈伤组织只再生一株植物(从而确保所有再生的植物来自独立的转化事件)。在一个优选的实施方案中，使用遗传霉素作为选择剂，选择步骤在黑暗中进行约1至10周。更优选地，选择步骤进行约2至5周。
在选择期结束后，可将在选择剂存在下继续生长并因此是已被遗传修饰的植物组织，通过置于合适的培养基和生长条件中进行操作和再生。这样得到的转基因植物可以检测是否存在目的DNA。出于本发明的目的，术语"再生"是指形成包括地上部分和根的植物。再生的植物可以种植在合适的基质(如土壤)上并转移到温室中。如本文所使用的，"遗传修饰(genetically modified)"或"转基因(transgenic)"或"稳定转化(stablytransformed)"是指包含通过转化引入其基因组的目的DNA序列的植物细胞、植物部分、植物组织或植物。
在一个实施方案中，该细菌是农杆菌属的。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌菌株EHA105。
本发明还涉及选定事件(CTC75064-3)的表征和检测由其衍生的植物材料的方法。用于检测和表征转基因植物的分析方法包括间接方法(基于蛋白质的检测方法)或直接方法(基于DNA的检测方法)。
宿主细胞基因组中T-DNA稳定整合位点的定义及其侧翼序列的表征对于开发和验证明确识别和表征的方法是必要的。
为了鉴定事件CTC75064-3中T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多项DNA扩增和测序实验。在T-DNA的两端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。随后，利用Sanger法对得到和分离的片段进行测序，以验证iPCR得到的结果。由这些实验产生的数据所得到的存在于事件CTC75064-3中的基因插入图如图3和SEQ ID NO:2所示，事件CTC75064-3的侧翼序列显示在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的至少17个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18。在本发明的另一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:13.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:12的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:5的序列的多核苷酸。在本发明的另一个方面，提供了一种包含序列SEQ ID NO:22的多核苷酸。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ IDNO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:13的植物。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ IDNO:13的植物。
在本发明的一个实施方案中，所述植物是转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。此外，所述植物是抗昆虫的，并且包含SEQ ID NO:5。还是在另一个方面，本发明的抗虫植物包含SEQ ID NO:22。在另一个方面，所述植物是事件CTC75064-3的抗虫甘蔗植物或由其衍生的植物。
在本发明的一个方面，事件CTC75064-3是甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQID NO:5。在另一个方面，事件CTC75064-3包含SEQ ID NO:22。
在其他方面，提供了一种检测和鉴定CTC75064-3事件的具体方法。
根据本发明，提供了一种检测来自事件CTC75064-3的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向引物和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；以及
e)检测扩增产物的存在。
在一个实施方案中，根据所描述的检测方法的引物对(步骤c)是设计为与包含SEQID NO 2的连续的核苷酸的多核苷酸结合。
在另一个实施方案中，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的连续的核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述(步骤c)引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续核苷酸。
此外，根据描述的检测方法的引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31的序列的连续的核苷酸以及第二引物包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计成结合到包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ IDNO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在另一个实施方案中，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQID NO:39的序列的连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
众所周知，特别是对于本技术领域的技术人员来说，DNA分子(或DNA)是由两股(核苷酸的)组成，它们通过核苷酸碱基之间的氢桥固定在一起。根据碱基的互补性进行配对，遵循的一般规则是：腺嘌呤与胸腺嘧啶和胞嘧啶与鸟嘌呤。因此，虽然核苷酸序列的表示只针对其中一条链进行，但它们的互补链或互补序列被包括在本发明的范围内，并被考虑用于本文所述引物和探针的定义。
获得用于DNA提取的样品的方法对于本领域普通技术人员来说是广为人知的，包括收集来自CTC75064-3转基因事件的任何植物材料，如茎、根和叶。优选地，样品从完整的叶子中获得。植物DNA提取方法包括但不限于基于使用CTAB洗涤剂的方法(Alianabi等，1999)，(任选地)随后用氯化铯或乙酸铵进一步净化样品，以及其它市售方法。
既然SEQ ID No:2、3、4、5、22、23、24、29、30、31、36、37、38和39已经可用，适用于本检测方法的引物对可以使用分子生物学技术领域的技术人员熟知的参数进行设计。例如，该对引物中的一个或两个引物可以被设计成构建体特异性、性状基因特异性、启动子特异性、插入DNA和基因组DNA之间连接处的序列特异性和/或侧翼序列特异性。
与本发明的这一方面相应地，有许多扩增方法可以使用。本领域技术人员已知的最常见的扩增技术之一，是聚合酶链反应(PCR)。PCR反应的扩增产物可以通过用荧光标记如溴化乙锭染色核苷酸链，然后用紫外光激发它(通常是在使用琼脂糖凝胶电泳进行大小分离后)来可视化。
本发明的一个实施例采用了PCR原理的变化，如定量实时PCR、巢式PCR、反向PCR(iPCR)、数字PCR、长(Long)PCR、降落(Touchdown)PCR、热起动(Hot Start)PCR、多重PCR等。扩增产物也可以通过不同的方法进行检测，这些方法是本发明所考虑的，例如SYBR GreenTM系统，当该试剂与双链DNA结合时就会发出荧光，以及
Figure BDA0002770643210000241
系统，其检测是基于荧光探针的相互作用。
Figure BDA0002770643210000242
方法使用与位于反应引物之间的目标PCR产物段互补的探针。在PCR循环的杂交阶段，探针与目标DNA结合，在Taq聚合酶延伸过程中，通过其5'-外切酶的活性，去除探针，释放出荧光色素并发出荧光。本发明这方面的其他实施例包括但不限于：环介导等温扩增(LAMP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、微阵列技术Luminex、"DNA行走(DNAwalking)"和下一代测序(NGS)、Sanger法、Illumina等。
本发明描述了一种基于定量实时PCR(qPCR)技术的具体检测方法，称为"Plus-Minus"或"Presence-Absence"，呈现出了该方法的两种变化：SYBR GREENTM和
Figure BDA0002770643210000243
技术。
在本发明的一个实施方案中，提供了引物对，其中正向引物由SEQ ID NO:6和反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物为SEQ ID.NO:8和反向引物为SEQ ID NO:9.
在另一个实施方案中，事件CTC75064-3的转基因甘蔗植物材料检测方法的步骤c)中使用的引物对包括由SEQ ID NO:6组成的正向引物和由SEQ ID NO:7组成反向引物的和/或正向引物是SEQ ID NO:8和反向引物是SEQ ID NO:9。此外，由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物产生的扩增子(扩增后的产物)通过SEQ ID NO:10的标记探针观察。另外，通过SEQID NO:8和SEQ ID NO:9引物产生的扩增子，通过SEQ ID NO:11的标记探针观察。因此，本发明的一个方面是，检测通过使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8和SEQID NO:9获得的扩增产物，是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
在本发明的一个实施方案中，通过所述方法扩增的区域(扩增的扩增子或产物)长度在80至1000个碱基对之间。在另外一个实施方案中，扩增子的长度在100到300个碱基对之间。在一个优选的实施方案中，使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7获得的扩增子的长度为107个碱基对，如SEQ ID NO:12所定义的。在另一个优选的实施方案中，通过使用引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9获得的扩增子长度为135个碱基对，如SEQ ID NO:13所定义的。
图6(本发明经由
Figure BDA0002770643210000244
的事件特异性检测反应)和7(SYBR GREENTM测定)代表两种方法的验证。
本发明中所述的引物和探针可组合使用以检测CTC75064-3事件。因此，本发明的另一个实施方案涉及使用多路PCR来鉴定CTC75064-3事件的植物材料。
本发明中包括用于检测和表征CTC75064-3事件的替代引物和探针。这些和其它变体可与但不限于上述任何一种直接检测方法一起使用。
此外，通过将DNA样品与探针杂交，可以从植物材料中检测CTC75064-3事件。具体而言，本发明描述了一种检测转基因甘蔗事件CTC75064-3的材料的方法，其包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品。
b)从样品中提取DNA或RNA。
c)提供探针或探针组合，该探针设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO 22，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO 31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO38和SEQ ID NO 39的序列的连续的核苷酸。其中多核苷酸是单链的。
d)将所述探针或探针的组合与样品杂交，并且
e)检测探针或探针组合的实际杂交。
在优选的实施方案中，本发明描述了一种检测来自转基因甘蔗事件CTC75064-3的材料的方法，它包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品。
b)从样品中提取DNA或RNA。
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的14个或更多个连续的核苷酸，同时该多核苷酸为单链。
d)将所述探针与样品杂交，并且
e)检测探针的实际杂交。
根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少15个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少16个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少17个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33的序列的至少18个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少20个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少21个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少22个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少23个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少24个连续的核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少25个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少26个连续的核苷酸的多核苷酸。
该探针可以是例如PCR产物或限制性消化片段。在另一个实施方案中，本文所述的探针可以用适合于使杂交得以检测的荧光、放射性、酶或其它标签标记。鉴于本公开的优点，本领域的技术人员现在将知道如何设计合适的探针。
在另一个实施例中，提供了一种在严格条件下(高特异性)对样品进行探针杂交的方法。严格的杂交条件对于本领域的技术人员来说是众所周知的。严格条件的例子包括：在大约65℃的温度下，在含有6x SSC、0.01％SDS和0.25％脱脂奶粉的溶液中进行杂交，然后在相同的温度下，在含有0.2倍SSC和0.1％SDS的溶液中进行洗涤。
基于杂交原理检测来自事件CTC75064-3的植物材料的合适技术包括但不限于Southern Blots和原位杂交。本领域的技术人员熟悉此类技术。
典型地，这些技术涉及将探针与样品孵育，洗涤以去除未结合的探针，并检测探针是否已杂交。所述检测方法取决于附着在探针上的标签类型。例如，放射性标记的探针可以通过暴露在X射线胶片上和显影来检测。另外，酶标记的探针可以通过转换底物以影响颜色变化来检测。
此外，本发明的另一个方面设想了一种检测源自事件CTC75064-3的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供一种抗体，该抗体设计为与植物内包含的Cry或NptII蛋白结合，该蛋白包含在SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸之内；将所述抗体与样品孵育；以及检测抗体是否结合。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，所述NptII蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包括SEQ ID NO:34，所述NptII蛋白包括SEQ ID NO:35。
基于所述抗体结合检测来源于CTC75064-3事件的植物材料的合适方法包括(但不限于)：western blot、ELISA(酶联免疫吸附测定)和质谱法(例如表面增强激光解吸/电离(SELDI))。本领域的技术人员熟悉这些免疫学技术。典型的步骤包括用与Cry或NptII蛋白结合的抗体孵育样品，洗涤以去除未结合的抗体，并检测抗体是否已结合。许多这样的检测方法是基于酶反应的：例如，抗体可以与酶如过氧化物酶连接，在应用合适的底物后，检测颜色变化。这种抗体可以是单克隆或多克隆的。
本发明的另一个方面考虑了一种检测源自事件CTC75064-3的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供来自样品的蛋白质提取物；提供设计用于检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸的植物中Cry或NptII蛋白存在的试纸条；将试纸条与样品一起孵育；并检测。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，NptII蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包含SEQ ID NO:34，所述NptII蛋白包含SEQ ID NO:35。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种检测来源于CTC75064-3事件的植物材料的方法，所述方法包括：获得用于分析的来源于CTC75064-3事件的样品和来源于非转基因甘蔗品种的样品(对照)；将一种或多种Diatraea saccharallis种的昆虫(对Cry1Ac易感)置于样品中；检测对昆虫的杀虫作用。在本发明的这一方面，"杀虫剂"指的是对昆虫的任何抑制作用(包括但不限于)：减少进食、生长迟缓、降低繁殖力、麻痹和死亡。
检测来自事件CTC75064-3的植物材料的方法包括但不限于生物叶饲检测，其中事件CTC75064-3的植物的叶子或其他合适的部分，或来自事件CTC75064-3的任何植物材料被一种或多种昆虫害虫侵染。所述检测的测量可以包括在调整的时间段后评估叶子或植物损害，评估死亡率或评估其他杀虫效果。这种生物测定可以在田间或温室中进行，并且可以需要自然或人工昆虫侵染。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于检测植物样品中是否存在事件CTC75064-3的试剂盒，所述试剂盒包括：检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19和/或杀虫晶体蛋白(Cry)的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸存在的手段。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒可包含DNA扩增检测技术，如PCR、qPCR或
Figure BDA0002770643210000281
在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可以包括探针杂交检测技术，如Southern Blots或原位(in situ)杂交。在一个方面，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC75064-3)的转基因甘蔗的材料的手段包括设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸的引物对，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。此外，该手段包括引物对，其中正向引物包括SEQ ID NO:6和反向引物包含SEQ ID NO:7，或者正向引物包含SEQ ID NO:8和反向引物包括SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC75064-3)的转基因甘蔗的材料的手段包括包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可包含抗体结合检测技术，如western blots、ELISA、质谱(SELDI)或试纸条。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包括生物昆虫检测技术，如叶片取食生物测定或生物死亡检测。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包括上述检测技术的任意组合。
本发明所述的转基因事件会影响由鳞翅目昆虫组成的群体中的一个或多个物种的昆虫。因此，与相同品种的非转基因甘蔗植株相比，在所述植株的栽培过程中需要减少杀虫喷雾的次数。
本发明本身并不拘泥于事件CTC75064-3；相反，它被进一步扩展到包括由其衍生的任何植物材料，包括种子，只要它们含有至少一种本发明的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明包括来自转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19.在其它实施方案中，本发明考虑了包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。此外，本发明还包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。本发明还包括但不限于通过常规或其它杂交方法从具有CTC75064-3事件或其衍生物的杂交系中衍生的植物；因此，本发明的一个实施方案涉及使用来自本文所述转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子，该植物、植物细胞、植物部分或种子用于再生植物、种植、栽培植物田或生产植物产品。本发明还考虑了包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在其它实施方案中，本发明包括包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在本发明中还考虑了一种包含SEQ ID NO.5或SEQ IDNO:22的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。此外，本发明还包括从上述组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:19。植物细胞和植物部分的实例包括但不限于：悬浮细胞、愈伤组织、体胚、分生组织、顶茎、茎、叶、叶盘、分蘖、芽。另一个方面考虑了一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是包含事件CTC75064-3的植物，并由此生产子代甘蔗植物。含有事件CTC75064-3的植物是包含SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。本发明还考虑了由上述生产抗虫甘蔗的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种商品产品，由包含事件CTC75064-3的甘蔗植物生产。因此，本发明包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。在一个实施方案中，本发明考虑了一种商品产品，其由包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。此外，本发明还包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的转基因甘蔗(Saccharumspp.)植物生产。商品产品的例子包括但不限于：甘蔗渣、甘蔗汁、糖浆、第一代乙醇(由甘蔗汁生产)、第二代乙醇(纤维素乙醇；由生物质生产)、生物质、糖、原糖、精制糖、糖蜜、酒糟和纤维。
本发明还提供了一种来自CTC75064-3事件的植物材料，其包含额外的多核苷酸序列，经过修饰或比CTC75064-3更小，或表现出其它表型特征。例如，植物材料CTC75064-3事件可以被转化以产生包含额外特征的新事件，例如，第二抗虫基因。这个过程被称为基因叠加。这样的第二昆虫抗性基因编码，例如，来自苏云金杆菌的杀虫凝集素(insecticidallectin)、杀虫蛋白酶抑制剂和其它杀虫蛋白。
本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供来源于CTC75064-3事件的植物材料。本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供CTC75064-3衍生的植物材料，并对所述植物材料施用其它农业化学试剂(例如除草剂、杀真菌剂等)。
在其它实施方案中，本发明描述了，一种制造事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以产生事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有更好的抗虫性。在另外一个实施方案中，本发明提供了一种培育CTC75064-3事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，在包含昆虫侵染的条件下，其中，与在相同条件下生长的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。本发明还提供了，一种事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
转基因甘蔗'CTC75064-3'的描述
转基因杂交甘蔗'CTC75064-3'植株在遗传学角度实质等同于重组分子的接受者(宿主)(即亲本植株品种'RB 867515，一种商业化的巴西甘蔗品种(植物品种保护/PVP-协议号-21806.000439/2000-45；PVP证书№271))，表型上与其相似，但具有新的和特定的特征(Cry1Ac的表达)，其保证了对甘蔗螟虫D.saccharalis(鳞翅目)的抗虫性。如同其亲本品种'RB 867515'，'CTC75064-3'是一个现代甘蔗杂交种，它具有几个合乎需求的农艺特性，如，高截根蔗萌发活力的遗传潜力，高甘蔗产量，优良的截根苗生长性，中晚熟，高蔗糖含量，并且对白条病，黑穗病，锈病和甘蔗花斑病耐受。
简言之，'CTC75064-3'植株的特点是，在阳光下暴晒时，茎秆呈紫色并有紫晕，未暴晒处的茎秆呈紫绿色。'CTC75064-3'植株表现为中等长度大小的弯曲节间和中等宽度的黄绿色生长环。节间外观光滑，无生长裂纹，蜡质中等。'CTC75064-3'植株表现为倒卵形的芽形，芽上的短柔毛处于顶端位置。叶架构竖立，叶尖弯曲。平均叶耳形状为披针形，呈现新月形叶舌。
在6个不同的地点，与亲本品种‘RB867515’相比，评估了平均成熟的茎秆高度(在种植后330收获日(Harvest Day after Planting)-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量；从冠部到叶子插入点测量+1)，茎秆直径(在种植后330收获日-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)，分蘖数(在30、60、90、120、150、180、210、240、270、300和330DAP；在Juazeiro-BA未测量)，重量(在330DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)，糖分含量(BRIX％；在330DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量；榨汁)、开花情况(在整个发展周期期间观察，直到330DAP，除了在Juazeiro，数据收集直到210DAP)和每公顷pol％(甘蔗汁中蔗糖的％)吨数(TPH；在种植后330收获日-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)。计算TPH根据的公式：
TPH＝(Pol％Cana x TCH)/100
对于每个数据集，将所有地点的数据合并进行统计分析。合并的地点分析采用以下统计模型：
yijk＝μ+Gk+(S)i+B(S)ij+(SG)ik+εijk,
其中，yijk为在地点i上经处理k的第j重复的测量值；μ为总体平均值；Si为地点i(i＝1～6)的效应；Bj为第j重复(j＝1～4)的效应；B(S)ij为在地点i的第j重复(j＝1to 4)的效应；Gk为处理k(k＝1～7)的效应；(SG)ik为地点i和处理k之间的交互作用；εijk为地点j和处理k的实验残留误差。
主效应分析和模型交互作用按Kuznetsova等人(2017)的描述进行。所有数据均采用通过lme4包装的混合线性模型(Bates等，2015)进行分析。
农艺和表型特征分析的结果如下方表格所示，并证实了'CTC75064-3'与其亲本品种('RB867515')相似的结论。
表01.对于'CTC75064-3'和'RB867515'亲本品种的农艺和表型特征的平均值。对Barrinha-SP、Piracicaba-SP、Valparaíso-SP、Quirinópolis-GO、
Figure BDA0002770643210000312
-PR和Juazeiro-BA地点的合并分析。从Juazeiro-BA收集的数据是在210DAP，其他地点的数据是在330DAP。
Figure BDA0002770643210000311
Figure BDA0002770643210000321
*转基因事件与亲本品种之间的显著性差异通过按5％水平的t检验(p≤0.05)。SE:标准误差；**范围：在3个商业化参考品种中观察到的平均最小和最大值。
Figure BDA0002770643210000323
未在Juazeiro(BA)进行评估。
已经进行了其他成分性研究，并证明"CTC75064-3"与其亲本品种("RB_867515")高度相似[如经合组织指导文件(经合组织，2011年)定义的与营养和饮食中使用甘蔗有关的成分参数]。基于合并的数据分析的结果(巴西甘蔗种植区的六个代表性地点)，数据表明，与亲本品种RB867515相比，整株植物和茎秆样品中含有的蛋白质Cry1Ac和NPTII不会显著干扰事件CTC75064-3的食品性成分。并且，在评估的11个参数中观察到的成分等同性证实了事件CTC75064-3和亲本品种RB867515之间高度相似的前提。
表02.转基因事件"CTC75064-3"和其传统对应品种"RB867515"中测量的成分参数的平均值。
Figure BDA0002770643210000322
1结果以干重为基础表示；2数值表示甘蔗茎秆中的含量；*转基因事件与亲本品种之间的显著性差异通过按5％水平的t检验(P 0.05)。EP:标准误差；**范围。在个别分析中观察到的3个商业化参考品种的最小和最大平均值。
实施例
实施例1.CTC75064-3事件的产生--农杆菌转化。
事件CTC75064-3是通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)介导的RB867515栽培品种的基因转化获得的。
RB 867515是一个商业杂交品种，是CTC75064-3事件的供体基因型(遗传背景)；也就是说，它代表了CTC75064-3事件的未转化对应物。该品种为中晚熟品种，专门在巴西中南地区种植。与其他商业化甘蔗杂交种一样，它是高倍性材料，具有来自其两个亲本品种(S.officinarum和甘蔗细茎野生种S.spontaneum)的大量染色体(DANIELS和ROACH，1987；SREENIVASAN等人，1987)。
CTC75064-3事件具有cry1Ac基因，其赋予对Diatraea saccharalis的抗性，以及nptII基因，用作选择标记。开发CTC75064-3事件的目的是为了对甘蔗螟虫进行主动性控制。预计在害虫卵孵化在CTC75064-3事件的叶子上后，幼虫开始取食，当摄取Cry1Ac蛋白时，在它们穿透CTC75064-3事件的秆之前就得到控制，如果这样就避免了害虫对作物的经济损害。cry1Ac基因的表达由翻译起始位点上游5'的包含双倍增强型启动子CaMV35s(2xCaMV35s)、小麦前导序列L-Cab、OsACT1内含子和Kozak序列的启动子区调控。nptII基因的表达由玉米泛素基因启动子UBI-1调控，其具有一个内源性内含子。Cry1Ac表达盒使用CaMV 35S终止子，且nptII表达盒使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
1.1使用cry1Ac和nptII基因开发构建体(图5；SEQ ID NO 14)。
使用商业细菌质粒、限制性酶消化和片段连接(用连接酶)的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(图5)。
通过连接2xCaMV35s-cry1Ac-T35s和UBI-nptII-TNOS盒来开发本发明的构建体。使用限制性酶将含有这两种盒的T-DNA从克隆质粒转移到基础质粒(图4:二元质粒载体，其宿主谱中含有大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌)，生成本发明的构建体(图5；SEQ ID NO:14).
在最后的克隆步骤之后，将构建体(SEQ ID NO:14)利用热休克插入到大肠杆菌菌株TOP10中。将含有构建体的分离菌落接种到补充有150μg/ml大观霉素的液体LB培养基中，并在37℃下且以250rpm摇动孵育16小时。然后制备含有细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的贮存品，将其储存在-80℃的超低温冰箱中。
然后，通过分离和纯化质粒DNA，并通过电穿孔转化农杆菌，将本发明的构建体从大肠杆菌转移到根癌农杆菌菌株EHA105。与大肠杆菌菌株一样，将含有农杆菌的细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的存货存放在-80℃的超低温冰箱中。
1.2农杆菌介导的植物转化方法
为了获得胚性愈伤组织，收集在田间或温室中生长长达12个月的幼RB 867515甘蔗叶卷，进行初始外植体的分离。
表面消毒后，在无菌条件下从分生组织上方切取约0.05-5mm厚的横切面。将切片置于愈伤组织诱导培养基[MS–Murashige和Skoog，1962；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、甘露醇、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D]的表面。培养物保持在26±2℃的黑暗中，每隔15天传代培养一次，共3～5个周期，每次7～28天。转化前一周，再次选择愈伤组织的胚胎发生特征(结节、紧凑、不透明、略带黄色)。
由用本发明构建体转化的EHA105菌株组成的农杆菌培养物，从甘油贮藏液开始，在28℃黑暗中保持2～3天。通过在MS液体培养基加乙酰丁香酮中重新悬浮培养制备农杆菌悬浮液，调整至最终OD600为0.1-1.0(MS盐、蔗糖和维生素B5)，用于感染愈伤组织。
目测选出具有胚胎特征的愈伤组织，直接转移到农杆菌悬浮液中，在黑暗中以50转/分的恒定速度持续搅拌，保持30分钟。
在此之后，将愈伤组织从农杆菌悬浮液中分离出来，并去除多余的悬浮液。之后，在半固体培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、柠檬酸、胶凝剂、2,4D和乙酰丁香酮)中，以22℃避光培养1-5天。
共培养后，将愈伤组织转移到DT静息培养基(MS盐；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D、特美汀)中，以26℃避光保持14天。
通过在含有植物调节素和选择剂遗传霉素的选择培养基中进行连续传代培养，选择转化的细胞。(含有遗传霉素的选择培养基：MS盐，蔗糖，维生素B5，选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸，酪蛋白水解物，硫酸铜，甘氨酸，胶凝剂，2,4D，特美汀)。在这种条件下，愈伤组织在26℃避光保持21天，然后将愈伤组织转移到再生培养基(相当于不含2,4D的选择培养基)，然后转移到延伸培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、酪蛋白水解物、胶凝剂、特美汀)。在选择剂存在的情况下，将愈伤组织暴露在4,000勒克斯的16小时光周期下，然后在将它们转移到温室之前进行繁殖、生根和适应。这个过程被用来生成最终创造事件CTC75064-3的克隆。
实施例2.事件CTC75064-3的分子特征
2.1 DNA提取。
使用来自事件CTC75064-3的约10mg叶片组织。根据制造商的说明，在BioSprint96Nucleic Acid Extractor(Quiagen，GER)上用BioSprint 96DNA DNA Plant KitExtraction Kit(Quiagen，GER)进行基因组DNA提取。在Multiskan GO光谱仪(ThermoScientific，USA)中，将DNA归一化为10ng/μL的浓度。
2.2插入宿主植物种质的转基因拷贝数的测定。
通过定量
Figure BDA0002770643210000351
PCR(qPCR/
Figure BDA0002770643210000352
)对插入CTC75064-3事件中的cry1Ac和nptII基因的拷贝数进行初步评估，并经由Southern blot和/或测序确认结果。
Figure BDA0002770643210000353
实时PCR反应是通过7500实时PCR系统(Applied Biosystems，EUA)在Fast模式下实现的。所用引物对和探针见表03。作为cry1Ac和nptII反应的内对照，以确认所用DNA的存在和质量，以及，反应的有效性，在多重模式中使用甘蔗多泛素基因(正向引物：5'ACCATTACCCTGGAGGTTGAGA 3'(SEQ ID NO:15)；反向引物。5'GTCCTGGATCTTCGCCTTCA3'(SEQ ID NO:16)；探针：VIC-5'CTCTGACACCATCGAC 3'-MGB(SEQ ID NO:17)。
表03:用于经由qPCR测定拷贝数的引物和探针
Figure BDA0002770643210000355
Figure BDA0002770643210000354
Figure BDA0002770643210000361
qPCR反应使用1X
Figure BDA0002770643210000362
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每种引物300nM，相应探针200nM。使用的循环是：50℃循环2分钟用于尿嘧啶N-糖基酶活化，95℃循环20秒用于DNA聚合酶活化，95℃3秒(变性)和60℃30秒(退火和延伸)循环40轮。
通过手动输入扩增曲线指数阶段的阈值进行数据分析。对于cry1Ac和nptII基因，拷贝数由DeltaCt(dCt)分析推断，其中内源基因的Ct(扩增产物发出的荧光信号达到阈值的周期)从靶基因的Ct中减去。在这类分析中，在每一个Ct值，拷贝数都被认为加倍，并且数值已知的同一物种的对照拷贝的参考数量作为参照。
因此，这两种检测都指出CTC75064-3事件基因组中cry1Ac基因存在1个拷贝。nptII基因也检测到相同的拷贝数(即1个拷贝)，该基因的检测是基于基因启动子的检测。
对于Southern印迹，按照冷探针标记步骤(Digoxigenin-DIG)，分别用不同的限制性酶(EcoRV、HindIII和Shp)消化来自CTC75064-3事件的10微克基因组DNA。简而言之，按照制造商(Macherey-Nagel GmbH&Co.KG,德国)的推荐，用
Figure BDA0002770643210000372
Plant II试剂盒在试管中提取CTC75064-3事件和亲本品种RB 867515的基因组DNA。在TAE 1X缓冲液(Tris-乙酸EDTA)中的1％琼脂糖凝胶上检查提取的DNA的质量，以及每个样品使用100单位的限制性酶(10U/μg gDNA)消化10μg的DNA，最终反应体积为400μl。
酶解反应按照制造商的建议(Thermo Fisher，美国)进行。消化产物用2体积的乙醇和10％的7.5M醋酸铵沉淀，并在-20℃下孵育48小时，沉淀的DNA在14,000×g离心30分钟，形成的沉淀重悬在35μl的milli-Q水中，直到完全溶解。用1X TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)在1％琼脂糖凝胶上目测消化质量。用EcoRV和HindIII酶检测含有cry1Ac和nptII基因的盒(图23A)。SphI酶用于检测载体骨干(图23B)。
设计了探针以检测存在于CTC75064-3事件中的cry1Ac基因(探针Cry1Ac-1,079bp)、nptII基因(nptII探针579bp)和CaMV 35s启动子区域(CaMV 35s启动子和OsACT1内含子；35S探针-904bp)。用于检测载体片段(骨干)的探针设计在整个载体上，覆盖了约98％的骨干(BB1探针-1,875bp；BB2探针-2,305bp；BB3探针-2,282bp；图23B)。制备探针并用于检测靶标(使用PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂(罗氏，货号#11636090910，瑞士)。将约100pg的线性化载体作为模板，以通过PCR扩增目的区域和引入地高辛分子(DIG)，并将其用作探针。用于制作探针的引物、杂交温度(Thyb)和每个扩增子的预期大小列于表04中。
来自RB 867515品种的DNA被用作阴性对照。作为阳性对照，将含有用于获得事件CTC75064-3的构建的质粒DNA加入到RB 867515基因组DNA中。质粒DNA先前用每个测定中使用的限制性酶线性化。
表04.用于合成用DIG标记的探针的引物清单。
Figure BDA0002770643210000371
Figure BDA0002770643210000381
将消化的DNA转移到尼龙膜上是根据确立完善的程序进行的。简而言之，将消化的DNA在1％琼脂糖凝胶中用TAE 1X缓冲液在40V下电泳约20小时，使用SYBR Safe DNA凝胶染色剂(Invitrogen#S33102，美国)作为嵌合剂(intercalant agent)。然后，将琼脂糖凝胶按以下顺序用四种不同的溶液处理。
·去嘌呤化溶液(1.1％HCL)；10-15分钟。
·变性溶液(0.5N NaOH；1.5M NaCl)；30-40分钟。
·中和液(1.5M NaCl；0.5M Tris)；30-40分钟。
·SSC 20x(盐水柠檬酸钠(Saline Sodium Citrate))；20分钟
根据制造商的说明，使用TurboBlotter Transfer System 20x 25(Sigma#WHA10416324，美国)实施DNA向尼龙膜上的转移。将带有转移的DNA样品的膜置于UV交联设备(UVP-Analytik-Jena，德国)中进行DNA固定(700×100μJ/cm2 2个循环)。然后进行预杂交和杂交。
预杂交处理包括将膜与DIG Easy Hyb溶液(Roche#11603558001，瑞士)在40℃下孵育3小时，与终浓度为100μg.mL-1变性的鲑鱼精子DNA一同，并不断旋转(0.5x g)。之后，用同样的预杂交溶液(DIG Easy Hyb与鲑鱼精子DNA)加入到标有DIG的探针中并变性，进行杂交。所用探针的浓度为65μg.mL-1。杂交温度为50℃。
杂交在杂交炉中进行约16小时，并不断旋转(0.5×g)。杂交后的膜被清洗和封闭。弃去封闭液后，用含有以1∶20000比例稀释的抗地高辛AP片段(Roche#11093274910，瑞士)的新阻断液覆盖膜。然后将膜在室温下孵育30分钟，并轻微摇动。丢弃抗体溶液，并根据制造商的说明，用最终浓度为1X的检测缓冲液(Roche#11585762001，瑞士)加CDP-Star即用型(Roche#12041677001，瑞士)洗涤并孵育膜。加入感光胶片，在与膜接触至少16小时后浸入1x显影液(Kodak#1900943，美国)以显现出条带，检测化学发光。用1x定影液(Kodak#1901875，USA)固定检测到的带状图像。
在与Cry1Ac和35S探针的杂交中，对于用HindIII消化的材料，从CTC75064-3事件的所有样品中观察到了一个约8.5kb的单带(图24左；图25右)。对于相同的探针，用EcoRV消化的样品在所有CTC75064-3事件样品中呈现出一个约2.79kb的片段(图24右；图25左)。对于与nptII探针的杂交，在用HindIII消化的材料中，在CTC75064-3事件的所有样品中观察到了一个具有约3.5kb的预期大小的片段(图26左)。对于EcoRV酶，观察到一个大于12kb的片段(图26右)。
使用EcoRV和HindIII酶与识别cry1Ac、nptII基因和35s启动子的探针相结合的Southern印迹结果证实了使用qPCR发现的结果，这表明CTC75064-3事件在基因组中只有一个携带一个拷贝cry1Ac基因和一个拷贝nptII基因的整合的T-DNA。此外，来自连续营养繁殖世代收集的样本的所有世代的CTC75064-3事件中都存在相同的片段(T0-T3；图24、25和26)，证实了该事件中插入的基因在4代营养繁殖中的遗传稳定性。在CTC75064-3事件中没有检测到载体骨干的序列(图27)。
2.3侧翼序列的定义。
为了分离事件CTC75064-3中存在的T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多次DNA测序实验。由这些实验数据生成的事件CTC75064-3的基因插入图如图3所示。
对T-DNA的两端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。iPCR方法是基于基因组DNA消化，使用酶切割T-DNA序列和随机事件基因组序列。切割产物被环化，并使用已知T-DNA区域的引物进行多重巢式PCR循环(表05)。然后将分离出的片段进行分离、克隆并通过Sanger方法进行测序。最后，组装了侧翼区域的共有(consensus)序列(SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24).
表05.用于进行iPCR(反向PCR)以识别侧翼区域的限制性酶和引物核苷酸序列。
Figure BDA0002770643210000391
Figure BDA0002770643210000401
Figure BDA0002770643210000402
同时，由于目前没有完全测序的基因组可以用作RB867515种质的参考，因此采用了捕获测序方法，作为分离插入到事件CTC75064-3的T-DNA及其侧翼区域的额外努力。在该策略中，开发了小的重叠多核苷酸片段(探针)以覆盖整个T-DNA序列。将这些探针与RB867515和CTC75064-3两个栽培品种的部分分级的基因组DNA杂交，并分离出杂交序列。然后根据标准程序使用
Figure BDA0002770643210000403
技术对分离的片段进行测序。将得到的数据与存在于转化载体中的T-DNA序列进行比对，并与上述iPCR数据一起，得到CTC75064-3事件及其侧翼序列(SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24)的完整T-DNA共有序列(SEQID No:2)。
2.4 CTC75064-3事件的检测和表征方法(事件特异性测定)
为了验证该方法，将非转基因(WT)植物和具有相同构建体的其他转基因事件作为实验对照。如上所述进行DNA提取。
基于T-DNA插入基因组侧翼序列的分子特征，设计并验证了用于识别CTC75064-3事件的实时PCR检测。为了开发特定的检测方法，选择了被称为"加-减(Plus-Minus)"或"存在-不存在(Presence–Absence)"的实时PCR(qPCR)技术，验证了该方法的两种变化：通过SYBR GREENTM和通过
Figure BDA0002770643210000404
技术。特定的引物对已被设计成在两种方法中产生有关T-DNA插入的信息，这样的一个引物结合到构建体中，第二个引物结合到宿主基因组中。对于
Figure BDA0002770643210000405
技术的使用，在引物之间设计了特定的探针。
在一个优选的实施方案中，设计的引物是为SEQ ID No:6至9定义的引物，其中SEQID NO:6的引物为右边界的正向引物，SEQ ID NO:7的引物是右边界的反向引物，SEQ IDNO:8的引物是左边界的正向引物，SEQ ID NO.9的引物是左边界的反向引物(表6)。
在一个优选的实施方案中，
Figure BDA0002770643210000411
PCR技术中采用的探针由在右边界中的SEQ ID NO:10和/或在左边界中的SEQ ID NO:11组成。
Figure BDA0002770643210000412
实时PCR反应使用7500Real-Time PCR System(AppliedBiosystems，美国)在其Fast模式下进行。
甘蔗多泛素基因(内源基因)被用作内部反应对照，以确认所使用DNA的存在和质量。以下试剂可与用于事件的测定方法多重地进行：正向引物(SEQ ID NO:15)；反向引物(SEQ ID NO:16)；探针(SEQ ID NO:17)。
表6.用在实时PCR测定中的引物和探针清单
Figure BDA0002770643210000413
qPCR反应使用1X
Figure BDA0002770643210000414
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每个事件特异性引物为150nM和相应探针为100nM，内源性多泛素基因的引物为200nM，其探针为200nM，DNA100-200ng，以及足够的水加至20μL的体积。使用以下PCR程序：50℃循环2分钟以活化尿嘧啶N-糖基化酶，95℃循环20秒以活化DNA聚合酶，95℃3秒(变性)和60℃30秒(退火和延伸)40个循环。
使用SYBR GREENTM的qPCR反应也使用Real-Time PCR System(AppliedBiosystems，USA)在其标准模式下进行这种类型的检测，以及QuantStudio 6Flex daApplied Biosystems。反应使用1X QuantiFast SYBR GreenTM PCR试剂盒(QIAGENTM)、150nM正向引物和150nM反向引物、20ng DNA和足够的水加至最终体积为25μL。反应使用本发明事件、与本发明事件相同构建体转化的其它事件(阴性对照)、野生型甘蔗(WT，未转化)样品和实验对照(提取和反应空白对照)。
使用以下PCR程序：95℃下5分钟的一个DNA变性循环，35个循环的引物退火循环和95℃下15秒及60℃下1分钟的扩增，以及生成熔解峰的一个解离循环(95℃下15秒，60℃下1分钟，95℃下15秒)。使用SYBR safe的反应不允许使用多重扩增，因此，有必要准备一个单独的内源基因扩增反应，使用相同的DNA以消除假阴性。
因此，可以通过高精度的
Figure BDA0002770643210000421
来验证本发明的事件特异性检测反应，如图6所示。
Figure BDA0002770643210000422
技术探针与DNA特异性结合，并在DNA扩增过程中释放，从而产生设备在此过程中捕获的荧光信号。
对应于本发明事件的样品显示出特异性扩增：具有定义良好的扩增曲线形成和特征性的S形形状；而其他事件、WT以及提取和反应空白的样品没有显示出事件特异性扩增。正如预期的那样，除了提取和反应空白对照外，内源性对照对所有样品都呈现了扩增，这既表明了反应中使用的DNA的质量，也表明了反应和循环的质量。
SYBR GREENTM检测结果显示了事件样品在预期的熔解温度下的特异性扩增。其他事件的样品，以及WT和空白的样品在这个温度下没有达到峰值(图7)。
实施例3.事件CTC75064-3的产生--基因组编辑(GE)
本发明的事件CTC75064-3是使用基因组编辑(GE)方式产生的，从而重现了使用本文所述的优选的农杆菌介导的转化方法产生的事件。
以这种方式，通过将cry1Ac基因插入到与CTC75064-3事件相同的基因组位置来重现CTC75064-3事件，cry1Ac基因的表达由能够以足以控制目标害虫侵染的水平驱动Cry1Ac蛋白表达的启动子或启动子区域和终止子调节。此外，还插入(瞬时或稳定地)标记基因或选择系统以实现事件选择。优选地，将所要求的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)被插入到与CTC75064-3事件相同的基因组位置。因此，通过插入表达控制D.saccharalis的毒素的cry1Ac基因和nptII基因，重现CTC75064-3事件。cry1Ac的表达受翻译起始位点上游5'的双倍增强型启动子CaMV 35S、小麦前导序列L-Cab、OsACT1内含子和Kozak序列组成的启动子区调控。nptII基因的表达受玉米泛素基因启动子UBI-1调控，UBI-1有一个内源性内含子。cry1Ac表达盒具有CaMV35s终止子(T35s)并且nptII表达盒使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
如果上述生成事件CTC75064-3的基因组编辑方法导致T-DNA在靶位点的整合效率低下，可以将发育基因或其他调控元件与GE试剂一起传递，以提高整合效率。
3.1构建体的开发。
使用商业化质粒、限制性酶消化、片段连接(用连接酶)和其它已知方法的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(质粒)。
GE试剂可以在多个质粒上递送，每个质粒包括酶复合体的一个元件(内切酶、crRNA或引导RNA，以及同源重组(HR)模板；图19)。
在一个实施方案中，HR模板构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC75064-3的侧翼序列(SEQ ID Nos:23和24)同源的DNA，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，HR模板构建体包含SEQ ID NO:26(图21)。本发明还包括包含内切酶表达盒的第二构建体。在一个优选的实施方案中，内切酶表达盒包含Cas9内切酶序列。在更优选的实施方案中，Cas9序列是针对甘蔗表达优化的密码子。在一个实施方案中，Cas 9构建体另外包括引导/crRNA序列。优选地，Cas 9构建体包括crRNA序列SEQ IDNO:28.在一个更具体的实施方案中，Cas 9构建体包含SEQ ID NO:27(图20)。本发明中还计划了单独包含引导RNA表达盒的第三构建体，其包含SEQ ID NO:28.
在另外一个实施方案中，基因组编辑构建体包含HR模板、核酸酶和引导RNA表达盒，在单个构建体中递送所有GE试剂。在一个实施方案中，单一构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC75064-3的侧翼序列(SEQ ID Nos:23和24)同源的DNA，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，该构建体包含SEQ ID NO:25(图22)。
可选地，构建体还包括荧光/选择标记和/或其他基因工程系统，以去除标记基因和/或核酸酶盒，例如来自噬菌体P1的Cre/loxP重组系统。在这种情况下，应被删除的标记基因/核酸酶基因盒侧翼是loxP区域，而Cre重组酶在瞬时表达过程中删除该片段。
3.2直接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用直接递送蛋白质、RNA或质粒的方法产生的。直接递送的方法选自由粒子轰击、电穿孔、脂质体转染和原生质体转染组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它递送方法也可以利用。_
3.2.1直接递送-RNP方法
在一个实施方案中，本发明的事件是使用核糖核蛋白(RNP)递送产生的。RNP递送的优选方法选自甘蔗愈伤组织的粒子轰击和原生质体转染组成的组。此外，其他甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于):叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
使用RNP方式进行基因组编辑，内切酶和crRNA或引导RNA以RNP形式递送，与HR模板分开，后者通过质粒递送。
导向RNA可以通过体外转录初步产生，或如同核糖寡核苷酸以化学方式合成，而相应的核酸酶可以通过进一步纯化(细菌表达)在体内产生，或从任何此类产品的制造商购买。在一个优选的实施方案中，该引导RNA包含SEQ ID NO:28.在另一个实施方案中，核酸酶是Cas9核酸酶。
由相应的核酸酶和引导RNA以及HR模板质粒组成的即用核糖核蛋白(RNP)复合物被吸附在金色颗粒上，并直接递送到细胞或组织中。
3.2.2直接递送--质粒法
在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC75064-3的位点定向整合，而无需整合与GE方式相关的额外转基因。
质粒递送的方法选自由甘蔗愈伤组织的粒子轰击(基因枪)或原生质体的聚乙二醇转化组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它方法也可以利用。此外，其它甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
仍然在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂是稳定表达的，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方式，LoxP位点将保留在事件CTC75064-3植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC75064-3植物的基因组中去除GE试剂DNA。
3.3间接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用间接递送质粒的方法产生的，如农杆菌转化。可以使用根癌农杆菌和发根农杆菌。植物病毒也可用于将质粒间接递送至植物细胞和组织。例如，转基因植物双生病毒使得实现更高的转化效率成为可能，特别是在没有稳定插入基因组的情况下。此外，不同的组织和细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：愈伤组织、原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
在一个优选的实施例中，农杆菌转化如实施例1所述进行。
在另一个优选的实施方案中，本发明的事件是通过农杆菌转化使用质粒递送产生的，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC75064-3的位点定向整合，而无需整合与GE方法相关的额外转基因。
GE试剂可以在多个质粒上递送，但优选在单个质粒上递送。在一个优选的实施方案中，构建体是SEQ ID NO:25，包括一个可选择的标记、一个核酸酶、crRNA或引导RNA和同源重组(HR)模板(图22)。HR模板包括包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC75064-3的侧翼序列(SEQ ID Nos:23和24)同源的DNA，位于表达盒的两侧。
在一个优选的实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂稳定表达，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方法，LoxP位点将保留在事件CTC75064-3植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC75064-3植物的基因组中去除GE试剂DNA。
通过上述所有转化过程，所得转化细胞将再生形成含有本发明事件的植物。
3.4分子表征。
使用基因组编辑生成的事件CTC75064-3，对于其T-DNA在基因组的目标位点准确插入情况，使用本发明的引物(SEQ ID NO:6-9)进行评估，如本文说明书中所述。
此外，设计用于扩增事件CTC75064-3侧翼序列中最外侧序列的一对引物得到验证，并可用于评价重组位点的完整性(表07，图28)。
表07.为CTC75064-3侧翼序列设计的引物对。
Figure BDA0002770643210000451
Figure BDA0002770643210000461
PCR反应使用0.2μM引物(表7)，20ngDNA，1X Dream Taq-Thermo Fisher buffer(Thermo Fisher Scientific Inc–美国)，Taq聚合酶(终体积20μL)。反应条件为：在94℃下1分钟一个循环，94℃下15秒、65℃下45秒和72℃下3分钟，35个循环，以及在72℃下7分钟的延伸一个循环。大于2kb的扩增子，反应用1个单位的Takara LA Taq酶–Takara(Takara BioInc-美国)，1X LA PCR缓冲液(Takara Bio Inc-USA),2.5mM MgCl2,2.5mM dNTP,0.5μM引物和200ng的DNA(终体积50μL)进行。
通过表07中的"T-DNA"和"侧翼区域"引物组合进行PCR反应产生的扩增子，可以用Sanger进一步测序，使用表08中所描述的引物对(引物对设计为退火到CTC75064-3事件的T-DNA序列)来确认插入物的完整性。
表08.针对CTC75064-3事件的T-DNA设计的引物对。
Figure BDA0002770643210000462
Figure BDA0002770643210000471
实施例4.对本发明事件中插入的基因表达产物的评价。
使用ELISA和Western印迹法对本发明事件中的基因表达产物进行了详细的表征，以确定Cry1Ac和NptII蛋白的浓度，并确认这些异源蛋白的身份。
(ELISA)酶联免疫吸附测定。
为了经由ELISA评价cry1Ac和nptII基因的表达，在作物发育的不同阶段研究不同的甘蔗组织。为了生产本发明事件和亲本对照的组织样品，进行的实验测试是AGRO/PHENO。
"AGRO/PHENO"试验在亲本对照种植区的6个代表性地点进行，其中3个在圣保罗州(Barrinha、Piracicaba和Valparaíso)，1个在戈亚斯州(Quirinópolis)，1个在巴伊亚州(Juazeiro)，1个在巴拉那州
Figure BDA0002770643210000473
实验采用随机完全分块设计，4组重复。实验地块由4个8米长的行组成，行间距为1.5米。
表09.用于分析本发明事件产生的cry1Ac和nptII基因表达的样品采集的测定信息。(种植后的天数(DAP)表示用于分析的样品采集的时间。)
Figure BDA0002770643210000472
Figure BDA0002770643210000481
在甘蔗植物发育的不同时期，研究了CTC75064-3事件产生的Cry1Ac和NptII蛋白的表达分析。评价的条件是：
·叶片中异源蛋白在CTC75064-3事件的一个栽培周期内的表达(100、200和300DAP)；
·在第一次收获的在330DAP时的甘蔗叶子、茎和根中异源蛋白的表达。在Juazeiro是在210DAP时。
在AGRO/PHENO测定中在100、200、300和330DAP时，在实验处理地块(CTC75064-3和亲本对照-RB 867515)上收集叶子样品。茎和根样品仅在330DAP时收集。在Juazeiro，330DAP样品是210DAP时收集的。采集后，样品被送往ELISA分析，以确定Cry1Ac和NptII蛋白的表达水平。
叶子样品：从5到10片"诊断"叶的顶端收集30厘米的组织，在曲折线2和3上，避免病叶。去除中央肋后，将叶子切成碎片，均质化并包装在先前确定的封口袋中。
茎秆样品。收集了10根整根甘蔗。去掉干叶和尖后，将甘蔗切成小尾状，均质化，装入贴有标签的包装中。
根部样品。从实验地块的第2行和第3行采集有代表性的一丛。将土壤粉碎，用清水洗净根部，去除多余的土壤。然后将干净的根切成碎块，均质化，装入有标签的塑料袋中。
所有样品(来自叶、茎和根组织)在取样15分钟内转移到泡沫塑料箱中的干冰中。如上所述，通过事件特异性检测确认所有团块样品的遗传学身份。
为了分析Cry1Ac蛋白，使用TissueLyser设备浸渍30±1mg叶、200±1mg茎和20±1mg根组织。向浸渍的叶组织中加入750μL补充有Tween 20的生理盐水磷酸盐提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20，pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM，美国)稀释。对于茎秆，使用375μL相同的缓冲液，对于根部样品，加入1,500μL。
对于叶子中NptII蛋白的分析，称重40±1mg并浸渍，对于茎和根样品，称重200±1mg并浸渍。在浸渍后的叶组织样品中，加入750μL提取缓冲液；而在茎和根样品中，加入1500μL同样的缓冲液。本例使用的提取缓冲液为PEB1 1x(pH 7.0)，按厂家说明书(
Figure BDA0002770643210000491
Kit for NPT II,Agdia,USA)进行稀释。
缓冲液加入后，进行旋涡震荡均质化，然后以最大速度离心20分钟。收集所得上清液，用Bradford测定法(Cry1Ac)和BCA(NptII)对总蛋白进行定量。
用于获得校准曲线的标准是与上述试剂盒一起提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用2000、1000、500、250、125和0μg/mL的校准物(在PBST缓冲液中配置)。每种标准校准物10μL，一式三份加入板孔中。独立稀释生成总共6条曲线。对于样品，3个单独的蛋白质提取液在每个孔中使用10μL。然后将200μL的Coomassie Plus ReagentSolution加入到每个含有校准剂和样品的孔中。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(Molecular Device)在595纳米(nm)处读取吸光度。
对每个研究的样品获得一式三份的总蛋白。对每个重复的总蛋白定量后，选择中位定量值变异最小的样品进行ELISA分析。总蛋白定量后，叶片样品按如下稀释：用于Cry1Ac分析的叶片样品稀释2500x，除了100DAP样品被3500x稀释；用于Cry1Ac分析的茎秆样品稀释2500x，而用于Cry1Ac分析的根样品稀释200x，所有用于NptII分析的样品(叶、茎和根)稀释8x。
通过96孔板光谱仪在两种不同波长下读取结果：在SpectraMax Plate reader(Molecular Devices,美国)上以450nm和630nm的波长读取。对于Cry1Ac，使用EnvirologixAP003 CRBS试剂盒进行蛋白质检测和定量。对于NptII使用
Figure BDA0002770643210000492
Kit for NPTII(Agdia，美国)试剂盒。在所有情况下，都遵循制造商的建议。
分析是基于测试样品的吸光度值与通过测量标准曲线的吸光度估计的方程中的预测值的关联。将合成蛋白在PBST缓冲液中稀释至所需浓度。对每个样品进行一式两份的实验分析。Cry1Ac和NptII蛋白的浓度是根据总蛋白(μg/mg)、新鲜组织(μg/g)和干燥组织(μg/g)计算的。
蛋白Cry1Ac和nptII的表达的统计分析结果分别见表10和表11。蛋白质的表达数据来自于一式两份的四组生物重复的平均值(实验田块)。表10列出了收集的一年栽培(100、200和300DAP)的甘蔗叶片中的Cry1Ac蛋白表达数据，按不同地点进行的个体和合并分析的结果。表11显示了在相同条件下，对NptII蛋白的分析结果。
表10.经过一年的栽培(100、200和300DAP；DAP＝种植后的天数)Cry1Ac在CTC75064-3事件的叶子中平均表达水平的比较，对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。在Juazeiro-BA，300DAP时数据不可用。经过5％水平的t检验，后跟相同字母的均值没有差异(p≤0.05)。SE：标准误差。
Figure BDA0002770643210000501
表11:经过一年的栽培(100、200和300DAP)，NptII在CTC75064-3事件的叶子中平均表达水平的比较，对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。在Juazeiro-BA，300DAP时数据在个体和合并分析中都不可用。经过5％水平的t检验，后跟相同字母的均值没有差异(p≤0.05)。SE：标准误差。
Figure BDA0002770643210000502
Figure BDA0002770643210000511
Cry1Ac的表达数据(叶片；μg/g新鲜组织和干燥组织)来自对本发明的事件在6个地点进行一年的甘蔗栽培的合并分析(表10)如图8(单位为μg蛋白/g新鲜组织)和图9(单位为μg蛋白/g干燥组织)所示。本发明的事件在6个地点进行一年的甘蔗栽培中的合并分析(表11)的NptII表达数据(叶片；μg/g新鲜组织和干燥组织)显示在图11(单位为μg蛋白/g新鲜组织)和图12(单位为μg蛋白/g干燥组织)。
在一个甘蔗周期内，所有地点的CTC75064-3事件的叶子中Cry1Ac蛋白的平均表达量为新鲜组织125.18μg/g和干燥组织423.75μg/g(Juazeiro在300DAP时除外——无数据)。对于NptII，在一个甘蔗周期内，所有地点的CTC75064-3事件的叶子中的平均表达量为新鲜组织1.401μg/g和干燥组织6.370μg/g(Juazeiro在300DAP时除外——无数据)。
表12和图10显示了来自在330DAP(Juazeiro为210DAP)时收获的CTC75064-3事件的叶子中Cry1Ac蛋白的表达数据(单位为μg蛋白/g新鲜和干燥组织)。
表12.在330DAP(*210DAP)收获的本发明事件的叶片中Cry1Ac的平均表达量的比较。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000512
Figure BDA0002770643210000521
表13和图13中显示了来自在330DAP(Juazeiro为210DAP)时收获的事件CTC75064-3的叶子中的NptII蛋白表达数据(单位为μg蛋白/g新鲜和干燥组织)。
表13:在330DAP(*210DAP)时收获的本发明事件的叶片中NptII平均表达量的比较。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000522
330DAP时收获的事件CTC75064-3的成熟茎秆中的Cry1Ac蛋白表达数据见表14和图10(μg/g新鲜和干燥组织)。
表14.在330DAP(*210DAP)收获的本发明事件的成熟茎秆中Cry1Ac的平均表达量的比较。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000523
在330DAP时收集的来自本发明的事件的成熟茎秆的NptII蛋白表达数据显示在表15和图13中(μg/g新鲜和干燥组织)。
表15.在330DAP(*210DAP)时收获的本发明事件的成熟茎秆中NptII平均表达量的比较(μg/g新鲜和干燥组织)。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000531
在330DAP时收获的事件CTC75064-3的根中Cry1Ac蛋白表达数据显示在表16和图10中(μg/g新鲜组织和干燥组织)。
表16.在330DAP(*210DAP)下收获的本发明事件的根组织中的Cry1Ac蛋白表达值(μg/g新鲜和干燥组织)。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000532
在330DAP时收集的本发明事件的根中的NptII蛋白表达数据如表17和和图13所示(μg/g新鲜和干燥组织)。
表17.NptII蛋白在本发明事件的根组织中的表达值(μg/g新鲜和干燥组织)。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差).
Figure BDA0002770643210000541
所有地点的CTC75064-3事件的茎秆中Cry1Ac蛋白的平均表达量在新鲜组织中为42.94μg/g，在干燥组织中为173.54μg/g。对于NptII，所有地点的CTC75064-3事件中茎秆的平均表达量为新鲜组织的0.138μg/g和干燥组织的0.558μg/g。
所有地点的CTC75064-3事件的根中Cry1Ac蛋白的平均表达量为新鲜组织的10.21μg/g和干燥组织的46.30μg/g。对于NptII，所有地点CTC75064-3事件的根中的平均表达量为新鲜组织的0.092μg/g和干燥组织的0.422μg/g。
叶、茎和根所得到的结果表明，本发明事件的Cry1Ac蛋白表达水平远高于NptII的表达。
在100DAP时，来自本发明事件的叶子的Cry1Ac的平均浓度低于200和300DAP时的平均浓度。对于NptII，叶片的平均表达水平在整个甘蔗周期中保持不变。
来自CTC75064-3事件的Cry1Ac和NptII蛋白表达水平在330DAP时在叶中的表达水平远高于茎和根。Cry1Ac蛋白的表达数据也显示出茎和根之间的显著差异，根部表现出最低的蛋白表达。对于NptII，蛋白质在茎和根部的平均表达量没有显著差异。
因此得出结论，来自本发明的事件的Cry1Ac和NptII蛋白的表达水平在不同的时间、组织和种植地点是特征性的，都有其在巴西种植的代表性。Cry1Ac蛋白的表达水平，特别是在本发明事件的叶片中，在整个栽培周期内保持较高的水平，保证了抗Diatraeasaccharalis的预期效果。
Western blot
为了鉴定本发明事件所表达的异源蛋白，CryAc使用50mg(±0,5mg)在液氮中冷冻的叶片，NptII使用300(±0,5mg)。在TissueLyser设备中，在25Hz下浸渍10分钟，加入3个钢珠(3mm–Qiagen，DEU)。对浸渍后的组织，加入500μl补充Tween 20的生理盐水磷酸提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20,pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM,USA)稀释。缓冲液加入后，进行旋涡震荡匀浆，并将混合物在4℃下以4,000RPM离心20分钟。收集所得的上清液，并对总蛋白进行定量。对于NptII，蛋白质提取物在继续进行之前被浓缩(
Figure BDA0002770643210000551
Ultra-0.5离心过滤装置(3000NMWL)。
对Cry1Ac和NptII蛋白质的分析所采用的定量根据ThermoScientificTMCoomassiePlus(Bradford)蛋白质检测试剂盒(23236)-微孔板程序和BCA的建议来进行。因此，用于获得校准曲线的标准是上述试剂盒提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用在PBST缓冲液中制备的2000、1000、500、250、125和0μg/ml校准物。将每个标准校准物10μL加入板孔中，一式三份。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(MolecularDevice，美国)在595纳米(nm)处读取吸光度。一旦进行了总蛋白提取，3μg蛋白提取物与2XLaemmli Sample Buffer(Bio-Rad,美国)混合，通过在100℃加热5分钟变性，以鉴定样品中存在Cry1Ac蛋白。在nptII检测和鉴定的情况下，40μg总蛋白提取物与样品缓冲液(2XLaemmli Sample Buffer)混合并变性。
作为异源蛋白存在的阴性对照，从常规亲本品种(WT-RB 867515)中提取3μg蛋白提取物用于CryAc实验，并取40μg用于NptII测定。此外，还准备了阳性对照来检测Cry1Ac和NptII蛋白。第一个阳性对照是用0.5ng的Cry1Ac(约69kDa，GenScript，美国)或NptII(约29kDa，Bon Opus Biosciences，美国)，稀释在从常规亲本品种(WT-RB 867515)叶片中提取的总蛋白溶液中制备的。第二种阳性对照是通过在PBST提取缓冲液中稀释1ng纯化的Cry1Ac蛋白或5ng的NptII蛋白。
将样品变性后应用在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(
Figure BDA0002770643210000552
TGXTMPrecast Gel)上，浸入Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液(Bio-Rad，美国)中，并通过在50V下电泳5分钟，然后在120V下电泳约90分钟而分离。接着，将聚丙烯酰胺凝胶在Tris/甘氨酸转移缓冲液(Bio-Rad，USA)中平衡，加入20％甲醇10-15分钟。PVDF膜用无水甲醇处理。将转移系统安装在装有冷的转移缓冲液的容器中，以在50V的恒定电压下浸泡转移("湿转移")3小时。转移完成后，将膜在4℃下，在不断搅拌下，在封闭液[5％脱脂奶粉(Bio-Rad，美国)和TBS/T(20mM Tris，150mM NaCl，1％Tween20)中封闭16小时，以防止可能的非特异性膜结合。
下一步，用主抗体孵育膜90分钟，以检测和确认Cry1Ac和NptII蛋白的存在和完整性。本测定中使用的多克隆抗体为兔抗-Cry1Ab(Fitzgerald，美国)，可同时结合Cry1Ac和Cry1Ab蛋白；以及兔抗-NptII(Rhea，BRA IM0770-18088)，可与NptII蛋白反应，在TBS/T以1:500稀释(v/v)。
在TBS/T中以3次5分钟(3x5)循环洗涤膜，并与山羊生产的HRP结合的二级抗兔抗体(Sigma Aldrich,美国)孵育，以1:20,000的浓度或以1:5,000的浓度-v/v(Fitzgerald，美国)孵育60分钟。孵育后，再次用TBS/T洗涤膜(3x5分钟)，根据制造商的说明，在AmershamHyperfilm ECL X射线胶片(GE Healthcare，USA)上通过Clarit Western ECL SubstrateKit底物反应(Biorad，USA)验证酶联免疫法。X射线胶片对膜的暴露时间从15秒到3分钟不等。
结果显示，Cry1Ac蛋白的表达谱出现一个约66kDa的免疫反应条带(图14)。所有样品(R1-R4)都是从Piracicaba地点的四个实验地块获得的本发明的事件的生物重复。正如预期的那样，阴性对照(WT)没有显示免疫反应性。阴性对照由从亲本品种提取的总蛋白样品组成。在亲本品种提取的总蛋白中加入Cry1Ac蛋白的阳性对照(WT+CP)，呈现出两条免疫反应带，分别为69和66kDa。在这种情况下(WT+CP)，它通常被称为成对物(doublet)，并被接受为植物叶片中Cry蛋白的细胞内蛋白分解断裂的产物，通常是通过被植物组织处理期间释放的蛋白酶移除末端氨基酸残基而产生的，同样还有显示在样品中的具有更小分子量(约20和10KDa)的其他条带。
nptII选择基因所编码的蛋白质也用western blot法检测。尽管NptII的表达水平低于Cry1Ac蛋白，但western印迹检测表明，在所有本发明的事件的生物重复中都存在预期大小为29kDa的免疫反应带(图15)。
在膜上加入两个阳性对照和一个阴性对照。第一个阳性对照(CP)对应于0.5ng纯化的NptII蛋白(约29kDa，Bon Opus Biosciences,美国)，第二个阳性对照(WT+CP)对应于0.5ng纯化的NptII蛋白稀释在亲本栽培品种的蛋白提取物中。阴性对照对应于亲本栽培品种的蛋白提取物。对应于NptII蛋白的诊断带在两个对照中都以预期的重量存在，并且与本发明的事件中存在的条带相同，确认了其身份。
因此得出结论，通过Western blot证实了本发明的事件表达的Cry1Ac和NptII蛋白的身份。本发明事件表达的蛋白质具有预期的大小，并且没有发现所述事件表达截断/融合蛋白质的证据。
实施例5.生物学试验：对甘蔗螟虫(D.saccharalis)的敏感性。
使用目标害虫D.saccharalis(甘蔗螟虫)的生物测定(bioassays)也可用于检测和表征事件CTC75064-3，证明表达的杀虫蛋白Cry1Ac提供的对害虫的防治效果。在本发明的范围内可以考虑不同的生物测定法：例如，叶盘测定法、网室生物测定法、组织稀释法，等等。
对于叶盘测定，收集事件CTC75064-3植物的叶子，切成16mm2的圆盘，并分布在含有凝胶琼脂的生物测定板中。从培养板的每个孔中侵染了D.saccharalis(0-24h龄)新生体，并在27±1℃、相对湿度60±10％、光周期12:12h(明：暗)下培养7天。孵化结束后，评价存活个体的幼虫死亡率和对幼虫发育的抑制作用，相对功效按下式计算。
Figure BDA0002770643210000571
将存活的幼虫用Digimizer软件(v 4.6.1)进行图像分析，基于头囊(cephaliccapsule)的宽度评估幼虫阶段。未达到第一龄的幼虫被视为死亡。与评估的转基因事件在遗传上非常相似的非转基因甘蔗品种可以用作测定对照。
为了表征事件在实验室中控制目标害虫D.saccharalis的功效，用CTC75064-3事件(30DAP)的植物组织进行叶盘测定。以非转基因甘蔗RB867515作为对照(CTC75-TC)。实验设计是完全随机的，每个处理有四个重复。当比较常规品种(CT75-TC)和CTC75064-3事件在用叶盘喂养7天后，平均观察到98.2％的死亡率。另外，基于头囊宽度的测量，观察到100％的存活个体没有发育到第1龄期以后，证明在用转基因事件喂养后，D.saccharalis的发育受到高度抑制(图18)。
对于组织稀释测定，在Piracicaba、Valparaíso、Barrinha(SP)和Quirinópolis(GO)的Agro/pheno田中对CTC75064-3事件的叶子取样，收集点为100、200和300DAP。这些样品被切碎，在冷冻干燥器中脱水，然后浸渍以获得一致的绿色粉末。为了准备生物测定板，每个象限的16个小室接收稀释25X的样品与MS饮食(多物种)，填充每个小室约1毫升。对于侵染，在每个小室中转移入2新生幼虫(0-24h龄)(32毛虫每象限)。在温度27±1℃、相对湿度60±10％和12:12的光周期(光：暗)下鉴定并孵化10天。孵化结束后，评估每个象限的有效死亡率和幼虫的平均质量。
有效死亡率按以下公式计算：
Figure BDA0002770643210000572
稀释试验的相对效力使用公式计算:
Figure BDA0002770643210000573
通过对Agropheno田地的组织稀释分析，验证有效性，对于无论是有效死亡率还是幼虫的质量减少都是可能的，分别为51％和94％。
对于网室生物测定，将转基因事件的幼苗种植在网室苗圃中，其中将植物种植在与自然环境条件相似的土壤中，但为受控的环境，防止自然侵染的发生。至少进行5次侵染，每分蘖含有20-35个Diatraea saccharalis卵。将所有被感染的茎秆采收并纵向切开，以量化损害，进行评估。侵染强度的计算方法是将有损伤的节间数除以节间总数，结果乘以100(侵染强度)。计算有效损害百分比，考虑昆虫造成损害的节间总数除以地块中评价的总茎数。
进行网室试验，以表征CTC75064-3事件与其亲本品种RB867515(WT；非转基因)相比，在随机块设计中控制螟虫攻击的功效，有4组重复。每个实验地块由8丛甘蔗植株组成，每15天接受10次约30个D.saccharalis卵的人工侵染。8个月后，计算两个品种的侵染强度(II)和有效损害量。相对功效按以下公式计算。
Figure BDA0002770643210000581
在人工侵染下，相比于其非转基因亲本品种RB 867515(对照)，CTC75064-3在控制D.saccharalis侵染方面的相对效力为98.8％，在控制茎秆损伤(长度)方面的相对效力超过99.9％。D.saccharalis对CTC75064-3茎秆造成的损害明显可见地低于常规甘蔗RB867515。在CTC75064-3和非转基因品种RB 867515之间，在所评价的两个参数中都存在统计学差异(t检验，P＜0.05)(df＝16；P＜0.0001)，表明在D.saccharalis大规模侵染下，该事件抑制了害虫造成的损害(图16)。
在甘蔗常规生产上，当侵染强度低于3％时，D.saccharalis被认为是受控制的(Gallo等人，2002)。对于CTC75064-3，侵染强度低于0.01％，加强了事件对其主要目标害虫的控制效果。
除了采用使用人工侵染的生物测定来观察D.saccharalis的侵染程度和造成的损害外，还可以基于直接从种植CTC75064-3的田间收集的信息来观察侵染和损害百分比。例如，可以通过定义实验区域进行茎秆取样切割，并计量节间有损害和无损害的数量来计算侵染强度(II)，而得到自然侵染评价。
在为本发明事件而进行的试验中，计算了四个实验区的侵染强度(II)：Piracicaba、Barrinha和Valparaiso(SP)和Quirinópolis(GO)。常规品种RB 867515(亲本；非转基因)被用作对照。该测定说明了事件CTC75064-3与亲本品种(RB 867515)相比对D.saccharalis侵染的抗性：在所有四个实验区中，与亲本品种(RB 867515)相比，观察到CTC75064-3植物的侵染强度更低(合并分析；图17)。在控制D.saccharalis侵染方面，事件CTC75064-3在所有地点都显示出100％的相对效力，除了Valparaiso之外，它显示出99.1％的效力，非常接近100％。因此，似乎事件CTC75064在控制Diatraea saccharalis上，在4个地点中平均比常规材料更加有效99.7
％(图17)。
在描述了优选实施例之后，应该理解，本发明的范围包括其他可能的变化，并且仅受所附权利要求的内容限制，包括其可能的等同物。
SEQUENCE LISTING
<110> 巴西甘蔗技术中心
<120> 用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC75064-3，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法
<130> P249050-CN
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6570
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含Cry1Ac和nptII基因的转基因构建体
<400> 1
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc ttaattcggg ggatctggat 120
tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 180
tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 240
cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga 300
tcgatcactc agcctcgagg gtggcggtca ctgggatgaa ctcgaacctg tcgatgatca 360
cgccggcggt gccgctgaag ttcctcacgc ccacgatgtt accgagggag gaggtgaaag 420
cgttggcgct ctcgaagtaa ccgaagtcgc tggattggag gttgtccagg gaggtagcgg 480
tagctggcac ggtgttggag aagatggagg agttacccca gttcacgttg aggtggatcg 540
gggtcacgga agcgtacctc acgcgcaccc tgtacctggt ggaggtggat gggaagtgga 600
ttggcacctc gatgtagccc ctgttctgga tgttgttgcc gctgctgttg agcctcacga 660
ggtcgccacc ggtgaagcct gggccggaaa tgacggaacc gttgaagagg aagttgccct 720
tcacggccgg gatttgggtg atgctgtcgg aggcgatgat gttgttgaac tcagcgctgc 780
ggtggatcca ggagaacatc ggagccctga tgatgctcac ggagctgttg ctgaagccgg 840
agcggaacat ggacacgtgg ctcagcctgt gggagaagcc ttgcctgggt ggcacgttgt 900
tgttctgtgg tgggatctcg tccagggagt ccacggtgcc gctcttcctg tagacagcgg 960
atggcaggtt ggaggaggtg ccgtaggcga actcggtgcc gtcgagcacg gacagttgct 1020
ggttgttgat accgatgttg aagggcctcc tgtacagggt ggaggacagg gtcctgtaga 1080
caccctgacc cagttgagcc acgatgcgtt gctgtggagc ggcgttgccc atggtgccgt 1140
agagcgggaa ggtgaactcg gggccgctga agcccactgg ggaggccatg atctggtggc 1200
cggaccagta gtactcgccc ctgtgagcgt cggtgtagat ggtgatgctg ttcaggatgt 1260
ccatcaggtg tgggctcctg atggagccct cgataccctg ggcggaaccg cggaagctac 1320
cgtcgaagtt ctccagcact gggttggtgt agatctccct ggtgagttgg gacacggtgc 1380
ggatcgggta ggtcctggag tcgtagttcg ggaagaggga cacaatgtcc agcacggtga 1440
gggtcaactc cctcctgaac tggttgtacc tgatccagtc cctggagtcc ggaccccaga 1500
cgcgctccag gccggtgttg taccagcgca cagcgtggtc ggtgtagttg ccaatcagcc 1560
tggtcaggtc gttgtagcgg ctgttgatgg tggcagcatc gaagccccac ctttggccga 1620
acacgctcac gtcgcgcagc acgctgaggt gcaggttagc ggcttgcacg tacacggaca 1680
ggagcggcac ttggtagttc tggacggcga acagtgggat agcggtggtc agggcgctgt 1740
tcatgtcgtt gaattgaatg cgcatttcct cgcggagagc tgggttggtc gggtcggcct 1800
cccactccct gaagctctcg gcgtagattt ggtagaggtt gctcaggccc tccagcctgg 1860
agatggcctg gttcctggcg aactcttcga tcctctggtt gatcagctgc tcgatttgca 1920
ccaggaaggc gtcccattgg gatggaccga agatacccca gatgatgtcc accaggccga 1980
gcacgaagcc agcacctggc acgaactcgc tgagcaggaa ctgggtcaag gacagggaga 2040
tgtcgatggg ggtgtaaccg gtctcgatgc gctcgccacc cagcacctcc acctctgggt 2100
tgctcaggca gttgtatggg atgcactcgt tgatgtttgg gttgttgtcc atggcggggt 2160
tgatcaggtt gatcacttct acctacaaaa aagctccgca cgaggctgca tttgtcacaa 2220
atcatgaaaa gaaaaactac cgatgaacaa tgctgaggga ttcaaattct acccacaaaa 2280
agaagaaaga aagatctagc acatctaagc ctgacgaagc agcagaaata tataaaaata 2340
taaaccatag tgcccttttc ccctcttcct gatcttgttt agcacggcgg aaattttaaa 2400
ccccccatca tctcccccaa caacggcgga tcgcagatct acatccgaga gccccattcc 2460
ccgcgagatc cgggccggat ccacgccggc gagagcccca gccgcgagat cccgcccctc 2520
ccgcgcaccg atctgggcgc gcacgaagcc gcctctcgcc cacccaaact accaaggcca 2580
aagatcgaga ccgagacgga aaaaaaaacg gagaaagaaa gaggagaggg gcggggtggt 2640
taccggcggc ggcggaggcc tcccttggat cttatggtgt gttgtccctg tgtgttctcc 2700
aatagtgtgg cttgagtgtg tggaagatgg ttctagagga tctgctagag tcagcttgtc 2760
agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat 2820
agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg 2880
aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 2940
tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc 3000
atttgtagga gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc 3060
aatggaatcc gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca atcggaccat 3120
cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 3180
tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttca acgatggcct 3240
ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg agccaccttc cttttccact atcttcacaa 3300
taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt accctttgtt 3360
gaaaagtctc aatcggacct gtttaaaccc tgaagcttac gcgtatgcct gcagtgcagc 3420
gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 3480
ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 3540
tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 3600
agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 3660
caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 3720
cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 3780
tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 3840
aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 3900
aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 3960
atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 4020
acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 4080
tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 4140
gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 4200
cctcctcctc tcacggcacg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt 4260
cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg 4320
tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct 4380
ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 4440
cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 4500
gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 4560
acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 4620
gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 4680
cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 4740
tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 4800
aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 4860
catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 4920
atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 4980
tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 5040
aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 5100
tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 5160
ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 5220
acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 5280
tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 5340
tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag 5400
gtcgactcta gaatgtggat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 5460
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 5520
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 5580
gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 5640
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 5700
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 5760
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 5820
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 5880
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 5940
gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 6000
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 6060
gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 6120
tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 6180
ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 6240
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 6300
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 6360
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 6420
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggcgcgc caagggcgaa 6480
ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atcgagctcg tcgactctag actcgagggc 6540
gcgccgacag gatatattgg cgggtaaacc 6570
<210> 2
<211> 6524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC75064的T-DNA片段
<400> 2
acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 60
gtactgatat cggtacctta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta 120
ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc 180
ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aattccctta tctgggaact 240
actcacacat tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg atcactcagc ctcgagggtg 300
gcggtcactg ggatgaactc gaacctgtcg atgatcacgc cggcggtgcc gctgaagttc 360
ctcacgccca cgatgttacc gagggaggag gtgaaagcgt tggcgctctc gaagtaaccg 420
aagtcgctgg attggaggtt gtccagggag gtagcggtag ctggcacggt gttggagaag 480
atggaggagt taccccagtt cacgttgagg tggatcgggg tcacggaagc gtacctcacg 540
cgcaccctgt acctggtgga ggtggatggg aagtggattg gcacctcgat gtagcccctg 600
ttctggatgt tgttgccgct gctgttgagc ctcacgaggt cgccaccggt gaagcctggg 660
ccggaaatga cggaaccgtt gaagaggaag ttgcccttca cggccgggat ttgggtgatg 720
ctgtcggagg cgatgatgtt gttgaactca gcgctgcggt ggatccagga gaacatcgga 780
gccctgatga tgctcacgga gctgttgctg aagccggagc ggaacatgga cacgtggctc 840
agcctgtggg agaagccttg cctgggtggc acgttgttgt tctgtggtgg gatctcgtcc 900
agggagtcca cggtgccgct cttcctgtag acagcggatg gcaggttgga ggaggtgccg 960
taggcgaact cggtgccgtc gagcacggac agttgctggt tgttgatacc gatgttgaag 1020
ggcctcctgt acagggtgga ggacagggtc ctgtagacac cctgacccag ttgagccacg 1080
atgcgttgct gtggagcggc gttgcccatg gtgccgtaga gcgggaaggt gaactcgggg 1140
ccgctgaagc ccactgggga ggccatgatc tggtggccgg accagtagta ctcgcccctg 1200
tgagcgtcgg tgtagatggt gatgctgttc aggatgtcca tcaggtgtgg gctcctgatg 1260
gagccctcga taccctgggc ggaaccgcgg aagctaccgt cgaagttctc cagcactggg 1320
ttggtgtaga tctccctggt gagttgggac acggtgcgga tcgggtaggt cctggagtcg 1380
tagttcggga agagggacac aatgtccagc acggtgaggg tcaactccct cctgaactgg 1440
ttgtacctga tccagtccct ggagtccgga ccccagacgc gctccaggcc ggtgttgtac 1500
cagcgcacag cgtggtcggt gtagttgcca atcagcctgg tcaggtcgtt gtagcggctg 1560
ttgatggtgg cagcatcgaa gccccacctt tggccgaaca cgctcacgtc gcgcagcacg 1620
ctgaggtgca ggttagcggc ttgcacgtac acggacagga gcggcacttg gtagttctgg 1680
acggcgaaca gtgggatagc ggtggtcagg gcgctgttca tgtcgttgaa ttgaatgcgc 1740
atttcctcgc ggagagctgg gttggtcggg tcggcctccc actccctgaa gctctcggcg 1800
tagatttggt agaggttgct caggccctcc agcctggaga tggcctggtt cctggcgaac 1860
tcttcgatcc tctggttgat cagctgctcg atttgcacca ggaaggcgtc ccattgggat 1920
ggaccgaaga taccccagat gatgtccacc aggccgagca cgaagccagc acctggcacg 1980
aactcgctga gcaggaactg ggtcaaggac agggagatgt cgatgggggt gtaaccggtc 2040
tcgatgcgct cgccacccag cacctccacc tctgggttgc tcaggcagtt gtatgggatg 2100
cactcgttga tgtttgggtt gttgtccatg gcggggttga tcaggttgat cacttctacc 2160
tacaaaaaag ctccgcacga ggctgcattt gtcacaaatc atgaaaagaa aaactaccga 2220
tgaacaatgc tgagggattc aaattctacc cacaaaaaga agaaagaaag atctagcaca 2280
tctaagcctg acgaagcagc agaaatatat aaaaatataa accatagtgc ccttttcccc 2340
tcttcctgat cttgtttagc acggcggaaa ttttaaaccc cccatcatct cccccaacaa 2400
cggcggatcg cagatctaca tccgagagcc ccattccccg cgagatccgg gccggatcca 2460
cgccggcgag agccccagcc gcgagatccc gcccctcccg cgcaccgatc tgggcgcgca 2520
cgaagccgcc tctcgcccac ccaaactacc aaggccaaag atcgagaccg agacggaaaa 2580
aaaaacggag aaagaaagag gagaggggcg gggtggttac cggcggcggc ggaggcctcc 2640
cttggatctt atggtgtgtt gtccctgtgt gttctccaat agtgtggctt gagtgtgtgg 2700
aagatggttc tagaggatct gctagagtca gcttgtcagc gtgtcctctc caaatgaaat 2760
gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 2820
acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 2880
ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 2940
tcttcaacga tggcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt 3000
tccactatct tcacaataaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg 3060
gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatc ggaccatcac atcaatccac ttgctttgaa 3120
gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 3180
ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca atgatggcat 3240
ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa 3300
tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa aagtctcaat cggacctgtt 3360
taaaccctga agcttacgcg tatgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct 3420
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 3480
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 3540
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 3600
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 3660
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 3720
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 3780
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 3840
gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 3900
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 3960
atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc 4020
gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 4080
ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg 4140
cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcacggca 4200
gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa 4260
atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 4320
acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt 4380
cctccccccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc 4440
cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg 4500
ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca 4560
gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc 4620
atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata 4680
tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga 4740
tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt 4800
ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa 4860
gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat 4920
gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc 4980
gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat 5040
tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa 5100
tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg 5160
catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag 5220
tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata 5280
tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg 5340
tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagaa tgtggattga 5400
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 5460
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 5520
gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 5580
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 5640
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 5700
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 5760
gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 5820
agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 5880
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga 5940
tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt 6000
ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 6060
ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 6120
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 6180
cttctgagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 6240
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 6300
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 6360
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 6420
gtcatctatg ttactagatc ggcgcgccaa gggcgaattc cagcacactg gcggccgtta 6480
ctagtggatc gagctcgtcg actctagact cgagggcgcg ccga 6524
<210> 3
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC75064的甘蔗基因组和插入部分的5'区域之间的接合核苷酸序列
<400> 3
gtgatcctag actttctaga aatcttagga agattactac actttagtta ttcataccaa 60
aaactaattc atagcttaac atgaccaaaa ttgctaatat ttcacaaatt gacgcttaga 120
caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc 180
ttaattcggg ggatctggat tttagt 206
<210> 4
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC75064的甘蔗基因组和插入部分的3'区域之间的接合核苷酸序列
<400> 4
tcatctatgt tactagatcg gcgcgccaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac 60
tagtggatcg agctcgtcga ctctagactc gagggcgcgc cgataccaat ttggacagaa 120
aactgacaag aacttcgaaa atacataatt ggagttctag agacacaaca aaagtgatcc 180
ttaactttat gtaaagctta ttaagt 206
<210> 5
<211> 6729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC75064: 侧翼序列和T-DNA
<400> 5
gtgatcctag actttctaga aatcttagga agattactac actttagtta ttcataccaa 60
aaactaattc atagcttaac atgaccaaaa ttgctaatat ttcacaaatt gacgcttaga 120
caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc 180
ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat 240
tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat 300
gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg 360
gagaaactcg agcttgtcga tcgatcactc agcctcgagg gtggcggtca ctgggatgaa 420
ctcgaacctg tcgatgatca cgccggcggt gccgctgaag ttcctcacgc ccacgatgtt 480
accgagggag gaggtgaaag cgttggcgct ctcgaagtaa ccgaagtcgc tggattggag 540
gttgtccagg gaggtagcgg tagctggcac ggtgttggag aagatggagg agttacccca 600
gttcacgttg aggtggatcg gggtcacgga agcgtacctc acgcgcaccc tgtacctggt 660
ggaggtggat gggaagtgga ttggcactcg atgtagcccc tgttctggat gttgttgccg 720
ctgctgttga gcctcacgag gtcgccaccg gtgaagcctg ggccggaaat gacggaaccg 780
ttgaagagga agttgccctt cacggccggg atttgggtga tgctgtcgga ggcgatgatg 840
ttgttgaact cagcgctgcg gtggatccag gagaacatcg gagccctgat gatgctcacg 900
gagctgttgc tgaagccgga gcggaacatg gacacgtggc tcagcctgtg ggagaagcct 960
tgcctgggtg gcacgttgtt gttctgtggt gggatctcgt ccagggagtc cacggtgccg 1020
ctcttcctgt agacagcgga tggcaggttg gaggaggtgc cgtaggcgaa ctcggtgccg 1080
tcgagcacgg acagttgctg gttgttgata ccgatgttga agggcctcct gtacagggtg 1140
gaggacaggg tcctgtagac accctgaccc agttgagcca cgatgcgttg ctgtggagcg 1200
gcgttgccca tggtgccgta gagcgggaag gtgaactcgg ggccgctgaa gcccactggg 1260
gaggccatga tctggtggcc ggaccagtag tactcgcccc tgtgagcgtc ggtgtagatg 1320
gtgatgctgt tcaggatgtc catcaggtgt gggctcctga tggagccctc gataccctgg 1380
gcggaaccgc ggaagctacc gtcgaagttc tccagcactg ggttggtgta gatctccctg 1440
gtgagttggg acacggtgcg gatcgggtag gtcctggagt cgtagttcgg gaagagggac 1500
acaatgtcca gcacggtgag ggtcaactcc ctcctgaact ggttgtacct gatccagtcc 1560
ctggagtccg gaccccagac gcgctccagg ccggtgttgt accagcgcac agcgtggtcg 1620
gtgtagttgc caatcagcct ggtcaggtcg ttgtagcggc tgttgatggt ggcagcatcg 1680
aagccccacc tttggccgaa cacgctcacg tcgcgcagca cgctgaggtg caggttagcg 1740
gcttgcacgt acacggacag gagcggcact tggtagttct ggacggcgaa cagtgggata 1800
gcggtggtca gggcgctgtt catgtcgttg aattgaatgc gcatttcctc gcggagagct 1860
gggttggtcg ggtcggcctc ccactccctg aagctctcgg cgtagatttg gtagaggttg 1920
ctcaggccct ccagcctgga gatggcctgg ttcctggcga actcttcgat cctctggttg 1980
atcagctgct cgatttgcac caggaaggcg tcccattggg atggaccgaa gataccccag 2040
atgatgtcca ccaggccgag cacgaagcca gcacctggca cgaactcgct gagcaggaac 2100
tgggtcaagg acagggagat gtcgatgggg gtgtaaccgg tctcgatgcg ctcgccaccc 2160
agcacctcca cctctgggtt gctcaggcag ttgtatggga tgcactcgtt gatgtttggg 2220
ttgttgtcca tggcggggtt gatcaggttg atcacttcta cctacaaaaa agctccgcac 2280
gaggctgcat ttgtcacaaa tcatgaaaag aaaaactacc gatgaacaat gctgagggat 2340
tcaaattcta cccacaaaaa gaagaaagaa agatctagca catctaagcc tgacgaagca 2400
gcagaaatat ataaaaatat aaaccatagt gcccttttcc cctcttcctg atcttgttta 2460
gcacggcgga aattttaaac cccccatcat ctcccccaac aacggcggat cgcagatcta 2520
catccgagag ccccattccc cgcgagatcc gggccggatc cacgccggcg agagccccag 2580
ccgcgagatc ccgcccctcc cgcgcaccga tctgggcgcg cacgaagccg cctctcgccc 2640
acccaaacta ccaaggccaa agatcgagac cgagacggaa aaaaaaacgg agaaagaaag 2700
aggagagggg cggggtggtt accggcggcg gcggaggcct cccttggatc ttatggtgtg 2760
ttgtccctgt gtgttctcca atagtgtggc ttgagtgtgt ggaagatggt tctagaggat 2820
ctgctagagt cagcttgtca gcgtgtcctc tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag 2880
gaagggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca 2940
catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc 3000
gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt 3060
cctttatcgc aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata 3120
aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga 3180
aaagtctcaa tcggaccatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct 3240
tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag 3300
gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc 3360
ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt 3420
ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca atcggacctg tttaaaccct gaagcttacg 3480
cgtatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc 3540
atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt 3600
ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact 3660
acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga 3720
caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct 3780
cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc 3840
atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt 3900
ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat 3960
ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa 4020
ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg 4080
ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg 4140
aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca 4200
ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag 4260
ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcacgg cagctacggg ggattccttt 4320
cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca 4380
ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca 4440
aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc 4500
tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt 4560
tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga 4620
tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa 4680
tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg 4740
ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 4800
cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg 4860
tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga 4920
tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat 4980
cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt 5040
tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc 5100
ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg 5160
tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt 5220
atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc 5280
atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt 5340
tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc 5400
tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg 5460
tttggtgtta cttctgcagg tcgactctag aatgtggatt gaacaagatg gattgcacgc 5520
aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 5580
cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 5640
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5700
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5760
ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5820
tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 5880
tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 5940
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 6000
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 6060
cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 6120
tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 6180
tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 6240
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag atcgttcaaa 6300
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 6360
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 6420
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 6480
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 6540
tcggcgcgcc aagggcgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tcgagctcgt 6600
cgactctaga ctcgagggcg cgccgatacc aatttggaca gaaaactgac aagaacttcg 6660
aaaatacata attggagttc tagagacaca acaaaagtga tccttaactt tatgtaaagc 6720
ttattaagt 6729
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物(右侧边界)
<400> 6
caagggcgaa ttccagcac 19
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物(右侧边界)
<400> 7
gttcttgtca gttttctgtc caaa 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物(左侧边界)
<400> 8
catgaccaaa attgctaata tttcac 26
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物(左侧边界)
<400> 9
aatccagtac taaaatccag atccc 25
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针(右侧边界)
<400> 10
ccgttactag tggatcga 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针(左侧边界)
<400> 11
cttaataaca cattgcggac gt 22
<210> 12
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC75064扩增子(右侧边界)
<400> 12
caagggcgaa ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atcgagctcg tcgactctag 60
actcgagggc gcgccgatac caatttggac agaaaactga caagaac 107
<210> 13
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC75064扩增子(左侧边界)
<400> 13
catgaccaaa attgctaata tttcacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc 60
ggacgttttt aatgtactga attagtactg atatcggtac cttaattcgg gggatctgga 120
ttttagtact ggatt 135
<210> 14
<211> 12800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含cry1Ac和nptII基因的二元质粒
<400> 14
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc ttaattcggg ggatctggat 120
tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa 180
tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac 240
cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga 300
tcgatcactc agcctcgagg gtggcggtca ctgggatgaa ctcgaacctg tcgatgatca 360
cgccggcggt gccgctgaag ttcctcacgc ccacgatgtt accgagggag gaggtgaaag 420
cgttggcgct ctcgaagtaa ccgaagtcgc tggattggag gttgtccagg gaggtagcgg 480
tagctggcac ggtgttggag aagatggagg agttacccca gttcacgttg aggtggatcg 540
gggtcacgga agcgtacctc acgcgcaccc tgtacctggt ggaggtggat gggaagtgga 600
ttggcacctc gatgtagccc ctgttctgga tgttgttgcc gctgctgttg agcctcacga 660
ggtcgccacc ggtgaagcct gggccggaaa tgacggaacc gttgaagagg aagttgccct 720
tcacggccgg gatttgggtg atgctgtcgg aggcgatgat gttgttgaac tcagcgctgc 780
ggtggatcca ggagaacatc ggagccctga tgatgctcac ggagctgttg ctgaagccgg 840
agcggaacat ggacacgtgg ctcagcctgt gggagaagcc ttgcctgggt ggcacgttgt 900
tgttctgtgg tgggatctcg tccagggagt ccacggtgcc gctcttcctg tagacagcgg 960
atggcaggtt ggaggaggtg ccgtaggcga actcggtgcc gtcgagcacg gacagttgct 1020
ggttgttgat accgatgttg aagggcctcc tgtacagggt ggaggacagg gtcctgtaga 1080
caccctgacc cagttgagcc acgatgcgtt gctgtggagc ggcgttgccc atggtgccgt 1140
agagcgggaa ggtgaactcg gggccgctga agcccactgg ggaggccatg atctggtggc 1200
cggaccagta gtactcgccc ctgtgagcgt cggtgtagat ggtgatgctg ttcaggatgt 1260
ccatcaggtg tgggctcctg atggagccct cgataccctg ggcggaaccg cggaagctac 1320
cgtcgaagtt ctccagcact gggttggtgt agatctccct ggtgagttgg gacacggtgc 1380
ggatcgggta ggtcctggag tcgtagttcg ggaagaggga cacaatgtcc agcacggtga 1440
gggtcaactc cctcctgaac tggttgtacc tgatccagtc cctggagtcc ggaccccaga 1500
cgcgctccag gccggtgttg taccagcgca cagcgtggtc ggtgtagttg ccaatcagcc 1560
tggtcaggtc gttgtagcgg ctgttgatgg tggcagcatc gaagccccac ctttggccga 1620
acacgctcac gtcgcgcagc acgctgaggt gcaggttagc ggcttgcacg tacacggaca 1680
ggagcggcac ttggtagttc tggacggcga acagtgggat agcggtggtc agggcgctgt 1740
tcatgtcgtt gaattgaatg cgcatttcct cgcggagagc tgggttggtc gggtcggcct 1800
cccactccct gaagctctcg gcgtagattt ggtagaggtt gctcaggccc tccagcctgg 1860
agatggcctg gttcctggcg aactcttcga tcctctggtt gatcagctgc tcgatttgca 1920
ccaggaaggc gtcccattgg gatggaccga agatacccca gatgatgtcc accaggccga 1980
gcacgaagcc agcacctggc acgaactcgc tgagcaggaa ctgggtcaag gacagggaga 2040
tgtcgatggg ggtgtaaccg gtctcgatgc gctcgccacc cagcacctcc acctctgggt 2100
tgctcaggca gttgtatggg atgcactcgt tgatgtttgg gttgttgtcc atggcggggt 2160
tgatcaggtt gatcacttct acctacaaaa aagctccgca cgaggctgca tttgtcacaa 2220
atcatgaaaa gaaaaactac cgatgaacaa tgctgaggga ttcaaattct acccacaaaa 2280
agaagaaaga aagatctagc acatctaagc ctgacgaagc agcagaaata tataaaaata 2340
taaaccatag tgcccttttc ccctcttcct gatcttgttt agcacggcgg aaattttaaa 2400
ccccccatca tctcccccaa caacggcgga tcgcagatct acatccgaga gccccattcc 2460
ccgcgagatc cgggccggat ccacgccggc gagagcccca gccgcgagat cccgcccctc 2520
ccgcgcaccg atctgggcgc gcacgaagcc gcctctcgcc cacccaaact accaaggcca 2580
aagatcgaga ccgagacgga aaaaaaaacg gagaaagaaa gaggagaggg gcggggtggt 2640
taccggcggc ggcggaggcc tcccttggat cttatggtgt gttgtccctg tgtgttctcc 2700
aatagtgtgg cttgagtgtg tggaagatgg ttctagagga tctgctagag tcagcttgtc 2760
agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat 2820
agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg 2880
aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 2940
tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc 3000
atttgtagga gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc 3060
aatggaatcc gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca atcggaccat 3120
cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 3180
tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttca acgatggcct 3240
ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg agccaccttc cttttccact atcttcacaa 3300
taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt accctttgtt 3360
gaaaagtctc aatcggacct gtttaaaccc tgaagcttac gcgtatgcct gcagtgcagc 3420
gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 3480
ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 3540
tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 3600
agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 3660
caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 3720
cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 3780
tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 3840
aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 3900
aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 3960
atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 4020
acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 4080
tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 4140
gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 4200
cctcctcctc tcacggcacg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt 4260
cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg 4320
tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct 4380
ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 4440
cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 4500
gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 4560
acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 4620
gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 4680
cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 4740
tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 4800
aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 4860
catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 4920
atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 4980
tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 5040
aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 5100
tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 5160
ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 5220
acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 5280
tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 5340
tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag 5400
gtcgactcta gaatgtggat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 5460
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 5520
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 5580
gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 5640
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 5700
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 5760
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 5820
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 5880
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 5940
gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 6000
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 6060
gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 6120
tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 6180
ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 6240
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 6300
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 6360
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 6420
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggcgcgc caagggcgaa 6480
ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atcgagctcg tcgactctag actcgagggc 6540
gcgccgacag gatatattgg cgggtaaacc ttagaataac ggatatttaa aagggcgtga 6600
aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc ccctcgggat 6660
caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg 6720
cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc 6780
ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc 6840
gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct gctgggctat 6900
gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc 6960
ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg 7020
gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc 7080
ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg 7140
ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg 7200
ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg 7260
agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc 7320
ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag 7380
gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag 7440
gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag 7500
gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc 7560
aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg 7620
ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg 7680
ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg 7740
agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg 7800
ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat 7860
cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg 7920
cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc 7980
ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc 8040
gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc 8100
gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc 8160
ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca 8220
gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa 8280
aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct 8340
tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt 8400
tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat 8460
taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg 8520
ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca 8580
gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg 8640
aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg 8700
cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg 8760
aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg 8820
aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac 8880
tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa 8940
tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc 9000
ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa 9060
tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca 9120
agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata 9180
gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg 9240
aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca 9300
tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca 9360
tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg 9420
cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag 9480
aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga 9540
acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa 9600
agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg 9660
agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg 9720
atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag 9780
ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt 9840
tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg 9900
aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg 9960
aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg 10020
aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt 10080
acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac 10140
acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa 10200
aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag 10260
ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt 10320
cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc 10380
taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca 10440
ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 10500
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 10560
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 10620
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 10680
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 10740
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 10800
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 10860
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 10920
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 10980
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 11040
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 11100
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 11160
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 11220
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 11280
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 11340
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 11400
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 11460
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 11520
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta 11580
ggtattattt gccaacgacc ttcgtgatct cgcccttgac atagtggaca aattcttcga 11640
gctggtcggc ccgggacgcg agacggtctt cttcttggcc cagataggct tggcgcgctt 11700
cgaggatcac gggctggtat tgcgccggaa ggcgctccat cgcccagtcg gcggcgacat 11760
ccttcggcgc gatcttgccg gtaaccgccg agtaccaaat ccggctcagc gtaaggacca 11820
cattgcgctc atcgcccgcc caatccggcg gggagttcca cagggtcagc gtctcgttca 11880
gtgcttcgaa cagatcctgt tccggcaccg ggtcgaaaag ttcctcggcc gcggggccga 11940
cgagggccac gctatgctcc cgggccttgg tgagcaggat cgccagatca atgtcgatgg 12000
tggccggttc aaagataccc gccagaatat cattacgctg ccattcgccg aactggagtt 12060
cgcgtttggc cggatagcgc caggggatga tgtcatcgtg caccacaatc gtcacctcaa 12120
ccgcgcgcag gatttcgctc tcgccggggg aggcggacgt ttccagaagg tcgttgataa 12180
gcgcgcggcg cgtggtctcg tcgagacgga cggtaacggt gacaagcagg tcgatgtccg 12240
aatggggctt aaggccgccg tcaacggcgc taccatacag atgcacggcg aggagggtcg 12300
gttcgaggtg gcgctcgatg acacccacga cttccgacag ctgggtggac acctcggcga 12360
tgaccgcttc acccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca 12420
agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa 12480
ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac 12540
ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca 12600
acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt 12660
ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg 12720
ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg 12780
gggagctgtt ggctggctgg 12800
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物: 甘蔗多泛素基因
<400> 15
accattaccc tggaggttga ga 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物: 甘蔗多泛素基因
<400> 16
gtcctggatc ttcgccttca 20
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针: 甘蔗多泛素基因
<400> 17
ctctgacacc atcgac 16
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC75064的甘蔗基因组和插入部分的5'区域之间的接合序列
<400> 18
ttgctaatat ttcacaaatt gacgct 26
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC75064的甘蔗基因组和插入部分的3'区域之间的接合序列
<400> 19
gagggcgcgc cgataccaat ttggac 26
<210> 20
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘蔗优化的截断cry1Ac基因(苏云金芽孢杆菌B. thurigiensis)
<400> 20
atggacaaca acccaaacat caacgagtgc atcccataca actgcctgag caacccagag 60
gtggaggtgc tgggtggcga gcgcatcgag accggttaca cccccatcga catctccctg 120
tccttgaccc agttcctgct cagcgagttc gtgccaggtg ctggcttcgt gctcggcctg 180
gtggacatca tctggggtat cttcggtcca tcccaatggg acgccttcct ggtgcaaatc 240
gagcagctga tcaaccagag gatcgaagag ttcgccagga accaggccat ctccaggctg 300
gagggcctga gcaacctcta ccaaatctac gccgagagct tcagggagtg ggaggccgac 360
ccgaccaacc cagctctccg cgaggaaatg cgcattcaat tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ctatcccact gttcgccgtc cagaactacc aagtgccgct cctgtccgtg 480
tacgtgcaag ccgctaacct gcacctcagc gtgctgcgcg acgtgagcgt gttcggccaa 540
aggtggggct tcgatgctgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac caggctgatt 600
ggcaactaca ccgaccacgc tgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtctggggt 660
ccggactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagttgac cctcaccgtg 720
ctggacattg tgtccctctt cccgaactac gactccagga cctacccgat ccgcaccgtg 780
tcccaactca ccagggagat ctacaccaac ccagtgctgg agaacttcga cggtagcttc 840
cgcggttccg cccagggtat cgagggctcc atcaggagcc cacacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgctcac aggggcgagt actactggtc cggccaccag 960
atcatggcct ccccagtggg cttcagcggc cccgagttca ccttcccgct ctacggcacc 1020
atgggcaacg ccgctccaca gcaacgcatc gtggctcaac tgggtcaggg tgtctacagg 1080
accctgtcct ccaccctgta caggaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcaactg 1140
tccgtgctcg acggcaccga gttcgcctac ggcacctcct ccaacctgcc atccgctgtc 1200
tacaggaaga gcggcaccgt ggactccctg gacgagatcc caccacagaa caacaacgtg 1260
ccacccaggc aaggcttctc ccacaggctg agccacgtgt ccatgttccg ctccggcttc 1320
agcaacagct ccgtgagcat catcagggct ccgatgttct cctggatcca ccgcagcgct 1380
gagttcaaca acatcatcgc ctccgacagc atcacccaaa tcccggccgt gaagggcaac 1440
ttcctcttca acggttccgt catttccggc ccaggcttca ccggtggcga cctcgtgagg 1500
ctcaacagca gcggcaacaa catccagaac aggggctaca tcgaggtgcc aatccacttc 1560
ccatccacct ccaccaggta cagggtgcgc gtgaggtacg cttccgtgac cccgatccac 1620
ctcaacgtga actggggtaa ctcctccatc ttctccaaca ccgtgccagc taccgctacc 1680
tccctggaca acctccaatc cagcgacttc ggttacttcg agagcgccaa cgctttcacc 1740
tcctccctcg gtaacatcgt gggcgtgagg aacttcagcg gcaccgccgg cgtgatcatc 1800
gacaggttcg agttcatccc agtgaccgcc accctcgagg ctgagtga 1848
<210> 21
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nptII基因
<400> 21
tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat 60
accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg 120
ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa 180
tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac 240
gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc 300
gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt 360
acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag 420
cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg 480
agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc 540
agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 600
cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac 660
cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 720
tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 780
atcttgttca atccacat 798
<210> 22
<211> 7522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC75064事件: 侧翼序列和T-DNA片段
<400> 22
aacgaggtga caactagggc actacctaga taacaaacac acatacaaca tcacaatcaa 60
gcagtcattt gagaaaattc aaacaaatgg gcttaagcaa ccaacacaag acacaaggct 120
cacccaaaat aagcatttat ctcaagcatg aactaactac aagtttagct caaaacaacg 180
ctagatacgg tagccaactt agcatgtgcc tagaatctgg acagcaacgc agtagttact 240
tgtttcaacc ataactgagg ttatagacat cccacaaagg tgatcctaga ctttctagaa 300
atcttaggaa gattactaca ctttagttat tcataccaaa aactaattca tagcttaaca 360
tgaccaaaat tgctaatatt tcacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg 420
acgtttttaa tgtactgaat tagtactgat atcggtacct taattcgggg gatctggatt 480
ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat 540
acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc 600
ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga gcttgtcgat 660
cgatcactca gcctcgaggg tggcggtcac tgggatgaac tcgaacctgt cgatgatcac 720
gccggcggtg ccgctgaagt tcctcacgcc cacgatgtta ccgagggagg aggtgaaagc 780
gttggcgctc tcgaagtaac cgaagtcgct ggattggagg ttgtccaggg aggtagcggt 840
agctggcacg gtgttggaga agatggagga gttaccccag ttcacgttga ggtggatcgg 900
ggtcacggaa gcgtacctca cgcgcaccct gtacctggtg gaggtggatg ggaagtggat 960
tggcactcga tgtagcccct gttctggatg ttgttgccgc tgctgttgag cctcacgagg 1020
tcgccaccgg tgaagcctgg gccggaaatg acggaaccgt tgaagaggaa gttgcccttc 1080
acggccggga tttgggtgat gctgtcggag gcgatgatgt tgttgaactc agcgctgcgg 1140
tggatccagg agaacatcgg agccctgatg atgctcacgg agctgttgct gaagccggag 1200
cggaacatgg acacgtggct cagcctgtgg gagaagcctt gcctgggtgg cacgttgttg 1260
ttctgtggtg ggatctcgtc cagggagtcc acggtgccgc tcttcctgta gacagcggat 1320
ggcaggttgg aggaggtgcc gtaggcgaac tcggtgccgt cgagcacgga cagttgctgg 1380
ttgttgatac cgatgttgaa gggcctcctg tacagggtgg aggacagggt cctgtagaca 1440
ccctgaccca gttgagccac gatgcgttgc tgtggagcgg cgttgcccat ggtgccgtag 1500
agcgggaagg tgaactcggg gccgctgaag cccactgggg aggccatgat ctggtggccg 1560
gaccagtagt actcgcccct gtgagcgtcg gtgtagatgg tgatgctgtt caggatgtcc 1620
atcaggtgtg ggctcctgat ggagccctcg ataccctggg cggaaccgcg gaagctaccg 1680
tcgaagttct ccagcactgg gttggtgtag atctccctgg tgagttggga cacggtgcgg 1740
atcgggtagg tcctggagtc gtagttcggg aagagggaca caatgtccag cacggtgagg 1800
gtcaactccc tcctgaactg gttgtacctg atccagtccc tggagtccgg accccagacg 1860
cgctccaggc cggtgttgta ccagcgcaca gcgtggtcgg tgtagttgcc aatcagcctg 1920
gtcaggtcgt tgtagcggct gttgatggtg gcagcatcga agccccacct ttggccgaac 1980
acgctcacgt cgcgcagcac gctgaggtgc aggttagcgg cttgcacgta cacggacagg 2040
agcggcactt ggtagttctg gacggcgaac agtgggatag cggtggtcag ggcgctgttc 2100
atgtcgttga attgaatgcg catttcctcg cggagagctg ggttggtcgg gtcggcctcc 2160
cactccctga agctctcggc gtagatttgg tagaggttgc tcaggccctc cagcctggag 2220
atggcctggt tcctggcgaa ctcttcgatc ctctggttga tcagctgctc gatttgcacc 2280
aggaaggcgt cccattggga tggaccgaag ataccccaga tgatgtccac caggccgagc 2340
acgaagccag cacctggcac gaactcgctg agcaggaact gggtcaagga cagggagatg 2400
tcgatggggg tgtaaccggt ctcgatgcgc tcgccaccca gcacctccac ctctgggttg 2460
ctcaggcagt tgtatgggat gcactcgttg atgtttgggt tgttgtccat ggcggggttg 2520
atcaggttga tcacttctac ctacaaaaaa gctccgcacg aggctgcatt tgtcacaaat 2580
catgaaaaga aaaactaccg atgaacaatg ctgagggatt caaattctac ccacaaaaag 2640
aagaaagaaa gatctagcac atctaagcct gacgaagcag cagaaatata taaaaatata 2700
aaccatagtg cccttttccc ctcttcctga tcttgtttag cacggcggaa attttaaacc 2760
ccccatcatc tcccccaaca acggcggatc gcagatctac atccgagagc cccattcccc 2820
gcgagatccg ggccggatcc acgccggcga gagccccagc cgcgagatcc cgcccctccc 2880
gcgcaccgat ctgggcgcgc acgaagccgc ctctcgccca cccaaactac caaggccaaa 2940
gatcgagacc gagacggaaa aaaaaacgga gaaagaaaga ggagaggggc ggggtggtta 3000
ccggcggcgg cggaggcctc ccttggatct tatggtgtgt tgtccctgtg tgttctccaa 3060
tagtgtggct tgagtgtgtg gaagatggtt ctagaggatc tgctagagtc agcttgtcag 3120
cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg aagggtcttg cgaaggatag 3180
tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa 3240
gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 3300
ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca atgatggcat 3360
ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa 3420
tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa aagtctcaat cggaccatca 3480
catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc 3540
gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt 3600
cctttatcgc aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata 3660
aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga 3720
aaagtctcaa tcggacctgt ttaaaccctg aagcttacgc gtatgcctgc agtgcagcgt 3780
gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt 3840
accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata 3900
tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag 3960
agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca 4020
ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct 4080
tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg 4140
gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa 4200
gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa 4260
ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat 4320
ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac 4380
accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc 4440
tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt 4500
cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc 4560
tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc 4620
cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg 4680
ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc 4740
gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg 4800
ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt 4860
gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac 4920
gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt 4980
tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc 5040
cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt 5100
tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa 5160
ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca 5220
tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 5280
gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg 5340
atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa 5400
ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta 5460
cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt 5520
actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac 5580
ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg 5640
atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt 5700
tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt 5760
cgactctaga atgtggattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 5820
ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 5880
gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 5940
cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 6000
ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 6060
agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 6120
ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 6180
agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 6240
tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 6300
gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 6360
catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 6420
ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg 6480
ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 6540
ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt 6600
aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt 6660
taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat 6720
tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta 6780
ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggcgcgcca agggcgaatt 6840
ccagcacact ggcggccgtt actagtggat cgagctcgtc gactctagac tcgagggcgc 6900
gccgatacca atttggacag aaaactgaca agaacttcga aaatacataa ttggagttct 6960
agagacacaa caaaagtgat ccttaacttt atgtaaagct tattaagttg tctataactt 7020
tcttattatc atattaagat gattctacgg ctaacaagga caaacatagc aaagaaaaca 7080
tctctgccgg atttggacag attctgtcat tctactttgc aagctcataa ctagagattt 7140
agaccatcac aattagtgct ataggacatt ttggaaagct tagaaaaagt actacacttc 7200
ttctattatc tctaagacac gattccatat gcacacaggt caaacaaacc aaacattcag 7260
atctattcag aacattgaca aaacctgacc gtaaactttt aaaattcata actctaagct 7320
caagcatgta gtcacactta tttctagtaa agctaagcac acatttttct caagcatttc 7380
ctattcaagc aacatggaac aaagcattct tgtttgactc cacacaagga agataggata 7440
ccacatcact cacaaattac tcatcatttg aacaagggtg agaggagcat agctatgcat 7500
aaggcaacaa tcatgaagat gc 7522
<210> 23
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC75064事件: 侧翼序列 - 左边界(5')
<400> 23
aacgaggtga caactagggc actacctaga taacaaacac acatacaaca tcacaatcaa 60
gcagtcattt gagaaaattc aaacaaatgg gcttaagcaa ccaacacaag acacaaggct 120
cacccaaaat aagcatttat ctcaagcatg aactaactac aagtttagct caaaacaacg 180
ctagatacgg tagccaactt agcatgtgcc tagaatctgg acagcaacgc agtagttact 240
tgtttcaacc ataactgagg ttatagacat cccacaaagg tgatcctaga ctttctagaa 300
atcttaggaa gattactaca ctttagttat tcataccaaa aactaattca tagcttaaca 360
tgaccaaaat tgctaatatt tc 382
<210> 24
<211> 1234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC75064事件: 侧翼序列 - 右边界(3')
<400> 24
taccaatttg gacagaaaac tgacaagaac ttcgaaaata cataattgga gttctagaga 60
cacaacaaaa gtgatcctta actttatgta aagcttatta agttgtctat aactttctta 120
ttatcatatt aagatgattc tacggctaac aaggacaaac atagcaaaga aaacatctct 180
gccggatttg gacagattct gtcattctac tttgcaagct cataactaga gatttagacc 240
atcacaatta gtgctatagg acattttgga aagcttagaa aaagtactac acttcttcta 300
ttatctctaa gacacgattc catatgcaca caggtcaaac aaaccaaaca ttcagatcta 360
ttcagaacat tgacaaaacc tgaccgtaaa cttttaaaat tcataactct aagctcaagc 420
atgtagtcac acttatttct agtaaagcta agcacacatt tttctcaagc atttcctatt 480
caagcaacat accaatttgg acagaaaact gacaagaact tcgaaaatac ataattggag 540
ttctagagac acaacaaaag tgatccttaa ctttatgtaa agcttattaa gttgtctata 600
actttcttat tatcatatta agatgattct acggctaaca aggacaaaca tagcaaagaa 660
aacatctctg ccggatttgg acagattctg tcattctact ttgcaagctc ataactagag 720
atttagacca tcacaattag tgctatagga cattttggaa agcttagaaa aagtactaca 780
cttcttctat tatctctaag acacgattcc atatgcacac aggtcaaaca aaccaaacat 840
tcagatctat tcagaacatt gacaaaacct gaccgtaaac ttttaaaatt cataactcta 900
agctcaagca tgtagtcaca cttatttcta gtaaagctaa gcacacattt ttctcaagca 960
tttcctattc aagcaacatg gaacaaagca ttcttgtttg actccacaca aggaagatag 1020
gataccacat cactcacaaa ttactcatca tttgaacaag ggtgagagga gcatagctat 1080
gcataaggca acaatcatga agatgctgga acaaagcatt cttgtttgac tccacacaag 1140
gaagatagga taccacatca ctcacaaatt actcatcatt tgaacaaggg tgagaggagc 1200
atagctatgc ataaggcaac aatcatgaag atgc 1234
<210> 25
<211> 26041
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9/crRNA/HR模板构建体
<400> 25
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 180
caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 240
gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 300
caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 360
gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 420
caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 480
cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 540
cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 600
cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 660
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 720
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 780
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 840
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 900
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 960
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 1020
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 1080
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 1140
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 1200
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 1260
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 1320
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 1380
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 1440
aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 1500
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 1560
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 1620
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 1680
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 1740
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 1800
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 1860
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 1920
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 1980
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 2040
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 2100
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 2160
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 2220
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 2280
gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt 2340
gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 2400
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 2460
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 2520
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 2580
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 2640
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 2700
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 2760
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 2820
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 2880
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 2940
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 3000
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 3060
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 3120
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 3180
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 3240
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 3300
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 3360
gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 3420
cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 3480
gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 3540
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 3600
aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 3660
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 3720
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 3780
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 3840
ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3900
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 3960
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 4020
catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 4080
cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4140
aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4200
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4260
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4320
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4380
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4440
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4500
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4560
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4620
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4680
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4740
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 4800
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4860
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4920
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4980
tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtattatt tgccaacgac cttcgtgatc 5040
tcgcccttga catagtggac aaattcttcg agctggtcgg cccgggacgc gagacggtct 5100
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aggcgctcca tcgcccagtc ggcggcgaca tccttcggcg cgatcttgcc ggtaaccgcc 5220
gagtaccaaa tccggctcag cgtaaggacc acattgcgct catcgcccgc ccaatccggc 5280
ggggagttcc acagggtcag cgtctcgttc agtgcttcga acagatcctg ttccggcacc 5340
gggtcgaaaa gttcctcggc cgcggggccg acgagggcca cgctatgctc ccgggccttg 5400
gtgagcagga tcgccagatc aatgtcgatg gtggccggtt caaagatacc cgccagaata 5460
tcattacgct gccattcgcc gaactggagt tcgcgtttgg ccggatagcg ccaggggatg 5520
atgtcatcgt gcaccacaat cgtcacctca accgcgcgca ggatttcgct ctcgccgggg 5580
gaggcggacg tttccagaag gtcgttgata agcgcgcggc gcgtggtctc gtcgagacgg 5640
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ctaccataca gatgcacggc gaggagggtc ggttcgaggt ggcgctcgat gacacccacg 5760
acttccgaca gctgggtgga cacctcggcg atgaccgctt cacccattta ttatttcctt 5820
cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5880
attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 5940
tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6000
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6060
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6120
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6180
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6240
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6300
aatgtactga attagtactg ataaatggcg cgccaagctt tggcaaacag ctattatggg 6360
tattatgggt ggtaccacgc gtcgatccac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattcg 6420
cccttggcgc gccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 6480
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 6540
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 6600
ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 6660
ctttattgcc aaatgtttga acgatctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg 6720
atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg 6780
ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc 6840
acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc 6900
ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg 6960
agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga 7020
tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg 7080
tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg 7140
gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc 7200
aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg 7260
cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct gcagttcatt cagggcaccg 7320
gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg 7380
gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa 7440
gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatcc acatggtggt gtgacctgca 7500
gaagtaacac caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat 7560
agcgtatgaa ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa 7620
gtatatcaag atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca 7680
aggttagagc atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc 7740
acatcaacat gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat 7800
gaagatgtat gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa 7860
cagtattcta ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca 7920
accaagcgaa caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata 7980
cctatcctag atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg 8040
cacacacata cagatccaaa attaataaat ccaccaggta gtttgaaaca gaattctact 8100
ccgatctaga acgaccgccc aaccagacca catcatcaca accaagacaa aaaaaagcat 8160
gaaaagatga cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac 8220
caaaccctat gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta 8280
gagccatccc aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg 8340
acgtacaggt cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc 8400
taacacaaac atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat 8460
ctagagaagg tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg 8520
ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg 8580
ttggggaaag agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc 8640
gaaggagcgg tgggaaagga atcccccgta gctgccgtgc cgtgagagga ggaggaggcc 8700
gcctgccgtg ccggctcacg tctgccgctc cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg 8760
agcaagtcca acggtggagc ggaactctcg agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc 8820
cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt 8880
agactcgtcg acggcgttta acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc 8940
cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt tgtttaattt ttagtcactt tattttattc 9000
tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa actaaaatag agttttagtt ttcttaattt 9060
agaggctaaa atagaataaa atagatgtac taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac 9120
cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa tggatgaagt attatatagg tgaagctatt 9180
tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc 9240
aaaatactca attgtccttt agaccatgtc taactgttca tttatatgat tctctaaaac 9300
actgatatta ttgtagtact atagattata ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt 9360
ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt 9420
tataacttag acatgcaatg ctcattatct ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc 9480
actgcaggga tccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 9540
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 9600
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 9660
ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 9720
ctttattgcc aaatgtttga acgatcccta ggacgatctc acttgtacag ctcgtccatg 9780
ccgtgggtga tgccagctgc ggtgacgaac tccagcagga ccatgtggtc gcgcttctcg 9840
ttggggtcct tgctcagagc ggactgggtg ctcaggtagt ggttgtcggg cagcagcacg 9900
ggaccgtcgc cgatgggcgt gttctgctgg tagtggtcgg cgagctggac gctgccgtcc 9960
tcgatgttgt ggcggatctt gaagttgacc ttgatgccgt tcttctgctt gtcagccatg 10020
atgtagacgt tgtggctgtt gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat gttgccgtcc 10080
tccttgaagt cgatgccctt cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc ctcgaacttc 10140
acctcggctc gggtcttgta gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg ctcctggacg 10200
tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc ggggtagcgg 10260
ctgaagcact gcacgccgta ggtgaaggtg gtcacgaggg tgggccaggg cacgggcagc 10320
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catttgtcac aaatcatgaa aagaaaaact accgatgaac aatgctgagg gattcaaatt 10560
ctacccacaa aaagaagaaa gaaagatcta gcacatctaa gcctgacgaa gcagcagaaa 10620
tatataaaaa tataaaccat agtgcccttt tcccctcttc ctgatcttgt ttagcacggc 10680
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atcccgcccc tcccgcgcac cgatctgggc gcgcacgaag ccgcctctcg cccacccaaa 10860
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tgtgtgttct ccaatagtgt ggcttgagtg tgtggaagat ggttctagag gatctgctag 11040
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ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata 11640
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tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat 11760
attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac 11820
tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca 11880
tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct 11940
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tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta 12060
tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact 12120
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cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 13260
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gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 13380
aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 13440
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aggagaccat caccccgtgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgcc tccgctcaga 15180
gcttcatcga gcgcatgacc aacttcgaca agaacctccc taacgagaag gtgctgccaa 15240
agcactccct gctctacgag tacttcaccg tctacaacga gctgaccaag gtgaagtatg 15300
tgaccgaggg catgaggaag cccgccttcc tcagcggcga gcagaagaag gccatcgtgg 15360
acctgctctt caagaccaac cgcaaggtga ccgtcaagca gctgaaggaa gactacttca 15420
agaagatcga gtgcttcgac tccgtggaga tcagcggcgt ggaggaccgc ttcaacgcct 15480
ccctcggcac ctaccacgac ctgctcaaga tcatcaagga caaggacttc ctcgacaacg 15540
aggagaacga ggacatcctg gaggacatcg tgctcaccct gaccctcttc gaggaccgcg 15600
agatgatcga ggagaggctc aagacctacg cccacctgtt cgacgacaag gtcatgaagc 15660
agctgaagag gcgcaggtac actggctggg gccgcctcag caggaagctg atcaacggca 15720
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accgcaactt catgcagctc atccacgacg actccctgac cttcaaggaa gacatccaga 15840
aggctcaggt gtccggccag ggcgacagcc tccacgagca catcgctaac ctggcgggca 15900
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cccagaaggg tcagaagaac tcccgcgaga ggatgaagag gatcgaggaa ggcatcaagg 16080
agctgggcag ccagatcctg aaggagcacc cggtggagaa cacccagctc cagaacgaga 16140
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acagcatcga caacaaggtg ctgacccgca gcgacaagaa caggggcaag tccgacaacg 16320
tcccaagcga ggaagtggtc aagaagatga agaactactg gcgccagctg ctcaacgcca 16380
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ctcaggtgaa catcgtcaag aagaccgagg tccagaccgg cggcttctcc aaggagagca 17040
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gcaagaggat gctcgcctcc gctggcgagc tgcagaaggg caacgagctg gccctcccgt 17400
ccaagtatgt gaacttcctg tacctcgcct cccactacga gaagctgaag ggcagccccg 17460
aggacaacga gcagaagcag ctcttcgtcg agcagcacaa gcactacctg gacgagatca 17520
tcgagcagat cagcgagttc agcaagcgcg tgatcctcgc cgacgccaac ctcgacaagg 17580
tcctgtccgc ctacaacaag caccgcgaca agcctatcag ggagcaggcc gagaacatca 17640
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ccatcgaccg caagaggtac accagcacca aggaagtgct ggacgccacc ctgatccacc 17760
agtccatcac cggcctgtac gagactcgca tcgacctcag ccagctgggc ggcgacccga 17820
agaagaagcg caaagtctga gggaccctcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat 17880
gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga 17940
gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt 18000
ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc ccccgaatta acctgcaggg 18060
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acaagtagat actgacattt gagaagagct tctgaactgt tattagtaac aaaaatggaa 18180
agctgatgca cggaaaaagg aaagaaaaag ccatactttt ttttaggtag gaaaagaaaa 18240
agccatacga gactgatgtc tctcagatgg gccgggatct gtctatctag caggcagcag 18300
ccctaccaac ctcacgggcc agcaattacg agtccttcta aaacgtcccg ccgagggcgc 18360
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ggtgacaact agggcactac ctagataaca aacacacata caacatcaca atcaagcagt 18660
catttgagaa aattcaaaca aatgggctta agcaaccaac acaagacaca aggctcaccc 18720
aaaataagca tttatctcaa gcatgaacta actacaagtt tagctcaaaa caacgctaga 18780
tacggtagcc aacttagcat gtgcctagaa tctggacagc aacgcagtag ttacttgttt 18840
caaccataac tgaggttata gacatgccac aaaggtgatc ctagactttc tagaaatctt 18900
aggaagatta ctacacttta gttattcata ccaaaaacta attcatagct taacatgacc 18960
aaaattgcta atatttcaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt 19020
tttaatgtac tgaattagta ctgatatcgg taccttaatt cgggggatct ggattttagt 19080
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tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa ctcgagcttg tcgatcgatc 19260
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gataccgatg ttgaagggcc tcctgtacag ggtggaggac agggtcctgt agacaccctg 20040
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gtagtactcg cccctgtgag cgtcggtgta gatggtgatg ctgttcagga tgtccatcag 20220
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gtaggtcctg gagtcgtagt tcgggaagag ggacacaatg tccagcacgg tgagggtcaa 20400
ctccctcctg aactggttgt acctgatcca gtccctggag tccggacccc agacgcgctc 20460
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cacgtcgcgc agcacgctga ggtgcaggtt agcggcttgc acgtacacgg acaggagcgg 20640
cacttggtag ttctggacgg cgaacagtgg gatagcggtg gtcagggcgc tgttcatgtc 20700
gttgaattga atgcgcattt cctcgcggag agctgggttg gtcgggtcgg cctcccactc 20760
cctgaagctc tcggcgtaga tttggtagag gttgctcagg ccctccagcc tggagatggc 20820
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ggcgtcccat tgggatggac cgaagatacc ccagatgatg tccaccaggc cgagcacgaa 20940
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gttgatcact tctacctaca aaaaagctcc gcacgaggct gcatttgtca caaatcatga 21180
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agaaagatct agcacatcta agcctgacga agcagcagaa atatataaaa atataaacca 21300
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tcatctcccc caacaacggc ggatcgcaga tctacatccg agagccccat tccccgcgag 21420
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ccgatctggg cgcgcacgaa gccgcctctc gcccacccaa actaccaagg ccaaagatcg 21540
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ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 21900
actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 21960
ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa 22020
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tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 22800
ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 22860
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cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 23340
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gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 23460
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gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg 23760
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tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 23940
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tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc 24180
tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 24240
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acactggcgg ccgttactag tggatcgagc tcgtcgactc tagactcgag ggcgcgccga 25500
taccaatttg gacagaaaac tgacaagaac ttcgaaaata cataattgga gttctagaga 25560
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gatcgagctc gtcgactcta gactcgaggg cgcgcctgac aggatatatt ggcgggtaaa 26040
c 26041
<210> 26
<211> 16771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HR_模板构建体
<400> 26
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 180
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cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 720
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gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 840
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accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 1080
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 1140
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 1200
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aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 1500
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 1560
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 1620
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 1680
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cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 1920
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cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 2040
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ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 2640
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 2700
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 2760
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 2820
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 2880
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 2940
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 3000
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 3060
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 3120
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 3180
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 3240
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 3300
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 3360
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gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 3540
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 3600
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gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 3720
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tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 3840
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catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 4080
cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4140
aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4200
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cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4440
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4500
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4560
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4620
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4680
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4740
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 4800
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4860
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tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtattatt tgccaacgac cttcgtgatc 5040
tcgcccttga catagtggac aaattcttcg agctggtcgg cccgggacgc gagacggtct 5100
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gagtaccaaa tccggctcag cgtaaggacc acattgcgct catcgcccgc ccaatccggc 5280
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gggtcgaaaa gttcctcggc cgcggggccg acgagggcca cgctatgctc ccgggccttg 5400
gtgagcagga tcgccagatc aatgtcgatg gtggccggtt caaagatacc cgccagaata 5460
tcattacgct gccattcgcc gaactggagt tcgcgtttgg ccggatagcg ccaggggatg 5520
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gaggcggacg tttccagaag gtcgttgata agcgcgcggc gcgtggtctc gtcgagacgg 5640
acggtaacgg tgacaagcag gtcgatgtcc gaatggggct taaggccgcc gtcaacggcg 5700
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acttccgaca gctgggtgga cacctcggcg atgaccgctt cacccattta ttatttcctt 5820
cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5880
attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 5940
tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6000
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6060
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gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6240
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6300
aatgtactga attagtactg ataaatggcg cgccaagctt tggcaaacag ctattatggg 6360
tattatgggt ggtaccacgc gtcggatccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga 6420
taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg 6480
cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat 6540
tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 6600
attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tccctaggac gatctcactt 6660
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ctcaacaata gtgtaatcct cgttatggct agtaatatcc agcttagtat ccacgtagta 6780
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gctgccagtg gagccagtgc cgtggccgag gaacaggtgg tgcctgccct cgctgcgctc 7440
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ctcccacttg aagccctcgg ggaaggacag cttcttgtag tcggggatgt cggccgggtg 7860
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ctcgccctcg ccctcgatct cgaactcgtg gccgttcatg ctgccctcca tcctcacctt 8040
gaagcgcatg aactccttga tcacttcctc gcccttggac accactacaa aaaagctccg 8100
cacgaggctg catttgtcac aaatcatgaa aagaaaaact accgatgaac aatgctgagg 8160
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gcagcagaaa tatataaaaa tataaaccat agtgcccttt tcccctcttc ctgatcttgt 8280
ttagcacggc ggaaatttta aaccccccat catctccccc aacaacggcg gatcgcagat 8340
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cccacccaaa ctaccaaggc caaagatcga gaccgagacg gaaaaaaaaa cggagaaaga 8520
aagaggagag gggcggggtg gttaccggcg gcggcggagg cctcccttgg atcttatggt 8580
gtgttgtccc tgtgtgttct ccaatagtgt ggcttgagtg tgtggaagat ggttctagag 8640
gatctgctag agtcagcttg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 8700
gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata 8760
tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 8820
ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc 8880
tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca 8940
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tgaaaagtct caatcggacc atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 9060
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gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct 9180
tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 9240
tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatcggac cccctcagcc tgcacctcga 9300
ggaagtctag gatcaccttt gtgggaacga ggtgacaact agggcactac ctagataaca 9360
aacacacata caacatcaca atcaagcagt catttgagaa aattcaaaca aatgggctta 9420
agcaaccaac acaagacaca aggctcaccc aaaataagca tttatctcaa gcatgaacta 9480
actacaagtt tagctcaaaa caacgctaga tacggtagcc aacttagcat gtgcctagaa 9540
tctggacagc aacgcagtag ttacttgttt caaccataac tgaggttata gacataccac 9600
aaaggtgatc ctagactttc tagaaatctt aggaagatta ctacacttta gttattcata 9660
ccaaaaacta attcatagct taacatgacc aaaattgcta atatttcaca aattgacgct 9720
tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattagta ctgatatcgg 9780
taccttaatt cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt 9840
ttattgatag aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac 9900
acatgagcga aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat 9960
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tgttaccgag ggaggaggtg aaagcgttgg cgctctcgaa gtaaccgaag tcgctggatt 10140
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cctggtgagt tgggacacgg tgcggatcgg gtaggtcctg gagtcgtagt tcgggaagag 11100
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aagcttatta agttgtctat aactttctta ttatcatatt aagatgattc tacggctaac 16380
aaggacaaac atagcaaaga aaacatctct gccggatttg gacagattct gtcattctac 16440
tttgcaagct cataactaga gatttagacc atcacaatta gtgctatagg acattttgga 16500
aagcttagaa aaagtactac acttcttcta ttatctctaa gacacgattc catatgcaca 16560
caggtcaaac aaaccaaaca ttcagatcta ttcagaacat tgacaaaacc tgcccacaaa 16620
ggtgatccta gacttggtac cactagtatt aattaagttt aaacggcgcg ccaagggcga 16680
attccagcac actggcggcc gttactagtg gatcgagctc gtcgactcta gactcgaggg 16740
cgcgcctgac aggatatatt ggcgggtaaa c 16771
<210> 27
<211> 18754
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9/crRNA模板构建体
<400> 27
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 180
caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 240
gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 300
caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 360
gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 420
caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 480
cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 540
cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 600
cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 660
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 720
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 780
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 840
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 900
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 960
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 1020
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 1080
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 1140
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 1200
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 1260
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 1320
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 1380
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 1440
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gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 1560
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 1620
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 1680
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 1740
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 1800
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 1860
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 1920
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 1980
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 2040
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 2100
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 2160
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 2220
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 2280
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gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 2400
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 2460
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 2520
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 2580
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 2640
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 2700
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 2760
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gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 2940
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 3000
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 3060
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 3120
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 3180
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cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 3300
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 3360
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cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 3480
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aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 3660
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 3720
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 3780
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 3840
ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3900
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ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4320
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gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 6540
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ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 6660
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acatcaacat gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat 7800
gaagatgtat gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa 7860
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accaagcgaa caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata 7980
cctatcctag atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg 8040
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ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt 9420
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ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata 11640
ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatcggac cccctcagcc tgcagtgcag cgtgacccgg 11700
tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat 11760
attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac 11820
tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca 11880
tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct 11940
acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta 12000
tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta 12060
tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact 12120
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gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt 12240
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aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 13440
catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 13500
ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 13560
atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 13620
tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca ggcgatcgcc 13680
acaccaccat gccgaagaag aagcgcaagg tcatggacaa gaagtactcc atcggcctgg 13740
acatcggcac caacagcgtg ggctgggccg tcatcaccga cgagtacaag gtgccctcca 13800
agaagttcaa ggtcctcggc aacaccgaca ggcacagcat caagaagaac ctgatcggcg 13860
ccctgctgtt cgactccggc gagactgcgg aggctaccag gctgaagcgc actgctcgca 13920
ggcgctacac caggcgcaag aaccgcatct gctacctcca ggagattttc tccaacgaga 13980
tggccaaggt ggacgactcc ttcttccacc gcctggagga gagcttcctg gtcgaggaag 14040
acaagaagca cgagcgccac cctatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtc gcctaccacg 14100
agaagtaccc aaccatctac cacctccgca agaagctggt ggactccacc gacaaggccg 14160
acctgaggct catctacctg gccctcgccc acatgatcaa gttccgcggc cacttcctca 14220
tcgagggcga cctgaacccg gacaacagcg acgtggacaa gctcttcatc cagctggtcc 14280
agacctacaa ccagctgttc gaggagaacc ccatcaacgc ctccggcgtg gacgctaagg 14340
ctatcctcag cgctaggctg tccaagagca ggcgcctgga gaacctcatc gcccagctcc 14400
cgggcgagaa gaagaacggc ctcttcggca acctgatcgc tctgtccctc ggcctgaccc 14460
ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggacgccaa gctccagctg tccaaggaca 14520
cctacgacga cgacctcgac aacctgctcg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctct 14580
tcctggccgc caagaacctc tccgacgcca tcctgctcag cgacatcctg agggtgaaca 14640
ccgagatcac caaggccccg ctgtccgcca gcatgatcaa gcgctacgac gagcaccacc 14700
aggacctcac tctcctgaag gccctcgtcc gccagcagct gcccgagaag tacaaggaga 14760
ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg cgggctacat cgatggcggc gcctcccagg 14820
aagagttcta caagttcatc aagcctatcc tggagaagat ggacggcacc gaggagctgc 14880
tcgtgaagct gaaccgcgag gacctgctcc gcaagcagag gaccttcgac aacggcagca 14940
tccctcacca gatccacctg ggcgagctgc acgctatcct ccgccgccag gaagacttct 15000
acccattcct gaaggacaac cgcgagaaga tcgagaagat cctcaccttc cgcatcccgt 15060
actacgtggg ccccctggcc cgcggcaact ccaggttcgc ctggatgacc aggaagagcg 15120
aggagaccat caccccgtgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgcc tccgctcaga 15180
gcttcatcga gcgcatgacc aacttcgaca agaacctccc taacgagaag gtgctgccaa 15240
agcactccct gctctacgag tacttcaccg tctacaacga gctgaccaag gtgaagtatg 15300
tgaccgaggg catgaggaag cccgccttcc tcagcggcga gcagaagaag gccatcgtgg 15360
acctgctctt caagaccaac cgcaaggtga ccgtcaagca gctgaaggaa gactacttca 15420
agaagatcga gtgcttcgac tccgtggaga tcagcggcgt ggaggaccgc ttcaacgcct 15480
ccctcggcac ctaccacgac ctgctcaaga tcatcaagga caaggacttc ctcgacaacg 15540
aggagaacga ggacatcctg gaggacatcg tgctcaccct gaccctcttc gaggaccgcg 15600
agatgatcga ggagaggctc aagacctacg cccacctgtt cgacgacaag gtcatgaagc 15660
agctgaagag gcgcaggtac actggctggg gccgcctcag caggaagctg atcaacggca 15720
tcagggacaa gcagtccggc aagaccatcc tggacttcct caagagcgac ggcttcgcca 15780
accgcaactt catgcagctc atccacgacg actccctgac cttcaaggaa gacatccaga 15840
aggctcaggt gtccggccag ggcgacagcc tccacgagca catcgctaac ctggcgggca 15900
gccctgccat caagaagggc atcctccaga ccgtgaaggt ggtggacgag ctggtgaagg 15960
tcatgggccg ccacaagcca gagaacatcg tcatcgagat ggccagggag aaccagacca 16020
cccagaaggg tcagaagaac tcccgcgaga ggatgaagag gatcgaggaa ggcatcaagg 16080
agctgggcag ccagatcctg aaggagcacc cggtggagaa cacccagctc cagaacgaga 16140
agctgtacct ctactacctg cagaacggcc gcgacatgta tgtggaccag gagctggaca 16200
tcaacaggct gtccgactac gacgtggacc acatcgtccc tcagtccttc ctcaaggacg 16260
acagcatcga caacaaggtg ctgacccgca gcgacaagaa caggggcaag tccgacaacg 16320
tcccaagcga ggaagtggtc aagaagatga agaactactg gcgccagctg ctcaacgcca 16380
agctcatcac ccagcgcaag ttcgacaacc tgactaaggc ggagaggggc ggcctgtccg 16440
agctggacaa ggctggcttc atcaagcgcc agctcgtgga gaccaggcag atcaccaagc 16500
acgtcgccca gatcctggac agcaggatga acaccaagta cgacgagaac gacaagctca 16560
tccgcgaggt gaaggtcatc accctcaagt ccaagctggt gagcgacttc cgcaaggact 16620
tccagttcta caaggtcagg gagatcaaca actaccacca cgcccacgat gcttacctca 16680
acgcggtggt gggcaccgcc ctcatcaaga agtaccctaa gctggagagc gagttcgtgt 16740
acggcgacta caaggtgtac gacgtccgca agatgatcgc caagtccgag caggagatcg 16800
gcaaggccac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaacttcttc aagaccgaga 16860
tcaccctcgc caacggcgag atccgcaaga ggccactgat cgagaccaac ggcgagactg 16920
gcgagatcgt gtgggacaag ggcagggact tcgccaccgt gaggaaggtc ctgtccatgc 16980
ctcaggtgaa catcgtcaag aagaccgagg tccagaccgg cggcttctcc aaggagagca 17040
tcctcccaaa gcgcaacagc gacaagctga tcgccaggaa gaaggactgg gacccgaaga 17100
agtacggtgg cttcgactcc cctactgtgg cttacagcgt cctggtggtc gccaaggtgg 17160
agaagggcaa gtccaagaag ctgaagagcg tcaaggagct gctcggcatc accatcatgg 17220
agaggtccag cttcgagaag aacccgatcg acttcctgga ggccaagggc tacaaggaag 17280
tgaagaagga cctgatcatc aagctgccca agtacagcct gttcgagctg gagaacggcc 17340
gcaagaggat gctcgcctcc gctggcgagc tgcagaaggg caacgagctg gccctcccgt 17400
ccaagtatgt gaacttcctg tacctcgcct cccactacga gaagctgaag ggcagccccg 17460
aggacaacga gcagaagcag ctcttcgtcg agcagcacaa gcactacctg gacgagatca 17520
tcgagcagat cagcgagttc agcaagcgcg tgatcctcgc cgacgccaac ctcgacaagg 17580
tcctgtccgc ctacaacaag caccgcgaca agcctatcag ggagcaggcc gagaacatca 17640
tccacctgtt caccctcacc aacctgggcg ccccagctgc cttcaagtac ttcgacacca 17700
ccatcgaccg caagaggtac accagcacca aggaagtgct ggacgccacc ctgatccacc 17760
agtccatcac cggcctgtac gagactcgca tcgacctcag ccagctgggc ggcgacccga 17820
agaagaagcg caaagtctga gggaccctcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat 17880
gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga 17940
gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt 18000
ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc ccccgaatta acctgcaggg 18060
gcggcaggga gagttttaac attgactagc gtgctgataa tttgtgagaa ataataattg 18120
acaagtagat actgacattt gagaagagct tctgaactgt tattagtaac aaaaatggaa 18180
agctgatgca cggaaaaagg aaagaaaaag ccatactttt ttttaggtag gaaaagaaaa 18240
agccatacga gactgatgtc tctcagatgg gccgggatct gtctatctag caggcagcag 18300
ccctaccaac ctcacgggcc agcaattacg agtccttcta aaacgtcccg ccgagggcgc 18360
gtggccgtgc tgtgcagcag cacgtctaac attagtccca cctcgccagt ttacagggag 18420
cagaaccagc ttataagcgg aggcgcggca ccaagaagca aagtctagga tcacctttgt 18480
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 18540
ggcaccgagt cggtgctttt ttttcctcga ggggcgatag gaacacgtac aacggccgtt 18600
gtacgtgttc ctatcgccgg taccactagt attaattaag tttaaacggc gcgccaaggg 18660
cgaattccag cacactggcg gccgttacta gtggatcgag ctcgtcgact ctagactcga 18720
gggcgcgcct gacaggatat attggcgggt aaac 18754
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9 - crRNA
<400> 28
aagtctagga tcacctttgt 20
<210> 29
<211> 7519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 22的互补序列 (反向-互补)
<400> 29
gcatcttcat gattgttgcc ttatgcatag ctatgctcct ctcacccttg ttcaaatgat 60
gagtaatttg tgagtgatgt ggtatcctat cttccttgtg tggagtcaaa caagaatgct 120
ttgttccatg ttgcttgaat aggaaatgct tgagaaaaat gtgtgcttag ctttactaga 180
aataagtgtg actacatgct tgagcttaga gttatgaatt ttaaaagttt acggtcaggt 240
tttgtcaatg ttctgaatag atctgaatgt ttggtttgtt tgacctgtgt gcatatggaa 300
tcgtgtctta gagataatag aagaagtgta gtactttttc taagctttcc aaaatgtcct 360
atagcactaa ttgtgatggt ctaaatctct agttatgagc ttgcaaagta gaatgacaga 420
atctgtccaa atccggcaga gatgttttct ttgctatgtt tgtccttgtt agccgtagaa 480
tcatcttaat atgataataa gaaagttata gacaacttaa taagctttac ataaagttaa 540
ggatcacttt tgttgtgtct ctagaactcc aattatgtat tttcgaagtt cttgtcagtt 600
ttctgtccaa attggtatcg gcgcgccctc gagtctagag tcgacgagct cgatccacta 660
gtaacggccg ccagtgtgct ggaattcgcc cttggcgcgc cgatctagta acatagatga 720
caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta 780
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta 840
catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag 900
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatctcagaa 960
gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta 1020
aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc 1080
caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga 1140
aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag 1200
atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc 1260
ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc 1320
tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg 1380
cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga 1440
caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac 1500
aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc 1560
ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg 1620
cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca 1680
gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg 1740
ttcaatccac attctagagt cgacctgcag aagtaacacc aaacaacagg gtgagcatcg 1800
acaaaagaaa cagtaccaag caaataaata gcgtatgaag gcagggctaa aaaaatccac 1860
atatagctgc tgcatatgcc atcatccaag tatatcaaga tcaaaataat tataaaacat 1920
acttgtttat tataatagat aggtactcaa ggttagagca tatgaataga tgctgcatat 1980
gccatcatgt atatgcatca gtaaaaccca catcaacatg tatacctatc ctagatcgat 2040
atttccatcc atcttaaact cgtaactatg aagatgtatg acacacacat acagttccaa 2100
aattaataaa tacaccaggt agtttgaaac agtattctac tccgatctag aacgaatgaa 2160
cgaccgccca accacaccac atcatcacaa ccaagcgaac aaaaagcatc tctgtatatg 2220
catcagtaaa acccgcatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatcat 2280
cttcaattcg taactatgaa tatgtatggc acacacatac agatccaaaa ttaataaatc 2340
caccaggtag tttgaaacag aattctactc cgatctagaa cgaccgccca accagaccac 2400
atcatcacaa ccaagacaaa aaaaagcatg aaaagatgac ccgacaaaca agtgcacggc 2460
atatattgaa ataaaggaaa agggcaaacc aaaccctatg caacgaaaca aaaaaaatca 2520
tgaaatcgat cccgtctgcg gaacggctag agccatccca ggattcccca aagagaaaca 2580
ctggcaagtt agcaatcaga acgtgtctga cgtacaggtc gcatccgtgt acgaacgcta 2640
gcagcacgga tctaacacaa acacggatct aacacaaaca tgaacagaag tagaactacc 2700
gggccctaac catggaccgg aacgccgatc tagagaaggt agagaggggg ggggggggag 2760
gacgagcggc gtaccttgaa gcggaggtgc cgacgggtgg atttggggga gatctggttg 2820
tgtgtgtgtg cgctccgaac aacacgaggt tggggaaaga gggtgtggag ggggtgtcta 2880
tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa tcccccgtag 2940
ctgccgtgcc gtgagaggag gaggaggccg cctgccgtgc cggctcacgt ctgccgctcc 3000
gccacgcaat ttctggatgc cgacagcgga gcaagtccaa cggtggagcg gaactctcga 3060
gaggggtcca gaggcagcga cagagatgcc gtgccgtctg cttcgcttgg cccgacgcga 3120
cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta gactcgtcga cggcgtttaa caggctggca 3180
ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt taatttctta aagggtattt 3240
gtttaatttt tagtcacttt attttattct attttatatc taaattatta aataaaaaaa 3300
ctaaaataga gttttagttt tcttaattta gaggctaaaa tagaataaaa tagatgtact 3360
aaaaaaatta gtctataaaa accattaacc ctaaacccta aatggatgta ctaataaaat 3420
ggatgaagta ttatataggt gaagctattt gcaaaaaaaa aggagaacac atgcacacta 3480
aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca aaatactcaa ttgtccttta gaccatgtct 3540
aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca ctgatattat tgtagtacta tagattatat 3600
tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga taaactgcac ttcaaacaag 3660
tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga catgcaatgc tcattatctc 3720
tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca ctgcaggcat acgcgtaagc ttcagggttt 3780
aaacaggtcc gattgagact tttcaacaaa gggtaatatc cggaaacctc ctcggattcc 3840
attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga aaaggaaggt ggctcctaca 3900
aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga tgcctctgcc gacagtggtc 3960
ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt 4020
cttcaaagca agtggattga tgtgatggtc cgattgagac ttttcaacaa agggtaatat 4080
ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 4140
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 4200
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 4260
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 4320
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 4380
catttcattt ggagaggaca cgctgacaag ctgactctag cagatcctct agaaccatct 4440
tccacacact caagccacac tattggagaa cacacaggga caacacacca taagatccaa 4500
gggaggcctc cgccgccgcc ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt tctccgtttt 4560
tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag aggcggcttc 4620
gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg cggctggggc tctcgccggc 4680
gtggatccgg cccggatctc gcggggaatg gggctctcgg atgtagatct gcgatccgcc 4740
gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgccg tgctaaacaa gatcaggaag 4800
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atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt tgaatccctc agcattgttc 4920
atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc ctcgtgcgga gcttttttgt 4980
aggtagaagt gatcaacctg atcaaccccg ccatggacaa caacccaaac atcaacgagt 5040
gcatcccata caactgcctg agcaacccag aggtggaggt gctgggtggc gagcgcatcg 5100
agaccggtta cacccccatc gacatctccc tgtccttgac ccagttcctg ctcagcgagt 5160
tcgtgccagg tgctggcttc gtgctcggcc tggtggacat catctggggt atcttcggtc 5220
catcccaatg ggacgccttc ctggtgcaaa tcgagcagct gatcaaccag aggatcgaag 5280
agttcgccag gaaccaggcc atctccaggc tggagggcct gagcaacctc taccaaatct 5340
acgccgagag cttcagggag tgggaggccg acccgaccaa cccagctctc cgcgaggaaa 5400
tgcgcattca attcaacgac atgaacagcg ccctgaccac cgctatccca ctgttcgccg 5460
tccagaacta ccaagtgccg ctcctgtccg tgtacgtgca agccgctaac ctgcacctca 5520
gcgtgctgcg cgacgtgagc gtgttcggcc aaaggtgggg cttcgatgct gccaccatca 5580
acagccgcta caacgacctg accaggctga ttggcaacta caccgaccac gctgtgcgct 5640
ggtacaacac cggcctggag cgcgtctggg gtccggactc cagggactgg atcaggtaca 5700
accagttcag gagggagttg accctcaccg tgctggacat tgtgtccctc ttcccgaact 5760
acgactccag gacctacccg atccgcaccg tgtcccaact caccagggag atctacacca 5820
acccagtgct ggagaacttc gacggtagct tccgcggttc cgcccagggt atcgagggct 5880
ccatcaggag cccacacctg atggacatcc tgaacagcat caccatctac accgacgctc 5940
acaggggcga gtactactgg tccggccacc agatcatggc ctccccagtg ggcttcagcg 6000
gccccgagtt caccttcccg ctctacggca ccatgggcaa cgccgctcca cagcaacgca 6060
tcgtggctca actgggtcag ggtgtctaca ggaccctgtc ctccaccctg tacaggaggc 6120
ccttcaacat cggtatcaac aaccagcaac tgtccgtgct cgacggcacc gagttcgcct 6180
acggcacctc ctccaacctg ccatccgctg tctacaggaa gagcggcacc gtggactccc 6240
tggacgagat cccaccacag aacaacaacg tgccacccag gcaaggcttc tcccacaggc 6300
tgagccacgt gtccatgttc cgctccggct tcagcaacag ctccgtgagc atcatcaggg 6360
ctccgatgtt ctcctggatc caccgcagcg ctgagttcaa caacatcatc gcctccgaca 6420
gcatcaccca aatcccggcc gtgaagggca acttcctctt caacggttcc gtcatttccg 6480
gcccaggctt caccggtggc gacctcgtga ggctcaacag cagcggcaac aacatccaga 6540
acaggggcta catcgagtgc caatccactt cccatccacc tccaccaggt acagggtgcg 6600
cgtgaggtac gcttccgtga ccccgatcca cctcaacgtg aactggggta actcctccat 6660
cttctccaac accgtgccag ctaccgctac ctccctggac aacctccaat ccagcgactt 6720
cggttacttc gagagcgcca acgctttcac ctcctccctc ggtaacatcg tgggcgtgag 6780
gaacttcagc ggcaccgccg gcgtgatcat cgacaggttc gagttcatcc cagtgaccgc 6840
caccctcgag gctgagtgat cgatcgacaa gctcgagttt ctccataata atgtgtgagt 6900
agttcccaga taagggaatt agggttccta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa 6960
gaaaccctta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc 7020
taaaaccaaa atccagtact aaaatccaga tcccccgaat taaggtaccg atatcagtac 7080
taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 7140
gaaatattag caattttggt catgttaagc tatgaattag tttttggtat gaataactaa 7200
agtgtagtaa tcttcctaag atttctagaa agtctaggat cacctttgtg ggatgtctat 7260
aacctcagtt atggttgaaa caagtaacta ctgcgttgct gtccagattc taggcacatg 7320
ctaagttggc taccgtatct agcgttgttt tgagctaaac ttgtagttag ttcatgcttg 7380
agataaatgc ttattttggg tgagccttgt gtcttgtgtt ggttgcttaa gcccatttgt 7440
ttgaattttc tcaaatgact gcttgattgt gatgttgtat gtgtgtttgt tatctaggta 7500
gtgccctagt tgccacctc 7519
<210> 30
<211> 379
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 23的互补序列 (反向-互补)
<400> 30
gaaatattag caattttggt catgttaagc tatgaattag tttttggtat gaataactaa 60
agtgtagtaa tcttcctaag atttctagaa agtctaggat cacctttgtg ggatgtctat 120
aacctcagtt atggttgaaa caagtaacta ctgcgttgct gtccagattc taggcacatg 180
ctaagttggc taccgtatct agcgttgttt tgagctaaac ttgtagttag ttcatgcttg 240
agataaatgc ttattttggg tgagccttgt gtcttgtgtt ggttgcttaa gcccatttgt 300
ttgaattttc tcaaatgact gcttgattgt gatgttgtat gtgtgtttgt tatctaggta 360
gtgccctagt tgccacctc 379
<210> 31
<211> 617
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 24的互补序列 (反向-互补)
<400> 31
gcatcttcat gattgttgcc ttatgcatag ctatgctcct ctcacccttg ttcaaatgat 60
gagtaatttg tgagtgatgt ggtatcctat cttccttgtg tggagtcaaa caagaatgct 120
ttgttccatg ttgcttgaat aggaaatgct tgagaaaaat gtgtgcttag ctttactaga 180
aataagtgtg actacatgct tgagcttaga gttatgaatt ttaaaagttt acggtcaggt 240
tttgtcaatg ttctgaatag atctgaatgt ttggtttgtt tgacctgtgt gcatatggaa 300
tcgtgtctta gagataatag aagaagtgta gtactttttc taagctttcc aaaatgtcct 360
atagcactaa ttgtgatggt ctaaatctct agttatgagc ttgcaaagta gaatgacaga 420
atctgtccaa atccggcaga gatgttttct ttgctatgtt tgtccttgtt agccgtagaa 480
tcatcttaat atgataataa gaaagttata gacaacttaa taagctttac ataaagttaa 540
ggatcacttt tgttgtgtct ctagaactcc aattatgtat tttcgaagtt cttgtcagtt 600
ttctgtccaa attggta 617
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 18的互补序列 (反向-互补)
<400> 32
agcgtcaatt tgtgaaatat tagcaa 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 19的互补序列 (反向-互补)
<400> 33
gtccaaattg gtatcggcgc gccctc 26
<210> 34
<211> 615
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌B. thurigiensis
<400> 34
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn
450 455 460
Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn
465 470 475 480
Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
485 490 495
Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly
500 505 510
Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg
515 520 525
Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn
530 535 540
Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr
545 550 555 560
Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala
565 570 575
Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe
580 585 590
Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val
595 600 605
Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu
610 615
<210> 35
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nptII蛋白
<400> 35
Met Trp Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp
1 5 10 15
Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys
20 25 30
Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu
35 40 45
Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu
50 55 60
Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly
85 90 95
Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu
100 105 110
Lys Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp
115 120 125
Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg
130 135 140
Ala Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp
145 150 155 160
Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys
165 170 175
Ala Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala
180 185 190
Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu
210 215 220
Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg
225 230 235 240
Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala
245 250 255
Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260 265
<210> 36
<211> 6524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 02的互补序列 (反向-互补)
<400> 36
tcggcgcgcc ctcgagtcta gagtcgacga gctcgatcca ctagtaacgg ccgccagtgt 60
gctggaattc gcccttggcg cgccgatcta gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt 120
tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga 180
ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat 240
gcttaacgta attcaacaga aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattca 300
atcttaagaa actttattgc caaatgtttg aacgatctca gaagaactcg tcaagaaggc 360
gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 420
cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 480
agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 540
ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 600
tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 660
gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 720
tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 780
cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 840
gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 900
cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 960
tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 1020
ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 1080
tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc cacattctag 1140
agtcgacctg cagaagtaac accaaacaac agggtgagca tcgacaaaag aaacagtacc 1200
aagcaaataa atagcgtatg aaggcagggc taaaaaaatc cacatatagc tgctgcatat 1260
gccatcatcc aagtatatca agatcaaaat aattataaaa catacttgtt tattataata 1320
gataggtact caaggttaga gcatatgaat agatgctgca tatgccatca tgtatatgca 1380
tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct atcctagatc gatatttcca tccatcttaa 1440
actcgtaact atgaagatgt atgacacaca catacagttc caaaattaat aaatacacca 1500
ggtagtttga aacagtattc tactccgatc tagaacgaat gaacgaccgc ccaaccacac 1560
cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc atctctgtat atgcatcagt aaaacccgca 1620
tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat catcttcaat tcgtaactat 1680
gaatatgtat ggcacacaca tacagatcca aaattaataa atccaccagg tagtttgaaa 1740
cagaattcta ctccgatcta gaacgaccgc ccaaccagac cacatcatca caaccaagac 1800
aaaaaaaagc atgaaaagat gacccgacaa acaagtgcac ggcatatatt gaaataaagg 1860
aaaagggcaa accaaaccct atgcaacgaa acaaaaaaaa tcatgaaatc gatcccgtct 1920
gcggaacggc tagagccatc ccaggattcc ccaaagagaa acactggcaa gttagcaatc 1980
agaacgtgtc tgacgtacag gtcgcatccg tgtacgaacg ctagcagcac ggatctaaca 2040
caaacacgga tctaacacaa acatgaacag aagtagaact accgggccct aaccatggac 2100
cggaacgccg atctagagaa ggtagagagg gggggggggg gaggacgagc ggcgtacctt 2160
gaagcggagg tgccgacggg tggatttggg ggagatctgg ttgtgtgtgt gtgcgctccg 2220
aacaacacga ggttggggaa agagggtgtg gagggggtgt ctatttatta cggcgggcga 2280
ggaagggaaa gcgaaggagc ggtgggaaag gaatcccccg tagctgccgt gccgtgagag 2340
gaggaggagg ccgcctgccg tgccggctca cgtctgccgc tccgccacgc aatttctgga 2400
tgccgacagc ggagcaagtc caacggtgga gcggaactct cgagaggggt ccagaggcag 2460
cgacagagat gccgtgccgt ctgcttcgct tggcccgacg cgacgctgct ggttcgctgg 2520
ttggtgtccg ttagactcgt cgacggcgtt taacaggctg gcattatcta ctcgaaacaa 2580
gaaaaatgtt tccttagttt ttttaatttc ttaaagggta tttgtttaat ttttagtcac 2640
tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat agagttttag 2700
ttttcttaat ttagaggcta aaatagaata aaatagatgt actaaaaaaa ttagtctata 2760
aaaaccatta accctaaacc ctaaatggat gtactaataa aatggatgaa gtattatata 2820
ggtgaagcta tttgcaaaaa aaaaggagaa cacatgcaca ctaaaaagat aaaactgtag 2880
agtcctgttg tcaaaatact caattgtcct ttagaccatg tctaactgtt catttatatg 2940
attctctaaa acactgatat tattgtagta ctatagatta tattattcgt agagtaaagt 3000
ttaaatatat gtataaagat agataaactg cacttcaaac aagtgtgaca aaaaaaatat 3060
gtggtaattt tttataactt agacatgcaa tgctcattat ctctagagag gggcacgacc 3120
gggtcacgct gcactgcagg catacgcgta agcttcaggg tttaaacagg tccgattgag 3180
acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 3240
cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 3300
aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 3360
cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 3420
tgatgtgatg gtccgattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 3480
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 3540
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 3600
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 3660
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa 3720
tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg 3780
acacgctgac aagctgactc tagcagatcc tctagaacca tcttccacac actcaagcca 3840
cactattgga gaacacacag ggacaacaca ccataagatc caagggaggc ctccgccgcc 3900
gccggtaacc accccgcccc tctcctcttt ctttctccgt ttttttttcc gtctcggtct 3960
cgatctttgg ccttggtagt ttgggtgggc gagaggcggc ttcgtgcgcg cccagatcgg 4020
tgcgcgggag gggcgggatc tcgcggctgg ggctctcgcc ggcgtggatc cggcccggat 4080
ctcgcgggga atggggctct cggatgtaga tctgcgatcc gccgttgttg ggggagatga 4140
tggggggttt aaaatttccg ccgtgctaaa caagatcagg aagaggggaa aagggcacta 4200
tggtttatat ttttatatat ttctgctgct tcgtcaggct tagatgtgct agatctttct 4260
ttcttctttt tgtgggtaga atttgaatcc ctcagcattg ttcatcggta gtttttcttt 4320
tcatgatttg tgacaaatgc agcctcgtgc ggagcttttt tgtaggtaga agtgatcaac 4380
ctgatcaacc ccgccatgga caacaaccca aacatcaacg agtgcatccc atacaactgc 4440
ctgagcaacc cagaggtgga ggtgctgggt ggcgagcgca tcgagaccgg ttacaccccc 4500
atcgacatct ccctgtcctt gacccagttc ctgctcagcg agttcgtgcc aggtgctggc 4560
ttcgtgctcg gcctggtgga catcatctgg ggtatcttcg gtccatccca atgggacgcc 4620
ttcctggtgc aaatcgagca gctgatcaac cagaggatcg aagagttcgc caggaaccag 4680
gccatctcca ggctggaggg cctgagcaac ctctaccaaa tctacgccga gagcttcagg 4740
gagtgggagg ccgacccgac caacccagct ctccgcgagg aaatgcgcat tcaattcaac 4800
gacatgaaca gcgccctgac caccgctatc ccactgttcg ccgtccagaa ctaccaagtg 4860
ccgctcctgt ccgtgtacgt gcaagccgct aacctgcacc tcagcgtgct gcgcgacgtg 4920
agcgtgttcg gccaaaggtg gggcttcgat gctgccacca tcaacagccg ctacaacgac 4980
ctgaccaggc tgattggcaa ctacaccgac cacgctgtgc gctggtacaa caccggcctg 5040
gagcgcgtct ggggtccgga ctccagggac tggatcaggt acaaccagtt caggagggag 5100
ttgaccctca ccgtgctgga cattgtgtcc ctcttcccga actacgactc caggacctac 5160
ccgatccgca ccgtgtccca actcaccagg gagatctaca ccaacccagt gctggagaac 5220
ttcgacggta gcttccgcgg ttccgcccag ggtatcgagg gctccatcag gagcccacac 5280
ctgatggaca tcctgaacag catcaccatc tacaccgacg ctcacagggg cgagtactac 5340
tggtccggcc accagatcat ggcctcccca gtgggcttca gcggccccga gttcaccttc 5400
ccgctctacg gcaccatggg caacgccgct ccacagcaac gcatcgtggc tcaactgggt 5460
cagggtgtct acaggaccct gtcctccacc ctgtacagga ggcccttcaa catcggtatc 5520
aacaaccagc aactgtccgt gctcgacggc accgagttcg cctacggcac ctcctccaac 5580
ctgccatccg ctgtctacag gaagagcggc accgtggact ccctggacga gatcccacca 5640
cagaacaaca acgtgccacc caggcaaggc ttctcccaca ggctgagcca cgtgtccatg 5700
ttccgctccg gcttcagcaa cagctccgtg agcatcatca gggctccgat gttctcctgg 5760
atccaccgca gcgctgagtt caacaacatc atcgcctccg acagcatcac ccaaatcccg 5820
gccgtgaagg gcaacttcct cttcaacggt tccgtcattt ccggcccagg cttcaccggt 5880
ggcgacctcg tgaggctcaa cagcagcggc aacaacatcc agaacagggg ctacatcgag 5940
gtgccaatcc acttcccatc cacctccacc aggtacaggg tgcgcgtgag gtacgcttcc 6000
gtgaccccga tccacctcaa cgtgaactgg ggtaactcct ccatcttctc caacaccgtg 6060
ccagctaccg ctacctccct ggacaacctc caatccagcg acttcggtta cttcgagagc 6120
gccaacgctt tcacctcctc cctcggtaac atcgtgggcg tgaggaactt cagcggcacc 6180
gccggcgtga tcatcgacag gttcgagttc atcccagtga ccgccaccct cgaggctgag 6240
tgatcgatcg acaagctcga gtttctccat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg 6300
aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt 6360
atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag 6420
tactaaaatc cagatccccc gaattaaggt accgatatca gtactaattc agtacattaa 6480
aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgt 6524
<210> 37
<211> 6729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 05的互补序列 (反向-互补)
<400> 37
acttaataag ctttacataa agttaaggat cacttttgtt gtgtctctag aactccaatt 60
atgtattttc gaagttcttg tcagttttct gtccaaattg gtatcggcgc gccctcgagt 120
ctagagtcga cgagctcgat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcgcccttg 180
gcgcgccgat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta gtttgcgcgc 240
tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat cataaaaacc 300
catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac gtaattcaac 360
agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa gaaactttat 420
tgccaaatgt ttgaacgatc tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 480
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 540
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 600
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 660
caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 720
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 780
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 840
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 900
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 960
agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 1020
gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 1080
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 1140
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 1200
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atccacattc tagagtcgac ctgcagaagt 1260
aacaccaaac aacagggtga gcatcgacaa aagaaacagt accaagcaaa taaatagcgt 1320
atgaaggcag ggctaaaaaa atccacatat agctgctgca tatgccatca tccaagtata 1380
tcaagatcaa aataattata aaacatactt gtttattata atagataggt actcaaggtt 1440
agagcatatg aatagatgct gcatatgcca tcatgtatat gcatcagtaa aacccacatc 1500
aacatgtata cctatcctag atcgatattt ccatccatct taaactcgta actatgaaga 1560
tgtatgacac acacatacag ttccaaaatt aataaataca ccaggtagtt tgaaacagta 1620
ttctactccg atctagaacg aatgaacgac cgcccaacca caccacatca tcacaaccaa 1680
gcgaacaaaa agcatctctg tatatgcatc agtaaaaccc gcatcaacat gtatacctat 1740
cctagatcga tatttccatc catcatcttc aattcgtaac tatgaatatg tatggcacac 1800
acatacagat ccaaaattaa taaatccacc aggtagtttg aaacagaatt ctactccgat 1860
ctagaacgac cgcccaacca gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa agcatgaaaa 1920
gatgacccga caaacaagtg cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg caaaccaaac 1980
cctatgcaac gaaacaaaaa aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac ggctagagcc 2040
atcccaggat tccccaaaga gaaacactgg caagttagca atcagaacgt gtctgacgta 2100
caggtcgcat ccgtgtacga acgctagcag cacggatcta acacaaacac ggatctaaca 2160
caaacatgaa cagaagtaga actaccgggc cctaaccatg gaccggaacg ccgatctaga 2220
gaaggtagag aggggggggg ggggaggacg agcggcgtac cttgaagcgg aggtgccgac 2280
gggtggattt gggggagatc tggttgtgtg tgtgtgcgct ccgaacaaca cgaggttggg 2340
gaaagagggt gtggaggggg tgtctattta ttacggcggg cgaggaaggg aaagcgaagg 2400
agcggtggga aaggaatccc ccgtagctgc cgtgccgtga gaggaggagg aggccgcctg 2460
ccgtgccggc tcacgtctgc cgctccgcca cgcaatttct ggatgccgac agcggagcaa 2520
gtccaacggt ggagcggaac tctcgagagg ggtccagagg cagcgacaga gatgccgtgc 2580
cgtctgcttc gcttggcccg acgcgacgct gctggttcgc tggttggtgt ccgttagact 2640
cgtcgacggc gtttaacagg ctggcattat ctactcgaaa caagaaaaat gtttccttag 2700
tttttttaat ttcttaaagg gtatttgttt aatttttagt cactttattt tattctattt 2760
tatatctaaa ttattaaata aaaaaactaa aatagagttt tagttttctt aatttagagg 2820
ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa aaattagtct ataaaaacca ttaaccctaa 2880
accctaaatg gatgtactaa taaaatggat gaagtattat ataggtgaag ctatttgcaa 2940
aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa gataaaactg tagagtcctg ttgtcaaaat 3000
actcaattgt cctttagacc atgtctaact gttcatttat atgattctct aaaacactga 3060
tattattgta gtactataga ttatattatt cgtagagtaa agtttaaata tatgtataaa 3120
gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg acaaaaaaaa tatgtggtaa ttttttataa 3180
cttagacatg caatgctcat tatctctaga gaggggcacg accgggtcac gctgcactgc 3240
aggcatacgc gtaagcttca gggtttaaac aggtccgatt gagacttttc aacaaagggt 3300
aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat 3360
agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt 3420
tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 3480
ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat 3540
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 3600
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 3660
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 3720
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 3780
ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 3840
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacacgct gacaagctga 3900
ctctagcaga tcctctagaa ccatcttcca cacactcaag ccacactatt ggagaacaca 3960
cagggacaac acaccataag atccaaggga ggcctccgcc gccgccggta accaccccgc 4020
ccctctcctc tttctttctc cgtttttttt tccgtctcgg tctcgatctt tggccttggt 4080
agtttgggtg ggcgagaggc ggcttcgtgc gcgcccagat cggtgcgcgg gaggggcggg 4140
atctcgcggc tggggctctc gccggcgtgg atccggcccg gatctcgcgg ggaatggggc 4200
tctcggatgt agatctgcga tccgccgttg ttgggggaga tgatgggggg tttaaaattt 4260
ccgccgtgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta tatttttata 4320
tatttctgct gcttcgtcag gcttagatgt gctagatctt tctttcttct ttttgtgggt 4380
agaatttgaa tccctcagca ttgttcatcg gtagtttttc ttttcatgat ttgtgacaaa 4440
tgcagcctcg tgcggagctt ttttgtaggt agaagtgatc aacctgatca accccgccat 4500
ggacaacaac ccaaacatca acgagtgcat cccatacaac tgcctgagca acccagaggt 4560
ggaggtgctg ggtggcgagc gcatcgagac cggttacacc cccatcgaca tctccctgtc 4620
cttgacccag ttcctgctca gcgagttcgt gccaggtgct ggcttcgtgc tcggcctggt 4680
ggacatcatc tggggtatct tcggtccatc ccaatgggac gccttcctgg tgcaaatcga 4740
gcagctgatc aaccagagga tcgaagagtt cgccaggaac caggccatct ccaggctgga 4800
gggcctgagc aacctctacc aaatctacgc cgagagcttc agggagtggg aggccgaccc 4860
gaccaaccca gctctccgcg aggaaatgcg cattcaattc aacgacatga acagcgccct 4920
gaccaccgct atcccactgt tcgccgtcca gaactaccaa gtgccgctcc tgtccgtgta 4980
cgtgcaagcc gctaacctgc acctcagcgt gctgcgcgac gtgagcgtgt tcggccaaag 5040
gtggggcttc gatgctgcca ccatcaacag ccgctacaac gacctgacca ggctgattgg 5100
caactacacc gaccacgctg tgcgctggta caacaccggc ctggagcgcg tctggggtcc 5160
ggactccagg gactggatca ggtacaacca gttcaggagg gagttgaccc tcaccgtgct 5220
ggacattgtg tccctcttcc cgaactacga ctccaggacc tacccgatcc gcaccgtgtc 5280
ccaactcacc agggagatct acaccaaccc agtgctggag aacttcgacg gtagcttccg 5340
cggttccgcc cagggtatcg agggctccat caggagccca cacctgatgg acatcctgaa 5400
cagcatcacc atctacaccg acgctcacag gggcgagtac tactggtccg gccaccagat 5460
catggcctcc ccagtgggct tcagcggccc cgagttcacc ttcccgctct acggcaccat 5520
gggcaacgcc gctccacagc aacgcatcgt ggctcaactg ggtcagggtg tctacaggac 5580
cctgtcctcc accctgtaca ggaggccctt caacatcggt atcaacaacc agcaactgtc 5640
cgtgctcgac ggcaccgagt tcgcctacgg cacctcctcc aacctgccat ccgctgtcta 5700
caggaagagc ggcaccgtgg actccctgga cgagatccca ccacagaaca acaacgtgcc 5760
acccaggcaa ggcttctccc acaggctgag ccacgtgtcc atgttccgct ccggcttcag 5820
caacagctcc gtgagcatca tcagggctcc gatgttctcc tggatccacc gcagcgctga 5880
gttcaacaac atcatcgcct ccgacagcat cacccaaatc ccggccgtga agggcaactt 5940
cctcttcaac ggttccgtca tttccggccc aggcttcacc ggtggcgacc tcgtgaggct 6000
caacagcagc ggcaacaaca tccagaacag gggctacatc gagtgccaat ccacttccca 6060
tccacctcca ccaggtacag ggtgcgcgtg aggtacgctt ccgtgacccc gatccacctc 6120
aacgtgaact ggggtaactc ctccatcttc tccaacaccg tgccagctac cgctacctcc 6180
ctggacaacc tccaatccag cgacttcggt tacttcgaga gcgccaacgc tttcacctcc 6240
tccctcggta acatcgtggg cgtgaggaac ttcagcggca ccgccggcgt gatcatcgac 6300
aggttcgagt tcatcccagt gaccgccacc ctcgaggctg agtgatcgat cgacaagctc 6360
gagtttctcc ataataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg 6420
gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata 6480
cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc 6540
ccgaattaag gtaccgatat cagtactaat tcagtacatt aaaaacgtcc gcaatgtgtt 6600
attaagttgt ctaagcgtca atttgtgaaa tattagcaat tttggtcatg ttaagctatg 6660
aattagtttt tggtatgaat aactaaagtg tagtaatctt cctaagattt ctagaaagtc 6720
taggatcac 6729
<210> 38
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 03的互补序列 (反向-互补)
<400> 38
actaaaatcc agatcccccg aattaaggta ccgatatcag tactaattca gtacattaaa 60
aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtgaaatat tagcaatttt 120
ggtcatgtta agctatgaat tagtttttgg tatgaataac taaagtgtag taatcttcct 180
aagatttcta gaaagtctag gatcac 206
<210> 39
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 04的互补序列 (反向-互补)
<400> 39
acttaataag ctttacataa agttaaggat cacttttgtt gtgtctctag aactccaatt 60
atgtattttc gaagttcttg tcagttttct gtccaaattg gtatcggcgc gccctcgagt 120
ctagagtcga cgagctcgat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcgcccttg 180
gcgcgccgat ctagtaacat agatga 206
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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gaggtgccaa tccacttccc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 41
gagttacccc agttcacgtt gag 23
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
acctccacca ggtacag 17
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 43
catcccatac aactgcctga g 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 44
ctgggtcaag gacagggaga t 21
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 45
ccggttacac cccc 14
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 46
ctctaccaaa tctacgccga ga 22
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
catgtcgttg aattgaatgc g 21
<210> 48
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 48
tctccgcgag gaaa 14
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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caccgtgctg gacattgtgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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tgagttggga cacggtgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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ctcttcccga actacgact 19
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
accctgtcct ccaccctgta 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 53
aggttggagg aggtgccgta 20
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 54
ccttcaacat cggtatca 18
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 55
tgccgaatat catggtggaa 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
cggccacagt cgatgaatc 19
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 57
tggccgcttt tct 13
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
atgactgggc acaacagaca atc 23
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
cggacaggtc ggtcttga 18
<210> 60
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
ctgctctgat gccgc 15
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
ctgccgagaa agtatccatc atg 23
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
gatgtttcgc ttggtggtcg 20
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
ctgatgcaat gcggcggc 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
gccgcttgta gccttcca 18
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
ccgccgacct ggtgga 16
<210> 66
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
cgtgacctca atgcg 15
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
cacaatcgtc acctcaaccg 20
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
atcaacgacc ttctggaaac g 21
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
cgcaggattt cgctctcg 18
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
acggaaccgt tgaagaggaa 20
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
atgtgtgagt agttcccaga taag 24
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
gatccaggag aacatcggag 20
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
ctatagggtt tcgctcatgt gttg 24
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
aattatacat ttaatacgcg 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 75
cgcggtgtca tctatgttac 20
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 76
tcaagaaggc gatagaaggc gatg 24
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 77
aataacgtca tgcattacat g 21
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 78
gataatcatc gcaagaccgg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 79
tcgtcgactc tagactcgag 20
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
aactttattc taggataaag ctatgt 26
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
cagataaggg aattagggtt cctat 25
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 82
acatacaaca tcacaatcaa gcagt 25
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 83
agagtcctgt tgtcaaaata ctcaa 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 84
ctcaaaacaa cgctagatac ggtag 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 85
gcatcttcat gattgttgcc ttatg 25
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 86
atgattagag tcccgcaatt ataca 25
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 87
cttgaatagg aaatgcttga gaaaa 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 88
cttgagtgtg tggaagatgg ttcta 25
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 89
gatctgaatg tttggtttgt ttgac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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gtttgtcctt gttagccgta gaat 24
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 91
tgatgcatat acagagatgc ttttt 25
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 92
ttcatccatt ttattagtac atcca 25
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 93
acggatgcga cctgtacg 18
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 94
tcagtaaaac ccacatcaac 20
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 95
gaccacatca tcacaaccaa g 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 96
gctccgaaca acacgaggtt g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 97
atgaagtatt atataggtga ag 22
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 98
agaggctatt cggctatgac 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 99
cagccgaact gttcgccagg 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 100
agcacgagga agcggtcagc 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 101
tgagatgaca ggagatcctg 20
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 102
caacagctcc gtgagcatca tc 22
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 103
ccagcgactt cggttacttc 20
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 104
ctctcggcgt agatttggta g 21
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 105
caacaaccca aacatcaacg 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 106
gggtcctgta gacaccctga 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 107
gctcaccctg ttgtttggtg tt 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 108
cggccacagt cgatgaatc 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 109
tgaaaagaaa aactaccgat gaa 23
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 110
tgatgtgatg gtccgattga 20
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 111
tcccctcggg atcaaagta 19
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 112
tagcgtgttt gtgcttttgc 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 113
ggccgctgaa attaaatcaa 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 114
gagtcagtga gcgaggaagc 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 115
cggtgaaaac ctctgacaca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 116
atacaggcag cccatcagtc 20

Claims (43)

1.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少14个连续的核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少15个连续的核苷酸。
3.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少16个连续的核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。
5.根据权利要求1-4任一项的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13。
6.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸。
7.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少15个连续的核苷酸。
8.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少16个连续的核苷酸。
9.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19。
10.根据权利要求6-9任一项的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12。
11.根据权利要求1-10任一项的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求1-11任一项的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:22。
13.引物对，其中正向引物包括SEQ ID NO:6且反向引物包括SEQ ID NO:7，或正向引物包括SEQ ID NO:8且反向引物包括SEQ ID NO:9。
14.一种检测源自事件CTC75064-3的植物材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且
e)检测扩增产物的存在。
15.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
16.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其至少一对引物由包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
17.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。
18.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一个引物对由包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
19.权利要求14的方法，其中正向引物包括SEQ ID NO:6且反向引物包括SEQ ID NO:7，或正向引物包括SEQ ID NO:8且反向引物包括SEQ ID NO:9。
20.权利要求14的方法，其中扩增产物包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
21.权利要求14的方法，其中扩增产物的检测是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
22.一种检测来自事件CTC75064-3的转基因甘蔗的材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针或探针的组合，其设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自由SEQID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 29、SEQ IDNO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ IDNO 38和SEQ ID NO:39组成的组的序列的连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；并且
e)检测探针的实际杂交。
23.一种检测来自包含Cry1Ac蛋白的转基因甘蔗的材料的试剂盒，其包含用于检测多核苷酸的存在的手段，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸，和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述手段包括设计成与包含选自SEQ ID NO:22和SEQID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合的引物对，其中至少一对引物包含选自由SEQ ID NO.23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。
25.权利要求23的试剂盒，其中包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。
26.基因构建体，其包含SEQ ID NO:1。
27.基因构建体，其包含SEQ ID NO:2。
28.权利要求26或27的基因构建体，其包含SEQ ID NO:14。
29.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
30.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
31.一种包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中所述植物是抗虫的。
32.来自权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19。
33.权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养物。
34.从权利要求33的组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
35.来自权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子的应用，其中这样的应用意在再生植物、生产种子、种植植物田或加工制造植物产品。
36.一种商品产品，由权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。
37.一种产生事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括以下步骤：
a)将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有氨基糖苷类抗生素的培养基中选择含有功能片段的转化细胞；以及
e)再生转化甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
38.权利要求37的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
39.一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是权利要求29的植物，并由此生产子代甘蔗植物。
40.一种由权利要求39的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
41.一种制造事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以产生事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有更好的抗虫性。
42.一种培育CTC75064-3事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，在包含昆虫侵染的条件下，其中，与在相同条件下生长的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。
43.一种事件CTC75064-3的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022226617A1 (pt) * 2021-04-27 2022-11-03 Ctc - Centro De Tecnologia Canavieira S.A. Polinucleotídeo, pares de iniciadores, métodos de detecção de material vegetal, construção genética, kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal, evento ctc75064-3, planta resistente a insetos, produto de comódite, método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente

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WO2022226617A1 (pt) * 2021-04-27 2022-11-03 Ctc - Centro De Tecnologia Canavieira S.A. Polinucleotídeo, pares de iniciadores, métodos de detecção de material vegetal, construção genética, kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal, evento ctc75064-3, planta resistente a insetos, produto de comódite, método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente

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