PT1504104E - Plantas resistentes a insectos e processos para a sua produção - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
PLANTAS RESISTENTES A INSECTOS E PROCESSOS PARA A
SUA PRODUÇÃO
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto uma sequência de ADN que codifica uma proteína CrylAb modificada que tem actividade insecticida. A presente invenção ainda tem por objecto um processo para a produção de plantas resistentes a insectos por meio da introdução, no genoma das plantas, de um ADN exógeno que compreenda essa sequência de codificação de CrylAb modificada. A presente invenção ainda tem por objecto plantas ou partes delas que compreendem, nesse genoma, a sequência de codificação de CrylAb modificada da presente invenção.
TÉCNICA ANTERIOR A bactéria Gram-positiva do solo Bacillus thuringiensis é bem conhecida pela sua produção de proteínas ou de delta-endotoxinas, que são tóxicas para uma variedade de larvas de lepidópteros, coleópteros e dípteros. Diferentes estirpes de B. thuringiensis têm-se mostrado capazes de produzir diferentes proteínas cristalinas insecticidas, que são especificamente tóxicas para certas espécies de insectos (revisto por Hõfte e Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998). A toxicidade específica das toxinas insecticidas produzida por B. thuringiensis para insectos-alvo e a sua não toxicidade para plantas e outros organismos, tem dado 1 origem a composições que compreendem diferentes estirpes de Bt, o produto de eleição para o controlo biológico de pragas de insectos na agricultura. Vários dos genes que codificam as proteínas cristalinas têm sido clonados e determinaram-se as suas sequências de ADN (Hõfte e Whiteley, 1989; Crickmore et al., 1995). Isto levou à engenharia genética de genes que codificam delta-endotoxinas modificadas e ao desenvolvimento de plantas que expressam estes genes de delta-endotoxinas para as tornar resistentes a insectos. A família dos genes de cryl codifica as proteínas cristalinas Cryl, que são activas principalmente contra as pragas causadas por lepidópteros. A forma de pro-toxina das delta-endotoxinas de Cryl consiste numa parte de protoxina de terminal C que não é tóxica e que se pensa que seja importante para a formação da estrutura cristalina (Arvidson et al., 1989). A metade amino da protoxina compreende o segmento activo de toxina da proteína Cryl. Ainda se identificaram diferentes domínios na toxina activa que estão implicados em diferentes aspectos do efeito de toxicidade (Grochulski et al., 1995). Contudo, estas funções parecem estar dependentes da delta-endotoxina examinada. Têm-se feito esforços significativos para modificar os genes de cryl de modo a melhorar os níveis de expressão nas plantas ao mesmo tempo que retêm pelo menos a sua toxicidade em relação aos insectos-alvo. A modificação dos genes de crylAb e crylAc para eliminar possíveis sinais de poliadenilação das plantas e elementos de instabilidade (sem alterar as sequências de aminoácidos codificadas) resultou num aumento da resistência das plantas transformadas com estas sequências (van der Salm et al., 2 1994). As modificações dos genes de crylAb já foram descritas nas patentes US 6.320.100, US 6.180. 774 e US 6.114.608. A patente US 5.500.365 descreve como a modificação na região 240 da região de codificação de um gene de crylAb, de modo a eliminar os possíveis sinais da planta, é de importância significativa para aumentar os níveis de expressão e consequentemente a toxicidade da toxina Cry em plantas. A presente invenção tem por objecto uma nova proteína CrylAb modificada e as sequências de ADN que codificam esta proteína que pode ser utilizada para a engenharia genética de resistência aos insectos em plantas. Mais particularmente verificou-se que esta sequência modificada, apesar de ter uma região 240 natural, assegura uma expressão suficientemente alta em células de plantas para conferir resistência aos insectos por parte de plantas ou de tecidos de plantas onde é expressa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto uma sequência que codifica a crylAb modificada, que codifica a proteína CrylAb modificada da SEQ ID NO: 1, que é uma proteína insecticida em que a sequência de ADN que codifica a sequência de CrylAb modificada compreende a sequência da SEQ ID NO: 2. A presente invenção ainda tem por objecto genes quiméricos que compreendem a sequência de ADN da crylAb modificada da presente invenção sob o controlo de um promotor que pode ser expresso pela planta. 3 A presente invenção ainda tem por objecto vectores recombinantes que compreendem os genes quiméricos da presente invenção e a produção de plantas transgénicas que utilizam estes vectores recombinantes. A presente invenção ainda tem por objecto plantas e as suas células, sementes ou tecidos, compreendendo no seu genoma um ADN externo compreendendo a sequência de ADN de crylAb modificada da presente invenção sob o controlo de um promotor que pode ser expresso pela planta. A presente invenção também tem por objecto um processo para realizar a engenharia genética de resistência a insectos em plantas, de modo a proteger as referidas plantas de insectos lepidópteros, introduzindo, por transformação, no genoma da planta, um ADN exógeno que compreende a sequência que codifica a crylAb modificada da presente invenção sob o controlo de um promotor que pode ser expresso pela planta.
De acordo com um enquadramento particular da presente invenção, a sequência que codifica a crylAb modificada é particularmente apropriada para realizar engenharia genética de resistência a insectos em colheitas agrícolas tal como milho e algodão. Mais particularmente, a expressão da proteína CrylAb modificada confere resistência destas plantas às pragas de lepidópteros. Mais particularmente, estas pragas incluem, mas não se limitam às principais pragas de lepidópteros do milho, algodão e arroz, tal como Ostrinia nubilalis (broca do milho europeu ou BME), Sesamia nonagrioides (broca dos caules mediterrânicos), Sesamia inferens (pirai do tronco cor-de-rosa), Helicoverpa zea (larva do milho, larva de traça do algodão), Helicoverpa armigera (lagarta americana), Heliothis virescens (larva de 4 traça do tabaco), Scirpophaga incertulas (pirai de tronco amarelo) e Cnaphalocrocis medinalis (enrolador da folha do arroz) .
Também tem por objecto a utilização do gene quimérico anterior para se obter plantas resistentes a insectos.
DESCRIÇÃO DETALHADA 0 termo "gene", tal como se utiliza aqui, refere-se a qualquer sequência de ADN que compreenda vários fragmentos de ADN operacionalmente ligados tal como uma região de promotor, uma região 5' não traduzida (a RNT5'), uma região de codificação e uma região 3' não traduzida (RNT3') compreendendo um sítio de poliadenilação. Um gene pode incluir mais fragmentos de ADN tal como, por exemplo, intrões. Embora seja necessário um promotor e uma região de codificação num gene utilizado para a transformação das plantas na presente invenção, a RNT3'que compreende um sítio de poliadenilação não precisa de estar presente no próprio gene transferido, mas pode ser recuperado nas sequências de ADN da planta a montante depois da inserção de um gene que não contenha a RNT3'que compreende um sítio de poliadenilação. 0 termo "quimérico", quando se refere a um gene ou a uma sequência de ADN, utiliza-se para referir ao facto de o gene ou a sequência de ADN compreenderem pelo menos dois fragmentos de ADN funcionalmente relevantes (tal como promotor, RNT5', região de codificação, RNT3', intrão) que não estão naturalmente associados uns aos outros e/ou com origem, por exemplo, em diferentes fontes. "Exógeno" refere-se a um gene ou a uma sequência de ADN em relação a uma espécie de planta que é utilizado para indicar que o 5 gene ou a sequência de ADN não se encontram naturalmente na planta ou não se encontrar naturalmente no locus genético nessa planta. A expressão "ADN exógeno" será utilizada aqui para referir uma sequência de ADN quando é incorporada no genoma de uma planta em resultado da transformação.
Um genoma de uma planta, tecido de planta ou célula de planta, tal como se utiliza aqui, referem-se a qualquer material genético na planta, tecido de planta ou célula de planta e inclui tanto o genoma nuclear como os plastídeos e a mitocôndria.
Um "fragmento" ou "uma parte truncada" de uma molécula de ADN ou de uma sequência de proteína, tal como se utiliza aqui, refere-se a uma porção do ADN original ou da sequência de proteína (ácido nucleico ou aminoácido) referida a uma sua versão sintética (tal como uma sequência que se adapta para uma expressão óptima em plantas), que pode variar em comprimento mas que é suficiente para assegurar que a proteína (codificada) é uma toxina para o insecto. Uma "variante" de uma sequência é utilizada aqui para indicar uma molécula de ADN ou uma proteína cuja sequência (de ácidos nucleicos ou de aminoácidos) é praticamente idêntica à sequência a que o termo se refere.
Sequências que são "praticamente idênticas" significa que quando duas sequências estão alinhadas, a percentagem de identidade das sequências, isto é, o número de posições com nucleótidos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleótidos ou aminoácidos na parte menor das sequências, é superior a 70 %, preferencialmente superior a 85 %, mais preferencialmente superior a 90 %, especialmente preferencial é superior a 95 %, sendo a mais preferencial entre 96 e 100 %. O alinhamento das duas sequências de 6 nucleótidos realiza-se por meio do algoritmo tal como descrito por Wilbur e Lipmann (1983) utilizando uma dimensão de janela de 20 nucleótidos, um comprimento de palavras de 4 nucleótidos e uma penalidade de intervalo de 4 .
Um "promotor que pode ser expresso numa planta", tal como se utiliza aqui, refere-se a um promotor que assegura a expressão de uma sequência de codificação a que está ligada numa célula de planta. Exemplos desses promotores são bem conhecidos na técnica. Um promotor que pode ser expresso numa planta pode ser um promotor constitutivo. Exemplos de promotores que dirigem a expressão constitutiva em plantas são conhecidos na técnica e incluem o promotor 35S do virus de mosaico da couve-flor, o promotor de nopalina-sintase (NOS), o promotor ubi (Christensen et al. 1992), o promotor do gene GOS2 de arroz (de Pater et al., 1992). Alternativamente, um promotor que pode ser expresso numa planta pode ser um promotor específico de tecido, isto é, um promotor que controla o mais alto nível de expressão de uma sequência de codificação (como se pode medir por ensaios convencionais do ARN) nalguns tecidos de plantas, por exemplo, em tecidos verdes (tal como o promotor da PEP-carboxilase) do que noutros tecidos da planta. Alternativamente, um promotor que pode ser expresso numa planta pode ser um promotor indutível numa ferida. Um promotor 'indutível numa ferida' ou um promotor que controla um modelo de expressão que é indutível numa ferida, tal como se utiliza aqui, significa que, após o ferimento da planta, quer mecanicamente ou por fornecimento de insectos, a expressão da sequência de codificação sob controlo do promotor aumenta significativamente. Exemplos promotores indizíveis numa ferida incluem o gene inibidor de proteinase da batata e do tomate (pinl e pin2) (Johnson 7 et al., 1989) e o promotor do gene inibidor da proteinase do milho (ipm) (Cordero et al. 1994). 0 "promotor TR2", tal como se utiliza aqui, refere-se a qualquer promotor que compreenda a parte funcional de TR2' (ou manopina-sintase, abreviada como mas) do elemento duplo do promotor TR1'-TR2' das Agrobacterium (Velten et al. 1984; Langridge et al. 1989). Assim, pode compreender o elemento TR2' quer isolado ou em combinação com todo ou parte do elemento divergente TRl' (Guevara-Garcia et al., 1998) ou outros elemento (reguladores), incluindo, mas não se limitando a regiões promotoras, intrões e similares, desde que as caracteristicas de indução de ferida em monocotiledóneas, particularmente milho, de acordo com a presente invenção sejam substancialmente retidas. Num enquadramento preferido da presente invenção, a transcrição é controlada a partir da região promotora TR2' (e a sequência de codificação fica portanto a jusante da sequência do promotor TR2'), mesmo se se utilizar o promotor duplo TR1'-TR2' (ou qualquer uma das suas partes que retenha o elemento promotor TR2'). 'Insecticida' utiliza-se aqui para significar que é tóxico para os insectos que são pragas para colheitas. Mais particularmente, no contexto da presente invenção os insectos-alvo são pragas tais como, mas não se limitando às principais pragas de lepidópteros, tais como, Ostrinia nubilalis (broca do milho europeu ou BME), Sesamia nonagrioides (broca dos caules mediterrânicos), Helicoverpa zea (larva do milho, lagarta do algodão), Helicoverpa armigera (lagarta americana) e Heliothis viriscens (larva da traça do tabaco). 8
Num enquadramento preferido da presente invenção, o adn que codifica uma proteína cristalina insecticida (PCI) é uma sequência de ADN de crylAb modificada que codifica uma PCI que corresponde à sequência da SEQ ID NO: 1, em que a sequência que codifica a crylAb modificada compreende a sequência SEQ ID NO: 2. A sequência de ADN utilizada para a transformação das plantas, particularmente milho, algodão ou arroz, de acordo com a presente invenção, pode também conter outros elementos para além de uma região de codificação que codifica a proteína CrylAb modificada da presente invenção, tal como uma região de codificação que codifica um péptido de trânsito, uma região de codificação que codifica uma proteína de marcador seleccionável ou uma proteína que confere resistência a um herbicida.
Num enquadramento preferido da presente invenção, a proteína CrylAb modificada é tóxica para a maior parte das pragas de lepidópteros de colheitas tal como milho, algodão e arroz. As plantas da presente invenção, compreendem um ADN exógeno no seu genoma compreendendo o ADN anterior que codifica uma proteína CrylAb modificada estão protegidas contra estas pragas, expressando uma quantidade controlável desta proteína. Por controlo entende-se uma quantidade tóxica (letal) ou combativa (sub-letal). Ao mesmo tempo, as plantas devem ser morfologicamente normais e podem ser cultivadas de uma forma usual para o consumo e/ou a produção de produtos. Além disso, as referidas plantas devem obviar substancialmente a necessidade de insecticidas químicos ou biológicos (para os insectos atingidos pela proteína CrylAb modificada). 0 nível de expressão de uma PCI num material de uma planta pode ser determinado num certo número de maneiras descrito na técnica, tal como por quantificação do ARNm que 9 codifica a proteína insecticida produzida no tecido utilizando iniciadores específicos (tal como descrito por Cornelissen & Vandewiele, 1989) ou a detecção específica directa da quantidade de proteína insecticida produzida, por exemplo, por processos de detecção imunológica. Mais particularmente, de acordo com a presente invenção, o nível de expressão de uma proteína CrylAb modificada é representado como a percentagem de proteína insecticida solúvel determinada por ELISA imuno-específica tal como descrito aqui em relação à quantidade total de proteína solúvel (como determinado, por exemplo, pela análise de Bradford (Bradford, 1976)). Uma análise por ELISA preferida na presente invenção é uma ELISA em sanduíche (Clark et al., 1986).
Podem utilizar-se diferentes ensaios para medir o efeito ou a eficácia insecticida da expressão da PCT na planta. De acordo com a presente invenção, os insectos-alvo são as principais pragas de lepidópteros de colheitas agrícolas tal como milho, algodão e arroz, mais particularmente broca do milho europeu ou (BME) e Sesamia nonagrioides (SMG) no milho, lagarta do algodão (LGA) e larva da traça do tabaco (LVT) no algodão o pirai de tronco amarelo, o pirai de tronco cor-de-rosa e o enrolador de folha do arroz no arroz. A toxicidade duma PCI produzida numa planta de milho por BME pode ser ensaiada in vitro fazendo o ensaio da proteína extraída da planta em bio-ensaios de alimentação com larvas de BME ou pontuando a mortalidade das larvas distribuídas no material de folhas de plantas transformadas num prato de Petri (ambos os ensaios tal como descrito por Jansens et al., 1997) ou em plantas isoladas em cilindros individuais. Na infestação do campo que a primeira broca do milho europeu (BMEl), avalia-se a infestação com base nas pontuações dos danos nas 10 folhas (Guthrie, 1989) enquanto a avaliação do número total de túneis dos caules por planta e do comprimento dos túneis dos caules são indicativos dos danos da alimentação dos caules do segundo caldo (BME2). A eficácia da PCI produzida nas plantas de algodão transformadas com um gene de crylAb modificada pode, do mesmo modo, ser medida utilizando um ensaio in vitro e/ou in vivo. A toxicidade dos tecidos das plantas transformadas para as larvas de LGA pode ser medida alimentando nós, folhas e terminais com larvas de LGA e avaliando o peso das larvas sobreviventes. No campo, as plantas são artificialmente infestadas com larvas de LGA recém-nascidas e pontuando os danos nas folhas, terminais, quadriculas, flores brancas e casulos a intervalos de tempo regulares (tal como descrito aqui) . Deve entender-se que se podem desenvolver ensaios semelhantes para qualquer insecto-alvo ou não alvo de modo a determinar a eficácia da PCI produzida na planta contra esse insecto.
As plantas da presente invenção compreendem também, no seu genoma, eventualmente, um gene que codifica a resistência herbicida. Mais particularmente, o gene de resistência aos herbicidas é o gene bar ou pat, que confere tolerância da planta ao glufosinato, isto é, as plantas são tolerantes ao herbicida LibertyTM. A tolerância ao LibertyTM pode ser ensaiada de diferentes maneiras. Por exemplo, a tolerância pode ser ensaiada por aplicação de uma pulverização de LibertyTM. Os tratamentos por pulverização podem ser feitos entre os estádios das plantas V2 e V6 para se obterem melhores resultados (os estádios do milho são como os determinados em 'How a Corn Plant Develops, Special Report No. 48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative Extension Service, 11
Ames, Iowa, Re-impresso em Junho de 1993; ver também o sítio da internet em: :). As plantas tolerantes são caracterizadas pelo facto de a pulverização das plantas com pelo menos 200 gramas de ingrediente activo/hectare (g.i.a./ha), preferencialmente 400 g.i.a./ha e possivelmente até 1600 g.i.a./ha (4X a taxa normal no campo), não matar as plantas. Uma aplicação extensiva devia ser aplicada a uma taxa de 0,79-0,96 Kg de LibertyTM + 1,12 kg de sulfato de amónio por 40 ares. O melhor é aplicar a um volume de 75,71 litros de água por 40 ares utilizando um esguicho do tipo ventoinha plana embora tendo cuidado para não dirigir as aplicações do líquido pulverizado directamente sobre as flores com pétalas das plantas para evitar que o tensioactivo queime as folhas. O efeito herbicida deve aparecer dentro de 48 horas e deve ser claramente visível no prazo de 5-7 dias.
Exemplos de outros genes da resistência herbicida são os genes que codificam a resistência a fenemedifama (tal como o gene pmph, US 5.347.047; US 5.543.306), os genes que codificam a resistência a glifosato (tal como os genes EPSPS, US 5.510.471), genes que codificam a resistência a bromoxinilo (tal como descrito na US 4.810.648), genes que codificam a resistência a sulfonilureia (tal como descrito na EPA 0 360 750), genes que codificam a resistência ao herbicida dalapon (tal como descrito na patente WO 99/27116) e os genes que codificam a resistência a cianamida (tal como descrito na patente WO 98/48023 e WO 98/56238) e os genes que codificam a resistência aos inibidores de glutamina-sintetase, tal como PPT (tal como descrito nas patentes EP-A-0 242 236, EP-A-0 242 246, EP-A-0 257 542). 12 A introdução de um ADN exógeno numa célula de planta pode ser conseguida pelos processos convencionais de transformação descritos na técnica. Esses processos incluem, mas não se limitam a transformação mediada por Agrobacterium (US 6.074.877, Hiei et al., 1997), bombardeamento com microprojécteis (tal como descrito, por exemplo por Chen et al., 1994; Casas et al., 1995; Christou, 1997, Finer et al., 1999, Vasil et al. 1999), introdução directa de ADN nos protoplastos (tal como descrito, por exemplo por De Block et al. 1989; Poulsen, 1996, Datta et al., 1999), electroporação (D'Halluin et al., 1992, US 5.641.665; Bates, 1995) ou a introdução de ADN mediada por um cristal capilar de silício (Dunwell, 1999) ou outros processos como os revistos de forma geral por Potrykus (1990), Sawahel et al. 1995; Langridge et al. (1998), Bogorad (2000) e Newell (2000).
Os exemplos que se seguem descrevem o desenvolvimento de uma sequência de ADN que codifica uma proteína CrylAb modificada, a construção de genes quiméricos que compreendem esta sequência para a expressão em plantas e plantas resistentes a insectos assim obtidas. A menos que seja estabelecido de outra forma nos exemplos, todas as técnicas de ADN recombinante são realizadas de acordo com protocolos normalizados como descrito em Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA e nos Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (RU). Os materiais e os processos normalizados para o trabalho molecular nas plantas estão descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific 13
Publications Ltd (RU) e Blackwell Scientific Publications, UK. Os materiais e os processos normalizados para as reacções em cadeia de polimerase podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e em McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, primeira edição, Springer Verlag, Alemanha.
Ao longo da memória descritiva e dos exemplos, faz-se referência às sequências que se seguem representadas na listagem de sequências: SEQ ID NO: 1: Proteína CrylAb modificada SEQ ID NO: 2: Sequência de ADN que codifica uma proteína CrylAb modificada
EXEMPLOS 1. Desenvolvimento de um gene de CrylAb modificada A sequência de ADN da CrylAb modificada aqui utilizada codifica parte da proteína CrylAb5 descrita por Hõfte et al. (1986) correspondendo aos aminoácidos 1 a 616, que tem uma inserção de um codão de alanina (GCT) 3' do codão de início de ATG (AlaAsp2...Asp616) . A sequência da proteína da proteína CrylAb modificada está indicada na SEQ ID NO: 1. A sequência de ADN que codifica essa proteína CrylAb modificada está indicada na SEQ ID NO: 2. 2. Gene de CrylAb no milho I. Desenvolvimento de ocorrências de CrylAb no milho 14
Para a transformação do milho por Agrobacterium, desenvolveram-se estruturas em que a sequência de codificação de crylAb foi colocada sob o controlo de promotores diferentes: promotor 35S (Odell et al. 1985) , o promotor ubi (Christensen et al. 1992), o promotor do gene G0S2 de arroz (de Pater et al., 1992) com a líder cab 22 de Petunia (Harpster et al. 1988), a sequência líder 5' do gene G0S2 de arroz, contendo o segundo exão, o primeiro intrão e o primeiro exão do transcrito de GOS (de Pater et al., 1992), ou uma região do promotor TR2' (Velten et al. 1984); incluindo todas as estruturas o gene 35S-bar. A transformação mediada por Agrobacterium foi feita por um co-cultivo de calos do tipo I derivados de embriões imaturos com a estirpe C58C1 (pTiEHAlOl)(pTTS35) (Agrobacterium C58ClRifR estirpe curada para pTiC58 comportando o plasmido de Ti não oncogénico pTiEHAlOl (Hood et al., 1986) e os plasmidos do quadro a seguir contendo os genes de interesse colocados entre as fronteiras de ADN-T). A transformação dos protoplastos foi feita por transfecção, mediada por PEG, de protoplastos preparados a partir de culturas de suspensão derivadas dos embriões de Pa91xH99xHE89 Z15. O ADN utilizado para transfecção foi um fragmento purificado dos plasmidos do quadro a seguir contendo os genes de interesse das fronteiras do adn-t.
Trannsforma-ção com Agrobacterium Descrição da estrutura Abreviatura PTSVH0203 p35S2-GEl-modcrylAb-3'ocs<>p35S3-bar-3'nos p35S-crylAb PTSVH0207 Líder Pubil-ubi leader com intrão-modcrylAb-3'ocs<>p35S3-bar-3'nos pUbi-crylAb PTSVH0208 Pgos2-cab22 leader-modcrylAb-3'ocs<>p35S3- pGos-cab- bar-3'nos crylAb PTSVH0209 Líder Pgos2-gos com intrão -modcrylAb- pGos-gos- 3'ocs<>p35S3-bar-3'nos crylAb 15 PTSVH0212 3'nos-bar-p35S3><Tr2-modcrylAb-3'ocs pTR2-crylAb Transformação dos protoplastos PSVH0211 Líder Pubil-ubi com intrão-crylAb53-31ocs<>p35S3-bar-31 nos pUbi-crylAb PSVH0213 Líder Pgos2-gos com intrão -modcrylAb-3'ocs<>p35S3-bar-31 nos pGos-gos- crylAb
Seleccionaram-se rebentos regenerados com base na tolerância à Liberty e/ou a medição dos níveis da proteína PAT por ELISA (Clark et ai, 1986). II. Avaliação das ocorrências a) Caracterização geral
Verificaram-se os transformantes de Agrobacterium quanto à presença da sequência de vectores sua fronteira esquerda do ADN-T. Realizaram-se as análises de "Southern blot" com material das folhas de transformantes primários (TP). b) Expressão da proteína CrylAb modificada
Avaliaram-se as ocorrências em estufa para a expressão de CrylAb detectando os níveis de proteína CrylAb modificada e solúvel em diferentes tecidos por meio de uma ELISA de CrylAb em sanduíche com uma fracção de IgG policondensada de um anti-soro policlonal de coelho contra CrylAb como primeiro anticorpo e um anticorpo monoclonal contra CrylAb como segundo anticorpo.
Os níveis de expressão da proteína CrylAb modificada nos diferentes tecidos de plantas com flores precoces 16 transformadas com a estrutura de p35S-estão indicados no quadro 1. Verificou-se que a expressão em diferentes plantas da descendência, de uma ocorrência obtida com a ocorrência de p35S-crylAb era constitutiva e superior em 0,5 % em média.
Quadro 1. Expressão de CrylAb em diferentes tecidos dos rebentos precoces da planta
Ocorrêncl Planta ns Lâmina de folha Raiz a CP048-2602 0042 0, 73 1,4 (estrutura ptsvh0203) 0032 1,12 3,18 0033 1,14 2,39 0034 1,12 2,65 0035 0,94 3,51 0039 0,88 2,48 0040 0,68 1,7 0036 0,27 0,81 0037 0,13 0,66 0038 0,15 1,15 0041 0,13 0,49 0043 0, 08 0,78 0044 0,13 0,98 0045 0, 08 0,55 0031 0,11 0,57 Média (DP) 0,51(0,44) 1,55(1,03) 17
Os níveis de expressão da proteína CrylAb em diferentes tecidos em folhas dos estádios precoces v, Rl e R4-5, nas sementes do estádio R4-5 e no pólen para plantas transformadas com as estruturas de p35S-crylAb, pGos-cab-crylAb, pGos-gos-crylAb e pTR2-crylAb estão ilustrados no quadro 2. OS resultados são apresentados como as médias das amostras de folhas e de sementes retiradas de 5 plantas e como médias das amostras de pólen retiradas de 3 plantas (desvio padrão entre parêntesis). A expressão de PCI para uma planta de p35S-crylAb está acima 0,1 % da proteína total solúvel. As plantas de pGos-cab-crylAb mostraram níveis de expressão de CrylAb próximos de 0,01-0,06 % nas folhas. As ocorrências obtidas com as estruturas de pGos-gos-crylAb exibiram uma expressão elevada (0,2-0,6 % de proteina) no tecido das folhas. A expressão de base da proteína nas folhas de plantas transformadas com a sequência de ADN da crylAb modificada, sob o controlo do promotor TR2' indutivel na ferida (pTR2'-crylAb) foi desde baixa a indetectável.
Quadro 2. Expressão da proteína CrylAb em diferentes tecidos de plantas transformadas com o gene de CrylAb
CrylAb em % de proteína solúvel/ proteína total Ocorrência Estrutura 5 plantas folhas da fase precoce V 5 plantas Rl/folha 3 plantas pólen 5 plantas R4-5/folha 5 plantas R4- 5/semente CE048-2602 p35S-crylAb 0,186 (0,066) 0,54 (0,38) 0 0,41(0,17) 0, 048 (0, 039) CE104-0202 pGos-cab- crylAb 0, 014 (0,0055) 0, 036 (0,015) CE1014-0402 pGos-cab- crylAb 0, 032 (0, 016) 0, 041 (0,011) CE122-0806 pGos-cab- 0,024(0,015) 0,10 (0,013) 0 0,058(0,036 0(0) 18 crylAb ) CE2162-0402 pGos-gos- crylAb 1,27(0,82) CE2168-0202 pGos-gos- crylAb 0, 467(0,23) CE2168-1218 pGos-gos- crylAb 0,26 (0, 026) CE21612- 1402 pGos-gos- crylAb 0,158(0,067) 0,256 (0, 106) 0 0,153(0,023 ) 0,017(0,0 06) CE21614- 0604 pGos-gos- crylAb 0,682(0,50) CE21614- 0816 pGos-gos- crylAb 0,327(0,27) 0, 925 (0,198), 1 planta 0, 06 0, 036 (0,0115) 0, 44(0,078) 0,0417(0, 021) CP21614- 1606 pGos-gos- crylAb 0, 38(0, 153) WI600-0218 pTR2-crylAb 0 0 0 0 0,002 WI600-0802 pTR2-crylAb 0 0 0 0,0048(0,00 16) 0,01
Num estudo feito em estufa, determinou-se a expressão da proteina CrylAb modificada em amostras de folhas de plantas no estádio V3 e, quando disponíveis, folhas e pólen de plantas no estádio Rl e folhas, caules e pólen de plantas na colheita, para ocorrências obtidas com as diferentes estruturas. Novamente, as plantas com as estruturas de pGos-gos-crylAb mostraram uma elevada expressão de CrylAb nas folhas (> 0,2 % da proteína solúvel total) (independentemente do processo de transformação utilizado). Para estas plantas, encontraram-se também elevados níveis de expressão nos caules (em média, 0,8 % ou mais de proteína solúvel total). As ocorrências obtidas a partir da transformação com as estruturas de pTR2'-crylAb exibiram uma expressão baixa (em média, 0,02 % ou menos de proteína solúvel total) ou indetectável da proteína CrylAb em todos os tecidos ensaiados. c) Expressão indutível de CrylAb
Para as ocorrências obtidas com a estrutura de pTR2'-crylAb, realizaram-se estudos em estufas para determinar a 19 expressão da proteína CrylAb após danos mecânicos. Colheram-se amostras de folhas por meio de corte e, 18h após o corte mecânico, mediram-se os níveis da proteína CrylAb por meio de ELISA (quadro 3) . As partes das folhas danificadas foram cortadas e incubadas durante 18 horas num prato de Petri em papel de filtro com meio de Murashige e Skoog (MS) (Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) e Blackwell Scientific Publications, RU) à temperatura ambiente e depois mediu-se o nível de proteína CrylAb utilizando um ensaio por ELISA em sanduíche. As partes de controlo das folhas não cortadas (de dimensão similar às partes das folhas cortadas) foram retiradas das plantas e postas imediatamente em gelo anidro para a análise das proteínas.
Quadro 3: Expressão da proteína insecticida em diferentes partes da planta antes e depois do ferimento mecânico
CrylAb em % de proteína solúvel/ proteína total Estádio V4 Florescimento Colheita Ocorrência Folha Folha Folha Folha raiz Raiz Pólen Fo- Cau- Semen- (estrutura) induzida induzi induzid lha le te da a WI600-0218 Média 0, 000 0, 020 0,000 0, 020 0, 023 0,036 0, 000 0, 000 0,000 0, 000 (pTR2'-CrylAb) desv. 0,000 0, 008 0,000 0, 007 0, 008 0,011 0, 000 0,000 0,000 0, 000 pad. WI606—0406 Média 0, 005 0, 046 0,000 0, 007 0, 012 0,008 0, 000 \ 0,002 0, 002 (pTR2'-CrylAb) desv. 0,007 0, 005 0,000 0, 006 0, 009 0, 009 0, 000 0,004 pad. WI604-1602 Média 0, 002 0,104 0,001 0, 020 0, 020 0,024 0, 000 0,004 0,004 0, 001 (pTR2'-CrylAb) desv. 0,003 0, 012 0,000 0, 009 0, 008 0, 008 0, 000 0, 002 0, 003 0, 000 pad. WI606-0802 Média 0,003 0, 064 0,001 0,010 0, 027 0,037 0, 000 0,002 0,004 0, 003 (pTR2'-CrylAb) desv. 0, 004 0,000 0, 009 0, 012 0, 020 0, 000 0,001 0,003 0, 001 pad. WI606-1206 Média 0,001 0, 081 0,000 0,022 0, 032 0,024 0, 000 0,004 0,002 0, 001 (pTR2'-CrylAb) desv. 0, 016 0,000 0,010 0, 005 0, 011 0, 000 0,003 0,001 0, 001 pad. CE048-2402 Média 0,83 0,614 0,280 0,397 0,196 0,253 0, 000 0,376 1,120 0, 047 (p35S-CrylAb) desv. 0,108 0,111 0, 027 0,133 0,083 0, 000 0,098 0,175 0,014 20
CrylAb em % de proteína solúvel/ proteína total Estádio V4 Florescimento Colheita Ocorrência Folha Folha Folha Folha raiz Raiz Pólen Fo- Cau- Semen- (estrutura) induzida induzi induzid lha le te da a pad. CE048-2602 Média 0,636 0,527 0,007 0, 006 0, 087 0,045 0, 000 0, 106 0, 040 0,015 (p35S-CrylAb) desv. 0,16 0, 046 0,002 0, 002 0, 044 0, 007 0, 000 0,011 0,013 0, 004 pad. Control 1 Média 0, 000 0, 000 0 0 0 0 0 0 0,001 0 (não desv. 0,000 0, 000 0 0 0 0 0 0 0,002 0 transformada) pad. Control 2 Média 0,000 0,000 0 0 0 0 0 0 0 0 (não desv. 0,000 0,000 0 0 0 0 0 0 0 0 transformada) pad. CE0104-0202 Média 0, 022 0,023 0,008 0,017 0,023 0,016 0,0001 \ \ \ (pGos/cab- desv. 0,009 0,005 0,005 0,004 0,012 0, 005 0,000 CrylAb) pad. CE1014-0402 Média 0, 025 0,017 0,007 0,010 0,028 0,034 0,000 0,010 0,040 0, 002 (pGos/cab- desv. 0,005 0,003 0,001 0,003 0,017 0, 013 0,000 0,003 0,020 0,001 CrylAb) pad. A expressão da proteína CrylAb ou estava ausente ou próxima dos limites de detecção nas folhas, caules e sementes nas diferentes ocorrências de pTR2' ensaiadas. Não se verificou nenhuma expressão acima dos níveis de base (tal como se verificou nas plantas de controlo não transformadas) nas folhas e no pólen nas florescência e no pólen no estádio de desfolha das plantas. Verificou-se a expressão constitutiva nas raízes. Quando as folhas são mecanicamente danificadas, a expressão da proteína CrylAb modificada é induzida e sobe até 0,02-0,1 % em folhas no estádio V4.
d) Eficácia de BME
Realizaram-se, em estufa, ensaios para avaliar a eficácia da BME e em dois locais diferentes no campo. Ao mesmo tempo, avaliaram-se as plantas quanto aos efeitos de fitotoxicidade das estruturas introduzidas. O quadro 4 mostra os resultados da eficácia ensaiada para BME. Na 21 estufa, determina-se a eficácia de BME medindo o comprimento dos túneis em cm por caule para 10 plantas e expressa-se como o comprimento médio (dp entre parêntesis) de túneis por número máximo de túneis por planta. No campo, a eficácia de BME é expressa como a média de 3 valores obtidos para diferentes grupos de 10 plantas.
Quadro 4. Ensaios de eficácia de BME em estufa e em diferentes localizações no campo
Eficácia de BME em estufa Eficácia de BME no campo 1 Eficácia de BME no campo 2 p35S-crylAb CE024-1301 1,2(1,47)/2 0,4(0,53)/4 0,05(0,07)/1 PGos-cab-crylAb CE050-0802 0(0)/0 0(0)/0 0 (0)/14 CE052-0101 0,6(0,84)/2 0,37(0,43)/3 0,17(0,23)/2 CE052-0205 1,6(2,4)/6 0,08(0,072)/1 0,05(0,07)/1 CE053-0605 0,4(0,69)/2 0, 113 (0,1)/1 0,09(0,085)/1 0,047(0,08)/1 0(0)/0 CE053-0702 0,6(0,96)/2 0,4(0,53)/5 0,055(0,097)1 CE057-0201 0,21(0,26)/1 0,2(0,35)/6 CE060-0402 0,7(1,64)/5 0,91(0,44)4 0,4(0,692)/3 CE061-0301 0,7(1,16)3 0,22(0,39)/4 0,0625(0,088)/ 1 CE061-1102 2,7(1,76)/5 1 CE061-1402 2,8(4,52)/8 0,22(0,47)/2 CE061-1502 1,7(0,97)/(3) 0,08(0,14)/1 0(0)/0 CE062-0201 0(0)/0 0(0)/0 CE067-0401 0(0)/0 0,205(0,113)1 CE068-0903 0,07(0,11)/2 0,04(0,0072)/1 pGos-gos-CrylAb CE180-0303 0(0)/0 0(0)/0 0(0)/0 CE181-0201 0,1(0,32)/1 0,36(0,34)/2 0(0)/0 CE182-0101 0(0)/0 0,07(0,1)/0 CE183-0501 0(0)/0 00,056(0,08)/1 CE183-0601 1 0(0)/0 22
Eficácia de BME em estufa Eficácia de BME no campo 1 Eficácia de BME no campo 2 CE184-0101 0,7(1,06)/3 0,51(0,35)/2 0(0)/0 CE184-0609 0(0)/0 0(0)/0 CE184-0801 0,11(0,33)/1 0(0)/0 0(0)/0 CE186-0203 0(0)/0 0,037(0,064)/1 CE187-0302 0,08(0,14)/2 0(0)/0 CE187-0408 0,1(0,32)/1 0(0)/0 0, 11(0,19) 1 CE187-0803 0,096 (0, 17)/1 0,097(0, 16) 1 CE193-1002 0,15(0,17)/1 0,33(0,58)/4 CE196-0201 0,4(1,26)/0 0(0)/0 0, 144(0,14) 1 CE197-0102 0(0)/0 CE198-0401 0,9(1,28)/3 0,09(0,08)/1 0(0)/0 CE198-0802 0(0)/0 0,17(0,21)/3 0,03(0,057)/1 CE198-1401 0(0)/0 0,047(0,0082)/1 0(0)/0 CE198-1702 0,1(0,32)/1 0,55(0,74)/4 0(0)/0 CE198-2101 0,1(0,32)/1 0(0)/0 0,085 (0, 12) 1 CE198-2501 0(0)/0 0(0)/0 0(0)/0 PUbi-crylAb ACE054-00103 158,8(32,3)/200 19,0(1,4)30 ACE054-01502 166,2(31,2)/235 20,7(0,98)/27 ACE054-02803 114,5(92,1)/270 22,4(2,9)/42 B73 controlo 150,6(40,3)/211 25,7(4,8)/39 27,6(7,4)/62 A ocorrência de p35S-crylAb deu um controlo absoluto de BME, tanto nos ensaios em estufa como nos ensaios no campo em localizações diferentes o que está correlacionado com a expressão em doses elevadas (tal como descrito antes). Do mesmo modo, a ocorrência de pGos-gos-crylAb e de PGos-cab-crylAb desencadeia um bom controlo de BME em todas as localizações em que se fez ensaios. A ocorrência de pUbi-crylAb não revelou um bom controlo de BME. Não se observou nenhuma fitotoxicidade para nenhuma das ocorrências de p35S-crylAb ou pGos-cab-crylAb. As ocorrências de pGos-gos-crylAb das auto-sementeiras mostraram segregação no campo de plantas verdes normais e 23 plantas raquíticas amareladas, nas quais as folhas mais pequenas estão a morrer, o que sugere algum impacto no rendimento agronómico.
Avaliaram-se catorze ocorrências obtidas com a estrutura de crylAb de pTR2' quanto à eficácia de BME nos ensaios em estufa e no campo (quadro 5) . Quatro das cinco únicas ocorrências de cópia (indicadas com um asterisco) deram o controlo total de BME2.
Quadro 5: Eficácia de BME em estufa e no campo para ocorrências de cryl Ab de pTR2'
Eficácia de BME Eficácia de BME Eficácia de BME Estufa Campo Campo Média(dp)/max Média(dp)/max Média(dp)/max Ocorrência túneis/pl túneis/pl túneis/pl WI602-0402 0,1 (0,31)/1 0,24(0,41)/2 0,21(0,01)/2 WI604-1602 0,2 (0,42)/1 0, 05 (0,071)/1 WI606 — 0406* 51,3(73,5)/195 8,41(1,8)/32 7,45(0,07)/30 WI606-0802 3,3(2,6)/8 0(0)/0 0,05(0,07)/1 WI606-1206 0, 38 (0, 74)/2 0,17(0,29)/3 0,1(0,14)/1 WI600-0218 2,0(1,87)/6 WI600-1402* 29,4(45,8)/142 6, 55 (2, 47)/28 WI602-0202* 168,5(26,9)/200 12,6(3,8)/31 WI604-0604* 102,5(83)/251 3, 7(2,0)/25 WI602-0802 0 (0)/0 0,33(0,15)/3 WI602-0204 66(68,2)/160 WI602-1002 102,4(63,4)/215 WI606-0602 45,5(52,8)/160 WI600-0802 0,9(1,44)/4 0,06(0,11)/2 0(0)/0 B73 control 150,6(40,3)/211 25,7 (4,8)/39 27,6(7,4)/62 Não se observou nenhum atraso no desenvolvimento agronómico nas plantas depois da segunda autofecundação 24 (sementeira em fileira) das diferentes ocorrências de TR2' em nenhum dos locais onde se fez o ensaio. e) Eficácia contra Sesamia nonagrioides
Infestou-s, com 2 aglomerados de ovos, cinco partes de plantas de milho em florescência, com a estrutura de crylAb de TR2'. Pontuaram-se os danos causados passados 14 dias e contou-se o número de larvas. Fez-se a média da pontuação dos danos com as cinco plantas. Como controlos, infestou-se, do mesmo modo, plantas B73 não transformadas. Os resultados estão ilustrados no quadro 6.
Quadro 6. Eficácia contra Sesamia nonagrioides.
Ocorrên cia Número de larvas por planta Altura da planta em cm Cm de tunéis por planta WI600-0802 0,6 (1,3) 198 (8,4) 0 B73 Controlo 197,2(14,0) 84 (5,5) 70 (9,4)
Exemplo 3 Gene de CrylAb no algodão I. Desenvolvimento de ocorrências de CrylAb no algodão
Preparou-se uma estrutura para a expressão do gene de crylAb modificado no algodão. A estrutura de pTSVH0203 contém a sequência de codificação de crylAb (codificando parte da proteína CrylAbõ descrita por Hofte et al.1986 com uma inserção de um codão de alanina (GCT) 3' do codão de início de ATG) sob o controlo dos promotores constitutivos 35S (Odell et al. 1985), ligado à sequência líder do gene El de tapetum de Oryza sativa (WO 92/13956) com as terminações ocs de 3' (fragmento contendo sinais de poliadenilação da região 3' não traduzida do gene de octopina-sintase do ADN-TL de pTiAch5, De Greve et al., 25 1983). A estrutura compreende, adicionalmente, a sequência de codificação de bar (a sequência de codificação de fosfinotricina-acetil-transferase de Streptomyces hygroscopicus; Thompson et al., 1987) sob o controlo do promotor 35S. PTSVH0203 P35S2-GEl-crylAb53-3'ocs<>p35S3-bar-31 nos p35S-crylAb-ocs
Utilizou-se esta estrutura para a transformação do algodão. As ocorrências obtidas foram submetidas a análise molecular para confirmar a presença do transgene. II. Análise de ocorrências a) Expressão da proteína CrylAb modificada A expressão da proteína CrylAb modificada foi determinada nas folhas, em amostras de terminais, nós, flores e casulos utilizando ELISA (quadro 7). Os resultados representam a percentagem da proteína CrylAb em relação ao teor total de proteína como uma média das amostras retiradas de 9 plantas. 0 momento em que as amostras foram recolhidas é representado por dias depois da plantação (entre parêntesis).
Quadro 7. Expressão de CrylAb medida por ELISA em diferentes tecidos ELISA, expressão de CrylAb em %, 9 plantas Ocorrências Folha (60) Folha (65- 80) Folha (115- 120) Folha terminal (60) Folha terminal (65-80) Folha terminal (115-120) Peda ços (60) Flores (65- 80) Casulos (115- 120) COCE040-04702A 0, 024 0,008 0,005 0,005 0,012 0,006 0,002 0,003 0 COCE040-04702B 0,011 COCE040-3106- 1143 0,017 0,022 0,012 0, 015 0,011 0,007 0, 003 26 COCE040-3106- 0,018 1144 b) ensaio laboratorial da toxicidade
As larvas de LGA foram alimentadas em nós, folhas e terminais obtidos de folhas no campo. Mediu-se o peso das larvas que sobreviveram para as diferentes ocorrências (quadro 8). Como controlo, utilizaram-se amostras de duas plantas não transgénicas e de uma planta que compreende um gene de resistência a herbicidas (ocorrência LL25).
Quadro 8. Toxicidade de CrylAb modificada expressa no algodão para as larvas de LGA
Peso em mg das larvas que sobreviveram Ocorrência Nós Terminais Folha 5 2, 8 0 8,7 8 (- controlo LL25) 22,3 1,7 15,5 11 0 0 18 13 4,3 1 20,6 16 6 0,3 23 21 (- controlo não transgénico) 16, 5 8,7 26,3 23 (- controlo não transgénico) 8, 2 38, 5 29 c) Eficácia do controlo de insectos no campo
No campo, as plantas foram artificialmente infestadas com larvas de LGA recém-nascidas. Pontuaram-se os danos nas folhas, nos nós, nos botões, nas flores e pétalas e fizeram-se as contagens de 8 em 8 dias em Agosto e
Setembro. Fez-se uma média em relação aos dados de cinco observações. A análise estatística indicou que se 27 encontraram diferenças significativas na severidade média dos danos de nós, flores e pétalas. Também o número médio de botões danificados e pétalas danificadas foi mais elevado para os controlos do que para as ocorrências de CrylAb; o número médio de larvas nos botões foi também significativamente reduzido comparado com os controlos.
Exemplo 4 Gene de CrylAb no arroz
Preparou-se uma estrutura para a expressão do gene de crylAb modificado no algodão. A estrutura contém as sequências de codificação de crylAb modificada (codificando parte da proteína CrylAbõ descrita por Hõfte et al.1986 com uma inserção do um codão de alanina (GCT) 3' do codão de inicio ATG) sob o controlo do promotor com a sequência lider de 5' do gene de G0S2 do arroz, contendo um segundo exão, o primeiro intrão e o primeiro exão do transcripto de GOS (de Pater et al., 1992). Utilizou-se esta estrutura para a transformação do algodão. As ocorrências obtidas foram submetidas a análise molecular para confirmar a presença do transgene.
Ensaiaram-se plantas de 25 ocorrências diferentes para o controlo do enrolador de folha do arroz, pirai do tronco amarelo e pirai do tronco cor-de-rosa por meio da contagem do número de larvas sobreviventes. Avaliou-se os danos causados nas plantas como danos nas folhas (para o enrolador de folhas) ou o número de "deadhearts" por número de rebentos no estádio de pré-florescência (pirai do tronco amarelo e pirai do tronco cor-de-rosa) ou o número de picões por número de rebentos no estádio de florescência (pirai do tronco amarelo). Apenas em 2 ocorrências se encontraram plantas nas quais algumas das larvas (5-7 em 28 25) sobreviveram. Todas as plantas de todas as outras ocorrências exibiram 90-100 % de larvas mortas. Embora as plantas de controlo estivessem ou completamente secas ou mostrassem muitas folhas dobradas quando infestadas com enrolador de folhas de arroz, nenhuma das plantas das ocorrências de crylAb mostrou nenhum dano significativo. Do mesmo modo, não se detectaram folhas jovens mortas ou picões para as plantas das ocorrências de crylAb, infestadas com pirai do tronco amarelo e pirai do tronco cor-de-rosa. 29
Referências
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Lisboa, 10 de Novembro de 2009. 31
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ADN caracterizada por compreender uma região de codificação que codifica uma proteína CrylAb modificada compreendendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 2.
- 2. Gene quimérico caracterizado pelo facto de compreender a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 sob o controlo de um promotor que se pode expressar numa planta.
- 3. Vector recombinante caracterizado pelo facto de compreender o gene quimérico de acordo com a reivindicação 2.
- 4. Célula de planta transgénica caracterizada pelo facto de compreender o gene quimérico de acordo com a reivindicação 2.
- 5. Planta transgénica caracterizada pelo facto de compreender a célula de acordo com a reivindicação 4.
- 6. Planta transgénica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de se seleccionar entre milho, algodão ou arroz.
- 7. Semente de uma planta, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de compreender a sequência de ADN da SEQ ID NO: 2.
- 8. Processo para a protecção de uma planta de pragas de insectos lepidópteros, caracterizado pelo facto de 1 compreender a introdução, por transformação na planta, do gene quimérico De acordo com a reivindicação 2.
- 9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de as referidas pragas de insectos se seleccionarem no grupo de broca do milho europeu, Sesamia nonagrioides, lagarta dos casulos do algodão, larva da traça do tabaco, pirai do tronco amarelo, pirai do tronco cor-de-rosa e enrolador de folha do arroz. Lisboa, 10 de Novembro de 2009. 2
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