BR102020005666A2

BR102020005666A2 - Polinucleotídeo, pares de iniciadores, métodos de detecção de material vegetal, construção genética, kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal, evento ctc93209-4, planta resistente a insetos, produto de comódite, método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente

Info

Publication number: BR102020005666A2
Application number: BR102020005666-2A
Authority: BR
Inventors: Adriana Cheavegatti Gianotto; Karina Yanagui De Almeida; Agustina Gentile; Maria Lorena Sereno; Wladecir Salles De Oliveira; Geraldo Felipe Ferreira E Silva
Original assignee: Ctc - Centro De Tecnologia Canavieira S.A.
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-09-28
Also published as: CO2022014793A2; WO2021184101A1; AR121625A1

Abstract

polinucleotídeo, pares de iniciadores, métodos de detecção de material vegetal, construção genética, kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal, evento ctc93209-4, planta resistente a insetos, produto de comódite, método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente. a presente invenção está relacionada à área de biotecnologia. mais precisamente, é descrita uma construção genética e método para a produção de um evento de planta transgênica, especialmente de um evento de cana-de-açúcar (saccharum spp.), o qual é resistente à infestação pela praga diatraea saccharalis, popularmente conhecida como broca comum, broca-da-cana ou apenas broca. a invenção descreve o evento, os métodos para identificação do evento, bem como métodos de detecção das inserções baseados nas regiões de intersecção entre o inserto e o genoma hospedeiro e as regiões flanqueadoras que o caracterizam.

Description

POLINUCLEOTÍDEO, PARES DE INICIADORES, MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MATERIAL VEGETAL, CONSTRUÇÃO GENÉTICA, KIT PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA EM UMA AMOSTRA DE MATERIAL VEGETAL, EVENTO CTC93209-4, PLANTA RESISTENTE A INSETOS, PRODUTO DE COMÓDITE, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE CANA-DE-AÇÚCAR RESISTENTE A INSETO E USO DE UMA PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, PARTE DE PLANTA OU SEMENTE

Campo Técnico

[0001] A presente invenção está relacionada à área de biotecnologia. Mais precisamente, é descrita uma construção genética e método para a produção de um evento de planta transgênica, especialmente de um evento de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), o qual expressa a toxina Cry1Ac apresentando resistência à infestação pela praga Diatraea saccharalis, popularmente conhecida como broca comum, broca-da-cana ou apenas broca. A invenção descreve métodos para detecção do evento e de material derivado do evento resistente à infestação por broca-da-cana, assim apresenta polinucleotídeos iniciadores, sondas e as regiões flanqueadoras identificadoras de tal evento.

Descrição do Estado da Técnica

[0002] A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma planta gramínea pertencente à família botânica Poaceae, sendo originária do Sudeste Asiático, mais precisamente da grande região central da Nova Guiné e Indonésia. Ela é uma das mais importantes espécies vegetais cultivadas nas regiões tropicais e subtropicais, com uma área maior que 23 milhões de hectares distribuídos em 121 países (FAO Statistical Yearbook 2012 p. 233).

[0003] A cana-de-açúcar é fonte de matéria prima para a produção de açúcar, vinho, melaço, rum, cachaça (o destilado nacional do Brasil) e etanol para combustível. O bagaço que produzido após a moagem da cana-de-açúcar pode ser utilizado para enfardamento e fornecimento de energia calorífica, empregada no moinho, e eletricidade, que é tipicamente vendida para a grade elétrica do consumidor, ou ainda como matéria prima para produção de etanol de segunda geração (BR 11 2014 02385-1). Desta forma, a agroindústria canavieira, responsável por gerar milhões de empregos na área, tem uma grande importância econômica e social, com geração de divisas por meio da comercialização de açúcar e etanol e pelo aproveitamento racional da biomassa vegetal.

[0004] Mais recentemente, com o advento do tema aquecimento global e uso de fontes alternativas a combustíveis fósseis (biocombustíveis), o interesse mundial por cana-de-açúcar tem aumentado de maneira significativa. O uso do etanol derivado da cana de açúcar como fonte de energia renovável tem sido considerado de extrema importância para redução dos gases de efeito estufa e da dependência aos combustíveis fósseis, tendo sido considerado uma das peças chaves dentre os esforços para controle das mudanças climáticas mundiais (Savage, 2011).

[0005] Atualmente o Brasil é o líder mundial na produção da canade-açúcar (Saccharum × officinarum), sendo responsável pela produção de 615,8 milhões de toneladas de cana-de-açúcar na safra 2018/19 (CONAB, 2018), destinados principalmente à produção de açúcar e etanol que, somados à produção de bioeletricidade, representam cerca de 2% de todo PIB nacional e mais de 30% do PIB agrícola.

[0006] Devido à importância econômica e social da cana-de-açúcar, observa-se um grande esforço em pesquisas com o objetivo de definir melhores práticas agrícolas para o seu cultivo e de melhorar a qualidade das variedades cultivadas. Os esforços para melhoramento das características agronômicas da cana de açúcar têm focado no aumento da produção e acúmulo de açúcares, aumento da tolerância a estresses bióticos e abióticos, resistência e tolerância a pragas e patógenos, e desenvolvimento de tecnologias alternativas para a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (PI 0802153-8; PI 0904538-4; PI 1101295-1).

[0007] A complexidade do genoma poliplóide e aneuplóide das variedades modernas de cana-de-açúcar, somada a sua base genética relativamente restrita e a baixa fertilidade, impõem grandes dificuldades e inúmeras limitações na seleção das plantas com as características agronômicas desejáveis por técnicas do melhoramento convencional (Souza et al, 2011; D´Hont & Glaszmann, 2005, Basel, v. 109, n. 1-3, p. 27-33; Cheavegatti-Gianotto et al., 2011), demandando grandes investimentos, mão de obra intensiva e prazos muito longos para serem considerados razoáveis considerando o contexto e demanda atual do mercado global. O aumento da produção de cana de açúcar observada nos últimos 20 anos é resultado não apenas do aumento da produtividade dos canaviais, mas também da diversificação das variedades cultivadas, o que permitiu a expansão da área cultivada de cana de açúcar para outras regiões com diferentes condições edafoclimáticas. Sabe-se que a sustentabilidade da produção agrícola da cana de açúcar no Brasil está fundamentada não só na capacidade de responder a pragas e doenças, mas também no desenvolvimento de novas variedades mais bem adaptadas às condições edafoclimáticas locais e isso só é possível através do suprimento contínuo de variedades no mercado.

[0008] O melhoramento convencional é importante para o suprimento contínuo de variedades, mas não suficiente para atender o mercado atual já que parte das características desejáveis e necessárias para os cultivos modernos não pode ser encontrada no background genético das espécies, sendo fundamental o desenvolvimento de técnicas para a introdução de genes exógenos para compor a constituição genômica das variedades de relevância agronômica.

[0009] Diante desse cenário, onde há uma necessidade crescente de incorporar com celeridade e eficiência características desejáveis em diferentes variedades, o uso de técnicas de engenharia genética (biotecnologia) nos programas de melhoramento genético de cana-deaçúcar ganhou destaque, em especial devido ao sucesso comercial da incorporação de características agronômicas desejáveis por meio de engenharia genética em outras espécies vegetais (soja, milho, canola, beterraba e algodão, por exemplo).

[0010] A engenharia genética de plantas envolve a transferência de genes de interesse para dentro de células vegetais (transformação genética), de tal maneira que uma progênie fértil e agronomicamente superior mantenha e expresse de forma estável o gene responsável pela característica desejada.

[0011] Apesar de comprovada a possibilidade de alteração genética (incorporação de características desejáveis) de cana-de-açúcar por meio de engenharia genética [resistência a vírus (Guo et al., 2015; Zhu et al., 2011), insetos (Kalunke, Kolge, Babu, & Prasad, 2009; Weng et al., 2011), herbicidas (Enrıquez-Obregon, Vazquez-Padron, PrietoSamsonov, De la Riva, & Selman- Housein, 1998; van der Vyver, Conradie, Kossmann, & Lloyd, 2013), tolerância a seca (Molinari et al., 2007; Reis et al., 2014), salinidade (Kumar, Uzma, Khan, Abbas, & Ali, 2014) e toxicidade a alumínio (Ribeiro, 2016), aumento da produção e acúmulo de açúcar (Bewg, Poovaiah, Lan, Ralph, & Coleman, 2016; Mudge et al., 2013)] , essa abordagem também é limitada por características intrínsecas da cana-de-açúcar, que apresenta respostas genótipo-dependentes à aplicação de técnicas de cultura de tecidos, baixa taxa de indução e regeneração de calos embriogênicos, além da impossibilidade de usar o embrião zigótico como tecido alvo na transformação genética, ao contrário de milho, arroz, trigo e outros cereais comerciais [(Anderson & Birch, 2012; Basnayake, Moyle, & Birch, 2011; Molinari et al., 2007)] . É frequente a obtenção de uma baixa taxa de eficiência de transformação, sendo observado alta variabilidade entre genótipos, havendo ainda inúmeros desafios a serem transpostos para a incorporação de características agronômicas desejáveis por meio de engenharia genética em cana-de-açúcar.

[0012] A cana-de-açúcar é tida como uma espécie recalcitrante para transformação genética e, apesar de terem sido avaliadas diversas abordagens de engenharia genética para essa espécie, ainda não há protocolos padrões que garantam a produção de eventos transgênicos de qualidade comercial (Smith et al. 1992; Rathius & Birch. 1992.; Chen et al. 1987; Arencibia. 1998; Manickavasagam et al. 2004.; Elliott et al. 1998).

[0013] Somada às limitações inerentes da espécie para a aplicação das técnicas existentes de engenharia genética devido à complexidade do genoma da cana-de-açúcar (alto grau de ploidia, aliado à presença de aneuploidia), não existem programas de introgressão de características de interesse agronômico em cultivares de cana de açúcar através de retrocruzamentos (reconstituição de um genótipo específico), como é comumente realizado em outras culturas de interesse comercial. Desta forma, para a "introdução" de uma mesma característica em mais de um germoplasma, possibilitando ganhos em produtividade em diferentes regiões de cultivo, é necessário realizar nova transformação genética, incorrendo nos mesmos custos e riscos associados ao primeiro evento obtido para aquela característica. Ainda hoje há muito pouca previsibilidade de sucesso para a introdução de uma mesma característica em diferentes variedades de cana de açúcar, sendo um processo extremamente genótipo-dependente, o que torna desafiador a construção de um portfólio de produtos geneticamente modificados para esta espécie.

[0014] A complexidade genotípica da cana de açúcar também impacta significativamente a caracterização dos eventos gerados de forma a garantir as características necessárias para a sua comercialização. A identificação inequívoca dos eventos transgênicos é fundamental para assegurar a sua rastreabilidade e monitoramento, sendo exigência regulatória para sua comercialização. A alta poliploidia do genoma da cana-de-açúcar e o alto número de regiões repetidas, associado a pouca informação existente sobre a sua organização e estrutura, constituem desafios para a caracterização dos eventos transgênicos gerados.

[0015] Existem diversos desafios técnicos a serem transpostos no campo do melhoramento genético de cana-de-açúcar para aumento da previsibilidade sobre os resultados esperados, mesmo quando aplicadas técnicas convencionais e/ou moleculares/genéticas amplamente conhecidas. Ainda assim, não restam dúvidas da urgência na obtenção de variedades melhoradas que apresentem características que impactem significativamente a produtividade da cultura e, portanto, o seu mercado.

[0016] Historicamente, as pragas agrícolas são um dos principais fatores que acarretam prejuízos na agricultura. No Brasil, a principal praga da cana-de-açúcar é a espécie Diatraea saccharalis Fabricius, 1794 (Lepidoptera: Crambidae), popularmente conhecida como broca comum, broca-da-cana ou apenas broca. Esta é encontrada em praticamente toda extensão cultivada da cultura, cuja área é de aproximadamente 10 milhões de hectares na atual safra 2019/20 (CONAB, 2019).

[0017] Após o acasalamento, a fêmea da broca-da-cana deposita de 200 a 400 ovos, em ambas faces e também nas bainhas das folhas verdes. Após a eclosão dos ovos, as larvas neonatas alimentam-se do parênquima foliar, migrando para a região da bainha à procura de abrigo. Permanecem nesta região por 7 a 10 dias, alimentando-se pela raspagem da bainha da folha ou da casca dos entrenós jovens. Após uma ecdise, as lagartas perfuram a casca do colmo, penetrando em seu interior. O inseto abre galerias no interior dos colmos, geralmente no sentido ascendente, à medida que se alimenta. No interior do colmo a lagarta passa por, aproximadamente, seis ecdises antes de se tornar adulto alado (DINARDO-MIRANDA, 2014). Esta é a fase do desenvolvimento em que o inseto provoca os danos econômicos à cultura.

[0018] O ataque da broca-da-cana também causa graves danos secundários à qualidade da matéria-prima utilizada para a produção do açúcar e do álcool pois a perfuração do colmo da cana-de-açúcar pela broca cria condições para entrada de fungos e bactérias oportunistas, especialmente Fusarium moniliforme e Colletotrichum falcatum, causando a podridão vermelha. O complexo broca/podridão vermelha provocam deterioração fisiológica, microbiológica e tecnológica da cana-de-açúcar. As bactérias associadas à matéria-prima com podridão-vermelha produzem fermentações indesejáveis, resultando em produtos estranhos à fermentação alcoólica do processamento industrial. Além disso, estas bactérias também produzem ácidos orgânicos e gomas (dextranas) a partir dos açúcares contidos no mosto, que afetam negativamente a viabilidade das células de leveduras, requerendo sua substituição nas dornas de fermentação (PRECETTI e TERÁN, 1983; PRECETTI et al., 1988; BOTELHO e MACEDO, 2002). Outro problema decorrente da presença de bactérias nas dornas de fermentação é a possibilidade de ocorrência de floculação do fermento. Neste caso, as bactérias contaminantes formam uma mucilagem que agrega as células da levedura, provocando sua floculação. Além da perda de leveduras e da produtividade de açúcar, plantas atacadas por broca/podridão-vermelha também apresentam altos teores de compostos fenólicos (METCALF e LUCKMANN, 1994; PRICE, 1997).

[0019] Utilizando valores médios de perdas agrícola e no processo industrial de produção de açúcar e etanol causadas pela broca, e um índice de Intensidade de Infestação de 4%, muito comum nos canaviais brasileiros, somados aos custos de controle empregados, estima-se que esta praga causa perdas econômicas da ordem de mais de R$ 5 bilhões por ano ao setor sucroenergético brasileiro.

[0020] A broca da cana-de-açúcar é uma praga de difícil controle por inseticidas químicos, devido ao comportamento alimentar da larva no colmo, impedindo o contato efetivo do inseticida com o inseto. Alternativamente aos inseticidas químicos, as proteínas inseticidas, identificadas principalmente a partir da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), tem sido utilizadas com grande efetividade para o controle de pragas agrícolas, dentre elas Diatraea sp. Dentre as proteínas inseticidas derivadas de cepas Bt, as proteínas cristalinas Cry destacam-se pela toxicidade específica às larvas de espécies de lepidópteros, dípteros e coleópteros comuns como pragas agrícolas. Essas proteínas, produzidas como protoxinas (65-149 KDa), são solubilizadas e ativadas no intestino dos insetos suscetíveis por proteólise e se ligam à membrana das células intestinais, induzindo à lise osmótica do epitélio, o que ocasiona a morte do inseto.

[0021] As proteínas Cry são classificadas em diversos grupos de acordo com a homologia de suas sequências, dentre eles, o grupo de proteínas classificado como Cry1 apresenta alta especificidade contra insetos lepidópteros, sendo um excelente candidato para manipulação genética dos germoplasmas de cana-de-açúcar para produção de variedades resistentes à broca da cana. A expressão heteróloga de proteínas Cry1 em variedades de cana-de-açúcar, apesar de desafiador, possui grande potencial para o controle da broca da cana, reduzindo as perdas econômicas do setor sucroalcooleiro, assim como a liberação de inseticidas químicos no meio ambiente.

[0022] Persiste, portanto, a necessidade de desenvolvimento de estratégias para mitigar os danos causados à cultivos de cana-deaçúcar pela infestação de pragas, principalmente pela infestação pela praga broca-da-cana. Ao oferecer aos produtores de cana-de-açúcar variedades de alto potencial de produção para diferentes ambientes edafoclimáticos, aliada a uma característica de resistência à broca, a biotecnologia agrícola confere importante contribuição ao setor sucroenergético e aos plantadores de cana-de-açúcar brasileiros.

[0023] O evento de cana-de-açúcar geneticamente modificado CTC93209-4 apresentado pela presente invenção tem como o objetivo fornecer aos produtores de cana-de-açúcar brasileiros uma cultivar que possui o background genético da cultivar CTC9003 (Certificado de proteção de cultivar № 20130134) e que expresse a proteína Cry1Ac de forma a ser resistente à Diatraea saccharalis. Adicionalmente, o evento CTC93209-4 expressa ainda a proteína NptII, utilizada nos passos iniciais de transformação genética como marcador de seleção. A cultivar CTC9003 foi lançada em 2012, e apresentou área de plantio de aproximadamente 10 mil ha em 2016, tendo sido empregada na renovação dos canaviais, indicando tendência de crescimento no mercado de cultivares de cana-de-açúcar nos próximos anos.

Objetivos da invenção

[0024] É um primeiro objetivo prover polinucleotídeos que identifiquem de maneira inequívoca o evento CTC93209-4.

[0025] É um segundo objetivo descrever pares de iniciadores e sondas capazes de identificar os polinucleotídeos que caracterizam o evento CTC93209-4.

[0026] É um terceiro objetivo fornecer métodos de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4.

[0027] Como um quarto objetivo da presente invenção, descrevese uma construção genética capaz de conferir a uma variedade vegetal, preferencialmente uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), resistência à infestação por praga, particularmente pela praga Diatraea saccharalis, popularmente conhecida como broca comum, broca-dacana ou apenas broca.

[0028] O quinto objetivo da invenção define-se como um kit para detecção da presença do evento CTC93209-4 em uma amostra de material vegetal.

[0029] É um sexto objetivo da invenção prover um evento de canade-açúcar contendo a construção genética de interesse localizada em sítios definidos no genoma da variedade de cana de açúcar transformada, caracterizado por sequências flanqueadoras específicas.

[0030] Um sétimo objetivo da presente invenção se dá por meio de uma planta resistente à insetos.

[0031] O oitavo objetivo da presente invenção é prover um produto de comódite.

[0032] Por fim, são os nono e décimo objetivos da invenção prover um método de produção de uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto e o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente.

Breve Descrição da Invenção

[0033] O primeiro objetivo é alcançado por meio de polinucleotídeos que compreendem pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33.

[0034] O segundo objetivo da invenção é alcançado por meio de pares de iniciadores em que o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 10 e o iniciador antisenso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 11 e/ou o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 12 e o iniciador antisenso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:13. Adicionalmente, a invenção também descreve pares de iniciadores em que o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 18 e o iniciador antisenso possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 19 e/ou o iniciador senso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 20 e o iniciador antisenso possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:21.

[0035] O terceiro objetivo é alcançado por um método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 caracterizado por compreender as etapas de:

I.a obtenção de uma amostra para análise;
II.a extração do DNA da amostra;
III.o fornecimento de pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 36, e SEQ ID NO 37 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 37;
IV.a amplificação da região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
V.detecção da presença de produto da amplificação,

onde, o produto de amplificação é caracterizado por compreender nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33.

[0036] Ainda para atingir o terceiro objetivo, a presente invenção descreve um método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 caracterizado por compreender as etapas de:

I.a obter uma amostra para análise;
II.a extrair o DNA/RNA da amostra;
III.o fornecer uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO 33 e suas sequências complementares;
IV.a hibridizar a dita sonda com a amostra, e
V.a detectar a sonda hibridizada.

[0037] O quarto objetivo é alcançado através de construção genética, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0038] O quinto objetivo da invenção evidencia-se por meio de um kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 caracterizado por compreender um meio para detecção da presença em uma amostra de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33 e de suas sequências complementares e/ou uma proteína Cry.

[0039] Já o sexto objetivo concretiza-se por meio do evento CTC93209-4, o qual é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33. Adicionalmente, o evento CTC93209-4 é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.

[0040] O sétimo objetivo é alcançado por meio da planta compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33. Adicionalmente, a planta é caracterizada pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37;

[0041] O produto de comódite do oitavo objetivo da invenção é alcançado a partir de uma planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4.

[0042] O nono objetivo da presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto compreendendo cruzar uma primeira planta de cana-de-açúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4. Adicionalmente, a presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto compreendendo inserir um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido nas sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 através de recombinação homóloga.

[0043] Por fim, o décimo objetivo da invenção descreve o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo o evento CTC93209-4 para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.

Descrição resumida das Figuras

[0044] A Figura 1 representa o mapa do T-DNA introduzido no evento da presente invenção.

[0045] A Figura 2 representa o plasmídeo utilizado como base para construção do plasmídeo utilizado na presente invenção.

[0046] A Figura 3 representa o plasmídeo resultante, utilizado para a obtenção do evento de interesse.

[0047] A Figura 4 representa os mapas completos dos dois insertos presentes no evento CTC93209-4, contendo as regiões flanqueadoras esquerdas e direitas. Mapas de acordo com os resultados dos experimentos de sequenciamento por captura e iPCR (Inserto 1 = SEQ ID NO 36; Inserto 2 – SEQ ID NO 37).

[0048] A Figura 5 representa um dos gráficos de amplificação da qPCR via Taqman® (fluorescência relativa x ciclo) para o evento de interesse (representação dos resultados para amplificação da borda direita do inserto 2 – iniciadores SEQ ID NO 18 e 19; sonda = SEQ ID NO 22; amplicom – SEQ ID NO 24).

[0049] A Figura 6 é uma das curvas de melting da qPCR via SYBR GREEN™ (fluorescência relativa x temperatura) para o evento de interesse (representação dos resultados para amplificação da borda direita do inserto 2 – iniciadores SEQ ID NO 18 e 19; amplicom – SEQ ID NO 24). As setas indicam o pico específico de amplificação do evento de interesse bem como as linhas basais indicativas de ausência de amplificação para os demais eventos e controles negativos.

[0050] A Figura 7 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folhas do evento CTC93209-4 para ciclo de cana-planta. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0051] A Figura 8 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folhas do evento CTC93209-4 para ciclo de cana-planta e cana-soca. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0052] A Figura 9 é o resultado da comparação de médias da expressão de Cry1Ac em folha, colmo e raiz do evento CTC93209-4. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0053] A Figura 10 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em folhas do evento CTC93209-4 para ciclo de cana-planta. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0054] A Figura 11 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em folhas do evento CTC93209-4 para ciclo de cana-planta e cana-soca. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0055] A Figura 12 é o resultado da comparação de médias da expressão de NptII em colmo e folha do evento CTC93209-4. Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de t ao nível de 5% de probabilidade. Cada barra representa a média ± erro padrão, conforme resultados da análise conjunta.

[0056] A Figura 13 é o resultado da metodologia Western blot para identificação da proteína Cry1Ac. M: Marcador de peso molecular (KDA). R1 a R4: amostras do evento CTC93209-4. CN (Controle negativo): Cultivar CTC9003. CP (Controle positivo): 0,5 ng de proteína Cry1Ac diluída em proteínas totais extraídas da cultivar CTC9003. Ø: Poço vazio.

[0057] A Figura 14 é o resultado da metodologia Western blot para identificação da proteína NptII. M: marcador de peso molecular (kDa). R1, R2 e R3: repetições biológicas do evento CTC93209-4. CP (controle positivo): 0,5 ng de proteína NptII diluída em proteínas totais extraídas da cultivar CTC9003. CN (controle negativo): proteínas totais extraídas da cultivar CTC9003. Ø: poço vazio.

[0058] A Figura 15 representa fotos dos colmos cortados longitudinalmente para avaliação da intensidade de infestação causada pela inoculação artificial de Diatraea saccharalis. A: evento CTC93209- 4; B: CTC9003.

[0059] A Figura 16 representa a porcentagem do Índice de Infestação de Diatraea saccharalis no evento CTC93209-4 em relação aos tratamentos controles: CTC9003 produzida por cultura de tecidos (CTC9003-TC) e CTC9003 convencional. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

[0060] A Figura 17 apresenta uma representação esquemática do T-DNA do evento CTC93209-4. Estratégia de Southern blot utilizando duas enzimas de restrição: EcoRV e BamHI. O corte da enzima BamHI, ao final do gene cry1Ac, resulta na separação dos genes cry1Ac e nptII em diferentes fragmentos no gel. O corte da enzima EcoRV, na região espaçadora entre o T-DNA e a borda esquerda (LB), resulta em um único fragmento contendo ambos os genes. As sondas e o tamanho mínimo esperado dos fragmentos para cada enzima estão apresentados.

[0061] A Figura 18 apresenta resultados de Southern blot utilizando as enzimas de restrição EcoRV (esquerda) e BamHI (direita). Resultados para a hibridização com a sonda Cry que reconhece o gene cry1Ac. As setas indicam os fragmentos esperados. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia; 0,1C: controle positivo: 0,1 cópia. T0: cana planta. T1: soca 1; T2: soca 2; T3: soca 3.

[0062] A Figura 19 apresenta resultados de Southern blot utilizando as enzimas de restrição EcoRV (esquerda) e BamHI (direita). Resultados para a sonda nptII. As setas indicam os fragmentos esperados. M: marcador de peso molecular; WT: controle negativo; 1C: controle positivo 1 cópia; 0,1C: controle positivo: 0,1 cópia. T0: cana planta. T1: soca 1; T2: soca 2; T3: soca 3.

Descrição Detalhada da Invenção

[0063] Inicialmente, considera-se como "evento" a variedade vegetal produzida por qualquer método de modificação e/ou transformação genética que expresse de forma significativa e constante a característica que se desejava incluir nesta. Mais particularmente, no presente caso, considera-se "evento" a variedade vegetal, preferencialmente a variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) que, após modificação genética, expressa a característica de resistência à praga, particularmente à praga Diatraea saccharalis (broca-da-cana).

[0064] Ainda, para fins de referência, a não ser que expressamente mencionado ao contrário, por região LB entende-se a borda esquerda de transferência do T-DNA (5’), e por região RB entende-se a borda direita de transferência do T-DNA (3’).

[0065] Adicionalmente, todas as sequências biológicas aqui descritas, exceto onde explicitamente mencionado o contrário, englobam também sequências possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as sequências a que se referem.

[0066] Por fim, por material vegetal entende-se todo e qualquer tecido vegetal ou derivado deste, tais como, mas não limitados a, sementes, troncos, folhas, palhas, cascas, raízes, células, moléculas de origem vegetal, entre outros, e ainda todo e qualquer produto de uma planta ou derivado deste, por exemplo, mas não limitado a, seiva, açúcar, etanol, entre outros.

[0067] A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o isolamento de genes e sua inserção estável em um genoma hospedeiro. Esta técnica, também chamada de transformação genética, pode ser definida como a introdução controlada de ácidos nucleicos ("DNA" ou ADN) em um genoma receptor, excluindo-se a introdução por fecundação. É um processo controlado, onde normalmente apenas o fragmento definido de DNA é introduzido no genoma do hospedeiro, ou genoma receptor, devendo ser a ele integrado. A inserção estável dessas moléculas em um genoma hospedeiro dá origem a um indivíduo igual ou substancialmente igual ao receptor da molécula recombinante, porém acrescido de característica nova e particular. Por "substancialmente igual" entende-se como um organismo que possui mais do que 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade em relação ao organismo receptor.

[0068] Existem diversas técnicas de transformação genética de plantas, as quais podem, de maneira geral, serem agrupadas em duas categorias principais: transferência indireta e direta de genes. A transferência indireta é aquela em que o DNA exógeno é inserido no genoma pela ação de um vetor biológico ou qualquer outro tipo de molécula carreadora, sendo a sua inserção facilitada por mecanismos endógenos ou exógenos, enquanto que a direta é baseada principalmente em processos físico-bioquímicos.

[0069] Os tecidos e/ou células a serem transformados podem variar de acordoo com técnicas de transformação genética utilizada e de acordo com a espécies ou genótipo de era transformado. De maneira geral, esses tecidos incluem, sem limitação, calos embriogênicos, calos, protoplastos, embriões, embriões somáticos, tecidos meristemáticos, e qualquer parte, tecido ou célula vegetal que possui capacidade regenerativa.

[0070] A transformação indireta baseia-se principalmente no sistema mediado por bactérias do gênero Agrobacterium e tem sido o método mais utilizado para obtenção de plantas transgênicas, por apresentar algumas vantagens como, por exemplo, a possiblidade de transferência de segmentos de DNA relativamente longos com nenhum rearranjo e integração de baixo número de cópias dos transgenes, garantindo maior estabilidade genotípica para os eventos gerados. Diversas espécies e linhagens de Agrobacterium, plasmídeos e protocolos têm sido desenvolvidos e adaptados para a transformação genética de diversas espécies de plantas. As vantagens do método de transformação mediado por Agrobacterium incluem a maior probabilidade de inserções cópia única, a integração estável e herança genética das características introduzidas, assim como expressão gênica consistente através das gerações, além de menores chances de silenciamento gênico.

[0071] Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias fitopatogênicas de solo, gram negativas, pertencentes à família Rhizobiaceae, que causam doenças em dicotiledôneas, conhecidas como galhas da coroa e raiz em cabeleira, respectivamente. Nesta interação planta-patógeno ocorre um processo de transferência natural de genes entre a agrobactéria e a célula vegetal, quando fragmentos de DNA bacteriano são transferidos para dentro da célula vegetal (T-DNA), integrando-se ao genoma nuclear. Em sua forma natural, a bactéria transfere o T-DNA ("transferred DNA"), que é parte do plasmídeo bacteriano denominado Ti ("tumour-inducing"), e este se integra ao genoma das células de plantas infectadas. No fragmento de T-DNA que é transferido para a célula vegetal estão os genes envolvidos na biossíntese constitutiva de fitohormônios (auxinas e citocininas) que alteram o programa de desenvolvimento normal do tecido infectado, ocasionando a formação do tumor. Além disso, contém também oncogenes para a síntese de açúcares e aminoácidos denominados de opinas, que são responsáveis pela sobrevivência da bactéria, que os utilizam como fonte de carbono e nitrogênio (Oger et al. 1997). Extremidades repetidas de 25 pares de base (pb) nas bordas direita e esquerda delimitam o T-DNA, e são imprescindíveis para sua transferência. Compostos fenólicos liberados pelos tecidos vegetais lesionados ativam regiões especificas (regiões vir), iniciando o processo de transferência do T-DNA para a célula vegetal. A Agrobacterium possui também genes cromossomais (chv) que garantem a ligação entre as células bacteriana e hospedeira, permitindo a formação do poro de passagem do complexo contendo o T-DNA (Sheng & Citovsky. 1996).

[0072] Uma vez que o segmento a ser transferido (transgene) é definido por suas bordas, qualquer sequência flanqueada pelas bordas pode ser transferida para uma planta por meio da agrobacteria, possibilitando a manipulação dessas sequências para transferência de sequências codificadoras de interesse. A substituição ou eliminação das regiões codificadoras do T-DNA do tipo selvagem (oncogenes), permitem a geração de linhagens de Agrobacterium não oncogênicas (desarmadas) e carreadoras das sequências de interesse, sem prejuízo a transferência do T-DNA para as plantas desde que os genes de virulência (região vir) sejam mantidos.

[0073] Adicionalmente, o sistema de transformação indireta por Agrobacterium permite o uso de construções artificiais de plasmídeos para a transferência de genes para as plantas desde que os mesmos contenham tais bordas de T-DNA, possibilitando uma grande flexibilidade para uso das ferramentas moleculares e materiais disponíveis e desenvolvidos para outras cepas bacterianas.

[0074] Estas construções artificiais de plasmídeos possuem promotores de diversas origens, entre eles promotores de genes de plantas, promotores virais, bacterianos e/ou quiméricos, além de genes que conferem resistência a antibióticos, resistência a herbicidas ou que possuam atividade enzimática (phosphomannose isomerase (PMI)/mannose (Man)) de forma a fazer com que estes marcadores possam ser usados para a seleção de células ou plantas transformadas.

[0075] Adicionalmente, essas construções podem conter genes auxiliares que interferem em vias de sinalização relevantes para a morfogênese de tecidos vegetais, aumentando a eficiência do processo de modificação genética e regeneração. Destacam-se, sem limitações: LEAFY COTYLEDON1 (Lotan et al., 1998), Lec1 (Lowe et al., 2002), LEAFY COTYLEDON2 (Stone et al., 2001), WUSCHEL (WUS; Zuo et al., 2002), e BABY BOOM (BBM; Boutilier et al., 2002), entre outros.

[0076] Em um primeiro aspecto da presente invenção, o DNA estranho ou exógeno que será introduzido na planta é clonado em um plasmídeo binário, entre as sequências consenso das bordas esquerda e direita (T-DNA). O plasmídeo binário é transferido para uma célula de Agrobacterium, que é subsequentemente utilizada para infectar o tecido vegetal. A região do T-DNA do vetor que compreende o DNA exógeno é inserida no genoma da planta. O cassete de expressão com o gene marcador e o cassete de expressão com o gene da característica podem estar presentes na mesma região do T-DNA, em regiões diferentes do T-DNA no mesmo plasmídeo, ou ainda em regiões diferentes do T-DNA em plasmídeos diferentes. Em uma modalidade da presente invenção, os cassetes estão presentes na mesma região do T-DNA. O versado na técnica está familiarizado com os métodos de transformação indireta por Agrobacterium.

[0077] Ainda de modo alternativo, a transferência direta do DNA pode ser utilizada para introduzir o DNA diretamente em uma célula vegetal. Esses métodos oferecem uma alternativa para a integração de um gene de interesse com toxicidade celular mínima em locais aleatórios do genoma. Nesses casos a introdução do DNA exógeno é realizada sem o auxílio de um vetor. Um método adequado de transferência direta do DNA pode ser o bombardeio de células vegetais com um vetor que compreende o DNA para a inserção utilizando uma pistola de partículas (transformação por biolística mediada por partículas). Outros métodos para transformação de células vegetais incluem a transformação de protoplastos (opcionalmente na presença de polietilenoglicóis); o tratamento com ultra-som de tecidos, células ou protoplastos vegetais em um meio compreendendo o polinucleotídeo ou o vetor; sonicação, a microinjeção do polinucleotídeo ou do vetor no material vegetal; macroinjeção, eletroporação de células vegetais e similares, infiltração a vácuo, uso de fibras de carboneto de silício, transformação química mediada por polietileno glicol (PEG), entre outros. Dentre as desvantagens associadas aos métodos de transformação direta estão os desafios relacionadas a regeneração e baixa expressão dos transgenes.

[0078] Ainda de modo alternativo, a transformação genética pode ser realizada de maneira sítio dirigida através da recombinação homóloga auxiliada por nucleases (edição genômica). Nos últimos anos, a tecnologia de edição genômica baseada no uso de nucleases "engenheiradas" ou quiméricas tem ganhado destaque, possibilitando a geração de organismos geneticamente modificados de maneira mais precisa e específica. Nesse caso, a introdução de genes exógenos ocorre através de mecanismos de recombinação homóloga através da introdução de um molde de recombinação homóloga (HR) contendo o DNA de interesse ligado a um fragmento de DNA homólogo ao genoma do organismo receptor. Dentre as ferramentas disponíveis estão o sistema enzimático quimérico CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats) - Cas, além das nucleases Zinc finger (ZFN) e TAL effector nucleases (TALENs). Os sistemas CRISPR/Cas são sistemas enzimáticos que compreendem 2 componentes principais: uma endonuclease (Cas) e um RNA guia (single-guide RNA - sgRNA). O RNA guia compreende 2 partes principais: "crispr RNA" (crRNA), uma sequência de 17-20 nucleotídeos complementar a sítios específicos no DNA genômico; "tracr RNA", um molde para ligação da nuclease Cas, responsável por guiar a endonuclease para o local específico de clivagem. A clivagem específica realizada pela endonuclease e direcionada pelo RNA guia pode ser reparada através de recombinação homóloga, integrando de maneira sítio dirigida o DNA exógeno flanqueado por sequências homólogas ao sítio de clivagem. A introdução desse sistema enzimático na célula pode ocorrer de diversas maneiras, utilizando plasmídeos, através de transformação direta ou indireta, ou ainda utilizando-se de proteínas e outras moléculas carregadoras. A expressão dos componentes do sistema pode ocorrer de forma transiente ou estável utilizando a maquinaria celular do organismo receptor ou ainda ser realizada de maneira exógena, e nesse caso, os componentes do sistema são entregues na célula "prontos para uso" (endonucleases + sgRNAs transcritos in vitro e combinados antes da sua introdução na célula). A descrição aqui apresentada não deve ser considerado exaustiva e, portanto, o uso de tais métodos de edição genômica dentro do escopo da presente invenção não deve ser limitado à descrição apresentada, estando contemplado a aplicação de variações desses sistemas e métodos, conforme conhecidas no Estado da Arte, bem como aquelas que ainda estão por serem descobertas.

[0079] Após a transformação, as plantas transgênicas devem ser regeneradas partindo do tecido vegetal transformado e a progênie que possui DNA exógeno selecionada utilizando um marcador apropriado tal como a resistência à canamicina, geneticina ou glufosinato de amônio. O versado na técnica está familiarizado com a composição de meios de regeneração adequados.

[0080] Alternativamente, outros métodos de seleção podem ser aplicados, sem a necessidade da introdução no organismo receptor de um marcador de seleção conforme acima exemplificado.

[0081] Em uma modalidade preferida, a transformação genética é mediada por meio de uma bactéria do gênero Agrobacterium.

[0082] Em uma modalidade ainda mais preferida, a transformação genética é mediada por Agrobacterium tumefasciens.

[0083] O evento CTC93209-4 exibe um novo genótipo que compreende dois cassetes de expressão. O primeiro cassete de expressão compreende um promotor adequado para a expressão em plantas ligado de forma operacional a um gene que codifica uma toxina inseticida Cry1Ac, útil no controle de pragas de insetos lepidópteros e um sinal de poliadenilação adequados. O segundo cassete de expressão compreende um promotor adequado para a expressão em plantas ligado de forma operacional a um gene que codifica uma proteína utilizada como marcador seletivo na obtenção do evento da presente invenção.

[0084] Os promotores adequados podem ser isolados ou expressos, entre outros organismos, em plantas. Vários promotores foram isolados ou desenvolvidos incluindo promotores constitutivos, do tipo "liga e desliga", responsivos a estresses abióticos, específicos aos tecidos, entre outros. Muitos desses promotores possuem sequências intrônicas descritas como relevantes para uma expressão adequada dos genes. Em um aspecto preferido da invenção, os promotores são promotores constitutivos e podem ser selecionados do grupo não limitante consistindo de CaMV 35S, CoYMV (Commelina yellow mottle virus), FMV 35S, Ubiquitina, promotor de Actina de arroz (Act-1), Act-2, promotor da nopalina sintase (NOS), promotor da octopina sintase (OCS), promotor da desidrogenase alcoólica de milho (Adh-1), PvUbi1, entre outros.

[0085] Em uma modalidade da invenção, o promotor é o promotor do gene de Ubiquitina de milho (pUBI). Em uma modalidade ainda mais preferida, o promotor de Ubiquitina de milho contém um íntron na sequência 5’ do RNA líder.

[0086] A região promotora da presente invenção (UBI-1) possui 1992 pares de bases que são subdivididas em: fragmento promotor (899 bases), primeiro éxon do gene da poliubiquitina-1 (83 bases) e primeiro íntron (1.010 bases).

[0087] Elementos adicionais tais como sequências intensificadoras e direcionadores (transportadores) também podem ser incorporadas no cassete de expressão com a finalidade de melhorar os níveis de expressão gênica, por exemplo, intensificadores de transcrição ou tradução, tais como, os intensificadores CaMV 35S, FMV 35S, Nos, supP, entre outras.

[0088] As sequências terminadoras também estão contempladas no cassete de expressão. Exemplos de sinais de poliadenilação adequados e funcionais nas plantas incluem o proveniente do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens, o proveniente do gene do inibidor II da proteinase, rbcS (pea ribulose‐1,5‐bisphosphate carboxylase small subunit), Lhcb1 (tobacco chlorophyll a/b‐binding proteins), CaMV 35S, octopina sintase, o proveniente do gene da alfatubulina, entre outros.

[0089] Em uma modalidade da presente invenção, o sinal de poliadenilação é aquele proveniente do gene nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens.

[0090] Preferivelmente, a expressão dos genes cry1Ac e nptII é regulada pelo promotor do gene da ubiquitina do milho - UBI-1 (que possui um íntron endógeno). Ambos os cassetes de expressão utilizam o terminador da nopalina sintase - NOS, de Agrobacterium tumefaciens.

[0091] O gene cry1Ac codifica uma toxina de 615 aminoácidos com peso molecular estimado de 68 KDa, originária de Bacillus thuringiensis serovar kustaki (estirpe HD73) que confere resistência à Diatraea saccharalis (broca-da-cana). A presente invenção contempla modificações do gene para a expressão apenas do núcleo tríptico ativo da proteína Cry1Ac nativa. Assim, em uma modalidade preferida da presente invenção, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Ac é truncado, codificando o núcleo tríptico inseticida de 52 KDa. O núcleo tríptico é responsável pela atividade inseticida da proteína, ligando-se a proteínas específicas do intestino do inseto levando à disrupção da integridade funcional e anatômica deste órgão que altera a absorção de nutrientes e rápida toxicidade e morte do inseto.

[0092] De acordo com a invenção, o polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1Ac pode ter códons otimizados ou alterados de outra maneira para melhora da sua expressão no material vegetal. Tal otimização de códons pode ser utilizada para alterar a estrutura secundária prevista do produto da transcrição de RNA produzido em qualquer célula transformada ou para destruir os elementos da instabilidade crípticos de RNA presentes no produto da transcrição não alterado, aumentando assim a estabilidade e/ou a disponibilidade do produto da transcrição na célula transformada.

[0093] Preferivelmente, o gene cry1Ac presente no evento da invenção corresponde a uma sequência de DNA sintética, truncada e otimizada com códons preferidos de cana-de-açúcar. Em um aspecto ainda mais preferido da presente invenção, o gene cry1Ac apresenta a sequência SEQ ID NO 34.

[0094] Vários genes marcadores para seleção de eventos em plantas já foram caracterizados, incluindo alguns que conferem tolerância a antibióticos e outros que conferem resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores que podem ser selecionados para uso na presente invenção incluem aqueles que conferem resistência ou tolerância a higromicina, canamicina, gentamicina, glifosato, glufosinato de amônio ou resistência a toxinas tais como a eutipina. Também estão disponíveis outras formas de seleção tais como os sistemas de seleção baseados em hormônio, seleção visual através da expressão de proteínas fluorescentes, manose isomerase, xilose isomerase, entre outros. Em uma modalidade da presente invenção, o gene marcador para seleção do evento da presente invenção é um que confere tolerância à antibióticos da classe dos aminoglicosídeos.

[0095] Em uma modalidade preferida da invenção, o gene marcador utilizado no segundo cassete de expressão é o gene nptII, o qual codifica a enzima neomicina fosfotransferase II (nptII) de 265 aminoácidos com peso molecular estimado de 29,2KDa. Em um aspecto ainda mais preferido da presente invenção, o gene nptII apresenta a sequência SEQ ID NO 35. A neomicina fosfotransferase II confere resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, como a canamicina e a geneticina. O gene nptII utilizado como marcador de seleção na obtenção dos eventos transformados é derivado do transposon Tn5 de Escherichia coli como descrito por BECK et al. (1982). A proteína NptII é produzida por vários procariontes amplamente encontrados no meio ambiente, tanto em habitats aquáticos e terrestres, como na microflora intestinal humana e animal. A proteína NptII inativa antibióticos aminoglicosídicos como neomicina, gentamicina, paromicina e canamicinas A, B e C utilizando-se de adenosina-trifosfato (ATP) para fosforilá-los, evitando assim que causem injúrias às células quando expostas aos antibióticos mencionados. Esse mecanismo possibilita seu uso como marcador de seleção de plantas transformadas.

[0096] O uso de genes marcadores de seleção, como o gene nptII, é importante para selecionar as células transformadas no processo de modificação genética (HORSCH et al., 1985). O objetivo da inserção do gene nptII no evento da presente invenção foi, portanto, a seleção de células transformadas com o gene cry1Ac.

[0097] Além dos cassetes de expressão descritos, cassetes de expressão adicionais são opcionalmente compreendidos no evento CTC93209-4.

[0098] O primeiro e segundo cassetes de expressão compreendidos no evento CTC93209-4 podem ser introduzidos na planta no mesmo ou em plasmídeos diferentes. Se o primeiro e segundo cassetes de expressão estiverem presentes no mesmo plasmídeo e foram introduzidos na planta por meio de um método de transformação mediado por Agrobacterium, podem estar presentes dentro das mesmas ou de regiões diferentes do T-DNA. Em uma modalidade da presente invenção, o primeiro e o segundo cassete de expressão estão presentes na mesma região do T-DNA.

[0099] Mais particularmente, o evento da presente invenção foi obtido por transformação mediada por Agrobacterium tumefasciens com uma construção genética compreendendo um fragmento de DNA (TDNA) contendo os cassetes de expressão dos genes cry1Ac e nptII (Figura 1). Preferivelmente, a construção genética da presente invenção é caracterizada pelo fato de que compreende a sequência nucleotídica possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:1.

[0100] O evento da presente invenção foi obtido por transformação mediada por Agrobacterium tumefasciens compreendendo o fragmento de T- DNA conforme definido acima (SEQ ID NO:1).

[0101] Este fragmento de T-DNA foi inserido dentro de um plasmídeo binário que contém em seu espectro de hospedeiro as bactérias Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens. Os elementos genéticos específicos, as origens dos componentes do plasmídeo binário original da presente invenção são apresentadas na Figura 2. Seu tamanho original total é de 5.018 pb e sua estrutura conta com:

1. o gene aadA, que confere resistência, em bactérias, ao antibiótico espectinomicina;
2. origem de replicação para E. coli do plasmídeo pBR322;
3. origem de replicação para A. tumefasciens do plasmídeo pVS1;
4. elementos de controle necessários;
5. bordas direita e esquerda para transferência do T-DNA, ambas do tipo nopalina;
6. e um sítio de múltipla clonagem.

[0102] O plasmídeo binário compreendendo a construção da presente invenção é representado na Figura 3. Em uma modalidade preferida, a construção genética da presente invenção é caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:26.

[0103] A referida construção genética foi inserida por choque térmico na cepa de DH5α de Escherichia coli. Uma colônia isolada contendo a construção (SEQ ID NO 26) foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 150 μg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C, com agitação à 250 rpm por um período de 16 horas. Prepararam-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer -80°C. A partir da mesma suspenção bacteriana extraiu-se DNA plasmidial utilizando-se QIAGEN Plasmid Giga Kit segundo as recomendações do fabricante (Qiagen, Alemanha).

[0104] A construção SEQ ID NO 26 foi então transferida para uma cepa de Agrobacterium tumefaciens (vetor) por meio de técnicas conhecidas por um técnico no assunto, como por exemplo, eletroporação, choque térmico, entre outras. Preferivelmente, a construção é transferida para uma cepa de Agrobacterium tumefaciens por meio de eletroporação. Uma colônia isolada de agrobactéria contendo a construção é inoculada em meio LB líquido suplementado com 100 μg/ml de espectinomicina e 50 μg/ml de rifampicina e incubada a 28°C, com agitação de 200 rpm por um período de 24 horas. Estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) são preparados e armazenados em ultrafreezer -80°C. Esses estoques são utilizados nos experimentos de transformação genética.

[0105] Em uma modalidade ainda mais preferida, o vetor é uma cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.

[0106] É ainda descrito um método para produção do evento de interesse. Em uma modalidade preferida, o referido método compreende as etapas de:

I.Introdução da construção genética em uma cepa de Agrobactéria;
II.Obtenção de calos embriogênicos de palmitos de uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.);
III.Co-cultivo dos calos embriogênicos com a Agrobactéria da etapa I;
IV.Seleção de células transformadas que contém o fragmento funcional em meio de cultura contendo geneticina; e
V.Regeneração de plantas de cana-de-açúcar transformadas.

[0107] Em um aspecto da presente invenção, o método para a produção do evento de interesse é baseado ou idêntico ao descrito pelo BR 11 2017 005441, cujos ensinamentos são incorporados à presente invenção.

[0108] O versado na técnica está familiarizado com a composição de meios de cultura adequados para a geração de calos embriogênicos (etapa II), assim como dos meios das etapas de co-cultivo (etapa III: cocultivo + descanso), seleção (etapa IV) e regeneração (etapa V; regeneração + elongação). Preferencialmente, os meios de cultura utilizados são baseados em composições compreendo ingredientes tais como, os sais MS (Murashige e Skoog, 1962), sacarose, vitaminas B5 e, opcionalmente: aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina; hidrolisado de caseína; ácido cítrico; manitol; sulfato de cobre; glicina; agente gelificante; auxinas; antibióticos; acetoseringona; e agentes de seleção. Destaca-se o uso de auxinas nos meios de geração de calos embriogênicos, co-cultivo e seleção, assim como geneticina no meio de seleção.

[0109] A etapa de "co-cultivo" refere-se à incubação do tecido de planta infectado ou que entrou em contato com Agrobacterium, de forma a permitir a transferência de T-DNA da Agrobacterium para as células de plantas. Esta etapa corresponde ao período entre o momento logo após a inoculação (contato da Agrobacterium com o tecido vegetal) até o momento em que a bactéria é retirada ou inativada.

[0110] O tecido inoculado pode ser co-cultivado por cerca de 1 a 30 dias, preferencialmente de 1 a 20, mais preferencialmente de 1 a 10.

[0111] Durante a etapa de co-cultivo, a temperatura pode ser qualquer temperatura adequada para a planta alvo conhecida na técnica. Ilustrativamente, para cana-de-açúcar, a temperatura pode variar entre cerca de 15°C a cerca de 30°C e de cerca de 16°C a cerca de 29°C. Em algumas concretizações, a etapa de co-cultivo ocorre na ausência de luz.

[0112] Após o co-cultivo com Agrobacterium, o meio é retirado e as células são transferidas para um meio de cultura na ausência de Agrobacterium, sendo incubadas no escuro, à temperatura de 20°C a cerca de 26°C, por um período de 1 a 20 dias.

[0113] O método aqui provido ainda inclui selecionar as células compreendendo pelo menos uma cópia da sequência genética de interesse. "Selecionar", como aqui utilizado, significa a situação em que é utilizado um agente seletivo para os transformantes, onde o dito agente seletivo irá permitir o crescimento preferencial de células de plantas contendo pelo menos uma cópia do gene marcador posicionado dentro do T-DNA e transferido pela Agrobacterium em detrimento daquelas células que não foram transformadas. Como indicado acima, qualquer marcador de seleção adequado pode ser utilizado. Preferencialmente, o gene marcador de seleção é utilizado é o gene nptII, o qual codifica uma enzima que confere resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, como a canamicina e a geneticina.

[0114] Em algumas concretizações, é adicionado também um agente que inibe o crescimento de Agrobacterium após a etapa III.

[0115] A seleção pode ocorrer em condições de claro ou escuro, dependendo da espécie de planta sendo transformada, e do genótipo, por exemplo. Em alguns casos, os calos embriogênicos ou outros tecidos submetidos à transformação podem ser sub-cultivados em intervalos regulares ou irregulares no mesmo meio. No caso de transformação de calos, é possível manter calos individuais separados para garantir que apenas uma planta seja regenerada por calo e, portanto, todas as plantas regeneradas são derivadas de eventos de transformação independentes. Em uma concretização preferida, a etapa de seleção ocorre no escuro, por cerca de 1 a 10 semanas, mais preferencialmente de 2 a 5 semanas, utilizando como agente de seleção o glufosinato de amônio.

[0116] Após o período de seleção, o tecido vegetal que continuou crescendo em presença do agente de seleção, e que, portanto, foi geneticamente modificado, pode ser manipulado e regenerado, colocando-o em meios de cultura e condições de crescimento adequados. As plantas transgênicas assim obtidas podem ser testadas para a presença do DNA de interesse. O termo "regenerar", para fins desta invenção, refere-se à formação de uma planta, que inclui uma parte aérea e raízes. As plantas regeneradas podem ser plantadas em substrato adequado, como por exemplo, solo e serem transferidas para a casa de vegetação. Como aqui usado, "geneticamente modificado" ou "transgênico" ou "estavelmente transformado" significa uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta que compreende uma sequência de DNA de interesse que é introduzida dentro do seu genoma por meio de transformação.

[0117] Em uma modalidade, a bactéria é do gênero Agrobacterium.

[0118] Em uma modalidade mais preferida, a bactéria é a Agrobacterium tumefaciens.

[0119] Em uma modalidade ainda mais preferida, a bactéria é uma cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.

[0120] A presente invenção também se refere a caracterização do evento selecionado (CTC93209-4) e métodos de detecção de material vegetal derivado do mesmo. Os métodos analíticos para detecção e caracterização de plantas transgênicas incluem métodos indiretos (métodos de detecção baseados em proteínas) ou métodos diretos (métodos de detecção baseados em DNA)

[0121] A definição do sítio de integração estável do T-DNA no genoma das células hospedeiras e caracterização das sequências flanqueadoras é necessária para o desenvolvimento e validação de metodologias para a identificação e caracterização inequívoca do evento.

[0122] O evento CTC93209-4 possui duas cópias do T-DNA (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3) estavelmente integradas no genoma do organismo receptor (CTC9003 - Certificado de proteção de cultivar № 20130134). Qualquer uma das cópias inseridas, assim como qualquer uma das suas sequências flanqueadoras, isoladamente ou em combinação, podem ser utilizadas para a identificação inequívoca do evento e sua caracterização. Preferivelmente, a identificação e caracterização inequívoca do evento ocorre através das sequências de junção entre as sequências de T-DNA inseridos e as suas sequências flanqueadoras.

[0123] Para identificar as regiões flanqueadoras das extremidades dos insertos de T-DNA presentes no evento CTC93209-4, foram realizados vários experimentos de amplificação e sequenciamento de DNA. Ensaios de PCR reverso (iPCR) foram realizados para ambas extremidades das sequências de T-DNA (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3) com o objetivo de isolar e clonar as regiões flanqueadoras dos insertos. Posteriormente, os fragmentos obtidos e isolados foram sequenciados por Sanger para validação dos resultados obtidos por iPCR. O mapa das inserções genéticas presentes no evento CTC93209-4 é representado na Figura 4 (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3). As sequências flanqueadoras do evento CTC93209-4 são caracterizadas por compreender nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41.

[0124] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da sequência SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 30. Em um aspecto adicional da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 17.

[0125] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 31 Em um aspecto da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 16.

[0126] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 32 Em um aspecto da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 25.

[0127] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO 33 Em um aspecto da invenção, o dito polinucleotídeo é caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 24.

[0128] Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 4. Em um mesmo aspecto da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 5. Em um aspecto adicional é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 6. Ainda em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 7. Ainda é fornecido pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 8. Ainda em um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 36. Adicionalmente, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 9. Ainda em um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 37.

[0129] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 30. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 30. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 30.
Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 30. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 17.

[0130] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31 Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 31. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 16.

[0131] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32 Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 32. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 25.

[0132] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, é fornecido uma planta que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO. 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33 Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33. Em uma modalidade, a planta compreende a SEQ ID NO 33. Em uma modalidade adicional, a planta compreende a SEQ ID NO 24.

[0133] Adicionalmente, a dita planta é resistente a insetos e é caracterizada por compreender pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 8. Ainda em um aspecto adicional, a planta resistente a insetos da presente invenção é caracterizada por compreender pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 36. Adicionalmente ou alternativamente, a dita planta é resistente a insetos e é caracterizada por compreender pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 9. Ainda em um aspecto da invenção, a dita planta resistente a insetos é caracterizada por compreender pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO 37. Em uma modalidade da presente invenção, a dita planta é uma planta de cana-de-açúcar. Em uma modalidade adicional, a dita planta é uma planta de cana-de-açúcar inseticida que é o evento CTC93209-4 ou uma planta derivada da mesma.

[0134] Em um aspecto da invenção, é fornecido o evento CTC93209-4 caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-deaçúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33. Adicionalmente, o evento CTC93209-4 é caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9. Em um aspecto adicional, o evento CTC93209-4 é caracterizado pelo fato de compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.

[0135] É ainda desejável um método para detecção e caracterização inequívoca do evento de interesse (evento específico).

[0136] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de detecção de material vegetal derivado do evento transgênico CTC93209-4 que compreende:

I. a obtenção de uma amostra para análise;
II. a extração do DNA da amostra;
III. o fornecimento de pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO 36 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 36; e SEQ ID NO 37 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 37;
IV. a amplificação da região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
V. detecção da presença do produto da amplificação,

[0137] Conforme o método de detecção descrito, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37 ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37. Adicionalmente, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37,ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde, o produto de amplificação detectado na etapa V é caracterizado por compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33. Em um aspecto adicional, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37,ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde, o produto de amplificação detectado na etapa V é caracterizado por compreender pelo menos 104 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 e SEQ ID NO 7 ou suas sequências complementares.

[0138] Em uma modalidade, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9. Em uma modalidade adicional, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9. Adicionalmente, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, onde, o produto de amplificação detectado na etapa V é caracterizado por compreender pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33. Em mais uma modalidade, a invenção escreve pares iniciadores planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9, onde, o produto de amplificação detectado na etapa V é caracterizado por compreender pelo menos 104 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 e SEQ ID NO 7 ou suas sequências complementares.

[0139] Em uma modalidade, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37,ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um dos iniciadores compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41ou de suas sequências complementares.

[0140] Em uma modalidade, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37,ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um dos iniciadores compreende pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41ou de suas sequências complementares.

[0141] Adicionalmente, os pares iniciadores, conforme o método de detecção descrito, são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um dos iniciadores compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41ou de suas sequências complementares.

[0142] Preferencialmente, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares e um segundo iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3 ou das suas sequências complementares.

[0143] Em uma modalidade, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador que compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares e um segundo iniciador que compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3 ou das suas sequências complementares.

[0144] Em uma modalidade adicional, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador que compreende pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares e um segundo iniciador que compreende pelo menos 7 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3 ou das suas sequências complementares.. Ainda nessa modalidade, os pares iniciadores são planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, ou das sequências complementares da SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37, onde pelo menos um par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares e um segundo iniciador que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3 ou das suas sequências complementares.

[0145] Em um aspecto particular, os pares de iniciadores utilizados na etapa III do método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 são caracterizados pelo fato de serem selecionados do grupo consistindo de sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.

[0146] É de conhecimento geral, em especial aos versados na técnica, que a molécula de DNA (ou ADN) é constituída por duas cadeias ou fitas de nucleotídeos que se mantêm unidas por pontes de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos. O pareamento ocorre de acordo com a complementariedade das bases, seguindo a regra geral de: Adenina com Timina e Citosina com Guanina. Assim, apesar da representação das sequências nucleotídicas ser realizada apenas para uma das fitas, a sua fita complementar ou sequência complementar está incluída no escopo dessa invenção, sendo considerada para a definição das sequências iniciadoras e sondas aqui descritas.

[0147] Os métodos para obtenção de amostras para extração de DNA para análises moleculares são amplamente conhecidos por um técnico no assunto e incluem a coleta de qualquer material vegetal derivado do evento transgênico CTC93209-4, como por exemplo colmo, raízes e folhas. Preferencialmente, as amostras são obtidas de folhas intactas. Métodos de extração de DNA vegetal incluem, sem limitação, aqueles baseados no uso do detergente CTAB (Alianabi et al., 1999), seguidos ou não de purificação posterior da amostra com cloreto de césio ou acetato de amônio, além dos métodos comerciais disponíveis.

[0148] Pares de iniciadores adequados para uso neste método de detecção podem ser planejados utilizando parâmetros bem-conhecidos pelos versados na técnica da biologia molecular agora que as SEQs IDs da presente invenção ficaram disponíveis. Por exemplo, um ou ambos os iniciadores do par podem ser planejados para serem específicos a construção, específicos ao gene da característica, específicos ao promotor, específicos à sequência da junção entre o DNA inserido e o DNA genômico e/ou específicos às sequências flanqueadoras.

[0149] Há muitos métodos de amplificação que podem ser utilizados de acordo com este aspecto da invenção. O princípio básico, uma das técnicas conhecida pelos versados na arte, é a reação em cadeia da polimerase (PCR). O produto da amplificação de uma reação da PCR pode ser visualizado através da coloração da cadeia nucleotídica, com, por exemplo, brometo de etídio, e a excitação com luz UV, tipicamente após a separação em tamanhos utilizando a eletroforese em gel de agarose.

[0150] Uma das modalidades da presente invenção emprega variações do princípio da PCR como, por exemplo, PCR quantitativo em tempo real, PCR aninhadas (nested PCR), PCR inversa (iPCR), PCR digital, Long PCR, Touchdown PCR, Hot Start PCR, Multiplex PCR, entre outros. O produto da amplificação também pode ser detectado por diferentes metodologias, as quais estão contempladas na presente invenção, como por exemplo, o sistema de SYBR GreenTM, o qual emite fluorescência quando este reagente se liga ao DNA de fita dupla e o sistema Taqman®, onde a detecção é baseado na interação de sondas fluorescentes. A metodologia Taqman® usa uma sonda que é complementar ao segmento do produto da PCR pretendido, localizada entre os iniciadores da reação. Durante a etapa de hibridização do ciclo da PCR a sonda está ligada ao DNA-alvo, e durante a extensão da Taq polimerase, através da sua atividade de 5’-exonuclease, remove a sonda, liberando o fluorocromo apresentador, permitindo a emissão de sua fluorescência. Modalidades adicionais desse aspecto da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: amplificação isotermal em loop ("loop-mediated isothermal amplification - LAMP"), eletroforese capilar em gel ("capillary gel electrophoresis – CGE"), "microarray", tecnologia Luminex, "DNA walking" e "Next Generation Sequencing (NGS), método de Sanger, Illumina, entre outros.

[0151] A presente invenção descreve uma metodologia de detecção específica baseada na técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) conhecida como "Plus-Minus" ou "Presença–Ausência", sendo apresentado duas variações da metodologia: via SYBR GREEN™ e via tecnologia Taqman®.

[0152] Em uma modalidade da presente invenção, são fornecidos pares de iniciadores para a detecção do inserto 1 caracterizados pelo fato de que o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 10 e o iniciador antisenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 11 e/ou o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 12 e o iniciador antisenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 13. Adicionalmente, o amplicom produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 é visualizado através de uma sonda marcada de sequência SEQ ID NO. 14. O amplicom produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 é visualizado através de uma sonda marcada de sequência SEQ ID NO. 15. Em uma modalidade ainda mais específica, o amplicon produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 16 e o amplicon produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 17.

[0153] Em uma outra modalidade, são fornecidos pares de iniciadores para a detecção do inserto 2 caracterizados pelo fato de que o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 18 e o iniciador antisenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 19 e/ou o iniciador senso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 20 e o iniciador antisenso possui pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 21. Adicionalmente, o amplicom produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 é visualizado através de uma sonda marcada de sequência SEQ ID NO. 22. O amplicom produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 é visualizado através de uma sonda marcada de sequência SEQ ID NO. 23. Em uma modalidade ainda mais específica, o amplicon produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 24 e o amplicon produzido pelos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 caracteriza-se por compreender a SEQ ID NO 25.

[0154] Assim, é um aspecto da presente invenção que a detecção dos amplicons obtidos através do uso dos pares de iniciadores selecionados do grupo possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 é realizada através da hibridização de sonda selecionada do grupo consistindo de, respectivamente, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23.

[0155] Em uma modalidade da presente invenção, a região amplificada pelo dito método (o amplicon) possui entre 80 e 1000 pares de bases de comprimento. Em uma modalidade adicional, o amplicon possui entre 80 e 300 pares de base de comprimento. Preferencialmente, o amplicon possui entre 80 e 200 pares de base de comprimento. Em uma modalidade ainda mais preferida, o amplicon obtido através do uso dos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 possui 112 pares de bases de comprimento, sendo definido pela SEQ ID NO 16; o amplicon produzido pelo uso dos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 possui 136 pares de bases de comprimento, sendo definido pela SEQ ID NO 17; o amplicon obtido através do uso dos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 possui 92 pares de bases de comprimento, sendo definido pela SEQ ID NO 24; o amplicon obtido através do uso dos iniciadores possuindo pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com as SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 possui 130 pares de bases de comprimento, sendo definido pela SEQ ID NO 25.

[0156] As Figuras 5 (reação de detecção específica para o evento da invenção via Taqman®) e 6 (ensaio via SYBR GREENTM), representam a validação de ambos os Métodos.

[0157] Os iniciadores e sondas descritos na presente invenção podem ser utilizados em combinação para detectar o evento CTC93209- 4. Assim, uma modalidade adicional da presente invenção envolve o uso de PCR multiplex para identificação do material vegetal do evento CTC93209-4.

[0158] Iniciadores e sondas alternativos para auxiliar a detecção e caracterização do evento CTC93209-4 estão incluídos na invenção. Esses e outras variações podem ser utilizados com qualquer um dos métodos de detecção direta descritos acima, mas não limitados a estes.

[0159] Adicionalmente, o evento CTC93209-4 pode ser detectado de material vegetal através da hibridização de amostras de DNA com as sondas. Especificamente, a presente invenção descreve um método para detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que compreende:

I. a obtenção de uma amostra para análise;
II. a extração do DNA/RNA da amostra;
III. o fornecimento de uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33, e suas sequências complementares, quando o dito polinucleotídeo possui filamento simples;
IV. a hibridização da dita sonda com a amostra, e
V. a detecção da sonda hibridizada.

[0160] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, é fornecido uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 22 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 23 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33ou das suas sequências complementares. Em uma modalidade, o dito polinucleotídeo compreende pelo menos 24 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ou das suas sequências complementares. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que compreende pelo menos 26 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33ou das suas sequências complementares.

[0161] A sonda pode ser, por exemplo, um produto da PCR ou um fragmento da digestão de restrição. Em uma modalidade adicional, a sonda como descrito aqui pode ser marcada com uma marcação fluorescente, radioativa, enzimática, ou outra adequada para possibilitar que a hibridização possa ser detectada. O versado na técnica saberá agora como planejar sonda adequadas, agora que possui vantagem da presente divulgação.

[0162] Em uma modalidade adicional, é fornecido um método de hibridização de uma sonda à amostra sob condições estringentes (alta especificidade). As condições de hibridização estringentes são bem conhecidas pelo versado na técnica e compreendem por exemplo: a hibridização a uma temperatura de aproximadamente 65°C em uma solução contendo 6x SSC, 0,01% de SDS e 0,25% de leite em pó desnatado, seguida pela lavagem na mesma temperatura em uma solução contendo 0,2 x SSC e 0,1% de SDS.

[0163] As técnicas adequadas para a detecção específica do material vegetal derivado do evento CTC93209-4 com base no princípio de hibridização incluem, mas não estão limitadas a Southern Blots e à hibridização in situ. O versado na técnica está familiarizado com técnicas tais como estas.

[0164] Tipicamente, estes envolvem a incubação de uma sonda com uma amostra, a lavagem para remoção da sonda não ligada e a detecção do fato da sonda ter se hibridizado. O dito método de detecção é dependente do tipo demarcação ligada à sonda – por exemplo – uma sonda marcada radioativamente pode ser detectada através da exposição a e do desenvolvimento do filme de raios-X. Alternativamente, uma sonda marcada enzimaticamente pode ser detectada através da conversão de um substrato para efetuar uma alteração de cor.

[0165] Adicionalmente, outro aspecto da invenção contempla um método para detecção do material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que compreende a obtenção de uma amostra para análise; o fornecimento de um anticorpo planejado para se ligar a uma proteína Cry ou NptII contida dentro de uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33; a incubação do dito anticorpo com a amostra; e a detecção do fato do anticorpo ter se ligado. Em uma modalidade da presente invenção, a dita proteína Cry é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 34 e a proteína NptII é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 35.

[0166] Os métodos adequados para a detecção do material vegetal derivado do evento CTC93209-4 baseados na dita ligação de anticorpos incluem, mas não estão limitados a western blots, a ELISA ("EnzymeLinked ImmunoSorbent Assays") e à espectrometria de massa (SELDI – "Surface-enhanced laser desorption/ionization" ou MALDI – "matrixassisted laser desorption/ionization"). O versado na técnica está familiarizado a estas técnicas imunológicas. As etapas típicas incluem a incubação de uma amostra com um anticorpo que se liga a proteína Cry ou NptII, a lavagem para a remoção de anticorpo não ligado e a detecção do fato do anticorpo ter se ligado. Muitos de tais métodos de detecção se baseiam em reações enzimáticas – por exemplo, o anticorpo pode estar ligado com uma enzima tal como a peroxidase e na aplicação de um substrato adequado, é detectada uma modificação da cor. Tais anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais.

[0167] Em um outro aspecto a invenção contempla um método para detecção do material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que compreende a obtenção de uma amostra para análise; o fornecimento de um extrato de proteínas da amostra; o fornecimento de tiras de teste planejadas para detectar a presença de uma proteína Cry ou NptII contida dentro de uma planta que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 ; a incubação das tiras de teste com a amostra; e a detecção. Em uma modalidade da presente invenção, a dita proteína Cry é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 34 e a proteína NptII é codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 35.

[0168] Em uma modalidade da invenção, é fornecido um método para a detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que compreende a obtenção de uma amostra derivada do evento CTC93209-4 e uma amostra de uma espécie não transgênica de canade-açúcar para análise (controle); submeter um ou mais insetos da espécie Diatraea saccharallis (susceptível à Cry1Ac) às amostras; detectar nas amostras efeito inseticida sobre os insetos. Nesse aspecto da invenção, "Inseticida" se refere a qualquer efeito inibidor sobre o inseto, incluindo, mas não se limitando à alimentação reduzida, ao crescimento retardado, à fecundidade reduzida, à paralisia, à morte.

[0169] O método de detecção do material vegetal do evento CTC93209-4 inclui, mas não está limitado aos ensaios biológicos de alimentação com folhas em que uma folha ou outra parte adequada da planta do evento CTC93209-4 ou qualquer material vegetal derivado do evento CTC93209-4, é infestado com uma ou mais pragas de insetos. A detecção pode ser feita através da avaliação dos danos na folha ou na parte vegetal após períodos de tempo ajustados, da avaliação da mortalidade ou de um outro efeito inseticida sobre os insetos. Tais ensaios biológicos podem ser realizados no campo ou em estufa e podem ser submetidos à infestação natural ou artificial de insetos.

[0170] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que compreende um meio para a detecção da presença de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32 e SEQ ID NO. 33 e de suas sequências complementares e/ou uma proteína Cry. Em uma modalidade da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por amplificação do DNA tal como a PCR, qPCR ou Taqman®. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por hibridização de sondas tais como Southern Blots ou a Hibridização in situ. Em uma outra modalidade da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por ligação a anticorpos tais como western blots, ELISAs, além de espectrometria de massa (SELDI ou MALDI) ou tiras de teste. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender a tecnologia de detecção por ensaio biológico com insetos tais como os ensaios biológicos de alimentação com folhas ou ensaios biológicos de mortalidade. Em uma modalidade adicional da presente invenção, o dito kit pode compreender qualquer combinação das tecnologias de detecção mencionadas acima.

[0171] O evento transgênico como descrito na presente invenção, possui um efeito sobre insetos de uma ou mais espécies do grupo que compreende insetos da ordem Lepidoptera. Como um resultado, um número reduzido de sprays inseticidas é necessário durante o cultivo da dita planta comparado com uma planta de cana-de-açúcar nãotransgênica da mesma variedade.

[0172] A presente invenção não está vinculada por si só ao evento CTC93209-4, mas é adicionalmente estendida para incluir qualquer material vegetal derivado do mesmo, incluindo semente, contanto que contenham pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção. A presente invenção inclui, mas não está limitada às plantas que são derivadas de cruzamentos de linhagens com o evento CTC93209-4 ou um derivado do mesmo através de métodos de cruzamento convencional ou outros. Assim, uma modalidade da presente invenção refere-se ao uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo o evento CTC93209-4, caracterizado pelo fato de que é para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta. Um outro aspecto contempla um método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma primeira planta de cana-de-açúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4.

[0173] Ainda sob esse aspecto, a presente invenção provê um método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto compreendendo inserir um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido nas sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a invenção fornece um método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto compreendendo inserir um fragmento de T DNA selecionado do grupo consistindo em uma sequência possuindo pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3, preferencialmente 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3, em sítio específico do genoma compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33 através de recombinação homóloga.

[0174] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um produto de comódite, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4.

[0175] A invenção inclui ainda material vegetal derivado do evento CTC93209-4 que pode compreender sequências de polinucleotídeos adicionais, modificadas ou menores comparado com o evento CTC93209-4 ou exibir outras características fenotípicas. Por exemplo, pode ser desejável transformar o material vegetal derivado do evento CTC93209-4 para gerar um novo evento que possui uma característica adicional, tal como um segundo gene de resistência a insetos. Este processo é conhecido como empilhamento de genes. O segundo gene de resistência a insetos pode codificar, por exemplo, lectinas inseticidas, inibidores da protease inseticidas e outras proteínas inseticidas derivadas das espécies de Bacillus thuringiensis.

[0176] A presente invenção fornece ainda um método de controle de insetos que compreende o fornecimento do material vegetal derivado do evento CTC93209-4 em um local onde os ditos insetos se alimentam. A invenção fornece ainda adicionalmente um método de controle de insetos que compreende o fornecimento do material vegetal derivado do CTC93209-4 no local em que os ditos insetos se alimentam e a aplicação de outros reagentes agroquímicos ao dito material vegetal tais como herbicidas, fungicidas e outros.

Exemplos Exemplo 1. Geração do Evento CTC93209-4. 1.1 Modificação Genética mediada por Agrobacterium

[0177] O evento CTC93209-4 foi obtido por transformação genética mediada por Agrobacterium tumefasciens da cultivar CTC9003.

[0178] A cultivar CTC9003 (Certificado de proteção de cultivar № 20130134) é um híbrido comercial desenvolvido pelo CTC e foi utilizada como doadora do background genético do evento CTC93209-4, isto é, representa a contraparte não-transformada do evento CTC93209-4. A cultivar 9003 possui alta produtividade e teor de açúcar, e seu ciclo de maturação permite colheita nos meses de abril a setembro na região Centro-Sul, sendo considerada uma variedade precoce/média. Apresenta como característica de destaque o alto perfilhamento, tolerância a seca e florescimento raro. É recomendada para plantio no norte do estado de São Paulo e nos estados do Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Goiás e Nordeste do Brasil (BRASIL, 2013). Assim como outros híbridos comerciais de cana-de-açúcar, tratase de um material de alta ploidia e complexidade genética (DANIELS e ROACH, 1987; SREENIVASAN et al., 1987).

[0179] O evento CTC93209-4 possui o gene cry1Ac, que expressa uma toxina para controle da D. saccharalis, e o gene nptIInptII, utilizado como marcador de seleção durante o processo de modificação genética. A expressão dos genes cry1Ac e nptII é regulada pelo promotor do gene da ubiquitina do milho - UBI-1 (que possui um intron endógeno). Ambos os cassetes de expressão utilizam o terminador da nopalina sintase – NOS, de Agrobacterium tumefaciens.

1.1 Desenvolvimento da Construção contendo os genes cry1Ac e nptII (Figura 3; SEQ ID NO 26).

[0180] Técnicas convencionais de clonagem gênica, utilizando plasmídeos bacterianos comerciais e digestão e ligação de fragmentos através do uso de enzimas de restrição e ligases foram utilizadas para construir a construção da presente invenção (Figura 3).

[0181] A construção da presente invenção foi desenvolvida por meio da junção dos cassetes UBI-cry1Ac-NOS e UBI-nptII-NOS, previamente sintetizados, sequenciados e clonados, originando o plasmídeo pSB11::Cry1Ac::nptII por clonagem tradicional. O T-DNA contendo ambos os cassetes foi retirado do pSB11::Cry1Ac::nptII por meio de digestão enzimática com as enzimas de restrição KpnI e HindIII e posteriormente transferido por clonagem tradicional para o plasmídeo base (Figura 2; vetor plasmidial binário, que contém em seu espectro de hospedeiro as bactérias Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens), gerando o plasmídeo binário contendo a construção da presente invenção (Figura 3; SEQ ID NO 26).

[0182] Após a clonagem final da construção (SEQ ID NO 26), a mesma foi inserida por eletroporação na cepa de Escherichia coli DH5α. Uma colônia isolada contendo a construção, a qual foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 150 µg/mL de espectinomicina e incubada a 37°C, com agitação de 250 rpm por um período de 16 horas. Preparou-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer -80°C.

[0183] A construção da presente invenção foi então transferida de E. coli para a cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens através do isolamento e purificação do DNA plasmidial e transformação da Agrobacterium por eletroporação. Uma colônia isolada de agrobactéria contendo o vetor desejado foi inoculada em meio LB líquido suplementado com 100 μg/ml de espectinomicina e 50 μg/ml de rifampicina e incubada a 28°C, com agitação de 200 rpm por um período de 24 horas. Preparou-se, então, estoques contendo suspensão bacteriana e glicerol 10% (v/v) que foram armazenados em ultrafreezer -80°C. Esses estoques foram utilizados nos experimentos de transformação genética que deram origem ao evento CTC93209-4.

1.2 Transformação das plantas mediada por Agrobacterium

[0184] Para obtenção de calos embriogênicos, folhas jovens enroladas (palmitos) de cana-de-açúcar da variedade CTC9003, desenvolvidas no campo ou casa de vegetação por até 12 meses, foram coletadas para isolamento dos explantes iniciais.

[0185] Após desinfecção superficial, secções transversais com cerca de 0,05-5mm de espessura foram cortadas da região acima do meristema, em condições assépticas. As secções foram colocadas na superfície do meio de cultura de indução de calos [Sais MS - Murashige e Skoog, 1962; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina, hidrolisado de caseína, ácido cítrico, manitol, sulfato de cobre, glicina,agente gelificante, 2,4D] . As culturas foram mantidas no escuro à temperatura de 26°C± 2°C, sendo subcultivado a cada 15 dias, por três a cinco ciclos de 7-28 dias cada. Uma semana antes da transformação, os calos foram novamente selecionados para as características embriogênicas (nodular, compacto, opaco e ligeiramente amarelado).

[0186] A cultura de Agrobacterium, compreendendo a cepa EHA105 transformada com o plasmídeo binário da presente invenção, foi iniciada a partir de um estoque de glicerol e mantida no escuro a 28°C por dois a três dias. A suspensão de Agrobacterium para infectar o material vegetal foi preparada ressuspendendo a cultura em meio líquido MS acrescido de acetoseringona, ajustando para uma OD600 final de 0,1-1,0 (sais MS, sacarose e vitaminas B5).

[0187] Os calos com características embriogênicas foram selecionados visualmente e diretamente transferidos para a suspensão de Agrobacterium, onde permaneceram por 30 minutos, no escuro com agitação constante de 50 rpm.

[0188] Após esse período, os calos foram separados da suspensão de Agrobacterium e o excesso da suspensão foi removido. Em seguida, os calos foram cultivados por 1 -5 dias em semi-sólido (sais MS, sacarose, vitaminas B5, ácido cítrico, agente gelificante, 2,4D e acetoseringona) a 22°C no escuro.

[0189] Após o co-cultivo, os calos foram transferidos para meio de descanso DT (Sais MS; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina, hidrolisado de caseína, ácido cítrico, sulfato de cobre, glicina, agente gelificante, 2,4D, timetina] ) e mantidos por 5-14 dias a 26°C no escuro.

[0190] As células transformadas foram selecionadas por sucessivos subcultivos em meio de cultura de seleção contendo fitorreguladores e o agente seletivo, geneticina (meio de seleção com geneticina, Sais MS; sacarose, vitaminas B5, aminoácidos selecionados do grupo compreendendo prolina e asparagina, hidrolisado de caseína, sulfato de cobre, glicina, agente gelificante, 2,4D, timetina). Os calos permaneceram nesta condição por 21 dias a 26°C no escuro. Em seguida, os calos foram transferidos para o meio de regeneração (equivalente ao meio de seleção com ausência de 2,4D) e posteriormente para o meio de elongação (Sais MS; sacarose, vitaminas B5, hidrolisado de caseína, agente gelificante, timetina), e para um fotoperíodo de 16 horas a 4.000 lux. Plantas regeneradas na presença do antibiótico utilizado como agente seletivo foram multiplicadas, enraizadas e aclimatadas antes da transferência para casa-devegetação, dentre elas, o clone que posteriormente originou o evento CTC93209-4, para o qual abaixo descreve-se os métodos para sua caracterização.

Exemplo 2. Caracterização Molecular do evento CTC93209-4 2.1 Extração de DNA.

[0191] Foi utilizado aproximadamente 10 mg de tecido foliar do evento CTC93209-4. A extração do DNA genômico foi realizada no extrator de ácidos nucleicos BioSprint 96 (Quiagen, GER) com o kit de extração BioSprint 96 DNA Plant Kit (Quiagen, GER), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA obtido foi normalizado para a concentração de 10 ng/µL em espectrômetro Multiskan GO (Thermo Scientific, EUA).

2.2 Determinação do número de cópias do transgene inseridas no germoplasma da planta hospedeira e presença/ausência de elementos do plasmídeo (backbone).

[0192] O número de cópias dos genes cry1Ac e nptII inseridos no evento CTC93209-4 foi avaliado inicialmente por meio de PCR quantitativo via Taqman® (qPCR/Taqman®), sendo seus resultados confirmados posteriormente via Southern blot e/ou sequenciamento.

[0193] As reações de PCR em tempo real via Taqman® foram realizadas utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, EUA) em seu modo Fast. Os conjuntos de primers e sondas utilizados encontram-se descritos na TABELA 1.
TABELA 1: Primers e sondas (Taqman®) utilizadas para a determinação do número de cópias via qPCR e análise da presença/ausência de backbone.

[0194] Como controle endógeno das reações para cry1Ac e nptII, visando confirmar a presença e qualidade do DNA utilizado, bem como a efetividade da reação, foi utilizado o gene da poliubiquitina de canade-açúcar (Primer Forward: 5’ ACCATTACCCTGGAGGTTGAGA 3’; Primer Reverse: 5’ GTCCTGGATCTTCGCCTTCA 3’; sonda: VIC-5’ CTCTGACACCATCGAC 3’-MGB) em modo multiplex.

[0195] As reações de qPCR utilizaram 1X TaqMan® Fast PCR Master Mix II (Applied Biosystems, EUA), 300 nM de cada iniciador e 200 nM das sondas correspondentes. A ciclagem utilizada foi: um ciclo de 50°C por 2 minutos para ativação da uracil-N-glicosilase, um ciclo de 95°C por 20 segundos para ativação da DNA polimerase, 40 ciclos de 95°C por 3 segundos (desnaturação) e 60°C por 30 segundos (anelamento e extensão).

[0196] A análise de dados foi realizada pela inserção manual do limiar (threshold) na fase exponencial da curva de amplificação. Para os genes cry1Ac e nptII, o número de cópias foi inferido a partir da análise de DeltaCt (dCt), na qual o Ct (ciclo no qual o sinal de fluorescência emitido pelo produto da amplificação atinge o limiar) do gene endógeno é subtraído do Ct do gene alvo. Neste tipo de análise, considera-se que o número de cópias dobra a cada Ct e toma-se como referência o número de cópias de controles da mesma variedade cujo valor é conhecido. Adicionalmente, o número de cópias para o gene cry1Ac foi confirmado pelo cálculo de delta-Ct (dCt), utilizando como referência controles internos da própria variedade, cujo resultado é expresso em números exponenciais (1, 2, 4, 8, 16 cópias).

[0197] A análise do número de cópias para o gene cry1Ac foi realizada utilizando primers e sonda com anelamento específico para a junção entre o promotor UBI-1 e o gene cry1Ac. Similarmente, o número de cópias do gene nptII também foi realizado com primers e sondas com anelamento específico na junção do promotor UBI-1 e o gene nptII. (TABELA 1)

[0198] Já para a análise da presença/ausência de backbone, as reações foram realizadas em multiplex para os genes aadA e c-StaA, sem a utilização de gene endógeno. A análise foi realizada considerando o Ct de amplificação dos genes, sendo considerada presença de backbone para amplificações abaixo do 30° ciclo.

[0199] Os resultados dos ensaios indicam a presença de 2 cópias do gene cry1Ac pela análise via dCt e 1,8 (~ 2) cópias via análise ddCt; e 1,7 (~2) cópias do gene nptII presentes no genoma do evento CTC93209-4. Não foram identificadas sequencias homólogas aos genes aadA e c-StaA, presentes no backbone do vetor utilizado na transformação, no genoma do evento CTC93209-4.2.3 Definição das sequências flanqueadoras.

[0200] Para isolar as regiões flanqueadoras às extremidades dos insertos de T-DNA presentes no evento CTC93209-4, foram realizados vários experimentos de sequenciamento de DNA. O mapa da inserção genética presente no evento CTC93209-4 resultante dos dados gerados por estes experimentos é apresentado na FIGURA 4.

[0201] Ensaios de PCR reverso (iPCR) foram realizados para ambas extremidades do T-DNA com o objetivo de isolar e clonar as regiões flanqueadoras do inserto. A metodologia de iPCR é baseada na digestão do DNA genômico utilizando enzimas que clivam a sequência do T-DNA e uma sequência aleatória do genoma do evento. Os produtos da clivagem são circularizados e submetidos a múltiplos ciclos de PCR aninhadas (nested PCR), utilizando primers para regiões conhecidas do T-DNA (TABELA 2). A partir do isolamento, sequenciamento e análise das bandas amplificadas nas reações de iPCR por metodologia Sanger, uma sequência consenso das regiões flanqueadoras foi definida (SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41).
TABELA 2. Enzimas de restrição e sequências de iniciadores utilizados para a realização das reações de iPCR e condições das reações de amplificação.

[0202] Em paralelo, como não há atualmente nenhum genoma completamente sequenciado que pudesse ser utilizado como referência para o germoplasma CTC9003, uma metodologia de sequenciamento por captura foi adotada como forma de esforço adicional para o isolamento do T-DNA inserido no evento CTC93209-4 e de suas regiões flanqueadoras. Nesta estratégia, pequenos fragmentos de polinucleotídeos sobrepostos (sondas) foram desenvolvidos de modo a cobrir toda a sequência do T-DNA. Essas sondas foram hibridizadas com o DNA genômico fracionado de ambas cultivares, CTC9003 e CTC93209-4, e as sequências híbridas foram isoladas. Os fragmentos isolados foram então sequenciados utilizando tecnologia Illumina® de acordo com protocolo padrão. Os dados obtidos foram alinhados com a sequência de T-DNA presente no vetor de transformação e, em conjunto com os dados obtidos por iPCR mencionados anteriormente, as sequências consensos de ambas inserções de T-DNA (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3) presentes no evento CTC93209-4 foram definidas, bem como as suas sequências flanqueadoras(SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41) e as sequências da junção entre as extremidades dos insertos e o genoma de cana de açúcar do evento CTC93209-4 (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33). Desta forma, as sequências consenso do evento CTC93209-4 foram definidas (SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37).

2.4 Método de detecção e caracterização do evento CTC93209-4 - ensaio evento-específico.

[0203] Para a validação da metodologia, foram utilizadas amostras de folha do evento oriundas de Piracicaba) Como controles experimentais, foram utilizados outros eventos geneticamente modificados que possuem a mesma construção e plantas controles não transformados (WT). A extração do DNA ocorreu conforme descrito acima.

[0204] A partir da caracterização molecular das sequências flanqueadoras da inserção do T-DNA no genoma no evento CTC93209- 4 de cana-de-açúcar geneticamente modificada, foi possível desenhar e validar ensaios de PCR em tempo real para a identificação inequívoca do evento. Para o desenvolvimento de metodologia de detecção específica optou-se pela técnica de PCR em tempo real (qPCR) conhecida como "Plus-Minus" ou "Presença–Ausência", sendo validadas as duas variações da metodologia: via SYBR GREEN e via tecnologia Taqman®. Dois pares de iniciadores de amplificação (primers) específicos foram desenhados para gerar informação a respeito das inserções do T-DNA em ambas metodologias, de modo que, para cada par de primer, um iniciador se ancora na região espaçadora e um segundo iniciador se ancora no genoma. Para o uso da tecnologia Taqman®, sondas específicas foram desenhadas entre os iniciadores.

[0205] O evento CTC93209-4 possui duas inserções e, portanto, pode ser identificado inequivocamente através da identificação de qualquer uma das regiões flanqueadoras. A tabela 3 apresenta as sequências de iniciadores e sondas desenvolvidos na presente invenção para identificação específica do evento, assim como as condições de reação aplicadas.
TABELA 3. sequências de iniciadores e sondas desenvolvidos na presente invenção para identificação específica do evento.

[0206] Em uma modalidade da invenção, a sonda empregada no PCR via tecnologia Taqman® para identificação do evento CTC93209-4 é selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23. As sondas SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 15 identificam, respectivamente, fragmentos localizados no Borda direita e na Borda esquerda da inserção de TDNA 1 (SEQ ID NO 36). As sondas SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 23 identificam, respectivamente, fragmentos localizados no Borda direita e na Borda esquerda da inserção de TDNA 2 (SEQ ID NO 37).

[0207] As reações de PCR em tempo real via Taqman® foram realizadas utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) em seu modo Fast.

[0208] Como controle endógeno de reação, visando confirmar a presença e qualidade do DNA utilizado, foi utilizado o gene da poliubiquitina de cana-de-açúcar (primer sense: SEQ ID NO: 27; primer antisense: SEQ ID NO: 28; sonda: SEQ ID NO: 29) em multiplex com o ensaio desenvolvido para o evento.

[0209] As reações de qPCR utilizaram 1X TaqMan® Fast PCR Master Mix II (Applied Biosystems, USA), 200 nM de cada iniciador específico para o evento da invenção e 150 nM da sonda correspondente, 300 nM dos iniciadores para o gene endógeno poliubiquitina e 300 nM da sua sonda, 50-200 ng de DNA e água suficiente para completar o volume de 20 µL. A ciclagem utilizada foi: um ciclo de 50°C por 2 minutos para ativação da uracil-N-glicosilase, um ciclo de 95°C por 20 segundos para ativação da DNA polimerase, 40 ciclos de 95°C por 3 segundos (desnaturação) e 60°C por 1 minuto (anelamento e extensão).

[0210] As reações de qPCR utilizando SYBR GREEN foram realizadas também utilizando o equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), em seu modo padrão para esse tipo de ensaio. As reações foram realizadas utilizando 1 X o QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGENTM), 300 nM do primer sense e 300 nM do primer anti-sense, 20 ng de DNA e água em quantidade suficiente para um volume final de 25 μL. Foram realizadas utilizando o evento da invenção e, como controles negativos, os outros eventos transformados com a mesma construção do evento da invenção (CTC93-234 e CTC93- 115), além de amostras de cana-de-açúcar selvagem (WT) e controles experimentais (branco de extração e reação). Ainda, como controle de qualidade do template e da reação, foi utilizado um gene endógeno em multiplex.

[0211] Os parâmetros de ciclagem utilizados foram: um ciclo de desnaturação do DNA a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos de anelamento dos iniciadores e amplificação a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto e um ciclo de dissociação para geração do "pico de melting" (95ºC por 15 seg, 60ºC por 1 min, 95ºC por 15 seg e 60ºC por 15 seg). A reação com SYBR safe não permite a utilização de multiplex, sendo necessário o preparo de nova reação de amplificação de gene endógeno, utilizando o mesmo DNA, para a eliminação de falsos negativos.

[0212] Como resultado, foi possível validar a reação de detecção específica para o evento da invenção via Taqman® com alta acurácia, como ilustrado na Figura 5 (inserto 2, borda direita).

[0213] Como resultado, foi possível validar a reação de detecção específica para o evento da invenção via Taqman® com alta acurácia, como ilustrado na Figura 5.

[0214] Reações de qPCR multiplex, compreendendo os iniciadores e sondas de todas as regiões flanqueadoras que caracterizam o evento, assim como o controle endógeno da poli-ubiqutitina, podem ser realizadas para a identificação do evento. Da mesma forma que também são suficientes para identificar de forma inequívoca o evento as reações específicas para cada região flanqueadora realizadas apenas em multiplex com o gene de poli-ubiquitina.

[0215] As amostras correspondentes ao evento da invenção apresentaram amplificação específica, com formação de curva de amplificação bem definida, com formato sigmoide característico, enquanto as amostras dos outros eventos, bem como WT e brancos da extração e reação, não apresentaram amplificação de eventoespecífico. O controle endógeno apresentou amplificação para todas as amostras, exceto brancos de extração e reação, como esperado, evidenciando a qualidade do DNA utilizado na reação, bem como a qualidade da reação e ciclagem (Figura 5).

[0216] O ensaio via SYBR GREENTM, por sua vez, apresentou amplificação específica das amostras do evento da invenção na temperatura de melting esperada. As amostras dos demais eventos, bem como WT e brancos não apresentaram pico de amplificação.

Exemplo 3. Reconstrução do evento CTC93209-4 através de técnicas de inserção sítio dirigido (sistema Crispr-Cas).

[0217] O evento CTC93209-4 pode ser gerado utilizando ferramentas de edição genômica (EG), recriando o evento inicialmente desenvolvido através de método de transformação genética mediados por Agrobacterium, conforme apresentado pela presente invenção. Desse modo, o T-DNA da presente invenção (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3) podem ser inseridos na mesma localização no genoma da cultivar CTC9003 conforme descrição apresentada para o evento CTC93209-4.

[0218] Em uma modalidade preferida, o evento da presente invenção pode ser gerado utilizando ribonucleoproteínas (RNP) ou a entrega direta de sgRNA para a células ou tecido vegetal a ser transformado. Dentre as metodologias preferidas para a entrega direta do complexo RNP/sgRNA estão o bombardeamento de partículas de calos de cana de açúcar e a transfecção de protoplastos, sem, no entanto, estarem limitadas a estas, sendo possível o uso de outras metodologias para o transporte transmembrana de moléculas, como é de conhecimento no Estado da Técnica. Nessa modalidade, as endonucleases e o RNA guia são entregues diretamente à célula vegetal, separadas do molde de recombinação homóloga (HR), o qual é entregue através de um plasmídeo. O molde de recombinação homóloga compreende o T-DNA da invenção (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) flanqueado por fragmentos de DNA homólogos às sequências flanqueadoras do evento CTC93209-4 (SEQ ID Nos: 38, SEQ ID Nos: 39, SEQ ID Nos: 40 e SEQ ID Nos: 41).

[0219] Em uma outra modalidade, o evento CTC93209-4 é recriado através da entrega de plasmídeos contendo as sequências necessárias para a expressão do componentes dos sistemas CRISPR-Cas e disponibilização do molde para a recombinação homóloga utilizando a maquinaria da própria células/tecido vegetal, os quais devem ser expressos de maneira transiente para a síntese do complexo enzimático capaz de realizar a clivagem sítio específica para a recombinação homóloga. A metodologia preferida para a entrega dos plasmídeos é a transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas de calos de cana de açúcar; entretanto, outras metodologias de transformação conhecidas no Estado da técnica podem ser utilizadas, assim como podem ser utilizados outros tecidos além de calos como por exemplo: protoplastos, discos foliares, meristemas, células finas em suspensão, entre outras.

[0220] Os reagentes de edição genômica podem ser entregues em múltiplos plasmídeos, mas preferencialmente utiliza-se um único plasmídeo o qual compreende uma endonuclease, o sgRNA, e um molde de recombinação homóloga contendo o gene de interesse. O molde de recombinação homóloga compreende uma sequência de TDNA selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e flanqueada nas extremidades 5’ e 3’ por sequências de DNA homologas as sequências flanqueadoras que caracterizam o evento CTC93209-4, as quais são selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nos: 38, SEQ ID Nos: 39, SEQ ID Nos: 40 e SEQ ID Nos: 41. A orientação das sequências é definida pela orientação do T-DNA no genoma do evento CTC93209-4 de tal forma que o molde de recombinação homóloga caracteriza-se por compreender sequência idêntica ou substancialmente idêntica à sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.

[0221] Ainda em uma modalidade adicional, o evento da invenção pode ser gerado através do uso de plasmídeos, onde os componentes do complexo enzimática encontram-se estavelmente inseridos no genoma do organismo receptor (CTC9003), sendo expressos e necessariamente excisados após a transformação através, por exemplo, do uso de sistema do tipo Cre/Lox ou equivalente. A escolha dessa alternativa gera permanência de sítios LoxP inseridos no genoma da planta. Novamente, a metodologia preferida para a entrega dos plasmídeos é através da transformação mediada por Agrobacterium ou bombardeamento de partículas de calos de cana de açúcar; entretanto, outras metodologias são conhecidas por uma pessoa versado na técnica e podem ser aqui aplicadas. Outros tipos celulares também podem ser usados para transformação, incluindo, mas não se limitando a protoplastos, discos foliares, meristemas, células finas em suspensão, entre outras. Os reagentes de edição genômica podem ser entregues em múltiplos plasmídeos, mas, preferivelmente são entregues em um único plasmídeo, o qual compreende sítios LoxP, um marcador de seleção, a sequência da endonuclease, sgRNA, e o molde de recombinação homóloga. O molde de recombinação homóloga compreende uma sequência de T-DNA selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e flanqueada nas extremidades 5’ e 3’ por sequências de DNA homologas as sequências flanqueadoras que caracterizam o evento CTC93209-4, as quais são selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nos: 38, SEQ ID Nos: 39, SEQ ID Nos: 40 e SEQ ID Nos: 41. A orientação das sequências é definida pela orientação do T-DNA no genoma do evento CTC93209-4 de tal forma que o molde de recombinação homóloga caracteriza-se por compreender sequência idêntica ou substancialmente idêntica à sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.

[0222] Considerando qualquer um dos processos de transformação descrito acima, as células transformadas resultantes serão regeneradas para formar uma planta idêntica ou substancialmente idêntica ao evento da presente invenção.

[0223] A incorporação exata do T-DNA nos sítios de inserção que caracterizam o evento CTC93209-4 é verificada através dos iniciadores descritos na presente invenção (SEQ ID NO: 10-13 e SEQ ID NO:18- 21) e sondas (SEQ ID NO:14-15 e SEQ ID NO: 22-23). Adicionalmente, reações de amplificação utilizando iniciadores específicos para a amplificação das sequências dos reagentes de edição genômica devem ser realizados para confirmar a ausência desses componentes do genoma da planta regenerada.

[0224] Genes morfogenéticos ou outros elementos regulatórios podem estar contemplados em qualquer ruma das estratégias acima descritas, possibilitando melhorias da eficiência de transformação (entrega e integração genômica).

Exemplo 4. Avaliação do produto da expressão do gene inserido no evento da invenção.

[0225] O produto da expressão dos genes no evento da presente invenção foi detalhadamente caracterizado por meio do emprego de metodologia ELISA, para determinação da concentração das proteínas Cry1Ac e NptII, e Western blot, para comprovação das identidades dessas proteínas heterólogas. A expressão dos genes cry1Ac e nptII no evento CTC93209-4 foi caracterizada em diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento da cultura e localidades de plantio.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

[0226] Para a produção das amostras de tecidos do evento CTC93209-4, foram realizados experimentos em localidades representativas das áreas de cultivo da cultivar parental CTC9003, a saber, Piracicaba, Barrinha e Valparaíso (SP), Quirinópolis (GO) e Juazeiro (BA).

[0227] Em cada local, os experimentos foram conduzidos em delineamento em blocos completos casualizados com 4 repetições. As parcelas foram compostas por 10 linhas de 8 metros, com espaçamento de 1,5 metros entre as linhas.

[0228] A análise de expressão das proteínas Cry1Ac e NptII no evento CTC93209-4 foi investigada em diferentes tecidos e em diferentes períodos do desenvolvimento dos ciclos de cana-planta e cana-soca. Os tecidos e tempos avaliados (± 5 dias) foram:

1) Folhas ao longo do ciclo de cana-planta: 60 e 120 Dias Após o Plantio (DAP);
2) Folhas ao longo do ciclo de cana-soca: 60 e 120 Dias Após o Corte (DAC);
3) Folhas ao longo de um ciclo de cana-planta: 100, 200 e 300 DAP;
4) Folhas, colmos e raízes ao final do ciclo de cana-planta: 330 DAP.

[0229] A amostragem dos tecidos nos ensaios para a avaliação da expressão das proteínas Cry1Ac e NptII no evento CTC93209-4 foi realizada da seguinte maneira:
Amostras de Folhas: foram coletados 30 cm de tecidos a partir da ponta de 5 a 10 folhas "diagnóstico" nas linhas 2 e 3 em ziguezague evitando folhas doentes. Após a retirada da nervura central as folhas foram picadas em pedaços, homogeneizadas e acondicionadas em sacos plásticos tipo "ziplock" previamente identificados.
Amostras de Colmos: foram coletadas 10 canas inteiras em ziguezague. Após retiras as folhas secas e ponteiros, as canas foram cortadas em pequenos toletes, homogeneizadas e acondicionadas em embalagens previamente identificadas.
Amostras de Raízes: foi coletada uma touceira representativa das linhas 2 e 3 da parcela experimental. O solo foi esboroado e as raízes lavadas com água limpa para a retirada do excesso de solo. Em seguida, as raízes limpas foram picadas em pedaços, homogeneizadas e acondicionadas em sacos plásticos previamente identificados.

[0230] Todas as amostras de tecidos (folha, colmo e raízes) foram transferidas para a caixa de isopor com gelo seco em até 15 min após a coleta. A identidade genética de todas as touceiras amostradas foi confirmada por meio de ensaio evento-específico conforme descrito acima (Exemplo 2).

[0231] Para a análise da proteína Cry1Ac foram utilizados 30 ± 0,5 mg de folha, 200 ± 0,5 mg de colmo e 15 ± 0,5 mg de raízes congelados em gelo seco ou nitrogênio líquido. A maceração foi realizada no equipamento TissueLyser. Ao tecido macerado de folha adicionaram-se 750 μL de tampão de extração fosfato salino (PBS) suplementado com Tween20 (NaCl 0,138 M; KCl 0,027 mM; Tween20 0,05%, pH 7,4) diluído de acordo com as instruções do fabricante (EnvirologixTM EUA).
No caso de colmo foram utilizados 375 μL, e para raízes 1.500 μL, do mesmo tampão.

[0232] Para análise da proteína NptII em folhas foram pesados 40 ±0,5 mg do tecido macerado, e para colmo e raiz foram pesados 200 ±0,5 mg. Similarmente, nas amostras de tecido foliar foram adicionados 750 μL do tampão de extração; enquanto que nas amostras de colmo e raiz foram adicionados 1.500 μL. O tampão de extração utilizado neste caso foi o PEB1 1x (pH 7,0), que acompanha o kit utilizado para a quantificação da proteína NPTII: PathoScreen® Kit for NPT II (Agdia, EUA).

[0233] Em todos os casos, após a adição do tampão nas amostras de folha, efetuou-se a homogeneização com vortex. Para as amostras de raízes utilizadas nas análises de Cry1Ac e para as amostras de raízes e colmos utilizadas nas análises de NptII foi utilizado o equipamento Tissue Lyser, com auxílio de beads, para tal atividade. A homogeneização foi seguida por centrifugação por 20 minutos a 4000 ×g. O sobrenadante resultante foi coletado e seguiu para a etapa de quantificação de proteínas totaispelas metodologias de Bradford (Cry1Ac) ou BCA (NPTII).

[0234] Os padrões utilizados para a obtenção da curva de calibração para quantificação das proteínas foram os padrões comerciais já previamente diluídos (Albumin Standard Thermo Scientific, cat#23209). As amostras que apresentaram quantificação acima da faixa linear de trabalho, estabelecida durante a validação do método, sofreram diluição para atingir o valor dentro da faixa validada.

[0235] As proteínas totais foram obtidas em triplicatas para cada amostra estudada. Após a quantificação de proteínas totais, escolheuse a amostra com menor variação do valor mediano da quantificação. Estas amostras foram normalizadas, de forma a se obter a mesma quantidade de proteínas totais para todas as amostras. A normalização foi feita para concentração final de 150 µg/mL de proteínas totais. Para o alvo NptII a normalização foi feita para uma concentração de 800 μg/mL. Na sequência, as amostras foram diluídas para garantir que as concentrações das proteínas a serem identificadas estivessem dentro da faixa de quantificação confiável. Para análise da presença da proteína Cry1Ac a diluição foi feita de forma a se ter 1 μg/mL. Para a análise da presença da proteína NptII não foi realizada diluição e a totalidade da concentração obtida na normalização foi utilizada na análise.

[0236] A obtenção de resultados para as proteínas Cry1Ac e NptII foi feita por espectrometria em placas de 96 poços com leitura em dois comprimentos de onda diferentes: 450 nm e 630 nm em leitora de Placa SpectraMax (Molecular Devices, EUA). Para a detecção e quantificação da proteína Cry1Ac foi utilizado o kit AP003 CRBS (Envirologix, EUA), seguindo as recomendações do fabricante com adição de uma série de calibradores padrão de proteína Cry1Ac sintética (GeneScript, EUA) nas seguintes concentrações: 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2,5 ng/mL, 1,25 ng/mL, 0,63 ng/mL, 0,31 ng/mL, 0,16 ng/mL e 0,08 ng/mL. As concentrações foram obtidas diluindo a proteína sintética Cry1Ac em tampão PBST. Para a detecção e quantificação da proteína NptII foi utilizado o kit PathoScreen® Kit for NPT II (Agdia, EUA), seguindo as recomendações do fabricante e com a adição de uma série de calibradores padrão de proteína NPTII sintética (Novoprotein, EUA) nas seguintes concentrações: 14,4 ng/mL, 7,2 ng/mL, 3,6 ng/mL, 1,8 ng/mL, 0,90 ng/mL, 0,45 ng/mL e 0,23 ng/mL. As concentrações foram obtidas diluindo a proteína sintética NPTII em tampão PEB1.

[0237] A análise baseou-se na associação dos valores de absorbâncias das amostras testes com os valores preditos em uma equação estimada pela medida de absorbância de uma curva padrão. As proteínas sintéticas foram diluídas para as concentrações desejadas em tampão PBST. As análises foram realizadas em duplicata experimental para cada amostra. As concentrações das proteínas Cry1Ac e NptII foram apresentadas com base em Proteína Total (µg/mg), Peso Fresco - PF (μg/g) e Peso Seco - PS (μg/g).

[0238] Os valores de concentração das proteínas alvo expressos em μg/mg de proteínas totais foram obtidos pela multiplicação do valor da concentração obtida no ELISA em ng/mL pelo fator de diluição aplicado. Esse valor foi dividido pela concentração normalizada de proteínas totais e multiplicado por 1.000, de acordo com a seguinte fórmula:

Onde,
PA = proteína alvo em ng/mL;
FD = fator de diluição;
PTn = proteínas totais normalizadas.

[0239] Para calcular o valor da proteína alvo, em microgramas por grama de tecido fresco (μg/g), determinou-se o valor da massa de proteínas totais (μg) presente no total de tampão utilizado na extração (μL). Descoberta a massa de proteína alvo no total de massa de proteínas totais (μg/mg), calculou-se a massa de proteína Cry1Ac (μg) contida em 30 mg de tecido fresco de folha, ou em 200 mg de tecido fresco de colmo, ou em 15 mg de tecido fresco de raiz.

[0240] Para o cálculo da massa de proteína NptII (μg) foram utilizadas as seguintes massas de tecidos: 40 mg de tecido fresco de folha; 200 mg de tecido fresco de colmos e raízes. Em seguida, foi possível estimar a quantidade de proteína alvo (μg) em 1 g de tecido fresco, de acordo com a seguinte fórmula:

Onde,
VT = volume do tampão de extração utilizado;
[PT] = concentração de proteínas totais em μg/mL;
TF = tecido fresco em grama (g).

[0241] O valor de proteína alvo em μg/g tecido seco foi calculado utilizando-se o valor estimado de quantificação em tecido fresco corrigido pela umidade de cada amostra. Em outras palavras, a umidade de cada tecido foi descontada da massa utilizada, de acordo com a seguinte fórmula:
TS = (100% - UM ) × TF
Onde,
TS = tecido seco (g);
UM – umidade medida.

[0242] Os dados de expressão em folha foram analisados individual e conjuntamente, de acordo com os seguintes modelos estatísticos:

[0243] Análise Individual: yijkt=μ+Bj+Gk+Tt+εijkt

[0244] Análise Conjunta: yijkt=μ+Si+B(S)ij+Gk+(SG)ik+Tt+εijkt Onde,

[0245] yijkt = medida da repetição j no local i para o tratamento k e na época de coleta t;

[0246] μ = média geral;

[0247] Si = efeito do local i, i = 1 a 5;

[0248] Bj = efeito da repetição j, j = 1 a 4;

[0249] B(S)ij = efeito da repetição j dentro do local I;

[0250] Gk = efeito do tratamento k, (k = 1 para variedade ou k = 3 para tecidos);

[0251] (SG)ik = interação entre o local i e o tratamento k;

[0252] Tt = efeito da época de coleta t (t = 1 a 3 ou t = 1 a 4);

[0253] εijkt = erro do resíduo experimental.

[0254] Os efeitos dos tratamentos Gk e Tt foram tratados como efeitos fixos enquanto que os efeitos Si, B(S)ij, (SG)ik e εijkt foram considerados efeitos aleatórios. Após as análises de qualidade e exploratória, os dados foram analisados de acordo com os modelos descritos acima, utilizando uma abordagem de modelos lineares mistos implementado no pacote lme4 (BATES et al., 2015). As análises foram realizadas em dois níveis. No primeiro nível foram realizadas análises individuais para os cinco locais. Em segundo nível realizou-se uma análise conjunta dos locais. A significância dos efeitos foi avaliada por meio do Teste t ao nível de significância de p ≤ 0,05 através do pacote lmerTest (KUZNETSOVA et al., 2017). Todas as análises foram realizadas no ambiente computacional R (R CORE TEAM, 2017), versão 3.5.1.

[0255] As análises individuais e conjunta dos dados de expressão da proteína Cry1Ac em folha para o evento CTC93209-4 ao longo de um ciclo de cana-planta (100 DAP, 200 DAP e 300 DAP) encontram-se na Tabela 4 abaixo. Os resultados da análise conjunta da expressão da proteína Cry1Ac em folha, com base em Tecido Seco, estão apresentados na TABELA 4 e FIGURA 7, juntamente com o resultado do teste de comparação de médias.
TABELA 4: Comparação das médias de expressão de Cry1Ac em folhas do evento CTC93209-4 ao longo de um ano de cultivo de canaplanta (100 DAP, 200 DAP e 300 DAP). Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. Ep: Erro Padrão.

[0256] As análises individuais e conjunta dos dados de expressão da proteína Cry1Ac em folhas do evento CTC93209-4 para os ciclos de cana-planta (60 e 120 DAP) e cana-soca (60 e 120 DAC) são apresentados na TABELA 5.

[0257] Os resultados da análise conjunta, referentes à expressão de Cry1Ac em folha com base em Tecido Seco para o ciclo de canaplanta (60 DAP, 120 DAP) e cana-soca (60 DAC, 120 DAC), estão apresentados na TABELA 5 e FIGURA 8, juntamente com o resultado do teste de comparação de médias.
TABELA 5. Comparação das médias de expressão de Cry1Ac em folhas do evento CTC93209-4 ao longo de um ciclo de cana-planta (60 e 120 DAP) e um ciclo de cana-soca (60 e 120 DAC). Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. NA: não avaliado. EP: Erro Padrão.

[0258] Devido a condições climáticas durante a condução dos ensaios, com ocorrência generalizada de estiagem após o corte do experimento, a brotação da cana-planta foi afetada negativamente. Não houve brotação e amostragem nos tempos 60 e 120 DAC em Quirinópolis (GO). Houve atraso na brotação e, consequentemente, não houve amostragem aos 60 DAC na localidade de Barrinha (SP). Nas demais localidades, embora tenha havido brotação (e amostragem), foi verificado uma queda na quantidade de Cry1Ac nas folhas do evento CTC93209-4 nas amostras aos 60 e 120 DAC. É possível inferir que, muito provavelmente, essa menor concentração estimada de Cry1Ac é reflexo da estiagem, pois a cana-de-açúcar não vegeta adequadamente nessas condições.

[0259] As análises individuais e conjunta dados de expressão da proteína Cry1Ac em diferentes tecidos (Colmo, Folha, Raiz) do evento CTC93209-4 aos 330 DAP são apresentados na TABELA 6 e Figura 9.
TABELA 6: Comparação das médias de expressão de Cry1Ac em diferentes tecidos do evento CTC93209-4 aos 330 DAP. Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. EP: Erro Padrão.

[0260] Os resultados da análise conjunta indicam que a proteína Cry1Ac é, aproximadamente, 6 vezes mais abundante em folhas que em colmos ou raízes do evento CTC93209-4.

[0261] As análises individuais e conjunta dos dados de expressão da proteína NptII em folha para o evento CTC93209-4 ao longo de um ciclo de cana-planta (100 DAP, 200 DAP, 300 DAP) encontram-se na Tabela 7. Os resultados da análise conjunta, referentes à expressão de NptII em folha com base em Tecido Seco para o ciclo de cana-planta (100 DAP, 200 DAP e 300 DAP), estão apresentados na TABELA 7 e FIGURA 10, juntamente com o resultado do teste de comparação de médias.
TABELA 7: Comparação das médias de expressão de NptII em folhas do evento CTC93209-4 ao longo de um ano de cultivo de cana-planta (100, 200 e 300 DAP). Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. EP: Erro Padrão.

[0262] As análises individuais e conjunta dos dados de expressão da proteína NptII em folhas do evento CTC93209-4 para os ciclos de cana-planta (60 e 120 DAP) e cana-soca (60 e 120 DAC) são apresentados na TABELA 8.
TABELA 8: Comparação das médias de expressão de NptII em folhas do evento CTC93209-4 ao longo de um ciclo de cana-planta (60 e 120 DAP) e um ciclo de cana-soca (60 e 120 DAC). Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. NA: Não Avaliado. EP: Erro Padrão.

[0263] Os resultados da análise conjunta, referentes à expressão de NptII em folha com base em Tecido Seco para o ciclo de cana-planta (60 DAP, 120 DAP) e cana-soca (60 DAC, 120 DAC), estão apresentados na Tabela 8 e FIGURA 11, juntamente com o resultado do teste de comparação de médias.

[0264] Devido a condições climáticas durante a condução dos ensaios, com ocorrência generalizada de estiagem após o corte do experimento, a brotação da cana-planta foi afetada negativamente. Não houve brotação e amostragem nos tempos 60 e 120 DAC em Quirinópolis (GO). Houve atraso na brotação e, consequentemente, não houve amostragem aos 60 DAC na localidade de Barrinha (SP). No entanto, não foi detectada queda na expressão da proteína NptII nas amostras de folhas de cana-soca (60 e 120 DAC).

[0265] As análises individuais e conjunta da expressão de NptII em folha e colmo do evento CTC93209-4 aos 330 DAP são apresentados na TABELA 9. Em Juazeiro (BA) não foi realizado comparação de médias pois não houve dados acima do LOD para amostras de colmo do evento CTC93209-4.
TABELA 9: Comparação das médias de expressão de NptII em folha e colmo do evento CTC93209-4 aos 330 DAP. Análise estatística individual e conjunta para os 5 locais ensaiados. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. < LOD: valores abaixo do limite de detecção do método. EP: erro padrão.

[0266] Os resultados da análise conjunta, referentes à expressão de NptII em diferentes tecidos com base em Tecido Seco aos 330 DAP, estão apresentados na TABELA 9 e FIGURA 12, juntamente com o resultado do teste de comparação de médias.Para o tecido raiz a maioria dos valores de expressão de NptII ficaram abaixo do LOD do ensaio. Na TABELA 10 estão reportados os valores de cada repetição para a expressão de NptII em raiz, em relação ao LOD do método
TABELA 10: Valores de expressão da proteína NptII em raiz do evento CTC93209-4 avaliado aos 330 DAP. Cada valor representa a uma repetição biológica obtida a partir de duas replicatas técnicas.

< LOD: Valores abaixo do Limite de Detecção.

[0267] Um resumo dos resultados obtidos pela metodologia ELISA aos 330 DAP pode ser visto na TABELAS 11 e 12.
TABELA 11: Médias aritméticas de expressão das proteínas Cry1Ac e NptII em folhas do evento CTC93209-4 colhidas aos 330 DAP. Valores apresentados como médias, ± desvio padrão, em μg/g de peso fresco.

1 Média de resultados de 4 localidades. A expressão em Juazeiro (BA) foi menor que o LOD do ensaio em todas as repetições. 2 Médias calculadas com os valores acima do LOD, a saber: Piracicaba e Quirinópolis (1 repetição), Juazeiro (2 repetições) e Valparaíso (3 repetições).
TABELA 12: Médias aritméticas da expressão das proteínas Cry1Ac e NptII em folhas do Evento CTC93209-4, em diferentes períodos dos ciclos da cana-planta e cana-soca. Valores apresentados como médias, ± desvio padrão, em μg/g de peso fresco.

1 Médias de 3 locais (Piracicaba-SP, Valparaíso-SP, Juazeiro-BA); 2 Médias de 4 locais (Piracicaba-SP, Barrinha-SP, Valparaíso-SP, Juazeiro-BA).

[0268] Os resultados obtidos indicam que o evento da invenção apresenta expressão média da proteína Cry1Ac em folhas no momento de colheita do evento CTC93209-4 (330 DAP) foi de, aproximadamente 33,4 μg/g de peso fresco, enquanto que a expressão média de Cry1Ac em colmos na mesma época foi de, aproximadamente, 5,3 μg/g de peso fresco. Ou seja, a expressão de Cry1Ac em colmos no momento da colheita é, aproximadamente, 6 vezes menor que a expressão de Cry1Ac em folhas.

[0269] A expressão média de NptII em folhas no momento de colheita do evento CTC93209-4 (330 DAP) foi de, aproximadamente 0,14 μg/g de peso fresco, enquanto que a expressão média de NptII em colmos na mesma época foi de, aproximadamente, 0,08 μg/g de peso fresco. Ou seja, a expressão de NptII em colmos no momento da colheita é, aproximadamente, 2 vezes menor que a expressão de NptII em folhas.

[0270] A expressão média de NptII em folhas, para todas as épocas de coleta considerando todos os locais avaliados, foi de 0,15 μg por grama de tecido fresco. A expressão média de Cry1Ac, nas mesmas condições, foi de 23,9 μg por grama de tecido freco. Em outras palavras, a expressão média de Cry1Ac em folhas foi aproximadamente 159 vezes maior que a expressão de NptII em colmos do evento CTC93209- 4, considerando o peso fresco.

[0271] A expressão média de NptII em raízes foi de 0,034 μg por grama de tecido fresco. O valor médio de proteína Cry1Ac encontrado foi de 6,8 μg por grama de tecido fresco, ou aproximadamente 200 vezes maior.

[0272] Ambas as proteínas foram mais abundantes em tecidos foliares que em colmos e raízes do evento CTC93209-4.

[0273] A proteína Cry1Ac foi muito mais abundante que a proteína NptII em todos os tecidos avaliados.

Western blot

[0274] Para identificação das proteínas heterólogas expressas no evento da invenção, foram utilizadas 50 mg de folha congeladas em nitrogênio líquido. A maceração foi realizada no equipamento TissueLyser, durante 1 minutos à 25 Hz, com a adição de três esferas de aço (3 mm – Qiagen). Ao tecido macerado, adicionou-se 500 µL do tampão de extração fosfato salino (PBS) suplementado com Tween 20 (NaCl 0,138 M; KCl – 0,027 mM; Tween 20 – 0,05%, pH 7,4) diluído de acordo com as instruções do fabricante (EnvirologixTM, EUA). Após a adição do tampão efetuou-se a homogeneização com vortex e centrifugação por 20 minutos, a 1520xg a 4°C. O sobrenadante resultante foi coletado e seguiu para a etapa de quantificação de proteínas totais.

[0275] A quantificação adotada para as análises das proteínas Cry1Ac e NptII foi executada de acordo com as recomendações do ThermoScientific TM Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Kit (23236) - Procedimento em microplaca. Para a proteína NptII, utilizouse o método de quantificação de proteínas totais denominado BCA. Tal protoclo é recomendado porque o tampão PEB1 disponível no kit PathoScreen® Kit for NPTII (Agdia, EUA) usado na extração é incompatível com o método Bradford. A quantificação com o método BCA foi executada de acordo com as recomendações do fabricante do kit: PierceTM BCA Protein Assay Kit (23225). Assim, os padrões utilizados para a obtenção da curva de calibração foram os padrões comerciais já diluídos de BSA (Pré-Diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin (BSA) set- 23208, (Thermo Scientific, EUA) na concentração de 2.000, 1.500, 1000, 750, 500, 250, 125 e 0 μg/mL.Foram adicionados 10 μL de cada calibrador padrão em poços triplicados na placa. As placas foram cobertas e incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. A absorbância foi lida em 595 nanômetros (nm) usando o software SoftmaxPro 7.0 (Molecular Device). Após a extração de proteínas totais, 3 µg de extrato proteico foram misturadas ao tampão de amostra 2X Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad, EUA) e submetidos à desnaturação via aquecimento à 100°C por 5 minutos para identificação da proteína Cry1Ac presente na amostra. No caso da detecção e identificação da proteína NptII, primeiro foi realizada a concentração do extrato de proteínas totais utilizando colunas Amicon® Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices (3000 NMWL) seguindo as recomendações do fabricante. Foram utilizados 20 μg de extrato proteico, misturados com o tampão de amostras como descrito para Cry1Ac.

[0276] Para o controle negativo da presença das proteínas heterólogas, foram utilizados 3 µg de extrato proteico extraído da variedade convencional parental CTC9003 sem nenhum spike de proteínas de interesse. Adicionalmente, foram preparados controles positivos para detectar as proteínas Cry1Ac e NptII, sendo 0,5 ng das proteínas Cry1Ac de ~69 kDa (GenScript, USA) ou NptII de ~29 kDa (Novoprotein, USA) purificadas, diluídos em 3 μg de solução de proteínas totais extraídas de folhas de plantas da variedade convencional CTC9003.

[0277] As amostras foram desnaturadas e aplicadas em gel de poliacrilamida 4-20% (Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gel) submerso em tampão Tris/glycine/SDS running buffer (Bio-Rad, EUA) e separadas por eletroforese a 50 V por 5 minutos e depois a 120 V por, aproximadamente, 90 minutos. Na sequência, os géis de poliacrilamida foram equilibrados em Tampão de Transferência Tris/Glycine Buffer (Bio-Rad, EUA), o qual foi adicionado de 20% de metanol, por 10 - 15 minutos. A membrana de PVDF foi tratada com metanol absoluto. O sistema para transferência foi montado em cuba preenchida com o Tampão de Transferência gelado para a transferência sob imersão ("transferência molhada"), à voltagem constante de 50V durante 3 horas. Após concluída a transferência, a membrana foi bloqueada durante 16 horas a 4°C, sob agitação constante, em solução de bloqueio [5% de leite em pó desnatado (Bio-Rad, EUA) e TBS/T (20mM Tris, 150mM NaCl, 1% Tween20] para prevenir possíveis ligações inespecíficas à membrana.

[0278] Na etapa seguinte, a membrana foi incubada com o anticorpo primário durante 90 minutos para detecção e confirmação da presença e integridade das proteínas Cry1Ac e NptII. Os anticorpos policlonais utilizados neste ensaio foram o Anti-Cry1Ab (Fitzgerald, EUA) produzido em coelho e que reage com as proteínas Cry1Ac e Cry1Ab; e o Anti-NptII (Abcam, EUA), também produzido em coelho, e que reage com a proteína PAT/NptII, diluídos na concentração de 1:1000 em TBS/T (v/v).

[0279] A membrana foi lavada em 3 ciclos de 5 minutos (3x5) em TBS/T e incubada com anticorpo secundário Anti-Rabbit conjugado com HRP produzido em cabras (Sigma), na concentração de 1:20.000 ou Fitzgerald, na concentração de 1:5.000 – v/v) por 60 minutos. Após as incubações, a membrana foi novamente lavada com TBS/T (3x5 minutos) e a reação imunoenzimática verificada em filmes de raio-X Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare, EUA) através da reação com substrato Clarit Western ECL Substrate Kit (Biorad, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A exposição do filme de raio-X a membrana variou de 15 segundos até 3 minutos.

[0280] Os resultados revelaram que o perfil de expressão da proteína Cry1Ac se apresenta como duas bandas imunorreativas de peso molecular quase idêntico ~69 e ~66 kDa, comumente denominada dobletes, nas amostras R1 a R4 (Figura 13). Ambas as amostras são repetições biológicas do evento da invenção CTC93209-4, obtidas de quatro parcelas experimentais distintas no Polo Piracicaba. Os dobletes de proteína geralmente provêm da remoção de resíduos de aminoácidos terminais por proteases (BRAVO et al., 2002). Como esperado, o controle negativo (CN) não apresentou imunoreatividade (FIGURA 18). O controle negativo consistiu de amostras de proteínas totais extraídas da variedade parental CTC9003 não transformada. O controle positivo (CP) consistiu da proteína Cry1Ac (0,5 ng) produzida por meio de expressão e purificação de proteína recombinante em E. coli, diluída em solução de proteínas totais extraídas da variedade CTC9003 convencional. Esta proteína foi isolada com >95% de pureza e apresenta uma banda única na altura esperada. Não foi observada nenhuma outra banda indicativa da presença da proteína Cry1Ac parcial ou de proteína de fusão de peso molecular maior, nas folhas.

[0281] A detecção da proteína expressa pelo gene de seleção nptII também foi realizada pelo ensaio de Western blot. Mesmo sendo expressa em níveis mais baixos do que a proteína Cry1Ac, os ensaios de Western blot demonstraram a presença de uma banda imunorreativa no tamanho esperado de ~29 kDa, em todas as repetições biológicas utilizadas do evento CTC93209-4 (FIGURA 14).Um controle positivo e um controle negativo foram adicionados à membrana. O controle positivo (CP) corresponde a 0,5 ng de proteína NptII purificada (Novoprotein), diluída em extrato proteico de cana-de-açúcar convencional (CTC9003). A banda diagnóstico correspondente a proteína NptII está presente no controle positivo na altura esperada e é idêntica à banda presente no evento CTC93209-4, confirmando a identidade da mesma (FIGURA 14). O controle negativo consistiu de amostras de proteínas totais extraídas da variedade CTC9003.

[0282] É possível observar em todas as amostras, a presença de bandas nas alturas aproximadas de 60 kDa, 100 kDa e 250 kDa. A presença de tais bandas nos controles positivos e negativos é indicativo de artefato de técnica, gerado provavelmente, por ligação inespecífica do anticorpo às proteínas endógenas de cana-de-açúcar (FIGURA 14).

[0283] Os resultados dos ensaios de Western blot confirmaram a presença e integridade das ambas as proteínas Cry1Ac e NptII e a ausência de formas alternativas não esperadas (truncadas/fusionadas) dessas proteínas, no evento geneticamente modificado CTC93209-4.

[0284] Conclui-se então que a identidade das proteínas Cry1Ac e NptII expressas pelo evento da invenção foi confirmada por meio de western blot. As proteínas expressas pelo evento da invenção apresentam o tamanho esperado e não foi encontrado evidências de proteínas truncadas/fusionadas sendo expressas pelo referido evento.

Exemplo 5. Ensaios biológicos: Suscetibilidade à broca-da-cana (D. saccharalis)

[0285] Ensaios Biológicos (bioensaios) com a praga alvo da cultura, D. saccharalis (broca-da-cana), também podem ser utilizados para a detecção e caracterização do evento CTC93209-4, demonstrando a eficácia de controle proporcionada pela proteína inseticida Cry1Ac expressa. Diferentes Bioensaios podem ser contemplados no escopo da presente invenção, como por exemplo, Ensaio de Disco Foliar, Ensaios de Eficácia em Telado, Ensaios de Diluição em Tecido, entre outros.

[0286] No caso de ensaio de disco foliar, amostras de folhas do evento são coletadas, cortadas em discos e em seguida mantidas úmidas. Em seguida, os discos foliares são distribuídos em placas de cultura contendo meio sólido (ágar), infestados com lagartas neonatas (0-24h de idade) de D. saccharalis e incubadas à uma temperatura de 27±1°C, umidade relativa 60±10% e fotoperíodo 12:12 (luz:escuro), por um período de 7 dias. Ao final da incubação, avalia-se a mortalidade das larvas, sendo calculado a partir disso a eficácia relativa ao controle (Eficácia relativa=(1-Mtc/Mev) x100). Como controles do ensaio, por exemplo, podem ser utilizadas variedades de cana de açúcar não transgênicas e geneticamente muito semelhantes ao evento transgênico avaliado.

[0287] Já no ensaio de Eficácia em Telado, mudas do evento transgênico são plantadas em um viveiro telado, onde as plantas são plantadas no solo e ficam em condições ambientais compatíveis com as condições naturais, porém com restrição a entrada ou saída de formas biológicas, como Diatraea saccharalis garantir a não ocorrência de infestações naturais. São realizadas pelo menos 5 infestações a cada 20 ou 30 dias, contendo de 20-35 ovos de Diatraea saccharalis por perfilho. Após 2 infestações realiza-se a primeira avaliação, a qual é seguida por avaliações intermediárias até a ocorrência da avalição final, quando todos os colmos infectados são colhidos e rachados longitudinalmente, sendo contado os entrenós totais e os entrenós brocados (com danos causados pela broca), obtendo-se assim o índice de infestação final (I.I.F). Avalia-se também os furos evoluídos e não evoluídos antes da abertura longitudinal dos colmos.

[0288] A observação e análise das infestações artificiais ou naturais em áreas de plantio também permitem a caracterização da eficácia dos materiais contra D. saccharalis. O I.I.F, por exemplo, pode ser calculado através da avaliação de infestações naturais através da definição de uma área experimental, coleta dos colmos e abertura longitudinal para contagem dos entrenós totais e os entrenós brocados (com danos causados pela broca), obtendo-se assim o índice de infestação final (I.I.F).

[0289] Para caracterizar a eficácia do evento CTC93209-4 contra a praga alvo em campo, foram instalados experimentos em 4 localidades (Piracicaba-SP, Barrinha-SP, Valparaíso-SP e Quirinópolis-GO). Os campos foram delineados em 4 parcelas por evento testado em blocos casualizados. Em cada parcela, foram selecionadas 5 touceiras, que foram mantidas até produzirem 10 perfilhos. Os perfilhos receberam 5 infestações artificiais com ovos de Diatraea saccharalis, espaçadas 30 dias. Em cada perfilho das touceiras selecionadas foi inoculado uma postura com cerca de 30 ovos cada.

[0290] Após 10 meses, foi realizada a avaliação para determinar o Índice de Infestação (I.I) que é considerado a unidade padrão para quantificar o dano causado pela broca da cana-de-açúcar. Para isso, todos os perfilhos das 5 touceiras de cada parcela foram cortados longitudinalmente e os danos, quando existentes, foram quantificados.

[0291] O índice de infestação foi calculado através da seguinte razão: número de entrenós com danos / número de entrenós totais no perfilho. Por fim, os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e a comparação das médias foi feita pelo teste de Tukey a 5%.

[0292] É possível observar que o evento CTC93209-4 sempre apresentou intensidade de infestação muito baixa, o que demonstra capacidade de controle da broca mesmo em condições artificiais de inoculação massiva. Para efeito de comparação, em Quirinópolis (GO), nas mesmas condições de inoculação do evento CTC93209-4 a intensidade de infestação chegou a 40% nos tratamentos com a cultivar CTC9003. Mesmo as Intensidades de Infestação medidas no evento CTC93209-4 refletem lesões iniciais causadas pela broca que não progrediram posteriormente. A FIGURA 15 apresenta a aparência visual típica dos tratamentos avaliados após a inoculação artificial.

[0293] Na FIGURA 16, verifica-se na análise conjunta (média dos resultados obtidos nas quatro localidades) índices de infestação maiores que 24% nos tratamentos controles com a cultivar CTC9003, enquanto o índice de infestação médio do evento CTC93209-4 foi próximo de zero.

Exemplo 6. Análises agronômicas e fenotípicas do evento CTC93209- 4, em comparação com variedade parental CTC9003 e variedades convencionais.

[0294] Características agronômicas e fenotípicas do evento CTC93209-4 foram avaliadas em comparação à variedade CTC9003 e quatro cultivares referências comerciais, em 5 locais representativos da área de cultivo da variedade parental CTC9003 no Brasil durante a safra 17/18. Os cinco locais selecionados para o plantio do experimento para avaliação dessas características fenotípicas foram localizados em São Paulo (Barrinha, Piracicaba e Valparaíso), Goiás (Quirinópolis) e Bahia (Juazeiro). Essas localidades são áreas representativas para a cultura da cana-de-açúcar no geral e permitem bom desenvolvimento vegetativo e produtividade da variedade parental CTC9003 em particular.

[0295] Todos os ensaios foram conduzidos em delineamento em blocos completos ao acaso, com 4 repetições. Em todos os locais de ensaio, as parcelas foram compostas por 10 linhas de 8 m, espaçadas em 1,5 entre linhas. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo Teste t ao nível de p ≤ 0,05. Na TABELA 13 encontram-se descritas as identificações dos materiais testes, controle, e referências, avaliados em cada local.
TABELA 13: Informações dos tratamentos e distribuição por local dos ensaios analisados.

[0296] Foram avaliadas as seguintes características fenotípicas:

[0297] 1. Estádio Fenotípico –O estádio fenotípico é caracterizado pelas alterações no exterior (morfologia) e as transformações que estão relacionadas ao ciclo da cultura. Para a cana-de-açúcar, optou-se pela contagem da média dos perfilhos ou colmos por touceira de cana, independentemente do número de folhas, ou estádio de desenvolvimento da planta. O estádio vegetativo da maioria das plantas de cada parcela foi avaliado a cada 30 ± 5 dias. Observações foram realizadas nas linhas 5 e 6 aos 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 e 330 (± 5) dias após o plantio (DAP).

[0298] 2. Estresses Bióticos/Abióticos – Estresses bióticos e ou abióticos são alterações causadas por algum agente externo seja ele biótico (insetos, doenças, mato-competição, etc.) ou abiótico (chuva, seca, geada, vento, etc.). Observações sobre a ocorrência desses stresees foram realizadas nas linhas 5 e 6 aos 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 e 330 (± 5) dias após o plantio (DAP). Quando observado algum estresse, solicitou-se a avaliação do nível de severidade e homogeneidade entre parcelas ou tratamento.

[0299] 3. Número de Perfilhos – Aos 120 ± 5 e 330 ± 5 DAP (Dias Após o Plantio) foram contados todos os perfilhos ou colmos das linhas 5 e 6 de cada parcela, descontando-se 2 m nas extremidades (frente e fundo) de cada linha.

[0300] 4. Altura da Planta – Aos 330 ± 5 DAP foram colhidos 2 feixes de 10 canas nas linhas 5 e 6 para medir a altura da planta, desde a inserção na coroa até a altura da inserção da folha +1.

[0301] 5. Peso da Parcela – Aos 330 ± 5 DAP, foram colhidos e pesados 2 feixes de 10 canas nas linhas 5 e 6.

[0302] 6. Diâmetro do Colmo – Aos 330 ± 5 DAP, foram colhidos 2 feixes de 10 canas nas linhas 5 6. Foram medidos o diâmetro de todos os colmos à altura do 5° colmo.

[0303] 7. Brix% - Aos 330 ± 5 DAP, foram coletados diretamente no campo duas (2) amostras de caldo por parcela para a medição % dos sólidos solúveis com o auxílio de um leitor portátil de Brix.

[0304] 8. Florescimento – Durante todo o ciclo de desenvolvimento da cultura até os 330 (± 5) DAP, foi observado o número de panículas florais, por parcela, as quais foram contadas e descartdas imediatamente.

[0305] Foram realizadas análises estatísticas individuais e conjuntas, de acordo com os modelos estatísticos descritos abaixo:

[0306] Análise Individual: yijk = μ+Bh+Gk+εijk

[0307] Análise Conjunta: yijk= μ+Si+B(S)ij+Gk+(SG)ik+εijk

[0308] Onde:

[0309] yijk = medida da repetição j no local i para o tratamento k;

[0310] μ = média geral;

[0311] Si= efeito do local i, i = 1 a 5;

[0312] Bj= efeito da repetição j, j = 1 a 4;

[0313] B(S)ij= efeito da repetição j dentro do local i, j = 1 a 4;

[0314] Gk= efeito do tratamento k, k = 1 a 7;

[0315] (SG)ik= interação entre o local i e o tratamento k;

[0316] εijk= erro do resíduo experimental.

[0317] Os dados foram analisados de acordo com os modelos descritos, utilizando uma abordagem de modelos lineares mistos implementado no pacote lme4 (BATES et al., 2015).Os dados foram analisados de acordo com os modelos descritos, utilizando uma abordagem de modelos lineares mistos implementado no pacote lme4 (BATES et al., 2015).

[0318] A caracterização comparativa entre dados de amostras oriundas de plantas derivadas de biotecnologia e plantas convencionais leva em consideração o princípio da equivalência substancial, ou seja, exceto para o objetivo da modificação genética, as demais características não se alteram além de uma variação conhecida e aceitável.

[0319] Os resultados dos testes de médias para os parâmetros fenotípicos do evento CTC93209-4 e da variedade parental CTC9003 estão apresentados na TABELA 14 e 15.
TABELA 14: Testes de médias para os parâmetros fenotípicos do evento CTC93209-4 e da variedade parental CTC9003. Análise individual para os locais Barrinha-SP, Juazeiro-BA, Piracicaba-SP, Quirinópolis-GO e Valparaíso-SP aos 330 DAP. Os valores mínimos e máximos indicam o intervalo das médias de quatro variedades comerciais plantadas nas mesmas condições experimentais.

* Diferença significativa entre os materiais teste e controle pelo teste t ao nível de p ≤ 0,05. **Valores médios mínimos e máximos ajustados de 4 variedades comerciais de referência. †Número médio de perfilhos ou colmos por touceira avaliados a cada 30 dias, média de 11 observações ao longo do ciclo.
TABELA 15: Testes de médias para os parâmetros fenotípicos do evento CTC93209-4 e da variedade controle CTC9003. Análise conjunta para os locais Barrinha-SP, Juazeiro-BA, Piracicaba-SP, Quirinópolis-GO e Valparaíso-SP aos 330 DAP. Os valores mínimos e máximos indicam o intervalo das médias de quatro variedades comerciais plantadas nas mesmas condições experimentais.

* Diferença significativa entre os materiais teste e controle pelo teste t ao nível de p ≤ 0,05. **Valores médios mínimos e máximos ajustados de 4 variedades comerciais de referência. †Número médio de perfilhos ou colmos por touceira avaliados a cada 30 dias; Média de 11 observações ao longo do ciclo.

[0320] Baseado no método de interpretação dos resultados é possível concluir que existe equivalência substancial entre o evento CTC93209-4 e a variedade controle convencional CTC9003. Nenhuma das modificações genéticas introduzidas no evento CTC93209-4 altera sua capacidade de reprodução, sobrevivência, disseminação ou transferência de genes para outros organismos. As avaliações realizadas e apresentadas nesse documento demonstram que o evento CTC93209-4 é equivalente em todas as características fenotípicas, agronômicas, fisiológicas e bioquímicas à variedade parental CTC9003, exceto pelas características conferidas pelos genes introduzidos.

[0321] Adicionalmente, também não se verificou nenhum tipo de estresse biótico ou abiótico que tenha ocorrido de forma diferencial para o evento CTC93209-4 em relação à variedade parental CTC9003. Os dados sugerem que o fenótipo do evento CTC93209-4 não difere significativamente em comparação a variedade parental CTC9003.

Exemplo 7. Estabilidade genotípica

[0322] A estabilidade genotípica do evento CTC93209-4 foi estudada por meio de análise de Southern blot realizada ao longo de 3 ciclos de propagação vegetativa.

[0323] Foram coletados 30cm de 5 a 10 folhas "diagnóstico" do evento CTC93209-4 e da variedade parental CTC9003. Após retirada da nervura central, as folhas foram picadas em pedaços, homogeneizadas e acondicionadas em sacos plásticos tipo "ziplock" previamente identificados. Esta primeira coleta foi identificada como T0, representando o ciclo de cana-planta. As plantas amostradas no T0 foram coletadas aos 360 DAP (dias após o plantio) em casa de vegetação. Nenhum rebaixamento ou corte das plantas tinha sido realizado antes da coleta T0. Após a coleta das folhas, foi realizado o rebaixamento imediato de todos os vasos. Aos 75 (± 5) dias após o corte foi realizada nova coleta das folhas como descrito acima. Esta segunda coleta foi identificada como T1, representando a primeira geração de cana-soca. O procedimento descrito foi repetido mais duas vezes até conseguir as amostras denominadas T3. Após cada coleta, as amostras foram acondicionadas em caixa com gelo seco e armazenadas em ultrafreezer até seu processamento.

[0324] Para a determinação do número de cópias e estabilidade genotípica do inserto de T-DNA no genoma do evento CTC93209-4, foram utilizadas sondas complementares ao gene cry1Ac e ao gene nptII, de acordo com o mapa de restrição do T-DNA apresentado na FIGURA 17. A sonda para o gene cry1Ac foi desenhada para cobrir aproximadamente 60% do gene na sua extremidade 5’, enquanto que a sonda para o gene nptII foi desenhada para cobrir quase que toda sua totalidade.

[0325] As enzimas EcoRV e BamHI foram utilizadas para a detecção dos cassetes contendo os genes cry1Ac e nptII. A enzima EcoRV pode apresentar dados de integridade da inserção, uma vez que seu uso gera um fragmento único contendo ambos os genes. As sondas e o tamanho mínimo esperado dos fragmentos para cada enzima estão apresentados na FIGURA 16.

[0326] Os resultados de Southern blot indicam que o evento CTC93209-4 apresenta estabilidade genotípica das inserções de TDNA ao longo de 3 ciclos de propagação vegetativa, representativas de 4 gerações (1 cana-planta e 3 canas-socas).

[0327] As sondas foram preparadas utilizando os reagentes do kit PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche, Alemanha, cat#11636090910), seguindo as instruções do fabricante. Foram utilizados cerca de 100 pg do vetor linearizado como molde para a amplificação das regiões de interesse e incorporação da molécula Digoxigenina (DIG) por PCR. Os iniciadores (primers) utilizados para a produção das sondas e o tamanho esperado de cada amplicon estão relacionados na TABELA 16.
TABELA 16: Lista de iniciadores utilizados na síntese de sondas marcadas com DIG.

[0328] O DNA genômico do evento CTC93209-4 e da variedade parental CTC9003 foi extraído conforme o protocolo de ALJANABI et al. (1999), com pequenas modificações. O DNA genômico extraído foi quantificado no fluorímetro Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc, EUA) utilizando o Qubit dsDNA BR Assay Kit 2-1000 ng (Invitrogen, EUA, cat#Q32850 ou cat#Q32853), seguindo as recomendações do fabricante. A qualidade do DNA extraído foi avaliada em gel de agarose 1%. Em seguida, 10 μg de DNA foram digeridos utilizando 100 unidades de enzima de restrição (10 U/μg de gDNA), em um volume final de 400 μL de reação. O digerido foi precipitado com 2 volumes de etanol e 10% de acetato de amônio 7,5 M, e incubado por 48 h a -20 °C. O precipitado foi centrifugado à 14.000 x g, 30 min e o pellet foi ressuspendido em 35 μL de água milli-Q.

[0329] A eletroforese do DNA digerido foi realizada em gel de agarose a 1% com tampão TBE 1X. O intercalante utilizado foi o SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen, EUA, cat #S33102) na proporção de 10 μL do intercalante para cada 100 mL de gel. Dez microlitros (10 μL) de DNA digerido foram acrescentados de 1 μL do tampão de corrida 6X concentrado (40% Sacarose; 0,25% Azul de bromofenol; 0,25% Xileno cianol) e todo o volume das amostras foi aplicado no gel de agarose. O padrão de peso molecular DIG Molecular Weight Marker VII Digoxigenin-labeled (Roche, Alemanha, cat #11669940910), bem como os controles negativo e positivos, foram adicionados a todos os géis. Todas as amostras foram separadas por elefroforese a 50 V por 60 min e, em seguida, a 35V por aproximadamente 16 horas. Para a transferência das amostras para membrana de Nylon carregada positivamente (Roche, Alemanha, cat #11417240001), o gel foi tratado com quatro soluções distintas, submergindo-o e deixando-o sob suave agitação em mesa agitadora, pelo tempo requerido, na seguinte ordem:

1. Solução de Depurinação (1,1% HCL); 10-15 min;
2. Solução de Desnaturação (0,5N NaOH; 1,5M NaCl); 30-40 min;
3. Solução de Neutralização (1,5M NaCl; 0,5M Tris); 30-40 min;
4. SSC 20x (Citrato de Sódio Salino); 5-15 min.

[0330] As etapas de tratamento com as soluções foram intercaladas com etapas de lavagem onde o gel foi enxaguado em água destilada, para retirada de qualquer resíduo das soluções, antes de adicionar a próxima solução. Em seguida, foi preparado o aparato de transferência do DNA do gel para a membrana de Nylon seguindo as instruções do fabricante do Sistema de transferência TurboBlotter 20 x 25 (SigmaAldrich, EUA, cat #WHA10416324). O tempo de transferência foi de 16 horas. Após a transferência, o gel foi removido cuidadosamente. A membrana com as amostras de DNA transferido foi colocada no equipamento UV Crosslinker com a face contendo o DNA voltada para cima. A fixação do DNA na membrana foi realizada em 2 ciclos de 700 x 100 μJ/cm2.

[0331] A solução de Pré-hibridização consistiu de solução DIG Easy Hyb pré-aquecida a 40 °C, adicionada de DNA de esperma de salmão desnaturado na concentração final de 100 μg/mL. As membranas foram incubadas em forno de hibridização a 40 °C por 3 horas, com rotação constante (0,5 x g). A solução de hibridização foi preparada de modo similar à solução de Pré-hibridização (DIG Easy Hyb com DNA de esperma de salmão) acrescentada da sonda escolhida para a reação, marcada com DIG e desnaturada. A concentração das sondas utilizadas foi de 65 μg/mL. A lavagem e bloqueio das membranas hibridizadas foi realizada utilizando o kit DIG Wash and Block Buffer (Roche, Alemanha, cat#11585762001), seguindo as recomendações do fabricante. O anticorpo Anti-Digoxigenin AP fragments (Roche, Alemanha, cat #11093274910) foi diluído na proporção 1:20.000. A membrana foi incubada por 30 min em temperatura ambiente e leve agitação.

[0332] Para a detecção dos anticorpos ligados às sondas marcadas, foi descartada a solução com o anticorpo e a membrana foi lavada com a solução DIG Wash buffer 1X e DIG Wash buffer 2X por 5 e 15 min respectivamente, à temperatura ambiente e sob agitação vigorosa. Em seguida, a membrana foi transferida para solução de 1X Detection buffer (Roche, Alemanha) e incubada por 5 min, sob leve agitação. Na sequência, a membrana foi colocada em saco plástico e coberta com 1X Detection buffer acrescido de CDP-Star ready to use (Roche, Alemanha), concentração final de 1×. A membrana foi incubada no escuro por 5 min e, após esse tempo, a membrana ainda úmida foi colocada dentro de um filme plástico limpo e revelada. A revelação foi realizada em filme fotográfico específico para a detecção de quimiluminescência (Roche, Alemanha, cat #11666657001). A membrana e o filme permaneceram em contato dentro do cassete por pelo menos 16 horas. A revelação foi feita submergindo o filme em 1× Solução de Revelação (Kodak, Japão) por alguns segundos até a visualização das bandas esperadas nas amostras bem como no marcador de peso molecular. O filme foi fixado com 1X Solução de Fixação (Kodak, Japão).

[0333] Os resultados do Southern blot confirmam que o evento CTC93209-4 possui 2 inserções estáveis ao longo de três gerações de propagação vegetativa representativas de 4 gerações (1 cana-planta e 3 canas-socas).

[0334] A enzima EcoRV corta uma única vez o T-DNA, na região espaçadora, entre o terminador do gene nptII e a borda esquerda (FIGURA 30). Assim, o resultado esperado da digestão do DNA do evento CTC93209-4 com a enzima EcoRV são dois fragmentos de DNA, correspondete às duas inserções de T-DNA carregango os dois genes (cry1Ac e nptII) cada uma. Esses fragmentos foram detectados individualmente com a sonda específica para cada um deles, apresentando-se como duas bandas no filme de raio X (FIGURAS 17 e 18). Os resultados de Southern blot com a enzima EcoRV também permitem inferir que os T-DNAs inseridos no evento CTC93209-4 se apresentam integros, uma vez que a hibridização das sondas Cry e nptII produziram os mesmos resultados, indicando que ambos os genes estão juntos na mesma inserção (FIGURAS 17 e 18).

[0335] A FIGURA 17 mostra também o resultado esperado da hibridização com a sonda Cry após 4 gerações vegetativas consecutivas (T0 a T3) do evento CTC93209-4. A geração T0 representa o primeiro estágio da cana-planta antes do primeiro corte. As gerações subsequentes são derivadas do corte sucessivo da planta T0 de maneira a simular o que é realizado no cultivo comercial. A presença dos mesmos fragmentos em todas as gerações de cana-de-açúcar avaliadas confirma a estabilidade genética da inserção no evento CTC93209-4.

[0336] A FIGURA 18 apresenta o resultado esperado da hibridização com a sonda nptII, nas mesmas condições. Os fragmentos esperados aparecem indicados com setas vermelhas nas FIGURAS 17 e 18.

[0337] Dois fragmentos são esperados a partir da digestão com a enzima BamHI. A enzima de restrição BamHI corta no final do gene cry1Ac, separando o T-DNA em duas metades, cada uma delas carregando um dos genes de interesse (cry1Ac ou nptII) (FIGURA 16). Assim, no caso do evento CTC93209-4, portador de duas cópias de cada gene, cada uma das regiões gênicas é detectada como duas bandas diferentes no filme de raio X quando utilizadas as sondas Cry e nptII. Estes fragmentos aparecem indicados nas FIGURAS 17 e 18.

[0338] Dois fragmentos de ~4 e ~13 kb são observados após digestão do DNA genômico com a enzima BamHI e detecção com a sonda Cry (FIGURA 32). Do mesmo modo, dois fragmentos de tamanhos diferentes (quando comparados à porção que carrega o gene cry1Ac), são observados após hibridização com a sonda nptII (FIGURA 18). Neste caso, os fragmentos encontrados possuem aproximadamente 4 kb com pequenas diferenças de tamanho entre si.

[0339] Tendo sido descritos exemplos de concretizações preferidas, deve ser entendido que o escopo da presente invenção abrange outras possíveis variações, sendo limitado tão somente pelo teor das reivindicações apensas, aí incluídos os possíveis equivalentes.

Claims

Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 30.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 30.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 17.
Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 31.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 31.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 16.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 8.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 36.
Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 32.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos SEQ ID NO 32.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 32.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 16 caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 25.
Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 33.
Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 33.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO 24.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 22, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 9.
Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 23, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO 37.
Pares de Iniciadores, caracterizados pelo fato de o iniciador senso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 10 e o iniciador antisenso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 11 e/ou o iniciador senso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 12 e o iniciador antisenso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:13.
Pares de Iniciadores, caracterizados pelo fato de o iniciador senso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 18 e o iniciador antisenso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 19 e/ou o iniciador senso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 20 e o iniciador antisenso possuir pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:21.
Método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4, caracterizado por compreender as etapas de:
- I. obter uma amostra para análise;
- II. extrair o DNA da amostra;
- III. fornecer pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 36, e SEQ ID NO 37 ou a sequência complementar da SEQ ID NO 37;
- IV. amplificar a região que fica entre os sítios em que os iniciadores se ligam; e
- V. detectar a presença de produto da amplificação,
onde, o produto de amplificação compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender pares de iniciadores planejados para se ligarem a pelo menos um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de sequências da etapa III onde, o produto de amplificação detectado na etapa V compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33.
Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo produto de amplificação detectado na etapa V compreender pelo menos 104 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 e SEQ ID NO 7 ou suas sequências complementares.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender o fornecimento de pares de iniciadores planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de sequências da etapa III, onde pelo menos um dos iniciadores compreende pelo menos 3 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender o fornecimento de pares de iniciadores planejados para se ligarem a um polinucleotídeo que compreende 14 nucleotídeos contíguos de sequências da etapa III, onde pelo menos um par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 ou de suas sequências complementares e um segundo iniciador que compreende nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3 ou das suas sequências complementares.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os pares de iniciadores utilizados na etapa III são definidos conforme a reivindicação 25.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os pares de iniciadores utilizados na etapa III são definidos conforme a reivindicação 26.
Método, de acordo com a reivindicação 27, em que os pares de iniciadores utilizados na etapa III são caracterizados pelo fato de serem selecionados do grupo consistindo de sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19; e SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os amplicons obtidos são selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 24.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a detecção do amplicom é realizada através da hibridização de sonda selecionada do grupo consistindo de sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23.
Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a detecção dos amplicom é realizada através de SYBR GREENTM.
Método de detecção de material vegetal derivado do evento CTC93209-4, caracterizado por compreender as etapas de:
I. obter uma amostra para análise;
II. extrair o DNA/RNA da amostra;
VI. fornecer uma sonda planejada para se ligar a um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO 33 e suas sequências complementares;
III. hibridizar a dita sonda com a amostra, e
IV. detectar a sonda hibridizada.
Construção genética, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
Construção genética, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:26.
Kit para detecção da presença em uma amostra de material vegetal derivada do evento CTC93209-4, caracterizado por compreender um meio para detecção da presença de um polinucleotídeo que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 e SEQ ID NO 33 e de suas sequências complementares e/ou uma proteína Cry.
Evento CTC93209-4, caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33.
Evento CTC93209-4, caracterizado pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9.
Evento CTC93209-4, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.
Planta resistente a insetos, caracterizada pelo fato de ser uma variedade de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33.
Planta resistente a insetos, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9.
Planta resistente a insetos, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada por compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de sequências com pelo menos 80% de identidade com as SEQ ID NO 36 e SEQ ID NO 37.
Produto de comódite, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4.
Método para produzir uma planta de cana-de-açúcar resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma primeira planta de cana-de-açúcar com uma segunda planta de cana-de-açúcar compreendendo o evento CTC93209-4.
Método para produzir uma planta de cana de açúcar resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende inserir um fragmento de T DNA em sítio específico do genoma compreendido nas sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 e SEQ ID NO 41 através de recombinação homóloga.
Uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo o evento CTC93209-4, caracterizado pelo fato de que é para regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.