CN101255432A

CN101255432A - 人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用

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Publication number: CN101255432A
Application number: CNA2008100654772A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 陈文华; 杨年松; 王君丹; 江辉松
Original assignee: BIOCENTURY TRANSGENE Co Ltd
Current assignee: BIOCENTURY TRANSGENE (CHINA) CO LTD
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2028-03-03
Also published as: WO2009109123A1; CN101255432B

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种杀虫基因及其编码的蛋白质与应用。本发明利用棉花优化密码子设计合成了CmCry2Aa杀虫蛋白基因并进一步获得了编码蛋白质N端缺失29个氨基酸的Cm1Cry2Aa杀虫蛋白基因，并分别构建了植物表达载体。转基因烟草鉴定结果表明CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫基因对棉铃虫具有极显著的抗性。

Description

人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种人工改造合成的杀虫基因以及其构建的植物表达载体及其在抗虫转基因植物研制方面的应用。

背景技术

植物生长过程中易遭受虫害，每年因虫害造成的农作物损失量十分巨大。为防治植物虫害发生，需大量喷施农药，长期大量使用化学农药，可导致害虫抗药性增强，并且会大量杀伤其天敌，生态失衡，步入恶性循环。利用基因工程手段使植物获得抗虫性，目前已被广泛采用，用于植物抗虫基因工程的基因主要包括：(1)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)基因：如Cry1Ac，Cry1F，Cry2Ab等；(2)蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors，PIS)基因：如豇豆(Vigna sinensis)胰蛋白酶抑制剂(cowpea trysin inhibitor，CpTI)基因CpTI等；(3)淀粉酶抑制剂(amylase inhibitor，AI)基因：如菜豆(Phaseolusvulgaris)α-淀粉酶抑制剂基因α-αi等；(4)植物外源凝集素(lectin)类基因：如雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis aggulutinin，GNA)基因gna等；(5)昆虫特异性神经毒素(neurotoxin)基因：如蝎毒素基因Bank I T₄等。在生产上利用最成功的基因主要有：Bt杀虫晶体蛋白基因和CpTI基因。其中应用最广泛的是Bt杀虫晶体蛋白基因，即苏云金芽孢杆菌(Bt)内毒素晶体蛋白基因，克隆于苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌(Bt)是1901年发现的一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌，已知其是可产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的多种伴孢结晶蛋白质。这种杀虫蛋白质已经发现了五十多大类，三百多种。Bt杀虫蛋白在昆虫消化道内消化酶的作用下，蛋白被水解，释放出约60～70kDa抗蛋白酶的活性毒素分子。活性毒素分子可与肠道上皮细胞纹缘膜上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔。消化道上皮细胞的离子、渗透压平衡遭到破坏，最终导致昆虫死亡。由于其杀虫的专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。自80年代后期以来，许多实验室已将Bt杀虫基因导入到不同植物组织的细胞中，并已在被转化的细胞和植物中表达了这种来源与微生物的杀虫基因，使转基因植物具有抗虫性。

不同种类Bt杀虫蛋白杀虫谱可能不同，目前人们已经发现了对鳞翅目、鞘翅目、双翅目据有毒性的杀晶体蛋白的大小及性状也不同。在1995年无脊椎病理学会(Society for Invertebrate Pathology，SIP)年会上专门成立了由Crickmore等人组成的Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会，提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系，将杀虫基因分为17类，36亚类(Crickmore et al.1995)，2008年增补为54类，101亚类(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中Cry2Aα对棉铃虫、红铃虫、玉米螟、烟芽夜蛾、粉纹夜蛾、黎豆夜蛾、稻纵卷叶螟、大豆夜蛾、热带家蚊等害虫均具有杀虫效果。

由于遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，如果直接将昆虫的基因直接转化至植物中，在一定程度上会影响其蛋白的表达，利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子合成基因，可以增加蛋白表达量。

另外Bt杀虫晶体蛋白的N端小段氨基酸残基在毒蛋白活化过程中被切除是杀虫活性所必须的。

发明内容

为提高转基因植物的抗虫性，本发明的目的在于提供一种在植物中能高效表达的杀虫基因。

一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比，5’端在起始密码子后少84个碱基。

所述核苷酸序列采用了植物偏爱性密码子。

所述核苷酸序列采用了棉花偏爱性密码子。

本发明的第二个目的在于提供一种含有上述人工改造合成的杀虫基因并可在植物中表达该杀虫基因编码的杀虫蛋白质。

一种人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质CmCry2Aa杀虫蛋白，由SEQ IDNO：1所示杀虫基因编码，具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，由633个氨基酸残基组成。

一种人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质Cm1Cry2Aa杀虫蛋白，由SEQ IDNO：2所示杀虫基因编码，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，由605个氨基酸残基组成，Cm1Cry2Aa杀虫蛋白与CmCry2Aa杀虫蛋白相比N端缺失28个氨基酸，二者都具有杀虫活性。

一种含有上述人工改造合成的杀虫基因的植物表达载体。

用含有上述人工改造合成的杀虫基因植物表达载体转化的具有杀虫能力的植物细胞。

用含有上述人工改造合成的杀虫基因植物表达载体转化的植物组织、器官及植株。

本发明的第三个目的在于提供人工改造合成的杀虫基因在培育抗虫植物品种中的应用，尤其是在培育抗虫棉花中的应用。

本发明利用棉花优化密码子合成了CmCry2Aa以及Cm1Cry2Aa杀虫蛋白基因，并分别构建了植物表达载体。转基因烟草鉴定结果表明所设计合成的CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫基因对棉铃虫具有极显著的抗性，缺失Bt杀虫蛋白的N端氨基酸可简化杀虫蛋白质的活化，在保持其杀虫活性的同时，扩大其杀虫谱。

附图说明

图1是CmCry2AaD1-pGEM质粒图谱；

图2是CmCry2AaD2-pUC57质粒图谱；

图3是CmCry2AaD3-pUC57质粒图谱；

图4是CmCry2AaD2.D3-pUC57质粒图谱；

图5是CmCry2Aa-pUC57质粒图谱；

图6是CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa的构建流程图；

图7是CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa PCR扩增鉴定图；

图8是CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa酶切鉴定图；

图9是质粒M1-BAR-35S-CmCry2Aa转化烟草抗虫性鉴定图；

图10是CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的构建流程图；

图11是CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的酶切鉴定图；

图12是Cm1Cry2Aa-pMD18质粒图谱；

图13a、b是Cm1Cry2Aa植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa的构建流程图；

图14是质粒M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa转化烟草抗虫性鉴定图；

图15是CmCry2Aa基因原核表达载体CmCry2Aa-pET30a的构建流程图；

图16是CmCry2Aa基因原核表达载体CmCryAa-pET30a酶切鉴定图；

图17是Cm1Cry2Aa基因原核表达载体Cm1Cry2Aa-pET30a的构建流程图；

图18是Cm1Cry2Aa基因原核表达载体Cm1Cry2Aa-pET30a酶切鉴定图；

图19是CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫蛋白的原核表达的蛋白电泳图；

图20是获得转基因棉花植株的情况说明。

具体实施方式

主要试剂配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，PH：7.0～7.2，固体培养基加1.5％琼脂粉

抗生素：Kan(卡那霉素)50mg/ml，Chl(氯霉素)34mg/ml

1M Tris-Hcl(PH6.8)：121.2gTris溶于1L水中，用浓盐酸调节PH值到6.8，高压灭菌

1.5M Tris-Hcl(PH8.8)：181.7g Tris溶于1L中，用浓盐酸调节PH值到8.8，高压灭菌

30％Acrylamide：丙烯酰铵290g、N，N-亚甲双丙烯酰铵10g定容到1L超纯水中

0.1mol/l IPTG：0.25g的IPTG溶解于10mL的ddH2O中

1M DTT：3.09gDTT溶于20ML的0.01M醋酸钠(PH5.2)中，分装成小份-20℃保存

10％过硫酸铵：1g过硫酸铵加水定容至10ml，分装成小份-20℃保存

1×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液：50mmol/lTris-HCL(PH6.8)、2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油、100mmol/lDTT(临用时加)

5×Tris-Glycine Buffer：Tris 15.1g、Glycine 94g SDS 5.0g定容到1L水中

考马斯亮蓝染色液：0.1％考马斯亮蓝R-250、25％异丙醇、10％冰醋酸定容到1L水中

考马斯亮蓝脱色液：100ml醋酸、50ml乙醇定容到1L水中

实施例1 Cm Cry2Aa杀虫基因的合成

1.根据Cry2Aa杀虫蛋白的氨基酸序列，根据棉花密码子用法，分结构域分别设计合成了构建CmCry2Aa杀虫基因的3个基因片段。基因合成委托北京奥科公司完成。

根据设计，合成的CmCry2Aa杀虫基因的密码子用法如下：

注：上表中各密码子所编码氨基酸符号后的三个数字分别表示：密码子数量/在蛋白中的出现频率(‰)/密码子用法(％)

结构域I(Domain I)DI基因片段：BamHI-ATG-DI-ApaI，其具体序列如：SEQNO ID：5所示。

结构域II(DomainII)DII基因片段：ApaI-DII-SspI，其具体序列如：SEQ NO ID：6所示。

结构域III(DomainIII)DIII基因片段：XbaI-HpaI-DIII-SacI，其具体序列如：SEQ NO ID：7所示。

CmCry2Aa杀虫基因的三个结构域基因编码片段D1、D2、D3人工合成后，分别克隆到载体pGEM和pUC57中，质粒分别命名为：CmCry2AaD1-pGEM，质粒图谱如图1所示；CmCry2AaD2-pUC57，质粒图谱如图2所示和CmCry2AaD3-pUC57，质粒图谱如图3所示。

2.CmCry2Aa杀虫基因的克隆拼接

首先将CmCry2AaD3-pUC57中的HpaI-D3-SacI片段克隆到CmCry2AaD2-pUC57中的SspI和SacI位点之间，一平端一粘端连接，构建得到载体质粒CmCry2AaD2.D3-pUC57，质粒图谱如图4所示，然后将CmCry2AaD1-pGEM中的SphI-ApaI D1片段克隆到该载体中，得到质粒CmCry2Aa-pUC57，质粒图谱如图5所示，完成CFM CmCry2Aa杀虫基因的拼接，Cm Cry2Aa杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。与天然的Cry2Aa(genebank登陆号AY496458：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝45685585)基因对应部分的核苷酸序列对比，其同源性为75.97％。其编码蛋白质氨基酸序列的同源性为99.95％。

实施例2 CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa的构建

带有完整CmCry2Aa杀虫基因的质粒CmCry2Aa-pUC57，进一步按照如图6所述程序构建植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa。植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa构建过程中筛选鉴定的PCR鉴定结果及酶切鉴定结果分别如图7和图8所示，图7中1、2和3泳道代表以1、2和3号克隆子为模板扩增出了目标条带，“+”代表以质粒M1-BAR-35S-CmCry2Aa为模板扩增出目标条带(阳性对照)，“-”代表以水为模板未扩增出目标条带(阴性对照)；图8中1泳道为限制性内切酶Xba I+SacI切质粒M1-BAR-Tnos-Gus，切下GUS，大约1.8Kbp左右，2，3，4，5和6泳道为限制性内切酶XbaI+SacI切1，2，3，5，6克隆子，切下来35S+CmCry2Aa，大约2.7Kbp左右。结果表明1、2、3号克隆均为正确克隆。

实施例3 转CmCry2Aa杀虫基因烟草获得

采用农杆菌介导叶盘法转化烟草(本领域科研人员周知的方法)，经PPT生根筛选，获得抗性植株46株，提取抗性烟草叶片总DNA，进行PCR鉴定，筛选出27株阳性植株，并进行抗棉铃虫饲虫试验，每叶接5头初孵幼虫，三天后结果如图9所示，1为未转CFM CmCry2Aa杀虫基因烟草叶片，2、3和4分别为转化CmCry2Aa杀虫基因烟草叶片，结果表明所合成CmCry2Aa杀虫基因抗棉铃虫效果非常突出。经调查，棉铃虫平均校正死亡率93.3％。

实施例4 NptII为选择标记的CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的构建

鉴于CmCry2Aa杀虫基因具有理想的棉铃虫毒杀效果，进一步进行了棉花的农杆菌转化。由于原CmCry2Aa植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa中选择标记基因Bar不利于棉花的农杆菌转化体系(草丁膦对棉花细胞的再生分化有抑制作用)，设计了克隆路线，获得NptII为选择标记基因的CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa，从pBI121通过PCR获得的NptII基因经克隆后经测序验证，确信所扩增NptII基因核苷酸序列正确。整个克隆流程如图10。

最终载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa经酶切鉴定，结果如图11所示，1，2泳道为EcoRI切M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的克隆子7，22的结果，能切下1.7Kbp左右的带，阳性；3泳道为EcoR I切Pnos-NPTII-Tnos-PBS作为阳性对照，切下1.7Kbp左右的带；4，5泳道为NcoI+KpnI切M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的克隆子7，22的结果，能切下1.4Kbp左右的带，为阳性；6，7泳道为Pst I切M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa的克隆子7，22的结果，能切下3Kbp左右的带，阳性；证明所构建以NptII为选择标记基因的CmCry2Aa植物表达载体完全正确。

实施例5 Cm1Cry2Aa杀虫基因的克隆及植物表达载体的构建及其功能鉴定

(1)Cm1Cry2Aa杀虫基因的克隆

根据CmCry2Aa杀虫蛋白的分子结构，杀虫基因N端存在长度为29个氨基酸的Coli结构片段，位于结构域1 α-螺旋1的前端。根据杀虫蛋白结构功能关系，该氨基酸序列为原毒素活化时需要被昆虫消化道胰蛋白酶水解去除。经DNAman软件分析，在第29、30氨基酸之间的确存在胰蛋白酶识别切割位点。

如果杀虫蛋白进入昆虫消化道后如不能切除该段多肽，杀虫活性降低。因此，设计突变引物，将CmCry2Aa的5’端28个氨基酸去除，使表达出的蛋白直接为活性蛋白，对于扩大杀虫谱(昆虫不能正确活化原毒素时)和提高杀虫效率有利(活化效率不是100％时)。将其命名为Cm1Cry2Aa。Cm1Cry2Aa 5端引物加BamHI位点，3端引物加SacI位点，以便下一步的克隆。所设计的引物如下：

引物1 2Aa5：5′-G GGATCC ATGTCTTTGGACACTATCCA-3′

引物22Aa3：5′-GAGCTCTTAGTACAAGGGT-3′

以质粒CmCry2Aa-pUC57为模板，扩增出的目的条带为1820bp。将扩增出的Cm1Cry2Aa克隆到pMD18-T上，命名为：Cm1Cry2Aa-pMD18，其质粒图谱如图12所示。

(2)Cm1Cry2Aa植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa的构建

为在植物中验证Cm1Cry2Aa的杀虫功能，设计构建以NptII为选择标记基因的Cm1Cry2Aa植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa，构建流程如图13a和b所示。

(3)Cm1Cry2Aa在烟草中的抗棉铃虫鉴定

采用农杆菌介导叶盘法转化烟草(本领域科研人员周知的方法)，经卡那霉素生根筛选，获得抗性植株25株，提取抗性烟草叶片总DNA，进行PCR鉴定，筛选出22株阳性植株，并进行抗棉铃虫饲虫试验，每叶接5头初孵幼虫，三天后部分结果如图14所示，1、2为未转Cm1Cry2Aa杀虫基因烟草叶片(对照试验)，3和4分别为转化CFM CmCry2Aa杀虫基因烟草叶片，结果表明所合成Cm1Cry2Aa杀虫基因抗棉铃虫效果与CmCry2Aa杀虫基因基本相当。经调查，棉铃虫平均校正死亡率87.7％。统计学分析表明差异不显著，与设计的预期结果一致。

实施例6 CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫基因原核表达载体的构建及原核表达

(1)CmCry2Aa基因原核表达载体CmCry2Aa-pET30a的构建

CmCry2Aa基因原核表达载体CmCry2Aa-pET30a的构建流程如图15所示，其酶切鉴定结果如图16所示，“B+S”表示BamH I+SacI切1号CmCry2Aa-pET30阳性克隆子质粒，能切下完整的CmCry2Aa，1.9K bp左右，大小符合；“+”表示BamH I+SacI切CmCry2Aa-pUC57质粒做为正对照，也能切下完整的CmCry2Aa，1.9K bp左右，大小符合；“B”BgII单酶双切CmCry2Aa-pET30的阳性克隆子质粒，能切下1.3Kbp左右的带，大小符合，可见此构建正确。

(2)Cm1Cry2Aa基因原核表达载体Cm1Cry2Aa-pET30a的构建

Cm1Cry2Aa基因原核表达载体Cm1Cry2Aa-pET30a的构建流程如图17所示，其酶切鉴定结果如图18所示，1，DNA Ladder；2，BamH I+SacI切4号Cm1Cry2Aa-pET30a阳性克隆子质粒，能切下完整的Cm1Cry2Aa，1.8K bp左右，大小符合；3，BamH I+SacI切1号Cm1Cry2Aa-pET30a阳性克隆子质粒，能切下完整的Cm1Cry2Aa，1.8K bp左右，大小符合(载体酶切不充分)；4，KpnI切4号Cm1Cry2Aa-pET30a阳性克隆子质粒，能切下1.78K bp左右基因片段，大小符合；5，KpnI切1号Cm1Cry2Aa-pET30a阳性克隆子质粒，能切下1.78K bp左右的基因片段，大小符合。可见此构建正确。

(3)CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa基因的原核表达

制备感受态大肠杆菌细胞：在LB培养基平板上活化E.coli Rosetta(DE3)菌株，挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃摇菌过夜，取此菌液500μl加入到100mlLB液体培养基中，37℃培养2～2.5hr，有大量絮状菌体出现时，冰浴15min，4℃、6000r/m离心5min，弃上清，加入1/5体积预冷的氯化钙，重悬菌体，4℃、6000r/m离心5min，再加1/3体积的氯化钙，重悬菌体，冰浴30min，4℃、6000r/m离心5min，弃上清，吸干，加入1/25体积氯化钙重悬菌体，以100μl菌液分装，-70℃保存。

分别将空原核表达载体pET30a(+)、CmCry2Aa-pET30a及Cm1Cry2Aa-pET30a原核表达载体转入菌株E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，具体方法为：从-70℃冰箱中拿出E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上把10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，再在42℃水浴中热激90sec，迅速再冰浴2min，再加入350μlLB空白液体培养基，37℃下摇动培养40min，再将此管菌体全部加入到含有50μg/ml Kan的固体培养基中，均匀涂布平板，待液体完全被吸收后，37℃倒置培养12～16小时。

挑取单菌落接种到含有50μg/ml Kan和34μg/ml Chl抗生素的5mL液体培养基中37℃过夜培养，取100μl接种到含有50μg/ml Kan和34μg/ml Chl抗生素的10mL液体培养基中，37℃培养2hr左右，OD600≈0.6时加入IPTG至终浓度1mmol/l，37℃下诱导表达。诱导表达4hr后，各取1mL菌液，10000r/m离心5min，收集菌体，加入100μl含有100mmol/lDTT的1×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液重悬，取40μl在100℃煮5min，取20μl上样，进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE分析法参考《分子克隆》，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为10％，先以80v电压电泳，待溴酚蓝指示剂进入到分离胶后，加大电压到110v，大约1hr30min待指示剂移动到胶底部时，结束电泳，用考马斯亮蓝染色液染色过夜，再用脱色液脱色直至蛋白条带清晰为止。

图19为CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa基因的原核表达SDS-PAGE电泳结果，1和2分别为经大肠杆菌表达的Cm1Cry2Aa蛋白及CmCry2Aa蛋白，可见大小在约66kD附近，Cm1Cry2Aa目的蛋白较CmCry2Aa蛋白略小(pET30a载体上HIS·Tag基因150bp，编码50个氨基酸)；3为转化pET30a空载体的阴性对照试验；5为蛋白质Marker。

实施例7 利用CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫基因植物表达载体获得转基因棉花

分别通过花粉管通道法和农杆菌介导法将CmCry2Aa或Cm1Cry2Aa杀虫基因植物表达载体转化棉花，均获得了转基因棉花。

花粉管通道法导入是利用微量注射器将DNA溶液注入棉花受精子房，并收获种子进行筛选鉴定而获得转基因棉花。具体操作程序为：

1)选择次日将开放的花蕾进行自交，并用毛绳标记；

2)在开花后20～24h左右，即开花次日，选择果枝和花位较好的幼子房作为导入对象，摘除或剥去花瓣，抹平花柱，使用50μL微量进样器作为微注射工具，一般用右手持微量注射器，左手轻扶摘除花瓣后的幼子房，从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度的约三分之二处，并后退至约三分之一处，轻轻操作微量注射器，将DNA溶液推入受精子房中。每朵花注射基因片段浓度为0.01μg/μl，每朵花注射5μl；

3)在铃柄基部涂抹40ppm的赤霉素溶液，以减轻幼铃脱落；

4)挂牌标记已经转基因的棉花幼铃；

5)收获种子，田间密植，根据选择标记基因种类进行筛选鉴定，获得转基因棉花植株。

农杆菌介导法是本领域科研人员熟知的植物遗传转化方法。具体操作程序为：

1.菌株培养

将所构建的杀虫基因植物表达载体电激转化到农杆菌菌株LBA4404中，农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)25mg/L的LB或YEB液体培养基中。28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4～6h，将菌液稀释至OD600值0.3～0.35。

2.无菌苗制备

(1)棉花种子用硫酸(H₂SO₄)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇对种子进行表面消毒1min，再用10％～15％过氧化氢(H₂O₂)处理2～4h，用无菌水冲洗2～3次；

(2)在无菌水中浸泡18～24h，待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS+琼脂6g/L，pH 6.8)中；

(3)25℃～28℃光培养3～5d时备用。

3.棉花外植体与农杆菌的共培养

取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入稀释好的菌液中5～10min，然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2.4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L，pH5.0，表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22℃～25℃共培养2天。

4.诱导愈伤组织及抗性愈伤组织的筛选

(1)愈伤组织的诱导

经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+MgCl₂ 0.91g/L+Gelrite 2.0g/L+Km 50～100mg/L+Cef 500mg/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)，在常规条件下(25℃)培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。

(2)抗性愈伤组织的检测

无菌条件下挑取愈伤组织少许进行选择标记基因nptII的ELISA检测或报告基因gus的检测，检测结果为阳性的愈伤组织继续继代，非阳性的愈伤组织淘汰。通过对nptII或gus基因表达的检测，获得棉花抗性愈伤组织的频率为50％～76％。

5.愈伤组织的增殖继代

诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl₂ 0.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L，pH 5.8)中，常规条件下(25℃)培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。

6.愈伤组织的分化及转基因苗移栽

愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH₄ ⁺、且KNO₃加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天门冬酰胺0.5g/L+MgCl₂0.91～1.35g/L+Gelrite 2.0～3.0g/L+葡萄糖20～30g/L，pH 5.8)，进一步分化成胚状体，胚状体长成为小植株后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉株根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足营养液。栽好的再生棉苗放入控温22℃、控湿80～85％的人工培养箱中5～7d，再在温室中培养10～20d后移栽到土盆或大田中。

利用上述方法，分别将CmCry2Aa及Cm1Cry2Aa杀虫基因植物表达载体导入棉花中获得了转基因棉花。图20为获得转基因棉花植株的情况说明，1为利用花粉管通道法将M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa载体转化棉花后，利用1000ppm卡那霉素在温室筛选转基因植株的情况；2为非转基因植株叶片卡那霉素处理后变黄；3为筛选获得的转基因植株，叶片经卡那霉素处理后不变色；4为非转基因植株叶片50ppm草丁磷处理后萎缩受害情况；5为利用花粉管通道法将CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-BAR-35S-CmCry2Aa转化棉花后，筛选到的转基因植株，利用50ppm草丁磷处理后叶片不受害。6为利用农杆菌介导法将CmCry2Aa杀虫基因植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-CmCry2Aa转入棉花后获得的尚未移栽的抗卡那霉素转基因棉花植株。

SEQUENCE LISTING

<110>创世纪转基因技术有限公司

<120>人工改造合成的杀虫基因及其编码的蛋白质与应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1902

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgaataacg ttcttaattc tggtagaact accatttgtg atgcttataa cgtggttgca 60

catgatcctt tctcatttga acacaagtct ttggacacta tccaaaagga gtggatggaa 120

tggaaaagga cagatcattc actttatgtt gctcctgtgg ttggaactgt ctcttccttc 180

ttgcttaaga aagttggttc tcttattgga aagaggatct tgtcagaact ttggggtatt 240

atctttcctt ctggttcaac caatcttatg caagacattc ttagagagac tgaacagttc 300

ttgaaccaaa ggttgaatac agatactctt gctagagtta acgctgaact tattggattg 360

caagccaata ttagagagtt caatcagcaa gttgataact ttcttaatcc tactcaaaac 420

ccagttcctc ttagcattac ttcttcagtg aatacaatgc agcaactttt cttgaacaga 480

cttcctcaat tccagatcca aggttatcag cttttgctcc ttccattgtt tgctcaagca 540

gctaatatgc atctttcttt cattagggat gttattctta acgctgatga atggggtatt 600

tcagcagcta ctttgagaac ctatagagac tatcttagga attacacaag agactattct 660

aactattgca ttaatactta ccaaactgct ttcagaggat tgaacacaag acttcatgat 720

atgcttgagt tcaggactta catgtttctt aacgttttcg agtatgtttc catttggtct 780

cttttcaagt accaatcact tatggtttcc tctggtgcaa acttgtatgc ttcaggttct 840

ggtcctcagc aaactcaatc cttcacagct cagaattggc catttcttta cagcttgttc 900

caagttaact ctaattacat tctttcaggt atctctggaa ctagattgtc cattacattt 960

cccaatattg gtggtcttcc tggttctact accacacatt cattgaactc tgctagagtt 1020

aattactcag gcggtgtttc tagtgggctt attggtgcaa ctaaccttaa tcataacttc 1080

aattgttcta cagttcttcc acctttgtca actccctttg ttaggtcttg gcttgattca 1140

ggtacagata gagaaggtgt tgctacttct accaactggc aaactgaatc cttccagacc 1200

actttgtctc ttagatgtgg tgctttctca gctagaggaa actctaatta ctttcctgat 1260

tacttcatta gaaacatctc tggtgttcca cttgtgatta ggaacgaaga tcttactaga 1320

cctttgcatt ataatcaaat caggaacatt gaatcaccat ctggtactcc tggaggtgca 1380

agagcttatc ttgtttctgt gcataacagg aagaataata tctatgcagc taacgagaat 1440

ggtacaatga ttcatcttgc tcctgaagac tacactgggt tcactatttc tccaatccat 1500

gctacacaag ttaacaatca gaccagaact ttcatttctg agaagtttgg taatcaagga 1560

gattcactta gattcgaaca atctaacaca actgcaagat acacacttag agggaatggt 1620

aactcctaca acttgtatct tagggtttct agcattggta actctactat tagagttacc 1680

atcaatggaa gagtttacac tgtttctaac gtgaatacaa ctaccaataa cgatggtgtt 1740

aatgataacg gtgctaggtt ctcagatatc aatattggaa acattgttgc ttctgacaat 1800

actaacgtta cacttgatat caatgtgact cttaactcag gtactccttt tgatcttatg 1860

aatatcatgt tcgttcctac taaccttcct cccttgtact aa 1902

<210>2

<211>1818

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgtctttgg acactatcca aaaggagtgg atggaatgga aaaggacaga tcattcactt 60

tatgttgctc ctgtggttgg aactgtctct tccttcttgc ttaagaaagt tggttctctt 120

attggaaaga ggatcttgtc agaactttgg ggtattatct ttccttctgg ttcaaccaat 180

cttatgcaag acattcttag agagactgaa cagttcttga accaaaggtt gaatacagat 240

actcttgcta gagttaacgc tgaacttatt ggattgcaag ccaatattag agagttcaat 300

cagcaagttg ataactttct taatcctact caaaacccag ttcctcttag cattacttct 360

tcagtgaata caatgcagca acttttcttg aacagacttc ctcaattcca gatccaaggt 420

tatcagcttt tgctccttcc attgtttgct caagcagcta atatgcatct ttctttcatt 480

agggatgtta ttcttaacgc tgatgaatgg ggtatttcag cagctacttt gagaacctat 540

agagactatc ttaggaatta cacaagagac tattctaact attgcattaa tacttaccaa 600

actgctttca gaggattgaa cacaagactt catgatatgc ttgagttcag gacttacatg 660

tttcttaacg ttttcgagta tgtttccatt tggtctcttt tcaagtacca atcacttatg 720

gtttcctctg gtgcaaacttgtatgcttca ggttctggtc ctcagcaaac tcaatccttc 780

acagctcaga attggccatt tctttacagc ttgttccaag ttaactctaa ttacattctt 840

tcaggtatct ctggaactag attgtccatt acatttccca atattggtgg tcttcctggt 900

tctactacca cacattcatt gaactctgct agagttaatt actcaggcgg tgtttctagt 960

gggcttattg gtgcaactaa ccttaatcat aacttcaatt gttctacagt tcttccacct 1020

ttgtcaactc cctttgttag gtcttggctt gattcaggta cagatagaga aggtgttgct 1080

acttctacca actggcaaac tgaatccttc cagaccactt tgtctcttag atgtggtgct 1140

ttctcagcta gaggaaactc taattacttt cctgattact tcattagaaa catctctggt 1200

gttccacttg tgattaggaa cgaagatctt actagacctt tgcattataa tcaaatcagg 1260

aacattgaat caccatctgg tactcctgga ggtgcaagag cttatcttgt ttctgtgcat 1320

aacaggaaga ataatatcta tgcagctaac gagaatggta caatgattca tcttgctcct 1380

gaagactaca ctgggttcac tatttctcca atccatgcta cacaagttaa caatcagacc 1440

agaactttca tttctgagaa gtttggtaat caaggagatt cacttagatt cgaacaatct 1500

aacacaactg caagatacac acttagaggg aatggtaact cctacaactt gtatcttagg 1560

gtttctagca ttggtaactc tactattaga gttaccatca atggaagagt ttacactgtt 1620

tctaacgtga atacaactac caataacgat ggtgttaatg ataacggtgc taggttctca 1680

gatatcaata ttggaaacat tgttgcttct gacaatacta acgttacact tgatatcaat 1740

gtgactctta actcaggtac tccttttgat cttatgaata tcatgttcgt tcctactaac 1800

cttcctccct tgtactaa 1818

<210>3

<211>633

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu Asp

20 25 30

Thr Ile Gln Lys Glu Trp Met Glu Trp Lys Arg Thr Asp His Ser Leu

35 40 45

Tyr Val Ala Pro Val Val Gly Thr Val Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys

50 55 60

Val Gly Ser Leu Ile Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Trp Gly Ile

65 70 75 80

Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg Glu

85 90 95

Thr Glu Gln Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala Arg

100 105 110

Val Asn Ala Glu Leu Ile Gly Leu Gln Ala Asn Ile Arg Glu Phe Asn

115 120 125

Gln Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Thr Gln Asn Pro Val Pro Leu

130 135 140

Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn Arg

145 150 155 160

Leu Pro Gln Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu

165 170 175

Phe Ala Gln Ala Ala Asn Met His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile

180 185 190

Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr Tyr

195 200 205

Arg Asp Tyr Leu Arg Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile

210 215 220

Asn Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp

225 230 235 240

Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met Val Ser Ser Gly

260 265 270

Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe

275 280 285

Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser

290 295 300

Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Thr Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ser Leu Asn

325 330 335

Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser Gly Leu Ile Gly

340 345 350

Ala Thr Asn Leu Asn His Asn Phe Asn Cys Ser Thr Val Leu Pro Pro

355 360 365

Leu Ser Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Thr Asp Arg

370 375 380

Glu Gly Val Ala Thr Ser Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Gln Thr

385 390 395 400

Thr Leu Ser Leu Arg Cys Gly Ala Phe Ser Ala Arg Gly Asn Ser Asn

405 410 415

Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val

420 425 430

Ile Arg Asn Glu Asp Leu Thr Arg Pro Leu His Tyr Asn Gln Ile Arg

435 440 445

Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Leu

450 455 460

Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile Tyr Ala Ala Asn Glu Asn

465 470 475 480

Gly Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile

485 490 495

Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Ser

515 520 525

Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn

530 535 540

Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr

545 550 555 560

Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Val Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn

565 570 575

Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile

580 585 590

Gly Asn Ile Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Thr Leu Asp Ile Asn

595 600 605

Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Pro Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Phe

610 615 620

Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

625 630

<210>4

<211>605

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Ser Leu Asp Thr Ile Gln Lys Glu Trp Met Glu Trp Lys Arg Thr

1 5 10 15

Asp His Ser Leu Tyr Val Ala Pro Val Val Gly Thr Val Ser Ser Phe

20 25 30

Leu Leu Lys Lys Val Gly Ser Leu Ile Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu

35 40 45

Leu Trp Gly Ile Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp

50 55 60

Ile Leu Arg Glu Thr Glu Gln Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp

65 70 75 80

Thr Leu Ala Arg Val Asn Ala Glu Leu Ile Gly Leu Gln Ala Asn Ile

85 90 95

Arg Glu Phe Asn Gln Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Thr Gln Asn

100 105 110

Pro Val Pro Leu Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu

115 120 125

Phe Leu Asn Arg Leu Pro Gln Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gln Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gln Ala Ala Asn Met His Leu Ser Phe Ile

145 150 155 160

Arg Asp Val Ile Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr

165 170 175

Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Tyr Leu Arg Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser

180 185 190

Asn Tyr Cys Ile Asn Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Ala Leu Asn Thr

195 200 205

Arg Leu His Asp Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val

210 215 220

Phe Glu Tyr Val Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln

245 250 255

Thr Gln Ser Phe Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe

260 265 270

Gln Val Asn Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu

275 280 285

Ser Ile Thr Phe Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr

290 295 300

His Ser Leu Asn Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser

305 310 315 320

Gly Leu Ile Gly Ala Thr Asn Leu Asn His Asn Phe Asn Cys Ser Thr

325 330 335

Val Leu Pro Pro Leu Ser Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser

340 345 350

Gly Thr Asp Arg Glu Gly Val Ala Thr Ser Thr Asn Trp Gln Thr Glu

355 360 365

Ser Phe Gln Thr Thr Leu Ser Leu Arg Cys Gly Ala Phe Ser Ala Arg

370 375 380

Gly Asn Ser Asn Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly

385 390 395 400

Val Pro Leu Val Ile Arg Asn Glu Asp Leu Thr Arg Pro Leu His Tyr

405 410 415

Asn Gln Ile Arg Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala

420 425 430

Arg Ala Tyr Leu Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile Tyr Ala

435 440 445

Ala Asn Glu Asn Gly Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Tyr Thr

450 455 460

Gly Phe Thr Ile Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr

465 470 475 480

Arg Thr Phe Ile Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg

485 490 495

Phe Glu Gln Ser Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly

500 505 510

Asn Ser Tyr Asn Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr

515 520 525

Ile Arg Val Thr Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Val Ser Asn Val Asn

530 535 540

Thr Thr Thr Asn Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser

545 550 555 560

Asp Ile Asn Ile Gly Asn Ile Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Thr

565 570 575

Leu Asp Ile Asn Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Pro Phe Asp Leu Met

580 585 590

Asn Ile Met Phe Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

595 600 605

<210>5

<211>712

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaattcggat ccatgaataa cgttcttaat tctggtagaa ctaccatttg tgatgcttat 60

aacgtggttg cacatgatcc tttctcattt gaacacaagt ctttggacac tatccaaaag 120

gagtggatgg aatggaaaag gacagatcat tcactttatg ttgctcctgt ggttggaact 180

gtctcttcct tcttgcttaa gaaagttggt tctcttattg gaaagaggat cttgtcagaa 240

ctttggggta ttatctttcc ttctggttca accaatctta tgcaagacat tcttagagag 300

actgaacagt tcttgaacca aaggttgaat acagatactc ttgctagagt taacgctgaa 360

cttattggat tgcaagccaa tattagagag ttcaatcagc aagttgataa ctttcttaat 420

cctactcaaa acccagttcc tcttagcatt acttcttcag tgaatacaat gcagcaactt 480

ttcttgaaca gacttcctca attccagatc caaggttatc agcttttgct ccttccattg 540

tttgctcaag cagctaatat gcatctttct ttcattaggg atgttattct taacgctgat 600

gaatggggta tttcagcagc tactttgaga acctatagag actatcttag gaattacaca 660

agagactatt ctaactattg cattaatact taccaaactg ctttcagggc cc 712

<210>6

<211>725

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gggcccttaa cacaagactt catgatatgc ttgagttcag gacttacatg tttcttaacg 60

ttttcgagta tgtttccatt tggtctcttt tcaagtacca atcacttatg gtttcctctg 120

gtgcaaactt gtatgcttca ggttctggtc ctcagcaaac tcaatccttc acagctcaga 180

attggccatt tctttacagc ttgttccaag ttaactctaa ttacattctt tcaggtatct 240

ctggaactag attgtccatt acatttccca atatcggtgg tcttcctggt tctactacca 300

cacattcatt gaactctgct agagttaatt actcaggcgg tgtttctagt gggcttattg 360

gtgcaactaa ccttaatcat aacttcaatt gttctacagt tcttccacct ttgtcaactc 420

cctttgttag gtcttggctt gattcaggta cagatagaga aggtgttgct acttctacca 480

actggcaaac tgaatccttc cagaccactt tgtctcttag atgtggtgct ttctcagcta 540

gaggaaactc taattacttt cctgattact tcattagaaa catctctggt gttccacttg 600

tgattaggaa cgaagatctt actagacctt tgcattataa tcaaatcagg aacattgaat 660

caccatctgg tactcctgga ggtgcaagag cttatcttgt ttctgtgcat aacaggaaga 720

atatt

725

<210>7

<211>507

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tctagagtta acatctatgc agctaacgag aatggtacaa tgattcatct tgctcctgaa 60

gactacactg ggttcactat ttctccaatc catgctacac aagtgaacaa tcagaccaga 120

actttcattt ctgagaagtt tggtaatcaa ggagattcac ttagattcga acaatctaac 180

acaactgcaa gatacacact tagagggaat ggtaactcct acaacttgta tcttagggtt 240

tctagcattg gtaactctac tattagagtt accatcaatg gaagagttta cactgtttct 300

aacgtgaata caactaccaa taacgatggt gttaatgata acggtgctag gttctcagat 360

atcaatattg gaaacattgt tgcttctgac aatactaacg ttacacttga tatcaatgtg 420

actcttaact caggtactcc ttttgatctt atgaatatca tgttcgttcc tactaacctt 480

cctcccttgt actaagagct cgaattc 507

Claims

1、一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2、一种人工改造合成的杀虫基因，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3、根据权利要求1和2所述的人工改造合成的杀虫基因，其特征在于所述核苷酸序列采用了植物偏爱性密码子。

4、根据权利要求1和2所述的人工改造合成的杀虫基因，其特征在于所述核苷酸序列采用了棉花偏爱性密码子。

5、权利要求1所述的人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

6、权利要求2所述的人工改造合成的杀虫基因编码的蛋白质，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

7、含有权利要求1或2所述人工改造合成的杀虫基因的植物表达载体。

8、用权利要求7所述人工改造合成的杀虫基因植物表达载体转化的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株。

9、权利要求8所述的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株在培育抗虫植物品种中的应用。

10、根据权利要求9的具有杀虫能力的植物细胞、组织或植株在培育抗虫植物品种中的应用，其特征在于所述植物为棉花。