CN114096669A

CN114096669A - 编码杀虫晶体蛋白的合成核苷酸序列及其用途

Info

Publication number: CN114096669A
Application number: CN202080049970.4A
Authority: CN
Inventors: 德瓦克什·辛格·帕里哈尔; 帕雷什·维尔马
Original assignee: DCM Shriram Ltd
Current assignee: DCM Shriram Ltd
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: ZA202200189B; IL289220A; KR20220037462A; BR112022000385A2; MX2022000465A; CA3146520A1; CN114096669B; AU2020319744A1; WO2021019565A1; AU2020319744B2; US20220275031A1; AR119533A1; JP2022542008A; EP3976632A1

Abstract

本公开内容提供了编码针对害虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列。本公开内容还涉及这些序列在植物中的表达。本公开内容还提供了包含本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列的DNA构建体、载体和宿主细胞。其还提供了经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生昆虫抗性转基因植物的用途、包含所述序列的昆虫抗性转基因植物，和包含含有本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌的组合物。

Description

编码杀虫晶体蛋白的合成核苷酸序列及其用途

电子提交的序列表的引用

在2019年7月30日创建的名为“PD034766IN-SC sequence listing.txt”的文件的序列表的正式副本是本说明书的一部分，该序列表大小为11kb，与本说明书同时电子提交。

技术领域

本公开内容涉及编码针对害虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列。本公开内容还涉及这些序列在植物中的表达。

背景技术

害虫是世界农业作物损失的主要因素，并且被认为是每年破坏世界总作物产量的五分之一的原因。在人工选择适合用于人消费的作物的过程中，还选择了对昆虫侵袭(infestation)高度易感的植物，这最终降低了其经济价值并提高了生产成本。

传统上，害虫通过施加化学和/或生物农药来控制。由于与化学农药的生产和使用相关的环境危害，对使用化学农药存在某些担忧。由于这样的担忧，监管机构已禁止或限制使用一些更危险的农药。

此外，公知的事实是，作为可适应新情况的自然选择过程，害虫能够随时间进化，例如克服有毒物质的影响或者绕过天然或人工植物抗性，这进一步增加了问题。

生物农药是化学农药的环境上和商业上可接受的替代物。它比传统的广谱化学杀虫剂具有更低的污染和环境危害的风险，并提供更强的靶标特异性。

已知芽孢杆菌属(genus Bacillus)的某些微生物物种例如苏云金芽孢杆菌(B.t.)具有针对广泛的害虫的杀虫活性。杀虫活性显示出集中在伴孢晶体蛋白包涵体中，但是也已从苏云金芽孢杆菌的营养生长阶段分离出了杀虫蛋白。

苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体(cry)蛋白基因在植物中的表达是本领域已知的，然而发现天然Bt基因在植物中表达极其困难。已尝试在植物中将Bt cry蛋白基因与在植物中发挥功能的多种启动子组合表达。然而，在转基因植物中仅获得了低水平的蛋白质。

Bt cry基因在植物中表达水平低的原因之一是与其中G/C比例比A/T更高的植物基因相比，Bt DNA序列中的A/T含量高。细菌基因的A/T总值为60％至70％，并且植物基因为40％至50％。因此，cry基因密码子使用中的GC比例明显不足以在最佳水平表达。此外，A/T丰富区还可包含转录终止位点(AATAAA多腺苷酸化)、mRNA不稳定基序(ATTTA)和隐蔽mRNA剪接位点。已观察到天然Bt cry基因的密码子使用与植物基因的密码子使用显著不同。因此，来自该基因的mRNA可能未被有效利用。密码子使用可在翻译或转录或mRNA加工水平上影响基因的表达。为了优化杀虫基因以用于在植物中表达，已尝试改变基因以使其尽可能类似于待转化的宿主植物内天然包含的基因。

然而，开发表达赋予对某些害虫具有抗性的高/最佳水平的Bt cry蛋白的作物植物品种仍然是农业领域中的主要问题。提高昆虫控制蛋白基因的表达对于开发具有农学上可接受的昆虫抗性水平的遗传改良植物是关键的。已进行了多种尝试来控制或预防作物植物的昆虫侵袭，然而某些害虫仍然是农业中的重要问题。因此，仍然需要在转基因植物中具有期望的杀虫蛋白表达水平的昆虫抗性转基因作物植物。

本发明通过提供编码针对害虫具有杀虫活性的Bt Cry2Ai蛋白的植物密码子优化合成DNA序列，在本文中提供了针对害虫侵袭的现有问题的解决方案。

发明内容

本文中公开了编码针对害虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列。本公开内容涉及用于增强植物细胞中异源基因表达的方法。构建cry2Ai基因的基因或编码区以提供植物特异性偏好密码子(preferred codon)序列。以这种方式，改变Cry2Ai蛋白的密码子使用以用于在植物中表达。这样的植物优化的编码序列可与能够指导编码序列在植物细胞中表达的启动子有效地连接。包含经密码子优化的苏云金芽孢杆菌合成核苷酸序列的经转化的宿主细胞和转基因植物也是本公开内容的一些方面。

本公开内容的目的之一是提供编码杀虫蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列已被优化以用于在植物中表达。

本公开内容的另一个目的是提供编码杀虫Bt蛋白的经密码子优化的核苷酸序列，以使Bt蛋白在植物中，优选在选自以下的植物中的表达最大化：茄子、棉花、稻、番茄、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科作物(legume)、甘蓝、花椰菜、西兰花、芸薹属(Brassica sp.)、豆类、豌豆、木豆(pigeonpea)、马铃薯、胡椒、葫芦、莴苣、甘薯芥花籽(sweet potatocanola)、大豆、苜蓿、花生和向日葵。

根据本公开内容，本发明人已合成了Bt杀虫Cry2Ai晶体蛋白基因，其中已改变了密码子使用以提高植物中的表达。然而，本发明人通过在本公开内容的核苷酸序列的合成中使用植物中最优选的密码子来优化密码子使用，而不是改变密码子使用以在总体密码子分布方面类似于植物基因。经优化的植物偏好密码子使用对于在双子叶植物例如棉花、茄子和番茄，在单子叶植物例如稻以及在豆科作物例如鹰嘴豆和木豆中高水平表达Bt杀虫蛋白是有效的。

本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列来源于具有根据SEQ ID NO：1所示氨基酸序列(NCBI GenBank：ACV97158.1)的苏云金芽孢杆菌Cry2Ai蛋白。具有根据SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的蛋白质针对多种鳞翅目(lepidopteran)昆虫具有活性，所述鳞翅目昆虫包括棉铃虫(Helicoverpa armigera)-棉铃虫(cotton bollworm)和玉米穗虫(cornearworm)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)-稻纵卷叶螟(rice leaffolder)、以及三化螟(Scirpophaga incertulas)-稻黄螟虫(rice yellow stem borer)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)。

尽管本公开内容已通过合成用于在植物中表达的经密码子优化的Bt cry2Ai核苷酸来示例，但认识到经密码子优化的Btcry2Ai核苷酸可用于优化蛋白质在植物例如棉花，茄子，番茄，稻和玉蜀黍中的表达。

因此，本公开内容的一个方面是提供经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质，其中所述核苷酸序列选自：(a)根据SEQID NO：2所示的核苷酸序列；(b)与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和(b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明的另一个方面是提供核酸分子，其包含用于在植物中表达的经密码子优化的序列，所述经密码子优化的序列选自：(a)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；(b)与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本公开内容的另一个方面是提供编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是

a.根据SEQ ID NO：2所示的，或与其互补的核苷酸序列；或者

b.与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列，或者与其互补的核苷酸序列。

本公开内容的另一个方面是提供重组DNA，其包含如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与异源调节元件有效地连接。

本公开内容的另一个方面是提供用于表达目的杀虫蛋白的DNA构建体，所述DNA构建体包含5’非翻译序列、编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的杀虫Cry2Ai蛋白或其杀虫部分的编码序列以及3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列包含在植物细胞中发挥功能的启动子，所述编码序列是如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，并且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多腺苷酸化信号。

本公开内容的另一个方面是提供质粒载体，其包含本文中公开的重组DNA或如本文中公开的DNA构建体。

本公开内容的另一个方面是提供宿主细胞，其包含如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列。

本公开内容的另一个方面是提供用于在植物中赋予昆虫抗性的方法，其包括：

(a)将如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列插入到植物细胞中，其中所述核苷酸序列与(i)在植物细胞中发挥功能的启动子和(ii)终止子有效地连接；

(b)从步骤(a)的植物细胞中获得经转化的植物细胞，其中所述经转化的植物细胞包含如本文中公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列；以及

(c)从步骤(b)的所述经转化的植物细胞中产生转基因植物，其中所述转基因植物包含如本文中公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

本公开内容的另一个方面是提供转基因植物，其包含如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列。

本公开内容的另一个方面是提供组合物，其包含含有如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的Cry2Ai蛋白。

本公开内容的另一个方面是提供在作物植物中控制昆虫侵袭并提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括使所述作物植物与杀虫有效量的如本文中公开的组合物接触。

本公开内容的又一个方面是如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列、DNA构建体或质粒用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。

本公开内容的又一个方面是如本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生杀虫组合物的用途，其中所述组合物包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞。

附图说明

图1示出了pGreen0029-CaMV35S-201D1的T-DNA构建体图。

图2示出了转基因棉花植物的遗传转化和再生。

序列简述

SEQ ID NO：1是Cry2Ai蛋白的氨基酸序列(NCBI GenBank：ACV97158.1)。

SEQ ID NO：2是编码Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(201D1)。

SEQ ID NO：3是编码Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(201D2)。

SEQ ID NO：4是编码Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(201D3)。

SEQ ID NO：5是编码Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(201D4)。

SEQ ID NO：6是编码Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(201D5)。

SEQ ID NO：7是用于扩增201D1 DNA序列(SEQ ID NO：2)的正向引物序列。

SEQ ID NO：8是用于扩增201D1 DNA序列(SEQ ID NO：2)的反向引物序列。

SEQ ID NO：9是用于扩增nptII DNA基因的正向引物序列。

SEQ ID NO：10是用于扩增nptII DNA基因的反向引物序列。

具体实施方式

本文中提供的详细描述是为了帮助本领域技术人员实践本发明，并且不应被解释为不适当地限制本发明的范围，因为本领域技术人员可在不脱离本发明的精神或范围的情况下对本文中讨论的实施方案进行修改和变化。在下文中将参照附图和/或序列表更全面地描述本发明，在附图和/或序列表中示出和/或描述了本发明的一些但非全部实施方案。本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文中阐述的实施方案。

尽管本文中采用了特定术语，但其仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。提供以下定义以便于理解实施方案。

必须注意的是，如在说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)冠词的语法对象。因此，例如，提及“探针”意指在组合物中可存在多于一种这样的探针。类似地，提及“元件”意指一个或更多个元件。

在整个说明书中，词语“包含/包括”或其变化形式将被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。

单位、前缀和符号可以以其SI认可的形式表示。除非另外指出，否则分别地，核酸以5’至3’的方向从左至右书写并且氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。数字范围包括限定该范围的数字。本文中氨基酸可通过它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样地，核苷酸可通过它们通常接受的单字母代码来指代。通过参考作为整体的说明书来更全面地定义上述定义的术语。

术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸序列”在本文中可互换使用。其包括提及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核酸)，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。核苷酸是聚合(连接成长链)以制备核酸(DNA和RNA)的亚基。核苷酸由三种较小的组分组成：核糖糖、含氮碱基和磷酸基团。

“多核苷酸”意指核酸的单链或者平行和反平行链。因此，多核苷酸可以是单链或双链核酸。

术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”替代“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

术语“经密码子优化的合成核苷酸序列”是非基因组核苷酸序列并且在本文中可互换使用，以指与天然或基因组核苷酸序列相比在核苷酸序列中具有一个或更多个改变的合成核苷酸序列或核酸分子。在一些实施方案中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于以下：由于用于在特定生物体(例如植物)中表达的核酸序列的密码子优化、遗传密码的简并而导致的核酸序列的改变，与天然或基因组序列相比引入至少一个氨基酸替换、插入、缺失和/或添加的核酸序列的改变，引入限制酶位点、去除与基因组核酸序列相关的一个或更多个内含子、插入一个或更多个异源内含子、缺失与基因组核酸序列相关的一个或更多个上游或下游调节区、插入一个或更多个异源上游或下游调节区、缺失与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区、插入异源5’和/或3’非翻译区、以及修饰多腺苷酸化位点的核酸序列的改变。

在本发明的上下文中，使用通常出现的核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是指尿苷。

在一些实施方案中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是合成的核苷酸序列。可使用本领域已知的方法，例如Murray et al.(1989)NucleicAcids Res.17：477-498，针对任何目的生物体制备经密码子优化的核苷酸序列。优化的核苷酸序列用于提高植物(例如单子叶和双子叶植物例如稻、番茄和棉花植物)中杀虫蛋白的表达。

本文中公开的新设计的cry2Ai DNA序列称为“经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列”。

术语“DNA构建体”、“核苷酸构建体”和“DNA表达盒”在本文中可互换使用，并且不旨在将实施方案限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，在本文中公开的方法中也可使用核酸构建体，特别是由核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸。

“重组”核酸分子或DNA或多核苷酸在本文中用于指已通过人工改变或产生的并且在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸分子或DNA多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是从基因组分离的多核苷酸、通过RNA的逆转录产生的cDNA、合成的核酸分子或两个另外分离的序列区段的人工组合(例如通过化学合成或通过控制通过遗传改造技术分离的多核苷酸区段)。

本文中使用的术语“同源”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置均被相同的核苷酸残基占据时，那么该区域在该位置是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的残基占据，则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性按照被相同核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例来表示。举例来说，具有核苷酸序列5’-ATTGCC-3’的区域和具有核苷酸序列5’-TATGGC-3’的区域共用50％同源性。优选地，第一区域包含第一部分并且第二区域包含第二部分，其中每个部分的至少约50％，并且优选至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。

用于比较的序列的最佳比对可通过本领域已知算法的计算机实施(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA)或通过检查来进行。

本文中使用的“序列同一性百分比”通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗口中的多核苷酸或氨基酸序列的片段与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(例如，空位或突出端)。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，并将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。

本文中使用的术语核苷酸序列之间的“显著序列同一性”是指包含与参考序列相比具有至少65％序列同一性，优选至少69％至77％序列同一性的序列的多核苷酸。

本文中使用的术语“启动子/调节序列”意指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在另一些情况下，该序列还可包含增强子序列和表达基因产物所需的其它调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是在细胞中以恒定方式驱动与其有效地连接的基因表达的启动子。举例来说，驱动细胞管家基因表达的启动子被认为是组成型启动子。

“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才引起该基因产物在活细胞中显著产生。

“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，仅在细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，才引起该基因产物在活细胞中显著产生。

本文中使用的“有效地连接”意指调节序列和编码序列之间的任何连接，无论取向或距离如何，其中该连接允许调节序列控制编码序列的表达。术语“有效地连接”还意指被连接的核酸序列是连续的，并且当需要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在同一阅读框中。术语“有效地连接”还指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。

本文中使用的“异源DNA编码序列”或“异源核酸”或“异源多核苷酸”意指除了天然编码Cry2Ai蛋白或Cry2Ai蛋白的任何同源物的编码序列之外的任何编码序列。

本文中使用的“编码区”是指编码蛋白质的基因、DNA或核苷酸序列的部分。术语“非编码区”是指基因、DNA或核苷酸序列中不是编码区的部分。

本文中使用的术语“编码”或“被编码”当用于特定核酸的上下文中时，意指所述核酸包含指导核苷酸序列翻译为特定蛋白质所必需的信息。编码蛋白质的信息通过使用密码子来指定。编码蛋白质的核酸可在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)或可缺少这样的间插非翻译序列(例如如在cDNA中)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指由通过肽键连接的氨基酸残基相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。合成多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。该术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，以指并入蛋白质、多肽或肽(统称为“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，否则可涵盖天然氨基酸的可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的已知类似物。

术语“蛋白质”通常是指大的多肽。术语“肽”通常是指短的多肽。然而，术语“多肽”在本文中用于指由通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基构成的任何氨基酸聚合物。

本文中使用的“表达盒”意指可并入到载体中的包含基因和其表达所必需的调节区的遗传模块。

“载体”是包含核酸分子并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。本领域已知的许多载体包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的一些实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

术语“表达载体”是指包含重组核酸的载体，所述重组核酸包含与待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如并入重组核酸的黏粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒。

本文中使用的术语“宿主细胞”是指预期的包含载体并支持表达载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)，或者真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，或者单子叶植物或双子叶植物植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个实例是稻宿主细胞，以及双子叶植物宿主细胞的一个实例是茄子或番茄宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

本文中使用的术语“毒素”是指显示农药活性(pesticidal activity)或杀虫活性(insecticidal activity)的多肽。“Bt”或“苏云金芽孢杆菌”毒素旨在包括在Bt的多种菌株中发现的较广泛类别的Cry毒素，其中包括这样的毒素。

术语“探针”或“样品探针”是指被其互补物或特定微阵列元件识别的分子。可通过本发明研究的探针的一些实例包括但不限于DNA、RNA、寡核苷酸、寡糖、多糖、糖、蛋白质、肽、单克隆抗体、毒素、病毒表位、激素、激素受体、酶、酶底物、辅因子以及包括细胞表面受体的激动剂和拮抗剂在内的药物。

本文中使用的术语“互补的”或“互补物”是指双链核酸中通过氢键缔合的碱基，嘌呤和嘧啶的配对。以下碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。本文中使用的术语包括完全和部分互补。

本文中使用的术语“杂交”是指其中核酸链与互补链通过碱基配对结合的过程。在两种不相同但非常相似的互补核酸杂交中使用的条件随两条链的互补程度和链的长度而变化。因此，该术语考虑了部分以及完全杂交。这样的技术和条件是本领域技术人员公知的。

术语“杀虫活性”和“农药活性”在本文中可互换使用，以指生物体或物质(例如如蛋白质)的活性，其可通过但不限于在进食并暴露适当长的时间之后的有害生物(pest)死亡率、有害生物重量损失、有害生物驱避性和有害生物的其它行为和物理变化来测量。因此，具有农药活性的生物体或物质不利地影响至少一个可测量的有害生物适应性参数。例如，“杀虫蛋白”是通过其自身或与其它蛋白质组合显示杀虫活性的蛋白质。

本文中使用的术语“影响害虫”是指在任何发育阶段控制昆虫进食、生长和/或行为的变化，包括但不限于杀伤昆虫、延缓生长、阻止生殖能力、拒食活性等。

本文中使用的术语“农药有效量”意指当存在于有害生物环境中时具有农药活性的物质或生物体的量。对于每种物质或生物体，农药有效量是针对在特定环境中受影响的每种有害生物来凭经验确定的。类似地，当有害生物是害虫时，“杀虫有效量”可用于指“农药有效量”。

本文中使用的术语“转化植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含一种或更多种异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸在转基因或转化植物的基因组内稳定地整合，使得多核苷酸被传递到连续世代。异源多核苷酸可单独或作为重组DNA分子的一部分整合到基因组中。

应当理解，本文中使用的术语“转基因”包括其基因型通过一种或更多种异源核酸的存在而改变的任何植物细胞、植物细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物。该术语包括初始使用本领域已知的遗传转化方法获得的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因中产生的那些。

本文中使用的术语“初始转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件例如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变来改变基因组(染色体或染色体外)。

本文中使用的术语“植物”包括全植物、植物细胞、植物原生质体、植物可由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其在植物或植物的部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、籽粒(kernel)、穗(ear)、穗轴(cob)、壳、秆(stalk)、根、根尖、花药等及其后代中是完整的。转基因植物的部分在实施方案的范围内，并且包括例如植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，其起源于先前用实施方案的DNA分子转化并且因此至少部分由转基因细胞组成的转基因植物或其后代。

苏云金芽孢杆菌cry基因和密码子优化

目前已对大致约400种编码δ-内毒素的cry基因进行了测序(Crickmore，N.2005.Using worms to better understand how Bacillus thuringiensis killsinsects.Trends in Microbiology，13(8)：347-350)。已基于氨基酸序列相似性将多种δ-内毒素分类到类(Cry 1、2、3、4等)中。这些类由数个亚类(Cry1A、Cry1B、Cry1C等)构成，所述亚类本身被细分为亚家族或变体(Cry1Aa、CrylAb、CrylAc等)。每一类的基因彼此有多于45％的同一性。每种单个cry基因的产物通常具有受限的活性谱，其限于少数物种的幼虫阶段。然而，不可能建立Cry蛋白的同一性程度与其活性谱之间的相关性。CrylAa和CrylAc蛋白是84％同一的，但仅CrylAa对家蚕(Bombyx mori)(L.)有毒性。相反，仅33％同一的Cry3Aa和Cry7Aa二者均对科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)Leptinotarsadecemlineata具有活性。其它Cry毒素对昆虫完全没有活性，但对其它无脊椎动物具有活性。例如，Cry5和Cry6蛋白种类对线虫具有活性。最近，还表征了对叶甲科(Chrysomelidae)的多种鞘翅目(Coleopteran)害虫具有活性的定名为Cry34Ab1/Cry35Ab1的来自Bt的双元毒素。它们被指定为Cry名称，尽管它们与Cry毒素家族的其它成员几乎没有同源性。

为了在转基因植物中实现期望的异源蛋白的表达水平，已发现其有益于以多种方式改变天然的，有时称为野生型或原始基因组DNA编码序列，以使得密码子使用更接近地匹配宿主植物物种的密码子使用，类似地，编码序列的G+C含量更接近地匹配宿主植物物种的G+C含量。

植物分子生物学领域的技术人员将理解可设计多个DNA序列以编码单个氨基酸序列。提高目的蛋白质编码区表达的常用手段是以这样的方式修饰编码区，以使得其密码子组成与靶向表达该基因的宿主的总体密码子组成类似。

可优化基因组/天然核酸以用于提高在宿主生物体中的表达。因此，当宿主生物体是植物时，合成核酸可使用植物偏好密码子进行合成以用于改善表达。例如，尽管一些实施方案的核酸序列可在单子叶和双子叶植物物种二者中表达，但是可修饰序列以考虑单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已显示出不同(Murrayet al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498)。因此，针对特定氨基酸的稻偏好密码子可来源于来自稻的已知基因序列，并且针对特定氨基酸的茄子偏好密码子可来源于来自茄子的已知基因序列。

已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，以及其它可对基因表达有害的良好表征的序列。可将序列的GC含量调整至给定的细胞宿主的平均水平，如通过参照宿主细胞中表达的已知基因来计算的平均水平。

Vaeck et al.(Vaeck M，Reynaerts A，

H，Jansens S，De Beukeleer M，Dean C，Zabeau M，Van Montagu M，Leemans J(1987)Transgenic plants protected frominsect attack.Nature 327：33-37)报道了表达Bt cry1Ab基因的昆虫抗性转基因烟草植物的产生，以用于保护免受欧洲玉米螟(美国和欧洲攻击玉蜀黍的主要有害生物之一)的侵害。然而，尽管使用强启动子，但植物中毒素的产生最初对于有效的农业利用来说太弱(Koziel G M，Beland G L，Bowman C，Carozzi N B，Crenshaw R，Crossland L，Dawson J，Desai N，Hill M，Kadwell S，Launis K，Maddox D，McPherson K，Heghji M，Merlin E，Rhodes R，Warren G，Wright M，Evola S(1993)Field performance of elite transgenicmaize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Biotechnology 11∶194-200)。与植物基因不同，Bt基因具有高A+T含量(66％)，这是植物的次优密码子使用，并且潜在地导致转录的错误剪接或过早终止(De laRiva和Adang，1996)。

Perlak et al.(Perlak F J，Fuchs R L，Dean D A，McPherson S L，Fishhoff DA(1991)Modification of the coding sequences enhances plant expression ofinsect control protein genes，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：3324-3328.)在未修饰编码的肽序列的情况下修饰了cry基因的编码序列，以确保与天然基因相比其允许在植物中产生两倍毒素的植物最佳密码子使用。该策略已成功地用于许多植物，例如用经修饰的cry1基因转化的棉花、稻和玉蜀黍以及用经修饰的cry3A基因转化的马铃薯。Bt玉蜀黍和Bt棉花在全世界大规模种植。

因此，生物体中天然存在的密码子偏倚导致异源生物体中基因的次优表达。在本发明中，将来自苏云金芽孢杆菌的天然cry2Ai基因在计算机上重构，以用于包括双子叶和单子叶植物在内的植物中重组蛋白质的最佳表达。当通过多变量分析来设计时，用双子叶/单子叶植物的高度优选的密码子替换稀有和高度稀有的密码子。手动检查通过基因设计者工具设计的经重构的合成基因的稀有密码子使用、mRNA二级结构的稳定性、基因二级转录的任何起始，以避免截短蛋白质的表达。通过mRNA优化器对经优化的mRNA的结构和稳定性进行了检查和确定。

本发明的一个特定的方面提供了编码Cry2Ai杀虫蛋白的经密码子优化的合成核酸、包含本发明核酸分子的杀虫组合物、多核苷酸构建体、重组核苷酸序列、重组载体、转化的微生物和植物。这些组合物可用于控制害虫，尤其是作物植物害虫的方法中。

本文中公开的经密码子优化的合成核苷酸序列可与多种启动子融合以制备重组DNA分子，所述启动子包括组成型、诱导型、暂时调节型、发育调节型、组织偏好型和组织特异性启动子。当与天然cry2Ai基因相比时，本文中公开的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列(编码序列)在转化植物中提供显著更高水平的表达。因此，可产生对鳞翅目有害生物具有抗性的植物，所述鳞翅目昆虫例如棉铃虫(Helicoverpa armigera)-棉铃虫(cottonbollworm)和玉米穗虫、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)-稻纵卷叶螟(riceleaffolder)、以及三化螟-稻黄螟虫和棉红铃虫。

本发明的一个实施方案提供了具有植物偏好密码子的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列在植物例如棉花、茄子、稻、番茄和玉蜀黍中的表达。本发明的另一个实施方案提供了包含本发明的合成cry2Ai核苷酸序列的DNA表达盒、植物转化载体。本发明的另一个实施方案提供了包含本文中公开的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列或由本文中公开的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列编码的杀虫多肽的组合物。本文中公开的组合物可以是包含本发明的农药和/或杀虫蛋白/多肽的农药和/或杀虫组合物。另一个实施方案提供了包含表达Cry2Ai毒素蛋白的本发明的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列的转基因植物。

特别地，本发明提供了根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的杀虫Cry2Ai蛋白。

在一些实施方案中，本发明还提供了用本文中公开的经密码子优化的合成cry2Ai核苷酸序列转化的植物和微生物，以及涉及使用这样的核苷酸序列、农药组合物、经转化的生物体及其产物来影响害虫的方法。

一些实施方案的多核苷酸序列可用于转化任何生物体例如植物和微生物(例如苏云金芽孢杆菌)以产生经编码的杀虫和/或农药蛋白。提供了涉及使用这样的经转化的生物体来影响或控制植物害虫的方法。一些实施方案的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器例如叶绿体。期望生物体的转化方法是本领域公知的，其使本领域技术人员能够使用本发明中公开的核苷酸序列进行转化。

一些实施方案的核苷酸序列涵盖已针对特定生物体的细胞表达而优化的核酸或核苷酸序列，例如已使用基于具有农药活性的多肽的氨基酸序列的植物偏好密码子回译(back-translated)(即反向翻译)的核酸序列。

本公开内容提供了编码杀虫Cry2Ai蛋白的经密码子优化的合成核酸/核苷酸序列。合成的编码序列特别适用于在双子叶(双子叶植物)和单子叶(单子叶植物)植物例如稻、番茄、茄子、玉蜀黍、棉花和豆科作物中表达蛋白质。

本公开内容提供了编码Cry2Ai蛋白的合成核苷酸序列，其特别适合于在植物中良好表达。所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列大致以与其在植物物种中天然存在的基因中平均使用的频率相同的频率使用植物优化的密码子。本公开内容还包括用于在植物中赋予昆虫抗性的经密码子优化的合成核苷酸序列。

对于植物转化，在本公开内容中使用选择标记基因。包含本文中公开的合成序列的DNA构建体和转基因植物被教导为用于使用农业上重要的植物的方法和组合物。

由经密码子优化的合成核苷酸序列编码的蛋白质各自表现出鳞翅目物种抑制性生物活性。双子叶和/或单子叶植物可用本文中公开的每种核苷酸序列单独或与编码杀虫剂(例如设计成抑制一种或更多种靶标有害生物内的基因的蛋白质、晶体蛋白、毒素和/或有害生物特异性双链RNA等)的其它核苷酸序列组合进行转化，以通过仅使用已知的来源于苏云金芽孢杆菌菌株的鳞翅目杀虫蛋白来实现在该领域以前不可行的昆虫抗性管理手段。

本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列还可与其它类型的编码杀虫毒素的核苷酸序列组合用于植物中，以获得经转化以包含至少一种用于控制选自以下的每种常见植物有害生物中的一种或更多种的手段的植物：鳞翅目害虫、鞘翅目害虫、刺吸害虫等。

调节序列

转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、激活剂、增强子、其它调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。

多核苷酸/DNA构建体将在转录的5’至3’方向上包含：在用作宿主的生物体中发挥功能的转录和翻译起始区(即启动子)、一些实施方案的DNA序列、以及转录和翻译终止区(即终止区)。转录起始区(即启动子)对于宿主生物体和/或一些实施方案的序列可以是天然的、类似的、外来的或异源的。另外，启动子可以是天然序列或替代地是合成序列。本文中使用的术语“外来的”是指在其中引入启动子的天然生物体中未发现该启动子。在启动子对于一些实施方案的序列是“外来的”或“异源的”的情况下，其意指启动子不是一些实施方案的有效地连接的序列的天然的或天然存在的启动子。

许多启动子可用于一些实施方案的实施。可基于期望的结局选择启动子。本发明的经密码子优化的核苷酸序列可与组成型、组织偏好型、诱导型或其它启动子组合用于在宿主生物体中表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括例如核心CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白、泛素、ALS启动子等。

取决于期望的结局，通过诱导型启动子表达基因可能是有益的。对调节植物中一些实施方案的核苷酸序列的表达特别感兴趣的是创伤诱导型启动子。这样的创伤诱导型启动子可响应由昆虫进食引起的损伤，并且包含马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因、wun1和wun2、winl和win2、WIP1、MPI基因等。

另外，病原体诱导型启动子可用于一些实施方案的方法和核苷酸构建体。这样的病原体诱导型启动子包括来自由病原体感染之后被诱导的病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR蛋白)例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的启动子。

化学调节的启动子可用于通过施加外源化学调节剂来调节植物中基因的表达。取决于目的，启动子可以是其中化学物质的施加诱导基因表达的化学诱导型启动子，或其中化学物质的施加抑制基因表达的化学抑制型启动子。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于被苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉蜀黍In2-2启动子、被用作芽前除草剂的疏水亲电子化合物活化的玉蜀黍GST启动子、和被水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它目的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子。

在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中比在至少一种其它植物组织中更大程度地表达。一些组织偏好启动子显示几乎仅在特定组织中表达。组织偏好启动子可用于靶向特定植物组织内增强的农药蛋白表达。如果需要，可修饰这样的启动子用于弱表达。

一些组织特异性启动子的实例包括但不限于叶偏好启动子、根特异性或根偏好启动子、种子特异性或种子偏好启动子、花粉特异性启动子以及髓(pith)特异性启动子。

根偏好或根特异性启动子是已知的，并且可选自可从文献中获得的或从多种相容的物种中从头分离的启动子。

“种子偏好”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子，例如种子储藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发期间有活性的那些启动子)二者。γ-玉米醇溶蛋白和Glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于β.-菜豆蛋白、β.-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质(waxy)、shrunken1、shrunken 2、球蛋白1等。

当期望低水平表达时，将使用弱启动子。通常，本文中使用的术语“弱启动子”是指驱动编码序列低水平表达的启动子。这样的弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子、核心35S CaMV启动子等。

终止区可从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒获得，例如章鱼碱合酶(octopine synthase，OCS)和胭脂碱合酶(nopaline synthase，NOS)终止区。

DNA表达盒可另外包含5’前导序列。这样的前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯Y病毒组(potyvirus)前导，例如TEV前导(烟草蚀纹病毒)、MDMV前导(玉蜀黍矮花叶病毒)、来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导(AMV RNA 4)；烟草花叶病毒前导(TMV)；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导(MCMV)。

在本文中公开和要求保护的本发明的一个特定实施方案中，组织偏好或组织特异性启动子与本公开内容的编码杀虫蛋白的合成DNA序列有效地连接，并且用至少一种这样的重组分子稳定转化转基因植物。所得植物将对以那些在其中表达该DNA的植物部分为食的特定昆虫具有抗性。

选择标记基因

通常，表达盒包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(neomycin phosphotransferase II，nptII)和潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase，hptII)的那些，以及赋予对除草化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸盐/酯(2，4-dichlorophenoxyacetate，2，4-D)具有抗性的基因。合适的选择标记基因的另外一些实例包括但不限于编码对氯霉素、甲氨蝶呤、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺胺、溴苯腈、草甘膦、草丁膦(phosphinothricin)的具有抗性的基因。

以上选择标记基因列表不意味着限制。在一些实施方案中可使用任何选择标志基因。

DNA构建体和载体

本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列在DNA构建体中提供，用于在目的生物体中表达。该构建体包括与本发明的序列有效地连接的5’和3’调节序列。

这样的多核苷酸构建体具有多个限制性位点以用于插入编码Cry2Ai毒素蛋白序列的DNA序列，以处于调节区的转录调节之下。多核苷酸构建体可另外包含选择标记基因。所述构建体可另外包含至少一个待共转化到期望生物体中的另外的基因。或者，可在多个多核苷酸构建体上提供另外的基因。

在制备DNA构建体/表达盒时，可操纵多种DNA片段，以提供正确方向的DNA序列，并在适当的情况下以正确的阅读框提供。为此，可使用适配子或接头来连接DNA片段，或可涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余DNA、去除限制性位点等。为此，可涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、重新替换，例如转换和颠换。

根据本发明，可将本文公开的DNA构建体/表达盒插入重组表达载体。表述“重组表达载体”意指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。一般来说，只要可以在宿主中复制和稳定，就可以使用任何质粒或载体。表达载体的重要特征是它具有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化的细胞的标记的大量克隆载体可用于准备将外来基因插入高等植物中。载体包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可将具有编码Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合适限制性位点处插入载体中。所得质粒用于转化到大肠杆菌中。将大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获并裂解。回收质粒。序列分析、限制性分析、电泳和其他生化分子生物学方法通常作为分析方法进行。每次操作之后，所使用的DNA序列可被切割并与下一个DNA序列连接。每个质粒序列都可在相同或其他质粒中克隆。取决于将期望基因插入植物的方法，可能需要其他DNA序列。例如，如果Ti或Ri质粒用于植物细胞的转化，则至少必须将Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但经常是右边界和左边界连接起来作为待插入的基因的侧翼区域。

包含本公开内容的经密码子优化的核苷酸序列和用于调节转录/翻译的合适信号的表达载体可通过本领域技术人员公知的方法构建。这样的方法的实例包括体外重组DNA技术、DNA合成技术和体内重组技术。可将DNA序列与表达载体中合适的启动子有效地连接，以诱导mRNA的合成。此外，表达载体可包含核糖体结合位点和转录终止子作为翻译起始位点。

本发明的重组载体的一个优选实例是Ti质粒载体，当该载体存在于合适宿主例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中时，其可将自身的一部分(即所谓的T区)转移至植物细胞。其他类型的Ti质粒载体目前用于将杂交基因转移至原生质体，原生质体可通过将植物细胞或杂交DNA适当插入植物基因组而产生新植物。

表达载体可包含至少一个选择标记基因。选择标记基因是具有这样的特性的核苷酸序列，基于该特性可通过常规化学方法对该选择标记基因进行选择。可用于区分转化的细胞与未转化的细胞的每个基因都可以是选择标记。实例包括对除草剂(例如草甘膦和phosphintricin)具有抗性的基因，以及对抗生素(例如卡那霉素、潮霉素、G418、博来霉素和氯霉素)具有抗性的基因，但不限于此。

对于本发明的重组载体，启动子可以是CaMV 35S、肌动蛋白或泛素启动子中的任何一种，但不限于此。由于可以在不同阶段以多种机制选择转化体，因此对于本发明可优选组成型启动子。因此，本文不限于选择组成型启动子的可能性。

对于本发明的重组载体，可使用任何常规终止子。其实例包括胭脂碱合成酶(NOS)、稻α-淀粉酶RAmy1 A终止子、菜豆碱终止子和根癌农杆菌的optopine基因终止子等，但不限于此。关于终止子的必要性，众所周知，这样的区域可提高植物细胞中转录的可靠性和效率。因此，考虑到本发明的情况，终止子的使用是高度偏好的。

本领域技术人员将知晓，本文公开的DNA构建体和载体可用于产生昆虫抗性转基因植物和/或产生杀虫组合物，其中所述组合物可包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞或能够表达本文公开的核苷酸序列以产生Cry2Ai杀虫蛋白的任何其他微生物。

重组细胞

实施方案还涵盖用至少一种本发明的经密码子优化的核酸、用包含所述核酸的表达盒或用包含所述表达盒的载体转化的微生物。在一些实施方案中，微生物是在植物上繁殖的微生物。本发明的一个实施方案涉及包封的农药蛋白，其包含能够表达本发明Cry2Ai蛋白的转化的微生物。

另一个实施方案涉及转化的生物体，例如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含本发明的经密码子优化的合成DNA分子、包含所述DNA分子的表达盒或包含所述表达盒的载体，其可稳定地并入到转化的生物体的基因组中。

认识到编码Cry2Ai蛋白的基因可用于转化昆虫病原生物体。这样的生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。

可通过合适的载体将编码实施方案的Cry2Ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列引入微生物宿主中，并将所述宿主施加于环境或植物或动物。在将核酸插入细胞中的背景下，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”并且包括提及将核酸并入到真核或原核细胞中，其中可将核酸并入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

在允许DNA稳定维持和表达的条件下，有多种方法可用于将表达农药蛋白的外来DNA引入微生物宿主中。例如，可构建表达盒，其包含与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译调节信号有效地连接的目的核苷酸构建体以及与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列，由此将发生整合，和/或在宿主中发挥功能的复制系统，由此将发生整合或稳定维持。

植物转化方法与转基因植物的产生

编使用本领域公知的多种技术将本发明的编码Bt Cry2Ai毒素蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列(DNA序列)插入植物细胞中。一旦插入的DNA被整合到植物基因组中，它就是相对稳定的。转化载体通常包含赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(例如卡那霉素、双丙氨膦(Bialaphos)、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性的选择标志物。因此，单独使用的标志物应允许选择转化的细胞，而不是不含插入的DNA的细胞。

有许多技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。那些技术包括使用根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA转化、融合、注射、基因枪法(微粒轰击)，或电穿孔以及其他可能的方法。如果使用农杆菌进行转化，则待插入的DNA必须克隆到特定质粒中，即中间载体或双元载体中。由于与T-DNA中的序列同源的序列，可通过同源重组将中间载体整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移所必需的vir区。

中间载体不能在农杆菌中自我复制。中间载体可通过辅助质粒(缀合)转移到根癌农杆菌中。双元载体可在大肠杆菌和农杆菌二者中自我复制。它们包含选择标记基因和由右和左T-DNA边界区域构成的接头或多接头。它们可直接转化到农杆菌中。用作宿主细胞的农杆菌将包含携带毒力(vir)区域的质粒。vir区域对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。可包含另外的T-DNA。如此转化的细菌用于植物细胞的转化。植物外植体可有利地与根癌农杆菌或发根农杆菌一起培养以用于将DNA转移到植物细胞中。然后可以在合适的培养基中从被感染的植物材料(例如，叶片、秆段、根，以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生整株植物，该培养基可包含用于选择的抗生素或杀生物剂。然后可检测如此获得的植物是否存在插入的DNA。在注射和电穿孔的情况下，对质粒没有特殊要求。可使用普通质粒，例如pUC衍生物。

已经转化的细胞可以按照传统的方法生长成植物。然后可使这些植物生长，并用相同的转化品系或者不同的品系授粉，并且鉴定出具有期望表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂种(hybrid)。可生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传期望表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现期望表型特征的表达。它们可形成生殖细胞并将转化的性状传递给后代植物。这样的植物可以以正常方式生长，并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。产生的杂交个体具有相应的表型特性。

本发明的植物转化方法涉及将本发明的多核苷酸引入植物中，并且不依赖于用于将多核苷酸引入植物中的特定方法。用于将多核苷酸引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

在本发明的一个实施方案中，用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化植物。转化的植物的一些非限制性实例是包含本发明的编码Cry2Ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列的可育转基因稻和番茄植物。稻和番茄的转化方法是本领域已知的。还可使用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化多种其他植物。

“稳定转化”旨在意指将引入植物中的核苷酸构建体整合到植物基因组中，并能被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入植物中而不整合到植物基因组中，或将多肽引入植物中。

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可因转化所靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法包括微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和弹道粒子加速。

在本发明的一个实施方案中，本发明的编码Cry2Ai毒素的经密码子优化的合成核苷酸序列在高等生物体(例如使用本公开内容的经密码子优化的核苷酸序列的植物)中表达。在这种情况下，表达有效量毒素的转基因植物保护自己免受害虫的侵害。当昆虫开始以这样的转基因植物为食时，它也会摄入所表达的毒素。这将阻止昆虫进一步咬入植物组织，或可甚至伤害或杀死该昆虫。将本发明的核苷酸序列插入到表达盒中，接下来将其稳定整合到植物基因组中。

实施方案还涵盖包含所述实施方案的至少一种核苷酸序列的转化或转基因植物。在一些实施方案中，植物用包含实施方案的至少一种核苷酸序列的核苷酸构建体稳定转化，所述核苷酸序列与驱动植物细胞中表达的启动子有效地连接。

虽然实施方案不依赖于提高植物对植物有害生物抗性的特定生物机制，但在植物中表达实施方案的核苷酸序列可导致实施方案的农药蛋白的产生以及植物对植物有害生物的抗性提高。这些实施方案的植物可用于影响害虫的农业方法中。某些实施方案提供了转化的作物植物，例如稻和番茄植物，其可用于影响植物害虫的方法中，所述害虫例如多种鳞翅目昆虫，包括稻纵卷叶螟-稻纵卷叶螟以及三化螟-稻黄螟虫。

“对象植物或植物细胞”是其中目的基因的遗传改变(例如转化)已受影响的植物或植物细胞，或是来源于如此改变的植物或细胞并且包含这种改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了用于测量对象植物或植物细胞表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即与导致对象植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料具有相同基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状没有已知影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)作为对象植物或植物细胞后代中的未转化分离子的植物或植物细胞；(d)与对象植物或植物细胞在遗传上相同但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)在目的基因在其中不表达的条件下的对象植物或植物细胞本身。

本文公开的cry2Ai核苷酸确定的性状转移(或渐渗(introgression))到近交植物例如棉花、稻、茄子(brinjal)、番茄和豆科作物品系中可通过轮回选择育种例如通过回交来实现。在这种情况下，首先将期望的轮回亲本与携带本文公开的用于cry2Ai确定的性状的核苷酸序列的近交供体(非轮回亲本)杂交。然后将该杂交的后代与轮回亲本回交，然后在产生的后代中选择待从非轮回亲本转移的期望性状。在与轮回亲本进行三代、优选四代、更优选五代或更多代回交并选择期望性状之后，对于控制所转移性状的基因座，后代将是杂合的，但对于大多数或几乎所有其他基因将与轮回亲本相似。

实施方案还涉及实施方案的转化的植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和枝条的插条。

可在实施方案的方法中使用的植物类别通常与适于转化技术的高等植物类别一样广泛，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于谷物、谷类植物(cereal)、蔬菜、油、果实、观赏植物、草坪植物等。例如，稻(水稻(Oryza sativa)、稻属(Oryza spp.))、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、黑麦(Secale cereale)、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor)、普通高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黍(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana)、小麦(Triticum aestivum、小麦属(Triticum sp.))、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare L)、甘蔗(Saccharum spp.)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、棉花属(Gossypium sp.))、番茄(Lycopersiconesculentum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甜菜(Betavulgaris)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、莴苣(Lactuca sativa)、甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、西兰花(Brassica oleracea var.indica)、芸薹属(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸薹属物种)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、花生(Arachishypogaea)、木豆(Cajanus cajan)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Pisum sativum)、豌豆(Lathyrus spp.)、黄瓜(Cucumis sativus)、哈密瓜(Cucumis cantalupensis)、和甜瓜(Cucumis melo)、苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油籽植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、谷子等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸薹、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、刺槐豆、葫芦巴、大豆、菜豆(garden bean)、豇豆(cowpea)、绿豆(mungbean)、利马豆、蚕豆(fava bean)、扁豆(lentil)、鹰嘴豆等。

在某些实施方案中，至少一种本发明的经密码子优化的合成核苷酸序列可与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以创建具有期望表型的植物。例如，经密码子优化的合成核苷酸序列可与任何其他编码具有农药和/或杀虫活性的多肽(例如其他Bt毒性蛋白等)的多核苷酸堆叠。所产生的组合还可包含任何一种目的多核苷酸的多个拷贝。实施方案的核苷酸序列还可与任何其他基因或基因组合堆叠，以产生具有多种期望性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于动物饲料期望的性状，例如高油基因、平衡的氨基酸、非生物胁迫抗性等。

本发明的核苷酸序列还可与以下堆叠：疾病或除草剂抗性期望的性状、无毒性和疾病抗性基因、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)、谷氨酰胺合酶抑制剂(例如草丁膦或basta(例如bar基因))、草甘膦抗性、加工(processing)或加工(process)产物期望的性状例如高油、改性油、改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(starchsynthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和淀粉脱支酶(starchdebranching enzyme，SDBE))。还可将实施方案的多核苷酸与提供农艺学性状(例如雄性不育性、秆强度、开花时间)或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因靶向)的多核苷酸组合。

这些堆叠组合可通过任何方法创建，包括但不限于通过任何常规、遗传转化或本领域已知的任何其他方法杂交育种植物。如果这些性状是通过对植物进行遗传转化而堆叠的，则目的多核苷酸序列可以在任何时候并且以任何顺序被组合。例如，包含一个或更多个期望性状的转基因植物可用作通过后续转化引入更多性状的靶标。这些性状可以在共转化方案中与由任何转化盒组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两种序列，则这两种序列可以包含在分开的转化盒(反式，trans)中或包含在同一个转化盒(顺式，cis)中。序列的表达可由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可期望引入将抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任意组合组合，以在植物中产生期望的性状组合。进一步认识到，可使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列堆叠在期望的基因组位置处。

转基因植物分析

聚合酶链式反应(PCR)

本发明提供了用于对本发明公开的如SEQ ID NO：2中所示的经密码子优化的核苷酸序列的片段进行PCR扩增的方法，所述核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的Cry2Ai蛋白，所述方法包括在存在如SEQ ID NO：7至8中所示引物组的情况下通过PCR扩增DNA。类似地，本发明公开的如SEQ ID NO：3至6中所示的经密码子优化的核苷酸序列的片段可使用对所述核苷酸序列具有特异性的引物来扩增。本领域技术人员可设计用于扩增所述核苷酸的引物组。用于从模板DNA PCR扩增DNA片段的方案和条件在本文中其他地方描述或以其他方式在本领域中已知。

寡核苷酸引物可设计成用于PCR反应以从本发明的经密码子优化的DNA序列扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中是公知的，并在Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，N.Y.)(以下称为“Sambrook”)中公开。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了适合于PCR扩增编码农药多肽的本发明经密码子优化的合成核苷酸序列的片段的引物组以及在DNA的PCR扩增中使用该引物组的方法。引物组包括正向和反向引物，其被设计成与本发明的核苷酸序列退火。

用于扩增本发明的如SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列的引物组包含如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示的正向和反向引物。

Southern杂交

在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，其选择性地与克隆基因组DNA片段群中存在的或来自所选生物体的其他相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是本发明经密码子优化的DNA序列的PCR扩增的DNA片段，或者含有核苷酸序列或能够与本文所公开的合成核苷酸的相应序列杂交的其他寡核苷酸的线性化质粒，并且可用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标志物来标记。因此，例如用于杂交的探针可通过基于实施方案的序列标记合成的寡核苷酸来制备。用于杂交的探针的制备方法在本领域中是公知的，并在Sambrook中公开。

例如，本文公开的整个序列或其一个或更多个部分可用作能够与相应序列特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这样的探针包括对于实施方案的序列而言是独特的且长度通常为至少约10或20个核苷酸的序列。这样的探针可用于通过PCR扩增核苷酸序列的相应cry2Ai核苷酸序列。

这样的序列的杂交可在严格条件下进行。本文中使用的术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，探针与其靶序列杂交的程度会比与其他序列的杂交程度明显更高(例如，至少是背景的2倍、5倍或10倍)。严格条件是顺序依赖性的，并且在不同的情况下会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。

通常，严格条件将是，在pH为7.0至8.3下，盐浓度为小于约1.5M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃并且对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。也可通过添加去稳剂(例如甲酰胺)来实现严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60℃至65℃下在0.1×SSC中最终洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm(热解链点)可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程近似：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，“％form”是杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及L是以碱基对表示的杂交长度。T^m是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。洗涤通常至少进行到达到平衡并实现低背景杂交水平，例如2小时、1小时或30分钟。对于每1％的错配，T^m降低约1℃；因此，可调整T^m杂交和/或洗涤条件，以与期望同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有90％同一性的序列，则T^m可降低10℃。通常，严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度和pH下的T^m低约5℃。然而，严格的严格条件可在低于T^m 1、2、3或4℃下利用杂交和/或洗涤；中等严格条件可在低于T^m 6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可在低于T^m11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下利用杂交和/或洗涤。

使用方程、杂交和洗涤组合物以及期望的T^m，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化是固有地描述的。如果期望的错配程度导致T^m低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则可以提高SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对于核酸杂交的广泛指南可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，第二章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第二章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。另见Sambrook et al。

本发明涵盖与如SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者与如SEQID NO：2中所示核苷酸序列的第262至402位和/或从第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列或其互补序列。本领域技术人员将知晓基于本文公开的用于核酸杂交的核苷酸序列的探针的制备。

蛋白质表达测定

为了定量确定目的蛋白的表达水平，可以进行多种测定。目的蛋白的表达水平可以直接测定，例如通过测定植物中编码蛋白的水平。用于这样的测定的方法是本领域公知的。例如，Northern印迹或定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)可用于评估转录水平，而western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)测定或酶测定可用于评估蛋白质水平。

在本发明中，通过使用ELISA确定包含如本发明公开的经密码子优化的核苷酸序列的转基因植物中的Cry2Ai蛋白表达水平，并且令人惊讶和出乎意料地发现如本文公开的经密码子优化的合成DNA序列显示转基因植物中Cry2Ai蛋白表达的显著增强。由此获得的转基因植物中增强的Cry2Ai蛋白表达对于有效地引起针对目标昆虫的最高水平的保护可以是最佳的。因此，本文公开的经密码子优化的合成DNA序列可用于植物中有效的昆虫控制以增强对害虫的抗性，从而提高作物产量。

生物测定

本领域技术人员已知多种生物测定技术。一般程序包括将实验化合物或生物体添加至封闭容器中的饮食源。农药活性可通过但不限于在取食和暴露适当时间长度之后的死亡率变化、体重减轻、吸引力、驱避性以及其他行为和身体变化来测量。本文所述的生物测定可用于幼虫或成虫阶段的任何取食害虫。

杀虫组合物

生物农药是传统化学农药最有希望的替代品之一，其对环境和生物区系(biota)的危害较小或没有。苏云金芽孢杆菌(通常称为Bt)是在其生长的静止期或衰老期期间产生称为δ-内毒素(δ-内毒素)的晶体蛋白的杀虫革兰氏阳性孢子形成细菌。Bt最初由Shigetane Ishiwatari于1902年从患病的蚕(家蚕(Bombyx mori))中发现。但其在1915年由Ernst Berliner从患病的地中海粉螟(Ephestia kuhniella)中进行正式表征。首次将其应用于控制昆虫的记录是在1920年底在匈牙利，并且在1930年代初在南斯拉夫将其应用于控制欧洲玉米螟。Bt作为主要的生物合理性农药最初被表征为昆虫病原体，并且其杀虫活性主要或完全归因于伴孢晶体。它针对多于150种害虫具有活性。Bt培养物的毒性在于其产生晶体蛋白的能力，这一观察结果导致了基于Bt的生物杀虫剂的开发以用于控制鳞翅目、双翅目和鞘翅目中的某些昆虫物种。

实施方案的组合物可用于以多种方式保护植物、种子和植物产品。例如，组合物可用于涉及通过选自喷施、撒粉、撒播或种子包衣的程序将有效量的农药组合物置于有害生物的环境中的方法。

在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子)，但尤其是种子作为商业产品出售之前，其通常用保护剂包衣(其包含除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的数种的混合物)与另外的载体、表面活性剂或通常用于制剂领域的促进施加的辅助剂一起(如果期望的话)进行处理，以提供保护免受细菌、真菌或动物有害生物造成的损害。为了处理种子，可通过用液体制剂浸渍块茎或谷粒，或通过用组合的湿或干制剂进行包覆来将保护剂包衣施加至种子。此外，在特殊情况下，可以是其他施加于植物的方法，例如针对芽或果实进行处理。

可用包含种子处理化合物的种子保护剂包衣对包含编码实施方案的农药蛋白的核苷酸序列的实施方案的植物种子进行处理，该化合物例如克菌丹(captan)、萎锈灵(carboxin)、福美双(thiram)、甲霜灵(methalaxyl)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)和常用于种子处理的其他化合物。在一个实施方案中，将包含实施方案的农药组合物的种子保护剂包衣单独使用或与通常用于种子处理的种子保护剂包衣之一组合使用。实施方案的组合物可以是适合于直接施加的形式或作为需要在施加前用适量的水或其他稀释剂进行稀释的主要组合物的浓缩物。农药浓度将根据特定制剂的性质(具体地，其是浓缩物还是待直接使用)而变化。组合物含有1至98％的固体或液体惰性载体，以及0至50％或0.1至50％的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标示速率施用，例如，当在干燥状态下时每英亩约0.01lb至5.0lb.，和当在液体状态下时每英亩约0.01pts.至10pts.。

本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列还可用于产生能够产生Cry2Ai蛋白的转化的苏云金芽孢杆菌。转化的苏云金芽孢杆菌随后可用于产生可用于农业活动(例如害虫管理)的杀虫和/或农药组合物。

在一些实施方案中，转化的微生物(其包括整个生物体、细胞、孢子(例如用本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列转化的苏云金芽孢杆菌)、农药蛋白、农药组分、影响有害生物的组分、突变体、活或死细胞和细胞组分(包括活和死细胞与细胞组分的混合物并且包括破碎的细胞和细胞组分))或分离的杀虫蛋白可以与可接受的载体一起配制成农药组合物，其例如为混悬剂、溶液剂、乳剂、撒粉剂、可分散颗粒剂或丸粒剂、可湿性散剂和可乳化浓缩物、气雾剂或喷剂、浸渍的颗粒剂、辅助剂、可包衣糊剂、胶体，以及在例如聚合物物质中的胶囊剂。这样的配制的组合物可通过如对包含所述多肽的细胞培养物进行干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩这样的常规手段来制备。

上文公开的这样的组合物可通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、润湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包封剂、黏合剂、乳化剂、染料、UV保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或其他影响植物生长的制剂来获得。一种或更多种农用化学品，包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂(harvest aid)和肥料，可与通常用于制剂领域的载体、表面活性剂或辅助剂或者有助于针对特定目标有害生物的产品处理和应用的其他组分组合。合适的载体和辅助剂可以是固体或液体，并对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增黏剂、黏合剂或肥料。实施方案的活性成分通常以组合物的形式施加，并且可施加于待处理的作物区域、植物或种子。例如，实施方案的组合物可施加于准备储存于粮仓或筒仓中或者在储存于粮仓或筒仓期间的谷物等。实施方案的组合物可与其他化合物同时或接连施加。施加含有至少一种由实施方案的细菌菌株产生的农药蛋白的实施方案的活性成分或实施方案的农用化学品组合物的方法包括但不限于叶面施加、种子包衣和土壤施加。施加次数和施加速率取决于相应有害生物的侵袭强度。

在另一个实施方案中，可在配制之前对实施方案的组合物以及转化的微生物和农药蛋白进行处理以延长当施加于目标有害生物的环境时的农药活性，只要预处理对农药活性无害即可。这样的处理可通过化学和/或物理手段进行，只要该处理不有害地影响组合物的性质即可。化学试剂的实例包括但不限于卤化剂；醛，例如甲醛和戊二醛；抗感染剂，例如氯化苯甲烃铵(zephiran chloride)；醇，例如异丙醇和乙醇。

在另一些实施方案中，在将实施方案的农药蛋白组合物施加于目标害虫的环境之前，用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理Cry毒素多肽以激活蛋白质可能是有利的。通过丝氨酸蛋白酶激活原毒素的方法在本领域是公知的。

组合物(包括实施方案的转化的微生物和农药蛋白)可通过例如喷施、雾化、撒粉、撒播、包衣或倾倒、引入到土壤中或土壤上、引入到灌溉水中、在有害生物开始出现时或在有害生物出现之前的时间通过种子处理或一般施加或撒粉的方式施加于害虫的环境作为保护措施。例如，实施方案的农药蛋白和/或转化的微生物可与谷物混合以在储存期间保护谷物。在植物生长的早期阶段获得对有害生物良好的控制通常是重要的，因为这是植物可能受到最严重损害的时候。如果认为有必要的话，则实施方案的组合物可方便地包含另一种杀虫剂。在一个实施方案中，组合物在种植的时间时以载体和实施方案的芽孢杆菌菌株或转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒形式直接施加至土壤。另一个实施方案是包含农用化学品例如除草剂、杀虫剂、肥料、惰性载体和实施方案的芽孢杆菌菌株或转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。

本领域技术人员将认识到并非所有化合物针对所有有害生物都是同等有效的。实施方案的化合物展示了针对害虫的活性，所述害虫可包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃、观赏植物、食品和纤维、公共和动物健康、家用和商业结构、家庭和储存产物有害生物。

害虫包括来自鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目的昆虫。

鳞翅目的害虫包括但不限于粘虫、地老虎(cutworm)、尺蠖(looper)和NoctuidaeSpodoptera frugiperda J E Smith(草地粘虫(fall armyworm))科中的heliothine；S.exigua Hubner(甜菜夜蛾(beet armyworm))；S.litura Fabricius(烟草地老虎(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；Mamestra configurata Walker(披肩粘虫(bertha armyworm))；M.brassicae Linnaeus(甘蓝夜蛾(cabbage moth))；Agrotisipsilon Hufnagel(黑地老虎(black cutworm))；A.orthogonia Morrison(西部地老虎(western cutworm))；A.subterranea Fabricius(粒肤地老虎(granulate cutworm))；Alabama argillacea Hubner(棉叶虫(cotton leaf worm))；Trichoplusia ni Hubner(粉纹夜蛾(cabbage looper))；Pseudoplusia includens Walker(大豆尺蠖(soybeanlooper))；Anticarsia gemmatalis Hubner(藜豆粉螟(velvetbean caterpillar))；Hypena scabra Fabricius(苜蓿绿夜蛾(green cloverworm))；Heliothis virescensFabricius(烟草夜蛾(tobacco budworm))；Pseudaletia unipuncta Haworth(粘虫)；Athetis mindara Barnes and Mcdunnough(糙肤地老虎(rough skinned cutworm))；Euxoa messoria Harris(暗面地老虎(darksided cutworm))；Earias insulanaBoisduval(多刺螟蛉虫(spiny bollworm))；E.vittella Fabricius(斑点螟蛉虫(spottedbollworm))；Helicoverpa armigera Hubner(美洲螟蛉虫(American bollworm))；H.zeaBoddie(玉米穗虫或棉铃虫)；Melanchra picta Harris(斑马纹粉螟(zebracaterpillar))；栖夜蛾属(Egira)(Xylomyges)；curialis Grote(柑橘地老虎(citruscutworm))；钻蛀虫(borer)、鞘蛾(casebearer)、结网毛虫(webworm)、锥虫(coneworm)和雕叶虫(skeletonizer)，其来自螟蛾科(Pyralidae)玉米螟(Ostrinia nubilalis Hubner)(欧洲玉米螟(European corn borer))；Amyelois transitella Walker(海军橙虫(navalorangeworm))；Anagasta kuehniella Zeller(地中海粉蛾(Mediterranean flourmoth))；Cadra cautella Walker(粉斑螟蛾(almond moth))；Chilo suppressalis Walker(稻茎螟(rice stem borer))；C.partellus，(高粱螟(sorghum borer))；Corcyracephalonica Stainton(米蛾(rice moth))；Crambus caliginosellus Clemens(玉米根结网毛虫(com root webworm))；C.teterrellus Zincken(蓝草结网毛虫(bluegrasswebworm))；Cnaphalocrocis medinalis Guenee(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))；Desmia funeralis Hubner(葡萄卷叶螟(grape leaffolder))；Diaphania hyalinataLinnaeus(瓜虫(melon worm))；D.nitidalis Stoll(泡菜虫(pickleworm))；Diatraeagrandiosella Dyar(西南玉米螟(southwestern corn borer))、D.saccharalisFabricius(甘蔗螟(surgarcane borer))；Eoreuma loftini Dyar(墨西哥稻螟(Mexicanrice borer))；Ephestia elutella Hubner(烟草(可可)蛾)；Galleria mellonellaLinnaeus(大蜡蛾(greater wax moth))；Herpetogramma licarsisalis Walker(草地螟(sod webworm))；Homoeosoma electellum Hulst(向日葵蛾(sunflower moth))；Elasmopalpus lignosellus Zeller(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；Achroiagrisella Fabricius(小蜡蛾(lesser wax moth))；Loxostege sticticalis Linnaeus(草地螟(beet webworm))；Orthaga thyrisalis Walker(茶树网蛾(tea tree web moth))；Maruca testulalis Geyer(豆荚螟(bean pod borer))；Plodia interpunctella Hubner(印度谷蛾(Indian meal moth))；Scirpophaga incertulas Walker(黄茎螟(yellow stemborer))；Udea rubigalis Guenee(西芹叶虫(celery leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)Acleris gloverana Walsingham(西部黑蚜虫(Western blackheadedbudworm))中的卷叶蛾、蚜虫、种子虫和果虫；A.variana Fernald(东部黑头蚜虫(Easternblackheaded budworm))；Archips argyrospila Walker(果树卷叶虫(fruit tree leafroller))；A.rosana Linnaeus(欧洲卷叶虫(European leaf roller))；以及其他黄卷蛾属(Archips)物种，Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm(夏季果实卷叶蛾(summerfruit tortrix moth))；Cochylis hospes Walsingham(向日葵带蛾(banded sunflowermoth))；Cydia latiferreana Walsingham(榛小卷蛾(filbertworm))；C.pomonellaLinnaeus(苹果蠹蛾(codling moth))；Platynota flavedana Clemens(斑驳卷叶蛾(variegated leafroller))；P.stultana Walsingham(杂食性卷叶蛾(omnivorousleafroller))；Lobesia botrana Denis&Schiffermuller(欧洲葡萄藤蛾(European grapevine moth))；Spilonota ocellana Denis&Schiffermuller(苹果芽小卷叶蛾(eyespottedbud moth))；Endopiza viteana Clemens(葡萄浆蛾(grape berry moth))；Eupoeciliaambiguella Hubner(藤蛾(vine moth))；Bonagota salubricola Meyrick(巴西苹果卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；Grapholita molesta Busck(梨小蛀果蛾(orientalfruit moth))；Suleima helianthana Riley(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；色卷蛾属(Choristoneura spp.)。

鳞翅目中所选择的其他农学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；橙色条纹橡木虫(Anisota senatoriaJ.E.Smith)(橙色条纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyiGuerin-Meneville)(柞蚕(Chinese Oak Silkmoth))；桑蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉叶潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Collas eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃配片舟蛾(Datana integrima Grote&Robinson)(核桃舟蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚丝蛾(Siberian silk moth))，榆角尺蠖(Ennomos subsignaria Hubner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(菩提尺蠖(1inden looper))；棕尾毒蛾(Euproctis chtysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；葡萄叶烟翅斑蛾(Harrisina americana Guerin-Meneville)(葡萄叶烟翅斑蛾(grapeleafskeletonizer))；行列半白大蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(行列半白大蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)((美国白蛾)fallwebworm)；番茄茎麦蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)(番茄茎麦蛾(tomatopinworm))；东部铁杉尺蛾(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蛾(Eastern hemlock looper))；西部铁杉尺蛾(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蛾(Western hemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(柳毒蛾(satinmoth))；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manducaquinquemaculata Haworth)(番茄天蛾(five spotted hawk moth，tomato hornworm))；番茄天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾，烟草天蛾(tomato hornworm，tobacco hornworm))；冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacritavemata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；大黄带凤蝶(Papilio cresphontesCramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail，orange dog))；加州槲蛾(Phryganidiacalifornica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；桔潜蛾(Phyllocnistiscitrella Stainton)(桔潜蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonotycterblancardella Fabricius)(斑幕潜叶蛾(spotted tentiform leafminer))；大菜粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大菜粉蝶(large white butterfly))；菜粉蝶(P.rapaeLinnaeus)(菜粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(暗脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋薊羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋薊羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(pectinophora gossypiella Saunders)(棉红铃虫(pinkbollworm))；纹白蝶(Pontia protodice Boisduval&Leconte)(纹白蝶(Southerncabbagworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenee)(杂食尺蠖(omnivorouslooper))；红山背舟蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红山背舟蛾(red humpedcaterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松异舟蛾(pine processionarycaterpiller))；衣蛾(Tineola bisselliella Hummel)(衣蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absolute Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(苹果巢蛾(ermine moth))；夜蛾科棉铃虫(Heliothissubflexa Guenee)；天幕毛虫(Malacosoma spp.)和毒蛾(Orgyia spp.)。

可以在害虫的早期发育阶段(例如作为幼虫或其他未成熟形式)测试实施方案的组合物的农药活性。昆虫可以在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度的全黑暗中饲养。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法是本领域普通技术人员公知的。

根据本发明的用于控制昆虫(特别是鳞翅目)的方法可以包括将本文公开的杀虫/农药组合物施用(例如，喷施)至要保护的区域或要保护的场所(区域)的植物，该组合物包含用本发明的经密码子优化的cry2Ai核苷酸序列转化的宿主细胞。要保护的场所可以包括例如害虫的栖息地或生长的植被或植被要生长的区域。

本公开内容涉及用于控制茄子害虫的方法，该方法包括通过种植用本发明的cry2Ai核苷酸序列转化的茄子植物或喷施含有本发明的Cry2Ai蛋白的组合物，将本文公开的杀虫/农药组合物施用至要保护的区域或植物。本发明还涉及针对鳞翅目茄子害虫的本发明的组合物用于最小化对茄子植物的损害的用途。

本公开内容还涉及用于控制稻害虫的方法，例如鳞翅目稻二化螟(ricestemborer)、稻纵卷叶螟(rice leaffolder)、稻包虫(rice skipper)，稻地老虎(ricecutworm)、稻粘虫(rice armyworm)、或稻纵卷叶螟(rice caseworm)，优选地选自以下的昆虫：二化螟(Chilo suppressalis)、斑禾草螟(Chilo partellus)、三化螟(Scirpophagaincertulas)、大螟(Sesamia inferens)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、Marasmia patnalis、稻显纹刷须野螟(Marasmiac exigua)、刷须野螟(Marasmiaruralis)、Scirpophaga innnotata，该方法包括通过种植用本发明的cry2Ai核苷酸序列转化的稻植物或喷施含有本发明的Cry2Ai蛋白的组合物，将本文公开的杀虫/农药组合物施用于要保护的区域或植物于要保护的区域或植物。本发明还涉及针对稻害虫的本文公开的组合物用于最小化对稻植物的损害的用途。

本公开内容还涉及用于控治番茄害虫如鳞翅目棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的方法，该方法包括通过种植用本发明的cry2Ai核苷酸序列转化的番茄植物或喷施含有本发明的Cry2Ai蛋白的组合物，将本文公开的杀虫/农药组合物施用于要保护的区域或植物于要保护的区域或植物。本发明还涉及针对番茄害虫的本文公开的组合物用于最小化对番茄植物的损害的用途。

本公开内容还涉及用于控制棉花害虫的方法，该方法包括通过种植用本发明的cry2Ai核苷酸序列转化的棉花植物或喷施含有本发明的Cry2Ai蛋白的组合物，将本文公开的杀虫/农药组合物施用于要保护的区域或植物于要保护的区域或植物。本发明还涉及针对棉花害虫的本文公开的组合物用于最小化对棉花植物的损害的用途。

为了获得Cry2Ai毒素蛋白(SEQ ID NO：1)，可以将表达Cry2Ai蛋白的重组宿主细胞以常规方式在合适的培养基上培养，并随后使用常规方法如酶降解或洗涤剂等裂解。然后可以通过标准技术如色谱法，提取，电泳等分离和纯化毒素。

因此，本发明提供了用于影响害虫(特别是植物有害生物)的组合物和方法。更具体地，本发明提供了经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码针对害虫的生物活性杀虫多肽，所述害虫例如但不限于鳞翅目有害生物的害虫，例如棉铃虫(棉铃虫)和玉米穗蛾，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)(稻纵卷叶螟)和三化螟(Scirpophaga incertulas)(稻黄螟虫)，和棉红铃虫(Spectinophora Gossypiella)。

根据本公开内容，在一个实施方案中提供了编码具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：(a)如SEQID NO：2中所示的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO：2中所示的核苷酸核苷酸序列从第262至402位和/或第1471至1631位的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和(b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含用于在植物中表达的经密码子优化的序列的核酸分子，其选自：(a)如SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列；(b)与如SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列从第262至402位和/或第1471至1631位的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，提供了编码具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是

a.如SEQ ID NO：2所示，或与其互补的核苷酸序列；或

b.与如SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，提供了本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中与如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列选自以下：SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在另一个实施方案中，提供了包含本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列的重组DNA，其中所述核苷酸序列有效地连接至异源调节元件。另一个实施方案涉及本文公开的重组DNA，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含选择标记基因、报道基因或其组合。另一个实施方案涉及本文公开的重组DNA，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含编码靶向或转运肽用于靶向液泡、线粒体、叶绿体、质体或用于分泌的DNA序列。

在另一个实施方案中，证明了用于表达目的杀虫蛋白的DNA构建体包含5′非翻译序列、编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列杀虫的杀虫Cry2Ai蛋白或其杀虫部分的编码序列、和3′非翻译区，其中所述5′非翻译序列包含在植物细胞中有功能的启动子，所述编码序列是如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列，并且其中所述3′非翻译序列包含转录终止序列和多腺苷酸化信号。

一个实施方案涉及包含本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的质粒载体。另一个实施方案提供了包含含有本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的重组DNA的质粒载体。另一个实施方案提供了包含含有本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的DNA构建体的质粒载体。

另一个实施方案提供了包含本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列的宿主细胞。本公开内容的宿主细胞包括植物、细菌、病毒、真菌和酵母细胞。在另一个实施方案中，所公开的宿主细胞是植物细胞、农杆菌属(Agrobacterium)或大肠杆菌(E.coli)。

本发明的另一个实施方案提供了在植物中赋予昆虫抗性的方法，其包括：

(a)将如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列插入植物细胞中，其中所述核苷酸序列有效地连接至(i)在植物细胞中有功能的启动子和(ii)终止子；

(b)从步骤(a)的植物细胞获得的经转化的植物细胞，其中所述经转化的植物细胞包含本公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列；以及

(c)从步骤(b)的所述经转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物包含本公开内容的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

另一个实施方案涉及通过本文公开的赋予昆虫抗性的方法获得的转基因植物。本发明的另一个实施方案涉及包含本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物。本发明的另一个实施方案涉及包含经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物，其中所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6。本公开内容的另一个实施方案涉及本文公开的转基因植物，其中所述植物选自：棉花、茄子、稻、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科植物、番茄、甘蓝、花椰菜、西兰花、芸苔属物种、豆、豌豆、木豆、马铃薯、胡椒、葫芦科植物、莴苣、甘薯、油菜、大豆、紫花苜蓿、花生、向日葵、红花、烟草、甘蔗、木薯、咖啡、菠萝、柑橘属、可可、茶、香蕉和瓜。

本公开的另一个实施方案涉及从本发明的转基因植物获得的组织、种子或后代，其中所述种子或后代包含如本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列。本发明的另一个实施方案涉及来源于本文公开的组织或种子或后代的生物样品，其中所述样品包含可检测量的本发明的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。本发明的另一个实施方案提供了来源于本公开内容中公开的转基因植物的商品产品，其中所述产品包含可检测量的如本文中公开的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

本发明的另一个实施方案提供了包含苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的组合物，所述苏云金芽孢杆菌包含编码本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的Cry2Ai蛋白。本文公开的组合物可以任选地包含对相同害虫有毒但表现出与所述杀虫蛋白不同模式的杀虫活性的另外的杀虫剂。本公开内容的组合物的杀虫剂选自以下：芽孢杆菌(Bacillus)毒素，致病杆菌(Xenorhabdus)毒素，光杆状菌(Photorhabdus)毒素，以及对抑制所述害虫中的一种或更多种必需基因具有特异性的dsRNA。

本发明的另一个实施方案提供了控制作物植物中昆虫侵袭的方法并提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括使所述作物植物与杀虫有效量的如上所述的组合物接触。

本发明的另一个实施方案涉及本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列、DNA构建体或质粒用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。本发明的另一个实施方案涉及如本文所公开的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生杀虫组合物的用途，其中所述组合物包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞。

本发明的另一个实施方案提供了表达本文公开的至少一种经密码子优化的合成核苷酸序列的转基因植物。另一个实施方案提供了通过本文公开的方法获得的转基因植物。本文公开的转基因植物选自：稻、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科植物、棉花、番茄、茄子、甘蓝、花椰菜、西兰花、芸苔属物种、豆、豌豆、木豆、马铃薯、胡椒、葫芦科植物、莴苣、甘薯、油菜、大豆、紫花苜蓿、花生、向日葵、红花、烟草、甘蔗、木薯、咖啡、菠萝、柑橘属、可可、茶、香蕉和瓜。本发明的一些实施方案涉及从本发明的转基因植物获得的组织、种子或后代，其中所述种子或后代包含本文所述的经密码子优化的合成核苷酸序列。本发明的一些实施方案提供了来源于组织或种子或后代的生物样品，其中所述样品包含可检测量的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。一个实施方案包括来源于本发明转基因植物的商品产品，其中所述产品包含可检测量的经密码子优化的合成核苷酸序列。

在一个实施方案中，提供了包含苏云金芽孢杆菌的组合物，所述苏云金芽孢杆菌包含本公开内容至少一种经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的Cry2Ai蛋白。所述组合物任选地包含对相同害虫有毒但表现出与所述杀虫蛋白不同模式的的杀虫活性的另外的杀虫剂。杀虫剂选自以下：芽孢杆菌毒素、致病杆菌毒素、光杆状菌毒素和对抑制所述害虫中的一种或更多种必需基因具有特异性的dsRNA。

在另一个实施方案中，提供了控制作物植物中昆虫侵袭的方法并提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括使所述作物植物与杀虫有效量的本文所述组合物接触。

另一个实施方案涉及本公开内容的经密码子优化的合成核苷酸序列、DNA构建体或质粒用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。另一个实施方案涉及本文公开的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生杀虫组合物的用途，其中所述组合物包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞。

本发明的这些和/或其它实施方案反映在构成本发明说明书的部分的权利要求的措辞中。

受益于说明书和相关附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员可以给出本发明的多种修改和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于本文公开的特定实施方案，并且修改和其它实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。

以下实施例举例说明本发明，但不是提供以限制本发明或所寻求的保护。

实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，并且不旨在限制本发明人认为是其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或唯一实验。已努力确保所用数(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。

一般方法

使用本领域标准的程序进行DNA操作。这些程序通常可以修改和/或替换而基本上不改变结果。除了其它参考文献所表明的以外，这些程序中的大多数描述于Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，second edition，1989。

实施例1：设计编码CRY2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的经密码子优化的序列

设计并合成了具有植物密码子偏倚的DNA序列，以用于在转基因植物中表达具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的Cry2Ai蛋白。由从SEQ ID NO：1的Cry2Ai蛋白序列(NCBI基因库ACV 97158.1)获得的编码序列计算植物的密码子使用表。将使用蒙特卡罗算法(Monte Carlo algorithm)(Villalobos A，Ness J E，Gustafsson C，Minshull J和Govindarajan S(2006)Gene Designer：a synthetic biology tool for constructingartificial DNA segments；BMC Bioinformatics 67：285-293)优化的DNA序列作为选择密码子的主要标准。在优化DNA序列时考虑来自密码子使用表的概率。稀有和较不频繁的密码子被最丰富的密码子替换。在省略使用小于该氨基酸的总密码子使用的约10％的任何冗余密码子之后计算加权平均植物密码子集。使用以下公式计算每个密码子的加权平均表示：

CI的加权平均％＝1/(％C1+％C2+％C3+等)×％C1×100，其中CI是所讨论的密码子，并且％C2、％C3等表示剩余同义密码子的平均％使用值。

为了获得编码SEQ ID NO：1的Cry2Ai蛋白的植物密码子优化的DNA序列，在编码Cry2Ai蛋白的DNA序列中进行密码子替换，以使得所得DNA序列具有植物优化的密码子偏倚表的总体密码子组成。还对序列进行改进以消除不期望的限制性酶识别位点，潜在的植物内含子剪接位点，A/T或C/G残基的长运行，以及可能干扰植物细胞中编码区的RNA稳定性、转录或翻译的其它基序。将基因在计算机上通过使用基因设计软件以6.0kcal/mole截止值形成稳定的mRNA二级结构来优化。进行其它改变以并入所期望的限制酶识别位点，并消除长的内部开放阅读框(除+1以外的框)。在起始密码子ATG之前并入XbaI、NcoI和BamHI的限制性识别位点，并在终止密码子之前插入限制性识别位点SmaI，以能够在原核载体中克隆经优化的基因以用于融合C端蛋白标签。在终止密码子后并入EcoRI和HindIII的限制性识别位点。在经优化的基因中使用终止密码子TGA。

这些改变都在保持大约植物偏倚密码子组成的限制内进行。编码Cry2Ai蛋白(SEQID NO：1)的完整植物密码子优化的序列如SEQ ID NO：2至6所示。植物偏倚的经密码子优化的DNA序列的计算机内翻译显示与天然Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)100％的同一性。植物密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO：2至6)命名为201D1、201D2、201D3、201D4和201D5。201D1至D5 DNA片段(SEQ ID NO：2至6)的合成由商业供应商(Genscript Inc，USA)进行。通过使用本领域已知的方法将201D1DNA片段克隆到pUC57载体中，并命名为pUC57-201D1。类似地，将201D2 DNA、201D3 DNA、201D4 DNA和201D5 DNA片段克隆到pUC57载体中，并分别命名为pUC57-201D2、pUC57-201D3、pUC57-201D4和pUC57-201D5。

实施例2：表达载体的构建

用BamHI和HindIII消化实施例1的pUC57-201D1载体以获得201D1 DNA(SEQ IDNO：2)片段(反应体积-20μl，质粒DNA-8.0μl，10X缓冲液-2.0μl，限制性酶BamHI-0.5μl，限制性酶HindIII-0.5μl，蒸馏水-9.0μl)。将所有试剂混合以获得反应混合物，并在37℃下孵育30分钟，随后将反应混合物通过在2％琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分析，并在UV照射下用干净的锋利解剖刀从琼脂糖凝胶切下201D1 DNA片段。使用凝胶洗脱试剂盒从凝胶中洗脱DNA片段。将含有DNA片段的凝胶切片转移到2ml eppendorf管中，并添加3X样品体积的缓冲液DE-A。将凝胶通过涡旋重悬浮于缓冲液DE-A中，并将内容物加热至75℃直至凝胶完全溶解，然后添加混合在一起的0.5X缓冲液DE-A和DE-B。通过将柱放入其中制备eppendorf管，并将结合混合物转移到柱。将具有柱的eppendorf管短暂离心。将柱置于新鲜的eppendorf管中，并添加500μl缓冲洗涤缓冲液-WI(Qiagen试剂盒)，然后离心。弃去上清液，并沿柱壁添加700μl洗涤缓冲液-W2以洗去所有残留的缓冲液，然后离心。用700μl等分样品的缓冲液W2重复该步骤。将柱转移到新的eppendorf管并以6000rpm离心1分钟以去除残留的缓冲液。将柱再次置于新的eppendorf管中，并在膜的中心添加40μl洗脱缓冲液。使具有洗脱缓冲液的柱在室温下静置1分钟，并将管以12000rpm离心1分钟。将经洗脱的201D1 DNA片段储存在-20℃下直至进一步使用。

将由此获得的经分离和纯化的201D1 DNA片段连接到线性化pET32a载体中。使用T4DNA连接酶(反应体积-30μl，10X连接缓冲液-3.0μl，载体DNA-5.0μl，插入DNA-15.0μl，T4DNA连接酶-1.0μl，蒸馏水-6.0μl)进行连接。将试剂充分混合并将所得反应混合物在16℃下孵育2小时。随后通过向100μl BL21 DE3感受态细胞添加10μl连接混合物来用包含携带201D1 DNA的pET32a载体的连接混合物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞。将由此获得的细胞混合物置于冰上30分钟，并在42℃水浴中孵育60秒进行热激，并放回冰上5至10分钟。随后，将1ml LB肉汤添加至混合物，并在振荡培养箱中在37℃下以200rpm再孵育1小时。将细胞混合物涂布在加有50μg/ml羧苄西林的LB琼脂上并在37℃下孵育过夜。通过限制性消化分析鉴定阳性克隆。将由此获得的表达载体命名为pET32a-201D1。

类似地，构建携带如SEQ ID NO：3至6所示的其它植物密码子优化的DNA序列的表达载体，并将所述表达载体命名为pET32a-201D2、pET32a-201D3、pET32a-201D4和pET32a-201D5。

实施例3：CRY2Ai在大肠杆菌中的表达。

克隆到pET32a中的201D1 DNA(SEQ ID NO：2)(命名为pET32a-201D1)在大肠杆菌BL 21 D3中表达。用1mM IPTG以约OD nm＝0.5至1.0的细胞密度诱导表达。诱导之后，将大肠杆菌细胞在振荡器中在16℃下孵育24至40小时以用于蛋白质产生。Cry2Ai蛋白(SEQ IDNO：1)在细胞中以可溶形式表达。随后将培养物转移到离心管并以10000rpm离心5分钟。弃去上清液，并用溶菌酶消化10ml细胞并在室温下孵育1小时。将样品以10000rpm离心5分钟并弃去上清液。将沉淀悬浮于无菌蒸馏水中并以10000rpm离心10分钟。将该步骤重复两次并将沉淀储存在-20℃下。在10％SDS-PAGE上分析含有来自诱导的重组菌株的蛋白质的沉淀。

类似地，将如SEQ ID NO：3至6所示的DNA序列克隆到pET32a中，并在大肠杆菌BL21D3中表达。

实施例4：含有编码CRY2Ai蛋白(SEQ ID NQ：1)的201D1 DNA(SEQ ID NO：2)的植物转化载体的构建

用限制酶消化携带201D1 DNA(SEQ ID NO：2)的pUC57-201D1载体以释放201D1DNA片段(反应体积-20μl，质粒DNA-8.0pl，10X缓冲液-2.0μl，限制酶EcoRV-0.5μl，蒸馏水-9.5pl)。将所有试剂混合并将混合物在37℃下孵育30分钟。通过凝胶电泳分析限制性消化之后获得的产物并进一步纯化。

通过用EcoRV酶限制性消化制备Ti质粒pGreen0029载体(反应体积一20μl，质粒DNA-8.0μl，10X缓冲液-2.0μl，限制性酶EcoRV-0.5μl，蒸馏水-9.5μl)。将所有试剂混合并将混合物在37℃下孵育30分钟。通过凝胶电泳分析限制性消化之后获得的产物。

将经纯化的201D1 DNA片段(SEQ ID NO：2)连接到线性化的pGreen0029载体中。使用T4DNA连接酶进行连接(反应体积-30μl，10X连接缓冲液-3.0pl，载体DNA-5.0pl，插入物DNA-15.0μl，T4 DNA连接酶-1.0μl，蒸馏水-6.0μl)。将试剂充分混合并将所得反应混合物在16℃下孵育2小时。随后通过向100μl BL21 DE3感受态细胞添加10μl连接混合物，用包含携带201D1 DNA(SEQ ID NO：2)的pGreen0029载体的连接混合物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞。将由此获得的细胞混合物置于冰上30分钟，并在42℃水浴中孵育60秒用于热激，并将细胞混合物放回冰上5至10分钟。随后，将1ml LB肉汤添加至混合物，并在振荡培养箱中在37℃下以200rpm再孵育1小时。将细胞悬浮液(100μl)均匀地涂布在含有50μg/ml羧苄西林的LB琼脂培养基上。将板在37℃下孵育过夜。通过限制性消化分析确认阳性克隆。将由此获得的重组载体命名为pGreen0029 CaMV35S-201D1。

因此，重组质粒pGreen0029-CaMV35S-201D1含有在35SCaMV启动子转录控制下的植物优化的201D1 DNA序列(SEQ ID NO：2)。另外，pGreen0029-CaMV35S-201D1含有nptII基因，其是在NOS启动子转录控制下的植物选择标记基因(图1)。pGreen0029-CaMV35S-201D1T区的组分的物理排列示为：

RB＞35SCaMV：201D1 CDS：CaMV polyA＞NOS启动子：nptII CDS：NOS PolyA＞LB

类似地，将如SEQ ID NO：3至6所示的DNA序列克隆到Ti质粒pGreen0029中，并将由此获得的重组载体命名为pGreen0029-CaMV35S-201D2、pGreen0029-CaMV35S-201D3、pGreen0029-CaMV35S-201D4和pGreen0029-CaMV35S-201D5。携带所述DNA序列(SEQ ID NO：3至6)的pGreen0029-CaMV35S的组分在T区中的物理排列示为：

RB＞35SCaMV：201D2 CDS：CaMV polyA＞NOS启动子：nptII CDS：NOS Poly A＞LB

RB＞35SCaMV：201D3 CDS：CaMV polyA＞NOS启动子：nptII CDS：NOS Poly A＞LB

RB＞35SCaMV：201D4 CDS：CaMV polyA＞NOS启动子：nptII CDS：NOS Poly A＞LB

RB＞35SCaMV：201D5 CDS：CaMV polyA＞NOS启动子：nptII CDS：NOS Poly A＞LB

用重组载体pGreen0029-CaMV35S-201D1转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

用携带如SEQ ID NO：2所示DNA序列的重组pGreen0029-CaMV35S-201D1质粒转化根癌农杆菌菌株LBA440。将200ngpGreen0029-CaMV35S-201D1质粒DNA添加至100μl根癌农杆菌菌株LBA440感受态细胞的等分样品。将混合物在冰上孵育30分钟并转移至液氮20分钟，然后在室温下解冻。然后将农杆菌细胞转移到1ml LB肉汤并在水浴振荡器中以200rpm在28℃下孵育24小时。将细胞悬浮液均匀地涂布在含有50μg/ml利福平，30μg/ml卡那霉素和5μg/ml四环素的LB琼脂培养基上。将板在28℃下孵育过夜。对经转化的农杆菌细胞进行质粒提取和限制性消化方法以及阳性根癌农杆菌菌落分析并选择和储存用于进一步使用。

实施例5(A)用pGreen0029-CaMV35S-201D1构建体的经农杆菌介导的棉转化

下面描述棉花转化的实验细节。棉花转化领域的技术人员将理解，当使用其它植物可表达的选择标记基因时，其它方法可用于棉花转化和用于选择经转化植物。

材料

根癌农杆菌菌株和选择标志物

根癌农杆菌LBA4404和作为选择标志物的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因已用于本文所述的棉花转化和再生实验。

培养基等

LB(Luria-Bertani，LB)培养基(Himedia)；LB琼脂(Himedia)；MS大量盐(Himedia)、MS微量盐(Himedia)、FeEDTA、B5维生素、硫胺素-HCl(Duchefa)、吡哆醇-HCl(Duchefa)、烟酸(Duchefa)]、肌-肌醇(Sigma)、蔗糖(Sigma)、琼脂(Duchefa)；2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)(Duchefa)：1mg/mL原种(stock)；激动素(Duchefa)；吲哚-3-丁酸/IBA(Duchefa)；乙酰丁香酮(3′，5′-二甲氧基-4′-羟基乙酰苯)(Sigma)；奥格门汀(Duchefa)；卡那霉素单硫酸盐(Duchefa)；

植物材料

棉花(Gossypium hirsutum)L.var Coker 310

体外种子萌发和预培养

将棉花种子var Coker 310在28℃±2℃下200rpm的振荡器中浸入含有0.1％吐温-20的无菌水中20分钟，并在振荡器中用0.1％HgCl₂处理20分钟。将种子用无菌水清洗5次。将经灭菌的种子在无菌水中浸泡过夜。在25℃±2℃下在16/8光/暗的光周期下，使经灭菌的种子在MS培养基中萌发。从7日龄幼苗制备子叶外植体并在包含以下的MS培养基上预培养：MS盐、维生素B5、葡萄糖：30.0g/l；植物凝胶：2.5g/lpH：5.8)与2，4-D(1.0mg/l)和激动素(5.0mg/l)，远轴面接触培养基。

共培养，选择和植物再生

在24小时之后，将来自预培养培养基的外植体用携带质粒pGreen0029-CaMV35S-201D1的根癌农杆菌LBA4404的悬浮培养物感染20分钟。悬浮培养培养基包含100μM乙酰丁香酮。将过量的悬浮培养物通过用无菌滤纸印迹干燥去除，并转移至包含MS培养基与2，4-D(1.0mg/l)和激动素(5.0mg/l)+乙酰丁香酮(100μM)的共培养培养基。在25℃±2℃下在黑暗中共培养48小时之后，将外植体用无菌蒸馏水和含有300mg/l奥格门汀的水溶液洗涤。将共培养的外植体用无菌滤纸印迹干燥，并在包含含有2，4-D(1.0mg/l)和激动素(5.0mg/l)+卡那霉素(50mg/l)+奥格门汀(300mg/l)的MS培养基的选择培养基上培养。将外植体在相同培养基上每两周传代培养，直到愈伤组织出现。收集愈伤组织并在MS培养基+卡那霉素(50mg/l)+奥格门汀(300mg/l)上传代培养。每21天在相同培养基上传代培养增殖的愈伤组织。鉴定胚性愈伤组织，并在含有另外的KNO₃(1.9g/l)+奥格门汀(300mg/l)的MS培养基上传代培养以获得体细胞胚胎。将从胚性愈伤组织出现的体细胞胚进一步在MS培养基+奥格门汀(300mg/l)上传代培养。将胚胎与粘附的愈伤组织一起置于位于培养基上的滤纸上。然后将发育的体细胞胚胎转移到含有半强度MS培养基的玻璃瓶。体细胞胚胎正常生长并在14至25天内变成小植物。将小植物小心地从组织培养瓶中取出并在含有沙砾(soilrite)的小塑料盆中硬化并在28±2℃下维持7至8天。随后将小植株转移到温室(图2)。

棉花转化和再生领域的技术人员将理解其它方法可用于棉花转化、再生。对于转化植物的选择，也可以使用其它植物可表达的选择标记基因。

实施例5(B)用201D1 DNA序列(SEQ ID NO：2)转化的推定转基因棉花植物的分子分析

(i)基因组DNA分离

从实施例5(A)获得的推定转基因棉花植物和Coker 310的对照非转基因植物的叶组织提取总基因组DNA。从推定的转基因棉花植物和非转基因棉花植物收集叶，并用300μl提取缓冲液(1M tris-HCL，pH 7.5，1M NaCl，200mM EDTA和10％SDS)使用QIAGENTissueLyser II(Retsch)匀化，并以12000rpm离心10分钟。将上清液转移到无菌微量离心管。向上清液添加氯仿-异戊醇(24：1)并以12000rpm离心10分钟。将水层转移到微量离心管。向其中添加等体积的冰冷异丙醇并在-20℃下保持20分钟。然后弃去上清液并向沉淀添加300μl乙醇。以10000rpm离心5分钟之后弃去上清液，并将DNA沉淀风干15分钟，并随后溶于40μl0.1X TE缓冲液(Tris-pH 8.0：10.0mM和EDTA-pH 8.0：1.0mM)中。使用Nanodrop

分光光度计(Thermo Scientific，USA)通过测量260nm处的OD来评估基因组DNA的品质和量。另外，通过用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳来评估DNA的完整性。

(ii)PCR分析

对推定的转基因棉花植物和非转基因对照棉花植物的基因组DNA(100ng)进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以用于使用如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示的引物分析合成的cry2Ai-201D1 DNA和使用如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物分析nptII基因。

PCR条件

94℃进行5分钟：1个循环

94℃进行45秒

58℃至62℃进行45秒，30个循环

72℃进行45秒

72℃进行10分钟：1个循环

发现所有推定的转基因棉花植物对具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的cry2Ai-201D1 DNA(1500bp)和nptII基因(698bp)呈阳性。

(iii)Southern杂交

选择所有PCR阳性棉花植物进行southern杂交。将ELISA阳性T₀转基因棉花植物的基因组DNA(各5μg)用NcoI或XbaI或BamHI限制性酶消化，并使用经[α-32P]-dCTP标记的201D1 DNA探针进行Southern印迹杂交。

将PCR和ELISA阳性转基因棉花植物和非转基因棉花植物的基因组DNA用NcoI限制性酶在37℃下消化16小时。将质粒DNA pGreen0029-CaMV35S-201D1用作阳性对照。将经消化的基因组DNA样品和质粒DNA在0.8％琼脂糖凝胶中在20V下在1X TAE缓冲液中分离(resolve)过夜，在UV透照器下溴化乙锭染色后显现并记录在凝胶记录系统(SYNGENE)中。

将经限制性消化和电泳分离的基因组DNA通过将凝胶浸没在两体积的变性溶液中30分钟并轻轻搅拌而变性。将凝胶通过浸没在两体积的中和溶液中30分钟并轻轻搅拌来中和。在无菌去离子水中短暂洗涤凝胶，并按照标准方案将DNA通过在20X SSC缓冲液中通过向上毛细管转移16小时转移到带正电荷的尼龙膜(Sigma)。在基因组DNA完全转移之后，将尼龙膜在2X SSC缓冲液中短暂洗涤并风干5分钟。通过将膜在UV交联剂(UV

1800 Stratagene，CA，USA)中在1100μJ下暴露1分钟来交联DNA。将经交联的膜密封在塑料袋中并保持在4℃直到用于Southern印迹杂交。

·变性溶液：

NaCl：1M

NaOH：0.5N

·中和溶液：

NaCl：1.5M

Tris：0.5M

·20X SSC：

NaCl：3.0M

柠檬酸钠：0.3M

pH：7.0与浓HCl

可以如下稀释20x SSC溶液：

最终SSC浓度	20x SSC溶液	蒸馏水或去离子水
			3x SSC	30ml	170ml
2x SSC	20ml	180ml
			1x SSC	10ml	190ml
0.5x SSC	5ml	195ml

探针的制备

将从载体扩增并使用凝胶提取小量制备试剂盒(Bio Basic Inc.，Canada)纯化的约100ng的1500bp的201D1 DNA片段用[α-32P]-dCTP放射性标记用作标记探针。

探针标记：将4μl经PCR扩增和纯化的用作标记的模板DNA。在微量离心管中将模板DNA与10μl随机引物(DecaLabel DNA标记试剂盒，Thermo Fisher Scientific Inc.USA)混合。用无菌蒸馏水使体积达到40μl，并通过在沸水浴上加热5分钟变性，并在冰上冷却。向变性DNA添加5μl含有dATP、dGTP、dTTP的标记混合物，5μl[α-32P]-dCTP(50μCi)和1μl DNA聚合酶I的Klenow片段，并在37℃水浴中孵育10分钟。添加1μl 0.5M EDTA终止反应，并在沸水浴中孵育4分钟，并转移到冰上4至5分钟。

预杂交和探针杂交

将如上所述的DNA交联膜轻轻放入含有30ml杂交缓冲溶液的杂交瓶中。将瓶紧密封闭并置于65℃的烘箱中45分钟至1小时以用于预杂交处理。

将杂交缓冲液从瓶中倒出并用含有经变性的[α-32P]-dCTP标记的DNA探针的30ml杂交溶液(维持在65℃)替换。将装有杂交溶液的瓶紧密封闭并置于65℃的烘箱中16小时。

·杂交溶液：

Na2HPO4，pH 7.2：0.5M

SDS：7％(w/v)

EDTA，pH 7.2：1mM

从瓶中倒出杂交缓冲液。添加约洗涤I溶液并将瓶置于烘箱中缓慢旋转的平台上在65℃下10分钟。10分钟之后，将洗涤I溶液用30ml洗涤II溶液替代，并在65℃下孵育5至10分钟同时轻轻搅拌。然后倒掉洗涤II溶液，并使用Gregor-Muller计数器检查膜中的放射性计数。根据计数，向瓶添加30ml洗涤III，并在65℃下孵育30秒至1分钟同时轻轻搅拌。随后去除洗涤III溶液，并将膜在Whatman 1号滤纸上在室温下干燥5至10分钟，并在暗室中在信号增强器屏(来自Amersham，USA的Hyper

)中在-80℃下暴露于X射线胶片(KodakXAR)2天。

暴露2天之后，在暗室中取出X射线胶片并浸入显影剂溶液中1分钟，随后浸入水中1分钟。最后将X射线胶片浸入定影剂溶液中2分钟，然后在水中清洗1至2分钟并随后风干。

·洗涤溶液

洗涤I：3X SSC+0.1％SDS

洗涤II：0.5X SSC+0.1％SDS

洗涤III：0.1X SSC+0.1％SDS

·显影剂溶液：

将13.2g Pack A内容物溶解在800ml蒸馏水中，在完全溶解之后添加89g Pack B组分并通过缓慢搅拌溶解。在完全溶解之后，使体积达到1000ml并储存在琥珀色瓶中。

·定影剂溶液：

通过缓慢搅拌将268g定影剂溶解在800ml蒸馏水中，在完全溶解之后，使体积达到1000ml，通过country滤纸过滤并储存在琥珀色瓶中。

所有PCR阳性转基因棉花植物显示不同大小的杂交信号，表明转基因整合到棉花基因组中。一些转基因棉花植物显示201D1 DNA序列整合到单个基因座(201D1 DNA的单拷贝)中，而少数转基因棉花植物显示201D1DNA序列整合到多个基因座中。在阳性对照中也观察到杂交信号，而非转基因棉花植物不显示任何杂交信号。

随后选择具有单拷贝转基因(SEQ ID NO：2-201D1)DNA的转基因棉花植物(T0)用于进一步的实验工作。使T0植物的种子生长以获得T1至T4代后代。

a.实施例6通过ELISA对推定的转基因棉花(T0)植物的生物化学分析

使用EnviroLogix Quantiplate试剂盒(EnviroLogix Inc.，USA)根据制造商的说明书进行夹心ELISA，以用于定量估计推定的转基因PCR阳性(201D1 DNA序列-SEQ ID NO1)棉花植物中的Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)。使用与试剂盒一起提供的阳性和阴性对照作为参照。将来自推定的转基因棉花植物的第二片真叶用于该实验。将约30mg叶组织在500μl提取缓冲液中匀化，并在4℃下以6,000rpm离心7分钟，并将上清液用于测定。将上清液(100μl)加载到经抗Cry2Ai蛋白抗体预包被的板中。用石蜡膜覆盖板，并在室温(24℃±2)下孵育15分钟。向每个孔中添加酶缀合物(100μl)。在1小时之后，用1X洗涤缓冲液彻底洗涤孔。向每个孔中添加底物(100μl)并孵育30分钟。通过添加终止溶液(0.1N盐酸)终止反应。使用阴性对照作为空白在450nm下读取板的光密度(Optical density，O.D.)。每个样品复制两次并且每个孔被认为是复制。

绘制不同浓度校准物(与试剂盒一起提供)的光密度之间的图。Cry2Ai蛋白(SEQID NO：1)的浓度通过绘制其O.D.值相对于图上相应的浓度水平来确定。如下所述计算浓度。

样品中存在的Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的量以微克/克新鲜叶组织表示。在通过Cry2Ai定量ELISA试剂盒筛选的15个PCR阳性棉花事件(T0)中，发现所有事件在新嫩转基因棉花叶组织中Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)的表达均为阳性。

汇总于表1中的ELISA结果的检查揭示了令人惊讶且出乎意料的观察结果，即携带包含201D1 DNA的构建体的大多数转基因棉花植物在不同代的营养阶段期间表达10μg/g至20μg/g新鲜叶组织范围内的Cry2Ai蛋白(SEQ ID NO：1)，并且在转基因植物的更多代中所述蛋白的表达令人惊讶地稳定，其在各代(T1至T4)间不显示显著变化。而发现Cry1Ac蛋白的表达在不同代的营养阶段期间为5μg/g至10μg/g新鲜叶组织，并且表达在各代(T1至T4)间不显示显著变化。因此，与现有技术相比，编码Cry2Ai蛋白的经密码子优化的合成DNA序列显示出在转基因植物中蛋白表达的显著增强。

表1：转基因棉花植物的比较ELISA分析

尽管出于清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但是显而易见的是，可以在本公开内容的范围内实践某些改变和修改。

序列表

<110> DCM SHRIRAM LIMITED

<120> 编码杀虫晶体蛋白的合成核苷酸序列及其用途

<130> PD034766IN-SC

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 633

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry2Ai蛋白的氨基酸序列 (NCBI GenBank:

ACV97158.1)

<400> 1

Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Asn Ile Thr Cys His Ala His

1 5 10 15

Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Ile Glu Lys Glu Trp Lys Glu Trp Lys Arg Thr Asp His Ser Leu

35 40 45

Tyr Val Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Gly Ser Phe Leu Leu Lys Lys

50 55 60

Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Gln Asn Leu

65 70 75 80

Ile Phe Pro Ser Gly Ser Ile Asp Leu Met Gln Glu Ile Leu Arg Ala

85 90 95

Thr Glu Gln Phe Ile Asn Gln Arg Leu Asn Ala Asp Thr Leu Gly Arg

100 105 110

Val Asn Ala Glu Leu Ala Gly Leu Gln Ala Asn Val Ala Glu Phe Asn

115 120 125

Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Gln Asn Pro Val Pro Leu

130 135 140

Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Arg

145 150 155 160

Leu Pro Gln Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu

165 170 175

Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile

180 185 190

Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Val Arg Thr Tyr

195 200 205

Arg Asp His Leu Arg Asn Phe Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile

210 215 220

Asn Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp

225 230 235 240

Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met Val Ser Ser Gly

260 265 270

Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe

275 280 285

Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser

290 295 300

Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Thr Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ser Leu Asn

325 330 335

Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser Gly Leu Ile Gly

340 345 350

Ala Thr Asn Leu Asn His Asn Phe Asn Cys Ser Thr Val Leu Pro Pro

355 360 365

Leu Ser Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Thr Asp Arg

370 375 380

Glu Gly Val Ala Thr Ser Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Gln Thr

385 390 395 400

Thr Leu Ser Leu Arg Cys Gly Ala Phe Ser Ala Arg Gly Asn Ser Asn

405 410 415

Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val

420 425 430

Ile Arg Asn Glu Asp Leu Thr Arg Pro Leu His Tyr Asn Gln Ile Arg

435 440 445

Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Leu

450 455 460

Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile Tyr Ala Ala Asn Glu Tyr

465 470 475 480

Gly Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile

485 490 495

Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Ser

515 520 525

Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn

530 535 540

Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr

545 550 555 560

Ile Asn Gly Arg Ala Tyr Thr Val Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn

565 570 575

Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile

580 585 590

Gly Asn Ile Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Thr Leu Asp Ile Asn

595 600 605

Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Pro Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Phe

610 615 620

Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

625 630

<210> 2

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 201D1

<400> 2

tctagaccat ggggatccat gaataatgtt cttaactctg gaaggaatat tacctgccat 60

gcacataatg ttgttgcaca tgacccattc agttttgaac ataagagtct aaacactata 120

gaaaaagagt ggaaggagtg gaaaaggaca gatcattctc tatacgtagc tccaatcgtg 180

gggactgtgg gttcttttct attaaagaag gtaggttcct tagtgggtaa gagaatactg 240

tctgaacttc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300

cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360

gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta acaggcaagt ggataacttt 420

ttaaacccta accaaaatcc agtcccactt gctattattg attccgtcaa cacattacag 480

cagttattcc tttcacgact gcctcaattc caaatccagg ggtatcaact cctactattg 540

ccgctattcg ctcaagccgc taacttgcac ctgagtttta tcagagatgt tattttgaat 600

gcagacgaat gggggatttc agccgcaact gtgagaactt atagagatca tctacgtaac 660

tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggcttg 720

aacactaggc ttcacgatat gcttgagttt aggacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780

tatgttagta tttggtcact atttaagtat caatccctta tggtatcctc tggagcaaac 840

ctatacgcct ccggttcagg cccccaacaa acccaatcct ttacagcaca gaactggcca 900

tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960

agactttcta ttacattccc caatatagga ggactcccag gttcaacaac aactcattca 1020

ttgaacagtg caagggttaa ctattctggc ggagtcagtt caggtcttat tggcgcaaca 1080

aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccac cgttaagcac accattcgta 1140

aggagttggt tagactcagg gacagataga gaaggagtcg caacatcaac gaattggcag 1200

actgagtctt tccaaacaac tctttcactt aggtgtggag cctttagcgc tagggggaac 1260

agcaactatt ttcctgacta ctttataaga aacatatcag gtgtcccatt ggttattagg 1320

aacgaggatt taacaaggcc cctacattac aaccagataa gaaatattga gtcaccgtcc 1380

ggtactccag gtggtgctag ggcttattta gtgagcgtgc ataataggaa gaataacatt 1440

tacgccgcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500

accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560

aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620

acccttcgtg gcaacggaaa tagctacaat ttgtatctcc gtgcttcatc tatcgggaac 1680

tcaactattc gtgttacaat caatggtaga gcatacaccg ttagtaatgt aaatacaact 1740

actaacaatg atggcgtaaa tgataatgga gcaaggttca gcgacataaa catagggaac 1800

attgtcgcaa gtgacaacac taacgttacc ttggatataa atgttacatt aaactccggc 1860

actccttttg acttgatgaa tattatgttc gtaccaacta atctcccacc gctgtatccc 1920

gggtgagaat tcaagcttga gctc 1944

<210> 3

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 201D2

<400> 3

tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ttgaattctg gaagaaatat tacttgtcat 60

gctcataatg ttgttgctca tgatcctttt tcttttgaac ataagtcttt gaatactatt 120

gaaaaggaat ggaaggaatg gaagagaact gatcattctt tgtatgttgc tcctattgtt 180

ggaactgttg gatctttttt gttgaagaag gttggatctt tggttggaaa gagaattttg 240

tctgaattgc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300

cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360

gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta acaggcaagt ggataacttt 420

ttaaacccta accaaaatcc agtcccactt gctattattg attctgtcaa cacattacag 480

cagttattcc tttcaagact gcctcaattc caaatccagg ggtatcaact cctactattg 540

ccgctattcg ctcaagctgc taacttgcac ctgagtttta tcagagatgt tattttgaat 600

gcagacgaat gggggatttc agctgcaact gtgagaactt atagagatca tctacgtaac 660

tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggattg 720

aacactaggc ttcacgatat gcttgagttt aggacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780

tatgttagta tttggtcact atttaagtat caatctctta tggtatcttc tggagcaaac 840

ctatacgctt ctggttcagg acctcaacaa acccaatctt ttacagcaca gaactggcca 900

tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960

agactttcta ttacattccc taatatagga ggactcccag gttcaacaac aactcattca 1020

ttgaacagtg caagggttaa ctattctgga ggagtcagtt caggtcttat tggagcaaca 1080

aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccac cgttaagcac accattcgta 1140

aggagttggt tagactcagg gacagataga gaaggagtcg caacatcaac gaattggcag 1200

actgagtctt tccaaacaac tctttcactt aggtgtggag cttttagcgc tagggggaac 1260

agcaactatt ttcctgacta ctttataaga aacatatcag gtgtcccatt ggttattagg 1320

aacgaggatt taacaaggcc tctacattac aaccagataa gaaatattga gtcaccgtct 1380

ggtactccag gtggtgctag ggcttattta gtgagcgtgc ataataggaa gaataacatt 1440

tacgctgcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500

accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560

aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620

acccttcgtg gaaatggaaa ttcttataat ttgtatttga gagcttcttc tattggaaat 1680

tctactatta gagttactat taatggaaga gcttatactg tttctaatgt taatactact 1740

actaataatg atggagttaa tgataatgga gctagatttt ctgatattaa tattggaaat 1800

attgttgctt ctgataatac taatgttact ttggatatta atgttacttt gaattctgga 1860

actccttttg atttgatgaa tattatgttt gttcctacta atttgcctcc tttgtatcct 1920

ggataagaat tcaagcttga gctc 1944

<210> 4

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 201D3

<400> 4

tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ttaaactctg gtcgtaacat tacatgtcat 60

gcacataacg tagtagcaca tgatccattc tctttcgaac ataaatcttt aaacacaatt 120

gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgtaca gatcattctt tatacgtagc accaattgta 180

ggtacagtag gttctttctt attaaaaaaa gtaggttctt tagtaggtaa acgtatttta 240

tctgaattac aaaacttaat tttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300

cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360

gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta accgtcaagt agataacttt 420

ttaaacccta accaaaatcc agtaccactt gctattattg attctgtaaa cacattacaa 480

caattattcc tttcacgttt acctcaattc caaatccaag gttatcaatt actactatta 540

ccactattcg ctcaagcagc taacttacac ttaagtttta tccgtgatgt tattttaaat 600

gcagacgaat ggggtatttc agcagcaact gtacgtactt atcgtgatca tctacgtaac 660

tttacacgtg attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tcgtggctta 720

aacactcgtc ttcacgatat gcttgagttt cgtacataca tgtttttaaa cgttttcgag 780

tatgttagta tttggtcact atttaagtat caatctctta tggtatcttc tggagcaaac 840

ctatacgcat ctggttcagg cccacaacaa acacaatctt ttacagcaca aaactggcca 900

tttttatatt cattatttca agtaaactct aattacattt tatcaggtat tagcggtaca 960

cgtctttcta ttacattccc aaatattgga ggattaccag gttcaacaac aactcattca 1020

ttaaacagtg cacgtgttaa ctattctggc ggagtaagtt caggtcttat tggcgcaaca 1080

aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaaca gtattaccac cattaagcac accattcgta 1140

cgtagttggt tagactcagg tacagatcgt gaaggagtag caacatcaac gaattggcaa 1200

actgagtctt tccaaacaac tctttcactt cgttgtggag catttagcgc tcgtggtaac 1260

agcaactatt ttcctgacta ctttattcgt aacatttcag gtgtaccatt agttattcgt 1320

aacgaggatt taacacgtcc actacattac aaccaaattc gtaatattga gtcaccatct 1380

ggtactccag gtggtgctcg tgcttattta gtaagcgtac ataatcgtaa gaataacatt 1440

tacgcagcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500

accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560

aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620

acccttcgtg gtaacggtaa ctcttacaac ttatacttac gtgcatcttc tattggtaac 1680

tctacaattc gtgtaacaat taacggtcgt gcatacacag tatctaacgt aaacacaaca 1740

acaaacaacg atggtgtaaa cgataacggt gcacgtttct ctgatattaa cattggtaac 1800

attgtagcat ctgataacac aaacgtaaca ttagatatta acgtaacatt aaactctggt 1860

acaccattcg atttaatgaa cattatgttc gtaccaacaa acttaccacc attataccca 1920

ggttaagaat tcaagcttga gctc 1944

<210> 5

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 201D4

<400> 5

tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ctgaacagcg gccgcaacat cacgtgccat 60

gcccataacg tcgtcgccca tgacccgttt agctttgaac ataaaagcct gaacacgatc 120

gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgcacg gaccatagcc tgtatgtcgc cccgatcgtc 180

ggcacggtcg gcagctttct gctgaaaaaa gtcggcagcc tggtcggcaa acgcatcctg 240

agcgaacttc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300

cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360

gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta acaggcaagt ggataacttt 420

ttaaacccta accaaaatcc ggtcccgctt gctattattg attccgtcaa cacattacag 480

cagttattcc tttcacgcct gcctcaattc caaatccagg ggtatcaact cctgctgttg 540

ccgctgttcg ctcaagccgc taacttgcac ctgagcttta tcagagatgt tattttgaat 600

gcagacgaat gggggatttc agccgcaacg gtgagaacgt atagagatca tctgcgcaac 660

tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggcttg 720

aacacgaggc ttcacgatat gcttgagttt aggacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780

tatgttagca tttggtcact gtttaagtat caatccctta tggtatcctc tggagcaaac 840

ctgtacgcct ccggttcagg cccgcaacaa acccaatcct ttacagcaca gaactggccg 900

tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960

agactttcta ttacattccc gaatatcgga ggactcccgg gttcaacaac aacgcattca 1020

ttgaacagcg caagggttaa ctattctggc ggagtcagct caggtcttat tggcgcaaca 1080

aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccgc cgttaagcac accgttcgta 1140

aggagctggt tagactcagg gacagataga gaaggagtcg caacatcaac gaattggcag 1200

acggagtctt tccaaacaac gctttcactt aggtgtggag cctttagcgc tagggggaac 1260

agcaactatt ttcctgacta ctttatcaga aacatctcag gtgtcccgtt ggttattagg 1320

aacgaggatt taacaaggcc gctgcattac aaccagatca gaaatattga gtcaccgtcc 1380

ggtacgccgg gtggtgctag ggcttattta gtgagcgtgc ataataggaa gaataacatt 1440

tacgccgcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500

accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560

aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620

acccttcgtg gcaacggcaa cagctataac ctgtatctgc gcgccagcag catcggcaac 1680

agcacgatcc gcgtcacgat caacggccgc gcctatacgg tcagcaacgt caacacgacg 1740

acgaacaacg acggcgtcaa cgacaacggc gcccgcttta gcgacatcaa catcggcaac 1800

atcgtcgcca gcgacaacac gaacgtcacg ctggacatca acgtcacgct gaacagcggc 1860

acgccgtttg acctgatgaa catcatgttt gtcccgacga acctgccgcc gctgtatccg 1920

ggctaagaat tcaagcttga gctc 1944

<210> 6

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 201D5

<400> 6

tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ctgaactctg gtcgtaacat cacttgtcac 60

gctcacaacg tagtagctca cgatccgttc tctttcgaac acaaatctct gaacactatc 120

gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgtact gatcactctc tgtacgtagc tccgatcgta 180

ggtactgtag gttctttcct gctgaaaaaa gtaggttctc tggtaggtaa acgtatcctg 240

tctgaactgc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300

cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360

gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta accgtcaagt ggataacttt 420

ttaaacccta accaaaatcc ggtaccgctt gctattattg attctgtaaa cacattacag 480

cagttattcc tttcacgtct gcctcaattc caaatccagg gttatcaact cctgctgttg 540

ccgctgttcg ctcaagccgc taacttgcac ctgagtttta tcagagatgt tattttgaat 600

gcagacgaat ggggtatttc agccgcaact gtgagaactt atagagatca tctgcgtaac 660

tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggcttg 720

aacactcgtc ttcacgatat gcttgagttt cgtacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780

tatgttagta tttggtcact gtttaagtat caatctctta tggtatcttc tggagcaaac 840

ctgtacgcct ctggttcagg cccccaacaa acccaatctt ttacagcaca gaactggccg 900

tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960

agactttcta ttacattccc caatatcgga ggactcccgg gttcaacaac aactcattca 1020

ttgaacagtg cacgtgttaa ctattctggc ggagtaagtt caggtcttat tggcgcaaca 1080

aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccgc cgttaagcac accgttcgta 1140

cgtagttggt tagactcagg tacagataga gaaggagtag caacatcaac taattggcag 1200

actgagtctt tccaaacaac tctttcactt cgttgtggag cctttagcgc tcgtggtaac 1260

agcaactatt ttcctgacta ctttatcaga aacatctcag gtgtaccgtt ggttattcgt 1320

aacgaggatt taacacgtcc cctgcattac aaccagatca gaaatattga gtcaccgtct 1380

ggtactccgg gtggtgctcg tgcttattta gtgagcgtgc ataatcgtaa gaataacatt 1440

tacgccgcaa acgaatatgg aactatgatc catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500

accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560

aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620

acccttcgtg gtaacggtaa ctcttacaac ctgtacctgc gtgcttcttc tatcggtaac 1680

tctactatcc gtgtaactat caacggtcgt gcttacactg tatctaacgt aaacactact 1740

actaacaacg atggtgtaaa cgataacggt gctcgtttct ctgatatcaa catcggtaac 1800

atcgtagctt ctgataacac taacgtaact ctggatatca acgtaactct gaactctggt 1860

actccgttcg atctgatgaa catcatgttc gtaccgacta acctgccgcc gctgtacccg 1920

ggttaagaat tcaagcttga gctc 1944

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 是用于扩增 201D1 DNA 序列 (SEQ ID NO: 2)的正向引物序列

<400> 7

ctccaatcgt ggggactgtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 是用于扩增 201D1 DNA 序列 (SEQ ID NO: 2)的反向引物序列

<400> 8

cccgatagat gaagcacgga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 是用于 nptii dna 基因扩增的正向引物序列

<400> 9

acgaggaagc ggtcagccca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 是用于 nptII DNA 基因扩增的反向引物序列

<400> 10

ttgcacgcag gttctccggc 20

Claims

1.经密码子优化的合成核苷酸序列，其编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质，其中所述核苷酸序列选自：(a)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；(b)与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和(b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.核酸分子，其包含用于在植物中表达的经密码子优化的序列，所述经密码子优化的序列选自：(a)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；(b)与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第262至402位和/或第1471至1631位核苷酸的至少10个核苷酸特异性杂交的核苷酸序列；以及(c)与(a)和b)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中与根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

4.重组DNA，其包含根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与异源调节元件有效地连接。

5.根据权利要求4所述的重组DNA，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含选择标记基因、报道基因或其组合。

6.根据权利要求4所述的重组DNA，其中所述经密码子优化的合成核苷酸序列任选地包含编码用于靶向液泡、线粒体、叶绿体、质体或用于分泌的靶向或转运肽的DNA序列。

7.用于在植物中表达杀虫蛋白的DNA构建体，所述DNA构建体包含5’非翻译序列、编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的杀虫Cry2Ai蛋白或其杀虫部分的编码序列以及3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列包含在植物细胞中发挥功能的启动子，所述编码序列是根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列，并且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多腺苷酸化信号。

8.质粒载体，其包含根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列。

9.宿主细胞，其包含根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物、细菌、病毒、真菌或酵母细胞。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞是农杆菌(Agrobacterium)或大肠杆菌(E.coli)。

12.用于在植物中赋予昆虫抗性的方法，其包括：

(a)将根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列插入到植物细胞中，其中所述核苷酸序列与(i)在植物细胞中发挥功能的启动子和(ii)终止子有效地连接；

(b)由步骤(a)的所述植物细胞获得经转化的植物细胞，其中所述经转化的植物细胞包含权利要求1的所述经密码子优化的合成核苷酸序列；以及

(c)由步骤(b)的所述经转化的植物细胞产生转基因植物，其中所述转基因植物包含权利要求1的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

13.通过根据权利要求12所述的方法获得的转基因植物。

14.转基因植物，其包含根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列。

15.根据权利要求13或14所述的转基因植物，其中所述植物选自稻、小麦、玉米、高粱、燕麦、粟、豆科作物、棉花、番茄、茄子、甘蓝、花椰菜、西兰花、芸薹属、豆类、豌豆、木豆、马铃薯、胡椒、葫芦、莴苣、甘薯芥花籽、大豆、苜蓿、花生、向日葵、红花、烟草、甘蔗、木薯、咖啡、菠萝、柑橘、可可、茶、香蕉和瓜。

16.从根据权利要求13或14所述的转基因植物获得的组织、种子或后代，其中所述种子或后代包含根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列。

17.来源于根据权利要求16所述的组织或种子或后代的生物样品，其中所述样品包含可检出量的根据权利要求1的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

18.来源于根据权利要求13或14所述的转基因植物的商品产品，其中所述产品包含可检出量的根据权利要求1的所述经密码子优化的合成核苷酸序列。

19.组合物，其包含含有根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，所述核苷酸序列编码具有根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的Cry2Ai蛋白。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述组合物任选地包含与所述杀虫蛋白针对相同害虫有毒但表现出不同的杀虫活性模式的另外的杀虫剂。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述杀虫剂选自芽孢杆菌(Bacillus)毒素、致病杆菌(Xenorhabdus)毒素、发光杆菌(Photorhabdus)毒素和对抑制所述害虫中一种或更多种必需基因具有特异性的dsRNA。

22.在作物植物中控制昆虫侵袭并提供昆虫抗性管理的方法，其中所述方法包括使所述作物植物与杀虫有效量的根据权利要求19所述的组合物接触。

23.根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生昆虫抗性转基因植物的用途。

24.根据权利要求1所述的经密码子优化的合成核苷酸序列用于产生杀虫组合物的用途，其中所述组合物包含含有所述核苷酸序列的苏云金芽孢杆菌细胞。