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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von Pflanzen, in
denen die Expression eines insektiziden Proteins durch einen wundeninduzierten
Promotor, der eine lokale Expression induziert, vorzugsweise den
TR2'-Promotor, reguliert
wird, die chimären
Gene, die bei diesem Verfahren verwendet werden, und die dadurch
erhaltenen Pflanzen sowie die Verfahren zum Erzielen einer Resistenz
gegen Insekten, die an Pflanzen fressen, durch lokalisierte Expression
eines insektiziden Proteins, das bei Verwundung von Pflanzen durch daran
fressende Insekten induziert wird.
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TECHNISCHER HINTERGRUND
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Die
erfolgreichsten Versuche zur Herstellung von Pflanzen, die gegenüber einem
Angriff durch Insekten resistent sind, wurden durch Expression von
Insektentoxinen in hohem Niveau erhalten, und es wird angenommen,
dass sie darauf beruhen (Estruch et al., 1997; Witowsky & Siegfried, 1997).
Insbesondere bei den Bt-Toxinen, von denen gefunden wurde, dass
sie als Volllängenproteine
in Pflanzen wenig exprimiert werden, konzentrierten sich die Anstrengungen
auf eine Erhöhung
der Expression dieser Toxine in Pflanzen durch Verwendung starker
konstitutiver Promotoren und durch Modifikation der Gene, die sie
codieren (Vaeck et al., 1987; Barton et al., 1987). Vor kurzem hat
man vorgeschlagen, dass eine räumliche
Regulation der Expression des insektiziden Proteins in solchen Geweben,
die einem Angriff durch Fraß des
Insekts unterliegen, oder die dadurch ausgelöst wird, möglicherweise Vorteile beim
Resistenzmanagement bieten (Peferoen & Van Rie, 1997). Eine der hauptsächlichen
Bedingungen für
die Erlangung einer rechtlichen Genehmigung für transgene, insektenresistente
Pflanzen ist die Verfügbarkeit
einer Insektenresistenzmanagement-Strategie. Die zurzeit bevorzugte
Strategie ist die Kombination von 100% Toxizität der transgenen Pflanzen gegenüber den
(dem) Ziel-Schädling(en),
die durch Expression eines spezifischen Toxins in starker Dosis
und dies während
des vollständigen
Lebenszyklus des Schädlings
erhalten wird, mit der Verwendung von Refugien nicht-transgener Pflanzen,
welche die Aufrechterhaltung der Population an Ziel-Schädlingen
gestatten (De Maagd et al. 1999). Um in der Lage zu sein, eine solche
Strategie zu bewältigen,
wurde die Verwendung starker konstitutiver Promotoren bei der gentechnologischen
Herstellung insektenresistenter Pflanzen weiter gefördert.
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Eine
induzierbare Expression von Insektenresistenz wurde hauptsächlich für die Kartoffelproteinase-Inhibitor-Gene (pin1
und pin2) untersucht, die Teil des natürlichen Abwehrsystems in Pflanzen
sind und nach Verwundung die Bildung eines systemischen Signals
in den gesamten Pflanzen gewährleisten
(Green und Ryan, 1972; Hilder et al. 1987). Das Einbringen des pin2-Gens
in Reis führte
zu einer systemischen Akkumulation des Proteins in einem hohen Niveau
in Reispflanzen, die eine erhöhte
Resistenz gegen hauptsächliche
Schädlinge
zeigten (Duan et al., 1996). Breitler et al. (2001) beschreiben
die Verwendung der C1-Region des Mais-Proteinase-Inhibitor- (MPI-) Gens zum
Antreiben einer wundeninduzierbaren Expression der für cry1B
codierenden Sequenz in Reis, und es wurde gefunden, dass die ersten
Transformanten Reis wirksam gegen Stängelbohrerangriff schützen, wobei
die wundeninduzierte Expression sowohl als lokal als auch als systemisch
beschrieben wurde.
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In
einem Laborexperiment im kleinen Maßstab waren transgene Kohlblätter, die
mit dem cry1Ab3-Gen, das unter die Kontrolle des induzierbaren vspB-Promotors
der Sojabohne gestellt worden war, transformiert waren, genauso
toxisch für
die Kohlmotte, wie diejenigen, die mit dem gleichen Gen unter der Kontrolle
des 35S- Promotors
transformiert waren, aber eine Wundeninduzierbarkeit wurde nicht
gezeigt (Jin et al., 2000).
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Der
TR2'-Promotor des
Mannopinsynthase-Gens von Agrobacterium tumefaciens, von dem ursprünglich angenommen
worden war, dass er eine konstitutive Expression steuert (Velten
et al. 1984; Vaeck et al. 1987), wurde dazu verwendet, eine wundeninduzierbare
Expression eines nativen Cry1Ab-Gens in Tomate zu steuern, was zu
einer relativ niedrigen Expression und nur mäßiger Insektenbekämpfung führte (Reynaerts & Jansens, 1994).
Obwohl eine mögliche
breite Anwendung für
die Expression von Bt-Proteinen vorgeschlagen wurde (Peferoen 1997),
scheint es Diskrepanzen zwischen den Berichten über das Expressionsmuster des TR2'-Promotors in Tabak
und anderen Dikotylen zu geben (Ni et al. 1995). Im Allgemeinen
ist die Verwendung von Monokotylen-Promotoren für eine optimale Expression
von Genen in Monokotylen bevorzugt (Shimamoto, 1994), und es wurde
gefunden, dass bestimmte Promotoren unterschiedliche in cis wirkende
Elemente in Mono- und in Dikotylen besitzen (Luan et al. 1992).
Der Beitrag verschiedener Elemente des TR2'-Promotors zu dessen Aktivität wurde
in Mais-Protoplasten untersucht (Fox et al., 1992), aber es gibt
keine Berichte über
das Expressionsmuster des TR2'-Promotors
in einer monokotylen Pflanze. Ferner wurde gefunden, dass die stärkste Deletionsmutante
20-mal weniger aktiv war als der CaMV-35S-Promotor (Fox et al.,
1992).
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Die
Agrobacterium-Mannopinsynthase-Promotoren wurden derart charakterisiert,
dass sie konstitutive, wurzelspezifische und gewebespezifische Promotoren
sind, siehe z.B. die
US-Patente
6291745 ,
6320100 und
63133378 . Im
US-Patent 5641664 wird angenommen,
dass verschiedene konstitutive sowie organ- und gewebespezifische
Promotoren, die dazu verwendet werden, die Expression von Genen
in transformierten dikotylen Pflanzen zu steuern, auch für die Verwendung
in transformierten Monokotylen geeignet sind. Als Teil einer allgemeinen
Liste geeigneter fremder konstitutiver Promotoren zum Transformieren
von Pflanzenzellen sind in diesem Patent die Promotoren TR1' und TR2' erwähnt, welche
die Expression der Gene 1' bzw.
2' der T-DNA von
Agrobacterium antreiben, und es wird gesagt, dass es sich dabei
um wundeninduzierbare Promotoren handelt. Dieses Patent zeigt keine
mit dem TR2'- oder
dem TR1'-Promotor
transformierte monokotyle Pflanze, noch gibt es irgendeinen Vorschlag,
dass diese Promotoren wundeninduzierte Promotoren in monokotylen
Pflanzen sind oder zur Expression eines insektiziden Proteins in
einer monokotylen Pflanze geeignet sind.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt, wie der TR2'-Promotor dazu verwendet werden kann,
eine wundeninduzierte Expression eines insektiziden Proteins in
monokotylen Pflanzen zu steuern, um eine Insektenresistenz zu erzielen.
Eine solche wundeninduzierbare Expression des TR2'-Promotors führt zu einer
starken, aber lokalisierten Erhöhung
der Expression des insektiziden Proteins. Die mutmaßliche Wirkung
auf Pflanzenvitalität
und -wachstum, die bei einer Expression einiger Bt-Proteine auf
hohem Niveau, insbesondere nach wiederholter Inzucht (wie in
WO 00/26378 für Cry2Ab
beschrieben), beobachtet wird, ist wahrscheinlich verringert, weil
die beschränkte
Expression des Proteins jegliche Belastung auf Funktionen, die für die Aufrechterhaltung
der agronomischen Qualitäten
der gentechnologisch veränderten
Nutzpflanze wichtig sind, minimieren sollte. Dies ist ebenfalls
ein wichtiger Faktor, wenn eine Akkumulation (Stacking) verschiedener
Merkmale (oder verschiedener Bt-Proteine) in Betracht gezogen wird.
Da Expressionsniveaus in starker Dosis nach Kontakt mit dem Ziel-Schädling erzielt
werden, sollten solche Pflanzen mit derzeitigen IRM-Strategien übereinstimmen.
Weiterhin verringert die Kombination der Spezifität des produzierten
Insektentoxins mit einem räumlich und
zeitlich beschränkten
Expressionsmuster (d.h. in Geweben, die für Verwundung empfänglich sind,
nach Verwundung) wahrscheinlich die Exposition von Nicht-Ziel-Organismen,
was als vorteilhaft gegenüber
einer konstitutiven Produktion der
. Toxine
durch die Pflanzen angesehen werden kann. Somit ist ein wirksames
System einer regulierten Expression, die eine wirksame Insektenresistenz
für wichtige
Nutzpflanzen wie Mais und Reis, gewährleistet, sowohl unter rechtlichen
als auch landwirtschaftlichen Gesichtspunkten von Interesse.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzielen einer
wundeninduzierten Expression eines Insektiziden Proteins in einer
monokotylen Pflanze, wobei das Verfahren umfasst, dass man in das
Genom der Pflanze eine fremde DNA, bei der es sich um ein chimäres Gen
mit einer DNA-Sequenz handelt, die für das insektizide Protein unter
der Kontrolle einer Promotorregion, die den TR2'-Promotor umfasst, codiert, einbringt.
Gemäß einer
bestimmten Ausführungsform
der Erfindung ist das insektizide Protein ein Bacillusthuringiensis-Toxin.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das insektizide Protein ein insektizides
Protein, das gegen Schädlinge
von monokotylen Pflanzen aktiv ist, am stärksten bevorzugt kann das insektizide
Protein ein Cry1Ab-, Cry1F-, Cry2Ae-, Cry9C- oder Cry2Ab-Protein
oder ein insektizides Fragment davon oder eine Mutante davon sein.
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Somit
betrifft eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzielung von Insektenresistenz,
vorzugsweise eine starke Dosis einer Insektenresistenz, in Pflanzen,
Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, insbesondere in monokotylen,
besonders Gramineen-, insbesondere Mais-, Pflanzen, -Pflanzenzellen
oder -Pflanzengeweben, indem die Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe
mit einer fremden DNA ausgestattet werden, die eine DNA-Sequenz
umfasst, die für
ein insektizides Protein unter der Kontrolle einer Promotorregion,
die den TR2'-Promotor
umfasst, codiert. Erfindungsgemäß wird der TR2'-Promotor dazu verwendet,
die Expression des insektiziden Proteins nach Verwundung, z.B. durch
Fraß von
Insekten, zu erhöhen.
Somit ist gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung die Expression des insektiziden Proteins in monokotylen
Pflanzen, die vorzugsweise im Gewächshaus durch einen ELISA-Assay
gemessen wird, in Abwesenheit einer Verwundung oder eines Befalls
in Blättern
niedrig (d.h. unter 0,005% des gesamten löslichen Proteins (Mittelwert
mehrerer Messungen, die an mehreren, vorzugsweise mindestens 3,
insbesondere mindestens 5, Pflanzen des gleichen Trans formationsereignisses
vorgenommen werden), und in den verwundeten oder befallenen Geweben,
insbesondere Blättern,
innerhalb von 24 Stunden erhöht, vorzugsweise
zumindest verdoppelt, am stärksten
bevorzugt 5- bis 100fach erhöht.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein chimäres Gen, das eine DNA-Sequenz
umfasst, die für
ein insektizides Protein unter der Kontrolle des wundeninduzierbaren TR2'-Promotors codiert, dazu verwendet, monokotylen
Pflanzen, insbesondere Gramineen, ganz besonders Mais, eine Insektenresistenz
zu verleihen, indem eine lokale Expression des insektiziden Proteins
an der Stelle des Insektenfraßes
gesteuert wird. Bei einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung
ist der TR2'-Promotor in
den vorstehenden Pflanzen und Verfahren eine Promotorregion, die
ein Fragment der SEQ ID NO: 1 umfasst, das von einer Nukleotidposition
zwischen den Nukleotidpositionen 1 und 336 bis zur Nukleotidposition 483 überspannt,
eine Promotorregion, die die Sequenz der Nukleotide 96 bis 483 der
SEQ ID NO: 1 umfasst, oder eine Promotorregion, die die Sequenz
der SEQ ID NO: 1 umfasst. Bei einer besonderen Ausführungsform der
Erfindung ist die Expression (wie im Gewächshaus gemessen) in Blättern nicht-verwundeter,
nicht-befallener
Pflanzen niedrig oder nicht nachweisbar (niedriger als 0,005% des
gesamten löslichen
Proteins (Mittelwert mehrerer Messungen, die an mehreren, vorzugsweise
mindestens 3, insbesondere mindestens 5, Pflanzen des gleichen Ereignisses
vorgenommen wird)), und nach Infektion werden erhöhte Niveaus
an insektizidem Protein (zumindest eine Verdopplung, vorzugsweise
eine 5- bis 100fache Erhöhung
oder mehr) innerhalb von 18 Stunden lokal in den infizierten Geweben
induziert. Gemäß diesem
Aspekt der Erfindung werden Pflanzen, genauer gesagt, monokotyle
Pflanzen, bereitgestellt, die insektenresistent sind, weil in ihrem
Genom eine fremde DNA vorliegt, die eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein insektizides
Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors codiert, wodurch eine Expression
in verwundeten Geweben gewährleistet
wird. Gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung ist die Expression eines insektiziden Proteins in
den Pflanzen derart, dass in Abwesenheit von Verwundung der Pflanze
(z.B. wenn sie im Gewächshaus
gezüchtet
wird) das Insektizide Protein bei niedrigen oder nicht nachweisbaren
Niveaus (d.h. niedriger als 0,005% des gesamten löslichen Proteins
(Mittelwert mehrerer Messungen, die an mehreren, vorzugsweise mindestens
3, insbesondere mindestens 5, Pflanzen des gleichen Ereignisses
vorgenommen wird)) in Blättern,
im Stängel,
in Samen und Pollen, vorzugsweise zumindest in Blättern und
Pollen, insbesondere zumindest in Blättern, liegt, und nach Fraß durch
Insekten in dem verwundeten Gewebe, vorzugsweise in den Blättern, auf
ein Niveau erhöht
wird, das ausreicht, um den fressenden Schädling abzutöten, vorzugsweise auf eine
Konzentration von mindestens 0,01% des gesamten löslichen
Proteins.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der TR2'-Promotor
in monokotylen Pflanzen dazu verwendet, ihnen eine Insektenresistenz
zu verleihen, indem eine wundeninduzierbare Expression eines insektiziden
Proteins, das ein Bt-Toxin ist, gesteuert wird. Beispiele für solche
DNA-Sequenzen, die für
Bt-Toxine codieren, sind im Stand der Technik bekannt und hier beschrieben.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des TR2'-Promotors in Mais
zur Steuerung einer wundeninduzierbaren Expression eines Bt-Toxins
besonders dazu geeignet, gentechnologisch eine Resistenz gegen den
Maiszünsler
(European Corn Borer, ECB) auf Basis der lokalen Expression des
Toxins in starker Dosis in der Pflanze nach Fraß durch die Zielinsekten zu
erzeugen. Die erfindungsgemäßen Pflanzen
oder Pflanzenteile (Zellen oder Gewebe), die in ihrem Genom eine
fremde DNA umfassen, die eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Insektizides
Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors codiert, produzieren nach
Verwundung Niveaus an insektizidem Protein, die für ECB-Larven,
einschließlich ECB-Larven
des vierten Stadiums, toxisch sind, wie durch hier beschriebene
Insektenwirksamkeitstests bestimmt werden kann. Vorzugsweise werden
Sterblichkeitsraten von ECB-Larven im viertem Larvenstadium von zumindest
97%, vorzugsweise mindestens 99%, am stärksten bevorzugt 100% erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner monokotyle Pflanzen, die gegenüber Insekten
resistent sind, wobei sie sehr niedrige Basalexpressionsniveaus
an insektizidem Protein in nicht-verwundeten Blättern der Pflanze exprimieren.
Gemäß einem
bestimmten Aspekt dieser Erfindung werden monokotyle Pflanzen, insbesondere
Mais, erhalten, welche eine effiziente Insektenresistenz mit optimalen
agronomischen Eigenschaften kombinieren, wobei dies nicht zu Lasten
der agronomischen Leistungen aufgrund der Expression des insektiziden
Proteins geht, wie durch Untersuchungen von Pflanzenphänotyp, -segregation,
-auflaufen, -stärke
und agronomische Bewertungen bestätigt werden kann.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt dieser Erfindung werden monokotyle Pflanzen, insbesondere
Maispflanzen, erhalten, die insektenresistent und ganz besonders
für die
Akkumulation mit weiteren Merkmalen (z.B. anderen Typen der Insektenresistenz,
Herbizidresistenz oder agronomischen Merkmalen) geeignet sind.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung werden monokotyle Pflanzen, insbesondere
Maispflanzen, bereitgestellt, die gegenüber (einem) Ziel-Schädling(en)
resistent sind, bei denen aber die Produktion des insektiziden Proteins
vorzugsweise in Blättern
und Pollen, besonders in Blättern,
in Abwesenheit einer Verwundung niedrig bis nicht nachweisbar ist,
was das Aussetzen von Nicht-Zielorganismen gegenüber dem insektiziden Protein
beschränkt.
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Erfindungsgemäß werden
die Pflanzen mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften erhalten,
indem man in das Genom der Pflanze eine DNA-Sequenz, die für ein insektizides
Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors,
von dem gezeigt wurde, dass er in monokotylen Pflanzen, insbesondere
in Maispflanzen, als wundeninduzierbarer Promotor wirkt, codiert,
einbringt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Der
Begriff "Gen", wie hier verwendet,
betrifft jede DNA-Sequenz, die mehrere operativ verknüpfte DNA-Fragmente umfasst,
wie eine Promotorregion, eine 5'-untranslatierte Region
(die 5'UTR), eine
codierende Region (die für
ein Protein codieren kann oder nicht) und eine 3'-untranslatierte Region (3'UTR), die eine Polyadenylierungsstelle
umfasst. Üblicherweise
werden in Pflanzenzellen die 5'UTR,
die codierende Region und die 3'UTR
in eine RNA transkribiert, von der im Falle eines proteincodierenden
Gens die codierende Region in ein Protein translatiert wird. Ein
Gen kann zusätzliche
DNA-Fragmente enthalten, wie zum Beispiel Introns. Während eine
Promotorregion in einem Gen erforderlich ist, das für die Transformation
bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, muss die 3'-UTR, die eine Polyadenylierungsstelle
umfasst, in dem übertragenen
Gen selbst nicht vorhanden sein, sondern kann sich in den stromaufwärts gelegenen
Pflanzen-DNA-Sequenzen nach der Insertion eines Gens, das keine
3'-UTR, die eine
Polyadenylierungsstelle umfasst, enthält, befinden. Ebenso kann eine
erfindungsgemäße codierende
Sequenz in das Pflanzengenom stromabwärts eines bestehenden Pflanzenpromotors
eingesetzt werden, so dass die Expression des erfindungsgemäßen Insektiziden
Proteins von einem solchen rekonstituierten chimären Gen in der Pflanze (z.B. wie
bei Promotor-Tagging-Experimenten) erfolgt.
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Der
Begriff "chimär", wenn er sich auf
ein Gen oder eine DNA-Sequenz bezieht, betrifft ein Gen oder eine
DNA-Sequenz, die mindestens zwei funktionell relevante DNA-Fragmente
(wie Promotor, 5'UTR,
codierende Region, 3'UTR,
Intron), die nicht natürlicherweise
miteinander in Zusammenhang stehen und/oder zum Beispiel aus verschiedenen
Quellen stammen, umfasst. "Fremd" in Bezug auf ein
Gen oder eine DNA-Sequenz wird im Hinblick auf eine Pflanzenspezies
dazu verwendet anzugeben, dass man das Gen oder die DNA-Sequenz
nicht natürlicherweise
in dieser Pflanzenspezies findet oder nicht natürlicherweise an diesem genetischen
Locus in dieser Pflanzenspezies findet. Der Begriff "fremde DNA" wird hier so verwendet,
dass er eine DNA-Sequenz betrifft, wie sie in das Genom einer Pflanze
infolge einer Transformation in dieser Pflanze oder in einer Pflanze,
von der sie ein Nachkomme ist, eingebracht wurde.
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Ein
Genom einer Pflanze, eines Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle,
wie hier verwendet, betrifft jegliches genetische Material in der
Pflanze, dem Pflanzengewebe oder der Pflanzenzelle und beinhaltet
sowohl das nukleäre
als auch das Plastiden- und das Mitochondriengenom.
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Ein "Fragment" oder eine "Verkürzung" eines DNA-Moleküls oder
einer Proteinsequenz, wie hier verwendet, betrifft einen Teil der
genannten ursprünglichen
DNA- oder Proteinsequenz
(Nukleinsäure-
oder Aminosäuresequenz)
oder eine synthetische Version davon (wie eine Sequenz, die an eine
optimale Expression in Pflanzen angepasst wurde), der in der Länge variieren
kann, aber dessen Mindestgröße derart
ist, dass gewährleistet
ist, dass das (codierte) Protein biologisch aktiv ist, wobei die
maximale Größe nicht
entscheidend ist. Eine "Variante" oder "Mutante" einer Sequenz wird
hier verwendet, um auf ein DNA-Molekül oder Protein hinzuweisen,
dessen (Nuklein- oder Aminosäure-)
Sequenz im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ist, auf die sich
der Begriff bezieht.
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Sequenzen,
die "im Wesentlichen
identisch" sind,
bedeutet, dass, wenn zwei Sequenzen ausgerichtet werden, die prozentuale
Sequenzidentität,
d.h. die Anzahl an Positionen mit identischen Nukleotiden oder Aminosäuren, dividiert
durch die Anzahl an Nukleotiden oder Aminosäuren in der kürzeren der
Sequenzen, höher als
70%, vorzugsweise höher
als 85%, stärker
bevorzugt höher
als 90%, besonders bevorzugt höher
als 95%, am stärksten
bevorzugt zwischen 96 und 100% ist. Die Ausrichtung von zwei Nukleotidsequenzen
erfolgt durch den Algorithmus, wie von Wilbur und Lipmann (1983)
beschrieben, unter Verwendung einer Fenstergröße von 20 Nukleotiden, einer
Wortlänge
von 4 Nukleotiden und einer Lückenstrafe
von 4.
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"Insektizid" wird hier so verwendet,
dass es toxisch für
Insekten, die Nutzpflanzenschädlinge
sind, bedeutet. Genauer gesagt, sind im Kontext der vorliegenden
Erfindung Ziel-Insekten die Schädlinge
von monokotylen Pflanzen, ganz besonders von Mais, wie, aber nicht
beschränkt
auf, die hauptsächlichen
Lepidoptera-Schädlinge,
wie Ostrinia mibilalis (Maiszünsler,
European corn borer oder ECB), Sesamia nonagrioides (Maiseule) und
Helicoverpa zea (Maiskolbenbohrer), sowie die hauptsächlichen
Coleoptera-Schädlinge,
wie die Insekten der Diabrotica ssp., insbesondere Diabrotica virgifera
virgifera und Diabrotica undecimpunctata howardi (Maiswurzelbohrer).
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Ein "insektizides Protein" oder "Toxin", wie hier verwendet,
sollte als ein Protein, Polypeptid oder Peptid verstanden werden,
das für
Insekten toxisch ist.
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Beispiele
für ein
solches insektizides Protein sind die Bt-Cry-Toxine, Mutanten oder
insektizide Fragmente davon (wie die in einer Übersicht von Höfte und
Whiteley, 1989, in Crickmore et al. (1998) dargestellten und in
WO 00/26378 ,
WO 97/40162 sowie
US 6,023,013 beschriebenen), genauer
gesagt das Protein Cry2Ae (
WO
02/057664 ) oder ein insektizides Fragment davon, das Protein
Cry2Ab oder ein insektizides Fragment davon, das Protein Cry9C oder
Fragmente oder Mutanten davon (wie z.B. in
WO 94/24264 oder
WO 99/00407 beschrieben), das Cry1F-Protein
oder ein insektizides Fragment davon und das Cry1Ab-Protein oder
ein insektizides Fragment davon sowie die kombinierten 149B1-Toxine
(etwa 14 und 44 Kilodalton) oder insektizide Fragmente davon und
das Cry3Bb-Protein und insektizide Fragmente oder Mutanten davon,
wie in den
US-Patenten 6,548,291 ,
6,063,597 und
6,501,009 beschrieben. Andere insektizide
Proteine sind zum Beispiel die VIPs, insbesondere VIP3A, ganz besonders
die Proteine VI23Aa, VIP3Ab und VIP3Ac oder insektizide Fragmente
davon (Estruch et al., 1996,
WO
96/10083 ,
US-Patente 6,429,360 ,
5,877,012 ), oder die von
den Sequenzen mis, war und sup codierten Proteine (
WO 98/18932 ,
WO 99/57282 ) und die aus Xhenorabdus
und Photorabdus ssp. isolierten Toxine, wie die von Photorabdus
luminescens produzierten (Forst et al., 1997). Weitere insektizide
Proteine sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf, den Kartoffel-Proteinase-Inhibitor I und II,
den Augenbohne-Proteinase-Inhibitor, den Cystein-Proteinase-Inhibitor
aus Sojabohne (Zhao et al., 1996) oder die Cystatine, wie die aus
Reis und Mais isolierten (Irie et al., 1996), Cholesterinoxidasen,
Chitinasen und Lektine. Ein insektizides Protein kann ein Protoxin
(d.h. das primäre
Translationsprodukt eines Volllängengens, das
für ein
insektizides Protein codiert) sein. Ebenfalls umfasst sind Äquivalente
und Varianten, Derivate, Verkürzungen
oder Hybride von jedem der obigen Proteine, die insektizide Aktivität besitzen.
Ein Bt- Toxin oder Bt-Protein,
wie hier verwendet, betrifft ein insektizides Protein, wie zuvor
definiert, das direkt oder indirekt (z.B. derart modifiziert ist,
dass die Expression in Pflanzen oder die Toxizität für Insekten verbessert ist)
von einem Protein stammt, das natürlicherweise von Bacillus thuringiensis
produziert wird, und umfasst eine Sequenz, die im Wesentlichen identisch
zu dem toxischen Fragment eines natürlicherweise produzierten Bt-Toxins
oder mindestens einer Domäne
davon ist. Ein Bt-Toxin oder Bt-Protein, wie hier verwendet, kann
ein Kristallprotein oder ein insektizider Teil davon sein oder kann
ein Nicht-Kristallprotein,
wie ein sezerniertes Protein, oder ein Protein sein, das hauptsächlich während der
vegetativen Phase eines Bt-Stamms produziert wird, oder kann eine
insektizide Mutante oder ein Teil davon sein. "Eine DNA, die für ein insektizides Protein
codiert", wie hier verwendet,
beinhaltet eine verkürzte,
modifizierte, synthetische oder natürlich vorkommende DNA-Sequenz, die
für ein
insektizides Protein codiert.
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Bei
einer besonderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die DNA, die für ein insektizides Protein
codiert, eine DNA-Sequenz, die ein Bt-Toxin codiert, stärker bevorzugt
eine DNA-Sequenz, die derart modifiziert ist, dass sie die Expression
des insektiziden Proteins in Pflanzen erhöht. Gemäß einer besonderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die DNA-Sequenz, die für ein insektizides
Protein codiert, eine modifizierte cry1Ab-DNA-Sequenz, die für mindestens
einen Teil des von Höfte
et al. (1986) beschriebenen Cry1Ab5-Proteins codiert, vorzugsweise
eine DNA-Sequenz, die für
ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von einer Aminosäureposition
zwischen den Aminosäurepositionen
1-28 bis zu einer Aminosäure zwischen
den Aminosäurepositionen
607-725 davon codiert und am stärksten
bevorzugt die Aminosäuren 1-616
umfasst. Am stärksten
bevorzugt hat das codierte modifizierte Cry1Ab-Protein eine Insertion
eines Alanin-Codons (GCT) hinter dem ATG-Startcodon (AlaAsp2 ...
Asp616).
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Das
Expressionsniveau eines insektiziden Proteins in Pflanzenmaterial
kann auf eine Reihe von Weisen bestimmt werden, die in der Technik
beschrieben sind, wie durch Quantifizierung der mRNA, die für das insektizide
Protein codiert, das in dem Gewebe produziert wird, unter Verwendung
spezifischer Primer (wie von Cornelissen & Vandewiele, 1989, beschrieben) oder
direkten spezifischen Nachweis der Menge an produziertem insektizidem
Protein, z.B. durch immunologische Nachweisverfahren. Genauer gesagt,
wird das Expressionsniveau an insektizidem Protein erfindungsgemäß als Prozentsatz
an löslichem
insektiziden Protein, wie durch immunspezifischen ELISA, wie hierin
beschrieben, bestimmt, in Bezug auf die gesamte Menge an löslichem
Protein (wie z.B. durch Bradford-Analyse (Bradford, 1976) bestimmt)
ausgedrückt.
Ein bevorzugter ELISA bei der vorliegenden Erfindung ist ein Sandwich-ELISA
(Clark et al., 1986).
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Ein "wundeninduzierbarer" Promotor oder ein
Promotor, der ein Expressionsmuster steuert, das wundeninduzierbar
ist, wie hier verwendet, bedeutet, dass nach Verwundung zumindest
in den Blättern
die Expression der codierenden Sequenz unter der Kontrolle des Promotors
signifikant erhöht
ist, d.h. mindestens verdoppelt, vorzugsweise auf das Fünffache
erhöht,
am stärksten
bevorzugt 20- bis 100-fach erhöht
ist.
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"Verwundung", wie hier verwendet,
soll entweder mechanische Beschädigung
oder Perforation von mindestens der Pflanzenepidermis oder der äußeren Zellschicht
durch jede Art von Insektenfraß bedeuten, aber
Verwundung, wie hier verwendet, kann auch durch Schneiden eines
Blattes mit einem scharfen Instrument, wie einem Skalpell, simuliert
werden. Vorzugsweise bedeutet erfindungsgemäß eine wundeninduzierbare Expression
eines insektiziden Proteins, vorzugsweise eines insektiziden Bt-Proteins,
in einer Pflanze, dass die Basalexpression (d.h. in Abwesenheit
von Verwundung, wie vorzugsweise im Gewächshaus gemessen) des Proteins
in den Blättern
der Pflanze im V4-Stadium niedrig ist, am stärksten bevorzugt kleiner als
0,005% des gesamten löslichen
Proteingehaltes (Mittelwert von Messungen, die an mehreren Pflanzen
eines Transformationsereignisses vorgenommen werden), und nach Verwundung
ansteigt, vorzugsweise auf ein Niveau von mehr als 0,01% des gesamten
löslichen
Proteins, stärker
bevorzugt auf ein Niveau von 0,04% bis 0,5% des gesamten löslichen
Proteingehaltes oder mehr, wie unter Verwendung eines Blattteils
gemessen, der nach der Verwundung entfernt und dann mehrere Stunden,
z.B. etwa 12 bis etwa 60 Stunden, vorzugsweise etwa 18 bis etwa
20 Stunden, in vitro inkubiert wurde. Messungen, die unter Verwendung
eines Tests von einem in vitro ausgeschnittenen Blatt durchgeführt werden
(bei einem solchen Test wird ein ausgeschnittenes Blatt oder ein
Teil davon in vitro (z.B. in einer Petrischale oder auf feuchtem
Filterpapier) in einem Gewächshaus
oder einer Wachstumskammer bei Raumtemperatur mehrere Stunden, vorzugsweise
etwa 12 bis 60 Stunden, stärker
bevorzugt etwa 18 bis 20 Stunden, nach der Verwundung inkubiert
(um die Bedingungen nach Insektenfraß besser widerzuspie-geln))
ergeben üblicherweise
eine höhere
Induktion der Expression als Messungen nach der Verwundung in planta
ohne In-vitro-Inkubation eines entnommenen Blattes oder eines Teils
davon. Die wundeninduzierten Proteinniveaus sind in der Regel niedriger
(aber immer noch signifi-kant höher
als die nicht-induzierten Hintergrundni-veaus), wenn sie etwa 12
bis 60 Stunden, stärker
bevorzugt etwa 18 bis 20 Stunden, nach der Verwundung eines Pflanzenblattes
ohne Ausschneiden des Blattteils für eine In-vitro-Inkubation gemessen
werden. Bei jeder der Messungen der
-
Konzentration
an insektizidem Protein in Pflanzengewebe, vorzugsweise in Blättern, nach
Verwundung und zur Messung der Zunahme der Expression, wie hier
beschrieben, ist es bevorzugt, den Test des entfernten Gewebes,
vorzugsweise des Blattes, mit In vitro-Inkubation zu verwenden, weil
dies wahrscheinlich die tatsächliche
Konzentration, die in dem Gewebe nach Insektenfraß induziert
wird, besser widerspiegelt (Kontrollblätter sind frisch, unverwundet
und werden keiner In-vitro-Inkubation unterzogen, so dass sie die
tatsächliche
Konzentration in Pflanzenge-webe besser widerspiegeln). Die Basal-
oder Hintergrundexpressionsniveaus eines wundeninduzierten Promotors,
wie hier verwendet, werden vorzugsweise an frisch ausgeschnittenem,
nicht zuvor verwundetem Blattmaterial gemessen, das von im Gewächshaus
gezogenen Pflanzen entnommen wird. Gemäß einer bestimmten Ausführungsform
der Erfindung steigt die Expression des insektiziden Proteins mindestens
in den verwundeten Blättern
auf 0,1% des gesamten löslichen
Proteingehaltes an der Stelle der Verwundung. Es wird angenommen,
dass der erfindungsgemäße Prozentsatz
an insektizidem Protein pro gesamtem löslichem Protein, die tatsächlich von
einem Insekt beim Insektenfraß aufgenommen
werden, aufgrund der lokalisierten Expression und der Tatsache,
dass nur induziertes (verwundetes) Gewebe von dem Insekt aufgenommen
wird, höher
sind als die Prozent, die in der Pflanze oder einem Teil davon gemessen werden.
Für die
Messung der Proteinkonzentration wird zudem eine bestimmte Mindestmenge
an Pflanzengewebe ausgeschnitten (üblicherweise werden bei Blättern etwa
2-3 mm um die Wunde ausgeschnitten), um die Analyse des insektiziden
Proteins durchzuführen,
so dass angenommen wird, dass das Vorliegen unverwundeter Zellen
den Prozentsatz an insektizidem Protein pro gesamtem löslichem
Protein, das aus der Probe extrahiert wird, verringert.
-
Wie üblicherweise
bei Transformationsexperimenten dieser Art beobachtet wird, wird
nach der Transformation ein Spektrum an verschiedenen Pflanzentransformationsereignissen
erhalten, und ein Selektionsverfahren ist bevorzugt, um die besten
Pflanzen für
eine weitere Entwicklung (d.h. zur Kreuzung in geeignete Pflanzenlinien,
die an eine bestimmte Wachstumsregion adaptiert sind) zu selektieren.
Bei einem solchen Selektionsverfahren werden Pflanzen selektiert,
die niedrige oder nicht nachweisbare Proteinniveaus im Pflanzengewebe,
vorzugsweise in Blättern
und Pollen, am stärksten
bevorzugt in Blättern,
zeigen, wobei die Pflanzen nach Wundeninduktion eine Erhöhung der
Expression auf mindestens das Fünffache
in Blättern
zeigen.
-
Ein "Gewächshaus", wie hier verwendet,
betrifft eine relativ stabile Wachstumsumgebung für Pflanzen, die
Pflanzen vor normalen Feldbedingungen abschirmt, ohne oder mit wenig
Befall durch Insekten, Kaninchen, Vögel oder andere Tiere oder äußere Faktoren
(wie Wind oder Stürme),
die eine Nutzpflanze auf dem Feld beschädigen können. Ein übliches Gewächshaus besteht größtenteils
aus transparenten Materialien wie Glas oder Kunststoff, so dass
natürliches
Tageslicht die Pflanzen erreichen kann, und kann eine regulierte
Licht-, Wachstumsmedium- (Boden oder ein künstliches Medium), Wasser-
und Nährstoffzufuhr
und/oder Temperaturregelung besitzen. Ein Gewächshaus, wie hier verwendet,
beinhaltet auch Räume
oder Kästen
ohne Tageslicht, solange eine Lichtquelle und ein Wachstumsmedium
bereitgestellt werden, so dass normale Pflanzenwachstumsbedingungen
hergestellt werden. Als solches ist ein Gewächshaus der am besten geeignete
Platz, um Basal- oder Hintergrundexpressionsniveaus in Blättern der
erfindungsgemäßen wundeninduzierten
Konstrukte (in nicht-induziertem Zustand) zu Vergleichszwecken zu
messen. Während
man ähnliche
Basal- oder Hintergrundexpressionsniveaus an insektizidem Protein
in Blättern
von Pflanzen auf einem Feld finden kann, wird erwartet, dass ein
Befall durch Insekten oder mechanische Beschädigung, z.B. durch Fahrzeuge,
Kaninchen oder Vögel,
der Pflanzen auf einem Feld das Expressionsniveau durch Induktion
des erfindungsgemäßen wundeninduzierbaren
Promotors erhöht
und somit gewöhnlich
bei allen Pflanzen auf einem Feld kein wirkliches Basalniveau gemessen
wird.
-
Eine
Expression in "starker
Dosis" oder eine
Insektenresistenz "in
starker Dosis",
wie hier in Bezug auf eine Pflanze, vorzugsweise eine erfindungsgemäße monokotyle
Pflanze, verwendet, betrifft eine Konzentration des insektiziden
Proteins in einer Pflanze (mittels ELISA als Prozentsatz des gesamten
löslichen
Proteins gemessen, wobei das gesamte lösliche Protein nach Extraktion
löslicher
Proteine in einem Extraktionspuffer (z.B. dem in Jansens et al.,
1997, beschriebenen Extraktionspuffer) unter Verwendung der Bradford-Analyse (Bio-Rad,
Richmond, CA; Bradford, 1976) gemessen wird), die ein Entwicklungsstadium
des Zielinsekts abtötet,
das signifikant weniger empfänglich,
vorzugsweise zwischen 25- bis 100-mal weniger empfänglich für das Toxin
ist als das erste Larvenstadium des Insekts, und von der somit erwartet
werden kann, dass sie eine vollständige Bekämpfung des Zielinsekts gewährleistet,
am stärksten
bevorzugt bedeutet eine Insektenresistenz in starker Dosis, dass
mindestens 97 Prozent, vorzugsweise mindestens 99 Prozent, am stärksten bevorzugt mindestens
100 Prozent Sterblichkeit des vierten Larvenstadiums (bei Insekten
mit 5 Larvenstadien) oder des letzten Larvenstadiums (bei Insekten
mit 4 oder weniger Larvenstadien) eines Zielinsekts erzielt werden,
wie 10 bis 14 Tage nach dem Insektenbefall einer solchen Pflanze
in Standard-Insekten-Biotests,
vorzugsweise Gesamt-Pflanzen-Biotests, einer Pflanze mit einer Expression
in starker Dosis oder einer Insektenresistenz in starker Dosis gemessen.
Die Existenz der Ziel-Insektenspezies (d.h. einer Insektenspezies,
die kommerziell einen erheblichen Schaden bei einer Pflanzenspezies
oder -varietät
anrichten kann und üblicherweise
ein Insekt ist, für
das eine transgene Pflanze entwickelt worden ist), für die eine
erfindungsgemäße transformierte Pflanze
eine Insektenresistenz in starker Dosis bereitstellt, ist ausreichend,
damit eine Pflanze als eine erfindungsgemäße Expression "in starker Dosis" ergebend bezeichnet
wird. Ebenfalls umfasst von der Erfindung sind die Pflanzenzellen
oder Pflanzengewebe, insbesondere Maispflanzenzellen oder -gewebe,
ob sie in einer Pflanze enthalten oder in einer In-vitro-Kultur
vorhanden sind, die mit dem erfindungsgemäßen wundeninduzierten chimären Gen
transformiert sind und eine Insektenresistenz in starker Dosis,
wie vorstehend beschrieben, bei Verwendung von Insekten-Biotests
aufweisen.
-
Eine
starke Dosis in Bezug auf eine ECB-Bekämpfung bei Mais, wie hier verwendet,
betrifft die Produktion von insektizidem Protein durch die Pflanze
im mittleren Wirtelstadium in einer Menge, die für ECB-Larven des L4-Stadiums
(European Corn Borer. Ecology and Management. 1996. North Central
Regional Extension Publication Nr. 327. Iowa State University, Ames,
Iowa) toxisch ist, wie durch Toxizitätstests mit künstlichem
Befall, wie hier beschrieben, bestimmt werden kann, wobei eine Sterblichkeit
von mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 97, stärker bevorzugt
mindestens 99%, am stärksten
bevorzugt 100% der L4-ECB-Larven
bei einem Test von 14 Tagen, vorzugsweise 10 Tagen, nach Befall
der Pflanzen mit L4-Larven erhalten wird. Überraschenderweise wird eine
Expression eines insektiziden Proteins in starker Dosis in den erfindungsgemäßen Maispflanzen
unter Verwendung des TR2'-Promotors
zum Antreiben der wundeninduzierten Expression erhalten, sogar wenn
die Expression in einem nicht-induzierten Zustand niedrig oder mit
empfindlichen ELISA-Protokollen nicht nachweisbar ist, und die Expression
wird nur nach Insektenfraß induziert.
Wie bei Pflanzentransformationsexperimenten üblich, sind einige der nach
Transformation erhaltenen Pflanzen für eine weitere Entwicklung
nicht geeignet, und geeignete Pflanzenlinien mit einer niedrigen
Basal- oder Hintergrundexpression und einer wundeninduzierten Expression
in starker Dosis müssen
aus den erzielten Transformationsereignissen selektiert werden,
und vorzugsweise enthält
eine solche Pflanzenlinie nur eine inserierte DNA, die für ein insektizides
Protein codiert. Üblicherweise
werden kommerziell annehmbare Pflanzenlinien aus mehr als Hundert,
vorzugsweise mehreren Hundert, transformierten Ausgangspflanzen
erhalten.
-
Erfindungsgemäß ist eine "wundeninduzierbare" Expression ferner
bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkung des Promotors
lokal, d.h. im Wesentlichen auf diejenigen Zellen oder Gewebe beschränkt ist,
die von der Verwundung direkt betroffen sind oder das verwundete
Gewebe direkt umgeben. Dies steht im Gegensatz zu einer systemischen
Wirkung, die direkt oder indirekt (durch eine Kaskade von Reaktionen)
eine weit gestreute Wirkung gewährleistet,
genauer gesagt, eine. weit gestreute Expression von Proteinen, die
an natürlichen
Abwehrmechanismen der Pflanze beteiligt sind. Vorzugsweise beträgt die Expression des
insektiziden Proteins in unbeschädigten
Geweben der Pflanze im Durchschnitt nicht mehr als 0,01% der gesamten
löslichen
Proteinkonzentration, stärker
bevorzugt nicht mehr als 0,005% des gesamten löslichen Proteins (Mittelwert
von mehreren Messungen, die an mehreren, vorzugsweise mindestens
3, besonders bevorzugt mindestens 5, Pflanzen von einem Trans formationsereignis
vorgenommen werden), wie durch ELISA (siehe oben) an im Gewächshaus
gezogenen Pflanzen gemessen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser
Erfindung ist die Aktivität
des wundeninduzierbaren Promotors in Blättern, insbesondere Maisblättern, auf
den Bereich der Verwundung lokalisiert und wird (unter Verwendung
von ELISA-Tests) nicht in einem Bereich der Pflanze, insbesondere
des Blattes, nachgewiesen, der mehr als 10 cm, insbesondere mehr
als 2 cm, von der Verwundungsstelle entfernt ist (z.B. nicht in
einem Blatt, das niedriger oder höher als das verwundete Blatt
in der gleichen Pflanze ist, noch in dem gleichen Blatt mehr als
10 cm, vorzugsweise mehr als 2 cm, entfernt von der Verwundungsstelle
an dem Blatt). Dies beschränkt
die Expression in der Pflanze, insbesondere in den Blättern, vorzugsweise
Maisblättern,
effektiv auf diejenigen Stellen, an denen eine Expression benötigt wird
(d.h. an denen ein Insekt frisst oder zumindest Blattgewebe bei
einem Versuch zu fressen perforiert), und minimiert somit Stress
auf die Pflanze, der durch eine konstitutive Expression in starker
Dosis verursacht werden könnte.
Es wird angenommen, dass insbesondere bei der Akkumulation mehrerer
Gene, die für
verschiedene Proteine (z.B. verschiedene Insektenbekämpfungsproteine)
codieren, in einer Pflanze eine wundeninduzierte Expression von
einem oder mehreren der eingebrachten Gene vorteilhaft ist.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
ist die erfindungsgemäße wundeninduzierte
Expression eines insektiziden Proteins durch eine schnelle Induktion
der Expression gekennzeichnet, die von einem Basal- oder Hintergrundniveau
nach Verwundung auf ein höheres
Proteinnivau (mindestens das Doppelte der Menge in den Kontrollen,
vorzugsweise mindestens das Fünf-
bis Hundertfache der Menge in den Kontrollen) etwa 18 bis 24 Stunden,
vorzugsweise 18, 20 oder 24 Stunden bei Verwendung eines Tests,
bei dem ein Blattteil verwundet, aus dem Blatt ausgeschnitten und
in vitro für
den Zeitraum inkubiert wird, ansteigt (das Basal- oder Hintergrundniveau wird an frisch
ausgeschnittenen und nicht zuvor verwundeten Blattteilen gemessen,
die nicht in vitro inkubiert werden).
-
Der "TR2'-Promotor", wie hier verwendet,
betrifft jeden Promotor, der den funktionellen TR2'- (oder Mannopinsynthase-,
abgekürzt
als mas-) Teil des dualen TR1'-TR2'-Promotorelements
von Agrobacterium umfasst (Velten et al. 1984; Langridge et al.
1989). Somit kann dieser das TR2'-Element
entweder allein oder in Kombination mit dem divergenten TR1'-Element (Guevara-Garcia et al., 1998)
oder anderen (regulatorischen) Elementen umfassen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Enhancer-Regionen, Introns und dergleichen, solange die erfindungsgemäßen Wundeninduktionspromotor-Eigenschaften
im Wesentlichen beibehalten werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung wird die Transkription von der TR2'-Promotorregion gesteuert (und die codierende
Sequenz ist somit mit der TR2'-Promotorsequenz
operativ verknüpft
und befindet sich stromabwärts
davon), sogar wenn der duale TR1'-TR2'-Promotor (oder ein
Teil davon, der das TR2'-Promotorelement
beibehält)
verwendet wird. Genauer gesagt, betrifft der TR2'-Promotor, wie hier verwendet, eine
Promotorregion, die ein Fragment der SEQ ID NO: 1 umfasst, das von
einer Nukleotidposition zwischen den Nukleotidpositionen 1 und 336
bis zur Nukleotidposition 483 überspannt,
vorzugsweise die Sequenz der Nukleotide 96 bis 483 der SEQ ID NO:
1 umfasst, am stärksten
bevorzugt die SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent
davon, d.h. eine Modifikation davon, die in der Lage ist, eine wundeninduzierte
Expression in Pflanzen, insbesondere in monokotylen Pflanzen, zu
steuern, umfasst. Derartige funktionelle Äquivalente beinhalten Sequenzen,
die im Wesentlichen identisch zu einer Nukleotidsequenz sind, die mindestens
die Nukleotide 328 bis 483 (welche das TR2'-Promotorelement umfasst, Velten et
al., 1984) der SEQ ID NO: 1 umfasst. Solche Sequenzen können von
verschiedenen Agrobacterium-Stämmen
isoliert werden. Alternativ entsprechen solche funktionellen Äquivalente
Sequenzen, die unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die mindestens
etwa 25, vorzugsweise mindestens etwa 50 oder bis zu 100 aufeinander
folgende Nukleotide der Nukleotide 328 bis 483 der SEQ ID NO: 1
umfassen, in einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden
können.
Funktionelle Äquivalente
des TR2'-Promotors können auch
durch Substitution, Addition oder Deletion von Nukleotiden der Sequenz
der SEQ ID NO: 1 erhalten werden und beinhalten Hybridpromotoren,
welche den funktionellen TR2'-Teil
der SEQ ID NO: 1 enthalten.
-
Solche
Promotorsequenzen können
teilweise oder vollständig
synthetisiert sein.
-
Die
erfindungsgemäßen Pflanzen
sind gegen Insektenschädlinge
durch die wundeninduzierbare Expression einer bekämpfenden
Menge an insektizidem Protein geschützt. Mit bekämpfend ist
eine toxische (letale) oder abwehrende (subletale) Menge gemeint.
Vorzugsweise wird nach Induktion eine starke Dosis (wie hier vorstehend
definiert) produziert. Gleichzeitig sollten die Pflanzen morphologisch
normal sein und auf übliche
Weise für
den Verbrauch und/oder die Produktion von Produkten kultiviert werden
können.
Ferner sollten diese Pflanzen im Wesentlichen den Bedarf an chemischen
oder biologischen Insektiziden (gegen Insekten, auf die das Insektizide
Protein abzielt) überflüssig machen.
-
Verschiedene
Tests können
zum Messen der Wirkung der Expression des insektiziden Proteins
in der Pflanze verwendet werden. Genauer gesagt, kann die Toxizität des in
einer Maispflanze produzierten insektiziden Proteins für Ostrinia
nubilalis oder ECB (hier auch als ECB-Wirksamkeit bezeichnet) in
vitro durch Testen von Protein, das aus der Pflanze extrahiert wurde,
in Fütter-Biotests
mit ECB-Larven oder durch Bewerten der Sterblichkeit von Larven,
die auf Blattmaterial von transformierten Pflanzen in einer Petrischale
verteilt werden, getestet werden (beide Tests sind von Jansens et
al., 1997, beschrieben). Im Feld wird ein Befall mit ECB-Larven
der ersten Brut (ECB1) auf Basis von Bewertungen der Blattschädigung untersucht
(Guthrie, 1989), während
eine Bewertung der Gesamtzahl an Stängeltunneln pro Pflanze und
die Stängeltunnellänge Anzeichen für Stängelfraßschäden durch
ECB der zweiten Brut (ECB2) sind (siehe z.B. Jansens et al., 1997,
in Bezug auf die Stängeltunnellängenanalyse).
Die erfindungsgemäßen Pflanzen
umfassen gegebenenfalls in ihrem Genom auch ein Gen, das für eine Herbizidresistenz
codiert. Genauer gesagt, ist das Herbizidresistenzgen das bar- oder
das pat-Gen, welches der Pflanze Glufosinat-Toleranz verleiht, d.h.
die Pflanzen sind tolerant gegenüber
dem Herbizid Liberty
TM. Eine Toleranz gegenüber Liberty
TM kann auf verschiedene Weisen getestet
werden. Zum Beispiel kann eine Toleranz durch Liberty
TM-Sprühapplikation
getestet werden. Die Sprühbehandlungen
sollten zwischen den Pflanzenstadien V2 und V6 erfolgen, damit die
besten Ergebnisse erzielt werden. Tolerante Pflanzen sind durch
die Tatsache gekennzeichnet, dass Sprühen der Pflanzen mit mindestens
200 Gramm Wirkstoff/Hektar (g.a.i./ha), vorzugsweise 400 g.a.i./ha
und möglicherweise
bis zu 1600 g.a.i./ha (4X die übliche
Feldrate) die Pflanzen nicht abtötet.
Ein breitwürfiges
Ausbringen sollte mit einer Rate von 28-34 oz Liberty
TM +
31 b Ammoniumsulfat pro Morgen erfolgen. Am besten wird ein Volumen
von 20 Gallonen Wasser pro Morgen unter Verwendung einer Düse des flachen
Trichtertyps appliziert, wobei darauf geachtet wird, die Sprühapplikationen
nicht direkt in den Wirtel der Pflanzen zu richten, um Verbrennung
durch oberflächenaktive
Mittel auf den Blättern
zu vermeiden. Die Herbizidwirkung sollte innerhalb von 48 Stunden
auftreten und innerhalb von 5-7 Tagen deutlich sichtbar sein. Beispiele
für weitere
Herbizidresistenzgene sind die Gene, die für eine Resistenz gegen Phenmedipham
codieren (wie das pmph-Gen,
US
5,347,047 ;
US 5,543,306 ),
die Gene, die für
eine Resistenz gegen Glyphosat codieren (wie die EPSPS-Gene,
US 5,510,471 ), die Gene,
die für eine
Bromoxynil-Resistenz codieren (wie in
US
4,810,648 beschrieben), die Gene, die für eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff
codieren (wie in
EP-A-0
360 750 beschrieben), die Gene, die für eine Resistenz gegen das
Herbizid Dalapon codieren (wie in
WO
99/27116 beschrieben), und die Gene, die für eine Resistenz
gegen Cyanamid codieren (wie in
WO
98/48023 und
WO 98/56238 beschrieben),
sowie die Gene, die für
eine Resistenz gegen Glutaminsynthetase-Inhibitoren codieren, wie
PPT (wie in
EP-A-0 242
236 ,
EP-A-0
242 246 ,
EP-A-0
257 542 beschrieben).
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann das Chimäre
Gen mit einer DNA, die für
ein Insektizides Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors codiert, (gleichzeitig oder
nacheinander) in Kombination mit anderen chimären Genen in eine Pflanze eingebracht
werden, um verschiedene Merkmale in der Pflanze zu erhalten (auch
als "Stacking" bezeichnet). Ebenso
ist die erfindungsgemäße Pflanze,
die ein chimäres
Gen enthält,
das eine DNA umfasst, die für
ein insektizides Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors codiert, besonders für eine Kombination
mit anderen Merkmalen geeignet. Solche anderen Merkmale sind u.a.,
sind aber nicht beschränkt
auf Merkmale, wie diejenigen, die von chimären Genen codiert werden, die
eine Insektenresistenz, Herbizidresistenz, Stress- oder Trockentoleranz
verleihen, oder Merkmale, welche andere agronomische Eigenschaften
der Pflanze modifizieren. Ein solches Merkmal kann auch die Synthese eines
Produkts, das aus der Pflanze gewonnen werden kann, beinhalten.
-
Das
Einbringen einer fremden DNA oder eines chimären Gens in das Genom einer
Pflanze, einer Zelle oder eines Gewebes kann auf verschiedene Weisen
erzielt werden und ist für
die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Eine erfolgreiche
genetische Transformation von Monokotylen wurde durch eine Reihe
von Verfahren erzielt, einschließlich Agrobacteriumvermittelte
Transformation (wie zum Beispiel für Mais in
US 6,074,877 oder
US 6,140,553 beschrieben), Mikroprojektilbeschuss
(wie zum Beispiel von Chef et al., 1994, beschrieben), direkte DNA-Aufnahme
in Protoplasten (wie zum Beispiel von Datta et al. 1999; Poulsen,
1996, beschrieben) und Elektroporation (D'Halluin et al., 1992).
-
Die
folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele beschreiben die Konstruktion chimärer Gene, die eine DNA-Sequenz
umfassen, die für
ein insektizides Protein unter der Kontrolle des TR2'-Promotors codiert,
für die
Expression in Pflanzen und die dadurch erhaltenen insektenresistenten
Pflanzen. Wenn in den Beispielen nicht anders angegeben, werden
alle DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standardprotokollen ausgeführt, wie
in Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
dritte Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in den
Bänden
1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols, USA, und in den Bänden I und II von Brown (1998)
Molecular Biology LabFax, zweite Auflage, Academic Press (UK) beschrieben.
Standardmaterialien und -verfahren für molekulare Pflanzenarbeiten
sind in dem gemeinsam von BIOS Scientific Publications Ltd. (UK)
und Blackwell Scientific Publications, UK, veröffentlichten Plant Molecular
Biology Labfax (1993) von R.D.D. Croy beschrieben. Standardmaterialien und
-verfahren für
Polymerasekettenreaktionen lassen sich in Dieffenbach und Dveksler
(1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, und in McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background
to Bench, erste Auflage, Springer Verlag, Deutschland, finden.
-
In
der gesamten Beschreibung und den Beispielen wird auf die folgenden
Sequenzen Bezug genommen, die im Sequenzprotokoll dargestellt sind:
SEQ
ID NO: 1: Nukleotidsequenz einer bevorzugten Ausführungsform
des TR2'-Promotors
SEQ
ID NO: 2: Sequenz von pTSVH0212
SEQ ID NO: 3: Sequenz einer
modifizierten codierenden cry1Ab-Sequenz
-
Beispiele
-
Beispiel 1. Erzeugung von Ereignissen
mit einem fremden Gen unter der Kontrolle des TR2'-Promoters
-
a) Entwicklung von Ereignissen
-
Für die Untersuchung
der wundeninduzierten Expression einer DNA-Sequenz, die für ein Insektizides Gen
codiert, wurde ein Konstrukt hergestellt, das eine Promotorregion
mit dem TR2'-Promotor
(Velten et al. 1984) umfasste, der die Expression eines modifizierten
cry1Ab-Proteins steuerte. Das Plasmid pTSVH0212 mit den Genen von
Interesse, die zwischen die T-DNA-Ränder gesetzt worden waren (auch
als 'TR2'-Cry1Ab' bezeichnet), wurde
für eine
Agrobacterium-vermittelte Transformation verwendet (
WO 98/37212 ).
| pTSVH0212 | 3'-nos-bar-p35S3><Tr2-modcry1Ab-3'ocs (SEQ ID NO: 2) |
-
Die
Struktur des pTSVH0212-Konstrukts ist in Tabelle 1 dargestellt.
Bei Kontrollpflanzen mit einer konstitutiven Expression des insektiziden
Proteins wurden die Transformationen mit Konstrukten durchgeführt, die eine
DNA-Sequenz umfassten, die für
das modifizierte Cry1Ab-Protein entweder unter der Kontrolle des 35S-Promotors
aus Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. 1980) (als 35S-cry1Ab bezeichnet)
oder des Promotors des GOS2-Gens aus Reis (de Pater et al., 1992)
mit dem cab22-Leader aus Petunie (Harpster et al. 1988) (auch als 'Gos/cab-cry1Ab' bezeichnet) oder
der 5'-Leadersequenz
des GOS2-Gens aus Reis, welche das zweite Exon, das erste Intron
und das erste Exon des GOS-Transkripts enthielt (de Pater et al.,
1992), (als 'Gos/gos-cry1Ab' bezeichnet) codierte.
Alle Konstrukte enthielten das 35S-bar-Gen. Tabelle 1: Nukleotidpositionen der genetischen
Elemente in pTSVH0212 (TR2'-cry1Ab)
| Nt-Positionen | Richtung | Beschreibung
und Literatur |
| 25-1 | gegen
den Uhrzeigersinn | linke
Randsequenz der TL-DNA von
pTiB6S3 (Gielen et al., 1984). |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 316-56 | gegen
den Uhrzeigersinn | Fragment
mit den Polyadeny-lierungssignalen
aus der 3'-untranslatierten
Region des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA von pTiT37 (Depicker
et al., 1982). |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 887-336 | gegen
den Uhrzeigersinn | bar:
die codierende Sequenz der Phosphinothricinacetyltransferase von
Streptomy |
| | | ces
hygroscopicus (Thompson et al., 1987). |
| 1720-888 | gegen
den Uhrzeigersinn | P35S3:
Promotorregion des Blumenkohlmosaikvirus-35S-Transkripts (Odell et al., 1985). |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 2252-1770 | gegen
den Uhrzeigersinn | TR2'-Promotorfragment
aus der rechten T-DNA des Octopin-Typ-Agrobacterium-Stamms ACH5 (Velten
et al., 1984) |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 2261-4114 | | Modifiziertes
cry1Ab: Die modifizierte codierende cry1Ab-Sequenz codiert für einen
Teil des von Höfte
et al. (1986) beschriebenen Cry1Ab5-Proteins und hat eine Insertion
von einem Alanincodon (GCT) 3' des
ATG-Startcodons (SEQ ID NO: 3). |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 4128-4422 | | Fragment
mit den Polyadenylierungssignalen aus der 3'-untranslatierten Region des Octopinsynthase-Gens
aus der TL-DNA von pTiAch5 (De Greve et al., 1983). |
| | | synthetische
Polylinker-Sequenz |
| 4470-4446 | gegen
den Uhrzeigersinn | rechte
Randsequenz der TL-DNA von
pTiB6S3 (Gielen et al., 1984). |
-
Die
regenerierten Pflänzchen
wurden auf Basis der Toleranz gegenüber Liberty selektiert.
-
b) Bewertung der Ereignisse
-
Die
Agrobacterium-Transformanten wurden hinsichtlich des Vorliegens
der Vektorsequenz am linken Rand der T-DNA überprüft. Southern-Blot-Analysen
wurden mit Blattmaterial der Primärtransformanten (T0) durchgeführt.
-
Beispiel 2. Wundeninduzierte Expression
eines insektiziden Proteins
-
i) Basalexpression des insektiziden Proteins
-
Das
Basalniveau der Expression des modifizierten insektiziden Cry1Ab-Proteins
wurde durch einen Cry1Ab-Sandwich-ELISA
mit einer polykondensierten IgG-Fraktion eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen
Cry1Ab als erstem Antikörper
und einem monoklonalen Antikörper
gegen Cry1Ab als zweitem Antikörper
nach der Extraktion von löslichem
Protein unter Verwendung des Extraktionsverfahrens und des Puffers, die
in Jansens et al. 1997 beschrieben sind, bestimmt. Proben von Blättern von
Pflanzen im V3-Stadium, Pollen und Blatt von Pflanzen im R1-Stadium
sowie Blättern,
Stängeln
und Pollen bei der Ernte wurden von Pflanzen im Gewächshaus
entnommen (die Maisstadien sind, wie in "How a Corn Plant Develops, Special Report Nr.
48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative
Extension Service, mes, Iowa, Neudruck Juni 1993, bestimmt; siehe
auch die Seite im Internet, welche die relevante Information enthält, unter http://www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agricult
ure/corn/corn_develop/CornGrowthStages.html). Zum Vergleich wurden
Proben von Pflanzen entnommen, die mit den Gos/gos-cry1Ab-Konstrukten
transformiert worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als
Prozentsatz nachgewiesenes Cry1Ab-Protein pro gesamtem löslichem
Protein dargestellt (unter Verwendung des Bradford-Assays (Bio-Rad,
Richmond, CA; Bradford, 1976) gemessen). Der Mittelwert stellt den
Durchschnitt von 5 Proben dar, die von unterschiedlichen Pflanzenlinien
eines Transformationsereignisses entnommen wurden. Tabelle 2. Expression des Cry1Ab-Proteins
in verschiedenen Geweben von Pflanzen, die mit den TR2'-cry1Ab- und Gos/gos-cry1Ab-Konstrukten
transformiert wurden
| | | Cry1Ab in
% lösliches
Protein/gesamtes Protein |
| Ereignis (Konstrukt) | | V3-Stadium
Blatt | R1-Stadium | Ernte |
| Blatt | Pollen | Blatt | Stängel | Pollen |
| WI602-0402 (TR2'-cry1Ab) | Mittelwert | | 0 | 0,000 | 0000 | 0,010 | 0,000 |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,010 |
| WI604-1602 (TR2'-cry1Ab) | Mittelwert | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,000 |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,000 |
| WI606-0802 (TR2'-cry1Ab) | Mittelwert | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,020 | 0,000 |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,040 | 0,000 |
| WI606-1206 (TR2'-cry1Ab) | Mittelwert | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,000 |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,000 |
| WI600-0218 (TR2'-cry1Ab) | Mittelwert | 0 | 0 | 0,000 | | | |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | | | |
| WI602-0802 (TR2'-cn1Ab) | Mittelwert | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,010 |
| Stand.abw. | 0 | 0 | 0,000 | 0,000 | 0,010 | 0,010 |
| CE2168-0202 (Gos/gos-cry1Ab) | Mittelwert | 0,31 | 0,26 | 0,040 | 0,230 | 0,800 | 0,030 |
| Stand.abw. | 0,04 | 0,06 | 0,010 | 0,060 | 0,360 | 0,010 |
| CE2168-1602 (Gos/gos-cry1Ab) | Mittelwert | 0,34 | 0,23 | 0,050 | 0,270 | 0,870 | 0,030 |
| Stand.abw. | 0,04 | 0,05 | 0,020 | 0,150 | 1,450 | 0,010 |
-
Für die aus
der Transformation mit dem TR2'-cry1Ab-Konstrukt
erhaltenen Pflanzen wurde gefunden, dass die Mittelwerte für die Basalexpression
des modifizierten Cry1Ab-Proteins im Gewächshaus in allen von Pflanzen
im V3-Stadium, im R1-Stadium oder bei der Ernte entnommenen Blattproben
unterhalb der Nachweisgrenze (0,001% oder 0,000% des gesamten löslichen
Proteins) waren. Es wurde gefunden, dass die durchschnittliche Basalexpression
des insektiziden Proteins im Stängel
für die
meisten Pflanzen bei der Ernte etwa 0,01% des gesamten löslichen
Proteingehaltes betrug. In Pflanzen, die mit dem Gos/gos-cry1Ab-Konstrukt erhalten
worden waren, war die Expression des Cry1Ab-Proteins in allen Blattproben
höher als
0,2% und betrug bis zu mehr als 1% in einigen der Stängelproben,
die bei der Ernte entnommen wurden.
-
ii) Wundeninduzierte Expression des insektiziden
Proteins
-
Es
wurden Studien im Gewächshaus
durchgeführt,
um die Expression des insektiziden Cry1Ab-Proteins nach mechanischer
Beschädigung
in nicht-transformierten Pflanzen, Pflanzen, die mit dem TR2'-cry1Ab-Konstrukt
erhalten worden waren, und Pflanzen, die mit dem Gos/cab-cry1Ab-Konstrukt
erhalten worden waren, zu bestimmen. Blätter und Wurzeln wurden durch
Schneiden beschädigt.
Die Verwundung erfolgte an vollständig entfalteten Blättern, wobei
nach jedem mm ein senkrechter Schnitt mit einem Skalpell auf dem
Blatt angebracht wurde, ohne die Mittelrippe zu verletzen.
-
Blattproben
wurden vor und 18 Std. nach der mechanischen Beschädigung entnommen.
Die Cry1Ab-Proteinniveaus
wurden mittels ELISA (Tabelle 3) an ausgeschnittenen Blattteilen
(Blattteile wurden 2 bis 3 mm um die Wunde ausgeschnitten) gemessen,
die für
18 Stunden in einer Wachstumskammer bei 20°C in einer Petrischale auf einem
Filterpapier inkubiert wurden, das mit Murashige-und-Skoog-Medium
(MS-Medium, für
die Zusammensetzung siehe das gemeinsam von BIOS Scientific Publications
Ltd. (UK) und Blackwell Scientific Publications, UK, veröffentlichte
Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R.D.D. Croy) angefeuchtet
war. Kontrollblattstücke ähnlicher
Größe wurden
von Pflanzen geschnitten und sofort (ohne In-vitro-Inkubation) für die Proteinmessung
auf Trockeneis gelegt. Die Mittelwerte stellen Durchschnitte von
5 Pflanzen pro Transformationsereignis dar.
-
-
Die
Expression des Cry1Ab-Proteins fehlte wiederum oder lag etwa bei
der Nachweisgrenze in Blättern,
Stängeln
und Kernen der verschiedenen getesteten TR2'-cry1Ab-Ereignisse.
Keine signifikante Expression wurde in Blättern und Pollen im V4-Stadium
und in blühenden
Pflanzen gefunden. Eine konstitutive Expression von etwa 0,02-0,03%
des gesamten löslichen
Proteins wurde bei diesen Pflanzen in den Wurzeln beobachtet. Wenn
die Blätter
mechanisch beschädigt
werden, wird die Expression des Cry1Ab-Proteins induziert und steigt
bis auf 0,05-0,1%. Die 35S-cry1Ab-Ereignisse zeigten ungeachtet
einer Verwundung eine konstitutive Expression des Cry1Ab-Proteins
von etwa 0,5% in den Blättern
von V3-Pflanzen. Während
der Blüte
und der Ernte wurden Expressionsniveaus von etwa 0,1-0,2% vor und
nach Verwundung gemessen.
-
Ein ähnlicher
Test, wobei die Verwundung in planta (ohne In-vitro-Inkubation eines
ausgeschnittenen Blattteils) an im Gewächshaus gezüchteten Pflanzen erfolgte,
führte
zu niedrigeren Expressionswerten, wobei sich immer noch eine deutliche
Zunahme der Expression nach Verwundung zeigte. In diesem Test wurden ECB-Larven
des zweiten Larvenstadiums in so genannten Klipskäfigen (clip
cages) auf fünf
Maispflanzen von WI602-0402 im VT-Stadium gesetzt. Von jeder Pflanze
wurden sechzig Stunden später
Proben des beschädigten
Blattbereichs im Klipskäfig,
von einem Blatt, das sich 2 cm oder 10 cm auf- und abwärts des
Klipskäfigs befand,
und von einem Blatt oberhalb und unterhalb des Blattes mit dem Klipskäfig entnommen.
Blattproben wurden ferner zu Beginn des Experiments entnommen. Mit
den Proben wurde ein Cry1Ab-ELISA durchgeführt, Mittelwerte (fett) und
Standardabweichung wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in der
nachstehenden Tabelle 4 dargestellt. Tabelle
4. Cry1Ab-Konzentration in TR2'-Cry1Ab-Pflanzen (Verwundung
durch Insektenfraß).
-
In
einem weiteren Test wurden fünf
Pflanzen im VT-Stadium
von WI604-1602 und WI606-1206 im Gewächshaus mit einem Skalpell
beschädigt.
Von jeder Pflanze wurden vierzig Stunden später Proben des beschädigten Blattbereichs
(üblicherweise
2 bis 3 mm um die Wundenstelle), von dem gleichen Blatt 2 cm und 10
cm auf- und abwärts
des beschädigten
Bereichs und von einem Blatt, das höher und tiefer als das verwundete
Blatt war, entnommen. Blattproben wurden ferner zu Beginn des Experiments
entnommen. Ein Cry1Ab-ELISA wurde an den Proben durchgeführt, Mittelwerte
(fett) und Standardabweichung wurden berechnet.
-
Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5. Cry1Ab-Konzentration in TR2'-Cry1Ab-Pflanzenlinien (Verwundung
durch Skalpell).
| | Probe | Zell (Std.) | Cry1Ab |
| % |
| Schaden
mit Skalpell |
| | | | WI604-1602 | WI606-1206 |
| unbeschädigt | an
Pflanze | 0 | 0,001 | 0,000 |
| | | | 0,001 | 0,000 |
| unbeschädigt | an
Pflanze | 40 | 0,001 | 0,000 |
| | | | 0,001 | 0,001 |
| beschädigt | an
Pflanze, Probeverletzung | 40 | 0,005 | 0,006 |
| | | | 0,001 | 0,002 |
| beschädigt | an
Pflanze, 2 cm über
Probeverletzung, Richtg. Stängel | 40 | 0,000 | 0,001 |
| | | | 0,001 | 0,001 |
| beschädigt | an
Pflanze, 2 cm unter Probeverletzung, Richtg. Blattspitze | 40 | 0,001 | 0,001 |
| | | | 0,001 | 0,001 |
| beschädigt | an
Pflanze, 10 cm über
Probeverletzung, Richtg. Stänge | 40 | 0,001 | 0,001 |
| | | | 0,000 | 0,001 |
| beschädigt | an
Pflanze, 10 cm unter Probeverletzung, Richtg. Blattspitze | 40 | 0,001 | 0,001 |
| | | | 0,000 | 0,000 |
| beschädigt | an
Pflanze, Blatt über
beschädigtem Blatt | 40 | 0,001 | 0,000 |
| | | | 0,001 | 0,000 |
| beschädigt | an
Pflanze Blatt unter beschädigtem
Blatt | 40 | 0,000 | 0,000 |
| | | | 0,001 | 0,000 |
-
Messungen
in zusätzlichen
Feldversuchen bestätigten
die niedrigen Basalexpressionsniveaus des Cry1Ab-Proteins in Pflanzen
(unter Verwendung von frischem Blattmaterial, das von den Pflanzen
entnommen, nicht in vitro inkubiert wurde): In einem Feldversuch
mit 5 Inzucht-Pflanzenlinien pro Ereignis, die das pTR2'-Cry1Ab-Konstrukt
enthielten, waren zwischen 0,001 und 0,003% des gesamten löslichen
Blattproteins Cry1Ab-Protein
(Mittelwert von 5 Pflanzen pro Ereignis (Standardabweichung durchschnittlich
0,001 bis 0,004%)) im Feld. Außerdem
zeigte ein weiterer Feldversuch, dass man mehr Cry1Ab-Protein in
Maispflanzen, die im Feld künstlich
mit ECB-Larven verseucht werden, als in nicht mit Insekten verseuchten
Pflanzen findet. Die Expressionsniveaus für das Cry1Ab-Protein, die man
bei diesem Versuch (8 Pflanzen) fand, betrugen im Durchschnitt zwischen
0,001 und 0,002% des gesamten löslichen
Proteins im vegetativen Blatt, zwischen 0,003 und 0,046% des gesamten
löslichen
Proteins im R1-Blatt und zwischen 0,009 und 0,017% des gesamten
löslichen
Proteins im R5-6-Blatt (unter Verwendung von frischem Blattmaterial,
das von den Pflanzen entnommen, nicht in vitro inkubiert wurde).
Wie erwartet, lieferte ein Insektenbefall im Feld eine erhöhte Cry1Ab-Proteinkonzentration
in einigen Pflanzen (Proben wurden zufallsgemäß von den Pflanzen genommen).
-
Beispiel 3. Insektenresistenz von Pflanzen
mit wundeninduzierbarer Expression
-
a) Wirksamkeit gegen einen kontrollierten
Befall mit ECB-Larven des vierten Larvenstadiums
-
Maispflanzen
im mittleren Wirtelstadium wurden in einen Plexiglaszylinder gestellt
und mit 10 oder 15 Maiszünslerlarven
im vierten Larvenstadium verseucht.
-
Nach
10 Tagen wurden die Pflanzen zerschnitten, und das prozentuale Überleben
von Larven wurde pro Pflanze bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle
6 dargestellt. Tabelle 6. Wirksamkeit gegen ECB-Larven
des vierten Larvenstadiums
| Ereignis | Anz.
getesteter Pflanzen | durchschnittliches
prozentuales Überleben
(SA) |
| WI602-0402 | 6 | 0 |
| WI602-0802 | 6 | 0 |
| WI604-1602 | 6 | 0 |
| WI606-0802 | 6 | 0 |
| WI606-1206 | 6 | 0 |
| B73-Kontrolle | 9 | 49,6
(18,8) |
-
Es
wurde gefunden, dass die Wirksamkeit der Bekämpfung von ECB-Larven des vierten
Larvenstadiums beim kontrollierten Befall für alle getesteten TR2'-cry1Ab-Pflanzen 100% betrug. Die Kontrollpflanzen zeigten
im Durchschnitt höchstens
50% Sterblichkeit.
-
Weil
angenommen wird, dass die ECB-Larven des vierten Larvenstadiums
zwischen 25- und 100-mal weniger empfänglich für das modifizierte Cry1Ab-Protein
sind als die Larven des ersten Stadiums, kann das in den TR2'-cry1Ab-Pflanzen
produzierte Proteinniveau als "starke
Dosis" angesehen
werden, auch wenn die Expressionswerte, wie sie in solchen Pflanzen
nach der Wundeninduktion gemessen werden, üblicherweise immer noch relativ
niedrig sind.
-
b) Wirksamkeit gegen ECB
-
Vierzehn
Ereignisse wurden hinsichtlich der ECB-Wirksamkeit im Gewächshaus und in Feldversuchen untersucht
(Tabelle 7). Die Ergebnisse sind als durchschnittliche Länge der
Tunnel (mit dem Standardabweichungswert in Klammern) über die
maximale Länge
der Tunnel bei jeder Pflanze (Durchschnitt(SA)/max. Länge/Pfl.)
angegeben. Im Gewächshaus
wurde die durchschnittliche Länge
der Tunnel aus Messungen an 10 Pflanzen ermittelt. Im Feld wird
die ECB-Wirksamkeit als Durchschnitt von 3 Werten ausgedrückt, die
für verschiedene
Gruppen von 10 Pflanzen erhalten wurden. Vier der fünf (mit
einem Sternchen markierten) Einzelkopie-Ereignisse ergaben eine
völlige
ECB-Bekämpfung,
die als eine Tunnellänge
von weniger als 3,5 cm bestimmt wurde. Tabelle 7. ECB-Wirksamkeit im Gewächshaus
und in Feldversuchen
| Ereignis | ECB-Wirksamkeit
Gewächshaus
Durchschnitt(SA)/max. Länge/Pfl. | ECB-Wirksamkeit
Feld 1 Durchschnitt(SA)/max. Länge/Pfl. | ECB-Wirksamkeit
Feld 2 Durchschnitt(SA)/max. Länge/Pfl. |
| WI602-0402* | 0,11(0,31)/1 | 0,24(0,41)/2 | 0,21(0,01)/2 |
| WI604-1602 | 0,2(0,42)/1 | 0,05(0,071)/1 | |
| WI606-0406* | 51,3(73,5)/195 | 8,41(1,8)/32 | 7,45(0,07)/30 |
| WI606-0802* | 3,3(2,6)/8 | 0(0)/0 | 0,05(0,07)/1 |
| WI606-1206* | 0,38(0,74)/2 | 0,17(0,29)/3 | 0,1(0,14)/1 |
| WI600-0218 | 2,0(1,87)/6 | | |
| WI600-1402 | 29,4(45,8)/142 | 6,55(2,47)/28 | |
| WI602-0202 | 168,5(26,9)/200 | 12,6(3,8)/31 | |
| WI604-0604 | 102,5(83)/251 | 3,7(2,0)/25 | |
| WI602-0802 | 0(0)/0 | 0,33(0,15)/3 | |
| WI602-0204 | 66(68,2)/160 | | |
| WI602-1002 | 102,4(63,4)/215 | | |
| WI606-0602 | 45,5(52,8)/160 | | |
| WI600-0802 | 0,9(1,44)/4 | 0,06(0,11)/2 | 0(0)/0 |
-
Keine
Belastung der agronomischen Leistung wurde für die Pflanzen nach der zweiten
Selbstung (Kolben auf Reihe) der verschiedenen TR2'-Ereignisse an irgendeiner
der getesteten Stellen beobachtet.
-
c) Wirksamkeit gegen Sesamia nonagrioides
-
Fünf Maispflanzen
des mittleren Wirtelstadiums, die das TR2'-cry1Ab-Konstrukt umfassten, wurden
jeweils mit 2 Eimassen verseucht. Die Schäden wurden nach 14 Tagen bewertet
und die Anzahl an Larven gezählt.
Die Schadensbewertung (ausgedrückt
als Pflanzenhöhe
und Länge
von Tunneln pro Pflanze in cm) wurde über die fünf Pflanzen gemittelt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle
8.
| Ereignis | Anz.
Larven | Pflanzenhöhe | cm
Tunnel |
| | pro
Pflanze | in
cm | pro
Pflanze |
| WI600-0802 | 0,6
(1,3) | 198
(8,4) | 0 |
| 873-Kontrolle | 197,2
(14,0) | 84
(5,5) | 70
(9,4) |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass auch eine gute Bekämpfung der Maiseule in den
getesteten TR2'-cry1Ab-Pflanzen vorliegt.
-
Beispiel 4: Vergleichsanalyse.
-
Eine
Analyse der Expression unter Verwendung des MPI-Promotors (den Breitler
et al., 2001, als wundeninduzierten Promotor beschreiben) in Maispflanzen
mit der gleichen codierenden Cry1Ab-Sequenz, wie sie vorstehend
verwendet wird, erfolgt zum Vergleich der Basal- (nicht-induzierten)
Niveaus und der Wundeninduktion im Feld. Maispflanzen, die den Insektiziden
Cry1Ab-Proteinanteil unter der Kontrolle dieses MPI-Promotors exprimieren,
zeigen ein mittleres Basalexpressionsniveau von mindestens etwa
0,04% Cry1Ab-Protein pro gesamtem löslichem Protein in Blättern in
Gewächshaustests.
Auch bei anfänglichen
Gewächshaustests unter
Verwendung von 2 MPI-Cry1Ab-Ereignissen
wird eine gewisse Schwankung in den Expressionsniveaus nach Verwundung
gefunden, aber eine wundeninduzierte Zunahme der (mittleren) Cry1Ab-Proteinexpression auf
mindestens das Fünffache
des (mittleren) Basalniveaus wird bei diesen Ereignissen (nach mechanischer Verwundung)
nicht gefunden, wenn die Konzentration sowohl in Pflanzenmaterial,
das frisch von diesen Pflanzen genommen wird, als auch in entnommenen
Blattteilen, die in vitro inkubiert werden, gemessen wird (in beiden
Fällen
wird die Konzentration in verschiedenen Pflanzen 21 Stunden und
42 Stunden nach Verwundung gemessen). Somit gibt es keine oder nur
eine schwache Induktion der Cry1Ab-Proteinexpression (verglichen mit
dem Basalproteinexpressionsspiegel) in diesen Assays mit dem MPI-Promotor.
-
Ferner
wird in einer Vergleichsanalyse die Leistung der erfindungsgemäßen Pflanzen
im Feld unter Verwendung des TR2'-Promotors
mit kommerziell erhältlichen
Maispflanzen verglichen, die einen Cry1Ab-Proteinabschnitt exprimieren. In diesen
Tests werden Maispflanzen verwendet, die aus den Ereignissen MON810 und
Bt11 erhalten wurden (siehe eine detaillierte Beschreibung in den
veröffentlichten
USDA-Petitionen dieser zugelassenen Maisereignisse), die einen 35S- Promotor für hohe konstitutive
Expressionsniveaus nutzen und von denen man weiß, dass sie eine Insektenresistenz
in starker Dosis liefern. Bei einem Feldversuch beträgt die mittlere
Tunnellänge
(in cm pro Stängel,
nach Aufspalten des Stängels,
wie in Jansens et al. (1997) beschrieben, gemessen) bei einer künstlichen
Verseuchung mit dem Maiszünsler
0, 0, 0,04, 0 bzw. 0,21 cm für 5
verschiedene Cry1Ab-TR2'-Maisereignisse, während die
mittlere Tunnellänge
für MON810-Mais
0,3 und für Bt11-Mais
0,13 beträgt
(in nicht-transformierten Kontroll-Maislinien werden in dem gleichen
Versuch Tunnellängen
von 12,2 bis 39,92 cm gefunden). Somit zeigt eine Vergleichsanalyse
des wundeninduzierten TR2'-Promotors
in Mais, dass eine Expression eines insektiziden Proteins unter
der Kontrolle des TR2'-Promotors
in Mais ein hohes Niveau an Insektenresistenz liefert, das mit demjenigen
vergleichbar ist, das mit kommerziell erhältlichen Ereignissen mit konstitutiven
Promotoren erzielt werden kann.
-
Bei
einem anderen Feldversuch beträgt
die mittlere Tunnellänge
(in cm pro Stängel,
nach Aufspalten des Stängels,
wie in Jansens et al. (1997) beschrieben, gemessen) bei einer künstlichen
Verseuchung mit Diatraea grandiosella 0,53, 0,68, 0,3, 0,64 bzw.
0,6 cm für
die 5 verschiedenen Cry1Ab-TR2'-Maisereignisse, während die
mittlere Länge
für MON810-Mais
0,43 und für
Bt11-Mais 0,15 beträgt
(in nicht-transformierten Kontroll-Maislinien werden in dem gleichen
Versuch Tunnellängen
von 32 bis 39,6 cm gefunden, bei einigen standen aufgrund von Brechen
des Stängels
durch die Tunnel keine Pflanzen mehr aufrecht).
-
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