WO2021087586A1 - Molécula de ácido nucléico do evento transgênico de milho me240913 expressando a proteína cry1da, célula, planta e semente transgênica, usos das mesmas, produto de planta, método, kit e amplicon para detecção do evento, e métodos para produzir uma planta transgênica e de controle de insetos-pragas lepidópteros - Google Patents

Molécula de ácido nucléico do evento transgênico de milho me240913 expressando a proteína cry1da, célula, planta e semente transgênica, usos das mesmas, produto de planta, método, kit e amplicon para detecção do evento, e métodos para produzir uma planta transgênica e de controle de insetos-pragas lepidópteros Download PDF

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Beatriz DE ALMEIDA BARROS
Claudia TEIXEIRA GUIMARÃES
Fernando HERCOS VALICENTE
Marcos DE OLIVEIRA PINTO
Meire de Cássia ALVES
Myriam MAIA NOBRE
Newton PORTILHO CARNEIRO
Roberto WILLIANS NODA
Simone MARTINS MENDES
Sidney NETTO PARENTONI
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Definitions

  • the present invention relates to the field of plant molecular biology, plant transformation, and plant reproduction and pest control. More specifically, the invention relates to transgenic maize plants (Zea mays) resistant to lepidopteran pest insects comprising a new transgenic genotype, their uses, methods of controlling lepidopteran pest insects and detecting the presence of nucleic acids unique to transgenic corn plants in a plant product and compositions thereof.
  • genes of interest are genes that give plants resistance to herbicides, environmental stresses, diseases and invertebrate pests.
  • cry gene derived from the Gram positive bacterium Bacillus thuringiensis (Bt).
  • Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis
  • Such bacteria naturally occurring in several habitats, including soil, phylloplane, grain residues, dust, water, plant matter and insects, it has the innate characteristic of forming protein crystals during the stationary and / or sporulation phase.
  • Protein crystals or delta-endotoxins representing 20 to 30% of the total cell protein (Boucias & Pendland, 1998), can have specific insecticidal properties and have various shapes, such as: bipiramidal, spherical, rectangular, cuboid and irregular. Bipyramidal crystals show a higher frequency of toxicity than crystals with other forms, in particular against lepidopterans.
  • the mechanism of action of Cry proteins with an insecticidal effect involves, in general, the solubilization of the crystals in the target intestine's medium intestine, the digestive action of proteases present in the intestine of these insects on the pro-toxins, the adherence of the active toxins to the receptors of the midgut and the insertion of these active Cry toxins in the apical cell membrane, creating ion channels or pores (cytolysis). These channels, when formed, can alter the insect's diet and disrupt the integrity of the intestine leading to decreased growth and even death.
  • Cry proteins in agriculture is the selective toxicity of each of these proteins against various species of insect pests, and their non-toxic nature to other vertebrate organisms, such as fish, amphibians, reptiles, birds and mammals.
  • Another advantage of Cry proteins is their relative specificity of toxicity in relation to pest insects from different cultures. Currently, several cry genes are recognized.
  • cry1, cry2 and cry9 genes are generally active against lepidopterans; the genes cry2, cry4A, cry10, cry11, cry17, cry19, cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32, cry39 and cry40 are generally active against dipterans; the cry3, cry7 and cry8 genes are generally active against beetles; and the cry5, cry12, cry13 and cry14 genes are generally active against nematodes.
  • Commercial products containing Bt Cry proteins with insecticidal activity are produced today and used as biopesticides. These products have a high percentage of sales in the market and have been used for more than 60 years to control mainly pests of the orders Lepidoptera and Diptera. Another use of these Cry proteins is their expression in transgenic plants.
  • frugiperda single gene versus pyramided Bt maize.) And (3) in Brazil (Farias, JR; Andow, DA; Horiksoshi, RJ; Sorgatto, RJ; Fresia, P .; Santos , AC; Omoto, C. Field-evolved resistance to Cry1F maize by S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Crop Protection, v.64, p.150-158, 2014). CrylAb-resistant populations of S. frugiperda (Omoto, C .; Berbardi, O.
  • the dvsnf7 gene is another pest control technology that uses double-stranded RNA to inhibit genes important for insect survival. However, it has a low effect on the lepidopteran order which is extremely voracious causing defoliation in very short times.
  • CrylDa is CrylDa, produced by some strains of Bt and known to be toxic to S. frugiperda (Costa, ML, Lana, UG, Barros, EC, Paiva, LV and Valicente, FH, J of Agricultural Science, 2014, vol 6, ppi 28-136).
  • S. frugiperda Costa, ML, Lana, UG, Barros, EC, Paiva, LV and Valicente, FH, J of Agricultural Science, 2014, vol 6, ppi 28-136.
  • the CrylDa protein has been described in previous articles as having a limited spectrum of toxicity against lepidopteran pests (von Frankenhuyzen, 2009) and variable toxicity to different populations within a species of lepidopteran, such as S. frugiperda.
  • CrylDa had the smallest spectrum of activity for Cry1 proteins against a variety of species of lepidopterans (toxic against only 44% of the species tested) compared to the main proteins Cry1A and 2Aa tested (active against> 80% of the species tested).
  • W020071 07302 describes the use of Cry1C, Cry1D or CrylDa sequences to produce a new chimeric protein potentially active against the earworm.
  • WO2015143311 and WO2016061377 describe structural modifications of the Cry1 Da protein in an attempt to broaden the spectrum against other pests of lepidopterans, specifically earworm caterpillar (Helicoverpa zea) including changes in the native amino acid sequence of CrylDa or in fusion with other insecticidal proteins to increase insecticidal activity against a broader spectrum of lepidopteran pests.
  • DNA constructs that encode desired proteins are individually inserted into the plant's genome by genetic transformation.
  • Current methods of plant transformation mainly use Agrobacterium tumefaciens which generally lead to a low number of copies of the gene constructs within the genome of the host plant.
  • the genetic constructs are composed of a promoter, coding region and terminator.
  • the promoter is the regulatory and determining element of expression both temporally and especially of the gene.
  • constitutive promoters such as that which controls the expression of the ubiquitin gene in corn.
  • DNA construction into the host's genome is random, and this random insertion into the DNA of the plant's genome may impact a gene whose product is critical to the plant's survival, rendering the resulting plant unviable.
  • random insertion may target a region of the host genome that can negatively influence the expression of the gene of interest, regardless of the use of constitutive promoters.
  • overproduction of the genetic product of construction has detrimental effects on the cell, leading mainly to decreased productivity. Because of these potential problems, it is common to produce dozens (in some cases hundreds) of different events and track these events to a single event that has the desired patterns and levels of transgenic expression for commercial purposes.
  • the progeny of such crosses maintain the characteristics of transgenic expression of the original transforming host plant.
  • This strategy is used to ensure reliable gene expression in several varieties that are well adapted to local growing conditions. This is impacted by having inserted the integrated DNA in ideal locations within the genome, thus providing the best levels of temporal and spatial expression, stability in several generations of creation and in various genetic origins. As such, the physical genomic location of the inserted DNA becomes a fundamental feature of the resulting product's effectiveness and is therefore new.
  • a well-known, but not limited, method of detecting nucleic acid is the amplification of DNA in vitro by the PCR (Polymerase Chain Reaction) technique using polynucleotide primers. The other method is to hybridize DNA using nucleic acid probes. Detection methods can use primers or probes based on elements common to different gene constructs or based on specific regions of the construct.
  • the present invention relates to a transgenic corn event, designated ME240913 comprising a new transgenic genotype that contains a crylDa nucleic acid sequence optimized for expression in corn.
  • the crylDa coding sequence encodes a truncated variant of the native protein CrylDa of SEQ ID NO: 3 which surprisingly provides a high level of protection for plants against leaf damage produced by various populations of S. frugiperda that occur naturally in Brazil (wild and resistant type to Cry1 F). It is important to note that the leaf tissue of the ME240913 event produces an unexpected high toxicity for pests of lepidopteran insects, such as Noctuidae insects, particularly S. frugiperda.
  • the present invention also provides other nucleic acids that are unique to the ME240913 event, namely the sequence of an amplicon resulting from a PCR reaction using specific primers to confirm the 5 'junction sequence, the 3' junction sequence , flanking sequences 5 'and 3', and / or complements thereto.
  • the invention also provides amplicons comprising the unique nucleic acids from the ME240913 event, transgenic corn plants comprising the unique nucleic acids from the ME240913 event and seeds from the transgenic corn plants.
  • the present invention also relates to methods for producing a transgenic maize plant comprising the unique nucleic acids of the invention by sexually crossing a first parent corn plant with a second parent corn plant to produce a plurality of first generation offspring plants, in which at least one of said parent plants comprises a single nucleic acid for the ME240913 event, selection of a first generation offspring plant that is resistant to infestation by lepidopteran insect pests, self-pollination of the first generation offspring to produce a plurality of second generation offspring, and selection, from second generation offspring, of a plant that is resistant to pest insects lepidoptera.
  • the present invention further describes methods for controlling lepidopteran pest insects, such as those of the Noctuidae family, particularly S. frugiperda.
  • Corn plants comprising the ME240913 event and methods of the present invention are effective for the control of specific lepidopteran insect-pest populations, such as S. frugiperda, which have become resistant to plants expressing Cry1F protein.
  • Methods for the production of hybrid maize seeds are also revealed. Such methods include the steps of planting seeds of a first line of congenital maize comprising at least one nucleotide sequence unique to the event ME240913 and of seeds of a second line of congenital having a different genotype, cultivation of corn plants resulting from said seeds planted until the flowering season, emasculation of the flowers of the plants of one of the congenital lines of corn, sexual crossing of the two different congenital lines with each other, and harvesting of the hybrid seed thus produced.
  • a sample of the seed, and consequently corn plants grown from the seed, comprising nucleic acids unique to the ME240913 event was deposited at American Type Culture Collection (ATCC) with accession number PTA-126224.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the transgenic corn plants of the invention have essentially all the corresponding morphological and physiological characteristics of isogenic non-transgenic corn plants in addition to those conferred on corn plants by the new genotype of the invention.
  • Plant products and extracts from ME240913 corn plants, tissues and seeds are also provided by the present invention.
  • the present invention further provides methods of introgression of the ME240913 event in maize strains through the sexual crossing of plants containing the ME240913 event, such as, for example, but not limited to the plants obtained from the seeds deposited in the American Type Culture Collection ( ATCC) with accession number PTA-126224.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the ME240913 event can be combined with other transgenic corn events by methods known in the art, such as pyramidation of genes.
  • These results also indicate that the ME240913 event acts through a different mechanism of action than the Cry1F and, therefore, the corn event will be very effective when combined with other insecticidal genes incorporated into the plant using gene pyramidation.
  • the ME240913 event also expresses the gene for resistance to the herbicide pat (bar). Therefore, the ME240913 event can also be used to reduce the rate of resistance to herbicides using gene pyramidation.
  • Examples of gene pyramidation include, but are not limited to, herbicide and insect pest resistance events.
  • the ME240913 event can be combined, for example, with events containing one or more genes selected from a pat gene, a cp4 epsps gene (5-enolpyruvyl-chiquimate-3-phosphate synthase), a crylAb gene, a cry1F gene, vip3A gene, cry1A.105 gene, cry2Ab gene, cry3Bb gene, cry34Ab gene, cry35Ab gene, mcry3A gene, ecry3.1Ab, dvsnf7 gene, and amy797E gene.
  • the present invention also provides a polynucleotide primer pair that comprises a first polynucleotide primer and a second polynucleotide primer, which work together in the presence of a template DNA from the ME240913 event in a sample to produce a diagnostic amplicon from the ME240913 event, wherein the first polynucleotide primer comprises a part of the 5 'flanking sequence, the 3' flanking sequence, and / or its complements, wherein the second polynucleotide primer comprises a part of a specific inserted sequence, or its complements, and in which said corn event ME240913 has a specific sequence containing the insertion of the event and flanking sequences in the corn genome.
  • the present invention relates to transgenic corn plants as well as cells and tissues thereof, which comprise a nucleic acid molecule of the invention.
  • the transgenic corn plant is resistant to lepidopteran insect pests.
  • the transgenic corn plant is highly resistant to damage to the leaves produced by naturally occurring S. frugiperda populations found in corn producing regions in Brazil.
  • the transgenic corn plant is highly toxic to S. frugiperda, producing 100% mortality when fed with fresh leaf tissue.
  • the transgenic corn plant is a plant highly toxic to S. frugiperda, as evidenced by high mortality and morbidity to S. frugiperda after dilution of the lyophilized leaves of the ME240913 event in the ratio of 1: 25 (weight / weight) with artificial diet.
  • the high toxicity of lyophilized plant leaf tissue from the ME240913 event shows that the referred event is very efficient in the control of S. frugiperda and useful for pyramidization of several insect control genes.
  • Maize seeds are also disclosed, which comprise a nucleic acid molecule of the invention.
  • corn seeds are deposited in the American Type Culture Collection under accession number PTA-126224 and are used to produce transgenic corn plants.
  • the present invention relates to a product of the corn plants event ME240913, tissue or seed, which comprise a nucleotide sequence of the present invention or its complements, and in which the sequence is detectable in the plant product using an amplification of the nucleic acid or nucleic acid hybridization method.
  • the invention also contemplates plant products, such as, but not limited to corn kernels, fodder, corn flour, corn starch, corn syrup, corn oil, corn starch, and cereals manufactured in whole or in part with corn products.
  • kits for detecting nucleic acids that are unique to the ME240913 event which comprise at least one nucleic acid molecule that is a primer or probe comprising a nucleic acid sequence comprising a specific sequence, and the complements to them. themselves, and in which said primer or probe, when amplifying or hybridizing a sequence of target nucleic acids in a sample followed by the detection of amplicon or hybridization with the target sequence, it is diagnostic for the presence of the nucleic acid sequences unique to the ME240913 event in the sample.
  • Also disclosed are methods for detecting the presence of at least one nucleic acid molecule that is unique to the ME240913 event in a sample comprising corn nucleic acids in which the said methods comprise the following steps: placing the sample in contact with a pair specific primers of the present invention, perform a nucleic acid amplification reaction to produce an amplicon, and detect said amplicon, where the amplicon comprises nucleic acid sequences unique to the ME240913 event, or its complements, and where said corn event ME240913 has a specific sequence containing the insertion of the event and flanking sequences in the corn genome.
  • Another method for detecting the presence of a nucleic acid molecule that is unique to the ME240913 event in a sample comprising corn nucleic acids comprises the steps of: placing the sample in contact with a probe that hybridizes under conditions of high stringency with DNA genomic event ME240913 and does not hybridize under high stringency conditions with the DNA of a control corn plant, in which the probe comprises a unique nucleotide sequence for the ME240913 event, and its complements, subject the sample and the probe to conditions of high stringency hybridization, and to detect the hybridization of the probe with the nucleic acid molecule, in which the referred corn event ME240913 presents a specific sequence containing the insertion of the event and flanking sequences in the corn genome.
  • a method for controlling insect-lepidopteran pests of corn plants is revealed, in which corn plants comprise a nucleic acid molecule comprising nucleic acid sequences unique to the ME240913 event, or its complements, wherein said methods comprise the steps of planting seeds obtained from a plant comprising said nucleic acid sequences unique to the event ME240913 in a corn planting area susceptible to lepidopteran pest insects.
  • corn plants contain truncated and modified CrylDa protein, produced from the expression of unique sequences of a single nucleic acid sequence for the ME240913 event , leading to the accumulation of expression levels in leaves of the truncated and modified protein CrylDa which are highly protective against leaf damage caused by populations that occur naturally in Brazil and are also highly toxic against S. frugiperda as can be seen in the high rates of mortality in the studies carried out.
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence encoding the truncated Cry1 Da protein, optimized for expression in corn present in the ME240913 event.
  • SEQ ID NO: 2 is the nucleic acid sequence of the complete transgene construct of the ME240913 event comprising in the following order: the 3 'UTR terminator region of the Tvsp gene; coding region the phosphinothricin acetyl transferase (bar) gene, a region of translational enhancer (tev); promoter region of the duplicated CaMV 35S gene, promoter region of the ubiquitin gene (ubi); codon-optimized nucleic acid sequence of the crylDa gene (SEQ ID NO: 1); and 3 'UTR terminator region of the nopaline synthase gene.
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the truncated CrylDa protein expressed by the ME240913 event.
  • SEQ ID NO: 4 is the 5 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 5 is the 3 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 6 is the 5 'flanking sequence.
  • SEQ ID NO: 7 is the 3 'flanking sequence.
  • SEQ ID NO: 8 is the nucleotide sequence comprising the 5 'flanking sequence (nucleotides 1-116), the complete insert sequence (nucleotides 117-6306) and the 3' flanking sequence (nucleotides 6307-6424) of the ME240913 event.
  • SEQ ID NO: 9 is a forward primer sequence useful in amplifying the 5 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 10 is a reverse primer sequence useful in amplifying the 5 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 11 is an illustrative sequence of amplicon resulting from PCR using specific primers to confirm the 5 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is a probe sequence useful in detecting the 5 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 13 is a forward primer sequence useful in amplifying the 3 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 14 is a reverse primer sequence useful in amplifying the 3 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 15 is an illustrative sequence of amplicon resulting from PCR using specific primers to confirm the 3 'junction sequence.
  • SEQ ID NO: 16 is a probe sequence useful in detecting the 3 'junction sequence.
  • FIGURES Figure 1 is a representative diagram of the ME240913 event insert and the respective nucleotide sequences that define said event, including 5 'and 3' junction and flanking sequences of the corn genome.
  • FIG. 2 is a representative diagram of the Ubi gene constructs :: cry1Da :: NOS and 2x35S :: bar :: Tvsp of the ME240913 event insert inserted in the Hindlll and EcoRI enzyme sites of the binary vector pTF 101.1, between the right and left edges of the TDNA.
  • Figure 3 shows the result of the evaluation of the ME240913 event in relation to the control of S. frugiperda using fresh leaves of corn for a period of 5 days. Sample of fresh leaf of non-GMO corn (a) and corn genetically modified with CrylDa (b) are shown.
  • Figure 4 shows the result of exposure tests of S. frugiperda to fresh leaf tissue from two genetic backgrounds containing the ME240913 event. Survival of S. frugiperda (%), was evaluated up to 3 days after the exposure of the newly hatched larvae to fresh control corn leaves and corn leaves expressing ME240913 event in two different genetic backgrounds (hybrid and RC1 F1) are shown.
  • Figure 5 shows the survival rate of newly hatched larvae after 14 days of exposure to lyophilized leaves at a 1:25 dilution in an artificial control diet and the ME240913 event.
  • Figure 6 shows the sizes of live caterpillars after 7 (A) and 10 (B) days of exposure to lyophilized leaf tissue diluted 1:25 from Event ME240913 in the artificial diet compared to the control diet.
  • Figure 7 shows the result of the level of damage in the leaves of the control corn plants (conv) and of the ME240913 (GMO) event in plots infested by six different populations of S. frugiperda.
  • Figure 8 shows photographs of damage to control corn plants (left) and Event ME240913 (right) in a field infested by populations of S. frugiperda de Palotina / PR (8A), Rondonópolis / MT (8B), Rondonópolis + Campo Verde / MT (8C), Paracatu / MG (8D), Sete Lagoas / MG (8E), and Ivatuba / PR (8F).
  • Trat 1 transgenic corn comprising the codon-nucleic acid molecule optimized crylDa of the present invention (SEQ ID NO: 1) + Cry1 F resistant caterpillar population;
  • Trat 2 Non-transgenic L3 maize strain + Cry1 F resistant caterpillar population;
  • Trat 3 transgenic corn comprising the codon-optimized nucleic acid molecule cryl Da of the present invention (SEQ ID NO: 1) + susceptible caterpillar population;
  • Trat 4 L3 non-transgenic corn strain + Population of susceptible caterpillars.
  • nucleic acids such as “nucleic acids”, “nucleotides” and the like should be interpreted as naturally occurring, synthetic or artificial nucleotides or nucleotides. They comprise deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) or any nucleotide analog and polymers or hybrids thereof in the sense (sense) or antisense (antisense) configuration, single-stranded or double-stranded. Unless otherwise stated, a specific nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants of it (for example, degenerate codon substitutions) and complementary sequences, as well as the sequences explicitly indicated.
  • nucleic acid is used interchangeably in this document with the terms “gene”, “cDNA”, “mRNA”, “oligonucleotide”, “nucleic acid molecule” or “primer”.
  • nucleic acid molecule refers to a polymer of single-stranded or double-stranded DNA or RNA bases, read from the 5 'end to the 3' end. It includes chromosomal DNA, self-replicating plasmid, infectious polymers of DNA or RNA that play a mainly structural role, among others. They also refer to a consecutive list of abbreviations, letters, characters or words, which represent nucleotides or genes, as usually employed in the technical field of the present invention.
  • the term "amplified” means the construction of multiple copies of a nucleic acid molecule or multiple copies complementary to the nucleic acid molecule using at least one of the nucleic acid molecules as a standard.
  • Amplification systems include, but are not limited to, the Polymerase Chain Reaction (PCR) system, ligase chain reaction (LCR) system, nucleic acid sequence based amplification (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), systems of Q-Beta Replicase, transcription-based amplification system (TAS), and amplification by tape displacement (SDA). See, for example: Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing, et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). The amplification product is described as an amplicon.
  • a "coding sequence” is a nucleic acid sequence that is transcribed into RNA such as mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA or antisense RNA.
  • RNA is then translated into an organism to produce a protein.
  • sequence similarity ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • a “gene” is a defined region that is located within a genome and that, despite the coding sequence mentioned above, can comprise other, primarily regulatory nucleic acid sequences, responsible for controlling expression, that is, transcription and translation of the coding region.
  • a gene can also contain other 5 'and 3' untranslated sequences and termination sequences. Other elements that may be present are, for example, introns.
  • Gene of interest refers to any gene that, when transferred to a plant, gives the plant a desired characteristic, such as antibiotic resistance, virus resistance, insect resistance, disease resistance, or resistance to other pests, herbicide tolerance, improved nutritional value, improved performance in an industrial process or altered reproductive capacity.
  • Gene as used in this document is the genetic material inherited from the maize plants of origin.
  • the ME240913 genotype refers to the heterologous genetic material transformed within the genome of a plant as well as the genetic material flanking the inserted sequence.
  • a "heterologous" nucleic acid sequence is a nucleic acid sequence not naturally associated with a host cell into which it is introduced, including the unnatural occurrence of multiple copies of a nucleic acid sequence.
  • a “homologous" nucleic acid sequence is a nucleic acid sequence naturally associated with a host cell into which it is introduced.
  • “High toxicity” of the corn leaf tissue refers to the ability of leaf tissue samples to produce 100% mortality for lepidopteran species, such as S. frugiperda, within 7 days after exposure to leaf tissue.
  • Another part of the definition of "high toxicity” is the ability of dry leaf tissue, diluted 1: 25 with conventional corn leaf tissue, to produce> 95% mortality and morbidity within 14 days after exposure to the leaf tissue diet.
  • 'Operationally linked' refers to the association of nucleic acid sequences in a single nucleic acid fragment so that the function of one affects the function of the other.
  • a promoter is operationally linked to a coding sequence or functional RNA when it is capable of affecting the expression of the coding sequence or functional RNA (that is, when the coding sequence or functional RNA is under the transcriptional control of the district Attorney). Coding sequences in sense or antisense orientation can be operationally linked to regulatory sequences.
  • Plant protection refers to the ability of the intact corn plant to resist leaf damage produced by susceptible lepidopteran pests, including, but not limited to, protection against leaf damage produced by S. frugiperda . Protection can be observed by examining plants or photographs of plants in order to compare the damage observed for control corn plants with those observed in a corn plant that expresses Cryl Da. "Plant protection”, as used in this document, also refers to the ability of the intact plant to resist damage produced by susceptible lepidopteran pests, including, but not limited to, the use of standard and accepted methods of classifying plant damage.
  • “Initiators” or “primers” as used in this document are isolated nucleic acids that are annealed to a complementary target DNA strand by hybridizing the nucleic acid to form a hybrid between the primer and the target DNA strand, and then extended along the target DNA strand by a polymerase, such as like DNA polymerase.
  • Primer pairs or sets can be used for amplification of a nucleic acid molecule, for example, by Polymerase Chain Reaction (PCR) or other conventional methods of nucleic acid amplification.
  • a “probe” is an isolated nucleic acid to which a conventional detectable marker or reporter molecule, such as a radioactive isotope, ligand, chemiluminescent agent or enzyme, is attached. Such probe is complementary to a strand of a target nucleic acid, in the case of the present invention, to a strand of genomic DNA from the ME240913 corn event.
  • the DNA of the ME240913 event can be from a corn plant or from a sample that includes DNA from the ME240913 event.
  • the probes according to the present invention include not only ribonucleic or deoxyribonucleic acids, but also polyamides and other probe materials that specifically bind to a target DNA sequence and can be used to detect the presence of that target DNA sequence.
  • Primers and probes are generally between 10 and 15 nucleotides or more in length. Primers and probes can also be at least 20 nucleotides or more in length, or at least 25 nucleotides or more, or at least 30 nucleotides or more in length. Such primers and probes hybridize specifically to a target sequence under high stringency hybridization conditions. Primers and probes according to the present invention can have complete sequence complementary to the target sequence, although probes that differ from the target sequence and that retain the ability to hybridize the target sequences can be designed by conventional methods.
  • Stringent conditions or “stringent hybridization conditions” include references to conditions under which a probe will hybridize to its target sequence, to a greater degree detectable than other sequences. Stringency conditions are dependent on the target sequence and will differ depending on the structure of the polynucleotide. By controlling the hybridization stringency and / or washing conditions, the target sequences that will be 100% complementary to the probe (homologous probe) can be identified. Alternatively, stringency conditions can be adjusted to allow for some inadequacy in the sequences so that lower degrees of similarity are detected (heterologous probe). Longer strings hybridize specifically at higher temperatures.
  • Specificity is typically the function of post-hybridization washes, with the ionic strength and temperature of the final wash solution being the critical factors.
  • the high stringency hybridization and washing conditions are selected because they are approximately 5 ° C below the thermal melting point (T m ) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH.
  • AT m is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes in a perfectly compatible probe.
  • a probe will hybridize to its target sequence, but not to other sequences.
  • An example of high stringency hybridization conditions for hybridization of complementary nucleic acids that have more than 100 complementary residues in a "Southern Blot" or “Northern Blot” filter is 50% formamide with 1 mg of heparin at 42 ° C, hybridization being performed overnight.
  • An example of very high stringency washing conditions is 0.15M NaCI at 72 ° C for approximately 15 minutes.
  • An example of high stringency washing conditions is a 0.2x SSC wash at 65 ° C for 15 minutes (see, Sambrook, infra, for a description of the SSC buffer).
  • a good example of hybridization conditions for the present invention includes hybridization in 7% SDS, 0.25 M NaP0 4 pH 7.2 at 67 ° C overnight, followed by two washes in 5% SDS, 0.20 M NaP0 4 pH 7.2 at 65 ° C for 30 minutes in each wash, and two washes in 1% SDS, 0.20 M NaP0 4 pH 7.2 at 65 ° C for 30 minutes in each wash.
  • a good example of medium stringency washing for a duplex of, for example, more than 100 nucleotides is 1x SSC at 45 ° C for 15 minutes.
  • a good example of low stringency washing for a duplex of, for example, more than 100 nucleotides is 4- 6x SSC at 40 ° C for 15 minutes.
  • high stringency conditions typically involve salt concentrations of less than approximately 1.0 M Na ions, typically concentrations of approximately 0.01 to 1.0 M Na ions (or other salts) at a pH 7.0 to 8.3, and the temperature is typically at least approximately 30 ° C.
  • High stringency conditions can also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
  • a signal for a 2x (or higher) noise rate than observed for an unrelated probe in the specific hybridization assay indicates the detection of a specific hybridization.
  • Nucleic acids that do not hybridize to each other under high stringency conditions are still substantially identical if the proteins they encode are substantially identical. This occurs, for example, when a copy of a nucleic acid is created using the maximum codon degeneration allowed by the genetic code.
  • a reference nucleotide sequence preferably hybridizes to the nucleotide sequence reference in 7% sodium Dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaP0 4 , 1 mM EDTA at 50 ° C with washing in 2X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C, more preferably at 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaP0 4 , 1 mM EDTA at 50 ° C with washing in 1X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C, more preferably still in 7% sodium dodecyl sulfate ( SDS), 0.5 M NaP0 4 , 1 mM EDTA at 50 ° C with washing in 0.5X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C, preferably in 7%
  • promoter is located 5 '(or upstream) from the site of initiation of transcription of a nucleotide sequence of interest whose mRNA transcription it controls and provides a site for specific RNA polymerase binding and other transcription factors for the beginning of the transcription. It may include other regulatory sequences, known to a person skilled in the art. According to the present invention, the promoter can be heterologous or homologous to the respective cell or host.
  • a nucleic acid sequence is "heterologous" to an organism or to a second nucleic acid sequence if it originates from a different species or, if from the same species, it is modified from its original form.
  • the term "unique" for the ME240913 event means distinctive features of the ME240913 event. Thus, nucleic acids unique to the ME240913 event are not found in other corn plants other than ME240913.
  • corn refers to the species Zea mays and includes all varieties of plants that can be reproduced with corn, including wild species of corn.
  • Detection Kit refers to a kit of parts useful in detecting the presence or absence of nucleic acids unique to ME240913 plants in a sample, where the kit comprises nucleic acid probes and / or primers of the present invention, which form hybrids specifically under high stringency conditions with a target DNA sequence, and other materials necessary to enable methods of nucleic acid amplification or hybridization.
  • transformation and the like should be interpreted as a process for introducing heterologous DNA into a cell, plant tissue or plant. It can occur under natural or artificial conditions, such as through the use of several methods well known in the art, whether in a prokaryotic or eukaryotic host cell.
  • transgene should be interpreted as any sequence of nucleic acid that is introduced into a cell through experimental manipulations, whether or not it can be integrated into the genome.
  • a transgene can be an "endogenous DNA sequence", or “exogenous DNA sequence” (ie, "heterologous”).
  • endogenous DNA sequence refers to a sequence of nucleotides that is naturally found in the cell into which it is introduced.
  • exogenous DNA sequence refers to a sequence of nucleotides that is not naturally found in the cell into which it is introduced.
  • transgenic when referring to a transformed organism, means an organism transformed with a recombinant DNA molecule that preferably comprises a suitable promoter operably linked to a DNA sequence of interest.
  • vector should be interpreted as a construct containing a DNA sequence that is operably linked to one or more suitable control sequences capable of leading to the expression of said DNA sequence in a suitable host.
  • control sequences include a promoter to effect transcription, an optional operator sequence to control such transcription, a coding sequence for the sites appropriate binding mechanisms of the mRNA to the ribosome, and to the sequences that control the termination of transcription and translation, for example.
  • the vectors suitable for carrying out the present invention can be diverse. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or be replicated by the chromosome.
  • the vector can also be a plasmid. According to this document, the terms "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably.
  • the vector according to the present invention comprises the nucleic acid molecule crylDa comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, as defined herein.
  • transgenic event refers to a recombinant plant produced by the transformation and regeneration of a plant tissue or cell with heterologous DNA, for example, an expression cassette that includes a gene of interest.
  • event refers to the original transformant and / or the offspring of the transformant that includes the heterologous DNA.
  • event also refers to the offspring produced by a sexual cross between the transformant and another strain of corn. In addition, after repeated backcrossing with a relative, the introduced DNA and the flanking DNA of the transformed relatives are present in the offspring of the crossing at the same location on the chromosome.
  • vent also refers to the DNA of the original transformant comprising the inserted DNA and the flanking genomic sequence immediately adjacent to the inserted DNA that would be expected to be transferred to a progeny that receives the inserted DNA including the transgene of interest as result of a sexual crossing of a parent line that includes the inserted DNA (for example: the original transformant and the progeny resulting from the crossing) and a parent line that does not contain the inserted DNA.
  • the transformation of plant tissue produces multiple events, each representing the insertion of a DNA construct within a different location in the genome of a plant cell. Based on the expression of the transgene or other desirable characteristics, a particular event is selected. In this way, the terms “event ME240913" and “event” can be used interchangeably.
  • An insect resistant ME240913 maize plant can be reproduced primarily by the sexual crossing of a first parent maize plant consisting of a maize plant grown from a transgenic ME240913 maize plant, such as a ME240913 maize plant grown from seed deposited at the ATCC under accession number: PTA-126224, and the progeny of this derivative of the transformation with the expression cassette of the means of execution of the present invention that confer resistance to lepidopteran pest insects, with a second parent corn plant can or not presenting resistance to lepidopteran pest insects, thus producing a plurality of first plants of the first generation; and then by selecting a first plant of the first generation that is resistant to lepidopteran insect pests; and self-pollination first-generation seedling, thereby producing a plurality of second-generation seedling plants; and finally for the selection of second generation offspring resistant to lepidopteran pest insects.
  • These steps may also include backcrossing the first generation plant resistant to lepidopteran insect pests or the second generation plant resistant to lepidopteran insect pests with the second parent corn plant or a third parent corn plant, thereby producing a plant maize that is resistant to lepidopteran pest insects.
  • backcrossing the first generation plant resistant to lepidopteran insect pests or the second generation plant resistant to lepidopteran insect pests with the second parent corn plant or a third parent corn plant, thereby producing a plant maize that is resistant to lepidopteran pest insects.
  • Such methods can be used for the introgression of the ME240913 event in maize lines, as well as for the pyramidization of the ME240913 event with other transgenic events.
  • host cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the host cell according to the present invention is a plant host cell.
  • it comprises a nucleic acid sequence that is unique to the ME240913 event, which is selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and complements thereof.
  • transgenic plant cell a transgenic plant
  • transgenic plant a transgenic plant
  • the like should be interpreted as cells or plants that have and preferably express, through experimental manipulations, a transgene, as well as refer to the progeny of a transgenic plant and subsequent generations of plants, as above.
  • plant and the like should be interpreted as being part or all of the plant organism.
  • part in this context, we mean plant cells and tissues, organs and parts of plants in all their manifestations, such as seeds, leaves, anthers, fibers, ear, roots, hair from roots, stems, embryos, corns, cotyledons, petioles, collected material, plant tissue, reproductive tissue and cell cultures.
  • Transgenic plants according to the present invention, can be generated and self-fertilized or crossed with other individuals in order to obtain additional transgenic plants. Transgenic plants can also be obtained by vegetative propagation of transgenic plant cells.
  • insects of the order Lepidoptera including, but not limited to, the Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, families Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, Crambidae and Tineidae, more particularly noctuids Spodoptera sp., Particularly S. frugiperda (Noctuidae) and particularly.
  • One of the achievements of the present invention relates to a method of controlling insect pests of crop plants, including, but not limited to, caterpillars. Any method of control of lepidopteran insect pests of cultivation plants is included in the scope of the present invention, and is not of particular relevance for obtaining the achievements of the invention, provided that the cultivation plants, in accordance with the present invention, comprise at least at least one nucleic acid sequence that is unique to the ME240913 event, which is selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and complements thereof, in which the method preferably comprises the planting of seeds obtained from a plant comprising at least one nucleic acid sequence that is unique to the ME240913 event, as defined in this document, in a cultivation area for crop plants susceptible to lepidopteran pest insects.
  • the “CrylDa” class of proteins also includes their counterparts. "Homologous" means that the indicated protein or polypeptide sustains a defined relationship to other members of the CrylDa class of proteins.
  • This invention relates to a genetically improved strain of corn that produces a truncated CrylDa protein, modified to control lepidopteran pest insects.
  • the invention is particularly designed for a transgenic corn event designated ME240913 comprising a new genotype, as well as for compositions and methods for detecting nucleic acids unique to the ME240913 event in a biological sample.
  • the invention is further designed for maize plants comprising the ME240913 genotype, for transgenic seeds of the maize plants, and for methods for producing a maize plant comprising the ME240913 genotype by crossing a maize crossed with itself comprising the ME240913 or other genotype. corn line.
  • Corn plants comprising the ME240913 genotype of the invention are useful in the control of lepidopteran pest insects including, but not limited to the Noctuidae and / or Crambidae family, preferably S. frugiperda and D. saccharalis.
  • Corn plants from the ME240913 event show plant protection against sensitive lepidopteran pests, including, but not limited to, Cry1F-resistant S. frugiperda and Cry1A, wild-type
  • corn plants show high toxicity to susceptible pests of lepidopterans, including, but not limited to S. frugiperda.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that is unique to the ME240913 event.
  • the present invention relates to a isolated nucleic acid molecule that binds a heterologous DNA molecule introduced into the genome of the ME240913 event to the DNA genome in the ME240913 event comprising at least 10 or more (e.g. 15, 20, 25, 30 or more) contiguous nucleotides of the molecule of the heterologous DNA and at least 10 or more (e.g. 15, 20, 25, 30 or more) contiguous nucleotides of the genome DNA flanking the insertion site of the heterologous DNA molecule.
  • a heterologous DNA molecule introduced into the genome of the ME240913 event to the DNA genome in the ME240913 event comprising at least 10 or more (e.g. 15, 20, 25, 30 or more) contiguous nucleotides of the molecule of the heterologous DNA and at least 10 or more (e.g. 15, 20, 25, 30 or more) contiguous nucleotides of the genome DNA flanking the insertion site of the heterologous DNA molecule.
  • nucleotide sequences comprising 10 or more nucleotides from the ME24091 3 contiguous insertion sequence and at least one nucleotide from the ME240913 event flanking DNA adjacent to the insertion sequence.
  • Such nucleotide sequences are unique, and they diagnose the ME240913 event.
  • the hybridization or amplification of the nucleic acid of the genomic DNA of the ME240913 event produces an amplicon comprising such unique sequences that allows the diagnosis of the ME240913 event.
  • the nucleotide sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5 and 8, and their complements.
  • the invention in another embodiment, relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that comprises at least one junction sequence from the ME240913 event, in which a junction sequence transposes the junction between a heterologous expression cassette inserted into of the maize genome and the maize genome DNA pairing the insertion site which is unique for the referred ME240913 event and is diagnostic for the ME240913 event.
  • the junction sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 and 5, and their complements.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule that unites a heterologous DNA molecule to the corn plant genome in the ME240913 event, which it comprises at least one selected sequence from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 5, and their complements.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that is unique to the ME240913 event, wherein said nucleotide sequence encodes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 8 and / or the complement thereof.
  • the invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4, 5 and 8, and the complements thereof.
  • the isolated nucleic acid molecule is contained in a corn seed deposited in the "American Type Culture Collection" under accession number PTA-126224, or in plants grown from that seed.
  • an amplicon comprising a unique nucleotide sequence for the ME240913 event is provided.
  • the nucleotide sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11 and 15, and their complements.
  • the present invention encompasses the flanking sequence primers to detect the ME240913 event.
  • flanking sequence primers comprise a nucleotide sequence of at least 10 contiguous nucleotides from the 5 'or 3' flanking sequence.
  • the contiguous nucleotides are selected from at least 10 contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 6 (5 'flanking sequence), or the complements thereof.
  • the 5 'flanking sequence primer has the sequence of SEQ ID NO: 9 or the complement thereof.
  • the contiguous nucleotides are selected at least 10 contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 7 (the 3 'flanking sequence), or the complements thereof.
  • the 3 'flanking sequence primer has the sequence of SEQ ID NOs: 12 or the complement thereof.
  • the present invention encompasses a pair of polynucleotide primers comprising a first polynucleotide primer and a second polynucleotide primer that work together in the presence of a ME240913 event DNA template in a sample to produce a diagnostic amplicon for the event ME240913.
  • the first initiator and / or the second initiator is chosen from SEQ ID NO: 9, 10, or the complements thereof.
  • the first initiator and / or the second initiator is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 13, 14, and their complements.
  • the amplicon that is produced by the pair of primers comprises SEQ ID NO: 11, 15, or the complements thereof.
  • the present invention encompasses a pair of polynucleotide primers comprising a first polynucleotide primer and a second polynucleotide primer that work together in the presence of a DNA model of the ME240913 event in a sample to produce a diagnostic amplicon for the event ME240913.
  • first primer is equal to or complementary to a corn plant genome sequence that matches the insertion point of a heterologous DNA sequence inserted into the ME240913 event genome
  • the second polynucleotide primer is equal to or complementary to the heterologous DNA sequence inserted in the ME240913 event genome.
  • the first polynucleotide primer comprises at least 10 contiguous nucleotides from position 1-116 and 6307-6424 of SEQ ID NO: 8 and the complements thereto.
  • the first initiator is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 13, and their complements.
  • the second polynucleotide primer comprises at least 10 contiguous 10 nucleotides of position 117-6306 of SEQ ID NO: 8, or complements thereto.
  • the second polynucleotide primer is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 14, and their complements.
  • the first polynucleotide primer which is shown in SEQ ID NO: 9
  • the second polynucleotide primer which is shown in SEQ ID NO: 10
  • the 20 amplicon comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the present invention relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid molecule that is unique to the ME240913 event in a sample 25 comprising corn nucleic acids, where the method comprises: (a) placing the sample in contact with a pair of primers, (b) perform a nucleic acid amplification reaction in order to produce an amplicon, and (c) detect the amplicon.
  • the present invention relates to
  • BO a method for detecting the presence of an acid molecule nucleic acid that is unique to the ME240913 event in a sample comprising corn nucleic acid, where the method comprises: (a) placing the sample in contact with a probe that hybridizes under conditions of high stringency with genomic DNA from the ME240913 event and does not hybridize under conditions high stringency with DNA from a control maize plant, in which the probe comprises at least 10 contiguous nucleotides from a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and complements thereof; (b) subjecting the sample and probe to high stringency hybridization conditions; and (c) detecting probe hybridization to the nucleic acid molecule.
  • Detection can be done by any means well known in the art including fluorescence, chemiluminescence, radiological, immunological and others.
  • hybridization is used as a means of amplifying a particular sequence to produce an amplicon that is diagnostic for the ME240913 event
  • the production and detection of amplicon by any means well known in the art is indicative of hybridization with target sequence where at least one probe or primer is used.
  • biological sample defines a sample derived from a corn plant that contains or is suspected to contain a nucleic acid comprising between five and ten nucleotides on either side of the point at which either or both of the two end points of the heterologous DNA sequence inserted is joined to the genomic DNA sequence within the chromosome in which the heterologous DNA sequence was inserted, in this document also known as junction sequences.
  • the junction sequence comprises as little as two nucleotides: those being the first nucleotide within the flanking or genomic DNA adjacent to the covalently joined to the first nucleotide within the sequence Inserted heterologous DNA.
  • the probe comprises a nucleotide sequence comprising at least 10 contiguous nucleotides of SEQ ID NOs: 4, 5, and the complements thereof.
  • the present invention relates to a kit for the detection of nucleic acids that are unique to the ME240913 event in a biological sample.
  • the kit comprises at least one nucleic acid molecule of sufficient length of contiguous polynucleotides to function as a primer or probe in a method for detecting the nucleic acid.
  • Amplification or hybridization with a target nucleic acid sequence in a sample followed by detection of the amplicon or hybridization with the target sequence diagnoses the presence of nucleic acid sequences unique to the ME240913 event in the sample.
  • the kit also includes other materials necessary to allow nucleic acid amplification or hybridization.
  • a nucleic acid molecule contained in the kit comprises a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 9, 10, 12, 13, 14, 16, and the complements thereof.
  • the nucleic acid molecule is a primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 10, 13, 14, and their complements.
  • the amplicon comprises SEQ ID NO: 11, 15, or the complements thereof.
  • detection methods can be used, including, but not limited to, TAQMAN, thermal amplification, ligase chain reaction, Southern-blot, ELISA, and colorimetric and fluorescent detection methods.
  • kits for detecting the presence of the target sequence that is, at least the sequence SEQ ID NO: 4, 5, or a junction sequence in a sample containing ME240913 genomic nucleic acid.
  • the kit is understood by at least two polynucleotides capable of binding to the target site or substantially adjacent to the target site and at least one means for detecting the binding of the polynucleotide at the target site.
  • the detection means can be by fluorescence, chemiluminescence, colorimetry or isotopy and can be coupled with at least immunological methods to detect the binding.
  • the kit can also detect the presence of the target site in a sample, that is, at least the sequence SEQ ID NO: 4, 5, or a junction sequence of the ME240913 event, taking advantage of two or more polynucleotide sequences that together are capable of binding to adjacent nucleotide sequences or within approximately 100 base pairs of the target sequence and which can be extended together to form an amplicon that contains at least the target site.
  • the present invention relates to a method for detecting the CrylDa protein in a biological sample, the method comprises: (a) extracting protein from the ME240913 event tissue; (b) analyzing the extracted protein using an immunological method comprising specific antibodies to the CrylDa protein produced by the ME240913 event; and (c) detecting the binding of the mentioned antibody to the CrylDa protein.
  • the present invention relates to a plant product derived from a ME240913 corn plant, tissue, or seed, where the plant product comprises a sequence of nucleotides that is the same or is complementary to the sequence that is unique to event ME240913, and where the sequence is detectable in the plant product using a nucleic acid amplification or hybridization method.
  • the nucleotide sequence is the same or complementary to at least one of SEQ ID NO: 4, 5 and complements thereof.
  • the plant product is selected from the group consisting of corn flour, cornmeal, corn syrup, corn oil, cornstarch and cereals manufactured in whole or in part containing corn-based products.
  • the present invention relates to an extract of a plant product derived from a ME240913 corn plant, tissue or seed comprising a nucleotide sequence that is the same as or is complementary to a sequence that is unique to ME240913.
  • the sequence is detectable in the extract using a nucleic acid amplification or hybridization method.
  • the sequence is the same or is complementary to at least one of SEQ ID NO: 4 and 5.
  • the plant product is selected from the group consisting of cornmeal, cornmeal , corn syrup, corn oil, cornstarch, and cereals manufactured in whole or in part containing corn-based products.
  • Another embodiment of the present invention relates to a corn plant, or parts thereof, and to seeds of a corn plant comprising the genotype of the transgenic event ME240913, where the genotype comprises at least one nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 4, 5 or supplements thereof.
  • An example of corn seed comprises the nucleic acid molecules of the invention that were deposited on 10/28/2019 and assigned the accession number PTA-126224.
  • the corn plant is from the Hill corn lines.
  • a technician with common knowledge in the field will recognize that the ME240913 genotype can be introduced into any variety of plant that can be reproduced with corn, including wild species of corn, and therefore, the list of strains reproduced in this modality should not be included. limited.
  • the present invention relates to a corn plant comprising at least a first and a second DNA sequence linked to form a contiguous nucleotide sequence, where the first DNA sequence is within a junction sequence and comprises at least approximately 10 contiguous nucleotides selected from the group consisting of nucleotides 1-116 and 6307-6424 of SEQ ID NO: 8, and their complements, wherein the second DNA sequence is within the inserted heterologous DNA sequence and comprises at least approximately 10 contiguous nucleotides selected from the group consisting of 117 nucleotides -6306 of SEQ ID NO: 8, and their complements; and wherein the first and second DNA sequences are useful as nucleotide probes or primers to detect the presence of the ME240913 corn event nucleic acid sequences in a biological sample.
  • nucleotide primers are used in a DNA amplification method to amplify a target DNA sequence from the standard DNA extracted from the corn plant and the corn plant is identifiable among other corn plants by producing a amplicon corresponding to a DNA sequence comprising SEQ ID NO: 11, 15 and complements thereof.
  • the present invention relates to a corn plant, where the ME240913 genotype confers resistance to lepidopteran pest insects to the corn plant.
  • the transgenic genotype conferring resistance to lepidopteran insect pests to the invented corn plant comprises a truncated or modified crylDa gene.
  • the corn plant expresses adequate concentrations in the leaf of the truncated and modified crylDa protein to confer high levels of protection of the leaf of the plant against damage by S. frugiperda.
  • the high level of protection of plant leaves occurs in several populations of S. frugiperda today in Brazil, including populations known to have high frequencies of cry1F-resistant S. frugiperda.
  • the insertion of the cryl Da gene from the corn plant ME20913 produces adequate expression of the truncated and modified CrylDa protein in leaf tissue to produce high toxicity for susceptible species of lepidopterans, including S. frugiperda.
  • the ME20913 corn plant is highly toxic to Cry1F-resistant S. frugiperda.
  • the present invention provides a method for producing a corn plant resistant to lepidopteran pest insects comprising the steps of: sexually crossing a first parent corn plant with a second parent corn plant, wherein said first or second parent corn plant comprises the ME240913 event DNA, in order to produce a plurality of first generation offspring plants; select a first generation seedling plant comprising event ME240913.
  • the method further comprises self-pollinating the first generation seedling plant, in order to produce a plurality of second generation seedling plants; and select from the second generation descendant plants, a plant comprising the ME240913 event.
  • the selection step can be done based on the evaluation of resistance to lepidopteran pest insects, detection of the ME240913 event DNA according to the methods taught in the present invention or treatment with herbicide and selection of plants resistant to the promoted herbicide. by the PAT (bar) herbicide resistance gene contained in the ME240913 event.
  • the present invention provides a method of producing hybrid maize seeds comprising the steps of: planting seeds of a first line of congenital corn comprising event ME240913 and seeds of a second line of congenital line having a different genotype; sexually cross the two different congenital strains with one another; and harvest the hybrid seed produced in this way.
  • the method comprises at least one of the stages of growing corn plants resulting from those planted until the flowering season and emasculating the flowers of the plants of one of the congenital corn lines.
  • the first breed of maize reproduced provides female offspring.
  • the first breed of maize reproduced provides male offspring.
  • the present invention also relates to hybrid seeds produced by the incorporated method and hybrid plants grown from seed.
  • the gene construct containing the ubiquitin promoter, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the sequence of amino acids from the insecticidal protein CrylDa truncated from SEQ ID NO: 3, optimized for expression in maize and the 3 'region of the nopaline synthase gene from Agrobacterium was synthesized at the DNA Cloning Service (http: //www.dna-cloning. com /) in the pUC vector flanked by the Hindlll and EcoRI restriction sites.
  • the construct was transferred from pUC to the vector pTF101 (Paz et al., 2004) using the restriction enzymes EcoRI and Hindlll and ligase T4, according to the manufacturer's instructions (LifeTech).
  • the selection of the recombinant plasmid pTF101 UBI :: cry1Da :: NOS was carried out by transforming E. coli DH5a using spectinomycin and the cloning was confirmed by sequencing and cleavage with the enzymes Hindlll and BamHI.
  • the commercial kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) was used. Plasmid DNA from two bacterial colonies containing the gene construct was sequenced and compared with the sequence of interest and found to be identical.
  • Agrobacterium tumefaciens EHA 101 containing the gene constructs of interest (UBI :: cry1 Da :: NOST and 35S :: bar :: 35T) was used in the genetic transformation of corn.
  • the genotype used in this transformation protocol is the Hill corn (Armstrong et al., 1991), according to the protocol by Frame et al. (2002), with minor modifications. Soon, for the transformation of this genotype, immature embryos between 1, 8 - 2.0 mm in length (10 -12 days after pollination) were collected. Spikes used to collect the embryos were dipped in a 1: 1 solution of commercial bleach (2.5% sodium hypochlorite) and H2O distilled with 1-2 drops of Tween 20, for 20 minutes. Then, they were rinsed with sterile distilled water for 5 minutes, twice.
  • Immature embryos were collected with the aid of a spatula from a superficial cut of the grains.
  • Agrobacterium tumefaciens EHA101 was used to transfer the genetic construct to corn.
  • Agrobacterium tumefaciens EHA101 was used to transfer the genetic construct to corn.
  • Agrobacterium tumefaciens EHA101 was used to transfer the genetic construct to corn.
  • YEP medium 5 gL 1 yeast extract; 10 gL 1 peptone; 5 gL -1 NaCI; 15 gL -1 bacto agar
  • the necessary antibiotics spectinomycin 100 mg.L 1 and 50 mg.L 1 kanamycin
  • an Agrobacterium streak using a colony isolated from the motherboard was made in YEP medium containing the necessary antibiotics.
  • the plate was incubated for 2 to 5 days at 19 ° C.
  • Agrobacterium was resuspended in infection medium (4.0 gL 1 of N6 salts; 68.4 gL 1 of sucrose; 36.0 gL 1 of glucose; 0.7 gL 1 of proline; 1.5 mg.
  • the embryos were transferred to the surface of co-culture medium (4.0 gL 1 of N6 salts; 1.5 mg.L 1 of 2.4-D; 30.0 gL -1 of sucrose; 0.7 gL -1 proline; 1.0 mL.L 1 N6 vitamins (1000X); 0.85 mg.L 1 of AgN0 3 ; 100 mM acetoseringone; 300 mg.L -1 of L-cysteine; 3 , 0 gL -1 of phytagel; pH 5.8) with the scutellum facing upwards.
  • the plates were incubated in the dark at 20 ° C for 3 to 5 days.
  • the embryos were transferred to the resting medium (4.0 gL 1 of N6 salts; 1.5 mg.L 1 of 2.4-D; 30.0 gL 1 of sucrose; 0.5 gL 1 of MES; 0.7 gL -1 of proline; 1.0 mL.L 1 N6 vitamins (1000X); 0.85 mg.L -1 of AgN0 3 ; 100 mg.L -1 of Tioxin; 3.0 phytagel gL- 1 ; pH 5.8) at 28 ° C (dark) for 7 to 15 days.
  • the resting medium 4.0 gL 1 of N6 salts; 1.5 mg.L 1 of 2.4-D; 30.0 gL 1 of sucrose; 0.5 gL 1 of MES; 0.7 gL -1 of proline; 1.0 mL.L 1 N6 vitamins (1000X); 0.85 mg.L -1 of AgN0 3 ; 100 mg.L -1 of Tioxin; 3.0 phytagel gL- 1 ; pH 5.8) at 28
  • the embryos were transferred to the selection medium (4.0 gL -1 of N6 salts; 1.5 mg.L -1 of 2.4-D; 30.0 gL -1 of sucrose; 0.5 gL -1 MES; 0.7 gL 1 proline; 1.0 mL.L 1 N6 vitamins (1000X); 0.85 mg.L 1 of AgN0 3 ; 100 mg.L -1 of Tioxin; 1, 5 and 3.0 mg / L of bialaphos; 3.0 gL -1 of phytagel; pH 5.8) (25 embryos / plate). Subcultures of these embryos in selective medium are carried out every 15 days until the callus selection grows vigorously.
  • the selection medium 4.0 gL -1 of N6 salts; 1.5 mg.L -1 of 2.4-D; 30.0 gL -1 of sucrose; 0.5 gL -1 MES; 0.7 gL 1 proline; 1.0 mL.L 1 N6 vitamins (1000X); 0.85 mg.L 1 of AgN0 3
  • Selected calluses were transferred to regeneration medium (4.62 gL -1 of MS salts; 60.0 gL -1 of sucrose; 100 mg.L -1 of myo-inositol; 1.0 mL.
  • bioassays were performed in the laboratory. The bioassays were performed as follows: newly hatched caterpillars of the species S. frugiperda were used to infest leaves of crylDa transgenic corn plants and the non-transgenic isoline (5 caterpillars per plant). The corn development stages used were V7 and V8 and the experiments were carried out in plastic containers and incubated in an acclimatized growth chamber (28C and 60% humidity, 12 hrs light). The damage note assessments took place after 05 days. In each case, the experimental design was composed by: “experimental group” (event ME240913 of transgenic corn containing the truncated crylDa construction) and “control group” (non-transgenic corn).
  • FIG. 3 is representative of the S. frugiperda feeding bioassays in non-transgenic corn and transgenic corn of the present invention. In this experiment, treatment with the Viptera corn genotype was not used.
  • Example 5 Exposure to fresh leaf tissue from two aenetic backqrounds containing the ME240913 event
  • hybrid 1 of the Helix L85 X strain Embrapa L3 ME240913 (leaves V8 and V9) was used.
  • Hybrid 2 was Hill ME240913 X Embrapa L3 strain (V5 and V6 leaves) and the hybrid control of Helix L85 X Embrapa L3 strains (V8 and V9 leaves). Both hybrids were heterozygous for the ME240913 event.
  • Fresh leaf discs measuring 1.8 cm in diameter were cut using a metal cutter and placed on 2.0% agar (1 mL / well) in 128-well plastic bioassay trays (Bio-Ba-128, CD International , Pitman, NJ, USA).
  • a cartridge caterpillar population, S. frugiperda da Embrapa Corn and Sorghum susceptible standard was used for the tests, the same used by Omoto et al 2016, as a susceptibility standard (Omoto, C., Bernardi, O., Salmeron , E., Sorgatto, RJ, Dourado, PM, Crivellari, A., Carvalho, RA, Willse, A., Martinelli, S., & Head, GP (2016) .Field-evolved resistance to CrylAb maize by S odo tera frugiperda in Brazil. Pest Management Science, 72 (9), 1727-1736.). maintained on an artificial diet and without selective pressure from insecticides or Bt.
  • a newly hatched larva (0 to 24 hours) was placed in each well containing a leaf disc using a fine brush.
  • the plates were sealed with Bio-CV-16 adhesives (CD International, Pitman, NJ, USA) and placed in an air-conditioned chamber (temperature 26 ⁇ 1 ° C; relative humidity 60 ⁇ 10%; photoperiod 14: 1 Oh clear: dark ).
  • One hundred and twenty larvae were used for each treatment.
  • This experiment evaluated the ME240913 event at the crossing of the Helix L85 X Embrapa L3 strain containing the ME240913 event (leaves collected at the V8 and V9 stage) and as a hybrid control of the Helix L85 X Embrapa L3 strains (V8 and V9 leaves). Results were compared with those obtained using leaves from the Helix L85 X Embrapa L3 hybrid control, also collected in stages V8 and V9.
  • the lyophilized transgenic corn leaves were prepared in a ratio of 1: 25 in the artificial diet of S. frugiperda presenting 4% (w / w).
  • the negative control contained 4% lyophilized non-transgenic tissue.
  • Approximately 1 L of the S. frugiperda artificial diet was prepared with an adapted protocol containing only 56% of the total amount of agar to the regular protocol. The diet was cooled and maintained at 55 ° C in a water bath as needed. For each treatment, 160 g of S. frugiperda diet were added to the plastic cup containing pre-weighed lyophilized tissue. The leaf tissue was mixed with a spatula until it was visually uniform.
  • the mixture was transferred to a thick plastic bag with a hole at one end and the diet was added to each well in a bioassay tray (CD-International 128-well trays) pressing the diet through the entire bag (like a pastry bag).
  • a bioassay tray CD-International 128-well trays
  • Approximately 0.8 ml of diet powder / leaf mixture was distributed in each of the 128 individual wells for each transgenic and non-transgenic material (total of 256).
  • a newly hatched larva (0 to 24 hours) was placed in each well using a fine brush.
  • the plates were sealed with Bio-CV-16 adhesives (CD International, Pitman, NJ, USA) and placed in a climate chamber (temperature 26 ⁇ 1 ° C; relative humidity 60 ⁇ 10%; photoperiod 14:10 h light: dark ).
  • FIG. 5 illustrates the survival result of newly hatched caterpillars of S. frugiperda (%), evaluated up to 14 days after exposure to lyophilized leaves in the proportion of 1:25 with artificial diet obtained from leaves of the ME240913 event and the control
  • Example 7 Protection against leaf damage in corn plants from Event ME240913 in fields infested by six different populations of S. frugiperda from different origins
  • Control plants were obtained from the hybrid between Helix L85 X Embrapa L3 strains.
  • the plants containing the event were obtained from the hybrid between the Helix L85 x Embrapa L3 ME240913 strains.
  • Naturally occurring populations of S. frugiperda were collected at the larvae stage in six different corn production sites in Brazil, as described: two populations were collected in the State of Paraná (Palotina and Ivatuba), two in the State of Mato Grosso (Rondonópolis and Campo Verde) and two in the State of Minas Gerais (Paracatu and Sete Lagoas).
  • the larvae were kept in laboratory conditions with an artificial diet until adulthood (cycle around ⁇ 30 days) without selective pressure from insecticides or Bt.
  • the newly hatched larvae were then infested on plants in the V4 growth stage under field conditions.
  • the treatments consisted of a combination of two hybrids and six insect populations with three replications. Plots of five rows, five meters long, were planted; whose infestation was carried out in the three central rows and which were used for the evaluation. The remaining two lines were used as a buffer zone (border).
  • the average visual damage of the leaves of the control treatment using the corn hybrid L85XL3 produced an infestation score for the six different populations of S. frugiperda ranging from 3.4 to 5.19 in the control treatment and close to zero in the hybrid expressing CrylDa . That is, the average grades of the plants evaluated in the hybrid containing the event with CrylDa were considerably lower ( ⁇ 0.1).
  • Figure 7 illustrates the results of damage scores (Davis et al, 1992 scale) from 0 to 9, caused by the feeding of different S. frugiperda populations ( ⁇ Confidence Interval, at 5% probability), in a conventional hybrid ( conv) that does not express the ME240913 event and in ME240913 maize hybrids) in the field. Evaluated at 14 days after infestation.
  • Figures 8A to 8F show the simple (conventional) control hybrid obtained from the crossing between the Helix-L85 x Embrapa-L3 strains (left in the photos) and their respective isogenic version containing the event, Helix-L85 x Embrapa-L3 with event ME240913 (on the right in the photos).
  • Each photo shows the conventional version and the version containing the ME240913 event, individually infested by each of six different populations of S.
  • frugiperda collected in Brazil in the following locations: population collected in Palotina-PR (8A), Rondonópolis-MT (8B ), Rondonópolis + Campo Verde-MT (8C), Paracatu-MG (8D), Sete Lagoas-MG (8E) and Ivatuba-PR (8F).
  • Leaf damage is visible in the controls on the left in each photo, while the hybrid containing the ME240913 event shows no damage (hybrid on the right in each photo).
  • Example 8 Bioassays using transgenic corn-resistant caterpillar populations containing the Crv1F gene
  • Tests were carried out to verify the potential of the ME240913 event in the population control of S. frugiperda resistant to the Cry1F protein.
  • the experiment was carried out in a greenhouse, with the planting of transgenic corn, containing the event ME240913 and non-transgenic corn (negative control).
  • Newly hatched caterpillars belonging to two distinct populations of S. frugiperda (a population resistant to the Cry1F gene and another population sensitive to same gene) were inoculated in corn plants (15 caterpillars per plant), in stages V7 and V8.
  • the vessels were isolated with a voile cage and the injury scores were evaluated after 07, 14 and 21 days.
  • the experimental design consisted of 04 treatments, with 05 pots each, containing from 02 to 03 corn plants per pot:
  • Treatment 1 ME240913 transgenic event infested with the population of S. frugiperda resistant to the Cry1 F protein according to Leite et al. 2016.
  • Treatment 3 Transgenic event ME240913 infested with the susceptible caterpillar population arising from the creation of maintenance of the entramatology laboratory at Embrapa Milho e Sorgo.
  • Treatment 4 Non-transgenic isogenic lineage infested with the susceptible caterpillar population arising from the creation of maintenance at the Embrapa Milho e Sorgo entomology laboratory.
  • the results indicated that the transgenic plant with the ME240913 event was able to control infestation with the population of S. frugiperda resistant to the Cry1 F protein, as well as in relation to the susceptible population, inhibiting its development (Figure 9) and protecting the plant attack by such a plague, as observed by the injury score ( ⁇ CI, P 0.05).
  • the biomass of S. frugiperda, evaluated 21 days after the release of caterpillars in different treatments, was 0% for treatments 1 and 3, and about 260 mg and 300 mg for treatments 2 and 4, respectively. In both cases, the averages are not overlapped by the CI, they differ (P 0.05).
  • This example 8 describes the use of a codon optimized CrylDa sequence to produce maize plants expressing a truncated CrylDa sequence with a high level of toxicity (100% mortality) for both wild populations and populations of S. frugiperda resistant to Cry1F .
  • the fact of identifying 100% mortality in populations of S. frugiperda resistant to Cry1 F when fresh leaves of the ME240913 event were used to feed these populations of S. frugiperda confirms the fact that the truncated protein and modified codon expressed from the CrylDa gene used it acts through a different mechanism from that existing in the commercial event that contains the Cry1F gene.

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Abstract

A presente invenção se refere a um novo evento de milho transgênico expressando a proteína inseticida Cry1Da truncada ou modificada designado evento ME240913. A invenção relata os ácidos nucléicos que são únicos ao evento ME240913. Também são definidos, iniciadores, amplicon, métodos e kits para detectar a presença do evento ME240913. A invenção também se refere a plantas de milho contendo o referido evento, usos das mesmas, métodos e composições de controle de insetos-pragas lepidópteros. A invenção descreve um evento de milho que demonstrou um alto nível de proteção de plantas contra danos de alimentação produzidos por Lepidoptera, incluindo S. frugirperda, bem como insetos resistentes a Cry1F. O evento da invenção mostrou-se altamente tóxico para S. frugirperda.

Description

Título "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO DO EVENTO TRANSGÊNICO DE MILHO ME240913 EXPRESSANDO A PROTEÍNA CRY1DA, CÉLULA, PLANTA E SEMENTE TRANSGÊNICA, USOS DAS MESMAS, PRODUTO DE PLANTA, MÉTODO, KIT E AMPLICON PARA DETECÇÃO DO EVENTO, E MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E DE CONTROLE DE INSETOS-PRAGAS LEPIDÓPTEROS"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, transformação de plantas, e reprodução de plantas e controle de praga. Mais especificamente, a invenção relaciona-se a plantas de milho (Zea mays ) transgênicas resistentes a insetos-pragas lepidópteros compreendendo um novo genótipo transgênico, usos das mesmas, métodos de controle de insetos-pragas lepidópteros e detecção da presença de ácidos nucléicos únicos às plantas de milho transgênicas em um produto de planta e composições desta.
ANTECEDENTES
Avanços consistentes em técnicas de engenharia genética têm possibilitado o desenvolvimento de plantas transgênicas de importância comercial, contendo genes heterólogos de interesse, os quais conferem características desejáveis a tais plantas. Dentre os genes de interesse podem ser citados genes que conferem às plantas resistência a herbicidas, a estresses ambientais, doenças e a pragas invertebradas.
No contexto de genes que codificam proteínas que são úteis para o controle de pragas invertebradas, pode ser citado o gene cry, oriundo da bactéria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Bt). Tal bactéria, de ocorrência natural em diversos habitats, incluindo solo, filoplano, resíduos de grãos, poeira, água, matéria vegetal e insetos, possui a característica inata de formar cristais proteicos durante a fase estacionária e/ou de esporulação. Os cristais proteicos ou delta- endotoxinas, representando de 20 a 30% da proteína total da célula (Boucias & Pendland, 1998), podem apresentar propriedades inseticidas específicas e ter várias formas, tais como: bipiramidal, esférica, retangular, cuboide e irregular. Os cristais bipiramidais apresentam uma maior frequência de toxicidade do que os cristais com outras formas, em particular contra lepidópteros.
O mecanismo de ação das proteínas Cry com efeito inseticida envolve, de forma geral, a solubilização dos cristais no intestino médio dos insetos alvo, a ação digestiva de proteases presentes no intestino desses insetos sobre as pro-toxinas, a aderência das toxinas ativas aos receptores do intestino médio e a inserção destas toxinas Cry ativas na membrana apical celular, criando canais de íons ou poros (citólise). Esses canais quando formados podem alterar a alimentação do inseto e disrupção da integridade do intestino levando a diminuição de crescimento e até a morte.
Uma vantagem do uso das proteínas Cry na agricultura é a toxicidade seletiva de cada uma dessas proteínas contra várias espécies de insetos praga, e sua natureza não tóxica a outros organismos vertebrados, tais como peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Outra vantagem das proteínas Cry é sua relativa especificidade de toxicidade em relação aos insetos-praga das diferentes culturas. Atualmente são reconhecidos diversos genes cry. Os genes cry1, cry2 e cry9 são geralmente ativos contra lepidópteros; os genes cry2, cry4A, cry10, cry11, cry17, cry19, cry24, cry25, cry27, cry29, cry30, cry32, cry39 e cry40 são geralmente ativos contra dípteros; os genes cry3, cry7 e cry8 são geralmente ativos contra coleópteros; e os genes cry5, cry12, cry13 e cry14 são geralmente ativos contra nematódeos. Produtos comerciais contendo proteínas Cry de Bt com atividade inseticida são produzidos hoje e utilizadas como biopesticidas. Esses produtos apresentam alta porcentagem de venda no mercado e têm sido utilizados a mais de 60 anos para o controle principalmente de pragas das ordens Lepidoptera e Diptera. Outro uso dessas proteínas Cry é a sua expressão em plantas transgênicas.
Apesar do uso de proteínas Bt especificas em plantas transgênicas de milho para o controle de insetos pragas, o seu uso tem produzido populações de Lepidoptera e Coleoptera resistentes às algumas dessas proteínas Bt (Tabashnik, B.E.; Brévault, T; Carrière, Y. Insect resistance to genetically engineered crops: successes and failures. ISB News Report: Agricultural and Environmental Biotechnology, Jan. 2014.). Um caso especifico é o aparecimento de populações de Spodoptera frugiperda resistentes especificamente aos genes Cry1F e Cry1A mais encontrados em condições tropicais. Spodoptera é a principal praga em várias regiões do mundo que cultivam o milho e o desenvolvimento da resistência as proteínas Cry1F e Cry1A representa um desafio significante para a produção de milho nesses locais no mundo. Populações de Spodoptera encontradas no campo identificadas como resistentes a proteínas Cry1F foram registradas (1) em 2010, Porto Rico (Storer, N.P.; Babcock, J.M.; Schlenz, M.; Meade, T.; Thompson, G.D.; Bing, J.W.; Huckaba, R.M. Discovery and characterization of field resistance to Bt maize: S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Puerto Rico. Journal of Economic Entomology, v.103, p.1031 -1038, 2010.), (2) nos Estados Unidos (Huang, F.; Qureshi, J.A.; Meagher JR, R.L.; Reisig, D. D.; Head, G.P.; Andow, D.A.; NI, X.; Kerns, D.; Buntin, G.D.; Niu, Y.; Yang, F.; Dangal, V. Cry1F resistance in fali armyworm S. frugiperda: single gene versus pyramided Bt maize.) e (3) no Brasil (Farias, J.R.; Andow, D.A.; Horiksoshi, R.J.; Sorgatto, R.J.; Fresia, P.; Santos, A.C.; Omoto, C. Field-evolved resistance to Cry1F maize by S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Crop Protection, v.64, p.150-158, 2014). No Brasil foram identificadas ainda populações de S. frugiperda resistentes a CrylAb (Omoto, C.; Berbardi, O. Salmeron, E.; Sorgatto, R. J.; Dourado, P. M.; Crivellari, A.; Carvalho, R. A.; Willse, A.; Martinelli, S.; Head, G. P. Field-evolved resistance to CrylAb maize by S. frugiperda in Brazil. Pest Management Science, Chichester, 2016). Algumas dessas populações de S. frugiperda resistentes ao Cry1F se desenvolvem rapidamente em função da pressão seletiva de produtos baseados em plantas transgênicas contendo apenas um gene cry1 ativo contra S. frugiperda.
Em função desse problema em larga escala do desenvolvimento de resistência a genes simples expressando Cry1 F em plantas de milho, cultivares comerciais são disponibilizadas contendo a combinação de dois ou mais genes inseticidas tais como crylAb, cry1F, vip3A, cry1A.105, cry2Ab, cry3Bb, cry34Ab, cry35Ab, mcry3A, ecry3.1Ab, e dvsnf7.
É critico portanto utilizar proteínas com diferentes modos de ação na chamada piramidização de proteínas que retardam a taxa de desenvolvimento da resistência. Consequentemente tem havido grande interesse na continuidade da descoberta de novas proteínas ativas contra S. frugiperda que não tenham resistência cruzada com aquelas que já apresentam resistência a, por exemplo, Cry1F.
O gene dvsnf7 é uma outra tecnologia de controle de insetos pragas que utiliza RNA de fita dupla para inibição de genes importantes para a sobrevivência do inseto. Contudo, tem baixo efeito sobre a ordem lepidóptera que é extremamente voraz causando desfoliamento em tempos muito curtos.
Existe, portanto, uma grande necessidade de desenvolvimento de novas proteínas alternativas, que são tóxicas tanto para populações de insetos do tipo selvagem como também as populações resistentes a Cry1 F/Cry1A. Essas novas proteínas devem ter alto valor para uso em estratégias de transgenia, serem passíveis de aplicação em tecnologia de transgênicos, e serem capazes de controlar pragas de insetos lepidópteros em plantações transgênicas.
Uma dessas proteínas é CrylDa, produzida por algumas cepas de Bt e conhecidas por serem tóxicas para S. frugiperda (Costa, ML, Lana, UG, Barros, EC, Paiva, LV and Valicente, FH, J of Agricultural Science, 2014, vol 6, ppi 28-136). Entretanto, a proteína CrylDa é descrita em artigos anteriores como tendo um espectro limitado de toxicidade contra pragas de lepidópteros (von Frankenhuyzen, 2009) e toxicidade variável para populações diferentes dentro de uma espécie de lepidópteros, como S. frugiperda. Por exemplo, Monnerat et al (2006). descobriram que a proteína CrylDa era tóxica para S. frugiperda coletada na Colômbia e no México, mas que foram não tóxicas para uma população coletada no Brasil (Applied and Environmental Microbiology, 2006, vol 72, p. 7029-7035).
O espectro relativamente pequeno de atividade contra pragas de lepidópteros e sua variabilidade quanto ao nível de toxicidade tem sido uma limitação importante do uso do CrylDa. Especificamente, von Frankenhuyzen (Frankenhuyzen, K. 2009. Minireview: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 101 : 1-16) relatou que CrylDa tinha o menor espectro de atividade das proteínas Cry1 contra uma variedade de espécies de lepidópteros (tóxicas contra apenas 44% das espécies testadas) em comparação com as principais proteínas Cry1A e 2Aa testadas (ativas contra > 80% das espécies testadas). Devido às limitações da proteína CrylDa nativa no espectro de atividade e sua variabilidade em nível de toxicidade, pesquisadores tem trabalhado para melhorar a estrutura da proteína Cry1 Da nativa para se tornar mais eficiente contra um espectro maior de insetos pragas da ordem Lepidoptera, mais especificamente a lagarta da espiga ( Helicoverpa zea).
O documento W020071 07302 descreve o uso de sequências de Cry1C, Cry1D ou CrylDa para produzir uma nova proteína quimérica potencialmente ativa contra a lagarta da espiga. Da mesma maneira, os documentos WO2015143311 e WO2016061377 descrevem modificações estruturais da proteína Cry1 Da na tentativa de ampliar o espectro contra outras pragas de lepidópteros, especificamente lagarta da espiga ( Helicoverpa zea) incluindo modificações na sequência de aminoácidos nativa do CrylDa ou na fusão com outras proteínas inseticidas para aumentar a atividade inseticida contra um espectro mais amplo de pragas de lepidópteros. Por causa do foco desses experimentos e descobertas terem se voltado para aumentar o espectro da atividade de CrylDa contra outros lepidópteros, essencialmente não existem dados disponíveis referentes à toxicidade de Cry1 Da ou suas variantes de ocorrência natural contra populações de S. frugiperda incluindo aquelas resistentes a Cry1F. O único estudo envolvendo a avalição de Cry1 Da expressa em plantas de milho transgênica mostrou que essa proteína tem efeito pequeno ou moderado de proteção contra os danos foliares causados por S. frugiperda (população não especificada no trabalho). E ainda, não são mostrados dados específicos sobre toxicidade desta proteína contra esta praga. Dado o nível de dano produzida no estudo citado acima, é razoável concluir que as plantas transgênicas tiveram apenas um pequeno efeito toxico sobre os insetos.
Com relação às plantas geneticamente modificadas, construções de DNA que codificam proteínas desejadas são individualmente inseridas no genoma da planta por transformação genética. Os atuais métodos de transformação das plantas utilizam principalmente a Agrobacterium tumefaciens que geralmente levam a um baixo número de cópias das construções gênicas dentro do genoma da planta hospedeira. As construções genicas são compostas de um promotor, região codificadora e terminador. O promotor é o elemento regulador e determinante da expressão tanto temporalmente como especialmente do gene. Geralmente para expressão de quantidade suficientemente grande, como é o caso de produção de proteína inseticida para controle de insetos-pragas lepidópteros, as construções utilizam promotores constitutivos como por exemplo o que controla a expressão do gene da ubiquitina em milho.
A integração da construção de DNA no genoma do hospedeiro é aleatória, e essa inserção aleatória no DNA do genoma da planta pode impactar um gene cujo produto é crítico para a sobrevivência da planta, tornando a planta resultante inviável. Além disso, a inserção aleatória pode ter como alvo uma região do genoma do hospedeiro que pode influenciar negativamente a expressão do gene de interesse, independentemente do uso de promotores constitutivos. Em outros exemplos, a superprodução do produto genético da construção tem efeitos prejudiciais para a célula, levando principalmente à diminuição da produtividade. Devido a esses problemas em potencial, é comum produzir dezenas (em alguns casos centenas) de eventos diferentes e rastrear esses eventos para um único evento que possua os padrões e níveis desejados de expressão transgênica para fins comerciais.
Um evento que possui níveis ou padrões desejados de expressão transgênica é útil para ser transferido para outros backgrounds genéticos da mesma espécie através de um cruzamento sexual tradicional. Existem relatos de genes que mesmo em expressão de níveis altos e constitutivos no genótipo progenitor, não necessariamente apresentaram a mesma resposta em outros backgrounds genéticos. Dessa forma é desejável que, além de uma expressão espacial e temporal adequadas, eventos de transformação apresentem uma variação baixa de expressão do gene em cruzamentos com outros genótipos (diferentes backgrounds).
Neste caso, a descendência de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica da planta hospedeira transformante original. Essa estratégia é usada para garantir a expressão genética confiável em várias variedades que estão bem adaptadas às condições locais de crescimento. Isso é impactado por ter inserido o DNA integrado em locais ideais dentro do genoma, proporcionando, assim, os melhores níveis de expressão temporal e espacial, estabilidade em várias gerações de criação e em várias origens genéticas. Como tal, a localização genômica física do DNA inserido torna-se uma característica fundamental da eficácia do produto resultante e, portanto, é nova.
Também seria de grande interesse estabelecer um método capaz de detectar a presença de um evento de transformação específico, a fim de determinar a presença do referido evento para teste de qualidade de sementes, liberação de campo e em plantas ou amostras processadas. Tais métodos poderiam ser utilizados também para determinar e acompanhar a segregação do gene em progénies de cruzamentos sexuais, rastreabilidade do evento em cruzamentos e detecção em alimentos derivados das plantas recombinantes. Um método de detecção do ácido nucléico bem conhecido, mas não limitado, é a amplificação de DNA in vitro pela técnica do PCR (Polimerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia) usando iniciadores de polinucleotídeo. O outro método é a hibridização do DNA usando sondas de ácido nucléico. Os métodos de detecção podem utilizar iniciadores ou sondas baseadas em elementos comuns entre diferentes construções gênicas ou baseadas em regiões especificas da construção.
Pelas razões mencionadas acima, há uma necessidade de identificação de métodos de detecção baseados em sequências novas de ácido nucléico que são únicas ao evento de milho transgênico, úteis para identificar o evento de milho transgênico e para detectar ácidos nucléicos do evento de milho transgênico em um produto de planta, bem como de kits compreendendo os reagentes necessários para o uso na detecção destes ácidos nucléicos em um produto de planta.
SUMÁRIO
A presente invenção refere-se a um evento de milho transgênico, designado ME240913 compreendendo um novo genótipo transgênico que contém uma sequência de ácido nucléico crylDa otimizada para expressão em milho. A sequência de codificação crylDa codifica uma variante truncada da proteína nativa CrylDa de SEQ ID NO: 3 que surpreendentemente confere alto nível de proteção das plantas contra danos nas folhas produzidos por várias populações de S. frugiperda que ocorrem naturalmente no Brasil (tipo selvagem e resistente ao Cry1 F). É importante ressaltar que o tecido foliar do evento ME240913 produz uma alta toxicidade inesperada para pragas de insetos lepidópteros, como insetos Noctuidae, particularmente S. frugiperda. Além da sequência codificante crylDa, a presente invenção também fornece outros ácidos nucléicos que são únicos ao evento ME240913, a saber a sequência de um amplicon resultante de reação PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência de junção 5’, a sequência de junção 3’, sequências flanqueadoras 5’ e 3’, e/ou complementos das mesmas. A invenção também fornece amplicons compreendendo os ácidos nucléicos únicos do evento ME240913, plantas de milho transgênico compreendendo os ácidos nucléicos únicos do evento ME240913 e sementes das plantas de milho transgênico.
A presente invenção também se refere a métodos para produzir uma planta de milho transgênica compreendendo os ácidos nucléicos únicos da invenção pelo cruzamento sexuado de uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora para produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração, em que pelo menos uma das referidas plantas progenitoras compreende um ácido nucléico único para o evento ME240913, seleção de uma planta descendente de primeira geração que seja resistente a infestação por insetos-pragas lepidópteros, autopolinização da planta descendente de primeira geração para produzir uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração, e seleção, dentre as plantas descendentes de segunda geração, de uma planta que seja resistente a insetos-pragas lepidópteros.
A presente invenção descreve ainda métodos para controlar insetos-pragas lepidópteros, tais como da família Noctuidae, particularmente S. frugiperda. As plantas de milho compreendendo o evento ME240913 e métodos da presente invenção são eficazes para o controle de populações insetos-pragas lepidópteros específicas, tal como S. frugiperda, que se tornaram resistentes às plantas expressando proteína Cry1F.
Métodos para a produção de sementes de milho híbridas também são revelados. Tais métodos compreendem as etapas de plantio de sementes de uma primeira linhagem de milho congénita compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913 e de sementes de uma segunda linhagem congénita tendo um genótipo diferente, cultivo de plantas de milho resultantes das referidas sementes plantadas até a época de floração, emasculação das flores das plantas de uma das linhagens congénitas de milho, cruzamento sexual das duas diferentes linhagens congénitas uma com a outra, e colheita da semente híbrida assim produzida.
Uma amostra da semente, e consequentemente plantas de milho cultivado da semente, compreendendo ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-126224. As plantas do milho transgênico da invenção apresentam essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas correspondentes das plantas de milho não-transgênicos isogênicos em adição àquelas conferidas nas plantas de milho pelo novo genótipo da invenção. Produtos de planta e extratos das plantas de milho ME240913, tecidos e sementes também são fornecidos pela presente invenção.
A presente invenção fornece ainda métodos de introgressão do evento ME240913 em linhagens de milho por meio do cruzamento sexual de plantas contendo o evento ME240913, tais como, por exemplo, mas não limitado as plantas obtidas a partir das sementes depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-126224.
De acordo com a presente invenção, o evento ME240913 pode ser combinado com outros eventos transgênicos de milho por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como piramidação de genes. O ensinamento de que ME240913 produz um alto nível de controle contra danos às plantas produzidos por várias populações de S. frugiperda brasileiras (incluindo insetos resistentes a Cry1 F) estabelece que o novo evento é tóxico para as populações de S. frugiperda resistentes a Cry1 F no Brasil. Estes resultados também indicam que o evento ME240913 atua através de um mecanismo de ação distinto do que o Cry1F e, portanto, o evento do milho será muito eficaz quando combinado com outros genes inseticidas incorporados na planta usando piramidação gênica. O evento ME240913 também expressa o gene de resistência ao herbicida pat (bar). Portanto, o evento ME240913 também pode ser usado para reduzir a taxa de resistência a herbicidas usando a piramidação gênica.
Exemplos de piramidação gênica incluem, mas não são limitados a eventos de resistência a herbicida e a insetos-pragas. Por meio de tais métodos, o evento ME240913 pode ser combinado, por exemplo, com eventos contendo um ou mais genes selecionados de um gene pat, um gene cp4 epsps (5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato sintase), um gene crylAb, um gene cry1F, um gene vip3A, um gene cry1A.105, um gene cry2Ab, um gene cry3Bb, um gene cry34Ab, um gene cry35Ab, um gene mcry3A, ecry3.1Ab, um gene dvsnf7, e um gene amy797E.
A presente invenção também fornece um par de iniciadores de polinucleotídeo que compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo, os quais funcionam juntos na presença de um DNA molde do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico do evento ME240913, em que o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende uma parte da sequência flanqueadora 5’, da sequência flanqueadora 3’, e/ou de seus complementos, em que o segundo iniciador de polinucleotídeo compreende uma parte de uma sequência inserida específica, ou seus complementos, e em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.
A presente invenção se refere a plantas de milho transgênico bem como a células e tecidos da mesma, os quais compreendem uma molécula de ácido nucléico da invenção.
Em uma modalidade, a planta de milho transgênica é resistente a insetos-pragas lepidópteros. Em uma modalidade de maior preferência, a planta de milho transgênica é altamente resistente a danos nas folhas produzidos por populações de S. frugiperda de ocorrência natural encontradas em regiões produtoras de milho no Brasil.
Em outra modalidade, a planta de milho transgênica é altamente tóxica para S. frugiperda, produzindo 100% de mortalidade quando alimentada com tecido de folhas frescas. Em outra modalidade, a planta de milho transgênica é uma planta altamente tóxica a S. frugiperda, como evidenciado por alta mortalidade e morbidade a S. frugiperda após diluição do folhas liofilizadas do evento ME240913 na relação de 1 :25 (peso/peso) com dieta artificial. A alta toxicidade do tecido foliar liofilizado de planta do evento ME240913 mostra que o referido evento é muito eficiente no controle de S. frugiperda e útil para piramidização de vários genes de controle de insetos.
São também reveladas sementes de milho, que compreendem uma molécula de ácido nucléico da invenção. Em uma modalidade, as sementes de milho estão depositadas na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-126224 e são usadas para produzir plantas de milho transgênicas.
Ainda, a presente invenção se refere a um produto das plantas de milho evento ME240913, tecido ou semente, as quais compreendem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção ou seus complementos, e na qual a sequência é detectável no produto de planta usando uma amplificação do ácido nucléico ou método de hibridização do ácido nucléico.
A invenção contempla ainda produtos de planta, tais como, mas não limitados a grão de milho, forragem, farinha de milho, polvilho de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte com produtos derivados de milho.
A presente invenção também fornece kits para detecção de ácidos nucléicos que são únicos para o evento ME240913, os quais compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é um iniciador ou sonda compreendendo uma sequência de ácido nucléico compreendendo uma sequência específica, e os complementos das mesmas, e em que o referido iniciador ou sonda, ao amplificar ou hibridizar uma sequência de ácidos nucléicos alvo em uma amostra seguida da detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo, é diagnóstico para a presença das sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913 na amostra.
São ainda revelados métodos para detecção da presença de pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, em que os referidos métodos compreendem as seguintes etapas: colocar a amostra em contato com um par de iniciadores específicos da presente invenção, executar uma reação de amplificação de ácido nucléico de forma a produzir um amplicon, e detectar o referido amplicon, em que o amplicon compreende sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913, ou seus complementos, e em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.
Outro método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos do milho compreende as etapas de: colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com o DNA genômico do evento ME240913 e não hibridiza sob condições de alta estringência com o DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913, e de seus complementos, submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência, e detectar a hibridização da sonda com a molécula de ácido nucléico, em que o referido evento de milho ME240913 apresenta uma sequência específica contendo a inserção do evento e sequências flanqueadoras no genoma do milho.
Ainda, são revelados método para controle de insetos- pragas lepidópteros de plantas de milho, em que as plantas de milho compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913, ou seus complementos, em que os referidos métodos compreendem as etapas de plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo as referidas sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913 em uma área de cultivo de plantas de milho suscetíveis a insetos-pragas lepidópteros.
Além disso, são descritos métodos para o controle de pragas de insetos lepidópteros de plantas de milho, em que as plantas de milho contêm proteína CrylDa truncada e modificada, produzida a partir da expressão de sequências únicas de uma sequência ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913, levando ao acúmulo dos níveis de expressão em folhas da proteína truncada e modificada CrylDa os quais são altamente protetores contra os danos foliares causados por populações que ocorrem naturalmente no Brasil e são também de alta toxicidade contra S. frugiperda como pode ser visto nas altas taxas de mortalidade nos estudos realizados.
São ainda revelados o uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo o evento ME240913 para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.
Estes e outros aspectos da invenção ficarão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir.
DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos codificadora da proteína Cry1 Da truncada, otimizada para expressão em milho presente no evento ME240913.
SEQ ID NO: 2 é a sequência de ácido nucleico da construção completa do transgene do evento ME240913 compreendo na seguinte ordem: a região terminadora 3’ UTR do gene Tvsp; região codificadora do gene fosfinotricina acetil transferase (bar), região de enhancer traducional (tev); região promotora do gene CaMV 35S duplicado, região promotora do gene da ubiquitina (ubi); sequência de ácido nucleico códon-otimizada do gene crylDa (SEQ ID NO: 1); e região terminadora 3’ UTR do gene da nopalina sintase.
SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos da proteína CrylDa truncada expressa pelo evento ME240913.
SEQ ID NO: 4 é a sequência de junção 5’.
SEQ ID NO: 5 é a sequência de junção 3’. SEQ ID NO: 6 é a sequência flanqueadora 5’.
SEQ ID NO: 7 é a sequência flanqueadora 3’.
SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência flanqueadora 5’ (nucleotídeos 1-116), a sequência completa do inserto (nucleotídeos 117-6306) e a sequência flanqueadora 3’ (nucleotídeos 6307-6424) do evento ME240913.
SEQ ID NO: 9 é uma sequência de iniciador forward útil na amplificação da sequência de junção 5’.
SEQ ID NO: 10 é uma sequência de iniciador reverse útil na amplificação da sequência de junção 5’. SEQ ID NO: 11 é uma sequência ilustrativa de amplicon resultante de PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência junção 5’.
SEQ ID NO: 12 é uma sequência de sonda útil na detecção da sequência de junção 5’. SEQ ID NO: 13 é uma sequência de iniciador forward útil na amplificação da sequência de junção 3’.
SEQ ID NO: 14 é uma sequência de iniciador reverse útil na amplificação da sequência de junção 3’.
SEQ ID NO: 15 é uma sequência ilustrativa de amplicon resultante de PCR utilizando iniciadores específicos para confirmar a sequência junção 3’.
SEQ ID NO: 16 é uma sequência de sonda útil na detecção da sequência de junção 3’.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um diagrama representativo do inserto do evento ME240913 e das respectivas sequências de nucleotídeos que definem o referido evento, incluindo sequências de junção e flanqueadoras 5’ e 3’ do genoma de milho.
A Figura 2 é um diagrama representativo das construções gênicas Ubi::cry1Da::NOS e 2x35S::bar::Tvsp do inserto do evento ME240913 inseridas nos sítios das enzimas Hindlll e EcoRI do vetor binário pTF 101.1, entre as bordas direita e esquerda do TDNA.
A Figura 3 mostra o resultado da avaliação do evento ME240913 com relação ao controle de S. frugiperda utilizando folhas frescas de milho por um período de 5 dias. Amostra de folha fresca de milho não OGM (a) e milho geneticamente modificado com CrylDa (b) são mostradas.
A Figura 4 mostra o resultado de ensaios de exposição de S. frugiperda ao tecido fresco de folhas de dois backgrounds genéticos contendo o evento ME240913. Sobrevivência de S. frugiperda (%), foi avaliada até 3 dias após a exposição das larvas recém eclodidas a folhas frescas de milho controle e folhas de milho expressando evento ME240913 em dois diferentes backgrounds genéticos (híbrido e RC1 F1) são mostrados. A Figura 5 mostra a taxa de sobrevivência de larvas recém eclodidas após 14 dias de exposição as folhas liofilizadas na diluição de 1 :25 em dieta artificial do controle e o evento ME240913.
A Figura 6 mostra os tamanhos das lagartas vivas após 7 (A) e 10 (B) dias de exposição a tecido liofilizado de folha diluído 1:25 do Evento ME240913 na dieta artificial em comparação com dieta controle. A Figura 7 mostra o resultado de nível de dano nas folhas das plantas de milho controle (conv) e do Evento ME240913 (OGM) em parcelas infestadas por seis populações diferentes de S. frugiperda.
A Figura 8 mostra fotografias de danos em plantas de milho controle (esquerda) e do Evento ME240913 (direita) em campo infestado por populações de S. frugiperda de Palotina/PR (8A), Rondonópolis/MT (8B), Rondonópolis + Campo Verde/MT (8C), Paracatu/MG (8D), Sete Lagoas/MG (8E), e Ivatuba/PR (8F).
A Figura 9 se refere ao resultado em gráfico da nota de injúria (±IC, P = 0,05) causada pela infestação de S. frugiperda em escala de Carvalho, 1970. Trat 1 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada crylDa da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas resistentes à Cry1 F; Trat 2 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas resistentes à Cry1 F; Trat 3 = milho transgênico compreendendo a molécula de ácido nucléico códon-otimizada cryl Da da presente invenção (SEQ ID NO: 1) + População de lagartas suscetíveis; Trat 4 = Linhagem de milho L3 não transgênico + População de lagartas suscetíveis.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Salvo se definido de outro modo, todos os termos da técnica, anotações e outras terminologias científicas aqui utilizadas destinam-se a ter os significados normalmente compreendidos pelos técnicos no assunto do campo da presente invenção. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos no presente documento com a finalidade de trazer clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve ser interpretada, necessariamente, como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido no estado da técnica. As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos pelo presente documento são geralmente bem compreendidos e empregados usando a metodologia convencional pelos técnicos no assunto. Conforme apropriado, os processos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo quando indicado de outra forma.
Vale ressaltar que a presente invenção, onde for apropriado, não se limita à metodologia, protocolos, linhagem de células, gêneros ou espécies de animais, construções e reagentes específicos descritos, os quais, de forma óbvia, podem variar. Além disso, a terminologia utilizada no presente documento é apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.
Ao longo do presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a”, ou formas singulares de qualquer termo ou expressão, incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.
Ao longo do presente documento, a palavra “compreende”, e quaisquer variações como “compreendem” ou “compreendendo”, devem ser interpretadas como “termos abertos”, podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, não possuindo caráter limitativo.
Ao longo do presente documento, a palavra “consiste”, e quaisquer variações como “consistem” ou “consistindo”, devem ser interpretadas “termos fechados”, não podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, possuindo caráter limitativo.
Ao longo do presente documento, os valores exatos ou faixas de valores exatos fornecidos com relação a um fator, quantidade, concentração ou preferência particular devem ser interpretados como também fornecendo valores ou faixas de valores aproximados correspondentes, tal como por meio da expressão “cerca de”.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “preferencialmente”, “particularmente”, “por exemplo”, “como”, “tal como”, “mais particularmente” e similares, e suas variações, devem ser interpretadas como características inteiramente opcionais, realizações preferenciais ou exemplificações possíveis não exaustivas, sem conferir caráter limitativo de escopo.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “ácidos nucleicos”, “nucleotídeos” e similares devem ser interpretadas como ácidos nucleicos ou nucleotídeos que ocorrem naturalmente, sintéticos ou artificiais. Compreendem desoxirribonucleotídeos (DNA) ou ribonucleotídeos (RNA) ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridos dos mesmos na configuração sense (senso) ou antisense (antissenso), de fita simples ou fita dupla. Salvo quando disposto de outra forma, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas desta (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como as sequências explicitamente indicadas. O termo “ácido nucleico” é utilizado de maneira alternada no presente documento com os termos “gene”, “cDNA”, “mRNA”, “oligonucleotídeo”, “molécula de ácido nucleico” ou “iniciador”.
As expressões “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico” e similares referem-se a um polímero de bases de DNA ou RNA de fita simples ou fita dupla, lido da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Inclui DNA cromossômico, plasmídeo de autorreplicação, polímeros infecciosos de DNA ou RNA que desempenham um papel principalmente estrutural, entre outros. Também se referem a uma lista consecutiva de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras, que representam nucleotídeos ou genes, conforme usualmente empregados no campo técnico da presente invenção.
Como usado neste documento, o termo “amplificado” significa a construção de cópias múltiplas de uma molécula de ácido nucléico ou cópias múltiplas complementares à molécula de ácido nucléico usando pelo menos uma das moléculas de ácido nucléico como um padrão. Sistemas de amplificação incluem, mas não estão limitados ao sistema de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sistema da reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada em sequência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas de Q-Beta Replicase, sistema de amplificação baseada na transcrição (TAS), e amplificação pelo deslocamento da fita (SDA). Ver, por exemplo: Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D. H. Persing, e outros, Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). O produto da amplificação é descrito como um amplicon.
Uma “sequência codificante” é uma sequência de ácido nucléico que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferencialmente, o RNA é então traduzido em um organismo para produzir uma proteína.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “similaridade de sequência”, “identidade” e similares, com relação a uma outra sequência, deve ser interpretada como a porcentagem de nucleotídeos na sequência que é idêntica aos nucleotídeos de outra sequência, após o alinhamento das sequências e a introdução de gaps, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência. De acordo com a presente invenção, a expressão “pelo menos 70% de similaridade”, por exemplo, é definida como similaridade ou identidade de 70 a 100%. Preferencialmente, a porcentagem de similaridade é de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.
Um “gene” é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e que, apesar da sequência codificante mencionada acima, pode compreender outras, primariamente sequências de ácido nucléico regulatórias, responsáveis pelo controle da expressão, ou seja, a transcrição e a tradução da região codificante. Um gene também pode conter outras sequências não traduzidas 5' e 3' e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons.
“Gene de interesse” refere-se a qualquer gene que, quando transferido a uma planta, confere à planta uma característica desejada, tais como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, melhora do desempenho em um processo industrial ou capacidade reprodutiva alterada.
“Genótipo” conforme usado neste documento é o material genético herdado das plantas de milho de origem. O genótipo ME240913 refere-se ao material genético heterólogo transformado dentro do genoma de uma planta bem como o material genético flanqueando a sequência inserida.
Uma sequência de ácido nucléico “heteróloga” é uma sequência de ácido nucléico não naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual está introduzida, incluindo a ocorrência não natural de cópias múltiplas de uma sequência de ácido nucléico.
Uma sequência de ácido nucléico “homóloga” é uma sequência de ácido nucléico naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual está introduzida. “Alta toxicidade” do tecido da folha de milho refere-se à capacidade de amostras de tecido da folha produzirem 100% de mortalidade para espécies de lepidópteros, como S. frugiperda, dentro de 7 dias após a exposição ao tecido da folha. Outra parte da definição de "alta toxicidade" é a capacidade do tecido foliar seco, diluído 1 :25 com tecido foliar convencional de milho, de produzir > 95% de mortalidade e morbidade dentro de 14 dias após a exposição à dieta do tecido foliar.
‘Operacionalmente ligada” refere-se à associação das sequências de ácido nucléico em um fragmento de ácido nucléico único para que a função de uma afete a função da outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante ou a um RNA funcional quando este é capaz de afetar a expressão da sequência codificante ou do RNA funcional (isto é, quando a sequência codificante ou do RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes em orientação senso ou antissenso podem ser operacionalmente ligadas às sequências regulatórias.
“Proteção de plantas”, conforme usado neste documento, refere-se à capacidade da planta de milho intacta de resistir aos danos foliares produzidos por pragas suscetíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando à proteção contra danos nas folhas produzidos por S. frugiperda. A proteção pode ser observada examinando plantas ou fotografias de plantas a fim de comparar os danos observados para plantas de milho controle com aqueles observados em planta de milho que expressa Cryl Da. "Proteção de plantas", conforme usado neste documento, também se refere à capacidade da planta intacta de resistir a danos produzidos por pragas de lepidópteros suscetíveis, incluindo, mas não se limitando ao uso de métodos padrão e aceitos de classificação de danos às plantas.
“Iniciadores” ou “primers”, conforme usados neste documento, são ácidos nucléicos isolados que são aneladas a uma fita de DNA alvo complementar pela hibridização do ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e então estendido ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, tal como DNA polimerase. Pares ou conjuntos de iniciadores podem ser usados para amplificação de uma molécula de ácido nucléico, por exemplo, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação do ácido nucléico.
Uma “sonda” é um ácido nucléico isolado ao qual é ligado um marcador detectável convencional ou uma molécula repórter, tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima. Tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a uma fita de DNA genômico do evento de milho ME240913. O DNA do evento ME240913 pode ser de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do evento ME240913. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se unem especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.
Iniciadores e sondas possuem geralmente entre 10 e 15 nucleotídeos ou mais de comprimento. Iniciadores e sondas também podem possuir pelo menos 20 nucleotídeos ou mais de comprimento, ou pelo menos 25 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 30 nucleotídeos ou mais de comprimento. Tais iniciadores e sondas hibridizam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Iniciadores e sondas de acordo com a presente invenção podem ter sequência completa complementar com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo e que retêm a habilidade para hibridizar as sequências alvo podem ser projetadas por métodos convencionais.
“Condições de estringência” ou “condições de hibridização estringentes” incluem referências a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar à sua sequência alvo, para um grau maior detectável do que a outras sequências. Condições de estringência são dependentes da sequência alvo e irão diferir dependendo da estrutura do polinucleotídeo. Pelo controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências alvo que serão 100% complementares à sonda (sonda homóloga) podem ser identificadas. Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma inadequação nas sequências de forma que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sonda heteróloga). Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização dos ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 “OverView of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid sonda assays”, Elsevier: New York; e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel e outros, Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience: New York (1995), e também Sambrook e outros (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5a Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós- hibridização, sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final os fatores críticos. De forma geral, as condições de hibridização de alto estringência e de lavagem são selecionadas por estarem aproximadamente a 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. ATm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibridiza em uma sonda perfeitamente compatível. Tipicamente, sob condições de alta estringência uma sonda irá hibridizar em sua sequência alvo, mas não em outras sequências.
Um exemplo de condições de hibridização de alta estringência para a hibridização dos ácidos nucléicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares num filtro em "Southern Blot" ou "Northern Blot" é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42°C, a hibridização sendo executada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem de estringência muito alta é 0,15M NaCI a 72°C por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem de alta estringência é uma lavagem 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição do buffer SSC).
Um bom exemplo de condições de hibridização para a presente invenção incluem hibridização em 7% SDS, 0,25 M NaP04 pH 7,2 a 67°C durante a noite, seguida por duas lavagens em 5% SDS, 0,20 M NaP04 pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem, e duas lavagens em 1% SDS, 0,20 M NaP04 pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem. Um bom exemplo de lavagem de estringência média para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um bom exemplo de lavagem de estringência baixa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4- 6x SSC a 40°C por 15 minutos.
Para sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos, condições de alta estringência tipicamente envolvem concentrações de sal de menos de aproximadamente 1 ,0 M Na íon, tipicamente concentrações de aproximadamente 0,01 a 1 ,0 M Na íons (ou outros sais) num pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente de pelo menos de aproximadamente 30°C. Condições de alta estringência também podem ser alcançadas com a adição de agentes destabilizantes como a formamida. Geralmente, um sinal para taxa de ruído de 2x (ou superior) do que o observado para uma sonda não relacionada no ensaio específico de hibridização indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucléicos que não hibridizam entre si sob condições de alta estringência são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificarem forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a máxima degeneração do códon permitida pelo código genético.
A seguir alguns bons exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para hibridizar as sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas às sequências de nucleotídeos de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência preferencialmente hibridiza para a sequência de nucleotídeos de referência em 7% de Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50°C, preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaP04, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C. As sequências da presente invenção podem ser detectadas usando todas as condições acima. Para fins de definir a invenção, são usadas as condições de alta estringência.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “promotor”, “sequência promotora” e similares devem ser interpretadas como uma sequência de DNA que, uma vez operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse, é capaz de controlar a transcrição da sequência de nucleotídeos de interesse em RNA. Um promotor está localizado a 5’ (ou à montante) em relação ao local de início de transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse cuja transcrição em mRNA ele controla e fornece um sítio para a ligação específica da RNA polimerase e outros fatores de transcrição para o início da transcrição. Pode incluir outras sequências reguladoras, conhecidas por um técnico no assunto. De acordo com a presente invenção, o promotor pode ser heterólogo ou homólogo à respectiva célula ou hospedeiro. Uma sequência de ácido nucleico é “heteróloga” a um organismo ou a uma segunda sequência de ácido nucleico se ela se origina a partir de uma espécie diferente ou, se a partir da mesma espécie, é modificada de sua forma original.
Conforme usado neste documento, o termo "único" para o evento ME240913 significa características distintivas do evento ME240913. Desta forma, ácidos nucléicos únicos para o evento ME240913 não são encontrados em outras plantas de milho que não sejam ME240913.
Conforme usado neste pedido de patente, o termo “milho” refere-se à espécie Zea mays e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com milho, incluindo espécies selvagens de milho.
“Kit de Detecção”, conforme usado neste pedido de patente, refere-se a um kit de partes úteis na detecção da presença ou ausência de ácidos nucléicos únicos para plantas ME240913 em uma amostra, onde o kit compreende sondas de ácido nucléico e/ou iniciadores da presente invenção, que formam híbridos especificamente sob condições de alta estringência com uma sequência alvo de DNA, e outros materiais necessários para possibilitar métodos de amplificação ou hibridização do ácido nucléico. Ao longo do presente documento, o termo “transformação” e similares deve ser interpretado como um processo para a introdução de DNA heterólogo em uma célula, tecido vegetal ou planta. Pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais, como pelo uso de vários métodos bem conhecidos na técnica, seja em uma célula hospedeira procarionte ou eucarionte. O método é geralmente selecionado com base na célula hospedeira que será transformada e pode incluir, mas não se limitar a, infecção virai, eletroporação, lipofecção, bombardeamento de partículas (biobalística) e mediada por Agrobacterium. Ao longo do presente documento, o termo “transgene” deve ser interpretado como qualquer sequência de ácido nucleico que é introduzida em uma célula por meio de manipulações experimentais, podendo ou não ser integrado ao genoma. Um transgene pode ser uma “sequência de DNA endógeno”, ou “sequência de DNA exógeno” (ou seja, “heterólogo”). A expressão “sequência de DNA endógeno” refere- se a uma sequência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. A expressão “sequência de DNA exógeno” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que não é naturalmente encontrada na célula na qual é introduzida. O termo “transgênico”, quando se refere a um organismo transformado, significa um organismo transformado com uma molécula de DNA recombinante que compreende preferencialmente um promotor adequado operacionalmente ligado a uma sequência de DNA de interesse.
Ao longo do presente documento, o termo “vetor” deve ser interpretado como uma construção contendo uma sequência de DNA que é operativamente ligada a uma ou mais sequências controle adequadas capazes de levar à expressão da dita sequência de DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para o controle de tal transcrição, uma sequência codificante dos sítios de ligação adequados do mRNA ao ribossomo, e às sequências que controlam o término da transcrição e tradução, por exemplo.
Podem ser diversos os vetores adequados para a realização da presente invenção. Esses vetores podem ser replicados de forma autónoma no organismo hospedeiro ou ser replicados pelo cromossomo. O vetor pode, também, ser um plasmídeo. De acordo com o presente documento, os termos “plasmídeo” e “vetor” são algumas vezes utilizados de forma alternada. Preferencialmente, o vetor, de acordo com a presente invenção, compreende a molécula de ácido nucleico crylDa compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , conforme definida no presente documento.
Conforme usado neste o termo "evento" transgênico refere- se a uma planta recombinante produzida pela transformação e regeneração de um tecido ou célula da planta com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de expressão que inclui um gene de interesse. O termo "evento" refere-se ao transformante original e/ou à descendência do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à descendência produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra linhagem de milho. Ainda, depois do retrocruzamento repetido com um parente, o DNA introduzido e o DNA flanqueador dos parentes transformados estão presentes na descendência do cruzamento no mesmo local do cromossomo. O termo "evento" também refere-se ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que esperar-se-ia ser transferido para uma descendência que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem progenitora que inclui o DNA inserido (por exemplo: o transformante original e a descendência resultante do cruzamento) e uma linhagem progenitora que não contém o DNA inserido. Normalmente, a transformação do tecido da planta produz múltiplos eventos, cada um representa a inserção de uma construção de DNA dentro de uma localização diferente no genoma de uma célula de planta. Baseado na expressão do transgene ou outras características desejáveis, um evento particular é selecionado. Desta forma, os termos "evento ME240913" e “evento” podem ser usados de forma intercambiável.
Uma planta do milho ME240913 resistente aos insetos pode ser reproduzida primeiramente pelo cruzamento sexual de uma primeira planta de milho progenitora consistindo em uma planta de milho cultivada a partir de uma planta de milho ME240913 transgênico, tal como uma planta de milho ME240913 cultivada a partir da semente depositada no ATCC sob número de acesso: PTA-126224, e a descendência desta derivada da transformação com o cassete de expressão dos meios de execução da presente invenção que conferem resistência a insetos-pragas lepidópteros, com uma segunda planta de milho progenitora pode ou não apresentar resistência a insetos-pragas lepidópteros, desta forma produzindo uma pluralidade de primeiras plantas da primeira geração; e depois pela seleção de uma primeira planta da primeira geração que é resistente a insetos-pragas lepidópteros; e autopolinização planta descendente de primeira geração, desta forma produzindo uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração; e finalmente pela seleção de plantas descendentes de segunda geração resistentes a insetos-pragas lepidópteros. Estas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da planta da primeira geração resistente a insetos-pragas lepidópteros ou da planta da segunda geração resistente a insetos-pragas lepidópteros com a segunda planta de milho progenitora ou uma terceira planta de milho progenitora, desta forma produzindo uma planta de milho que seja resistente a insetos-pragas lepidópteros. Tais métodos podem ser utilizados para a introgressão do evento ME240913 em linhagens de milho bem como para a piramidação do evento ME240913 com outros eventos transgênicos.
Ao longo do presente documento, as expressões “célula hospedeira”, “organismo hospedeiro” e similares devem ser interpretadas como sendo o organismo hospedeiro específico ou a célula alvo específica, mas também como sendo os descendentes ou potenciais descendentes desses organismos ou células. Uma vez que, devido à mutação ou aos efeitos ambientais, determinadas modificações podem surgir em gerações sucessivas, esses descendentes não precisam ser necessariamente idênticos à célula parental. No entanto, ainda estão incluídos no escopo de proteção da presente invenção. De acordo com a presente invenção, as células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. Preferencialmente, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção, é uma célula hospedeira de planta. Preferencialmente, compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, que é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e complementos das mesmas.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “célula vegetal transgênica”, “planta transgênica” e similares devem ser interpretadas como células ou plantas que possuem e preferencialmente expressam, por meio de manipulações experimentais, um transgene, bem como também se referem à progénie de uma planta transgênica e gerações subsequentes de plantas, conforme acima.
Ao longo do presente documento, o termo “planta” e similares deve ser interpretado como sendo a parte ou o todo do organismo vegetal. Por “parte”, neste contexto, entende-se células vegetais e tecidos, órgãos e partes de plantas em todas as suas manifestações, como sementes, folhas, anteras, fibras, espiga, raízes, pelos de raízes, caules, embrião, calos, cotilédones, pecíolos, material coletado, tecido vegetal, tecido reprodutivo e culturas de células. As plantas transgênicas, de acordo com a presente invenção, podem ser geradas e autofecundadas ou cruzadas com outros indivíduos a fim de obter plantas transgênicas adicionais. Plantas transgênicas também podem ser obtidas por propagação vegetativa de células vegetais transgênicas.
Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “praga”, “insetos-pragas lepidópteros” e similares devem ser interpretadas como insetos da ordem Lepidoptera, incluindo, mas sem se limitar, às famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, Crambidae e Tineidae, mais particularmente noctuídeos Spodoptera sp., particularmente S. frugiperda (Noctuidae) e cambídeos Diatraea sp., particularmente D. saccharalis (Crambidae).
Uma das realizações da presente invenção refere-se a um método de controle de insetos-pragas lepidópteros de plantas de cultivo, incluindo, mas não limitado a lagartas. Qualquer método de controle de insetos-pragas lepidópteros de plantas de cultivo está incluído no escopo da presente invenção, não sendo de particular relevância para a obtenção das realizações da invenção, desde que as plantas de cultivo, de acordo com a presente invenção, compreendam pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, que é selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e complementos das mesmas, em que o método compreende, preferencialmente, o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que é única ao evento ME240913, conforme definida no presente documento, em uma área de cultivo de plantas de cultura suscetíveis a insetos-pragas lepidópteros. A classe “CrylDa” de proteínas compreende também seus homólogos. “Homólogo” significa que a proteína indicada ou polipeptídeo sustentam uma relação definida para outros membros da classe CrylDa de proteínas.
Esta invenção refere-se a uma linhagem geneticamente melhorada de milho que produz uma proteína CrylDa truncada, modificada para controle de insetos-pragas lepidópteros. A invenção é particularmente projetada para um evento de milho transgênico designado ME240913 compreendendo um novo genótipo, bem como para composições e métodos para detectar ácidos nucléicos únicos ao evento ME240913 em uma amostra biológica. A invenção é ainda projetada para plantas de milho compreendendo o genótipo ME240913, para sementes transgênicas das plantas de milho, e para métodos para produzir uma planta de milho compreendendo o genótipo ME240913 pelo cruzamento de um milho cruzado com si mesmo compreendendo o genótipo ME240913 ou outra linhagem de milho. Plantas de milho compreendendo o genótipo ME240913 da invenção são úteis no controle de insetos-pragas lepidópteros incluindo, mas não limitado à família Noctuidae e/ou Crambidae, preferencialmente S. frugiperda e D. saccharalis. Plantas de milho do evento ME240913 mostram proteção das plantas contra pragas sensíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando a S. frugiperda resistente a Cry1F e a Cry1A, do tipo selvagem
Em outra modalidade, as plantas de milho mostram alta toxicidade para pragas suscetíveis de lepidópteros, incluindo, mas não se limitando a S. frugiperda.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento ME240913.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que se liga uma molécula de DNA heteróloga introduzida no genoma do evento ME240913 para o genoma do DNA no evento ME240913 compreendendo pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 30 ou mais) nucleotídeos contíguos da molécula do DNA heteróloga e pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 30 ou mais) nucleotídeos contíguos do DNA do genoma flanqueando o sítio de inserção da molécula de DNA heteróloga. Estão também incluídas as sequências de nucleotídeos que compreendem 10 ou mais nucleotídeos da sequência de inserção contígua do evento ME24091 3 e pelo menos um nucleotídeo do DNA flanqueador do evento ME240913 adjacente à sequência de inserção. Tais sequências de nucleotídeos são únicas, e diagnosticam o evento ME240913. A hibridização ou amplificação do ácido nucléico do DNA genômico do evento ME240913 produz um amplicon compreendendo tais sequências únicas que permite diagnosticar o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 8, e os complementos das mesmas.
Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência de junção do evento ME240913, na qual uma sequência de junção transpõe a junção entre um cassete de expressão heteróloga inserido dentro do genoma do milho e o DNA do genoma do milho pareando o local de inserção a qual é única para o referido evento ME240913 e é diagnóstica para o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de junção é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e os complementos destas.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada que une uma molécula de DNA heteróloga ao genoma da planta de milho no evento ME240913, a qual compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5, e os complementos das mesmas.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento ME240913, em que a referida sequência de nucleotídeos codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é SEQ ID NO: 8 e/ou o complemento da mesma.
Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em 4, 5 e 8, e os complementos destas. Em um aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada está contida em uma semente de milho depositada na “American Type Culture Collection” sob o número de acesso PTA-126224, ou em plantas cultivadas a partir da referida semente.
Em uma modalidade da presente invenção, um amplicon compreendendo uma sequência de nucleotídeos única para o evento ME240913 é fornecida. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 11 e 15, e os complementos das mesmas.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba os iniciadores da sequência flanqueadora para detectar o evento ME240913. Tais iniciadores da sequência flanqueadora compreendem uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da sequência flanqueadora 5' ou 3'. Em um aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 6 (sequência flanqueadora 5'), ou os complementos da mesma. Em outro aspecto desta modalidade, o iniciador da sequência flanqueadora 5' apresenta a sequência de SEQ ID NO: 9 ou o complemento da mesma. Em outro aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 7 (a sequência flanqueadora 3'), ou os complementos da mesma. Ainda, em um outro aspecto desta modalidade, o iniciador da sequência flanqueadora 3' apresenta a sequência de SEQ ID NOs: 12 ou o complemento da mesma.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um molde de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Em um aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é escolhido de SEQ ID NO: 9, 10, ou os complementos das mesmas. Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 14, e os complementos das mesmas. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o amplicon que é produzido pelo par de iniciadores compreende SEQ ID NO: 11 , 15, ou os complementos das mesmas.
Em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Onde o primeiro iniciador é igual ou é complementar a uma sequência do genoma da planta de milho que pareia com o ponto de inserção de uma sequência de DNA heteróloga inserida no genoma do evento ME240913, e a segunda sequência de iniciador de polinucleotídeos é igual ou é complementar à sequência de DNA heteróloga inserida no genoma do evento ME240913.
Em um aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador de polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da 5 posição 1-116 e 6307-6424 de SEQ ID NO: 8 e os complementos das mesmas. Em um outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9, 13, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos 10 contíguos da posição 117-6306 de SEQ ID NO: 8, ou complementos da mesma. Ainda, em um outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 10, 14, e os complementos das mesmas.
Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do 15 polinucleotídeo, que é apresentado na SEQ ID NO: 9, e o segundo iniciador do polinucleotídeo, que é apresentado na SEQ ID NO: 10, funcionam juntos na presença de um modelo de DNA do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico para o evento ME240913. Em uma modalidade deste aspecto, o 20 amplicon compreende a sequência de nucleotídeos apresenta na SEQ ID NO: 11.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento ME240913 em uma amostra 25 compreendendo ácidos nucléicos de milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores, (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, de forma a produzir um amplicon, e (c) detectar o amplicon.
Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a
BO um método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácido nucléico do milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento ME240913 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e complementos das mesmas; (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detectar hibridização da sonda para a molécula de ácido nucléico. A detecção pode ser feita por qualquer meio bem conhecido na técnica incluindo fluorescência, quimiluminescência, radiológica, imunológica e outros. No caso em que a hibridização é usada como um meio para a amplificação de uma sequência particular para produzir um amplicon que é diagnóstico para o evento ME240913, a produção e a detecção do amplicon por qualquer meio bem conhecido na técnica é um indicativo da hibridização com sequência alvo onde pelo menos uma sonda ou um iniciador é utilizado(a).
O termo “amostra biológica” define uma amostra derivada de uma planta de milho que contém ou é suspeita de conter um ácido nucléico compreendendo entre cinco e dez nucleotídeos em qualquer lado do ponto no qual um ou outro dos dois pontos terminais da sequência de DNA heteróloga inserida é unida à sequência de DNA genômico dentro do cromossomo no qual a sequência de DNA heteróloga foi inserida, neste documento também conhecido como sequências de junção. Além disto, a sequência de junção compreende tão pouco quanto dois nucleotídeos: aqueles sendo o primeiro nucleotídeo dentro do DNA flanqueador ou genômico adjacente ao covalentemente unido ao primeiro nucleotídeo dentro da sequência de DNA heteróloga inserida. Em um aspecto desta modalidade, a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 4, 5, e os complementos destas.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere a um kit para a detecção dos ácidos nucléicos que são únicos ao evento ME240913 em uma amostra biológica. O kit compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico de comprimento suficiente de polinucleotídeos contíguos para funcionar como um iniciador ou sonda em um método para detecção do ácido nucléico. A amplificação ou a hibridização com uma sequência de ácido nucléico alvo em uma amostra seguida da detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo diagnostica a presença de sequências de ácido nucléico únicas ao evento ME240913 na amostra. O kit ainda compreende outros materiais necessários para permitir a amplificação ou a hibridização do ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, uma molécula de ácido nucléico contida no kit compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 9, 10, 12, 13, 14, 16, e os complementos das mesmas. Em outro aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico é um iniciador selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 9, 10, 13, 14, e os complementos das mesmas. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o amplicon compreende SEQ ID NO: 11 , 15, ou os complementos das mesmas. Uma variedade de métodos de detecção pode ser usada, incluindo, mas não limitados a TAQMAN, amplificação térmica, reação em cadeia por ligase, Southern-blot, ELISA e métodos de detecção colorimétrica e fluorescente. Em particular, a presente invenção fornece kits para detectar a presença da sequência alvo, isto é, pelo menos a sequência SEQ ID NO: 4, 5, ou uma sequência de junção em uma amostra contendo ácido nucléico genômico do ME240913. O kit é compreendido por pelo menos dois polinucleotídeos capazes de se ligarem ao sítio alvo ou substancialmente adjacente ao sítio alvo e pelo menos um meio para detectar a ligação do polinucleotídeo no sítio alvo. Os meios de detecção podem ser por fluorescência, quimioluminescência, colorimetria ou isotopia e podem ser acoplados pelo menos com métodos imunológicos para detectar a ligação. O kit também pode detectar a presença do sítio alvo em uma amostra, isto é, pelo menos a sequência SEQ ID NO: 4, 5, ou uma sequência de junção do evento ME240913, levando vantagem de duas ou mais sequências de polinucleotídeos que juntas são capazes de se ligar às sequências de nucleotídeo adjacentes ou dentro de aproximadamente 100 pares de base da sequência alvo e que podem ser estendidas entre si para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para detectar a proteína CrylDa em uma amostra biológica, o método compreende: (a) extrair proteína do tecido do evento ME240913; (b) analisar a proteína extraída usando um método imunológico compreendendo anticorpos específicos para a proteína CrylDa produzida pelo evento ME240913; e (c) detectar a ligação do anticorpo mencionado com a proteína CrylDa.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um produto de planta derivado de uma planta de milho do evento ME240913, tecido, ou semente, onde o produto de planta compreende uma sequência de nucleotídeos que é igual ou é complementar à sequência que é única ao evento ME240913, e onde a sequência é detectável no produto de planta usando um método de amplificação ou hibridização de ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, a sequência de nucleotídeos é igual ou é complementar a pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 4, 5 e complementos das mesmas. Em um outro aspecto desta modalidade, o produto de planta é selecionado do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos à base de milho.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um extrato de um produto de planta derivado de uma planta de milho ME240913, tecido ou semente compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é igual ou é complementar a uma sequência que é única ao ME240913. Em um aspecto desta modalidade, a sequência é detectável no extrato usando um método de amplificação ou hibridização de ácido nucléico. Em outro aspecto desta modalidade, a sequência é igual ou é complementar a pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 4 e 5. Ainda, em outro aspecto desta modalidade, o produto de planta é selecionado dentre o grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena, e cereais fabricados no todo ou em parte que contenham produtos à base de milho.
Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma planta de milho, ou partes da mesma, e a sementes de uma planta de milho compreendendo o genótipo do evento transgênico ME240913, onde o genótipo compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 4, 5 ou complementos das mesmas. Um exemplo de semente de milho compreende as moléculas de ácido nucléico da invenção que foram depositadas no dia 28/10/2019 e atribuídas o número de acesso PTA-126224. Em um aspecto desta modalidade, a planta de milho é das linhagens de milho Hill. Contudo, um técnico com conhecimentos comuns na área reconhecerá que o genótipo ME240913 pode ser introduzido dentro de qualquer variedade de planta que possa ser reproduzida com milho, incluindo espécies selvagens de milho, e desta forma, a lista de linhagens reproduzidas desta modalidade não deve ser limitada.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma planta de milho compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda sequência de DNA ligadas para formar uma sequência de nucleotídeos contíguos, onde a primeira sequência de DNA está dentro de uma sequência de junção e compreende pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos contíguos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1-116 e 6307-6424 de SEQ ID NO: 8, e os complementos das mesmas, em que a segunda sequência de DNA está dentro da sequência de DNA heteróloga inserida e compreende pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos contíguos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 117-6306 de SEQ ID NO: 8, e os complementos das mesmas; e em que a primeira e segunda sequências de DNA são úteis como sondas ou iniciadores de nucleotídeo para detectar a presença das sequências de ácido nucléico do evento de milho ME240913 em uma amostra biológica. Em um aspecto desta modalidade, os iniciadores de nucleotídeo são usados em um método de amplificação de DNA para amplificar uma sequência de DNA alvo do DNA padrão extraído da planta de milho e a planta de milho é identificável dentre outras plantas de milho pela produção de uma amplicon correspondendo a uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 11 , 15 e complementos das mesmas.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma planta de milho, onde o genótipo ME240913 confere a resistência a insetos-pragas lepidópteros à planta de milho. Em um aspecto desta modalidade, o genótipo transgênico conferindo resistência a insetos- pragas lepidópteros à planta de milho da invenção compreende um gene crylDa truncado ou modificado.
Em outra modalidade, a planta de milho expressa concentrações adequadas na folha da proteína crylDa truncada e modificada para conferir altos níveis de proteção da folha da planta contra danos por S. frugiperda. Em outra modalidade, verificou-se que o alto nível de proteção de folhas de plantas ocorre em várias populações de S. frugiperda atual no Brasil, incluindo populações conhecidas por possuir altas frequências de S. frugiperda resistente a cry1F. Em outra modalidade, a inserção do gene cryl Da da planta de milho ME20913 produz expressão adequada da proteína CrylDa truncada e modificada em tecido foliar para produzir alta toxicidade para espécies susceptíveis de lepidópteros, incluindo S. frugiperda. Em ainda outra modalidade, a planta de milho ME20913 é altamente tóxica para S. frugiperda resistente a Cry1F.
Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta de milho resistente a insetos-pragas lepidópteros compreendendo as etapas de: cruzar sexualmente uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora, em que a referida primeira ou segunda planta de milho progenitora compreende o DNA evento ME240913, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração; selecionar uma planta descendente de primeira geração compreendendo o evento ME240913. Preferencialmente o método compreende ainda autopolinizar a planta descendente de primeira geração, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de segunda geração; e selecionar a partir das plantas descendentes de segunda geração, uma planta compreendendo o evento ME240913. Em uma modalidade, a etapa de seleção pode ser feita com base na avalição de resistência a insetos-pragas lepidópteros, detecção do DNA do evento ME240913 de acordo com os métodos ensinados na presente invenção ou tratamento com herbicida e seleção de plantas resistentes ao herbicida promovida pelo gene PAT (bar) de resistência a herbicida contido no evento ME240913. Em uma modalidade preferida o método para produzir uma planta de milho transgênica compreendendo os ácidos nucléicos únicos da invenção compreende o cruzamento sexuado de uma primeira planta de milho progenitora contendo o evento ME240913 com uma segunda planta de milho progenitora não transgênica para produzir plantas descendentes, seleção de uma planta descendente de primeira geração que seja resistente a infestação por insetos-pragas lepidópteros, repetição do ciclo de retrocruzamento por 4 vezes, autopolinização da planta progenitora contendo o evento ME240913 para obtenção de plantas em homozigose.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de sementes de milho híbridas compreendendo as etapas de: plantar sementes de uma primeira linhagem de milho congénita compreendendo o evento ME240913 e sementes de uma segunda linhagem congénita tendo um genótipo diferente; cruzar sexualmente as duas diferentes linhagens congénitas uma com a outra; e colher a semente híbrida produzida desta maneira. Em uma modalidade preferencial o método compreende pelo menos uma das etapas de cultivar plantas de milho resultantes das referidas plantadas até a época de floração e emascular as flores das plantas de uma das linhagens congénitas de milho. Em um aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os descendentes femininos. Em outro aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os descendentes masculinos. A presente invenção também se refere a sementes híbridas produzidas pelo método incorporado e a plantas híbridas cultivadas da semente.
Os exemplos subsequentes têm unicamente o propósito de ilustrar uma ou mais incorporações preferenciais da invenção e não são para serem construídos como limitador do escopo da invenção. EXEMPLOS
Exemplo 1 - Construção qênica
A construção gênica contendo o promotor da ubiquitina, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 codificando a sequência de aminoácidos da proteína inseticida CrylDa truncada de SEQ ID NO: 3, otimizada para expressão em milho e a região 3’ do gene da nopalina sintase de Agrobacterium foi sintetizada no Serviço de Clonagem de DNA (http://www.dna-cloning.com/) no vetor pUC flanqueado pelos sítios de restrição Hindlll e EcoRI. A construção foi transferida do pUC para o vetor pTF101 (Paz et al., 2004) usando as enzimas de restrição EcoRI e Hindlll e ligase T4, de acordo com as instruções do fabricante (LifeTech). A seleção do plasmídeo recombinante pTF101 UBI:: cry1Da::NOS foi realizada através da transformação do E. coli DH5a usando a espectinomicina e a clonagem foi confirmada por sequenciamento e clivagem com as enzimas Hindlll e BamHI. Para o sequenciamento foi utilizado o kit comercial BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). DNA plasmidial de duas colónias de bactéria contendo a construção gênica foi sequenciado e comparado com a sequência de interesse e constatou-se que elas eram idênticas.
Uma vez confirmada a clonagem do gene UBI::cry1 Da::NOS no plasmídeo pTF101 , esta construção gênica foi utilizada para transformar a cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA101 , utilizando a metodologia de eletroporação (BioRad/MicroPulser). O mesmo procedimento de confirmação da transformação acima foi realizado para comprovação da presença do vetor binário recombinante contendo o gene crylDa em A. tumefaciens. O DNA plasmidial foi isolado de colónias de A. tumefaciens, amplificado com primers para detecção do gene bar.
Agrobacterium tumefaciens EHA 101 contendo as construções gênicas de interesse (UBI::cry1 Da::NOST e 35S::bar::35T) foi utilizada na transformação genética de milho.
Exemplo 2 - Transformação genética de embriões imaturos de milho Hill via Agrobacterium tumefaciens
O genótipo utilizado neste protocolo de transformação é o milho Hill (Armstrong et al., 1991), conforme protocolo por Frame et al. (2002), com pequenas modificações. Brevemente, para a transformação deste genótipo, foram coletados embriões imaturos entre 1 ,8 - 2,0 mm de comprimento (10 -12 dias após a polinização). Espigas utilizadas para a coleta dos embriões foram mergulhadas em uma solução de 1 :1 de água sanitária comercial (2,5% hipoclorito de sódio) e H2O destilada com 1-2 gotas de Tween 20, por 20 minutos. Em seguida, foram enxaguadas com água destilada estéril por 5 minutos, duas vezes.
Os embriões imaturos foram coletados com 0 auxílio de uma espátula a partir de um corte superficial dos grãos. Para a transferência da construção genica para 0 milho utilizou-se Agrobacterium tumefaciens EHA101. A partir de uma cultura estoque da A. tumefaciens contendo a construção genica de interesse, mantida em glicerol a -80 °C, uma estria foi feita em meio YEP (5 g.L 1 de extrato de levedura; 10 g.L 1 de peptona; 5 g.L-1 de NaCI; 15 g.L-1 de bacto ágar) contendo os antibióticos necessários (espectinomicina 100 mg.L1 e 50 mg.L1 kanamicina) e a placa foi incubada por 2 a 3 dias a 28 °C placa mãe). Para a transformação genética, uma estria da Agrobacterium utilizando uma colónia isolada da placa mãe foi feita em meio YEP contendo os antibióticos necessários. A placa foi incubada por 2 a 5 dias a 19 °C. Em seguida, a Agrobacterium foi ressuspendida em meio de infecção (4,0 g.L 1 de N6 sais; 68,4 g.L 1 de sacarose; 36,0 g.L 1 de glicose; 0,7 g.L 1 de prolina; 1 ,5 mg.L 1 de 2,4-D; 1 ,0 mL.L 1 N6 vitaminas (1000X = 1 ,0 g.L-1 de tiamina HCI; 0,5 g.L-1 de piridoxina HCI; 0,5 g.L-1 ácido nicotínico); pH 5,2) suplementado com 100 mM de acetoseringona até atingir uma OD550 = 0,3-0, 4 e, incubada em agitador a ~150 rpm, 23 °C por 2 horas.
Para a infecção dos embriões imaturos de milho, 50 a 100 embriões foram coletados em 1 ml_ de meio de infecção acrescido de acetoseringona. Após a coleta, os embriões foram enxaguados duas vezes, 1 ml_ da cultura bacteriana foi adicionado e a suspensão incubada por cinco minutos a 23 °C. Após a infecção, os embriões foram transferidos para a superfície de meio de co-cultivo (4,0 g.L1 de N6 sais; 1 ,5 mg.L 1 de 2,4-D; 30,0 g.L-1 de sacarose; 0,7 g.L-1 de prolina; 1 ,0 mL.L 1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L 1 de AgN03; 100 mM de acetoseringona; 300 mg.L-1 de L-cisteína; 3,0 g.L-1 de phytagel; pH 5,8) com o escutelo voltado para cima. As placas foram incubadas no escuro a 20 °C por 3 a 5 dias. Após o co-cultivo os embriões foram transferidos para o meio de repouso (4,0 g.L 1 de N6 sais; 1 ,5 mg.L 1 de 2,4-D; 30,0 g.L 1 de sacarose; 0,5 g.L 1 de MES; 0,7 g.L-1 de prolina; 1,0 mL.L 1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L-1 de AgN03; 100 mg.L-1 de Tioxin; 3,0 g.L- 1 de phytagel; pH 5,8) a 28 °C (escuro) por 7 a 15 dias. Em seguida, os embriões foram transferidos para o meio de seleção (4,0 g.L-1 de N6 sais; 1 ,5 mg.L-1 de 2,4-D; 30,0 g.L-1 de sacarose; 0,5 g.L-1 de MES; 0,7 g.L 1 de prolina; 1 ,0 mL.L 1 N6 vitaminas (1000X); 0,85 mg.L 1 de AgN03; 100 mg.L-1 de Tioxin; 1 ,5 e 3,0 mg/L de bialaphos; 3,0 g.L-1 de phytagel; pH 5,8) (25 embriões/placa). Subcultivos destes embriões em meio seletivo são realizados a cada 15 dias até a seleção de calos crescendo vigorosamente.
Calos selecionados foram transferidos para meio de regeneração (4,62 g.L-1 de MS sais; 60,0 g.L-1 de sacarose; 100 mg.L-1 de mio-inositol; 1 ,0 mL. L 1 de MS vitaminas (1000X); 1 ,5 mg/L de bialaphos; 4,0 g.L-1 de phytagel; pH 5,8) e incubados a 26 ± 2 °C (escuro) por 15 a 21 dias. Calos prontos para a germinação, possuindo aspecto seco e coloração branca opaca, foram transferidos para o meio de germinação (4,62 g.L-1 de MS sais; 30,0 g.L-1 de sacarose; 100 mg.L-1 de mio-inositol; 1 ,0 mL.L-1 de MS vitaminas (1000X = 0,5 g.L-1 de tiamina HCI; 0,5 g.L-1 de piridoxina HCI; 0,05 g.L-1 ácido nicotínico); 3,0 g.L-1 de phytagel; pH 5,8) (12 calos por placa), 25 °C, 80-100 pE/m2/sec de intensidade luminosa, 16 horas de fotoperíodo.
Plântulas com raízes bem desenvolvidas e as estruturas foliares medindo cerca de 5 cm de comprimento (14 a 20 dias), foram transplantadas para vasos em casa de vegetação contendo uma mistura de solo e matéria orgânica (2/3 de solo e 1/3 de matéria orgânica (TDP 30/15) produzida comercialmente passando por uma fase de aclimatação.
Após obtenção do genótipo Hill com o evento ME240913, o evento foi introgredido do genótipo Hill para a linhagem tropical L3, utilizando seleção assistida por marcadores moleculares.
Exemplo 3 - Bioensaios
Visando avaliar a suscetibilidade do milho transgênico expressando a proteína CrylDa truncada a S. frugiperda, realizaram-se bioensaios em laboratório. Os bioensaios foram realizados da seguinte maneira: lagartas recém-eclodidas da espécie S. frugiperda foram utilizadas para infestar folhas de plantas de milho transgênico crylDa e a isolinha não transgênica (5 lagartas por planta). Os estádios de desenvolvimento de milho utilizados foram V7 e V8 e os experimentos foram realizados em recipientes plásticos e incubados em câmara de crescimento aclimatadas (28C e 60% umidade, luminosidade 12 hrs). As avaliações das notas de danos ocorreram após 05 dias. Em cada caso, o delineamento experimental foi composto por: “grupo experimental” (evento ME240913 de milho transgênico contendo a construção crylDa truncada) e “grupo controle” (milho não transgênico).
Os parâmetros avaliados foram: nota de injúria utilizando a escala proposta por Carvalho, 1970 (0: planta com folhas não- danificadas; 1: planta apresentando folhas raspadas; 2: planta apresentando folhas furadas; 3: planta apresentando folhas rasgadas; 4: planta apresentando lesão no cartucho; e 5: planta apresentando cartucho destruído); sobrevivência de lagartas (contou-se o número de lagartas sobreviventes em cada vaso); e biomassa de lagartas (utilizando balança de precisão de quatro casas decimais).
Exemplo 4 - Bioensaios para controle de S. fruaioerda utilizando o evento transqênico de milho ME240913
Ensaios com S. frugiperda inicialmente, o evento ME240913 foi testado para o controle dessa praga. Sementes do evento foram germinadas em casa de vegetação e quando as plantas atingiram o estádio entre V10 e V12 folhas as duas folhas mais novas de cada planta foram utilizadas em bioensaios com S. frugiperda. Foram realizadas três repetições, com cinco lagartas por repetição. Utilizou-se folhas dos milhos Hill e L3 como controle negativo (lagartas crescem normalmente) e folhas do milho com a tecnologia Viptera® como controle positivo (lagartas não conseguem crescer). Neste primeiro teste foi verificado que o evento ME240913 possuía boa capacidade de controlar o desenvolvimento da lagarta, atingindo 100% de mortalidade (Tabela 1).
Tabela 1 - Avaliação do evento ME240913 com relação ao controle de S. fruaioerda
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O bioensaio com este evento foi repetido, utilizando-se quatro repetições com 20 lagartas por repetição, e os resultados confirmaram que este evento possui a capacidade de controlar o desenvolvimento da S. frugiperda (Tabela 2). A Figura 3 é representativa dos bioensaios de alimentação com S. frugiperda em milho não-transgênico e milho transgênico da presente invenção. Nesse experimento não se utilizou o tratamento com o genótipo de milho Viptera.
Tabela 2 - Avaliação de eventos transqênicos de milho com relação ao controle de S. frugiperda fbioensaio 2)
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Exemplo 5 - Exposição ao tecido fresco de folhas de dois backqrounds aenéticos contendo o evento ME240913
Nesse experimento foi utilizado hibrido 1 da linhagem Helix L85 X linhagem Embrapa L3 ME240913 (folhas V8 e V9). O híbrido 2 foi de Hill ME240913 X linhagem Embrapa L3 (folhas V5 e V6) e o controle o híbrido das linhagens Helix L85 X Embrapa L3 (folhas V8 e V9). Ambos os híbridos eram heterozigotos para o evento ME240913.
Discos de folhas frescas de 1,8 cm de diâmetro foram cortados usando um cortador metálico e colocados em ágar a 2,0% (1 mL/poço) em bandejas de bioensaio de plástico com 128 poços (Bio- Ba-128, C-D International, Pitman, NJ, EUA).
Utilizou-se para os ensaios uma população de laboratório lagarta do cartucho, S. frugiperda da Embrapa Milho e Sorgo suscetível padrão, a mesma utilizada por Omoto et al 2016, como padrão de suscetibilidade (Omoto, C., Bernardi, O., Salmeron, E., Sorgatto, R. J., Dourado, P. M., Crivellari, A., Carvalho, R. A., Willse, A., Martinelli, S., & Head, G. P. (2016). Field-evolved resistance to CrylAb maize by S odo tera frugiperda in Brazil. Pest Management Science, 72(9), 1727-1736.). mantida em dieta artificial e sem pressão seletiva de inseticidas ou Bt.
Uma larva recém eclodida (0 a 24 horas) foi colocada em cada poço contendo um disco foliar usando um pincel fino. As placas foram seladas com adesivos Bio-CV-16 (C-D International, Pitman, NJ, EUA) e colocadas em câmara climatizada (temperatura 26 ± 1 °C; umidade relativa de 60 ± 10%; fotoperíodo 14:1 Oh claro :escuro). Cento e vinte larvas foram usadas para cada tratamento.
A mortalidade foi avaliada após 24 horas de exposição e, posteriormente, diariamente, até 100% de mortalidade. Considerou-se como lagartas mortas aquelas que não respondem ao toque do pincel.
Folhas frescas de milho expressando o tecido foliar do evento ME240913 produziram mortalidade por S. frugiperda a partir do dia dois após alimentadas e a mortalidade de 100% após três dias. O mesmo padrão de mortalidade rápida e completa foi observado nos dois híbridos testados. O resultado é ilustrado na Figura 4. Exemplo 6 - Exposição a tecido liofilizado de folha diluído 1:25 do Evento ME240913 na dieta artificial
Esse experimento avaliou o evento ME240913 no cruzamento da linhagem Helix L85 X linhagem Embrapa L3 contendo o evento ME240913 (folhas coletadas no estádio V8 e V9) e como controle o híbrido das linhagens Helix L85 X Embrapa L3 (folhas V8 e V9). Resultados foram comparados com aqueles obtidos utilizando folhas do hibrido controle Helix L85 X Embrapa L3, também coletadas nos estádios V8 e V9.
Aproximadamente sete plantas dos dois híbridos de milho descritos acima foram colhidas após 27 dias de crescimento. As folhas entre os estádios de desenvolvimento V8 e V9 foram colocadas em sacos plásticos congelados com nitrogénio líquido e transferidos para um freezer ultrabaixo de -80°C. Os tecidos das folhas foram liofilizados utilizando dessecação em congelamento. Após a liofilização, o material foi moído usando um moedor de tecidos (IKA A11 Basic). As amostras das folhas liofilizadas e moídas foram armazenadas em copos plásticos com tampas seladas em temperatura ambiente.
As folhas de milho transgênico liofilizadas foram preparadas em uma proporção de 1 :25 na dieta artificial de S. frugiperda apresentando 4% (p/p). O controle negativo continha 4% de tecido não transgênico liofilizado. Aproximadamente 1 L da dieta artificial de S. frugiperda foi preparado com um protocolo adaptado contendo apenas 56% da quantidade total de ágar ao protocolo regular. A dieta foi resfriada e mantida a 55 °C em banho-maria conforme necessário. Para cada tratamento, 160 g de dieta de S. frugiperda foram adicionadas ao copo de plástico contendo tecido liofilizado pré-pesado. O tecido da folha foi misturado com uma espátula até ficar visualmente uniforme. A mistura foi transferida para um saco plástico grosso com um furo em uma das extremidades e a dieta foi adicionada em cada um dos poços em uma bandeja de bioensaio (bandejas CD-Internacional de 128 poços) pressionando a dieta através de todo o saco (como um saco de confeiteiro). Aproximadamente 0,8 ml de mistura de pó de dieta / folha foram distribuídos em cada um dos 128 poços individuais para cada material transgênico e não transgênico (total de 256).
Utilizou-se a população de S. frugiperda suscetível padrão descrita no ensaio supracitado.
Uma larva recém eclodida (0 a 24 horas) foi colocada em cada um dos poços usando uma escova fina. As placas foram seladas com adesivos Bio-CV-16 (C-D International, Pitman, NJ, EUA) e colocadas em câmara climática (temperatura 26 ± 1 ° C; umidade relativa de 60 ± 10%; fotoperíodo 14:10 h claro: escuro).
A mortalidade foi registrada nos dias 3, 6-10 e 13-14 dias após a exposição. Larvas visivelmente inativas que não se moviam quando tocadas com uma escova fina eram consideradas mortas.
Nesse experimento foi observado mortalidade de 67% no dia 7 e 97% no dia 14 (125/128 larvas). As três larvas restantes apresentaram inibição significativa no crescimento em comparação com as larvas que se alimentavam de tecido foliar controle (testemunha). A Figura 5 ilustra o resultado de sobrevivência de lagartas recém eclodida de S. frugiperda (%), avaliada até 14 dias após exposição a folhas liofilizadas na proporção de 1:25 com dieta artificial obtidas a partir de folhas do evento ME240913 e o controle Exemplo 7 - Proteção contra danos às folhas em plantas de milho do Evento ME240913 em campos infestados por seis populações diferentes de S. frugiperda de diferentes origens
As plantas de controle foram obtidas do híbrido entre as linhagens Helix L85 X Embrapa L3. As plantas contendo o evento foram obtidas do híbrido entre as linhagens Helix L85 x Embrapa L3 ME240913. Populações de ocorrência natural de S. frugiperda foram coletadas no estádio de larvas em seis locais distintos de produção de milho no Brasil, conforme descrito: duas populações foram coletadas no Estado do Paraná (Palotina e Ivatuba), duas no Estado de Mato Grosso (Rondonópolis e Campo Verde) e duas no Estado de Minas Gerais (Paracatu e Sete Lagoas). As larvas foram mantidas em condições de laboratório com dieta artificial até a fase adulta (ciclo em torno de ~ 30 dias) sem pressão seletiva de inseticidas ou Bt. As larvas recém eclodidas foram então infestadas nas plantas no estágio de crescimento V4 em condições de campo.
Os tratamentos consistiram em uma combinação de dois híbridos e seis populações de insetos com três repetições. Foram plantadas parcelas de cinco linhas com cinco metros de comprimento; cuja infestação foi realizada nas três fileiras centrais e as quais foram utilizadas para a avaliação. As duas linhas restantes foram usadas como zona tampão (bordadura).
A avaliação do dano causado pela alimentação da lagarta nas plantas de milho foi realizada de acordo com Davis et al. 1992. Em resumo, foi utilizada uma escala de 0 a 9, na qual 0 representava plantas sem nenhum dano e 9 representava plantas com folhas expandidas destruídas. Assim o aumento da unidade na escala representou maiores níveis de lesões nas folhas.
Os escores de campo foram registrados 7, 14 e 21 dias após as exposições.
A média de dano visual das folhas do tratamento controle utilizando o hibrido de milho L85XL3 produziram uma nota de infestação para as seis diferentes populações de S. frugiperda variando de 3,4 a 5,19 no tratamento controle e próximos de zero no híbrido expressando CrylDa. Ou seja,, médias de notas das plantas avaliadas no híbrido contendo o evento com CrylDa foram consideravelmente menores (<0,1).
A Figura 7 ilustra os resultados de notas de dano (escala de Davis et al, 1992) de 0 a 9, causada pela alimentação de diferentes populações S. frugiperda (± Intervalo de Confiança, a 5% de probabilidade), em híbrido convencional (conv) que não expressa o evento ME240913 e em híbridos de milho ME240913) em campo. Avaliado aos 14 dias após a infestação.
As Figuras 8A a 8F mostram o híbrido simples controle (convencional) obtido do cruzamento entre as linhagens Helix-L85 x Embrapa-L3 (à esquerda nas fotos) e sua respectiva versão isogênica contendo o evento, Helix-L85 x Embrapa-L3 com evento ME240913 (à direita nas fotos). Cada foto mostra a versão convencional e a versão contendo o evento ME240913, infestadas individualmente por cada uma de seis diferentes populações de S. frugiperda coletadas no Brasil, nos seguintes locais: população coletada em Palotina-PR (8A), Rondonópolis-MT (8B), Rondonópolis+Campo Verde-MT (8C), Paracatu-MG (8D), Sete Lagoas-MG (8E) e Ivatuba-PR (8F). Danos nas folhas são visíveis nos controles à esquerda em cada foto, enquanto o híbrido contendo o evento ME240913 não mostra danos (híbrido à direita em cada foto).
Exemplo 8 - Bioensaios utilizando populações de lagartas resistentes ao Milho transqênico contendo o gene Crv1F
Ensaios foram realizados para verificar o potencial do evento ME240913 no controle de população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1F.
O experimento foi realizado em casa de vegetação, com o plantio do milho transgênico, contendo o evento ME240913 e do milho não transgênico (controle negativo). Lagartas recém eclodidas pertencentes a duas populações distintas de S. frugiperda (uma população resistente ao gene Cry1F e outra população sensível ao mesmo gene) foram inoculadas nas plantas de milho (15 lagartas por planta), em estágio V7 e V8. Após a infestação, os vasos foram isolados com gaiola voil e as avaliações das notas de injúria ocorreram após 07, 14 e 21 dias. O delineamento experimental foi composto por 04 tratamentos, com 05 vasos cada, contendo de 02 a 03 plantas de milho por vaso:
Tratamento 1 : Evento transgênico ME240913 infestado com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1 F de acordo com Leite et al. 2016.
Tratamento 2: Linhagem isogênica L3 não transgênica infestada com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1F de acordo com Leite et al 2016.
Tratamento 3: Evento transgênico ME240913 infestado com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.
Tratamento 4: Linhagem isogênica não transgênica infestada com a população de lagartas suscetíveis oriunda de criação de manutenção do laboratório de entomologia da Embrapa Milho e Sorgo.
Os resultados indicaram que a planta transgênica com o evento ME240913 foi capaz de controlar a infestação com a população de S. frugiperda resistente à proteína Cry1 F, tão bem quanto em relação à população suscetível, inibindo seu desenvolvimento (Figura 9) e protegendo a planta do ataque por tal praga, conforme observado pela nota de injúria (±IC, P=0,05). O percentual de sobrevivência de S. frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 65% e 35% para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. A biomassa de S. frugiperda, avaliada 21 dias após a liberação de lagartas em diferentes tratamentos, foi de 0% para os tratamentos 1 e 3, e cerca de 260 mg e 300 mg para os tratamentos 2 e 4, respectivamente. Em ambos os casos, as médias não são sobrepostas pelo IC, diferem entre si (P=0,05).
Este exemplo 8 descreve o uso de uma sequência códon otimizada de CrylDa para produzir plantas de milho expressando uma sequência truncada de CrylDa com alto nível de toxicidade (100% de mortalidade) tanto para as populações selvagens como para populações de S. frugiperda resistentes a Cry1F. O fato de identificar 100% de mortalidade em populações de S. frugiperda resistentes a Cry1 F quando folhas frescas do evento ME240913 foram utilizadas para alimentar essas populações de S. frugiperda confirma o fato de que a proteína truncada e códon modificada expressa do gene CrylDa utilizado age através de um mecanismo diferente daquele existente no evento comercial que contém o gene Cry1F.
DEPÓSITO Sementes de milho do evento ME240913 revelado acima foram depositadas em 28/10/2019 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Colection (ATCC), 1801 Universidade de Boulevard, Manassas, VA 20110, sob número de acesso PTA-126224.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que é única ao evento ME240913, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e complementos das mesmas.
2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação
1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína CrylDa truncada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
3. Molécula de ácido nucléico de acordo a reivindicação 1 ou
2, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico é compreendida em uma semente de milho depositada na American Type Culture Collection sob número de acesso PTA-126224.
4. Amplicon, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Par de iniciadores de polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo os quais funcionam juntos na presença de um DNA modelo do evento ME240913 em uma amostra para produzir um amplicon diagnóstico do evento ME240913, em que o primeiro iniciador de polinucleotídeo reconhece uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e complementos das mesmas, e em que o segundo iniciador de polinucleotídeos reconhece a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, ou complemento da mesma.
6. Planta de milho transgênica, célula, ou tecido da mesma, caracterizado(a) pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Planta de milho, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a planta de milho é resistente a insetos- pragas lepidópteros.
8. Planta de milho, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que possui um alto nível de proteção de folhas de plantas de milho contra pragas de Lepidoptera, incluindo, entre outras, S. frugiperda, incluindo populações de S. frugiperda resistentes a Cry1F e/ou Cry1A.
9. Planta de milho de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o tecido foliar da mesma possui alta toxicidade para pragas suscetíveis de Lepidoptera, preferencialmente Spodoptera frugiperda.
10. Semente de milho, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. Semente de milho, caracterizada pelo fato de que está depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA-126224.
12. Planta de milho transgênica, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir de uma semente como definida na reivindicação
10 ou 11.
13. Produto de planta, caracterizado pelo fato de que é derivado de uma planta de milho como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.
14. Produto de planta de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre o grupo consistindo em farinha de milho, polvilho de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte com produtos derivados de milho.
15. Método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores como definidos na reivindicação 5;
(b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, de forma a produzir um amplicon; e
(c) detectar o amplicon.
16. Método para detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única para o evento ME240913 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos do milho, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento ME240913 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle, em que a sonda compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e complementos das mesmas;
(b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e
(c) detectar hibridização da sonda para a molécula de ácido nucléico.
17. Kit para detecção de ácidos nucléicos que são únicos para o evento ME240913, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico que é um iniciador ou sonda compreendendo uma sequência de ácido nucléico a qual, ao amplificar ou hibridizar uma sequência de ácidos nucléicos alvo em uma amostra seguida da detecção do amplicon ou hibridização com a sequência alvo, são diagnósticos para a presença das sequências de ácidos nucléicos únicas para o evento ME240913 na amostra.
18. Método para a produção de uma planta de milho compreendendo o evento ME240913 resistente a insetos-pragas lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: cruzar sexualmente uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora, em que a referida primeira ou segunda planta de milho progenitora compreende o DNA evento ME240913, de forma a produzir uma pluralidade de plantas descendentes de primeira geração; selecionar a partir das plantas descendentes, uma planta compreende o DNA evento ME240913.
19. Método para a produção de sementes de milho híbridas, caracterizado pelo fato de que compreende: plantar sementes de uma primeira linhagem de milho congénita compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e seus complementos e sementes de uma segunda linhagem congénita tendo um genótipo diferente; cruzar sexualmente as duas diferentes linhagens congénitas uma com a outra; e colher a semente híbrida produzida desta maneira.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta da primeira linhagem de milho congénita é o progenitor feminino.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta da primeira linhagem de milho congénita é o progenitor masculino.
22. Semente híbrida, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 19.
23. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo crescimento da semente de milho híbrido como definida na reivindicação 20.
24. Método para controle de insetos-pragas lepidópteros de plantas de milho, em que as plantas de milho compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e seus complementos, caracterizado pelo fato de que compreende o plantio de sementes obtidas a partir de uma planta compreendendo a referida molécula de ácido nucleico em uma área de cultivo de plantas de milho suscetíveis a insetos-pragas lepidópteros.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o inseto-praga lepidóptero é S. frugiperda.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o S. frugiperda é resistente a Cry1 F e/ou Cry1 A.
26. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que folhas frescas de plantas contendo o
DNA do evento ME240913 são altamente tóxicas para S. frugiperda.
27. Uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.
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