BR102013018436B1 - Proteína inseticida, gene inseticida, cassete de expressão, vetor recombinante, microrganismo transgênico, e métodos para a produção de proteínas inseticidas, ampliar o alcance de insetos alvo, produção de plantas resistentes a insetos, proteção de plantas dos danos causados por pragas de insetos, e controlar pragas de insetos - Google Patents
Proteína inseticida, gene inseticida, cassete de expressão, vetor recombinante, microrganismo transgênico, e métodos para a produção de proteínas inseticidas, ampliar o alcance de insetos alvo, produção de plantas resistentes a insetos, proteção de plantas dos danos causados por pragas de insetos, e controlar pragas de insetos Download PDFInfo
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Abstract
PROTEÍNA INSETICIDA, GENE QUE CODIFICA A MESMA E SEU USO. A presente invenção refere-se a uma proteína inseticida, o seu gene que codifica e o uso das mesmas. A proteína inseticida compreende: (a) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, ou (b) uma proteína derivada de (a) que consiste em uma sequência de aminoácidos por meio da substituição, deleção ou adição de um resíduos ou mais aminoácidos das sequências de aminoácidos de (a), e que possui atividade inseticida, ou (c) uma proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou (d) um proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência complementar, que hibrida com a SEQ ID NO: 1 mediante as condições rigorosas, ou (e) uma proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácido nucleico contêm as sequências de nucleotídeos iso codificadas com as sequências de nucleotídeos em (d). A proteína inseticida da presente invenção tem um elevado nível de expressão e forte toxicidade contra as pragas de insetos.
Description
[0001] A presente invenção se refere a uma proteína inseticida, o seu gene que codifica e os usos da mesma, mais particularmente, se refere a uma proteína inseticida PIC9 modificada, o seu gene que codifica a proteína inseticida e os usos da mesma.
[0002] As pragas de plantas são um fator importante para a perda de colheitas, resultando em uma perda econômica enorme de agricultores e até mesmo afetando as condições de vida da população local. Os inseticidas químicos de amplo espectro e os inseticidas bióticos são frequentemente usados por pessoas para prevenir e controlar as pragas de plantas. No entanto, há limites para serem usados na aplicação prática: os inseticidas químicos conduzirão a contaminação do ambiente e do aparecimento de insetos resistentes aos medicamentos e os inseticidas bióticos são facilmente degradados no meio ambiente e devem ser aplicados repetidamente durante a produção, o que aumenta, de forma dramática, o custo de produção.
[0003] Para solucionar as limitações dos inseticidas químicos e dos inseticidas bióticos no que dizem respeito à aplicação prática, os cientistas descobriram, com base em pesquisas, que algumas plantas transgênicas resistentes a insetos podem ser obtidas através da transferência do gene resistente aos insetos de codificação de proteína inseticida em plantas, com a finalidade de evitar e controlar as pragas. A proteína inseticida Pic9 é uma das proteínas inseticidas, produzida por Bacillus thuringiensis sbusp.kurstaki, B.t.k. Pic9 é uma proteína insolúvel cristal parasporal.
[0004] A proteína pic9 é ingerida na mesêntero de insetos, e a protoxina toxalbumina é dissolvida em ambiente de pH alcalino do mesêntero de inseto. A proteína Terminal N e do terminal C é digerida por meio da proteinase alcalina e a protoxina é convertida em fragmentos ativos. Estes fragmentos ativos são limitados aos receptores na superfície superior da membrana epitelial dos mesêntero de inseto, e inserido dentro da membrana do intestino, o que resulta em lesões de perfuração da membrana celular, destruindo a alteração da pressão osmótica e o equilíbrio do pH no interior e no exterior da membrana celular, e a perturbação do processo de digestão de insetos e, finalmente, conduz à morte.
[0005] Há uma perda de grãos grave a cada ano por causa das pragas, como broca do milho, Agrotis ypsilan, lagarta do cartucho do milho, ou lagarta do algodão. Até o momento, não há relatos sobre o nível de expressão e de toxicidade da proteína Pic9 inseticida em plantas.
[0006] O objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma proteína inseticida, o seu gene que codifica e os usos da mesma, em que a proteína PIC9 inseticida tem um elevado nível de expressão e forte toxicidade em plantas, especialmente no milho.
[0007] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção proporciona uma proteína inseticida, que compreende: (a) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, ou (b) Atividade inseticida de uma proteína derivada de (a) que consiste em uma sequência de aminoácidos por meio da substituição, da deleção ou da adição de um ou mais resíduos de aminoácidos das sequências de aminoácidos em (a), e tem atividade inseticida, ou (c) uma proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou (d) uma proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácidos nucleicos contendo as sequências de nucleotídeos, em que as sequências nucleotídicas têm as sequências complementares que hibridam com a SEQ ID NO: 1 mediante as condições rigorosas, ou (e) uma proteína gerada por meio da expressão de moléculas de ácidos nucleicos contendo as sequências de nucleotídeos, em que as sequências nucleotídicas são iso codificantes com as sequências de nucleotídeos em (d).
[0008] As condições rigorosas podem ser que a hibridação é realizada em 6 x SSC (citrato de sódio), solução a 0,5 % de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 65 °C, e a membrana é então lavada uma vez com 2 x SSC, SDS a 0,1 % e 1 x SSC, SDS a 0,1 %, de uma maneira respectiva.
[0009] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona um gene inseticida, que compreende: (a) sequências de nucleotídeos que codifica a proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, ou (b) sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos, em que as sequências de aminoácidos são as proteínas provenientes de (a), por meio da substituição, da deleção ou da adição de um ou mais resíduos de aminoácidos das sequências em (a), e que têm atividade inseticida, ou (c) sequências de nucleotídeos contendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO : 1, ou (d) sequências de nucleotídeos que hibridaram com as sequências de nucleotídeos definidas por meio de (c) mediante as condições rigorosas e que codificam para a proteína que possui a atividade inseticida, ou (e) sequências de nucleotídeos iso codificando com as sequências de nucleotídeos em (d).
[00010] As condições rigorosas podem ser que a hibridação é realizada em 6 x SSC (citrato de sódio), solução a 0,5 % de SDS (dodecilsulfato de sódio ) a 65 °C, e a membrana é então lavada uma vez com 2 x SSC, SDS a 0,1 % e 1 x SSC, SDS a 0,1 %, de uma maneira respectiva.
[00011] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um cassete de expressão, que contém o gene inseticida ligado de uma maneira eficaz sob a regulação de sequências reguladoras.
[00012] Para atingir o objetivo acima, a presente invenção proporciona ainda um vetor recombinante contendo o cassete de expressão.
[00013] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um organismo hospedeiro transgênico contendo o gene inseticida, incluindo as células vegetais, células animais, bactérias, leveduras, baculovírus, nemátodos ou algas.
[00014] Além disso, a planta é milho, soja, algodão, arroz ou trigo.
[00015] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um método para a produção de proteínas inseticidas, que compreendem: adquirir as células do organismo hospedeiro transgênico; a cultura das células do organismo hospedeiro transgênico, em condições que permitam a produção de proteína inseticida e; a recuperação da proteína inseticida.
[00016] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um método para alargar a gama de insetos alvo, que compreendem: o cassete de expressão que expressa em uma planta em conjunto com pelo menos uma segunda proteína inseticida do que a sequência que é diferente daquela de a proteína inseticida do cassete de expressão.
[00017] Além disso, a segunda proteína inseticida é a proteína inseticida do tipo VIP, inibidor da protease, aglutinina, α-amilase ou a peroxidase.
[00018] Na presente invenção, a expressão de proteína pic9-02 inseticida em uma planta transgênica pode ser acompanhada por meio da expressão de uma ou mais proteínas inseticidas do tipo VIP. Esta coexpressão de mais do que uma toxinas inseticidas na mesma planta transgênica pode ser implementada por meio de engenharia genética, que torna a planta conter e expressar o gene desejado. Além disso, a primeira planta (o primeiro precursor) pode expressar a proteína PIC9- 02 inseticida por meio de manipulação da engenharia genética, e a segunda unidade (o segundo precursor) pode expressar a proteína inseticida do tipo VIP, por meio de manipulação genética. Uma planta de descendência, que expressa todos os genes que foram introduzidos no primeiro e no segundo progenitor principal, pode ser obtida por meio da hibridação do primeiro progenitor e do segundo progenitor.
[00019] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um método para a produção de plantas resistentes ao inseto, que compreende: introdução do gene inseticida ou o cassete de expressão ou o vetor recombinante em uma planta.
[00020] De preferência, a planta é milho, soja, algodão, arroz ou trigo.
[00021] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um método para proteger as plantas contra danos causados por pragas de insetos, que compreende: introdução do gene inseticida ou o cassete de expressão ou o vetor recombinante em uma planta de modo que a planta após introdução gera proteína inseticida suficiente para proteger as plantas contra os danos causados por meio das pragas de insetos.
[00022] De preferência, a planta é milho, soja, algodão, arroz ou trigo.
[00023] Para atingir o objetivo anterior, a presente invenção proporciona ainda um método para controlar as pragas de insetos, que compreende: o contato de pragas de insetos com uma quantidade inibidora da proteína inseticida, ou a proteína inibitória de inseto codificada por meio do gene inseticida.
[00024] De preferência, as pragas de insetos são as pragas de insetos da ordem Lepidoptera.
[00025] A introdução do gene inseticida ou o cassete de expressão ou o vetor recombinante em uma planta significa a introdução de DNA exógeno em uma célula de planta na presente invenção, e os métodos de transformação convencionais incluem, mas não se limitando a, a transformação mediada por Agrobaterium, micro bombardeio de emissões, a ingestão direta de DNA em um protoplasto, a eletroporação ou a introdução do DNA mediada por meio de vergas de silício.
[00026] Por genomas de planta, tecido de planta ou da célula de planta da presente invenção entendem-se qualquer material genético na planta, tecido de planta ou célula da planta, e incluem os genomas de núcleo, de plastídeos e mitocôndrias.
[00027] O "fragmento" ou "segmento" de moléculas de DNA ou as sequências protéicas da presente invenção significa que uma parte do DNA original é envolvido ou de sequências de proteínas (nucleotídeo ou aminoácido) ou as formas modificadas artificialmente dos mesmos (por exemplo, a sequência adequada para a expressão em uma planta), e o comprimento das sequências mencionadas acima é variável, mas é suficiente para garantir que a proteína (codificada) seja a toxina de insetos.
[00028] A substituição, deleção ou adição de sequências de aminoácidos da presente invenção são técnicas convencionais neste domínio, e de preferência, esta alteração de aminoácidos é a seguinte: a mudança de caraterística pequena, ou seja, a substituição conservadora de aminoácidos que não tem nenhum efeito significativo sobre a dobragem de proteínas e/ou atividade da proteína; pequena deleção, deleção tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; pequena extensão do terminal amino ou terminal carboxila, por exemplo, um resíduo de metionina é estendido no terminal amino, e o pequeno peptídeo de ligação, por exemplo, 20 a 25 resíduos de comprimento.
[00029] Os exemplos de substituição conservadora entende-se a substituição que ocorre no seguinte grupo de aminoácidos: aminoácidos alcalinos (tais como arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (tais como ácido glutâmico e ácido aspártico), os aminoácidos polares (tais como amida de glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tais como leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (tais como fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos micromoleculares (tais como glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Essas substituições de aminoácidos que normalmente não alteram a atividade específica são bem conhecidas neste campo, e foram descritas, por exemplo, em Proteina que foi escrita por N. Neurath e RL Hill e publicada pela Academic Press de Nova York em 1979. As mudanças mais comuns são a Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, qui/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Lie, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, e as suas trocas de reversão.
[00030] É aparente para aquelas pessoas que são versadas na técnica que, esta substituição pode ocorrer a partir de uma região que desempenha um papel importante em funções moleculares, e ainda gera polipeptídeos ativos. Para polipeptídeos da presente invenção, os resíduos de aminoácidos que são necessários para as atividades dos polipeptídios e, portanto, escolhidos para não serem substituídos, podem ser identificados com base nos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mutagênese dirigida ao local ou alanina mutagênese de varredura (por exemplo, vide: Cunningham e Wells, Science 244: 1081 a 1085, 1989). A última técnica é que a introdução de uma mutação em cada resíduo carregado positivamente na molécula, e, em seguida, a detecção da atividade resistente aos insetos das moléculas resultantes de mutações de modo a determinar os resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade molecular. O local de interação da enzima do substrato também pode ser determinado por meio de análise da sua estrutura tridimensional, sendo que tal estrutura tridimensional pode ser determinada por meio dastécnicas, tais como análise de RMN, cristalografia ou marcação por meio da fotoafinidade, etc (vide, por exemplo, de Vos et ail., 1992, Science 255: 306 a 312, Smith et al, 1992, J. Mol. Biol 224: 899 a 904; Wlodaver et al, 1992, FEBS Letters 309: 59 a 64) .
[00031] Por conseguinte, as sequências de aminoácidos que têm umacerta homologia com as sequências de aminoácidos mostradas por meio da Sequência 2 Também estão incluídas na presente invenção. Estas sequências têm pelo menos de 40 % -50 % de homologia com as sequências da presente invenção, de 60 %, 65 % ou 70 %, e mesmo pelo menos de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de homologia. Isto quer dizer, a gama de homologia de sequência é de pelo menos 40 % a 50 %, 60 %, 65 % ou 70 %, e mesmo pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais.
[00032] As moléculas de ácidos nucleares ou os segmentos do mesmo sobre a presente invenção podem ser hibridadas com o gene inseticida na presente invenção mediante as condições rigorosas. Qualquer hibridação de ácidos nuclear convencional ou um método de amplificação pode ser usado para identificar a existência do gene inseticida de acordo com a presente invenção. As moléculas de ácido nucleares ou os segmentos do mesmo podem ser especificamente hibridadas com outras moléculas de ácido nucleares mediante uma determinada circunstância. Na presente invenção, se duas moléculas de ácidos nucleares podem formar estruturas nucleares antiparalelos do ácido de filamento duplo, isto significa que estas duas moléculas de ácidos nucleares podem ser especificamente hibridizadas umas com as outras. Se duas moléculas de ácidos nucleares mostram complementaridade completa, uma delas é chamada como o "complemento" da outra. Na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nuclear é complementar ao nucleotídeo correspondente na outra molécula de ácido nuclear, as duas moléculas de ácidos nucleares mostram uma "complementaridade completa". Se duas moléculas de ácidos nucleares podem ser hibridadas com a outra, com estabilidade suficiente de modo a que elas são recozidas e ligadas umas com as outras, pelo menos mediante as condições convencionais "pouco rigorosas", estas duas moléculas de ácidos nucleares são "complementares a menor". Do mesmo modo, se duas moléculas de ácidos nucleares podem ser hibridadas com a outra, com estabilidade suficiente de modo a que elas são recozidas e ligadas umas com as outras mediante as condições convencionais "altamente rigorosas", as duas moléculas de ácidos nucleares têm "complementaridade". O desvio de complementaridade completa só é permitido se esse desvio não impede completamente duas moléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. A fim de fazer uma molécula de ácido nuclear ser utilizado como iniciador ou sonda, ela só precisa garantir que haja uma complementaridade suficiente na sequência, de modo que uma estrutura estável em filamento duplo pode ser formada sob UM solvente e A salinidade específica que são utilizadas.
[00033] Na presente invenção, a sequência que é substancialmente homóloga é um segmento da molécula de ácido nuclear, que pode ser especificamente hibridada com uma cadeia complementar correspondente de um outro segmento da molécula de ácido nuclear mediante as condições altamente rigorosas. Existem condições rigorosas adequadas para a promoção de hibridação do DNA, por exemplo, o tratamento de DNA com 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio ( SSC ) a 45 °C, seguida de lavagem com 2,0 x SSC a 50 °C, e estas condições são bem conhecidos por aquelas pessoas que são versadas na técnica. Por exemplo, a salinidade na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de 2,0 x SSC, 50 °C de condições rigorosas inferiores a 0,2 x SSC, 50 °C de condições altamente rigorosas. Além disso, as condições de temperatura na etapa de lavagem podem ser elevadas para 22 °C a temperatura ambiente de condições rigorosas inferiores a 65 °C de condições altamente rigorosas. As condições de temperatura e salinidade, tanto podem ser alteradas, ou uma delas é inalterada, enquanto a outra é alterada. De preferência, as condições rigorosas da presente invenção podem ser realizar uma hibridação específica com a SEQ ID NO: 1 em 6 x SSC, solução a 0,5 % de SDS a 65 °C, e a membrana é então lavada uma vez com 2 x SSC, SDS a 0,1 % e 1 x SSC, SDS a 0,1 %, de uma maneira respectiva.
[00034] Portanto, as sequências que têm atividade inseticida e que podem ser hibridadas com a sequência 1 na presente invenção mediante as condições rigorosas são incluídas na presente invenção. Estas sequências têm pelo menos 40 % a 50 % de homologia com as sequências da presente invenção, 60 %, 65 % ou 70 %, e mesmo pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de homologia. Isto quer dizer, a gama de homologia de sequência é de pelo menos 40 % -50 %, 60 %, 65 % ou 70 %, e mesmo pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais.
[00035] Quando os polipeptídeos codificados por meio de uma sequência de ácido nuclear têm as mesmas sequências de aminoácidos como os polipeptídeos codificados por meio de uma sequência de referência nuclear de ácido, a sequência do ácido nuclear e a sequência de ácido nuclear de referência são "iso codificando", tal como descrito na presente invenção.
[00036] As sequências de regulação na presente invenção incluem, mas não se limitando a, promotores, peptídeos de trânsito, terminadores, potenciadores, sequências líder, íntrons e outras sequências reguladoras operativamente ligadas ao gene inseticida.
[00037] Os promotores são promotores expressivos na planta, e os "promotores expressivos na planta" são promotores que podem garantir, em uma célula da planta, a expressão de sequências de codificação conectadas a partir das mesmas. Os promotores expressivos na planta podem ser promotores constitutivos. Os exemplos de promotores que orientam a expressão constitutiva em plantas incluem, mas não se limitando a, promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, promotor ubi, promotor do gene GOS2 de arroz e semelhantes. De uma maneira alternativa, os promotores expressáveis em plantas podem ser promotores específicos de tecido, ou seja, tendo um nível mais elevado de orientar a expressão de sequências de codificação em alguns tecidos de planta, por exemplo, em chlorenchyma, do que em outros tecidos da planta (que pode ser determinado por meio do teste convencional de RNA), por exemplo, promotor carboxilase PEP. De uma maneira alternativa,os promotores expressáveis em plantas podem ser promotores de feridas induzidas. Os promotores de feridas induzidas ou os promotores que orientam o padrão de expressão da ferida introduzida indicam que, quando a planta é ferida por máquina ou por meio de uma mordida de um inseto, a expressão de sequências de codificação sob a regulação do promotor é melhorada de uma maneira significativa em comparação com os que, mediante as condições normais de crescimento. Os exemplos dos promotores induzidos por feridas incluem, mas não se limitando a, promotores da protease da batata e do tomate (genes supressores de pino I e pino II) e de genes supressores de protease de milho (MPI).
[00038] Os peptídeos de trânsito (também conhecido como sequência sinal de secreção ou a sequência alvo) são usados com a finalidade de orientar o produto transgênico celular a um órgão específico ou de um compartimento celular, e pode ser heterogêneo para a proteína do receptor, por exemplo, utilizando um código de sequência de peptídeo de trânsito do cloroplasto para o cloroplasto alvo, ou usando a sequência conservadora "KDEL ' para o retículo endoplasmático alvo, ou usando CTPP do gene lectina de cevada para o vacúolo alvo.
[00039] As sequências líder incluem, mas não se limitando a, a sequência líder do vírus de RNA pequeno, tais como a sequência líder de EMCV (região 5 ' não codificadora do vírus da encefalomiocardite ); sequência líder do vírus do grupo Y da batata, tal como uma sequência líder MDMV (vírus do mosaico de milho); proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina humana (BIP); sequência líder não traduzida (AMV RNA4) de proteína revestida do mRNA do vírus do mosaico alfafa; sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV).
[00040] Os intensificadores incluem, mas não se limitando a, potenciador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o potenciador do vírus mosaico figwort (FMV), potenciador do vírus do anel de cravo gravado (CERV), potenciador do vírus do mosaico da nervura de mandioca (CsVMV), potenciador do vírus do mosaico da mirabilis ( MMV), potenciador do vírus de ondulação da folha amarela de Cestrum (CmYLCV), potenciador do vírs da ondulação da folha de algodão Multan (CLCuMV), potenciador do vírus mottle amarelo de commelina (CoYMV) e potenciador do vírus de raia clorótica de amendoim (PCLSV).
[00041] Para a aplicação de monocotiledôneas, os íntrons incluem, mas não se limitando a, íntron de milho hsp70, íntron de ubiquitina do milho, íntron Adh, íntron de sacarose sintase ou íntron de arroz At1. Para a aplicação de dicotiledôneas, os íntrons incluem, mas não se limitando a, o íntron CAT-1, íntron pKANNIBAL, íntron PIV2 e íntron 'Super ubiquitina' .
[00042] Os terminadores podem ser as sequências de sinal de poliadenilação adequadas que funcionam em plantas, incluindo, mas não limitadas a, sequências de sinal de poliadenilação derivadas de Agrobaterium tumefaciens da nopalina sintetase (NOS) de genes, sequências de sinal de poliadenilação derivadas de inibidor de protease II (pino II) do gene, sequências de sinal de poliadenilação derivadas do gene E9 ssRUBISCO de ervilha e as sequências de sinal de poliadenilação derivadas do gene da α-tubulina.
[00043] A "ligação eficaz" na presente invenção indica a ligação de sequências de ácidos nucleares. A articulação permite uma sequência para proporcionar as funções necessárias das sequências ligadas. A "ligação eficaz" na presente invenção pode ser a ligação entre um promotor e uma sequência de interesse, de modo que a transcrição da sequência de interesse é controlada e regulada por meio do promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e a expressão desta proteína é desejada, a "ligação eficaz" indica que: um promotor está ligado com a sequência de tal forma que o transcrito resultante é altamente traduzido. Se a ligação entre um promotor e uma sequência de codificação é a fusão da transcrição e a expressão da proteína codificada, se desejado, a ligação é tal que o primeiro códon de iniciação da tradução é o códon de iniciação da sequência de codificação. De uma maneira alternativa, se a ligação entre um promotor e uma sequência de codificação é a fusão de tradução e a expressão da proteína codificada, se desejada, a ligação é tal que o primeiro códon de iniciação de tradução contém a sequência 5' não traduzida que está ligada com o promotor de forma a que a relação entre o produto de tradução resultante, bem como a tradução em fase de leitura aberta que codifica a proteína desejada está em conformidade com a estrutura de leitura. As sequências de ácidos nucleares capazes de 'ligação eficaz "incluem, mas não se limitam a: sequências que fornecem a função de expressão do gene (ou seja, elementos de expressão de genes, tais como, promotor de região 5' não traduzida, íntrons, a região de codificação de proteína, na região 3 ' não traduzida, local de poliadenilação e/ou terminador de transcrição), as sequências que fornecem a função de transferência de DNA e/ou a função de integração (isto é, T-DNA de sequência da borda, o local de reconhecimento da recombinase específica do local, o local de reconhecimento de integrase), as sequências de fornecimento da função seletiva (isto é, aos marcadores resistentes ao antibióticos, o gene biossintético), as sequências que fornecem a função de marcar do marcador, a sequência auxiliar da sequência de operação in vitro ou in vivo (ou seja, a sequência poli-ligante, a sequência de recombinação específica do local ), e as sequências de fornecimento da função de replicação (isto é, a origem de replicação de bactérias, a sequência de replicação autônoma, a sequência centromérica).
[00044] O "inseticida" na presente invenção indica a toxicidade contra as pragas das culturas. Mais em particular, as pragas de insetos alvo são, por exemplo, mas não limitadas a, a maioria das pragas de lepidópteros, tais como a broca do milho, Agrotis ypsilan, lagarta do milho, lagarta do algodão do caule etc.
[00045] Na presente invenção, a proteína pic9-02 inseticida tem as sequências de aminoácidos, mostradas por meio da SEQ ID NO: 2 da listagem de sequência. O gene inseticida tem a sequência de nucleotídeos pic9-02, mostrado por meio da SEQ ID NO: 1. Quando o gene inseticida, especialmente a sequência de DNA transformada de milho, é utilizado para a instalação, para além da região de codificação de uma proteína codificada por meio da sequência de nucleotídeos pic9-02, pode compreender outros elementos, como a região de codificação de peptídeos de trânsito e da região de codificação da proteína seletivamente marcada ou a região de codificação da proteína de resistência melhorada aos herbicidas.
[00046] A proteína pic9-02 inseticida na presente invenção é tóxica para a maioria das pragas de lepidópteros, causando dano ao milho. A unidade descrita na presente invenção, em especial o milho, contem DNA exógeno no seu genoma, e o DNA exógeno contém as sequências de nucleotídeos pic9-02, de modo a que a planta está protegida contra as pragas por expressar a quantidade desta proteína supressora. A quantidade de supressão se refere a dosagem letal ou sub-letal de dosagem. Ao mesmo tempo, a planta deve ser normal em morfologia, e pode ser cultivada de acordo com um método convencional para fins de consumo do produto e/ou de produção. Além disso, a planta pode eliminar substancialmente a necessidade de inseticidas bióticos ou químicos (inseticidas químicos ou bióticos são inseticidas que são dirigidos contra os insetos que são direcionados por meio da proteína codificada da sequência de nucleotídeos Pic9-02).
[00047] O teor de proteína inseticida cristalina (ICP), em materiais de plantas de expressão pode ser determinado por meio dos vários métodos descritos na técnica, por exemplo, por meio da quantificação de mRNA, que é gerado no tecido e codifica a proteína inseticida, utilizando um iniciador específico ou especificamente por meio da determinação da quantidade da proteína inseticida gerada diretamente.
[00048] O efeito inseticida de ICP na planta pode ser determinado por meio de testes diferentes. Os insetos-alvo da presente invenção são principalmente insetos lepidópteros, mais particularmente, da broca asiática do milho, Pseudaletia separata, lagarta do algodão, arroz da broca do caule ou broca do caule rosada, etc
[00049] Além disso, o cassete de expressão contendo as sequências de gene inseticida (gene pic9-02) da presente invenção também pode ser expresso em planta em conjunto com pelo menos um gene que codifica para a proteína resistente a herbicida, de modo a obter-se uma planta transgênica tendo tanto atividade elevada de inseticida quanto a resistência a herbicidas. Os genes resistentes a herbicidas incluem, mas não se limitando a, os genes resistentes ao glufosinato (por exemplo, gene bar, gene pat), genes resistentes a fenemedifame (por exemplo, gene pmph), os genes resistentes ao glifosato (por exemplo, gene de EPSPS), genes resistentes a bromoxinil, genes resistentes a sulfoniluréia,, genes resistentes a dalapon e genes resistentes a cianamida ou genes resistentes a inibidor da glutamina sintetase (por exemplo, gene resistente ao PPT).
[00050] A presente invenção proporciona uma proteína inseticida, um gene que codifica para a proteína inseticida e o uso da mesma. A proteína inseticida tem as seguintes vantagens: 1. Toxicidade forte. A proteína pic9-02 inseticida da presente invenção tem forte toxicidade inseticida, especialmente contra as pragas de lepidópteros, que causam danos ao milho. 2. Nível de expressão elevada. A proteína pic9-02 inseticida da presente invenção, que adota os códons preferidos de milho, está completamente de acordo com as caraterísticas do gene do milho, de modo que o gene inseticida da presente invenção é particularmente adequado para a expressão em monocotiledóneas, especialmente na do milho, com alo nível de expressão e uma boa estabilidade.
[00051] A solução técnica da presente invenção será ainda descrita em pormenores a seguir com referência aos desenhos e exemplos em anexo.
[00052] A Figura 1 é um fluxograma da construção do vetor de clonagem recombinante DBN01 contendo as sequências de nucleotídeos pic9-T-02 de acordo com a proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e ao seu uso na presente invenção;
[00053] A Figura 2 é um fluxograma da construção do vetor de expressão recombinante DBN100146 contendo as sequências de nucleotídeos pic9-02 de acordo com a proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e o seu uso na presente invenção;
[00054] A Figura 3 é um fluxograma da construção do vetor de expressão recombinante DBN100146R contendo as sequências conhecidas de acordo com a proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e o seu uso na presente invenção;
[00055] A Figura 4 é um diagrama de efeito inseticida de planta de milho transgênico inoculada com broca do milho Asiática, em conformidade com a proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e o seu uso na presente invenção;
[00056] A Figura 5 é um diagrama de efeito inseticida de planta de milho transgênico inoculada com Pseudaletia separata, em conformidade com a proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e o seu uso na presente invenção.
[00057] A solução técnica da proteína inseticida, o gene que codifica para a proteína inseticida e o seu uso na presente invenção será ainda descrito abaixo com referência aos exemplos. Exemplo 1 - Aquisição e síntese de sequência de gene Pic9-02 1. Aquisição da sequência do gene Pic9-02
[00058] A sequência de aminoácidos (699 aminoácidos) de proteína pic9-02 inseticida é apresentada por meio da SEQ ID NO: 2 na lista de sequência, uma sequência de nucleotídeos (2100nucleotídeos ), o qual codifica a sequência de aminoácidos (699 aminoácidos) correspondente à proteína pic9-02 inseticida, é adquirida de acordo com os códons preferidos de milho, mostrados por meio da SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências. A utilização de códons preferidos de milho pode ser vista na http: //www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=381124 internet. 2. Síntese sequência de nucleotídeos pic9-02
[00059] A sequência de nucleotídeos pic9-02 ( ilustrada por meio da SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências ) é sintetizada por Nanjing Genscript Biotecnologia Co., Ltd., o terminal 5 ' da sequência de nucleotídeos pic9-02 sintetizado ( SEQ ID : 1 ) está além disso ligado com o local de corte da enzima AscI, e o terminal 3 ' da sequência de nucleotídeos pic9-02 ( SEQ ID NO: 1 ) está além disso ligada com o local de corte da enzima Spel.
[00060] Por outro lado, a síntese da sequência de nucleotídeos pic9-02 substituída ( mostrado por meio da SEQ ID NO: 3 na lista de sequência ) é caraterizada pelo fato de Cys na posição 674 da sequência de aminoácido pic9-02- ( representada por meio da SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências ) é substituído por Tir, o terminal 5 ' da sequência de nucleotídeos pic9-02 substituída sintetizada ( SEQ ID NO: 3 ), está além disso ligada com o local de corte da enzima AscI, e o terminal 3' da sequência de nucleotídeos pic9-02 substituída ( SEQ ID NO: 3 ) está ainda ligada com o local de corte da enzima Spel.
[00061] Por outro lado, a síntese sequência de nucleotídeos pic9-02 excluída (mostrada por meio da SEQ ID NO: 4 na listagem de sequência) é caraterizada pelo fato de os aminoácidos nas posições 641 a 650 da sequência de amino ácido pic9-02 (representado por meio da SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências) são eliminados, o terminal 5’ da sequência de nucleotídeos pic9-02 sintetizada suprimida (SEQ ID NO: 4) está ainda ligada com o local de corte da enzima AscI, e o terminal 3' da sequência de nucleotídeos pic09-02 eliminada (SEQ ID NO: 4) está ainda ligada com o local de corte da enzima Spel.
[00062] Por outro lado, a síntese da sequência de nucleotídeos pic09-02 adicionada (mostrado por meio da SEQ ID NO: 5 na listagem de sequência) é caraterizada pelo fato de 5 aminoácidos, Asp, Glu, Arg, Asn e Leu, serem adicionados atrás da posição 699 da sequência de aminoácido pic09-02 (representado por meio da SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências), o terminal 5 ' da sequência de nucleotídeos pic9-02 sintetizada adicionada (SEQ ID NO: 5) está além disso ligada com o local de corte da enzima Asei, e o terminal 3 ' da sequência de nucleotídeos pic9-02 adicionada (SEQ ID NO: 5) está além disso ligada com o local de corte da enzima Spel. Exemplo 2 Construção do vetor de expressão recombinante e transformação do vetor de expressão recombinante em Agrobaterium 1. Construção de vetor recombinante clonagem DBN01-T contendo a sequência de nucleotídeos Pic9-02
[00063] A sequência de nucleotídeos pic9-02 sintetizada é ligada em vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, EUA, CAT: A3600 ) de acordo com a instrução de produto do vetor pGEM-T da empresa Promega, dessa maneira o vetor de clonagem recombinante DBN01-T é obtido, e o fluxo de construção é mostrado na Figura 1 (em que, Amp representa gene resistente penbritin; F1 representa a origem de replicação do fago f1; LacZ é LacZ códon de iniciação; SP6 é promotor de SP6 RNA polimerase; T7 é o promotor de T7 RNA polimerase ; pic9-02-02 é a sequência de nucleotídeos pic9 (SEQ ID NO: 1) e MCS é o local de multi-clonagem).
[00064] Em seguida, o vetor de clonagem recombinante DBN01-T é transformado em célula T1competente E. coli ( Transgen, Pequim, China, Cat. N °: . CD501 ) por meio do choque térmico sob as seguintes condições: a colocação de 50 ul de células E. coli competente T1 e 10 ul de plasmídeo de DNA ( vetor de clonagem recombinante DBN01-T ), em banho de água a 42 °C durante 30 segundos, em seguida, colocando-os em banho-maria a 37 °C durante 1 hora (em um leito com agitação a uma velocidade de 100 rpm), durante a noite fazendo com que os mesmos venham a crescer em uma placa de LB (10 g/L de triptona, extrato de levedura 5g/L, 10 g/L de NaCl, 15 g/L de ágar, pH é regulado para 7,5 com NaOH ) contendo penbritin ( 100 mg/L ) e revestido com X-gal (5-bromo -4- cloro-indol-3-beta-D-galatósido) sobre a superfície. Escolhendo as colônias brancas e, em seguida, a sua cultura durante a noite em um meio líquido LB (10 g/L de triptona, 5g de extrato/L de levedura, 10g/L de NaCl, 100 mg/L penbritin, o pH é regulado para 7,5 por NaOH ) a 37 °C. Extraindo os plasmídeos de colônias brancas por meio do processo alcalino: centrifugação do líquido bacteriano em 12000rpm durante 1 minuto, removendo o sobrenadante, suspendendo as bactérias depositadas com uma solução pré-resfriada de gelo a 100 ul I (Tris-HCl a25 mM, EDTA a 10 mM ácido etilenodiaminotetracético), glicose a 50mM, pH 8,0), adicionando uma solução recém-preparada II, 150 ul (NaOH a 0,2 M, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sódio)), invertendo o tubo, durante quatro vezes para misturar as substâncias no tubo, e colocando o tubo em gelo durante 3 de 5 minutos, acrescentando a solução gelada 150 ul III ( acetato de postássio a 4M, ácido acético a 2M ), totalmente e uniformemente misturando as substâncias no tubo de uma vez só, e colocando o tubo em gelo durante 5 a 10 minutos; centrifugação do tubo de 12000rpm por 5 minutos a 4 °C, adição de etanol absoluto, 2 x o volume de sobrenadante, uniformemente misturados e, em seguida deixando a mistura repousar durante 5 minutos à temperatura ambiente e a mistura da centrifugação a 12000rpm durante 5 minutos a 4 °C com a finalidade de remover o sobrenadante, lavando o depósito com etanol de 70 % em peso e, em seguida, secando o depósito no ar, adicionando 30 ul de TE (Tris-HCL a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 8,0) contendo RNAase (20μg/ml) para dissolver o depósito, colocando-os em banho-maria a 37 para °C 30 minutos a RNA de digestão, e preservando os mesmos a -20 °C para uso futuro.
[00065] As colônias positivas são confirmadas por meio da sequenciação após os plasmídeos extraídos terem sido submetidos a AscI e Spel da enzima clivando a identificação e o resultado mostrando que a sequência de nucleotídeos pic9-02, inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01-T, é a sequência de nucleotídeos apresentada por meio da SEQ ID NO: 1 na listagem de sequência, indicando que a sequência de nucleotídeos pic9-02 está inserida de maneira correta.
[00066] De acordo com o método para a construção de vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeos sintetizada pic9-02 substituída está ligada em vetor de clonagem pGEM-T com a finalidade de obter vetor de clonagem recombinante DBN02-T, em que miPIC9-02-02 é a sequência de nucleotídeos pic9 substituída ( SEQ ID NO: 3). A substituição correta da sequência de nucleotídeos Pic9-02 substituída em vetor de clonagem recombinante DBN02-T é identificada por meio de enzima a decompor e o sequenciamento.
[00067] De acordo com o método para a construção de vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeos pic9- 02 suprimida sintetizado está ligada em vetor de clonagem pGEM-T com a finalidade de obter o vetor recombinante clonagem DBN03-T, em que mdPIC9-02é a sequência de nucleotídeos pic9-02 suprimida ( SEQ ID NO: 4 ). A inserção correta da sequência de nucleotídeos Pic9-02 eliminada no vetor de clonagem recombinante DBN03-T é identificada por meio de enzima a decompor e o sequenciamento.
[00068] De acordo com o método para a construção de vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a sequência de nucleotídeos pic9- 02adicionada sintetizada está ligada em vetor de clonagem pGEM-T para adquirir o vetor recombinante clonagem DBN04-T, em que maPIC9-02é a sequência de nucleotídeos pic9-02 adicionada ( SEQ ID NO: 5 ). A inserção correta da sequência de nucleotídeos Pic9-02 adicionada no vetor de clonagem recombinante DBN04-T é identificada por meio de enzima a decompor e o sequenciamento. 2. Construção do vetor de expressão recombinante DBN100146 contendo a sequência de nucleotídeos pic9-02
[00069] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-01 ( vetor da estrutura principal: pCAMBIA2301 ( que pode ser oferecido por meio da instituição CAMBIA ) ) são cortados por meio da endonucleases de restrição AscI e SpeI, de uma maneira respectiva. Os segmentos de sequências de nucleotídeos pic9-02 que são cortados são inseridos entre o local AscI e o local Spe I do vetor de expressão DBNBC-01. Como a construção do vetor por métodos de corte convencionais de enzima é reconhecido por meio de uma pessoa que seja versada na técnica, os locais da enzima de corte Asei e Spel no vetor de expressão DBNBC-01 são também introduzidos por meio do método convencional de corte da enzima de modo a construir o vetor de expressão recombinante DBN100146. O fluxo de construção é mostrado na Figura 2 ( Kan: gene da canamicina; RB: fronteira direita; Ubi: gene promotor de ubiquitina de milho ( SEQ ID NO: 6 ); pic9-02: sequência de nucleotídeos pic9- 02 ( SEQ ID NO: 1 ); NOS: terminador da nopalina sintetase ( SEQ ID NO: 7 ); PMI: o gene de isomerase fosfomanose ( SEQ ID NO: 8 ), e LB: fronteira esquerda ).
[00070] O vetor de expressão recombinante DBN100146 é transformado em célula T1 E. coli competente por meio do choque térmico sob as seguintes condições: a colocação de 50 uL de células T1 competente E. coli e 10 uL de plasmídeo de DNA ( vetor de expressão recombinante DBN100146 ) em banho de água a 42 ° C durante 30 segundos, em seguida, colocando-os em banho-maria a 37 ° C durante 1 hora ( em um leito com agitação a 100 rpm ) e, depois, cultivando-os sobre uma placa de LB sólido ( 10 g/L de triptona, extrato de levedura 5g/L, 10 g/L de NaCl, 15g/L de ágar, pH é regulado para 7,5 por NaOH ) contendo 50 mg/L de canamicina, durante 12 horas a 37 ° C; tratando as colônias brancas e, em seguida, a sua cultura durante a noite em um meio líquido LB ( 10 g/L de triptona, 5 g/L de extração de levedura, 10g/L de NaCl, 50 mg/L de canamicina, o pH é regulado para 7,5 com NaOH ), a 37 ° C. Os plasmídeos das colônias brancas são extraídos por meio de um processo alcalino. Os plasmídeos extraídos são identificados por meio da endonucleases de restrição de Asei e Spel e as colônias positivas são verificadas por meio da sequenciação. O resultado mostra que a sequência de nucleotídeos do vetor de expressão recombinante DBN100146 entre o local AscI e o local Spe I é a sequência de nucleotídeos apresentada por meio da SEQ ID NO: 1 na listagem de sequência, ou seja, a sequência de nucleotídeos pic9-02.
[00071] De acordo com o método para a construção de vetor de expressão recombinante DBN100146 como descrito acima, a sequência nucleotídica PIC9-02 substituída cortada do vetor de clonagem recombinante DBN02-T por meio do local Asei e Spel é inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para adquirir vetor de expressão recombinante DBN100146-i. Através da clivagem da enzima e da identificação de sequenciação, o vetor de expressão recombinante DBN100146-i entre o local AscI e o local Spe I é a sequência de nucleotídeos PIC9-02 substituída.
[00072] De acordo com o método para a construção de vetor de expressão recombinante DBN100146 como descrito acima, a sequência de nucleotídeos pic9-02 suprimida cortada do vetor de clonagem recombinante DBN03-T por meio do local Asei e Spel é inserido no vetor de expressão DBNBC-01 para adquirir vetor de expressão recombinante DBN100146-d. Através da clivagem da enzima e da identificação de sequenciação, o vetor de expressão recombinante DBN100146-i entre o local AscI e o local Spe I é a sequência de nucleotídeos PIC9-02 substituída .
[00073] De acordo com o método para a construção de vetor de expressão recombinante DBN100146 como descrito acima, a sequência nucleotídica pic9-02 adicionada cortado do vetor de clonagem recombinante DBN04-T por meio do local Asei e Spel é inserido no vetor de expressão DBNBC-01 para adquirir vetor de expressão recombinante DBN100146-a. Através da clivagem da enzima e da identificação de sequenciação, o vetor de expressão recombinante DBN100146-i entre o local AscI e o local Spe I é a sequência de nucleotídeos pic9-02 substituída . 3. A construção do vetor recombinante de expressão DBN100146R contendo a sequência conhecida ( controle positivo )
[00074] De acordo com o método para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T contendo a sequência de nucleotídeos PIC9-02, como descrito na parte 2 do exemplo 1 da presente invenção, vetor recombinante de clonagem DBN01R-T contendo a sequência conhecida ( SEQ ID NO: 9 ) é construída utilizando a sequência conhecida. A sequenciação de verificação é realizada em colônias positivas, e o resultado mostra que a sequência conhecida inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01R-T é a sequência de nucleotídeos apresentada por meio da SEQ ID NO: 9 na listagem de sequência, indicando que a sequência conhecida está inserida de uma maneira correta .
[00075] De acordo com o método para a construção de vetor de expressão DBN100146 recombinante contendo a sequência de nucleotídeos pic9-02, como descrito na parte 2 do exemplo 2 da presente invenção, o vetor de expressão recombinante DBN100146R contendo uma sequência conhecida são construídas utilizando a sequência conhecida, e a construção de fluxo é mostrado na Figura 3 (vetor da estrutura principal : pCAMBIA2301 (que pode ser fornecida por meio da instituição CAMBIA); Kan: gene da canamicina; RB: fronteira direita; Ubi: promotor do gene da ubiquitina de milho (SEQ ID NO: 6); mR: sequência conhecida (SEQ ID NO: 9); NOS: terminador da nopalina sintetase (SEQ ID NO: 7); PMI: o gene de isomerase fosfomanose (SEQ ID NO: 8), e LB: fronteira esquerda). A verificação de sequenciação é levada a cabo sobre as colônias positivas e, o resultado mostra que a sequência conhecida inserida no vetor de expressão recombinante DBN100146R é a sequência de nucleotídeos apresentada por meio da SEQ ID NO: 9 na listagem de sequência, indicando que a sequência conhecida está inserida de uma maneira correta. 4. A transformação do vetor de expressão recombinante em Agrobaterium
[00076] Os vetores de expressão recombinantes DBN100146 DBN100146,-i,-d, DBN100146 DBN100146-um, e DBN100146R (sequência conhecida), que foram construídos de uma maneira correta, são transformados em Agrobaterium LBA4404 ( Invitrgen, Chicago, EUA; Cat.No: 18313 a 015 ) por meio de um método de nitrogênio líquido, e as condições de transformação são as seguintes: a colocação de 100 uL e LBA4404 de Agrobaterium de 3μL DNA de plasmídeo ( vetor de expressão recombinante ), em nitrogênio líquido durante 10 minutos e, em seguida, colocando-os em banho-maria a 37 ° C durante 10 minutos; inoculando o revestimento LBA4404 de Agrobaterium transformado em um tubo de ensaio de LB e a cultura é durante 2 horas a 28 ° C a 200 rpm, e, em seguida, sobre uma placa de LB contendo 50 mg/L de rifampicina e 100 mg/L de canamicina até que o monoclonal positivo apareça, a colheita da cultura e o monoclonal positivo e a extração dos plasmídeos a partir dos mesmos. A clivagem da enzima e a identificação é realizada no monoclonal positivo depois de ser cortado por meio das enzimas de restrição BglII e Aatll, o resultado mostra que as estruturas de vetores de expressão recombinantes DBN100146 DBN100146,-i,-d, DBN100146 DBN100146-a e DBN100146R (sequência conhecida ) estão completamente corretas.
[00077] Exemplo 3: Aquisição e verificação de nucleotídeos Pic9-02 planta de milho sequência, transferido. 1. Aquisição da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida da planta de milho,
[00078] Os embriões imaturos da cepa de milho Z31 cultivada mediante as condições estéreis e o Agrobaterium mencionado na parte 4 do exemplo 2 são cocultivados de acordo com o método de infecção de Agrobaterium utilizado, de modo a transferir o T-DNA (incluindo a sequência do promotor de gene da ubiquitina de milho, a sequência de nucleotídeos PIC9-02, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 substituída, a sequência de nucleotídeos pic9-02 suprimida, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 adicionada, a sequência conhecida, o gene da PMI e sequência de terminação) dos vetores de expressão recombinantes, DBN100146 DBN100146 -i,DBN100146-d, DBN100146-a, e DBN100146R (sequência conhecida) construída na parte 2 e parte 3 do Exemplo 2 em genoma do milho, de modo que As sequências de nucleotídeos PIC9-02 transferidas da planta de milho, As sequências de nucleotídeos PIC9-02 substituídas transferidas da planta de milho, as sequências de nucleotídeos PIC9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, As sequências de nucleotídeos PIC9- 02 adicionadas transferidas da planta de milho e as sequências transferidas da planta de milho são adquiridas (controle positivo), entretanto, a planta de milho do tipo selvagem é usada como controle negativo.
[00079] Em resumo, para a transformação de milho, mediada por Agrobaterium, os embriões imaturos de milho são separados e estão em contato com a suspensão de Agrobaterium, em que o Agrobaterium pode transferira sequência de nucleotídeo pic09-02 com pelo menos uma célula de um dos embriões imaturos (etapa 1: etapa de infestação ), e o promotor está ligado operativamente à sequência de nucleotídeos pic9-02. Nesta etapa, os embriões imaturos são imersos de preferência, em suspensão de Agrobaterium ( DO660 = 0,4 a 0,6, médio de infestação ( 4,3 g/L de sal de MS, vitamina MS, 300 mg/L de caseína, 68.5g/L de sacarose, 36 g/L de glicose, 40 mg/L acetossiringona ( AS ), 1 mg/L 2, o ácido 4-Dicloropenoxiacético ( 2, 4D ) e pH 5,3 ) de modo a iniciar a inoculação. Os embriões imaturos e o Agrobaterium são cocultivados durante um período de tempo (3 dias) (etapa 2: . etapa de cocultura) De preferência, os embriões imaturos, após a etapa de infestação, são cultivados em um meio sólido (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 20 g/L de sacarose, 10g/L de glucose, 100 mg/L de acetossiringona ( AS ), 1 mg/L 2, o ácido 4-Dicloropenoxiacético (2, 4-D), 8 g/L de ágar e pH 5,8 ). Pode haver um etapa de "recuperação" opcional após este etapa de cocultura. Na etapa de "recuperação", existe pelo menos um antibiótico (cefalosporina) conhecido para suprimir o crescimento de Agrobaterium em um meio (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30g/L de sacarose, 1 mg/L 2, o ácido 4- Dicloropenoxiacético (2, 4-D), 8 g/L de ágar e pH 5,8), e não há nenhuma seletor da planta transformante acrescentado (Etapa 3: etapa de recuperação) . De preferência, os embriões imaturos são cultivados no meio de cultura sólido contendo antibiótico, mas não seletor de modo a eliminar o Agrobaterium e proporcionar um período de tempo para a recuperação das células infectadas. Em seguida, os embriões imaturos inoculados são cultivados em um meio contendo o seletor (manose) e crescimento de calo transformado é escolhido (etapa 4: escolher a etapa ). Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em um seletor de triagem contendo o meio sólido (4,3 g/L de sal de MS, MS vitamina A, 300 mg/L de caseína, 5 g/L de sacarose, 12,5 g/L de manose, 1 mg/L 2, o ácido 4- Dicloropenoxiacético (2, 4-D), 8 g/L de ágar e pH 5,8) com a finalidade de se obter o crescimento seletivo das células transformadas. Posteriormente, o calo é para ser regenerado em uma planta (etapa 5: etapa de regeneração). Preferencialmente, o calo que cresce em um meio contendo o seletor, é cultivado em meios sólidos (meio de diferenciação de MS e meio de enraizamento de MS) com a finalidade de regenerar uma planta.
[00080] O calo resistente que é obtido por meio do rastreio é transferido para meio de diferenciação MS ( 4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de 6-benziladenina, 5g/L de manose, 8g/L de ágar e pH 5,8 ) para a diferenciação de cultura a 25 ° C. A plântula que a obtida através da diferenciação é transferida para o meio de enraizamento MS ( 2,15 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, ácido indole-3-acético, 1 mg/L, 8 g/L de ágar-ágar, e pH 5,8 ) e cultivadas a 25 ° C até que a plântula é de 10 centímetros de altura, e, em seguida, a plântula é transferida para uma estufa e cultivada até que se dê frutos. Na estufa, a plântula é cultivada durante 16 horas a 28 ° C e, em seguida, cultivadas durante 8 horas a 20 ° C a cada dia. 2. Verificação das sequências de nucleotídeos pic9-02 transferidas da planta de milho, por meio de TagMan.
[00081] Sobre 100mg, as folhas da planta de milho da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida, a sequência de nuceotídeo pic9-02 substituída da planta de milho, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, a sequência de nucleotídeo pic9-02 adicionada da planta de milho e a sequência transferida da planta de milho a ser conhecida como amostras são tomadas, de uma maneira respectiva, e os seus DNAs genoma são extraídos usando DNeasy Plant Maxi Kit de Qiagen, e o número de cópias do gene pic9 é detectado pelo método da sonda Taqman de fluorescência PCR quantitativa . Enquanto isso, sob a condição de que uma planta de milho de tipo selvagem como controle negativo, o genoma do DNA foi detectado e analisado com base no método acima referido. A experiência é repetida três vezes com a finalidade de se obter um valor médio.
[00082] O método específico para a detecção do número de cópias do gene pic9 é como se segue:
[00083] Etapa 11, 100mg das folhas da planta de milho da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida, a sequência de nuceotídeo PIC9-02 substituída da planta de milho, as sequências de nucleotídeos PIC9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, a sequência de nucleotídeo PIC9-02 adicionada transferida da planta de milho, a sequência da planta de milho transferida conhecida e a planta de milho de tipo selvagem, de uma maneira respectiva, são tidas como amostras e fornecidas em homogenatos em um almofariz, e 3 replicados são para cada amostra;
[00084] Etapa 12, os DNAs genoma das amostras acima são extraídos usando DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen, e para detalhes, consultar as instruções do produto;
[00085] Etapa 13, as concentrações de DNA do genoma das amostras acima são medidas usando NanoDrop 2000 ( Thermo Scientific );
[00086] Etapa 14, as concentrações de DNA do genoma das amostras acima são reguladas para o mesmo valor de concentração que está dentro de uma gama de 80ng/μL para 100ng/μL;
[00087] Etapa 15, o número de cópias das amostras é determinado por meio do método da sonda Taqman utilizando a fluorescência quantitativa de PCR, e as amostras, cujo número de cópias foi determinado, são consideradas como as amostras padrão e a amostra de milho de tipo selvagem é considerada como controle negativo, e 3 replicados são para cada amostra, com a finalidade de se obter um valor médio, as sequências dos iniciadores e as sondas de fluorescência quantitativas de PCR são como se segue:
[00088] Os seguintes iniciadores e sondas utilizados para a detecção da sequência de nucleotídeos PIC9-02, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 substituída, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 suprimida, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 adicionada: Iniciador 1 ( CF1 ): TCATTTGGGGCTTCGTCG mostrado por meio de SEQ ID NO: 10 na listagem de sequência; Iniciador 2 ( CR1 ): TGATTGATCAGCTGCTCAACCT mostrado por meio de SEQ ID NO: 11 na listagem de sequência; Probe 1 ( CP1 ): CCAGTGGGATGCGTTCCTCGCTC mostrado por meio de SEQ ID NO: 12 na listagem de sequência.
[00089] Os iniciadores e as sondas abaixo são usados para a detecção da sequência conhecida: Iniciador 3 (CF2): CGATATGCTGTTCGCTGGTAC mostrado por meio de SEQ ID NO: 13 na listagem de sequência; Iniciador 4 (CR2): GTTGTACCTGACCCAATCACGAG mostrado por meio de SEQ ID NO: 14 na listagem de sequência; Sonda 2 (CP2): CGGTCCCCAAACACGTTCGAGTCC mostrado por meio de SEQ ID NO: 15 na listagem de sequência.
[00090] O sistema de reação PCR é como segue : JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) 10μL 50 x mistura do iniciador/sonda 1 μL Genoma DNA) 3μL Água( ddH2O) 6μL
[00091] 50 x mistura do iniciador/sonda contém 45μL cada de iniciadores a 1mM, sonda a 50μL 100μM e 860μL 1xTE da solução de tampão, e é armazenado em um tubo de teste âmbar a 4 C°.
[00092] Etapa 21 As condições da reação de PCR são como segue: Temperatura Tempo 95 C° 5 minutos 22 95 C° 30 segundos 23 60 C° 1 minuto 24 Retornar à Etapa 22 , repetir por 40 vezes
[00093] Os dados foram analisados usando o software SDS2.3 (Applied Biosystems).
[00094] Os resultados da experiência mostram que, a sequência de nucleotídeos PIC9-02, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 substituída, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 suprimida, a sequência de nucleotídeos pic9-02 adicionada e sequência conhecida foram todas integradas no genoma das plantas de milho a serem detectadas, e as plantas de milho transgênicas contendo uma única cópia do gene PIC9-02 e a sequência conhecida são obtidos a partir da sequência de nucleotídeos PIC9-02 da planta de milho transferida, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 da planta de milho transferida substituída, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 da planta de milho transferida suprimida, a sequência de nucleotídeos PIC9-02 da planta de milho transferida adicionada, a sequência da planta de milho transferida conhecida Exemplo 4: Detecção de proteínas inseticidas de plantas de milho transgênicas 1. Detectar o teor de proteína inseticida ( Proteína PIC9 ) de milho transgênico
[00095] As soluções envolvidas nesta experiência são as seguintes:
[00096] Uma solução tampão de extração: 8g/L de NaCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,9 g/L de Na2HPO4 • 12H2O, 0,2 g/L de KCl, 5,5 ml/L de Tween-20 e pH 7,4;
[00097] Uma solução tampão de lavagem: 8g/L de NaCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,9 g/L de Na2HPO4 • 12H2O, 0,2 g/L de KCl, 0,5 ml/L de Tween-20 e pH 7,4;
[00098] Solução de Parada: HCl a 1M.
[00099] 3mg de das folhas da planta de milho da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida, a sequência de nucleotídeo pic9- 02 substituída transferida da planta de milho, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, a sequência de nucleotídeo pic9-02 adiconada transferida da planta de milho e a sequência da planta de milho transferida conhecida (controle positivo) foram tomadas como amostras, de uma maneira respectiva. Estas amostras são baseadas em nitrogênio líquido, depois 800μL da solução tampão de extração são adicionadas e centrifugadas durante 10 minutos a 4000rpm. O sobrenadante é diluído por 40 vezes com a solução tampão de extração, e o sobrenadante diluído 80μL é feito para a detecção de ELISA. Uma vez que as posições 650 a 699 da sequência de aminoácido pic9-02 derivada de Cry1Ab e Domínio II ( posições 300 a 500 ) da sequência de aminoácido pic9-02 também tem alta consistência com Cry1Ab, o anticorpo de Cry1Ab pode ser utilizada para detectar a proteína inseticida pic9-02. A proporção da quantidade da proteína inseticida ( proteína PIC9 ) em amostras com base no peso fresco de folhas é detectada e analisada por meio de kit ELISA ( ensaio imunossorvente ligado à enzima ) ( kit Cry1Ab/Cry1Ac, de ENVIRLOGIX ), e para os detalhes, por favor, consultar as instruções do produto.
[000100] Ao mesmo tempo, a planta de milho de tipo selvagem e as plantas de milho não transgênicas identificadas por meio de PCR quantitativo de fluorescência são consideradas como controles negativos, e detectadas e analisadas de acordo com o método acima. Existem 20 casos de transformação (ou seja, casos) de sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas, no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas excluídas, transferidos no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas adicionadas no total, cinco casos de transformação (ou seja, casos) de sequência de plantas transferidas conhecidas no total, três plantas não transgênicas (NGM) identificadas por meio da fluorescência de PCR quantitativo, e três plantas do tipo selvagem (CK), essa identificação é repetida 3 vezes para cada planta.
[000101] Os resultados experimentais sobre o conteúdo de proteínas inseticidas (proteínas Pic9-02) de milho transgênico são mostrados como Tabela 1. As proporções de determinados níveis de expressão médios de proteínas inseticidas (proteínas Pic9-02) nas folhas da planta de milho da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida, a sequência de nuceotídeo pic9-02 substituída da planta de milho, a sequência de nuceotídeo pic9-02 eliminada da planta de milho, a sequência de nuceotídeo pic9-02 adicionada da planta de milho, a sequência da planta de milho transferida conhecida, a planta de milho de tipo selvagem e as plantas de milho não transgênicas identificadas por meio de PCR quantitativo de fluorescência são como se segue com base na nova peso das folhas: 5.444,67, 5.304,12, 4.976,46, 5.397,71, 2.560,48, 0 e 0, de uma maneira respectiva. Tabela 1 Os determinados níveis médios de expressão de proteínas Pic9-02 nas Plantas de milho Transgênicas
[000102] Os resultados acima indicam que, a proporção ( ng/g ) do nível de expressão média de proteína inseticida na planta de milho da sequência de transferência conhecida com base no peso fresco das folhas é 2560,48, e a proporção ( ng/g ) do nível de expressão média de proteína inseticida na planta de milho da sequência de transferência de nucleotídeos PIC9-02 com base no peso fresco das folhas é 5444,67, que é o dobro do que o anterior, e este resultado indica que a proteína inseticida na presente invenção tem uma excelente estabilidade no milho, e o nível de proteína PIC9-02 em expressão de milho é aumentada dramaticamente por PIC9-02 sequência de nucleotídeos que é optimizada de acordo com os códons preferidos de milho. Em comparação com a sequência de nucleotídeos PIC9-02 das plantas de milho transferidas, os níveis de expressão de proteínas da sequência de nucleotídeo PIC9-02 substituída da planta de milho, as sequências de nucleotídeos PIC9-02 eliminadas transferidas da planta de milho e sequência de nucleotídeos PIC9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas tem nenhuma diferença significativa. 2. Detecção para os efeitos inseticidas de plantas de milho transgênicas.
[000103] O efeito inseticida da sequência de nucleotídeos PIC9-02 das plantas de milho transferidas, a sequência de nucleotídeo PIC9-02 substituída transferida da planta de milho, as sequências de nucleotídeos PIC9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, sequência de nucleotídeos PIC9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas, a sequência de planta de milho transferida conhecida, a planta de milho do tipo selvagem e a planta de milho não-transgênica identificada por meio da fluorescência de PCR quantitativo contra a broca do milho asiática, lagarta do algodão e lagarto oriental são detectados, de uma maneira respectiva.
[000104] (1) broca do milho da Ásia: as folhas da planta de milho da sequência de nucleotídeos Pic9-02 transferida, a sequência de nucleotídeo pic9-02 substituída da planta de milho, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas, a planta de milho de tipo selvagem e as plantas de milho não transgênico identificadas por meio de PCR de fluorescência quantitativa são recolhidas e lavadas com água esterilizada, e em seguida com água sobre essas folhas é absorvida por meio de uma gaze. Depois, as partes principais destas folhas de milho são removidas e estas folhas são cortadas em tiras de 1 centímetro x 2cm. Uma tira da folha após o corte é colocada sobre o papel de filtro na parte inferior de um prato de cultura de plástico redondo, e o papel de filtro é umedecido com água destilada. 10 brocas do milho asiáticas que são criados em cativeiro (larva) são colocadas em cada prato de cultura, e cada prato de cultura de insetos de teste é coberta por uma tampa e, em seguida, meios para 3 a 5 dias a uma temperatura de 26 a 28 ° C, umidade relativa de 70 % a 80 % e fotoperíodo (luz/escuro ) de 16: 08, e então o número de larvas mortas é determinado tendo em vista calcular a média de mortalidade das sondas asiáticas de milho em cada uma das amostras. Existem 20 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas, no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas excluídas transferidas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas adicionadas no total, cinco casos de transformação (ou seja, casos) de plantas de sequência transferidos conhecidos, três não-transgênicos (NGM) plantas identificadas por meio de PCR de fluorescência quantitativa, e três plantas do tipo selvagem ( CK ), esta identificação é repetida 3 vezes para cada planta. Os resultados são apresentados como a Tabela 2 e Figura 4. Tabela 2 Resultados experimentais de efeito inseticida Plantas do milho Transgênicas da broca de milho asiático
[000105] Os resultados indicam que: As plantas que têm uma certa resistência à broca asiática milho pode ser selecionada a partir da sequência pic9-02 da planta de milho transferida e a sequência de nucleotídeos da planta de milho transferida a ser conhecida, no entanto, o ensaio de mortalidade dos insetos das sequência de nucleotídeos pic9-02 da planta do milho a ser transferidas é significativamente mais elevada do que a da sequência da planta de milho transferida a ser conhecida. O ensaio de mortalidade dos insetos a sequência de nucleotídeos pic9-02 da planta de milho transferida é superior a 90 %, enquanto que o teste de insetos de mortalidade da sequência de transferência da planta de milho conhecido é de cerca de 70 %.
[000106] (2) lagarta do algodão: jovens filamentos da sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho transferidas, a sequência de nucleotídeo pic9-02 substituída da planta de milho transferida, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas, a sequência da planta de milho transferida conhecida, a planta de milho do tipo selvagem e da planta de milho não-transgênica identificada por meio de PCR de fluorescência quantitativa são tomadas de uma maneira respectiva. 20 a 30 filamentos são então colocados no papel de filtro na parte inferior de um prato de cultura de plástico redondo, e o papel de filtro é umedecido com água destilada. 10 lagartas do algodão, que foram criadas em cativeiro (larva) são colocadas em cada prato de cultura, e cada prato de cultura de insetos de teste é coberto por uma tampa e, em seguida, meios para 3 a 5 dias a uma temperatura de 26 a 28 ° C, em relação umidade de 80 % a 90 % e fotoperíodo (claro/escuro) de 14: 10. O número de larvas mortas é contado, e a pontuação total de resistência é calculada de acordo com dois índices, incluindo o progresso do desenvolvimento e mortalidade de larvas: pontuação total = 100 x 90 x de mortalidade (número de larvas recém eclodidas/o número total de inoculado larvas) 60 x (número de larvas recém eclodidas negativo de controle/o número total de larvas inoculadas) 10 x (número de larvas controle negativo/o número total de larvas inoculadas). Existem 20 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9- 02 das plantas transferidas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas, no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidos excluídas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) a Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas adicionadas no total, cinco casos de transformação (ou seja, casos) de plantas de sequência transferidas conhecidas, três plantas não-transgênicas (NGM) identificadas por meio de PCR de fluorescência quantitativa, e três plantas do tipo selvagem ( CK ), esta identificação é repetida 3 vezes para cada planta. Os resultados são apresentados como a Tabela 3. Tabela 3 Resultados experimentais de efeito inseticida de Plantas do milho Transgênicas inoculadas da lagarta de algodão
[000107] Os resultados indicam que: as plantas que têm certa resistência à lagarta do algodão podem ser selecionadas a partir da sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho transferidas e a sequência transferido planta de milho conhecida. No entanto, a pontuação total do bioensaio da sequência de transferência de nucleotídeos pic9-02 da planta de milho é significativamente maior do que a da sequência da planta de milho transferida a ser conhecida. A pontuação total do bioensaio da sequência de nucleotídeos Pic9-02 da planta de milho transferida acima de 75, enquanto que a pontuação total do bioensaio da sequência transferido planta de milho conhecida em geral é de cerca de 40. Os resultados também indicam que a sequência de nucleotídeos pic9-02 transferida da planta do milho não conduz à morte massiva das larvas recém-nascidos, mas irá suprimir o progresso do desenvolvimento de larvas grandemente, e especificamente, de 3 a 5 dias mais tarde, as larvas são ainda basicamente no estado de nova incubação ou entre os estados de nova incubação e controle negativo.
[000108] ( 3 ) Larva Oriental: as folhas da sequência de nucleotídeos Pic9-02 da planta de milho transferida, a sequência de nucleotídeo pic9-02 substituída transferida da planta de milho, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho, sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas, sequência da planta de milho transferida conhecida, a planta de milho de tipo selvagem e as plantas de milho não transgênicas identificadas por meio de PCR de fluorescência quantitativa são tomadas, e muito bem lavados com água esterilizada e de água sobre essas folhas é absorvida por uma gaze. Depois, as veias destas folhas de milho são removidos e estas folhas são cortadas em tiras de 1 centímetro x 2cm. 3 folhas em forma de tira depois de corte são colocadas no papel de filtro na parte inferior de um prato de cultura de plástico redondos, e o papel de filtro é umedecido com água destilada. 10 larvas orientais, que são criadas em cativeiro (larva são colocadas em cada prato de cultura, e cada prato de cultura de insetos de teste é coberta por uma tampa e, em seguida, meios para 3 a 5 dias a uma temperatura de 26 a 28 ° C, em relação umidade de 80 % a 90 % e fotoperíodo (claro/escuro) de 14: 10. A pontuação total de resistência é obtido de acordo com três índices, incluindo o progresso do desenvolvimento de larvas orientais, a mortalidade e a proporção dos danos às folhas: pontuação total = 100 x 90 x de mortalidade (número de larvas recém eclodidas/o número total de larvas inoculadas) + 60 x (o número de larvas recém-nascidos de controlo negativo/o número total de larvas inoculadas) 10 x (o número de larvas de controlo negativo/o número total de larvas inoculadas) 100 x (proporção de 1 dano às folhas). Existem 20 casos de transformação (ou seja, casos ) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas transferidas, no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas excluída transferidos no total, 10 casos de transformação (ou seja, casos) de Sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas adicionadas no total, cinco casos de transformação (ou seja, casos) de plantas de sequência transferidos conhecidos, três não-transgênicos (NGM) plantas identificadas por meio de PCR de fluorescência quantitativa, e três plantas do tipo selvagem ( CK ), esta identificação é repetido 3 vezes para cada planta. Os resultados são apresentados como a Tabela 4 e Tabela 5.
[000109] Os resultados indicam que: as plantas que têm certa resistência à lagarta da larva oriental podem ser selecionadas a partir da sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho transferidas e sequência da planta de milho transferida conhecida. No entanto, a pontuação total do bioensaio da sequência de nucleotídeo pic9-02 da planta de milho transmitida é significativamente mais elevada do que a da sequência transferidas da planta de milho a ser conhecida. A pontuação total do bioensaio da sequência de nucleotídeos Pic9-02 da planta de milho transferida acima de 150, enquanto a pontuação total do bioensaio da sequência de nucleotídeos Pic9-02 da planta de milho transferida é de cerca de 90. O resultado também indica que a sequência de nucleotídeos Pic9-02 da planta de milho transferida não conduz à morte massiva das larvas recém-nascidas, mas irá suprimir o progresso do desenvolvimento de larvas grandemente, ou seja, e mais especialmente, de 3 a 5 dias mais tarde, as larvas são ainda basicamente, no estado de nova incubação, ou entre os estados de nova incubação e de controle negativo, e a proporção de danos das folhas é inferior a 30 %.
[000110] Está provado que as sequências de nucleotídeos pic9-02 transferidas da planta de milho otimizadas, têm alta resistência a insetos. Ou seja, a sequência de nucleotídeos pic9-02 da planta de milho transferida, depois de ter alto nível de expressão de proteínas pic9-02, tem toxicidade elevada, de modo que a toxicidade da expressão da proteína pic9-02 em milho é extremamente levantada por meio da sequência de nucleotídeos pic9-02 optimizada de acordo com os códons preferidos de milho. Além disso, em comparação com a sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho transferidas, a toxicidade da proteína pic9-02 da sequência de nucleotídeo pic9-02 substituída da planta de milho, as sequências de nucleotídeos pic9-02 eliminadas transferidas da planta de milho e sequência de nucleotídeos Pic9-02 das plantas de milho adicionadas transferidas não tem diferença significativa. Tabela 4 Resultados experimentais de efeito inseticida de Plantas de milho Transgênicas inoculadas de larvas orientais
[000111] Em resumo, o gene inseticida da presente invenção, o qual adota os códons preferidos de milho, está completamente de acordo com as caraterísticas do gene do milho, de modo que o gene inseticida da presente invenção é particularmente adequado para a expressão em monocotiledôneas, em particular em milho. A proteína pic9-02 da presente invenção não só tem um elevado nível de expressão quanto uma boa estabilidade, mas também tem uma forte toxicidade contra as pragas de insetos, especialmente contra as pragas de insetos da ordem Lepidoptera.
[000112] Deve ser salientado que, finalmente, os exemplos acima são apenas usados com a finalidade de ilustrar as soluções técnicas da presente invenção, mas não para limitar a presente invenção, ao passo que a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência aos exemplos preferidos, deve ser entendido por uma pessoa que seja versada na técnica que as modificações ou substituições equivalentes podem ser feitas para as soluções técnicas da presente invenção sem se afastar do espírito e do âmbito da presente invenção.
Claims (14)
1. Proteína inseticida, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (b) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2, em que Cys na posição 674 da sequência de aminoácidos é substituída por Tyr;; (c) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2, em que os aminoácidos nas posições 641 a 650 da sequência de aminoácidos são deletados; ou (d) uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2, em que 5 aminoácidos, Asp, Glu, Arg, Asn e Leu, são adicionados atrás da posição 699 da sequência de aminoácidos.
2. Gene inseticida, caracterizado pelo fato de que compreende: (e) uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1; (f) uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 3; (g) uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 4; ou (h) uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 5.
3. Cassete de expressão, caraterizado pelo fato de que contém o gene inseticida eficazmente ligado como definido na reivindicação 2, que está sob a regulação de sequências reguladoras.
4. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que contém o gene inseticida como definido na reivindicação 2 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 3.
5. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que contém o gene inseticida como definido na reivindicação 2 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 3, sendo que, o microrganismo transgênico compreende bactérias, leveduras, ou baculovírus.
6. Método para a produção de proteínas inseticidas, caracterizado pelo fato de que compreende: adquirir as células do organismo hospedeiro transgênico como definido na reivindicação 5; cultivar as células do organismo hospedeiro transgênico sob as condições que permitem a produção de proteína inseticida e; recuperar a proteína inseticida.
7. Método para ampliar o alcance de insetos alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: expressar o cassete de expressão como definido na reivindicação 3, em uma planta em conjunto com pelo menos uma segunda proteína inseticida que é diferente da proteína inseticida gerada por expressão do cassete de expressão como definido na reivindicação 3.
8. Método para ampliar o alcance de insetos alvo, de acordo com a reivindicação 7, caraterizado pelo fato de que a segunda proteína inseticida é uma proteína inseticida de tipo VIP, um inibidor da protease, uma aglutinina, uma α-amilase ou uma peroxidase.
9. Método para a produção de plantas resistentes a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o gene inseticida como definido na reivindicação 2 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 3 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 4, em uma planta.
10. Método para a produção de planta resistente a insetos, de acordo com a reivindicação 9, caraterizado pelo fato de que a planta é milho, soja, algodão, arroz ou trigo.
11. Método para a proteção de plantas dos danos causados por pragas de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o gene inseticida como definido na reivindicação 2 ou o cassete de expressão como definido na reivindicação 3 ou o vetor recombinante como definido na reivindicação 4, em uma planta, para que a planta depois da introdução gere proteína inseticida suficiente para proteger a planta contra os danos causados por meio das pragas de insetos.
12. Método para proteger as plantas contra danos causados por pragas de insetos, de acordo com a reivindicação 11, caraterizado pelo fato de que a planta é milho, soja, algodão, arroz ou trigo.
13. Método para controlar pragas de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar pragas de insetos com uma quantidade inibidora da proteína inseticida como definida na reivindicação 1, ou a proteína inibitória de inseto gerada pela expressão do gene inseticida como definido na reivindicação 2.
14. Método para controlar pragas de insetos, de acordo com a reivindicação 13, caraterizado pelo fato de que as pragas são pragas de insetos da ordem Lepidoptera.
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