CN116219063A - 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法 - Google Patents

用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116219063A
CN116219063A CN202310235129.XA CN202310235129A CN116219063A CN 116219063 A CN116219063 A CN 116219063A CN 202310235129 A CN202310235129 A CN 202310235129A CN 116219063 A CN116219063 A CN 116219063A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleic acid
acid sequence
dna
corn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310235129.XA
Other languages
English (en)
Inventor
王利君
刘海利
张铭
陶梦梦
于彩虹
王诚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202310235129.XA priority Critical patent/CN116219063A/zh
Publication of CN116219063A publication Critical patent/CN116219063A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列。本发明玉米植物DBN9235对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件DBN9235的DNA分子。

Description

用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，特别是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域。具体地，本发明涉及昆虫抗性和草铵膦除草剂耐受性的转基因玉米事件DBN9235和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件DBN9235的核酸序列及其检测方法。
背景技术
玉米(Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。生物技术已经应用于玉米以改善其农艺性状和品质。在玉米生产中昆虫抗性是一项重要的农艺性状，特别是对鳞翅目昆虫的抗性，例如玉米螟、棉铃虫、东方黏虫、小地老虎、草地贪夜蛾等。玉米对鳞翅目昆虫的抗性可以通过转基因的方法使鳞翅目昆虫的抗性基因在玉米植物中表达而获得。另一个重要的农艺性状是除草剂耐受性，如已有成功的玉米转化事件NK603、GA21等，美国等玉米主要种植区域已广泛种植。值得一提的是，草铵膦除草剂与草甘膦除草剂的作用机理不同，其为灭生性的触杀型除草剂，且可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的手段。玉米对草铵膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草铵膦除草剂耐受型基因(如pat)在玉米植物中表达而获得。
已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。
能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含于插入序列的第一引物和包含于插入序列的第二引物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法，转基因玉米事件DBN9235对昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件DBN9235的DNA分子。
为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1-223位中至少11个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:3或其互补序列第224-844位中至少11个连续的核苷酸；和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1-401位中至少11个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:4或其互补序列第402-904位中至少11个连续的核苷酸。
优选地，所述核酸序列具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1-223位中22-25个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:3或其互补序列第224-844位中22-25个连续的核苷酸；和/或SEQID NO:4或其互补序列第1-401位中22-25个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:4或其互补序列第402-904位中22-25个连续的核苷酸。
优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。
所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因玉米事件DBN9235中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9235的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因玉米事件DBN9235中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9235的存在。
优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。
本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中T-DNA插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:1的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件DBN9235或其后代的存在。所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因玉米事件DBN9235中在T-DNA插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为844个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由223个核苷酸的玉米基因组5’侧翼序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第1-223位)、200个核苷酸的DBN11815构建体DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第224-423位)、195个核苷酸的t35S花椰菜花叶病毒转录终止子的DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第424-618位)和226个核苷酸的编码草铵膦除草剂耐受剂PAT蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第619-844位)组成，包含所述SEQ ID NO:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9235的存在。
所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中T-DNA插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件DBN9235或其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件DBN9235中在插入序列的3’末端位于T-DNA插入接合部位附近的一个长度为904个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由17个核苷酸的RB7核基质附着区序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第1-17位)、384个核苷酸的DBN11815构建体DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第18-401位)和503个核苷酸的玉米基因组3’侧翼序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第402-904位)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9235的存在。
进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列。
所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因玉米事件DBN9235的长度为12229个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9235的存在。
表1、SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件
Figure BDA0004121775660000041
本领域技术人员熟知的，第一、第二、第三和第四核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。
所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增方法中以产生扩增子，所述扩增子用于检测生物样品中转基因玉米事件DBN9235或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测方法中，以检测生物样品中转基因玉米事件DBN9235或其后代的存在。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包含所述核酸序列。
优选地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
具体地，所述两种引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:2的互补序列和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11、或者SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的互补序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与探针接触，所述探针包含所述核酸序列；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％ SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％ SDS和1×SSC、0.1％ SDS各洗膜1次。
优选地，所述探针包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
可选地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括所述核酸序列；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。
优选地，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、和/或SEQ ID NO:6-11或其互补序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包含所述核酸序列，其可以作为对于转基因玉米事件DBN9235或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针。
优选地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种植物细胞，包含编码昆虫抗性Cry1Fa2蛋白的核酸序列、Cry2Ab2蛋白的核酸序列、编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示的序列。
优选地，所述植物细胞包含编码昆虫抗性Cry1Fa2蛋白的核酸序列、Cry2Ab2蛋白的核酸序列、编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列包括SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
优选地，所述植物细胞依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第424-11342位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述转基因玉米植物。
优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或SEQ IDNO:4所示的序列。
优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5第424-11342位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5。
为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤或控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，所述转基因玉米植物对草铵膦除草剂具有耐受性。
优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第424-11342位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对昆虫具有抗性和/或耐受草铵膦除草剂的玉米植物的方法，包括：
种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含编码昆虫抗性Cry2Ab2蛋白的核酸序列、Cry1Fa2蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域的核酸序列，或者所述玉米种子的基因组中包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
使所述玉米种子长成玉米植株；
用靶昆虫侵袭所述玉米植株和/或用有效剂量草铵膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，包括将第一玉米植物基因组中包含的编码昆虫抗性Cry2Ab2蛋白的核酸序列、Cry1Fa2蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域的核酸序列，或者将所述第一玉米植物基因组中包含的SEQ ID NO:5所示的核酸序列，引入第二玉米植物，从而产生大量子代植株；选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株，且所述子代植株对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
优选地，所述方法包括将转基因玉米事件DBN9235与缺少昆虫抗性和/或草铵膦耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株；所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生自转基因玉米事件DBN9235的农产品或商品，所述农产品或商品为玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。
在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。
所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。
所述“包含”、“包含”或“含有”是指“包括但不限于”。
术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。
术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。
“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼DNA”亦称“侧翼区”或“侧翼序列”或“侧翼基因组序列”或“侧翼基因组DNA”，是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“3’侧翼”或“右边界侧翼”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“5’侧翼”或“左边界侧翼”等。
引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合区域”或“接合序列”是指包含接合点的DNA。
本发明提供了称为DBN9235的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件DBN9235亦称为玉米植物DBN9235，其包括转基因玉米事件DBN9235的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件DBN9235的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物DBN9235的产物，例如玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。
本发明转基因玉米事件DBN9235包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件DBN9235获得对昆虫的抗性和对草铵膦除草剂的耐受性。所述DNA构建体包含三个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接Cry1Fa2蛋白的核酸序列，所述Cry1Fa2蛋白的核酸序列主要对鳞翅目昆虫具有抗性。第二个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接Cry2Ab2蛋白的核酸序列，所述Cry2Ab2蛋白的核酸序列主要对鳞翅目昆虫具有抗性。第三个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素N-乙酰基转移酶(phosphinothricin N-acetyltransferase，PAT)的基因，所述PAT蛋白的核酸序列对草铵膦除草剂具有耐受性。
Cry2Ab2杀虫蛋白和Cry1Fa2杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的两种，其是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)产生的不溶性伴孢结晶蛋白。Cry2Ab2蛋白或Cry1Fa2蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下，蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段，活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。所述Cry2Ab2基因和Cry1Fa2基因可以通过优化密码子或者以其它方式改变其核苷酸序列，以达到增加转化细胞中转录物的稳定性和可利用性的目的。
所述“鳞翅目(Lepidoptera)”，包括蛾、蝶两类昆虫，是农林害虫最多的一个目，如小地老虎、棉铃虫、斜纹夜蛾、二点委夜蛾、桃蛀螟等。
所述膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)基因可以是从链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)菌株分离的酶，通过乙酰化催化L-膦丝菌素转化为其无活性形式，以赋予植物对草铵膦除草剂的耐受性。Phosphinothricin(PTC，2-氨基-4-甲膦酰丁酸)是谷氨酰胺合成酶的抑制剂。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦酰-丙氨酰-丙氨酸的结构单位，此三肽(PTT)具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及抗真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的活性。膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)基因也可以作为选择性标记基因。
所述“草铵膦”又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，用“草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草铵膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂处理包含了来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的生长或产量。
所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。
所述基因枪转化法即为用包含外源DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的生物弹击转化)。
所述花粉管通道转化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又名花粉管引导组织)，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊。
转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。
DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。
转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”是指含有异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还指原始转化体和含有异源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于原始转化体亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化体的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA的亲本系(例如原始转化体和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。
本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。
术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。
本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。
培养对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件DBN9235，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件DBN9235及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件DBN9235及其后代是通过利用本发明的对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对鳞翅目昆虫的抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；然后选择对鳞翅目昆虫的侵袭具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株；或者将第一子代植物自交，由此产生多个第二代子代植物，用靶昆虫侵袭和/或用草铵膦处理所述子代植株，选择对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株。可以培育出对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使鳞翅目昆虫抗性和/或草铵膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用鳞翅目昆虫侵袭、草铵膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件DBN9235中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。
还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以交配以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。
术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件DBN9235基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件DBN9235或种子还是来源于转基因玉米事件DBN9235的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。
术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。
基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼序列，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件DBN9235的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。
关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。
术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。
如本发明使用的，“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件DBN9235通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件DBN9235，或玉米提取物，例如粗粉、面或油是否包含转基因玉米事件DBN9235，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件DBN9235的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件DBN9235也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约50个核苷酸碱基对，更优选加上约250个核苷酸碱基对，最优选加上约450个核苷酸碱基对或更多。
可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。PCR扩增方法已经发展到可扩增多达22kb的基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的外源DNA序列和来自转基因玉米事件DBN9235的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件DBN9235的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有用作引物的DNA分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的玉米基因组的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其扩增与转基因玉米事件DBN9235的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:1。用作DNA引物的其它DNA分子可选自SEQ ID NO:5。
这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是遗传点分析(Genetic Bit Analysis)，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
另一种方法是焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。
Chen等(基因组研究(Genome Res.)9:492-498，1999)描述的荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交(Northern blot)和原位杂交(in situ hybridization)。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。
Tyangi等(自然生物技术(Nature Biotech.)14:303-308，1996)介绍了分子标记在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。
可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件DBN9235的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件DBN9235的DNA的玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在图1和表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的DNA结构包含：位于转基因插入序列5’末端的玉米植物DBN9235侧翼基因组区域；来自农杆菌的左侧边界区域(LB)的一部分插入序列；第一个表达盒由含有花椰菜花叶病毒35S启动子(pr35S)，可操作地连接到链霉菌的草铵膦耐受性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(cPAT)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒35S终止子(t35S)上而组成；第二个表达盒由来源于水稻的肌动蛋白1(Actin)启动子，可操作地连接到玉米Rubisco基因叶绿体转运肽基因(spZmCTP2)上，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的Cry2Ab2蛋白(cCry2Ab2)上，并可操作地连接到In2-1基因转录终止子(tIn2)上而组成；第三个表达盒由含有玉米泛素基因1启动子(prZmUbi1)，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的Cry1Fa2蛋白(cCry1Fa2)上，可操作地连接到来自根癌农杆菌A6株pTiA6质粒甘露碱合酶的转录终止子(tORF25PolyA)上，并可操作地连接到核骨架结合序列(eRB7)上而组成；来自农杆菌的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的玉米植物DBN9235侧翼基因组区域(SEQ ID NO:5)。在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件DBN9235中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件DBN9235的玉米基因组侧翼DNA序列的任何部分。
转基因玉米事件DBN9235可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草甘膦、麦草畏等)耐受性的转基因玉米品种，或携带其他抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件DBN9235一起育种，可以提供抗多种虫害并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。
本发明转基因玉米事件DBN9235是对鳞翅目害虫的摄食损伤有抗性的，并且耐受含草铵膦的农业除草剂的植物毒性作用。玉米植物DBN9235表达来自苏云金芽孢杆菌的Cry2Ab2蛋白和Cry1Fa2蛋白，其提供了对鳞翅目害虫(如小地老虎、东方黏虫)摄食损伤的抗性，并表达来自链霉菌的草铵膦抗性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)蛋白，其赋予植物对草铵膦的耐受性。玉米植株DBN9235具有如下优点：1)免受由于鳞翅目害虫(如小地老虎、东方黏虫、棉铃虫、草地贪夜蛾等)造成的经济损失，小地老虎、东方黏虫、棉铃虫、草地贪夜蛾等是玉米种植区的主要害虫；2)施加含草铵膦的农业除草剂给玉米作物用于广谱杂草控制的能力；3)玉米产量没有降低。此外，编码昆虫抗性和草铵膦耐受性性状的转基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于转基因玉米事件DBN9235基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明检测方法中SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ IDNO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列，SEQ ID NO:6或其互补序列、或者SEQ IDNO:7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因玉米事件DBN9235或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的存在。
序列简述
SEQ ID NO:1转基因玉米事件DBN9235中在插入序列5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22为核苷酸分别位于玉米基因组上插入位点的两侧；
SEQ ID NO:2转基因玉米事件DBN9235中在插入序列3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22为核苷酸分别位于玉米基因组上插入位点的两侧；
SEQ ID NO:3转基因玉米事件DBN9235中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为844个核苷酸的序列；SEQ ID NO:4转基因玉米事件DBN9235中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为904个核苷酸的序列；SEQ ID NO:5整个T-DNA序列、5’和3’末端的玉米基因组侧翼序列；
SEQ ID NO:6位于SEQ ID NO:3上的序列，跨越了左侧边界区域(LB)、
t35S转录终止序列和pat耐除草剂基因序列；
SEQ ID NO:7位于SEQ ID NO:4上的序列，跨越了RB7基因表达调控序列和右侧边界区域(RB)；
SEQ ID NO:8扩增SEQ ID NO:3的第一引物；
SEQ ID NO:9扩增SEQ ID NO:3的第二引物；
SEQ ID NO:10扩增SEQ ID NO:4的第一引物；
SEQ ID NO:11扩增SEQ ID NO:4的第二引物；
SEQ ID NO:12 5’侧翼基因组序列上的引物；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:12配对的位于T-DNA上的引物；
SEQ ID NO:14 3’侧翼基因组序列上的引物，其与SEQ ID NO:12配对可以检测转基因是纯合子或是杂合子；
SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:14配对的位于T-DNA上的引物；
SEQ ID NO:16Taqman检测Cry1Fa2基因的第一引物；
SEQ ID NO:17Taqman检测Cry1Fa2基因的第二引物；
SEQ ID NO:18Taqman检测Cry1Fa2基因的探针；
SEQ ID NO:19Taqman检测Cry2Ab2基因的第一引物；
SEQ ID NO:20Taqman检测Cry2Ab2基因的第二引物；
SEQ ID NO:21Taqman检测Cry2Ab2基因的探针；
SEQ ID NO:22Taqman检测pat基因的第一引物；
SEQ ID NO:23Taqman检测pat基因的第二引物；
SEQ ID NO:24Taqman检测pat基因的探针；
SEQ ID NO:25玉米内源基因SSIIb的第一引物；
SEQ ID NO:26玉米内源基因SSIIb的第二引物；
SEQ ID NO:27Southern杂交检测中Cry1Fa2基因的探针；
SEQ ID NO:28Southern杂交检测中Cry2Ab2基因的探针；
SEQ ID NO:29Southern杂交检测中pat基因的探针；
SEQ ID NO:30位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向一致；
SEQ ID NO:31位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:32位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:33位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向一致；
SEQ ID NO:34位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:35位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得侧翼序列。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的转基因插入序列与玉米基因组接合部位的结构示意图，以及用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列相对位置的示意图(相对位置示意图参考B73 RefGen v4)；
图2为本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的重组表达载体DBN11815的结构示意图；
图3为本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的转基因玉米事件DBN9235接种草地贪夜蛾、东方黏虫和亚洲玉米螟的离体效果图；
图4为本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的转基因玉米事件DBN9235接种亚洲玉米螟的田间效果图；
图5为本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的转基因玉米事件DBN9235在草地贪夜蛾自然发生条件下的田间效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明用于检测玉米植物DBN9235的核酸序列及其检测方法的技术方案。
第一实施例、载体克隆、转化与筛选
1.1、载体克隆
使用标准基因克隆技术构建重组表达载体DBN11815(如图2所示)。所述载体DBN11815包含三个串联的转基因表达盒，第一个表达盒由玉米多聚泛素基因1启动子(prZmUbi1)，可操作地连接到来源于苏云金芽孢杆菌具有昆虫抗性的Cry1Fa2蛋白(cCry1Fa2)上，可操作地连接到根癌农杆菌A6株pTiA6质粒甘露碱合酶的转录终止子(tORF25PolyA)上，可操作地连接到核骨架结合序列(eRB7)上而组成；第二个表达盒由水稻肌动蛋白1启动子(prOsAct1)，可操作的连接到玉米Rubisco基因叶绿体定位信号肽(spZmCTP2)上，可操作的连接到来源于苏云金芽孢杆菌具有昆虫抗性的Cry2Ab2蛋白(cCry2Ab2)上，可操作的连接到玉米In2-1基因转录终止子(tIn2)上而组成；第三个表达盒由花椰菜花叶病毒35S启动子(pr35S)，可操作地连接到来源于链霉菌的具有草铵膦耐受性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(cPAT)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒35S的转录终止子(t35S)上而组成。
将所述载体DBN11815用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，并且以草铵膦为选择标记对转化细胞进行筛选。
1.2、植物转化
采用常规的农杆菌侵染法进行转化，将无菌培养的玉米品种DBN567的幼胚与本实施例1.1中所述的农杆菌共培养，将构建的重组表达载体DBN11815中的T-DNA转入到玉米染色体组中，以产生转基因玉米事件DBN9235。
对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将DBN11815载体中的T-DNA(包含Cry1Fa2基因的核苷酸序列、Cry2Ab2基因的核苷酸序列和pat基因的核苷酸序列)传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)，在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660＝0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH 5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、AS 100mg/L、2,4-D 1mg/L、琼脂8g/L，pH 5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1mg/L、头孢霉素250mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素150-250mg/L)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(草铵膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、头孢霉素250mg/L、草铵膦10mg/L、2,4-D 1mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、头孢霉素250mg/L、4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸5mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上，温度25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、头孢霉素250mg/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上，温度25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于温度28℃下培养16h，再于温度20℃下培养8h。
1.3、转基因事件的鉴定和筛选
一共产生235个独立转基因T0单株。
由于遗传转化、基因插入等均可能对玉米植株造成农艺性状上的影响(例如黄弱、死亡、卷叶或结实差等)，因此将上述235个独立的转基因T0单株送入温室移栽并进行培养，以鉴定转基因T0单株在不同时期(苗期-拔节期、拔节期-散粉期和灌浆期-成熟期)的农艺性状表现，共获得176个农艺性状表现正常的转基因T0单株。
通过TaqManTM分析检测上述176个转基因玉米植株是否存在单拷贝的Cry1Fa2、Cry2Ab2和pat基因，且不含载体骨架序列，共获得97个转基因T0单株；通过转基因插入位点分析，共筛选到20个T-DNA两侧序列完整、T-DNA没有插入到玉米基因组的重要基因中、基因插入没有产生新的开放阅读框(ORF)的转基因T0单株；通过对主要靶标昆虫(如小地老虎、东方黏虫、棉铃虫)的抗性评价和比较，共筛选到15个昆虫抗性良好的转基因T0单株；通过对草铵膦除草剂耐受性的评价和比较，共筛选到15个草铵膦除草剂耐受性良好的转基因T0单株；在不同世代、不同地理环境和/或不同遗传背景材料的情况下，通过对转基因玉米植株的农艺性状、分子生物学、靶标昆虫抗性、草铵膦耐受性等是否可稳定遗传进行筛选，选定了转基因玉米事件DBN9235是优异的，其具有单拷贝转基因(参见第二实施例)、良好的昆虫抗性、草铵膦除草剂耐受性和农艺性状表现(参见第六实施例和第七实施例)。
第二实施例、用TaqMan进行转基因玉米事件DBN9235检测
取转基因玉米事件DBN9235的叶片约100mg作为样品，用植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Maxi Kit,Qiagen)提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry1Fa2基因、Cry2Ab2基因和pat基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
具体方法如下：
步骤1、取转基因玉米事件DBN9235的叶片(授粉后)100mg，在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
步骤2、使用植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Maxi Kit,Qiagen)提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤3、用超微量分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤4、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；
步骤5、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测Cry1Fa2基因序列：
引物1：ttgtctgagtttgttccaggtgtg如序列表中SEQ ID NO:16所示；
引物2：ccaatcagatggagtgatgaagc如序列表中SEQ ID NO:17所示；
探针1：tgcgtttggcctcttcgacctcatc如序列表中SEQ ID NO:18所示；
以下引物和探针用来检测Cry2Ab2基因序列：
引物3：gctcctgctgccactctttg如序列表中SEQ ID NO:19所示；
引物4：gaggatcacgtcacgaatgaag如序列表中SEQ ID NO:20所示；
探针2：tcaggctgccaacctgcacctct如序列表中SEQ ID NO:21所示；
以下引物和探针用来检测pat基因序列：
引物5：gagggtgttgtggctggtattg如序列表中SEQ ID NO:22所示；
引物6：tctcaactgtccaatcgtaagcg如序列表中SEQ ID NO:23所示；
探针3：cttacgctgggccctggaaggctag如序列表中SEQ ID NO:24所示；
PCR反应体系为：
Figure BDA0004121775660000231
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和860μL 1×TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为：
Figure BDA0004121775660000232
利用快速实时荧光定量PCR系统软件(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR SystemSDS v2.3，Applied Biosystems)分析数据，结果表明获得的转基因玉米事件DBN9235为单拷贝。
第三实施例、分析转基因玉米事件DBN9235的插入位点
3.1、基因组DNA提取
DNA提取按照常规采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法：取2g转基因玉米事件DBN9235的幼嫩叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.5mL于温度65℃预热的DNA提取CTAB缓冲液(20g/LCTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用NaOH调pH至8.0)，充分混匀后，于温度65℃抽提90min；加入0.5倍体积苯酚和0.5倍体积氯仿，颠倒混匀；12000rpm(每分钟转数)转速下离心10min；吸取上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻柔晃动离心管，于温度4℃静置30min；12000rpm转速下再离心10min；收集DNA到管底；弃上清液，用1mL质量浓度为70％的乙醇，洗涤沉淀；12000rpm转速下离心5min；真空抽干或在超净台吹干；DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液中，保存在温度-20℃条件下。
3.2、侧翼DNA序列的分析
对上述提取的DNA样品进行浓度测定，使待测样品的浓度位于80-100ng/μL之间。用限制性内切酶Eco RI(5’端分析)和Nco I(3’端分析)分别酶切基因组DNA。每个酶切体系中加入26.5μL基因组DNA，0.5μL上述限制性内切酶以及3μL酶切缓冲液(采用的限制性酶均是NEB公司的酶及其配套的缓冲液或通用缓冲液，现称NEBCutSmart)，酶切1h。待酶切结束后，向酶切体系中加入70μL无水乙醇，冰浴30min，12000rpm转速下离心7min，弃上清，吹干，之后加入8.5μL双蒸水、1μL 10×T4-DNA连接酶缓冲液(NEB T4 DNA Ligase ReactionBuffer，其具体配方可访问NEB网站或参考https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases、https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer)以及0.5μL T4-DNA连接酶在温度4℃连接过夜。用一系列嵌套引物进行PCR扩增分离5’端和3’端基因组DNA。具体的，分离5’端基因组DNA的引物组合包括SEQ ID NO:13和SEQID NO:30作为第一引物，SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32作为第二引物，SEQ ID NO:13作为测序引物。分离3’端基因组DNA引物组合包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:33作为第一引物，SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35作为第二引物，SEQ ID NO:15作为测序引物，PCR反应条件如表3所示。
上述PCR扩增反应所获得的扩增产物在质量分数为2.0％琼脂糖凝胶上电泳以分离PCR扩增产物，随后使用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,目录#_28704,Qiagen Inc.,Valencia,CA)从琼脂糖基质分离目的片段。然后对纯化的PCR扩增产物测序(例如，使用ABI PrismTM 377,PE Biosystems，Foster City,CA)并分析(例如,使用DNASTAR序列分析软件,DNASTAR Inc.,Madison,WI)。
使用标准PCR方法确认5’和3’侧翼序列和接合序列。5’侧翼序列和接合序列可使用SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12，组合SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO：30来确认。3’侧翼序列和接合序列可使用SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14，组合SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:33来确认。PCR反应体系和扩增条件如表2和表3所示。本领域技术人员将理解，其它引物序列也可用于确认侧翼序列和接合序列。
PCR扩增产物的DNA测序提供了可以用于设计其他DNA分子的DNA，所述其他DNA分子作为引物和探针可用于鉴定来源于转基因玉米事件DBN9235的玉米植物或种子。
发现在SEQ ID NO:5的核苷酸第1-223位显示的为玉米基因组序列在转基因玉米事件DBN9235插入序列的左边界侧翼(5’侧翼序列)，在SEQ ID NO:5的核苷酸第11727-12229位显示的为玉米基因组序列在转基因玉米事件DBN9235插入序列的右边界侧翼(3’侧翼序列)。5’接合序列在SEQ ID NO:1中列出，3’接合序列在SEQ ID NO:2中列出。
3.3、PCR接合性测定
接合序列是相对短的多核苷酸分子，其是新的DNA序列，当在多核酸检测分析中检测到时对于转基因玉米事件DBN9235的DNA是诊断性的。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的接合序列为转基因玉米事件DBN9235中转基因片段的插入位点和玉米基因组DNA的每一侧的11个多核苷酸。更长或更短的多核苷酸接合序列可以从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中选择。接合序列(5’连接区域SEQ ID NO:1，和3’连接区域SEQ ID NO:2)作为DNA探针或作为DNA引物分子在DNA检测方法中是有用的。接合序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7也是转基因玉米事件DBN9235中新的DNA序列，其也可以作为DNA探针或作为DNA引物分子检测转基因玉米事件DBN9235 DNA的存在。所述SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:3的核苷酸224-844位)跨越了DBN11815构建体DNA序列和t35S转录终止序列和pat基因序列，所述SEQ ID NO:7(SEQ IDNO:4的核苷酸1-401位)跨越了RB7基因表达调控序列和DBN11815构建体DNA序列。
此外，通过使用来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少一个引物来产生扩增子，所述引物用于PCR方法中时产生转基因玉米事件DBN9235的诊断性扩增子。
具体地，从转基因插入序列的5’端产生PCR扩增产物，该PCR扩增产物为包含来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的基因组中侧翼于T-DNA插入序列的5’端的基因组DNA的一部分。这个PCR扩增产物包含SEQ ID NO:3。为了进行PCR扩增，设计与侧翼于转基因插入序列的5’端的基因组DNA序列杂交的引物7(SEQ ID NO:8)，和与之配对的位于T-DNA插入序列中pat基因序列的引物8(SEQ ID NO:9)。
从转基因插入序列的3’端产生PCR扩增产物，该PCR扩增产物包含来源于转基因玉米事件DBN9235的植物材料的基因组中侧翼于T-DNA插入序列的3’端的基因组DNA的一部分。这个PCR扩增产物包含SEQ ID NO:4。为了进行PCR扩增，设计与侧翼于转基因插入序列的3’端的基因组DNA序列杂交的引物9(SEQ ID NO:10)，和与之配对的与T-DNA插入序列中RB7基因表达调控序列的引物10(SEQ ID NO:11)。
表2和表3中说明的DNA扩增条件可以用于上述PCR接合性试验以产生转基因玉米事件DBN9235的诊断性扩增子。扩增子的检测可以通过使用Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪等进行，或通过本领域技术人员已知的方法和设备进行。
表2、用于转基因玉米事件DBN9235的5’端转基因插入物/基因组接合区域鉴定的PCR步骤和反应混合物条件
Figure BDA0004121775660000261
表3、热循环仪扩增条件
Figure BDA0004121775660000262
轻轻地混合，如果热循环仪上没有保温帽，可以在每个反应液上方添加1-2滴矿物油。使用表3中的循环参数在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、MJEngine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin-Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)热循环仪上进行PCR反应。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪应当在计算的模式下运行。Perkin-Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速度(ramp speed)设定为最大值。
实验结果表明：引物7和8(SEQ ID NO:8和9)，当其用在转基因玉米事件DBN9235基因组DNA的PCR反应中时，产生844bp片段的扩增产物，当其用在未转化玉米基因组DNA和非DBN9235玉米基因组DNA的PCR反应中时，没有片段被扩增；引物9和10(SEQ ID NO:10和11)，当其用在转基因玉米事件DBN9235基因组DNA的PCR反应中时，产生904bp片段的扩增产物，当其用在未转化玉米基因组DNA和非DBN9235玉米基因组DNA的PCR反应中时，没有片段被扩增。
PCR接合性测定还可用于鉴定来源于转基因玉米事件DBN9235的材料是纯合子或是杂合子。将引物11(SEQ ID NO:12)、引物12(SEQ ID NO:13)和引物13(SEQ ID NO:14)用于扩增反应以产生转基因玉米事件DBN9235的诊断性扩增子。表4和表5中说明的DNA扩增条件可以用于上述接合性试验以产生转基因玉米事件DBN9235的诊断性扩增子。
表4、接合性测定反应液
Figure BDA0004121775660000271
Figure BDA0004121775660000281
表5、接合性测定的热循环仪扩增条件
Figure BDA0004121775660000282
使用表5中的循环参数在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、MJEngine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin-Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)热循环仪上进行PCR反应。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪应当在计算的模式下运行。Perkin-Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速度(ramp speed)设定为最大值。
在所述扩增反应中，含有模板DNA的生物样品含有诊断该样品中转基因玉米事件DBN9235的存在情况的DNA。或者扩增反应将由含有来源于玉米基因组的DNA的生物样品产生两个不同的DNA扩增子，所述来源于玉米基因组的DNA相对于转基因玉米事件DBN9235中存在的插入DNA对应的等位基因是杂合的。这两个不同的扩增子将对应于来源于野生型玉米基因组基因座的第一扩增子(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14)和诊断转基因玉米事件DBN9235DNA的存在情况的第二扩增子(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)。仅产生对应于针对杂合基因组描述的第二扩增子的单个扩增子的玉米DNA样品，可诊断确定该样品中转基因玉米事件DBN9235的存在，且该样品由相对于转基因玉米植物DBN9235中存在的插入DNA对应的等位基因为纯合的玉米种子所产生。
需要说明的是，转基因玉米事件DBN9235的引物对被用于产生对转基因玉米事件DBN9235基因组DNA为诊断性的扩增子。这些引物对包括但不限于，引物7和8(SEQ ID NO:8和9)，和引物9和10(SEQ ID NO:10和11)，用于所述的DNA扩增方法中。另外，用于扩增玉米内源基因的一个对照引物14和15(SEQ ID NO:25和26)被包括在内，其作为反应条件的一个内在标准。对转基因玉米事件DBN9235 DNA抽提样品的分析应该包括一个转基因玉米事件DBN9235的阳性组织DNA抽提物对照，一个来源于非转基因玉米事件DBN9235的阴性DNA抽提物对照和一个不含有模板玉米DNA抽提物的阴性对照。除了这些引物对之外，还可以使用来自SEQ ID NO:3或其互补序列、或者SEQ ID NO:4或其互补序列的任何引物对，当它们被用于DNA扩增反应时分别产生对于来源于转基因事件玉米植物DBN9235的组织为诊断性的包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的扩增子。表2-表5中说明的DNA扩增条件可以用于使用合适的引物对以产生转基因玉米事件DBN9235的诊断性扩增子。当在DNA扩增方法中测试时产生对转基因玉米事件DBN9235为诊断性扩增子的、推定含有转基因玉米事件DBN9235的玉米植物或种子DNA的提取物，或来源于转基因玉米事件DBN9235的产物，可以被用作扩增的模板，来确定是否存在转基因玉米事件DBN9235。
第四实施例、利用Southern印迹杂交检测转基因玉米事件DBN9235
4.1、用于Southern印迹杂交的DNA提取
利用研钵和研杵，在液氮中研磨大约5-10g叶片组织。在20mL CTAB裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0、20mM EDTA pH 8.0、1.4M NaCl、0.2％v/vβ-疏基乙醇、2％w/vCTAB)中重悬浮4-5g研磨后的叶片组织，在温度65℃温育60min。在温育期间，每10min将样品颠倒混匀一次。温育后，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀进行抽提，以转速4000rpm离心20min。取水相用等体积氯仿/异戊醇(24:1)重复抽提一次。再次收集水相后加入等体积异丙醇，混匀后在温度-20℃放置1h以沉淀DNA，再以转速4000rpm离心5min得到DNA沉淀，然后在1mL TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)中重悬浮DNA沉淀。为了降解任何存在的RNA，在温度37℃下，将DNA和40μL浓度为10mg/mL RNase A温育30min，以4000rpm离心5min，并且在0.1倍体积浓度为3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积无水乙醇存在的情况下，以转速12000rpm离心10min沉淀DNA。弃掉上清液后，用70％(v/v)的1mL乙醇洗涤沉淀，室温干燥后在1mL TE缓冲液中将DNA重新溶解。
4.2、限制酶消化
用超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度。
在100μL反应体系中，每次消化5μg DNA，用限制性内切酶Nco I、Nhe I、Mfe I和Spe I分别消化基因组DNA，以T-DNA上Cry1Fa2基因、Cry2Ab2基因和pat基因的部分序列作为探针。对于每种酶，在适当的温度下过夜温育消化物。利用真空离心蒸发浓缩器(speedVacuum，Thermo Scientific)旋转样品以减少体积至20μL。
4.3、凝胶电泳
向来源于本实施例4.2中的每个样品添加溴酚蓝上样缓冲液，并且将每个样品加样到含有溴化乙锭的0.7％ TAE琼脂糖凝胶上，在TAE电泳缓冲液(40mM Tris-醋酸、2mMEDTA，pH 8.5)中电泳分离，在电压20V下电泳凝胶过夜。
电泳结束后，用0.25M HCl处理凝胶10min以使DNA脱嘌呤，然后分别用变性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl，pH 7.2)处理凝胶各30min。在瓷盘中倒入5×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)，搭上一块玻璃板，然后依次放浸湿的滤纸桥、凝胶、带正电的尼龙膜(Roche，Cat.No.11417240001)、三张滤纸、纸塔、重物。在室温下转膜过夜后，在去离子水中漂洗尼龙膜2次，通过紫外交联仪(UVP，UV CrosslinkerCL-1000)将DNA固定在膜上。
4.4、杂交
用PCR扩增适合的DNA序列用于探针制备。所述DNA探针为SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:29，或者与上述序列部分同源或互补。用DNA Labeling and DetectionStarter Kit II试剂盒(Roche，Cat.No.11585614910)进行探针的DIG标记、Southern印迹杂交、洗膜等操作，具体方法参考其产品说明书。最后用X光片(Roche，Cat.No.11666916001)检测探针结合的位置。
每个Southern上包括两种对照样品：(1)来自阴性(未转化的)分离子的DNA，其用于鉴定任何可与元件-特异性探针杂交的内源玉米序列；(2)来自阴性分离子的DNA，其中引入了Hind III-消化的DBN11815质粒，其量基于探针长度等价于一个拷贝数，其作为杂交的阳性对照并用于说明实验的灵敏度。
杂交数据提供了确证的证据支持TaqManTM PCR分析，即玉米植物DBN9235含有Cry1Fa2基因、Cry2Ab2基因和pat基因的单拷贝。利用该Cry1Fa2基因探针，Nco I和Nhe I酶解分别产生大小约6.0kb和7.5kb的单一条带；利用该Cry2Ab2基因探针，Mfe I和Spe I酶解分别产生大小约28kb和6.0kb的单一条带；利用该pat基因探针，Nco I和Nhe I酶解分别产生大小约6.5kb和25kb的单一条带，这表明Cry1Fa2基因、Cry2Ab2基因和pat基因各一个拷贝存在于玉米植物DBN9235中。另外，对于骨架探针，未得到杂交条带，说明在转化过程中未有任何DBN11815载体骨架序列进入玉米植物DBN9235基因组中。
第五实施例、转基因玉米载体DBN11815的筛选
根据对本领域的基本认识，包含相同基因的不同载体设计对目标性状的表现会有不同影响。为获得最佳的目标性状表现，设计并构建了包括载体DBN11815在内的10个包含Cry1Fa2、Cry2Ab2和pat基因的表达载体。它们包含相同的目的基因，但目的基因的调控元件及表达盒的组合方式不同，包括调整Cry1Fa2、Cry2Ab2、pat基因表达盒的排列顺序；调整Cry2Ab2基因表达盒与Cry1Fa2、pat基因表达盒的连接方向；调整Cry2Ab2、pat基因表达盒内所使用的启动子和/或终止子；调整元件核骨架结合序列(eRB7)是否存在以及在表达盒中的位置。将上述10个不同的表达载体分别转育到玉米中，通过相同的试验方法进行生物测定、蛋白含量检测以及抗虫性稳定性评估，筛选得到最优载体DBN11815，用于产品开发。DBN11815载体的实验结果如下：
5.1、转基因玉米载体的生物测定
将DBN11815载体的转基因玉米植株和野生型玉米植株(非转基因，NGM)分别对小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg，BCW)、东方黏虫(Mythimna seperata，OAW)按照如下方法进行生物测定：
分别取DBN11815转基因玉米载体和野生型玉米植株(非转基因，NGM)的新鲜叶片(V3-V4时期)，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1cm×3cm的长条状，取1-3片(根据昆虫食量确定叶片数量)剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的初孵幼虫，虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70％-80％、光周期(光/暗)16:8的条件下放置3天后统计结果。统计幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分(满分300分)：抗性总分＝100×死亡率+[100×死亡率+90×(初孵虫数/接虫数)+60×(初孵-阴性对照虫数/接虫数)+10×(阴性对照虫数/接虫数)]+100×(1-叶片损伤率)。其中，接虫数是指接虫的数量，即每皿10头(视害虫的取食量而定)；幼虫发育进度已通过抗性总分公式体现；叶片损伤率是指被害虫取食的叶片面积占叶片总面积的比例。选择DBN11815载体的3个转化事件，每个转化事件与野生型玉米植株(非转基因，NGM)分别选5株长势一致的植株进行测试，每株重复3次。结果如表6所示。
表6、DBN11815转基因玉米载体的抗虫生物测定平均结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000311
Figure BDA0004121775660000321
5.2、转基因玉米载体抗虫蛋白检测
将DBN11815转基因玉米载体植株和野生型玉米植株(非转基因，NGM)，通过ELISA按照如下方法检测Cry2Ab2和Cry1Fa2蛋白在不同表达载体中的表达量：
分别取DBN11815玉米载体植株和野生型玉米植株(非转基因，NGM)的新鲜叶片(V3时期)，经冷冻干燥处理后，称取20mg进行液氮研磨，然后加入1mL萃取缓冲液(8g/L NaCl，0.27g/L KH2PO4，1.42g/LNa2HPO4，0.2g/L KCl，5.5ml/L Tween-20，pH7.4)，混匀，4℃静置30分钟，12000g离心10分钟，取上清液用上述萃取缓冲液稀释至适当倍数，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。
用ENVIROLOGIX公司的ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测试剂盒：Cry2A试剂盒(AP005)和Cry1F试剂盒(AP016)，对样品中蛋白质(Cry2Ab2蛋白，Cry1Fa2蛋白)含量占组织干重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。同时以野生型玉米植株叶片(非转基因，NGM)作为对照，按照上述方法进行检测分析，DBN11815载体选3个转化事件，每个转化事件选4株植株，每株进行4次技术重复。结果如表7所示。
表7、DBN11815转基因玉米载体收集的组织中的抗虫基因蛋白水平(μg/g DWT)测定平均结果
Figure BDA0004121775660000322
上述实施例5.1和5.2的结果表明：与非转基因对照植株、其它9个包含Cry1Fa2、Cry2Ab2和pat基因的表达载体相比，载体DBN11815具有最优的抗虫表现(小地老虎和东方黏虫)和蛋白表达量。
5.3、转基因玉米载体的抗虫性稳定性检测
(1)对小地老虎抗虫稳定性检测
将转基因玉米载体DBN11815的T2代植株(包括纯合和杂合型植株)以及野生型玉米植株(非转基因，NGM)对小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg，BCW)进行生物测定，试验设计和试验方法与上述实施例5.1一致。以野生型玉米植株叶片(非转基因，NGM)作为对照，DBN11815载体选3个转化事件，每个转化事件选5株植株，每株重复3次。结果如表8所示。
表8、转基因玉米载体DBN11815的T2代对小地老虎的抗性结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000331
(2)对东方黏虫的抗虫稳定性检测
在上一个试验的基础上，继续评估T2代材料在高筛选压下的抗虫性稳定性。将转基因玉米载体DBN11815(转化事件1～3)以及野生型玉米植株(非转基因，NGM)对二龄东方黏虫(Mythimna seperata，OAW)按照如下方法进行生物测定：
取玉米植株新鲜叶片(V5-V6时期)，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约2.5cm×3cm的长条状，取3片剪后的长条状叶片放入24孔板单孔中，按此操作放满24孔板，各单孔放入1头人工饲养的二龄幼虫，虫试24孔板加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70％-80％、光周期(光/暗)16:8的条件下放置7天后统计结果(其中，放置4天后，为避免叶片腐烂影响幼虫存活，需按照以上方法更换新鲜的叶片，不同之处为本次取6片长条状叶片放入24孔板中)。以野生型玉米植株叶片(非转基因，NGM)作为对照，转基因玉米载体DBN11815选择3个转化事件，每个转化事件选择18株植株长势一致的植株进行测试，其中每6株植株作为一个整体，分布到一个24孔板中，每个植株的叶片平均分配到4个孔。以一个24孔板计为1个重复，共设3个重复，统计死亡率。结果如表9所示。
表9、转基因玉米载体DBN11815的T2代对二龄东方黏虫的抗性结果-死亡率(％)
Figure BDA0004121775660000332
Figure BDA0004121775660000341
实施例5.3的结果表明：与非转基因对照植株、其它9个包含Cry1Fa2、Cry2Ab2和pat基因的表达载体相比，转基因玉米载体DBN11815测试3个转化事件，在转基因位点分别为杂合和纯合植株中，对小地老虎和二龄东方黏虫均具有良好的抗性，不同转化事件抗虫表现稳定。
经第五实施例综合评估测试，DBN11815抗虫生物测定、抗虫蛋白表达量以及在不同世代间抗虫稳定性上综合表现最优，选择表现优良的转化事件DBN9235，用于产品开发。
第六实施例、转基因玉米事件DBN9235事件的昆虫抗性检测
6.1、转基因玉米事件DBN9235在玉米自交系DBN567遗传背景下的生物测定
将来自优选的转基因玉米载体DBN11815中的转基因玉米事件DBN9235和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种植株分别对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，FAW)、东方黏虫(Mythimna seperata，OAW)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis，ACB)、棉铃虫(Helicoverpa armigera，CBW)、桃蛀螟(Conogethes punctiferalis，YPM)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura，TCW)和小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg，BCW)进行生物测定，试验设计和试验方法与上述实施例5.1一致。结果如表10所示。
表10、转基因玉米事件DBN9235叶片组织的抗虫生物测定结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000342
结果表明：转基因玉米事件DBN9235受体背景叶片组织对草地贪夜蛾、东方黏虫、亚洲玉米螟、棉铃虫、桃蛀螟、斜纹夜蛾和小地老虎均具有较好的抗性，且转基因玉米事件DBN9235的试虫死亡率和抗性总分均显著高于NGM。
6.2、转基因玉米事件DBN9235在不同遗传背景下的生物测定通过回交方式，将转基因玉米事件DBN9235导入两个遗传差异较大的玉米自交系，MLA05和MLB07，世代为BC4F3。在新的遗传背景下评估玉米事件DBN9235的抗虫表现。将转基因玉米事件DBN9235和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种植株分别对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，FAW)、东方黏虫(Mythimna seperata，OAW)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis，ACB)进行生物测定，试验设计和试验方法与上述实施例5.1的评价一致。结果如表11所示。
表11、转基因玉米事件DBN9235叶片组织的抗虫生物测定结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000351
结果表明：转基因玉米事件DBN9235不同遗传背景叶片组织对草地贪夜蛾、东方黏虫和亚洲玉米螟均具有较好的抗性，且转基因玉米事件DBN9235的试虫死亡率和抗性总分均显著高于NGM。
6.3、转基因玉米事件DBN9235在玉米杂交种MZ003遗传背景下的生物测定
将转基因玉米事件DBN9235与常规非转基因玉米自交系MLT05杂交，获得转基因玉米杂交种MZ003，在杂交种背景下评估玉米事件DBN9235的抗虫表现。
(1)转基因玉米事件DBN9235的杂交种MZ003叶片组织的生物测定将包含玉米事件DBN9235的杂交种MZ003和常规玉米杂交种MZ003(非转基因，NGM)两种植株分别对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，FAW)和东方黏虫(Mythimna seperata，OAW)进行生物测定，试验设计和试验方法与上述实施例5.1一致。结果如表12所示。
表12、转基因玉米事件DBN9235叶片组织的抗虫生物测定结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000352
Figure BDA0004121775660000361
结果表明：转基因玉米事件DBN9235的杂交种MZ003叶片组织对草地贪夜蛾和东方黏虫均具有较好的抗性，且转基因玉米事件DBN9235的试虫死亡率和抗性总分均显著高于NGM。
(2)转基因玉米事件DBN9235的杂交种MZ003在田间的抗虫效果
将包含玉米事件DBN9235的杂交种MZ003和常规玉米杂交种MZ003(非转基因，NGM)两种植株的的种子按随机区组设计，3次重复，每个重复的小区面积为30m2(5m×6m)，行距60cm，株距25cm，常规栽培管理，全生育期不喷施杀虫剂。不同昆虫试验小区之间有2m的间隔，避免昆虫在不同小区之间的扩散。
(a)棉铃虫
在玉米吐丝期进行人工接虫，共接虫2次，每小区人工接虫植株数不少于40株，在每株玉米花丝中接人工饲养的初孵幼虫约20头。初次接虫3天后，进行第二次接虫，接虫数量同第一次。在接虫14-21天后，逐株调查雌穗被害率、每个雌穗存活幼虫数和雌穗被害长度。通常接虫后14天开始调查，若此时NGM的为害级别达到感或高感，则视为有效，若没有达到可适当推迟调查，但若接虫后21天NGM的为害仍未达到相应级别，则本次接虫视为无效。根据雌穗被害率、存活幼虫数、雌穗被害长度(cm)，计算各小区玉米穗期棉铃虫对雌穗的为害级别平均值，判断标准如表13所示，然后按表14的标准判别玉米穗期对棉铃虫的抗性水平。转基因玉米事件DBN9235吐丝期对棉铃虫的抗性结果如表15所示。
表13、玉米雌穗受棉铃虫为害程度的分级标准
Figure BDA0004121775660000362
表14、玉米雌穗对棉铃虫的抗性评价标准
Figure BDA0004121775660000363
Figure BDA0004121775660000371
表15、转基因玉米事件DBN9235雌穗对棉铃虫的抗性结果
Figure BDA0004121775660000372
结果表明：在人工接种的条件下，转基因玉米事件DBN9235对棉铃虫表现高抗水平。转基因玉米事件DBN9235对棉铃虫的被害级别显著低于非转基因玉米(NGM)。
(b)亚洲玉米螟
试验方法与上述评价棉铃虫抗性一致。不同的是，根据雌穗被害情况、蛀孔数量、蛀孔隧道长度(cm)以及存活幼虫龄期和存活数量，计算各小区玉米穗期亚洲玉米螟对雌穗的抗性被害级别平均值，判断标准如表16所示，然后按表17的标准判别玉米穗期对亚洲玉米螟的抗性水平。转基因玉米事件DBN9235吐丝期对亚洲玉米螟的抗性结果如表18所示。
表16、玉米雌穗受亚洲玉米螟为害程度的分级标准
雌穗被害级别 症状描述
1 雌穗没有受害
2 花丝被害＜50％
3 大部花丝被害≥50％；有幼虫存活，龄期≤2龄
4 穗尖被害≤1cm；有幼虫存活，龄期≤3龄
5 穗尖被害≤2cm；或有幼虫存活，龄期≤4龄；隧道长度≤2cm
6 穗尖被害≤3cm；或有幼虫存活，龄期>4龄；隧道长度≤4cm
7 穗尖被害≤4cm；隧道长度≤6cm
8 穗尖被害≤5cm；隧道长度≤8cm
9 穗尖被害＞5cm；隧道长度>8cm
表17、玉米雌穗对亚洲玉米螟的抗性评价标准
Figure BDA0004121775660000373
Figure BDA0004121775660000381
表18、转基因玉米事件DBN9235雌穗对亚洲玉米螟的抗性结果
Figure BDA0004121775660000382
结果表明：在人工接种的条件下，转基因玉米事件DBN9235对亚洲玉米螟表现高抗水平。转基因玉米事件DBN9235对亚洲玉米螟的被害级别显著低于非转基因玉米(NGM)。
(c)草地贪夜蛾
试验方法不同于以上棉铃虫和亚洲玉米螟，草地贪夜蛾为田间自然感虫条件下评估。在草地贪夜蛾发生较为严重的地区对转基因玉米事件DBN9235进行自然条件下的田间抗虫测试。在小喇叭口期左右评估叶片组织，发生虫害10-15天后，且NGM多为5-6龄高龄幼虫危害时，逐株调查草地贪夜蛾对玉米叶片为害情况，计算各重复草地贪夜蛾对玉米叶片为害级别的平均值，其判断标准如表19所示，然后按表20的标准判别玉米小喇叭口期叶片对草地贪夜蛾的抗性水平。转基因玉米事件DBN9235小喇叭口期对草地贪夜蛾的抗性结果如表21所示。
表19、玉米叶片受草地贪夜蛾为害程度的分级标准
食叶级别 为害症状
0 叶片没有明显为害
1 叶片仅有针刺状孔洞
2 叶片有针刺状孔和2mm左右小圆孔
3 心叶片有针刺状孔、2mm左右小圆孔和少量长度≤1.3厘米的长条状孔
4 心叶有部分长度介于1.3-2.5厘米的长条状孔
5 少量心叶有长度≥2.5厘米的长条状孔，或少量小于2厘米不规则状孔
6 部分心叶有长度≥2.5厘米的长条状孔，或有部分大于2厘米不规则状孔
7 大部分心叶存在部分长度条性状孔，且存在部分大于2厘米不规则状孔
8 大部分心叶存在较多长度条性状孔，且存在较多大于2厘米不规则状孔
9 心叶几乎被取食光
表20、玉米叶片对草地贪夜蛾的抗性评价标准
叶片平均为害级别 抗性水平
0.0～4.0 轻度为害
5.0～7.0 中等为害
8.0～9.0 严重为害
表21、转基因玉米事件DBN9235自然感虫条件下叶片组织对草地贪夜蛾的抗性结果
Figure BDA0004121775660000391
结果表明：在草地贪夜蛾自然发生条件下，转基因玉米事件DBN9235对草地贪夜蛾具有较好的抗性水平。转基因玉米事件DBN9235叶片组织对草地贪夜蛾的被害级别显著低于非转基因玉米(NGM)。
6.4、转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936的生物测定及应用评估
将转基因玉米事件DBN9235与DBN9936(CN104830847B)和DBN9501(CN109868273B)进行遗传整合，导入到同一个玉米植株中。具体为，首先将转基因玉米事件DBN9936与转基因玉米事件DBN9501杂交，获得叠加转基因玉米事件DBN9501×DBN9936的杂合植株，然后经过两代自交，并通过TaqMan检测目标基因拷贝数(参考第二实施例)和PCR接合性检测位点的纯杂合(参考第三实施例)，获得叠加转基因玉米事件DBN9501×DBN9936纯合植株，将其作为父本与转基因玉米事件DBN9235(母本)杂交，获得叠加转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936。
本领域的技术人员应当知晓，除上述示例外，还有其他多种杂交组合方式可以将转基因玉米事件DBN9235、DBN9501和DBN9936导入到同一个玉米植株中。
(1)转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936对草地贪夜蛾抗性检测
(a)转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936叶片组织的生物测定
将转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种植株对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，FAW)进行生物测定，试验设计和试验方法与上述实施例5.1的评价一致。结果如表22示。
表22、转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936叶片组织对初孵草地贪夜蛾的抗性结果-死亡率(％)和抗性总分(分)
Figure BDA0004121775660000392
Figure BDA0004121775660000401
结果表明：转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936杂交种背景叶片组织对草地贪夜蛾具有较好的抗性，且转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936的试虫死亡率和抗性总分均显著高于非转基因玉米(NGM)。
(b)转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936田间效果
试验设计和试验方法与上述的实施例6.3(2)(c)草地贪夜蛾评估一致，且判断标准如上表19所示，抗性评价标准如上表20所示。转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936小喇叭口期对草地贪夜蛾的抗性结果如表23所示。
表23、转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936自然感虫条件下叶片组织对草地贪夜蛾的抗性结果
Figure BDA0004121775660000402
结果表明：在草地贪夜蛾自然发生条件下，转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936对草地贪夜蛾具有较好的抗性水平，且转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936叶片组织被害级别显著低于非转基因玉米(NGM)。
(2)转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936产量和品质评估
遗传叠加的转基因玉米DBN9235×DBN9501×DBN9936对亚洲玉米螟具有多个抗虫机制。可进一步减少实际生产中要求的抗虫庇护所的比例，更好的保护生产效益并延缓抗性发生。将转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936(多抗虫机制，5％庇护所混种)和DBN9936(单一抗虫机制，20％庇护所条播)在亚洲玉米螟自然发生较为严重的地区进行评估。试验设计为每处理种植20行，行长9m，行距60cm，株距28cm，常规栽培管理。根据NY/T1611-2017玉米螟测报技术规范，调查亚洲玉米螟发生代数、各代发生级别、为害率(为害率＝被害虫取食的玉米植株数量/总植株数量×100％)。计算每个小区的玉米产量为各小区的玉米籽粒总产量(重量)，不同产品的产量差异以产量百分率的形式进行度量，产量百分率(％)＝DBN9235×DBN9501×DBN9936(5％庇护所混种)/DBN9936(20％庇护所条播)×100％。产量百分比结果如表24所示。并且计算各小区发霉果穗比率，仅统计由亚洲玉米螟导致的发霉果穗(发霉果穗比率＝发霉果穗数/总植株数量×100％)。不同产品的发霉果穗比率如表24所示。
调查发现，种植地区当年亚洲玉米螟发生两代，一代亚洲玉米螟危害率为57％，二代亚洲玉米螟百株活虫数为56头。前后两代亚洲玉米螟均为4级偏重发生级别。在该亚洲玉米螟自然发生较为严重的条件下，因玉米螟为害引起的果穗霉变率，DBN9235×DBN9501×DBN9936(多抗虫机制，5％庇护所混种)显著低于DBN9936(单一抗虫机制，20％庇护所条播)，籽粒品质显著提升(表24)。同时产量方面表现略有提高(表24)。体现了遗传叠加DBN9235×DBN9501×DBN9936玉米转化事件在生产应用中的巨大价值。
表24、转基因玉米事件DBN9235×DBN9501×DBN9936对品质和产量的评估结果
Figure BDA0004121775660000411
第七实施例、事件的除草剂耐受性评估
7.1、营养期损伤的耐受性及其稳定性评估
对转基因玉米事件DBN9235的T3、T4和T5等世代的材料喷施草铵膦进行评估。试验选用保试达(Basta)除草剂(有效成分为18％的草铵膦铵盐水剂)进行喷施，保试达进行田间控草的推荐使用浓度是400g a.i./ha。各世代材料评估试验均对DBN9235进行以下两种除草剂处理：(1)按800g a.i./ha(a.i./ha是指“活性成分每公顷”)剂量在V3期喷施保试达除草剂；(2)不喷施除草剂，在处理(1)喷施除草剂的同时，喷施等体积的清水。每种处理均设置3个重复，每个重复2行(行长9m，行距60cm，株距28cm)。并设置非转基因玉米(NGM)为平行对照。
在用药后2周调查药害症状，药害症状分级如表25所示。用营养期受损评分作为评价转化事件除草剂耐受性的指标。营养期损伤主要指在草铵膦处理后短期内(几小时至十几天)造成的诸如叶片灼伤、畸形、枯萎等药害表现；具体地，营养期损伤评分＝∑(同级受害株数×级别数)/(总株数×最高级别)×100；其中营养期损伤评分是根据草铵膦处理后2周的药害调查结果而确定的。需要说明的是，不同含量和剂型的草铵膦除草剂换算成上述等量有效成分草铵膦均适用于以下结论。转基因玉米事件DBN9235对草铵膦除草剂耐受性结果如表26所示。
表25、草铵膦除草剂对玉米营养期损伤程度的分级标准
药害级别 症状描述
0 生长正常，无任何受害症状
1 叶基部出现轻微灼伤，灼伤面积≤10％
2 叶基部明显灼伤，灼伤面积＞10％，14天内可恢复
3 植株叶片畸形或从药害部位断裂，14天内不可恢复
4 植株严重畸形；叶片萎缩，干枯死亡
表26、转基因玉米事件DBN9235对草铵膦除草剂耐受性的结果
Figure BDA0004121775660000421
结果表明：在不同世代中，转基因玉米事件DBN9235在草铵膦除草剂(800g a.i./ha)处理下营养期损伤评分均为0。由此，转基因玉米事件DBN9235具有良好的草铵膦除草剂耐受性，并且在不同世代间表现稳定。
7.2、对产量影响的评估
本试验在三个不同环境(A：吉林长春市；B：河北唐山市；C：山东济南市)进行，各环境中对转基因玉米事件DBN9235均进行以下两种处理：(1)草铵膦药剂处理：按800g a.i./ha(a.i./ha是指“活性成分每公顷”)剂量在V3期对玉米DBN9235植株喷洒保试达除草剂(2)对照药剂处理：
Figure BDA0004121775660000422
(有效成分为30％的苯唑草酮)+莠去津除草剂混合处理；具体操作为，按25g a.i./ha剂量的/>
Figure BDA0004121775660000423
与按945g a.i./ha剂量的莠去津除草剂混配，将混配后的除草剂在V3期喷洒玉米DBN9235植株。每种处理均设置6个重复。每个重复小区面积为21.6m2(9m×2.4m)，行距60cm，株距28cm，常规栽培管理。每个小区的玉米产量为各小区的玉米籽粒总产量(重量)，不同处理间的产量差异以产量百分率的形式进行度量，产量百分率＝喷施草铵膦小区产量/喷施/>
Figure BDA0004121775660000424
+莠去津小区产量×100％。产量百分率结果如表27所示。
表27、转基因玉米事件DBN9235玉米产量结果
Figure BDA0004121775660000431
结果显示，在不同环境下，转基因玉米事件DBN9235喷施
Figure BDA0004121775660000432
除草剂(25g a.i./ha)+莠去津除草剂(945g a.i./ha)和喷施草铵膦除草剂(800g a.i./ha)两种处理下的产量没有明显差异，由此，进一步表明转基因玉米事件DBN9235具有良好的草铵膦耐受性。
第八实施例
可由转基因玉米事件DBN9235生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的表达量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因玉米事件DBN9235材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的来源于转基因玉米事件DBN9235的核苷酸序列，其中探针序列或引物序列选自如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所示的序列或其部分，以诊断转基因玉米事件DBN9235的存在。
综上所述，本发明转基因玉米事件DBN9235对鳞翅目昆虫具有较好的抗性，同时对草铵膦除草剂具有较高的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件DBN9235的DNA分子。
对应于转基因玉米事件DBN9235的种子已根据布达佩斯条约于2022年7月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.45228。保藏物将在保藏处保藏30年。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.一种具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1-223位中至少11个连续的核苷酸和SEQ IDNO:3或其互补序列第224-844位中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ IDNO:4或其互补序列第1-401位中至少11个连续的核苷酸和SEQ ID NO:4或其互补序列第402-904位中至少11个连续的核苷酸；
优选地，所述核酸序列具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1-223位中22-25个连续的核苷酸和SEQ ID NO:3或其互补序列第224-844位中22-25个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1-401位中22-25个连续的核苷酸和SEQ ID NO:4或其互补序列第402-904位中22-25个连续的核苷酸；
优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ IDNO:2或其互补序列；
优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ IDNO:4或其互补序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列。
3.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包含权利要求1或2所述核酸序列；优选地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
4.根据权利要求3所述检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，其特征在于，所述两种引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:2的互补序列和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11、或者SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的互补序列。
5.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与探针接触，所述探针包含权利要求1所述核酸序列；优选地，所述探针包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
6.根据权利要求5所述检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
7.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9235的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括权利要求1所述核酸序列；优选地，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、和/或SEQ ID NO:6-11或其互补序列；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。
8.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包含权利要求1所述核酸序列，其可以作为对于转基因玉米事件DBN9235或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；优选地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ IDNO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
9.一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述转基因玉米植物；
优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列；
优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中依次包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5第424-11342位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列。
10.一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤或控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，所述转基因玉米植物对草铵膦除草剂具有耐受性；
优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列；
优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第424-11342位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ IDNO:5所示的序列。
11.一种培养对昆虫具有抗性和/或耐受草铵膦除草剂的玉米植物的方法，其特征在于，包括：
种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含编码昆虫抗性Cry1Fa2蛋白的核酸序列、Cry2Ab2蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域的核酸序列，或者所述玉米种子的基因组中包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
使所述玉米种子长成玉米植株；
用靶昆虫侵袭所述玉米植株和/或用有效剂量草铵膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
12.一种产生对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，包括：向所述玉米植株的基因组中引入编码昆虫抗性Cry1Fa2蛋白的核酸序列、Cry2Ab2蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列；
优选地，所述方法包括将第一玉米植物基因组中包含的编码昆虫抗性Cry1Fa2蛋白的核酸序列、Cry2Ab2蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域的核酸序列，或者将所述第一玉米植物基因组中包含的SEQ ID NO:5所示的核酸序列，引入第二玉米植物，从而产生大量子代植株；选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株，且所述子代植株对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列；
优选地，所述方法包括将转基因玉米事件DBN9235与缺少昆虫抗性和/或草铵膦耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株；
优选地，所述方法包括将第一代子代植物自交，由此产生多个第二代子代植物；用靶昆虫侵袭和/或用草铵膦处理所述子代植株；选择对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的所述子代植株。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括将所述对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株与另一玉米亲本进行有性杂交，并且收获由此生产的杂交种子。
14.一种产生自转基因玉米事件DBN9235的农产品或商品，其特征在于，所述农产品或商品为玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。
CN202310235129.XA 2023-03-13 2023-03-13 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法 Pending CN116219063A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310235129.XA CN116219063A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310235129.XA CN116219063A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116219063A true CN116219063A (zh) 2023-06-06

Family

ID=86584227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310235129.XA Pending CN116219063A (zh) 2023-03-13 2023-03-13 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116219063A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109868273B (zh) 用于检测玉米植物dbn9501的核酸序列及其检测方法
CN116144818B (zh) 转基因玉米事件lp026-2及其检测方法
CN112852801B (zh) 转基因玉米事件lp007-1及其检测方法
WO2016173361A1 (zh) 玉米植物dbn9936及用于检测其的核酸序列和方法
CN112831585B (zh) 转基因玉米事件lp007-4及其检测方法
CN112852991B (zh) 转基因玉米事件lp007-7及其检测方法
CN116144817B (zh) 转基因玉米事件lp026-4及其检测方法
WO2016173362A1 (zh) 玉米植物dbn9978及用于检测其的核酸序列和方法
CN111247255B (zh) 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法
CN111406117B (zh) 用于检测大豆植物dbn8002的核酸序列及其检测方法
CN109971880B (zh) 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法
CN113151533B (zh) 转基因玉米事件lp007-6及其检测方法
CN112877454B (zh) 转基因玉米事件lp007-3及其检测方法
CN113151534B (zh) 转基因玉米事件lp007-5及其检测方法
CN116144671A (zh) 转基因玉米事件lp026-3及其检测方法
WO2023155193A1 (zh) 用于检测大豆植物dbn8205的核酸序列及其检测方法
CN116144672B (zh) 转基因玉米事件lp026-1及其检测方法
WO2016173360A1 (zh) 玉米植物dbn9927及用于检测其的核酸序列和方法
CN113980958B (zh) 转基因玉米事件lp007-8及其检测方法
CN116640761B (zh) 转基因玉米事件lp018-1及其检测方法
CN116219063A (zh) 用于检测玉米植物dbn9235的核酸序列及其检测方法
CN116694626B (zh) 转基因玉米事件lp035-2及其检测方法
CN116694627B (zh) 转基因玉米事件lp035-1及其检测方法
CN116694629B (zh) 转基因玉米事件lp038-1及其检测方法
CN116732215A (zh) 用于检测玉米植物dbn9229的核酸序列及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication