MXPA04010770A - Plantas resistentes a insectos y metodos para obtener las mismas. - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ADN que codifica una proteina cryIAb modificada que presenta actividad insecticida; la invencion se relaciona ademas con un metodo para producir plantas resistentes a insectos que com0rende la introduccion en el genoma de las plantas de un ADN extrano que comprende dicha secuencia de codificacion cryIAb modificada; la invencion se relaciona ademas con plantas o partes de las mismas que comprenden en su genoma la secuencia de codificacion cryIAb modificada de la presente invencion.

Description

PLANTAS RESISTENTES A INSECTOS Y METODOS PARA OBTENER LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una secuencia de ADN que codifica una proteína cryIAb modificada que presenta actividad insecticida. La invención se relaciona además con un método para producir plantas resistentes a insectos que comprende la introducción en el genoma de las plantas de un ADN extraño que comprende dicha secuencia de codificación cryIAb modificada. La invención se relaciona además con plantas o partes de las mismas que comprenden en su genoma la secuencia de codificación cryIAb modificada de la presente invención.

La bacteria de la tierra Gram-positiva, Bacillus thuringiensis, es bien conocida por su producción de proteínas o delta-endotoxinas, que son tóxicas para una gran variedad de larvas de lepidópteros, coleópteros y dípteros. Se ha demostrado que diferentes cepas de B. thuringiensis producen diferentes proteínas cristalinas insecticidas, que son específicamente tóxicas para determinadas especies de insectos (revisado por Hófte y Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998).

La toxicidad específica de las toxinas insecticidas producidas por 8. thuringiensis para los insectos de interés y su falta de toxicidad para las plantas y otros organismos ha permitido elaborar composiciones que comprenden diferentes cepas de Bt que constituyen el producto de elección para el control biológico de las plagas de insectos para la agricultura. Se han clonado varios de los genes que codifican las proteínas cristalinas y se ha determinado asimismo las secuencias de ADN de los mismos (Hófte y Whiteley, 1989; Crickmore et al., 1995). Esto ha llevado a la manipulación de genes codificadores de delta-endotoxinas modificadas y al desarrollo de plantas que expresan estos genes de delta-endotoxinas para volverlas resistentes a insectos. La familia de genes cryl codifican las proteínas cristalinas Cry1 , que son primariamente activas contra las plagas de lepidópteros. La forma pro-toxina de las delta-endotoxinas Cry1 consiste de una parte protoxina C- terminal que no es tóxica y que se considera importante para la formación de ' crista les -(Arvidsón^et al. 1989). La mitad amino de la protoxina .comprende el segmento activo de la toxina de la proteína Cry1. Se han identificado además diferentes dominios en la toxina activa que están comprometidos en diferentes aspectos del efecto de toxicidad (Grochulski et al., 1995). Sin embargo, estas funciones parecen depender de la delta-endotoxina examinada. Se han invertido esfuerzos significativos para modificar los genes cryl con el fin de aumentar los niveles de expresión en plantas reteniendo al menos su toxicidad para los insectos de interés. La modificación de los genes cryIAb y cryIAc para eliminar las señales de poliadenilación y los motivos de inestabilidad vegetales putativos(sin alterar las secuencias de aminoácidos codificadas) ha dado como resultado una mayor resistencia de las plantas transformadas que contienen estas secuencias (van der Salm et al., 1994). 5 Las modificaciones del gen cryIAb se describen en la Patente de EEUU N° 6,320,100, la Patente de EEUU N° 6,180,774 y la Patente de EEUU N° 6,1 14,608. En la Patente de EEUU N° 5,500,365 se describe cómo la modificación en la región 240 de la región de codificación de un gen cryIAb para eliminar las señales vegetales putativas es de significativa importancia 10 para incrementar los niveles de expresión y de esa toxicidad de la toxina Cry en plantas. La presente invención se relaciona con una nueva proteína CryIAb modificada y con las secuencias de ADN codificadoras de esta proteína que se pueden utilizar para manipular la resistencia a insectos en 15 plantas. Más particularmente, se encontró que esta secuencia modificada, a - - ·· pesar - de " contener " la región 240 nativa, asegura una expresión suficientemente alta en células vegetales como para conferir resistencia a insectos a la planta o tejido vegetal en la cual se expresa. 20 BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una secuencia de codificación cryIAb modificada, que codifica la proteína cryIAb modificada de la SEQ ID N° 1 , que es una proteína insecticida. De acuerdo con una realización particular de la invención, la secuencia de ADN que codifica la secuencia cryIAb modificada corresponde a la secuencia de la SEQ ID N° 2, o comprende la secuencia de la SEQ ID N° 2. La invención se relaciona además con genes quiméricos que comprenden la secuencia de ADN cryIAb modificada de la presente invención bajo el control de un promotor que se puede expresar en plantas. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el promotor que se puede expresar en plantas es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejidos o un promotor inducible por lesiones o un promotor que asegura la expresión de la proteína cryIAb modificada al menos en las células o tejidos de una planta que es susceptible al ataque de insectos. La invención se relaciona además con vectores recombinantes que comprenden los genes quiméricos de la invención y con la producción de plantas transgénicas que emplean vectores recombinantes. ; ~ ' ~ r ^Lá iñvención se relaciona además con plantas y células, semillas o tejidos de las mimas, que comprenden en su genoma un ADN extraño que comprende la secuencia de ADN cryIAb modificada de la presente invención bajo el control de un promotor que se puede expresar en plantas. La invención también se relaciona con un método para manipular la resistencia a insectos en plantas, que comprende la introducción, en el genoma de la planta, de un ADN extraño que comprende la secuencia de codificación cryIAb modificada de la presente invención bajo el control de un promotor que se puede expresar en plantas. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la secuencia de codificación cryIAb modificada es particularmente adecuada para manipular resistencia a insectos en cultivos de agricultura, tal como maíz y algodón. Más particularmente, la expresión de la proteína cryIAb modificada confiere resistencia a las plagas de lepidópteros de estas plantas. Más particularmente, estas plagas incluyen, por ejemplo, las grandes plagas de lepidópteros de maíz, algodón y arroz, tal como Ostrinia nubilalis (barrenador europeo del maíz o ECB), Sesamia nonagrioides (barrenador del tallo del mediterráneo), Sesamia inferens (barrenador púrpura), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca del maíz, gusano de la cápsula del algodón), Helicoverpa armígera (gusano de la cápsula americana), Heliothis virescens (oruga del tabaco), Scirpophaga incertulas (barrenador amarillo), y Cnaphalocrocis medinalis (gusano envainador de arroz).

- --- - — - DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIO El término "gen", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier secuencia de ADN que comprende varios fragmentos de ADN ligados operativamente, tal como una región promotora, una región no traducida 5' (la 5'UTR), una región de codificación y una región no traducida 3' (3'UTR) que comprende un sitio de poliadenilación. El gen puede incluir fragmentos de ADN adicionales tal como, por ejemplo, intrones. Aunque se requiere un promotor y una región de codificación en el gen usado para la transformación vegetal en la presente invención, no es necesario que dicho gen transferido contenga una 3' UTR que comprende un sitio de poliadenilación, sino que se puede recuperar de las secuencias de ADN vegetales ubicadas 5' después de 5 la inserción del gen que no contiene una 3' UTR con un sitio de poliadenilación. . El término "quimérico" con referencia a un gen o a una secuencia de ADN se utiliza para se refiere al hecho que el gen o la secuencia de ADN comprende al menos dos fragmentos de ADN funcionalmente importantes (tal 0 como un promotor, una 5'UTR, una región de codificación, una 3'UTR, un intrón) que no están asociadas naturalmente entre sí y/o que son originarias, por ejemplo, de fuentes diferentes. El término "extraño" con referencia a un gen o a una secuencia de ADN con respecto a la especie vegetal se utiliza para indicar que el gen o la secuencia de ADN no se encuentra naturalmente 5 en dicha planta o que no se encuentra naturalmente en dicho locus genético - — en la;planta. Ertérmino ''ADѾxtráñó" se usará en este documento para hacer- referencia a una secuencia de ADN que se ha incorporado en el genoma de la planta como resultado de la transformación. El genoma de una planta, un tejido vegetal o una célula vegetal, 0 tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier material genético en la planta, el tejido vegetal o la célula vegetal, e incluye el genoma nuclear y de plástidos y mitocondrial. Un "fragmento" o "truncamiento" de una molécula de ADN o secuencia proteica, tal como se utiliza aquí, se refiere a una porción de la secuencia de ADN o proteica original (de ácido nucleico o aminoácidos) a la que se hace referencia o una versión sintética de la misma (tal como una secuencia adaptada para una expresión óptima en plantas), que puede variar en cuanto a longitud pero que es suficiente para asegurar que la proteína (codificada) es una toxina de insecto. Una "variante" de una secuencia se usa en este documento para indicar una molécula de ADN o una proteína cuya secuencia (nucleica o de aminoácidos) es esencialmente idéntica a la secuencia a la cual hace referencia el término. Las secuencias son "esencialmente idénticas" cuando al alinear dos secuencias, el porcentaje de identidad de secuencia, es decir la cantidad de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividida por la cantidad de nucleótidos o aminoácidos de la más corta de las secuencias.es mayor que un 70%, preferentemente mayor que un 85%, más preferentemente mayor que un 90%,en especial mayor que un 95%, más preferentemente entre un 96 y 100% La alinéa'ciórfde lasados secuencias de nucleótidos se hace utilizando el ~ algoritmo descripto por Wilbur y Lipmann(1983) usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos.una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una restricción para la falta de coincidencia de 4. Un 'promotor que se puede expresar en plantas', tal como se utiliza aquí, se refiere a un promotor que asegura la expresión de una secuencia de codificación a la cual está ligado en la célula vegetal. Los ejemplos de dichos promotores son bien conocidos en el arte. El promotor que se puede expresar en plantas puede ser un promotor constitutivo. Los ejemplos de promotores que dirigen una expresión constitutiva en plantas son conocidos en el arte e incluyen el 35S promotor del virus en mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintetasa (NOS), el promotor ubi 5 (Christensen et al. 1992), el promotor del gen GOS2 de arroz (de Pater et al., 1992). Como alternativa, el promotor que se puede expresar en plantas puede ser un promotor específico de tejidos, es decir, un promotor que dirige un nivel de expresión más alto de la secuencia de codificación (medido mediante ensayos de ARN convencional) en algunos tejidos de la planta, por ejemplo en 10 los tejidos verdes (tal como el promotor de la PEP carboxilasa), que en otros tejidos de la planta. Como alternativa, el promotor que se puede expresar en plantas puede ser un promotor ¡nducible por lesiones. Un promotor 'inducible por lesiones' o un promotor que dirige un patrón de expresión que es inducible por lesiones, tal como se utiliza aquí, significa que después de lesionar la 15 planta, ya sea mecánicamente o por ingesta de alimentos por insectos, secuencia de codificación bajo el control del promotor. Los ejemplos de promotores inducibles por lesiones incluyen el gen del inhibidor de proteinasa de papa y tomate (pin1 y pin2) (Johnson et al., 1989) y el promotor del gen del inhibidor de proteinasa (MPI) 20 de maíz (Cordero et al. 1994). Un "promotor TR2'", tal como se utiliza aquí se relaciona con cualquier promotor que comprende la parte funcional TR2' (o manopina sintetasa, abreviada como mas) del elemento promotor doble TR1 '-TR2' de Agrobacteríum (Velten et al. 1984; Langridge et al. 1989). Entonces, esto puede comprender el elemento TR21 ya sea solo o en combinación con todo o una parte del elemento divergente TR1 ' (Guevara-García et al., 1998) u otros elementos (reguladores), incluyendo por ejemplo regiones potenciadoras, intrones y semejantes, en tanto se retenga sustancial mente la característica de inducción por lesiones en monocotiledóneas, en particular en maíz, acorde con la presente invención. En una realización preferida de esta invención, la transcripción es dirigida desde la región promotora TR2' (y la secuencia de codificación se encuentra entonces 3' con respecto a la secuencia promotora TR2'), aún si se usa el promotor doble TR1 '-TR2' (o cualquier parte del mismo que retenga el elemento promotor TR2'). El término de 'insecticida' se usa en este documento significa que es tóxico para los insectos que son plagas de cultivos. Más particularmente, en el contexto de la presente invención, los insectos de interés son las plagas tal como, por ejemplo, las principales plagas de lepidópteros;; tal como 'Ostriniá nubilalis (barrenador de maíz europeo o ECB),~ Sesamia nonagrioides (barrenador de tallo del mediterráneo), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca del maíz, gusano de la cápsula de algodón), Helicoverpa armígera (gusano de la cápsula americano) y Heliothis virescens (oruga del tabaco). En una realización preferida de la presente invención, el ADN que codifica una proteína insecticida cristalina (ICP) es una secuencia de ADN cryIAb modificada que codifica una ICP que es una proteína cry Ab modificada. De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de codificación cryIAb modificada codifica la proteína cry Ab modificada correspondiente a la secuencia de la SEQ ID N° 1. De acuerdo con otra realización preferida de la invención, la secuencia de codificación cryIAb 5 modificada corresponde a la secuencia de la SEQ ID N° 2. La secuencia de ADN usada para la transformación de plantas, en particular de maíz, algodón o arroz, acorde con la presente invención, también puede comprender otros elementos además de la región de codificación que codifica la proteína cryIAb modificada de la invención, tal como una región de codificación que codifica 10 un péptido de tránsito, una región de codificación que codifica una proteína marcadora seleccionare o una proteína que confiere resistencia a un herbicida. En una realización preferida de la invención, la proteína cryIAb modificada es tóxica para las principales plagas de lepidópteros de los 15 cultivos, tal como de maíz, algodón y arroz. Las plantas de la presente_ - - -—-invención, que comprenden en su genoma un ADN extraño que comprende un ADN codificadora de una proteína cryIAb modificada están protegidas contra estas plagas, por expresión de una cantidad controladora de esta proteína. El término controladora significa que es una cantidad tóxica (letal) o combativa 20 (subletal). Al mismo tiempo, las plantas deberían ser morfológicamente normales y se pueden cultivar de la manera habitual para el consumo y/o la producción de productos. Aún más, dichas plantas deben evitar sustancialmente la necesidad de insecticidas químicos o biológicos (para los insectos afectados por la proteína cryIAb modificada). El nivel de expresión de una ICP en un material vegetal puede ser determinado de diversas maneras que se describen en el arte, tal como por cuantificación del ARNm que codifica la proteína insecticida producida en 5 el tejido usando cebadores específicos (tal como describen Cornelissen & Vandewiele, 1989) o por detección directa específica de la cantidad de proteína insecticida producida, por ejemplo, mediante métodos de detección inmunológicos. Más particularmente, de acuerdo con la presente invención el nivel de expresión de una proteína cryIAb modificada está representada como 10 el porcentaje de proteína insecticida soluble determinado por un ELISA inmunoespecífico, que se describe en este documento, con relación a la cantidad total de proteína soluble (determinada, por ejemplo, mediante el análisis de Bradford (Bradford, 1976)). Un ELISA preferido en la presente invención es un ELISA de tipo sándwich (Clark et al., 1986). 15 Se pueden usar diferentes ensayos para medir el efecto - -r insecticida-o-ia- eficacia de lá~expresión de una ICP en la planta. De acuerdo con la presente invención, los insectos de interés son las principales plagas de lepidópteros de los cultivos de agricultura, tal como maíz, algodón y arroz, más particularmente el barrenador de maíz europeo (ECB) y Sesamia 20 nonagrioides (SMG) en maíz, el gusano de la cápsula del algodón (CBW) y oruga del tabaco (TBW) en algodón y el barrenador de tallos amarillo, el barrenador de tallo púrpura y el gusano envainador en arroz. Se puede evaluar la toxicidad de una ICP producida en una planta de maíz para ECB in vitro evaluando la proteína extraída de la planta en bioensayos de alimentación con larvas de ECB o por calificación de la mortalidad de larvas distribuidas sobre el material foliar de las plantas transformadas en una caja de Petri (ambos ensayos fueron descriptos por Jansens et al., 1997) o en plantas aisladas en cilindros individuales. En el campo, se evalúa la infestación por la primera progenie del barrenador de maíz europeo (ECB1 ) basado en la calificación de los danos en las hojas (Guthrie, 1989) mientras que la evaluación de la cantidad total de túneles en los tallos por planta y la longitud de los túneles en los tallos son indicativos de los daños en los tallos ocasionados por alimentación de la segunda progenie (ECB2). De manera similar se puede medir la eficacia de la ICP producida en plantas de algodón transformadas con un cryIAb modificado usando ensayos ¡n vitro y/o in vivo. La toxicidad del tejido vegetal transformado para larvas de CBW se puede medir por alimentación de las larvas CBW sobre cuadrados, hojas o terminales y evaluar el peso de las - larvas que sobreviven. En el campo, las plantas son. infestadas artificialmente con larvas neonatas de CBW y luego se evalúan los daños ocasionados en hojas, hojas terminales, cuadrados, floración blanca y cápsulas a intervalos regulares (como se describe en este documento). Se comprenderá que es posible desarrollar ensayos similares para cualquier insecto sea de interés o no, con el fin de determinar la eficacia de la ICP producida en la planta contra dicho insecto. Las plantas de la presente invención también pueden comprender, optativamente, en su genoma un gen que codifica resistencia a herbicidas. Más particularmente, el gen de resistencia a herbicidas es el gen bar o el gen pat gen, que confiere tolerancia a glufosinato en la planta, es decir las plantas son tolerantes al herbicida Liberty™. La tolerancia a Liberty™ se puede evaluar de diferentes maneras. Por ejemplo, la tolerancia se puede evaluar mediante una aplicación por rociado con Liberty™. Los tratamientos en base a rociado se deben efectuar entre las etapas V2 y V6 de la planta para obtener los mejores resultados (las etapas del maíz son las definidas en 'How a Corn Plant Develops, Informe especial N° 48, Universidad de Ciencia y Tecnología del Estado de lowa, Servicio de Extensión Cooperativa, Ames, lowa, reimpreso en junio, 1993; véase también sitio de internet en: http://www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agricultu-re/maíz/maíz_develop/CornGrowthStages.html:). Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho que el rociado de las plantas con al menos 200 gramos de ingrediente activo/hectárea (g.i.a./ha), preferentemente 400 g.i.a./ha y posiblemente hasta" 1600 g.i.a. ha (4X la dosis de campo normal), no mata las plantas. Se debería efectuar una aplicación general a una dosis de 28-34 oz de Liberty™ + 3 Ib de sulfato de amonio por acre. Es mejor aplicar un volumen de 20 galones de agua por acre usando una tobera de tipo plano con la precaución de no dirigir las aplicaciones de rociado directamente al verticilo de las plantas con el fin de evitar que el agente tensioactivo queme las hojas. El efecto herbicida debe aparecer dentro de las 48 horas y debe ser claramente visible dentro de los 5-7 días.

Los ejemplos de otros genes de resistencia a herbicidas son los genes que codifican resistencia a fenmedifam (tal como el gen pmph, Patente de EEUU N° 5,347,047; Patente de EEUU N° 5,543,306), los genes que codifican resistencia a glifosato (tal como los genes EPSPS, Patente de EEUU 5 N° 5,510,471 ), los genes que codifican resistencia a bromoxinilo (tal como los que se describen en la Patente de EEUU N° 4,810,648), los genes que codifican resistencia a sulfonilurea (tal como los que se describen en EPA 0 360 750), los genes que codifican resistencia al herbicida dalapón (tal como los que se describen en WO 99/27 16) y los genes que codifican resistencia a 0 cianamida (tal como los que se describen en WO 98/48023 y WO 98/56238) y los genes que codifican resistencia a los inhibidores de glutamina sintetasa, tal como PPT (tal como los que se describen en EP-A-0 242 236, EP-A-0 242 246, EP-A-0 257 542). La introducción de un ADN extraño o un gen quimérico en una 5 célula vegetal se puede efectuar con los métodos convencionales de -r— transformación qué se- describen en eí arte. Dichos métodos incluyen.p.ej.-, transformación mediada por Agrobacteríum (Patente de EEUU N° 6,074,877, Hiei et al., 1997), bombardeo con microproyectiles (descripto.p.ej., por Chen et al., 1994; Casas et al., 1995; Christou, 1997, Finer et al., 1999, Vasil et al.1999), captación directa de ADN en protoplastos (descripta,p.ej.,por De Block et al.1989; Poulsen, 1996,Datta et al.,1999), electroporación (D'Halluin et al., 1992, Patente de EEUU N° 5,641 ,665; Bates, 1995) o introducción de ADN mediada por fibras de siíiconas (DunweII, 1999) u otros métodos revisados en general por Potrykus (1990), Sawahel et al. (1995), Komari et al.(1998), Bogorad (2000) y Newell (2000). Los siguientes ejemplos no limitantes describen el desarrollo de una secuencia de ADN que codifica una proteína cryIAb modificada, la construcción de genes quiméricos que comprenden esta secuencia para su expresión en plantas y plantas resistentes a insectos obtenidas con los mismos. A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos estándar que se describen en Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EEUU y en los Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda edición, Academic Press (Reino Unido). Los materiales y métodos estándar para el trabajo en biología molecular vegetal se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D.- Croy publicada "conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Los materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden consultar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera edición, Springer Verlag, Alemania. En toda la descripción y en los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias representadas en el listado de secuencias: SEQ ID N° 1 : proteína crylAb modificada SEQ ID N° 2: secuencia de ADN que codifica una proteína crylAb modificada EJEMPLOS 1. Desarrollo de un gen crylAb modificado La secuencia de ADN crylAb modificada usada en este documento codifica parte de la proteína Cry1Ab5 descripta por Hófte et al. (1986) correspondiente a los aminoácidos 1 a 616, que posee una inserción de un codón de alanina (GCT) 3' con respecto al codón de inicio ATG (AlaAsp2...Asp616). La secuencia proteica de la proteína crylAb modificada se muestra en la SEQ ID N° 1. La secuencia del ADN que codifica dicha proteína crylAb modificada se muestra en la SEQ ID N° 2. 2. Gen CrylAb en maíz I. Desarrollo de eventos CrylAb en maíz Para la transformación con Agrobacteríum de maíz, se desarrollaron construcciones en las cuales la secuencia de codificación crylAb se colocó bajo el control de diferentes promotores: el promotor 35S (Odell et al. 1985), el promotor ubi (Christensen et al. 1992), el promotor del gen G0S2 de arroz (de Pater et al., 1992) con la directriz cab22 de petunia (Harpster et al. 1988), la secuencia directriz 5' del gen GOS2 de arroz, que contiene el segundo exón, el primer intrón y el primer exón del transcripto GOS (de Pater et al., 1992) o una región promotora TR2' (Velten et al. 1984); 5 todas las construcciones incluyeron el gen 35S-bar. La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo por co-cultivo de callos de tipo I derivados de embriones inmaduros con la cepa C58C1 (pTiEHA101 )(pTTS35)(cepa C58C1 RifR de Agrobacterium curado para el pTiC58 que contiene el plásmido no oncogénico Ti, pTiEHA101 (Hood et al., 10 1986) y los plásmidos de la siguiente tabla que contiene los genes de interés ubicados entre los bordes de ADN-T). La transformación de los protoplastos se efectuó por transfeccion mediada por PEG de protoplastos preparados a partir de cultivos en suspensión derivados de embriones Pa91 xH99xHE89 Z15.EI ADN usado para 15 la transfeccion era un fragmento purificado de los plásmidos de la siguiente — ^ tabla.que contiene'ló genes cíe interés entre los bordes del ADN-T. * - ; CUADRO A Las plántulas regeneradas se seleccionaron sobre la base de la tolerancia a Liberty y/o la medición de los niveles de proteína PAT por ELISA (Clark et al, 1986).

II. Evaluación de los eventos a) caracterización general Se comprobó en los transformantes de Agrobacterium la presencia de la secuencia del vector en el borde izquierdo del ADN-T. El análisis por transferencia Southern se llevó a cabo con material foliar de transformantes primarios (TO). b) Expresión de la proteína cryIAb modificada Los eventos fueron analizados en invernadero por la expresión de CryIAb mediante detección de los niveles de proteína cryIAb modificada soluble en diferentes tejidos con un ELISA de tipo sándwich CryIAb con una fracción de IgG policondensada de un antisuero policlonal de conejo contra CryIAb como primer anticuerpo y un anticuerpo monoclonal contra CryIAb como segundo anticuerpo. Los niveles de expresión de la proteína cryIAb modificada en diferentes tejidos de verticilos tempranos de plantas transformadas con la construcción p35S-cry1Ab se muestran en la tabla 1. Se encontró que la expresión en las diferentes plantas de la progenie de un evento obtenido con el evento p35S-cry1 Ab era constitutiva y en promedio superior al 0.5%.

CUADRO 1 Expresión de CrylAb en diferentes tejidos de verticilos tempranos en plantas 5 Los niveles de expresión de la proteína CrylAb en diferentes tejidos de hojas en las etapas V temprana, R1 y R4-5, de granos en etapa R4-15 5 y en polen para plantas transformadas con las construcciones p35S-cry1Ab, ------ -'pGos-cab-c^lAb. Gós^gos-crylAb y pTR2-cry1Ab se muestran en la tabla 2.

Los resultados se expresan como los promedios de las muestras de hojas y granos tomadas de 5 plantas y como los promedios de muestras de polen tomadas de 3 plantas (desviación estándar entre comillas). La expresión de la 20 ICP para la planta p35S-cry1Ab representa más que el 0.1 % de proteínas solubles totales. Las plantas pGos-cab-cry1Ab mostraron una expresión de CrylAb de aproximadamente 0.01-0.06% en las hojas. Los eventos obtenidos con las construcciones pGos-gos-cry1Ab mostraron una gran expresión (0.2- 0.6% de proteína) en tejido foliar. La expresión basal de proteínas en las hojas de las plantas transformadas con la secuencia de ADN cryIAb modificada bajo el control del promotor TR2' inducible por lesiones (pTR2'-cry1 Ab) era baja a no detectable.

CUADRO 2 Expresión de la proteína CryIAb en diferentes tejidos de plantas transformadas con el gen CryIAb En un estudio en invernadero, la expresión de la proteína cryIAb modificada se determinó en muestras de hoja de plantas en etapa V3 y, según disponibilidad, en hojas y polen de plantas en etapa R1 , y hojas, tallos y polen de plantas en el momento de la cosecha, para los eventos obtenidos con las 5 diferentes construcciones. Nuevamente, las plantas con las construcciones pGos-gos-cry1Ab mostraron una gran expresión de CryIAb en hojas (>0.2% de las proteínas solubles totales) (independientemente del método de transformación usado). Para estas plantas, también se observaron niveles de expresión altos en tallos (en promedio 0.8% de las proteínas solubles totales o 10 más). Los eventos obtenidos de la transformación con las construcciones pTR2'-cry1Ab presentaban una expresión baja (en promedio 0.02% de las proteínas solubles totales o menos) o no detectable de proteína CryIAb en todos los tejidos evaluados. 15 c) Expresión inducible de CryIAb - . -_ — -Se llevaróñ'a 'cabo estudios para los eventos, obtenidos, con la - - construcción pTR2'-cry1Ab, en invernadero, a fin de determinar la expresión de la proteína CryIAb después de lesiones mecánicas. Se tomaron muestras de hoja antes de las lesiones y 18 hs después del daño mecánico y se 20 midieron los niveles de proteína CryIAb por ELISA (Tabla 3). Se recortaron las partes dañadas de las hojas y se incubaron durante 18 horas en una caja de Petri sobre papel de filtro humedecido con medio de Murashige y Skoog (MS) (Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicada conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido) a temperatura ambiente y luego se midió el nivel de proteína CryIAb usando un ensayo ELISA de tipo sándwich. Se recortaron partes de hojas control sin lesionar (de tamaño similar que las partes de hojas lesionadas) de las plantas y se colocaron inmediatamente sobre hielo seco para el análisis de proteínas.

CUADRO 3 Expresión de la proteína Insecticida en diferentes partes de plantas antes y después de las lesiones mecánicas La expresión de la proteína CryIAb comprendía alrededor del límite de detección o estaba ausente en hojas, tallo y granos de los diferentes eventos pTR2' evaluados. No se halló expresión superiores a los niveles básales (como los niveles en las plantas control no transformadas) en hojas y polen en plantas en la etapa de verticilo y liberación de polen. Se observó expresión constitutiva en las raíces. Cuando las hojas se lesionaban mecánicamente, se inducía la expresión de la proteína cryIAb modificada y aumentaba hasta un 0.02-0.1 % en las hojas en etapa V4. d) Eficacia ECB Las pruebas de eficacia ECB se llevaron a cabo en invernadero y en dos sitios a campo diferentes. Al mismo tiempo, las plantas fueron evaluadas por los efectos fitotóxicos de las construcciones introducidas. En la tabla 4 se muestran los resultados de eficacia para ECB. En invernadero, la eficacia ECB se determina midiendo la longitud de los túneles en cm por tallo en 10 plantas y se expresa como la longitud promedio (d.e. entre comillas) de los túneles por cantidad máxima de túneles por planta. En el campo, la eficacia ECB se expresa como el promedio de 3 valores obtenidos para los diferentes grupos de 10 plantas.

CUADRO 4 Pruebas de eficacia ECB en invernadero y en diferentes sitios en el campo El evento p35S-cry1Ab permitió obtener un control absoluto de ECB, tanto en las pruebas de invernadero como en las pruebas de campo en los distintos sitios que se correlacionaba con una dosis alta de expresión (como se describió previamente). De manera similar, los eventos pGos-gos-cryIAb y PGos-cab-cry1Ab presentaban un buen control de ECB en todos los sitios evaluados. El evento pUbi-cry1Ab no mostró un buen control de ECB. No se observó fitotoxicidad para ninguno de los eventos p35S-crylAb o pGos-cab-cry1Ab. Las semillas autocruzadas de los eventos pGos-gos-cry1Ab mostraron segregación en el campo de plantas verdes normales y en plantas marchitadas, amarillentas, en las cuales las hojas inferiores están moribundas, lo cual sugiere algún impacto sobre el rendimiento agronómico. Se evaluaron catorce eventos obtenidos con la construcción pTR2'-cry1Ab por la eficacia ECB en invernadero y en pruebas a campo (Tabla 5). Cuatro de los cinco eventos de una sola copia (indicados con un asterisco) permitió un control total de ECB2.

CUADRO 5 Eficacia de ECB en Invernadero y a campo para los eventos de pTR2'- crylAb No se observaron desventajas en cuanto al rendimiento agronómico de las plantas después de la segunda autocruza (mazorca por -fila) de-los difereñtés¾ventos TR2' en ninguno de los sitios.evaluados. d) Eficacia contra Sesamia nonagrioides Se infestaron cinco plantas de maíz en la etapa media del verticilo obtenidas con la construcción pTR2'-cry1Ab con 2 masas de huevos. Los daños fueron calificados después de 14 días y se efectuó un recuento de larvas. Se promedió el puntaje de los daños en las cinco plantas. De manera similar se infestaron plantas B73 no transformadas como controles. Los resultados se muestran en la tabla 6.

CUADRO 6 EJEMPLO 3 Gen Cry Ab en algodón I. Desarrollo de eventos Cr IAb en algodón Se obtuvo una construcción para la expresión del gen cryIAb modificado en algodón. La construcción pTSVH0203 contiene la secuencia de codificación de cryIAb modificada (que codifica parte de la proteína Cry1Ab5 descripta~ por Hófté ét al,1986,~ que contiene una inserción de un -codón de alanina (GCT) 3' con respecto al codón de inicio ATG) bajo el control de promotores constitutivos 35S (Odell et al. 1985), ligada a la secuencia directriz del gen E1 del tapetum de Oryza sativa (WO 92/13956) con el termínador 3' de oes (fragmento que contiene señales de poliadenilación de la región no traducida 3' del gen de la octopina sintetasa del ADN-TL del pTiAch5, De Greve et al., 1983). La construcción comprende además la secuencia de codificación bar (la secuencia de codificación de la fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus; Thompson et al., 1987) bajo el control del promotor 35S. PTSVH020 P35S2-G E1 -cry Ab53-3'ocs<>p35S3-bar- p35S-cry1Ab-ocs 3 3'nos Esta construcción se usó para la transformación de algodón. Los eventos obtenidos fueron sometidos a análisis molecular para confirmar la presencia del transgen.

II. Análisis de los eventos a) Expresión de la proteína crylAb modificada La expresión de la proteína crylAb modificada se determinó en muestras de hojas, hojas terminales, cuadrados, flores y cápsulas usando un ELISA (Tabla 7). Los resultados representan el porcentaje de proteína CrylAb en el contenido de proteínas totales como un promedio de las muestras se tomaron las muestras está representado como días después de la siembra (entre comillas).

CUADRO 7 Expresión de CrylAb medido por ELISA en diferentes tejidos b) Ensayo de toxicidad en laboratorio Se alimentaron larvas de CBW sobre cuadrados, hojas y hojas terminales obtenidos de hojas en el campo. Se midió el peso de las larvas sobrevivientes para los diferentes eventos (Tabla 8). Se usaron las muestras de'dos-plantas~ñb~transgénicas y de una planta que contenía un gen de resistencia a herbicidas (evento LL25) como control.

CUADRO 8 Toxicidad de cry Ab modificada expresada en algodón contra larvas de CBW 5 10 c) Eficacia del control de insectos en el campo En el campo, las plantas fueron infestadas artificialmente con larvas neonatas de CBW. Se calificaron los daños ocasionados en las hojas, hojas terminales, cuadrados, floración blanca y cápsulas y se efectuaron 15 recuentos cada 8 días en los meses de agosto y septiembre. Se calcularon las -· --- -- -•~medias::conTlos'¾atós~de "cinco observaciones. El análisis estadístico indicó que había diferencias significativas en la severidad promedio de los daños en hojas terminales, floración blancas y cápsulas. Además, el promedio de cuadrados dañados y cápsulas dañadas era mayor en los controles que para 20 los eventos CryiAb. La cantidad promedio de larvas en los cuadrados también estaba significativamente reducida en comparación con los controles.

EJEMPLO 4 Gen Cry Ab en arroz Se elaboró una construcción para la expresión del gen cryIAb 5 modificado en arroz. La construcción contiene la secuencia de codificación cryIAb modificada (que codifica parte de la proteína Cry1Ab5 descripta por Hofte et al, 1986, que contiene la inserción de un codón de alanina (GCT) 3' con respecto al codón de inicio ATG) bajo el control del promotor con la secuencia directriz 5' del gen GOS2 de arroz, que contiene el segundo exón, 0 el primer intrón y el primer exón del transcripto GOS (de Pater et al., 1992). Esta construcción se usó para la transformación de arroz. Los eventos obtenidos fueron sometidos a análisis molecular para confirmar la presencia del transgen. Se evaluaron plantas de 25 eventos diferentes por el control de 5 gusano envainador de arroz, barrenador amarillo del tallo y barrenador — --púrpura del tallo po? ¾~cu^ento "de la cantidadjde larvas que sobrevivieron. Se evaluaron los daños ocasionados en las plantas como lesiones en las hojas(por el gusano envainador) o la cantidad de daño tipo "deadhearts" (corazones muertos),por cantidad de retoños en la etapa de prefloración(barrenador amarillo del tallo y barrenador púrpura del tallo) o la cantidad de daño tipo "whiteheads" (cabezas blancas) por cantidad de retoños en la etapa de floración (barrenador amarillo del tallo). Solamente se encontraron algunas (5-7 de 25) larvas sobrevivientes en las plantas de 2 eventos. Todas las plantas de los demás eventos mostraron un 90-100% de larvas muertas. En tanto las plantas control se habían secado por completo o mostraban muchas hojas plegadas cuando eran Infestadas con el gusano envainador de arroz, ninguna de las plantas de los eventos cryIAb mostraron daño significativo alguno. De manera similar, no se detectaron daños tipo "deadhearts" o "whiteheads" en las plantas de los eventos cryIAb, infestados con el barrenador amarillo del tallo o el barrenador púrpura del tallo.

REFERENCIAS Arvidson et al., 1989, Mol Microbiol 3:1533 Bailón et al. 1987, Plant Physiol 85:1103-1 109 Bates, 1995, Methods Cell Biol. 1995;50:363-73 Bogorad 2000, Trends Biotechn 18(6):257-263 Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254 Breitler et al. 2001 , Mol Breeding 7: 259-274 Casas et al., 1995, Plant Breed Rev 13:235-264 Chen et al., 1994, Theor Appl Genet 88:187-192 Christensen et al. 1992, Plant Mol Biol 18(4):675-89 Christou, 1997, Plant Mol Biol 35(1 -2): 197-203 Clark et al., 1986, Methods Enzymol. 118:742-766. Cordero et al. 1994, Plant J 6(2):141-50. 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¦ 285 " Glu Gly Ser lie Arg Ser Pro His Leu Met Asp lie Leu Asn Ser lie 290 295 300 Thr lie Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His 305 310 315 320 Gln lie Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe 325 330 335 Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg lie Val 340 345 350 Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr 355 360 365 Arg Arg Pro Phe Asn lie Gly lie Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu 370 375 380 Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala 385 390 395 400 Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu lie Pro Pro 405 410 415 Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser 420 425 430 His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser lie 435 440 445 lie Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp lie His Arg Ser Ala Glu Phe Asn 450 455 460 Asn lie lie Pro Ser Ser Gln lie Thr Gln lie Pro Leu Thr Lys Ser 465 470 475 480 Thr Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr 485 490 495 Gly Gly_.Asp:;Ile -Leu~Arg Arg- Thr- Ser Pro Gly Gln lie Ser Thr Leu '' ' ' " 500 .505 - * 510 Arg Val Asn lie Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg 515 520 525 Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser lie Asp Gly 530 535 540 Arg Pro lie Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser 545 550 555 560 Asn Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe 565 570 575 Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe 580 585 590 Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr lie Asp Arg lie Glu Phe Val Pro Ala 595 600 605 Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp 610 615 <210> 2 <211> 1854 <212> ADN <213> Artificial: secuencia que codifica proteína modificada de Bacillus thuringiensis <400> 2 atggctgaca acaaccccaa catcaacgag tgcatcccct acaactgcct gagcaaccca 60 gaggtggagg tgctgggtgg tgagaggatc gagaccggtt acacccccat cgacatcagc 120 ctgagcctga cccagttcct gctgagcgag ttcgtgcctg gtgctggctt cgtgctggga 180 ctagtggaca tcatctgggg catcttcggt cccagccagt gggatgcctt cctggtgcag 240 atcgaacagt taattaacca aagaatagaa gaattcgcta ggaaccaagc catctctaga 300 ctggagggcc tgagcaacct gtaccagatc tacgccgaga gcttccgcga gtgggaggct 360 gaccccacca acccagccct gcgcgaggag atgcgcatcc agttcaacga catgaactct 420 gccctgacca ccgccatccc actcttcgct gtccagaact accaggtccc tctcctgtct 480 gtctatgtgc aagctgccaa--cctccatctc: ~agcgtccttc gcgacgtgag cgtctttggg J5 0 cagaggtggg ggttcgacgc tgccaccatc aacagccgct acaacgacct gacgcgtctg 600 atcggcaact acaccgacca cgcagtgaga tggtacaaca ctgggcttga gagggtctgg 660 ggtcccgaca gccgcgactg gatcaggtac aaccagttca ggcgtgaact cactctcacc 720 gtcttggata tcgtcagtct cttccccaac tacgacagca ggacctaccc tatccggact 780 gtgagccagc tgacccgcga gatctacacc aaccccgtgc tggagaactt cgacggcagc 840 ttcaggggct ctgcccaggg catcgagggc agcatccgca gcccccacct gatggacatc 900 ctgaacagca tcaccatcta cactgacgcc cacaggggtg agtactactg gtctggccac 960 cagatcatgg cttctcccgt gggcttcagc ggtcccgagt tcaccttccc cctgtacggc 1020 acaatgggca acgctgcccc acagcagagg atcgtggccc agctgggcca gggcgtgtac 1080 cgcaccctga gcagcaccct gtacaggagg cccttcaaca tcggcatcaa caaccagcag 1140 ctgagcgtgc tggatggcac cgagttcgcc tacggcacca gcagcaacct gcccagcgcc 1200 gtataccgca agagcggcac tgtggacagc ctggacgaga tcccacccca gaacaacaac 1260 gtgcccccta ggcaggggtt ctctcatcgc ctctcacacg tgagcatgtt ccgcagcggc 1320 ttcagcaaca gcagcgtgag catcatcagg gctcccatgt tcagctggat ccaccgcagc 1380 gctgagttca acaacatcat tccaagtagc cagatcactc agatcccact caccaagagc 1440 accaacctgg gctccgggac tagcgttgtc aagggaccag ggttcactgg aggcgacatc 1500 ctgaggagga ccagcccagg ccagatcagc accttaaggg tgaacatcac cgctcccctc 1560 agccaacgct acagggtcag gatcaggtac gcttccacca ccaacctgca gttccacacc 1620 agcatcgacg gcaggcccat caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc 1680 aacctgcaga gcggaagctt ccgcactgtg ggcttcacta ccccattcaa cttctccaac 1740 ggcagcagcg tgttcaccct gtctgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc 1800 gacaggatcg agtttgtccc agctgaggtg accttcgaag ctgagtacga ctga 1854

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una secuencia de ADN, caracterizada porque comprende una región de codificación que codifica una proteína cryI Ab modificada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N° 2.

2. - Un gen quimérico que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 1 , caracterizado porque se encuentra bajo el control de un promotor que se puede expresar en plantas.

3. - Un vector recombinante, caracterizado porque comprende el gen quimérico de la reivindicación 2.

4. - Una célula vegetal transgénica, caracterizada porque comprende el gen quimérico de la reivindicación 2.

5.- Una planta transgénica, caracterizada porque comprende la "célülá égetal de la reivindicación 4.

6. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque se selecciona entre maíz, algodón o arroz.

7. - Semillas de la planta de la reivindicación 6, caracterizadas porque comprenden la secuencia de ADN de la SEQ ID N° 2.

8. - Un método para proteger una planta de las plagas de insectos lepidópteros, caracterizado porque comprende la introducción en la planta del gen quimérico de la reivindicación 2.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dichas plagas de insectos son plagas de insectos lepidópteros.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dichas plagas de insectos se seleccionan del grupo formado por barrenador del maíz europeo, Sesamia nonagrioides, gusano de la cápsula de algodón, oruga del tabaco, barrenador amarillo del tallo, barrenador púrpura del tallo y el gusano envainador de arroz.