CN108699552B - 棉花事件n15-5以及用于其检测的引物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了棉花转化事件N15‑5及其检测引物和方法。携带N15‑5转化事件的棉花植物在D组7号染色体上包含所述事件，即，外源插入DNA序列和棉花基因组DNA序列的接合。利用外源插入DNA序列及其侧翼棉花基因组上接合区的DNA序列，可设计检测引物，用于针对N15‑5事件的特异性检测。

Description

棉花事件N15-5以及用于其检测的引物和方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域，特别是涉及具有棉铃虫抗性的棉花转化事件，以及检测该转化事件是否存在的特有方法。

背景技术

在世界范围内，虫害给农业生产带来了较大的损失。传统采用化学杀虫剂的防治技术，在传统农业实践中发挥了巨大的作用。但是，这种虫害防治技术存在很大的弊端，一方面，大量有毒化学农药的使用，不仅污染环境，而且易残留，严重威胁人们健康；另一方面，化学农药长期大量使用还能够造成害虫的抗药性，导致虫害的爆发。例如，上世纪90年代初，由于棉铃虫抗药性的发展，导致我国棉铃虫的大爆发，使我国各大棉区大幅度减产甚至绝产。

目前，转基因技术为解决虫害给棉花生产造成严重危害这一世界性难题提供了可行方案。人们也通过选择种植转基因抗虫作物防治某类虫害。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis,下文简称为Bt)是一种能形成芽孢的革兰氏阳性芽孢杆菌,已知其可产生对多种昆虫,如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质(Aronson,Microbiol.Rev.50:1-14,1968)。由于Bt毒素杀虫的专一性和高度选择性,对植物和包括人在内的动物没有毒害,而且对环境友好。因此,目前商业化应用的抗虫转基因农作物所使用的抗虫基因主要是Bt杀虫蛋白基因。

1995年，郭三堆等人采用植物优化密码子，人工合成了GFM cry1A杀虫基因(ZL95119563.8)，随后导入到数个中国主产棉区的主栽品种中，获得抗虫棉，并在1997年进行了产业化应用。孟山都公司获得的Mon531抗虫棉花转化事件在1996年进行了商业化；随后孟山都公司又获得的Mon15985双Bt抗虫棉花转化事件(ZL02802047.2)，也已经在美国、巴西和印度等多个国家全球进行了商业化。2008年，崔洪志等人改造合成了CmCry2Aa和Cm1Cry2Aa杀虫基因并在模式植物烟草中进行了功能验证(ZL200810065477.2)。

在19世纪末棉铃虫对化学杀虫剂产生了较强抗性的情况下，GFM cry1A抗虫棉(ZL95119563.8)的大面积推广应用，为我国植棉业发展发挥了非常关键的作用。但目前单价抗虫棉已经连续应用了近20年，吴益东和吴孔明研究团队发现，在存在有效天然庇护所情况下，中国华北棉区棉铃虫对GFM cry1A抗虫棉的抗性个体频率由2010年的0.93％上升到2013年的5.5％；表明由于抗虫棉的长期连续应用，中国棉铃虫抗性治理形势异常严峻(Yidong Wu,Large-scale test of the natural refuge strategy for delayinginsect resistance to transgenic Bt crops，Nature Biotechnology,15December2014)。为预防棉铃虫对第一代抗虫棉产生抗性，影响棉花生产，本领域迫切需求新型抗棉铃虫技术。

发明内容

本发明人通过转基因方法获得了一种高抗棉铃虫等鳞翅目昆虫的棉花植物转化事件，命名为N15-5。该植物转化事件棉花(Gossypium hirsutum)的代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，于2016年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所邮政编码：100101)，保藏编号为：CGMCC No.12267。

本发明第一方面提供了一种棉花转化事件N15-5，其特征在于其D组第七号染色体上的一段DNA序列如SEQ ID No：17所示，其由第707-16019bp的T-DNA插入序列、第1-706bp的上游侧翼棉花基因组序列和第16020-16806bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。

本发明第二方面提供了一个DNA序列，所述DNA序列至少包含部分或全部所述T-DNA插入序列和部分或全部所述侧翼棉花基因组序列。该特征DNA序列片段可通过本发明第三方面提供的方法进行检测。

本发明第三方面提供了一种用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件以及本发明第二方面所述特征DNA序列片段的引物对，其由特异性识别本发明第一方面所述的任一侧的侧翼序列的第一引物和特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物的序列为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21；或者所述第一引物的序列为SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25。

本发明第四方面提供了一种鉴定棉花生物样品中转化事件N15-5的方法，其包括:

(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；

(b)以提取的DNA样品为模板，使用本发明第三方面所述的引物对进行PCR扩增；

(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID NO：17上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中N15-5转化事件的存在。

本发明第五方面提供了一种获得转基因抗虫棉花材料的方法，包括：

将含有本发明第一方面所述棉花转化事件的棉花材料与其它棉花育种材料进行杂交后，优选进一步进行回交，获得含有本发明第一方面所述的转化事件的新材料；

在杂交或回交过程中，利用本发明第四方面所述的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。

本发明第六方面提供了本发明第一方面所述的转化事件、本发明第二方面所述的转化事件的特征DNA序列的片段、本发明第四和第五方面所述的方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行植物育种以及用作分子标记的用途。

本发明的这种抗虫棉新转化事件，可表达Cm1Cry2Aa杀虫蛋白，与现有GFM cry1A抗虫棉表达的杀虫蛋白具有非竞争性受体结合特性，可用于缓解棉铃虫产生抗性的风险以及进行抗性治理。

附图说明

图1示出了植物表达载体M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa的图谱。

图2示出了利用Southern杂交技术，Cm1Cry2Aa为探针对转化事件N15-5拷贝数进行检测的实验结果。图2a是利用3组T-DNA插入序列含有的酶切位点进行酶切的杂交图；图2b是利用2组T-DNA插入序列没有的酶切位点及1组T-DNA插入序列内部含有的酶切位点的杂交图。在图中：Marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1，M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa/EcoRI+HindIII；2，N15-5/EcoRI+HindIII；3，N15-5/SacI；4，N15-5/EcoRI；5，J14/SacI；6，J14/EcoRI；7，M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa/HindIII；8，N15-5/HindIII；9，N15-5/NdeI；10，N15-5/SpeI；11，J14/HindIII；12，J14/NdeI；13，J14/SpeI。

图3示出了利用Southern杂交技术，nptII为探针对转化事件N15-5拷贝数进行检测的实验结果。图3a是利用3组插入序列内部含有的酶切位点进行酶切的杂交图；图3b利用2组插入序列内部没有的酶切位点及1组插入序列内部含有的酶切位点的杂交图。在图中：Marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1，nptII阳性对照，2，N15-5/EcoRI；3，N15-5/SacI；4，N15-5/KpnI；5，J14/SacI。6，M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa/HindIII；7，N15-5/HindIII；8，N15-5/NdeI；9，N15-5/SpeI；10，J14/HindIII；11，J14/NdeI；12，M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa/EcoRI；13，N15-5/EcoRI；14，N15-5/NdeI；15，J14/EcoRI；16，J14/NdeI。

图4是左边界(LB)旁侧序列示意图。

图5是右边界(RB)旁侧序列示意图。

图6示出了以受体材料冀棉14DNA为模板，使用序列分别为SEQ ID No:15和SEQIDNo:16的引物对，扩增得到大小为600bp左右的扩增产物，测序后与N15-5的旁侧序列比对的结果。

图7是插入序列及旁侧序列示意图。

图8示出了利用引物对N15-5RBF1/N15-5RBR1分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带555bp左右。

图9示出了利用引物对N15-5RBF2/N15-5RBR2分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带1016bp左右。

图10示出了利用引物对N15-5RBF1/N15-5RBR2分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带856bp左右。

图11示出了利用引物对N15-5RBF2/N15-5RBR1分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带715bp左右。

图12示出了利用引物对N15-5LBF1/N15-5LBR1分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带464bp左右。

图13示出了利用引物对N15-5LBF2/N15-5LBR2分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH2O阳性扩增条带920bp左右。

图14示出了利用引物对N15-5LBF2/N15-5LBR1分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带880bp左右。

图15示出了利用引物对N15-5LBF1/N15-5LBR2分别扩增N15-5(T1)、N15-5(T2)、N15-5(T3)、冀棉14的棉花样品的结果。在图中：M，marker，λDNA/HindIII+EcoRI；1：N15-5-1，2：N15-5-2，3：N15-5-8，4：N15-5-8-1，5：N15-5-8-2，6：N15-5-8-3，7：N15-5-8-1-1，8：N15-5-8-1-2，9：N15-5-8-1-3，10：冀棉14-1，11：冀棉14-2，12：ddH₂O阳性扩增条带504bp左右。

图16示出了N15-5事件特征DNA序列及相关引物相对位置示意图。

具体实施方式

在本发明中，“转化事件”是指将外源目的基因通过农杆菌介导遗传转化方法(本领域技术人员公知)，转化到棉花细胞中，并进一步获得的转基因棉花植株中外源DNA序列在棉花基因组中的特定位置插入并整合的事件；本发明的优选棉花转化事件N15-5具有独特遗传信息的分子特征和外源抗虫基因表达规律，适合用于抗虫棉花的培育与应用。

本发明利用Cm1Cry2Aa杀虫基因(ZL200810065477.2)，进一步获得的一个Cm1Cry2Aa优选棉花转化事件N15-5。“转化事件”并不是一种植物细胞或植株，植物细胞或植株仅仅是转化事件存在的载体；转化事件的核心特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序列和特定棉花基因组序列连接的一段特征DNA序列，并且表现出特定的应用属性。尽管外源目的基因载体是同样的，但不同转化事件由于外源基因载体插入位置的不同而表现不同的遗传性状，这种差异来自两个方面，一方面是外源基因因插入的位置效应而具有不同的表达规律；另一方面外源基因的插入改变了受体植物基因结构而导致受体植物的遗传性状发生改变。通过转化事件专利对转基因农作物进行知识产权保护是目前国际上的一个新趋势，因为一个进入商业化的转化事件是发明人通过筛选鉴定而获得的生物类的独特创造，外源基因与受体作物基因组特定位置的整合，不仅使转化事件具备独特的分子特征，而且具有独特的外源基因表达规律，区别于研究过程中获得的其它转化事件，具有相比较更适合商业化应用的特征特性，因此具有明显的新颖性、实用性和创造性。目前，国际上已经有较多的转化事件获得了知识产权保护，均为一些跨国公司所拥有，部分在中国也申请了专利，例如前面提到过的ZL02802047.2专利。

实施例

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1.陆地棉(Gossypium hirsutum)的遗传转化：

在专利ZL200810065477.2(公开号CN 101255432A)专利说明书实施例5中，公开了Cm1Cry2Aa杀虫基因的克隆及植物表达载体的构建及其功能鉴定过程。本实施例中转化棉花所用的外源基因就是该专利所公开的Cm1Cry2Aa杀虫基因；所用的植物表达载体就是该专利所公开的M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa，其载体图见图1。其获得过程见专利ZL200810065477.2专利说明书相关内容。

利用农杆菌介导的遗传转化方法，用M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa载体转化冀棉14(获取于中国棉花研究所国家棉花中期库，统一编号：ZM-30270)下胚轴。

挑取含有M1-Pnos-NPTII-35S-Cm1Cry2Aa载体的农杆菌LBA4404(购自BiovectorScience Lab,Inc)，接种至含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)50mg/L及链霉素(streptomycin，S/Sm)50mg/L的LB液体培养基中，28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。以菌液：培养基1：50-1：100的比例用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4-6h，将菌液稀释至OD600值0.8-1.0。

将受体材料冀棉14种子发芽，取生长3-4天的无菌苗下胚轴，切成0.6-0.8cm的段，浸染10-15min，取出下胚轴段，置共培养培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.1mg/L)，22℃-25℃共培养2天。转至愈伤诱导培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.1mg/L+Kan50mg/L)20-30天继代一次，90天后转接至愈伤增殖培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.05mg/L+Kan50mg/L)，20-30天继代一次，待长出胚性愈伤后，将胚性愈伤继代至萌发培养基(MSB+KT 0.1mg/L+Kan50mg/L)，40天左右挑取萌发的绿芽至生根培养基(SH+Kan 50mg/L)进行筛选，进而获得小苗和可嫁接抗性植株114株。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得起始编号为“N”的转基因棉花共114株，存活98株。

实施例2.T₀代转基因棉花材料的筛选鉴定：

T₀代转基因棉花盆栽种植于温室中。通过苗期杀虫蛋白表达量检测以及抗虫性生物测定试验，分别对获得的98株T₀代转基因棉花进行了筛选鉴定，其中18株表现为不育，80株育性表现正常；通过苗期Elisa蛋白表达水平的检测(初步定量分析，未制作标准曲线，检测Cry2Aa杀虫蛋白的Elisa检测试剂盒购自印度Amar Immunodiagnostics公司)，表明在存活的98株T₀代转基因棉花中杀虫蛋白高表达的有79株(OD值>1.8)；中等水平表达的9株(1.0<OD值<1.8)；较低水平表达或不表达10株(OD值小于1.0)；通过室内棉铃虫抗性生物学测定，对N系列T0代抗虫棉进行了抗虫性测定。测定方法是取顶部展开叶片，置于培养皿中，叶柄基部用浸水脱脂棉球包裹，每皿接入12头人工饲养的初孵棉铃虫幼虫，5天后统计棉铃虫死亡及存活情况。表1列举了其中一次实验结果报告单，说明棉铃虫抗性生物学测定的记录方法。其中，“虫孔分布”列中“A”表示虫孔集中，“C”表示分散，通常集中的虫孔表明叶片对棉铃虫没有抗性，而分散的虫孔表明叶片对棉铃虫有抗性；“虫孔多少”列中“D”表示虫孔多，“S”表示少，“Js”表示极少。校正死亡率计算公式为：

通过16次室内抗虫性测定试验，完成了98株转基因棉花的抗虫性测定，筛选到对棉铃虫达到高抗级别6株(抗虫性测定结果中标注为“HR”)，抗性级别22株(抗虫性测定结果中标注为“R”)，抗性较差或抗性不稳定70株(抗虫性测定结果中标注为“N”)。筛选鉴定总体情况见下表2。

表1.室内棉铃虫抗性生物学测定报告单

试验编号：10036 接虫时间：2010.5.29

表2.N系列T0代抗虫棉植株Cm1Cry2Aa杀虫蛋白表达及抗虫性筛选鉴定汇总表

实施例3.转基因棉花田间实验的栽培管理

转基因棉花中间试验阶段的研究工作均在广东深圳龙岗坪地完成。因试验地点气候条件等差异，田间实验的栽培管理与主要植棉区有所差异，具体栽培管理方法如下。

1.育苗及移栽

5月中旬在温室育苗，从育苗到移栽15天左右。播种时插牌作好标记。播种前先将基质钵泡入水中至基质钵含水量达饱和，捞出基质钵放入相应尺寸的塑料育苗盘穴中，一穴对应一个钵。采用光籽播种，用筷子尖的一端在钵面上插两个小孔，孔距1厘米左右，孔深度0.8厘米左右，一孔播一粒，播种时种子尖的一端朝下，塞入小孔，播种深度以种子粗的一端平钵面为宜，接着盖土，盖土厚度控制在1.5-1.7厘米。盖土后喷施500倍的立枯灵稀释溶液防治立枯病等。然后将育苗盘置于盘床中，潮汐式灌水，水位高为育苗盘高的3/4为宜。一天后待育苗盘上的盖土湿润后放掉盘床里的水。出苗后如果棉苗出现轻度萎嫣即可灌水，方法同上。播种4-5天后棉苗出齐。叶面喷施(500倍立枯灵、1000倍氧乐果、500倍啶虫脒和1000倍吡虫啉)的混合溶液，防治立枯病、蚜虫、白粉虱和潜叶娥等。一周后继续用上述农药稀释液进行叶面喷施，移栽前一天用上述农药稀释液叶面喷施，防棉苗带虫带病进大田。

6月初棉苗长到3-4片真叶时移栽。5月底前完成整地开厢工作，2米开厢。棉苗移栽宽窄行排列，宽行1.1米，窄行1.0米，株距0.5米。移栽时盖土不能高于棉苗子叶节位置。

2.苗期(6月初-6月底)管理

移栽10天左右(6月中旬)施苗肥，复合肥30斤/亩，方法为挖窝穴施。棉苗移栽后常遇大雨，雨后及时扶苗清沟排积水。苗期虫害以叶蝉和甜菜叶娥为主，用药为混合溶液(500倍棉烟灵、1000倍氧乐果和500倍啶虫脒)，方法为喷施叶背面。棉苗长出7-9片真叶时，这些叶片的叶腋里会长出营养枝，这些营养枝长到2-3厘米时，及时搬掉，减少养分消耗。苗期搬芽一次。苗期除草以人工除草为主，一般2次。

3.蕾期(7月初-7月中下旬)管理

在试验所在地，夏季降雨量大，降雨频繁，水土流失严重，施在棉花地里的肥料易流失。所以蕾肥分成两次施，间隔15天左右。在7月初留第一台果枝后施初蕾肥，复合肥60斤/亩，有机肥600斤/亩。肥料施在厢面，然后在厢面中耕培土上厢结合施肥进行；7月中偏下旬棉株有6-7台果枝时施第二次蕾肥，复合肥50斤/亩，硼锌微肥4斤/亩，肥料撒在厢沟。

为防止试验棉花株型过高，用缩节胺进行控制。7月初，棉株有10-12片真叶时，亩用缩节胺0.8克，兑水15公斤，均匀喷施叶面，控大苗不控小苗。7月中旬棉株有6-7台时，亩用缩节胺1.2-1.5克，兑水15公斤叶面喷施，促进棉株稳健生长。6月底-7月初棉苗长出10-12片真叶，真叶叶腋里会长出果枝，开时现蕾，由于这些台果枝生长位置较低，长势较弱，加上天气潮湿多雨，果枝上花蕾发育差，易脱落，形成空枝。所以这3台果枝在平常情况下都搬掉。第4台果枝留为真正意义上的第一台果枝。进入蕾期过后，每隔15天左右，及时搬掉主茎叶或果枝叶叶腋里长出的赘芽。一般蕾期搬芽2-3次。

4.花铃期(7月底-9月初)管理

8月上旬棉株开花至4-5台时施花铃肥，尿素、钾肥各30斤，肥料撒施在第一次中耕的厢沟里。8月初棉花进入初花期(棉株有9-10台果枝)时，再次进行化控，亩用缩节胺2克，兑水15公斤。8月中旬偏下旬棉株打顶一周后，亩用缩节胺2.5克，兑水15公斤，均匀喷施叶面。在8月上中旬棉株长出15-16台果枝时，将主茎顶打顶。在花铃期每隔15天左右，及时搬掉主茎叶或果枝叶叶腋里长出的赘芽。花期搬芽2-3次。根据虫害发生情况酌情治虫。

5.吐絮期(9月初-10月底)管理

棉花进入吐絮期后，棉株开始进入衰退期，虫害发生较少了，基本不进行施肥和治虫，但还需做好整枝工作。吐絮期搬芽1-2次左右。待种子成熟后收获种子。

实施例4.转基因棉花抗虫遗传稳定性分析

选取N1-8、N15-5、N16-4、N20-1以及N34-4共5个优选棉花转化事件，对其自交后代进一步进行抗虫性鉴定。以受体棉花品种冀棉14为阴性对照，以编号为90938的第一代GFMCry1A抗虫棉材料为阳性对照。方法仍采用实施例2中的室内鉴定法。对T1代棉花株行，于4叶期选择顶部第二片真叶，以2000ppm卡那霉素溶液进行叶片涂抹筛选，保留卡那霉素处理7天后叶片不变色的植株，进行抗虫性鉴定并进一步自交收种。T2代种植多个株行，同样在田间进行卡那霉素鉴定，选择不分离纯合株行进行抗虫性鉴定。T1代和T2代抗虫鉴定实验汇总数据分别见下表3和表4。

表3优选Cm1Cry2Aa转基因棉花T1代株行抗虫鉴定

*除J14之外，进行抗虫鉴定的单株均为卡那霉素抗性单株。

表4 N15-5和N16-4T2代纯合株行抗虫鉴定

结果发现：通过对T1代和T2代抗卡那转基因植株的抗虫性鉴定，优选抗虫转化事件的抗虫性能够稳定遗传；其中N15-5转化事件的抗虫性最为理想。

实施例4.转基因棉花Cm1Cry2Aa杀虫蛋白表达含量分析

对转化事件N15-5、N16-4、N1-8、N34-4和N20-1的T2代阳性单株进行定量检测，每个转化事件取5个单株。分别于苗期(4-6叶期)、蕾期及花铃期取棉株顶部平展倒二叶，称取0.05g，液氮研磨后加1000μl蛋白提取缓冲液，混匀后离心沉淀，取上清原液或倍比稀释液，根据试剂盒说明书(购自印度Amar Immunodiagnostics Pvt Ltd)，利用双抗夹心ELISA法进行定量检测，过程如下：加入50μl抗原：12000r/min，4℃离心10min，吸取50μL于酶标孔(含有抗体的酶标板)中。同时加50μL酶标二抗。于室温反应40min。用洗板机洗板4次。每孔加入100μL显色底物，室温在摇床上摇20min至显色反应完成。显色完成后，每孔加入100μL终止液终止反应。用酶标仪在450nm吸光度下读取OD值。同时将Cry2A标准蛋白(购自Envirologix)配制成0.05至1.0ng/ml溶液与样品同时检测，制备标准曲线。根据标准曲线计算出每克叶子中1mCry2Aa蛋白含量。

对5个转化事件的检测结果发现，在三个时期转化事件N15-5中抗虫蛋白表达量均为最高，分别达8.91μg/g fwt、2.65μg/g fwt和2.01μg/g fwt，如下表。就本领域研究人员所周知，第一代抗虫棉GFM Cry1A杀虫蛋白在不同生育期叶片的表达量一般在0.5-2.0μg/gfwt。本发明N15-5转化事件的Cm1Cry2Aa杀虫蛋白表达量远远高于第一代抗虫棉GFM Cry1A杀虫蛋白的表达量。这是本发明N15-5转化事件应用价值的一个重要体现，可以通过高剂量降低靶标昆虫的抗性风险。

表5 N15-5等优选转化事件Cm1Cry2Aa杀虫蛋白表达量

实施例5.N15-5转化事件的转移及衍生棉花材料的抗虫性鉴定

通过常规育种技术的杂交方法，可以将N15-5抗虫转化事件转移到其它的棉花育种材料中，使普通的棉花育种材料获得抗虫新特性。后续可进一步进行连续回交(使用轮回亲本连续进行杂交)，获得农艺性状与回交亲本一致并含有该转化事件的抗虫棉新材料，进行育种应用。在杂交或回交过程中，利用前述的卡那霉素溶液涂抹叶片鉴定的方法或者本发明实施例8的检测方法(较前者更准确)在后代群体中进行筛选鉴定，确认该转化事件的存在。如发现转化事件丢失，则将之淘汰。

本实施例中列举了N15-5转化事件与LG6101、LG6036两个骨干育种资源材料杂交并继续回交的后代材料不同生长阶段的抗虫性鉴定汇总数据，见下表6和表7。证明N15-5转化事件的抗虫性状可以通过杂交的方式，转移到其他棉花育种资源材料中，无论是F1代杂交后代还是进一步的回交后代均高抗棉铃虫，且在不同发育阶段比较稳定。

株行材料编号说明：

N15-5与育种材料杂交后代编号格式为“A×B F₁-X”，其中“A”为杂交亲本中的母本材料，“B”为父本材料，“X”为株行编号。

回交后代编号格式为“A×B BC_nF₁-X”。“A”为F1代作为母本的棉花材料，“B”为F1代作父本的棉花材料，也就是回交亲本(或者称轮回亲本)；“BC”表示回交(Backcross)，“n”为回交代次；“X”为株行编号。

表6 N15-5与育种材料杂交1代株行的抗虫性鉴定

表7 N15-5与育种材料回交3代株系的抗虫性鉴定

*注：回交材料抗虫鉴定的单株均选择卡那抗性单株

需要特别指出的是杂交是实现N15-5转化事件向其他棉花受体材料转移的一种育种手段，回交是使抗虫新材料的农艺性状恢复到与受体棉花材料相一致的一种连续杂交方法。无论是哪种育种方法，通过有性杂交的方式将N15-5转化事件中特征DNA片段转移到受体棉花材料，并使受体材料获得与N15-5事件相似的抗虫性状，是实施本发明的重要途径。

实施例6.转化事件N15-5拷贝数检测

利用Southern杂交技术对转转化事件N15-5拷贝数进行检测。

样品制备：取转化事件N15-5T1代幼嫩植物组织4.0g左右，提取植物基因组DNA，具体步骤如下：于液氮中研磨成粉末状。在65℃水浴中预热提取缓冲液15ml，将研磨成均匀粉状后加入提取缓冲液中，振荡混匀，65℃水浴45min，期间摇匀2-3次，充分裂解。加入1/3体积5mol/L KAc上下颠倒混匀，冰浴约2-3h，4℃、12000rpm离心10min；取上清，加入1/5体积的5％CTAB Buffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min；待冷却置窒温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提3次，室温12000rpm离心5min，如界面浑浊再抽提一至两次；取上清，加入2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min，室温，12000rpm，离心10min；弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次。抽干沉淀，加500μl灭菌水溶解；加1/10体积RNase处理DNA样品，37℃30min；加1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min，4℃、12 000rpm离心5min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加适量ddH2O溶解，使用紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度，取80-100μg DNA分别用限制性内切酶消化过夜后酒精沉淀，用适量ddH2O溶解后加入0.8％琼脂糖凝胶中，以1V/cm电压电泳过夜。真空转移至尼龙膜上，紫外交联固定。

Cm1Cry2Aa探针制备：以含Cm1Cry2Aa基因的质粒为模板，以Cm1Cry2AaF和Cm1Cry2AaR引物(序列如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示)，利用PCR法制备地高锌标记的特异性探针，PCR体系如下：

PCR程序：94.0℃5min；30个循环:94.0℃30s，58.0℃30s，72.0℃1min 30s；72.0℃5min。

nptII探针制备：以含nptII基因的质粒为模板，以nptIIF和nptIIR引物(序列如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示)，利用PCR法制备地高锌标记的特异性探针，PCR体系如下：

PCR程序：94.0℃5min；30个循环:94.0℃30s，58.0℃30s，72.0℃30s；72.0℃5min。

杂交检测：将尼龙膜放入杂交管中，加一定体积的杂交液(10ml/100cm²)，65℃，预杂交3-4h；95℃变性DIG标记探针(25ng/ml)10min，迅速置于冰水中冷却10min彻底变；将变性探针迅速加到杂交管(3.5ml/100cm²膜)，混匀，65℃杂交过夜(>10h)。取出尼龙膜，进行洗膜。在室温下，30ml 2×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×5min。在50℃下，0.1×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×15min，将膜转入装有20ml洗涤缓冲液中振荡洗涤5min。在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1-5min；20-30ml封闭液中孵育30min；在10ml抗体液孵育30min；用20-30ml洗涤液洗涤2×15min；15ml检测液中平衡2-5min；现配20ml显色底物(NBT/BCIP)暗处静置显色；50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存。

检测结果如图2及图3如示，图2a及图3a表明了插入了两个T-DNA；图2b及图3b表明了T-DNA串联插入，插入为单一位点。结合旁侧序列分析结果，表明N15-5事件为单插入位点插入，由两个T-DNA串联插入。

实施例7.旁侧序列分析

样品制备：用本领域技术人员公知的植物DNA提取方法提取含有N15-5转化事件的棉花材料的基因组DNA，取2.5μg DNA，分别用EcoR I消化6-8小时，酒精沉淀纯化后加适量水溶解。

连接接头：根据载体酶切位点分析，分别设计合成两对接头：

GenomeWalker Adaptor+EcoR I，GenomeWalker Adaptor–EcoR I(序列如SEQ IDNo:5，SEQ ID No:6所示)，其中对SEQ ID No:5的5’端进行了磷酸化，3’端加氨基。

等量混合GenomeWalker Adaptor+EcoR I和GenomeWalker Adaptor–EcoR I，70℃保温10分钟，后缓慢降到室温。取4μl消化纯化的DNA加到含1.9μl GenomeWalker Adaptor(25μM)，1.6μl 10X连接缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶(6单位/μl)，在16℃下过夜连接，停止反应，在70℃下培养5min，在每个管中，加入72μl TE(10/1,pH7.5)，在低速下振荡5-10s。

使用Clontech GenomeWalker^TM Universal试剂盒方法，利用引物AP1和GSP1，(序列如SEQ ID No:7，SEQ ID No:8所示)，以连接产物为模板，进行第一轮扩增：7个循环:94℃25s,72℃4min；32个循环:94℃25s，67℃4min；最后一个循环后再于67℃保温7分钟。PCR产物稀释50倍后，用AP2和GSP2(序列如SEQ ID No:9，SEQ ID No:10所示)进行第二轮PCR扩增，PCR程序如下：5循环:94℃25s,72℃5min；20循环:94℃25s,67℃4min；最后一个循环后再于67℃保温10分钟。产物回收测序。

对N15-5事件的左边界(LB)端序列分析如图4所示，共获得985bp的核苷酸序列(序列如SEQ ID No:11所示)，包括1bp-198bp的LB与MAR之间的载体序列，第199bp-985bp为棉花序列。

SEQ ID No:11序列说明：

RB端序列分析，根据所获得的棉花侧翼序列，利用公布的二倍体棉花(Gossypiumraimondii)D染色体组基因组序列(http://www.phytozome.net/cotton.php)进行对比分析，设计下游引物N15-5RBC(SEQ ID NO:12)。以N15-5基因组DNA为模板，用N15-5RBC和2AaR(SEQ ID No:13所示)进行PCR扩增，PCR程序如下：35循环:94℃25s,68℃5min；最后一个循环后再于68℃保温10分钟。产物回收测序。

对N15-5事件的右边界(RB)端序列分析如图5所示，共获得4095bp的核苷酸序列(序列如SEQ ID No:14所示)，包括1bp-706bp的棉花DNA序列，第707bp-955bp的CaMV 35S启动子部分序列，第956bp-973bp的连接序列，第974bp-1944bp的MAR序列，第1945bp-1950bp的连接序列，第1951bp-2129bp的RB与MAR之间的载体骨架序列，第2130bp-2994bp的MAR部分序列，第2995bp-3012bp的连接序列，第3013bp-3792bp的CaMV 35S启动子序列，第3793bp-3798bp的连接序列，第3799bp-4095bp的Cm1Cry2Aa部分序列。

SEQ ID No:14序列说明：

以受体材料冀棉14DNA为模板，分别在插入序列的RB和LB端侧翼棉花基因组序列设计引物N15-5RBcheck(序列如SEQ ID No:15)，N15-5LBcheck(序列如SEQ ID No:16所示)，得到大小为600bp左右的扩增产物并测序，与N15-5的旁侧序列比对发现，该事件通过插入序列替换原基因组序列上55bp碱基获得的。比对结果截图见图6。

根据以上结果，本领域技术人员可容易得出N15-5事件的特征DNA序列(SEQ IDNO:17)，如下所示，加下划线部分示出的是T-DNA插入序列，未加下划线部分示出的是插入序列的侧翼棉花基因组DNA序列，插入序列及旁侧序列示意图如图7所示。

SEQ ID NO:17：

实施例8.转化事件检测

棉花材料中是否具有N15-5转化事件的独特标志性DNA信息，可鉴别该棉花材料是否利用了本发明技术。因此，可使用特异的DNA引物对进行PCR扩增以检测N15-5事件。所述引物对由特异性识别所述插入序列任一侧翼序列的第一引物组成和特异性识别本发明T-DNA插入序列的第二引物。例如，当第一引物为N15-5RBF1(SEQ ID NO:18)时，第二引物可为N15-5RBR1(SEQ ID NO:19)或N15-5RBR2(SEQ ID NO:21)；当第一引物为N15-5RBF2(SEQ IDNO:20)时，第二引物可为N15-5RBR1(SEQ ID NO:19)或N15-5RBR2(SEQ ID NO:21)；当第一引物为N15-5LBF1(SEQ ID NO:22)时，第二引物可为N15-5LBR1(SEQ ID NO:23)或N15-5LBR2(SEQ ID NO:25)；当第一引物为N15-5LBF2(SEQ ID NO:24)时，第二引物可为N15-5LBR1(SEQ ID NO:23)或N15-5LBR2(SEQ ID NO:25)；N15-5事件特征DNA序列及相关引物相对位置示意图如图16所示。利用引物对N15-5RBF1/N15-5RBR1、N15-5RBF2/N15-5RBR2、N15-5RBF1/N15-5RBR2、N15-5RBF2/N15-5RBR1、N15-5LBF1/N15-5LBR1、N15-5LBF2/N15-5LBR2、N15-5LBF2/N15-5LBR1、N15-5LBF1/N15-5LBR2分别扩增N15-5、冀棉14的棉花样品的结果如图8至15所示。

PCR体系如下：

N15-5RBF2/N15-5RBR2，PCR程序：94.0℃5min；35个循环:94.0℃30s，68.0℃1min30s；72.0℃5min。N15-5RBF1/N15-5RBR1、N15-5RBF1/N15-5RBR2、N15-5RBF2/N15-5RBR1、N15-5LBF1/N15-5LBR1、N15-5LBF2/N15-5LBR2、N15-5LBF2/N15-5LBR1、N15-5LBF1/N15-5LBR2，PCR程序：94.0℃5min；35个循环:94.0℃30s，62.0℃30s，72℃1min；72.0℃5min。

实施例9.染色体定位

根据所获得的棉花侧翼序列，利用公布的四倍体棉花(Gossypium hirsutum)染色体组基因组序列(http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)进行对比分析，可知N15-5事件中，与插入序列接合的棉花侧翼DNA序列与D7染色体上的序列高度同源，因此可知，N15-5事件中外源DNA插入序列的整合位点位于受体四倍体棉花的D组第7条染色体上。该植物转化事件棉花(Gossypium hirsutum)的代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，于2016年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所邮政编码：100101)，保藏编号为：CGMCC No.12267。

其他序列如下：

SEQ ID No:1：ATGTCTTTGGACACTATCCAAA

SEQ ID No:2:TTAGTACAAGGGTGGAAGGTTAG

SEQ ID No:3:ATGATTGAACAAGATGGATTG

SEQ ID No:4:TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG

SEQ ID No:5:aattaccagc cc

SEQ ID No:6:gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt

SEQ ID No:7:gtaatacgac tcactatagg gc

SEQ ID No:8:GTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCC

SEQ ID No:9:actatagggc acgcgtggt

SEQ ID No:10:GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAA

SEQ ID No:12:TTGCTTCGATGTCGGGGAATGGGT

SEQ ID No:13:GAACTCTCTAATATTGGCTTGCAATCC

SEQ ID No:15:ACCTTGCTTTTCAAGAATTCCGC

SEQ ID No:16:TGAATCTATTACTAGTGTCGTGCC

SEQ ID No:18:GTCTCCAAGAACTGAATTCTTGTC

SEQ ID No:19:GTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTG

SEQ ID No:20:ATTGGGTATCGAAGTTCTCATCATAG

SEQ ID No:21:ATTGATCAATAGGACGATGACACATG

SEQ ID No:22:GTCGGACAAGAGTATCTACCCGACAC

SEQ ID No:23:GTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCC

SEQ ID No:24:CGCTCTTTGTAGGAGCTTCTTTGAT

SEQ ID No:25:TACCGTCGACCTCGAGTTTCTCCAT。

序列表

<110> 创世纪转基因技术有限公司

<120> 棉花事件N15-5以及用于其检测的引物和方法

<130> CP2016XXXX

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 1

atgtctttgg acactatcca aa 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

ttagtacaag ggtggaaggt tag 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

atgattgaac aagatggatt g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

tcagaagaac tcgtcaagaa gg 22

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

aattaccagc cc 12

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 6

gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt 48

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 7

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 8

gttcccagat aagggaatta gggttcc 27

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 9

actatagggc acgcgtggt 19

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 10

gggtttcgct catgtgttga gcatataa 28

<210> 11

<211> 985

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 11

gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa 60

tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc 120

ccccgaatta attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt 180

tgtctaagcg tcaatttgtt tcacgacgtt ttctttcagc aattacatgt tcttgtgcca 240

gtaatggaac cctagtcaat gaacccacca tctttgggac ctgcccccaa atttagttca 300

tcaataattt tgcttcttag aaaattaaaa taaaatggca cgacactagt aatagattca 360

tatatgaacg ttggtattga gataattttc taaagtttta cataattgtg tcgggtagat 420

actcttgtcc gacactttat aattgagcta gtgtaaatac atgccaacct catttttggg 480

tttcaaatca cagtctacac cataatatag cagagatgaa ctggagttgt tgaaggagat 540

tatatgggaa gatgaagaag gaaaagaagc tttttgaggt gcgatgcaag aactccaatt 600

gttggtcttg agttgcttta atggcggcct ttccaagacg tcgagctgat gataagaagc 660

ttcattaatg gatgaaccat tgatttttgg ataggatgaa tagctttcag attggaaatt 720

gaaatcatca aatggatact caatagggtt ggtcgtttca tattgtgtga aaaaagtggg 780

atcctccatt tcgtgtaaat caaacataca taacagtgat ttccatcaaa gaagctccta 840

caaagagcgc catgaaaaca ataaattctt agaaattaag gcaccacaat taattaaaag 900

cttggcaccc cataattata tttgatttga ctgaaaatat gatagaaaat cacaaaaaaa 960

aacccagtaa ttaataaagg aattc 985

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 12

ttgcttcgat gtcggggaat gggt 24

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 13

gaactctcta atattggctt gcaatcc 27

<210> 14

<211> 4095

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 14

ttgcttcgat gtcggggaat gggtttttag attgggtatc gaagttctca tcataggaag 60

atgtttgatc atcttgcgcg taaaattggg tggtcttctt cacaaatttt actgattcca 120

ctgttctctt agcaacttgt tcctccagcc ttgcctttct ctcttgaagt tgcttcaagt 180

attcgatagc gtctccaaga actgaattct tgtctttctg caatgcacac acacacatat 240

atatatacat ataagctctc aacataagcc caaatgcttt tctttctttt gaaactatac 300

cttgcttttc aagaattccg caagttattg catgaaatat ttatattgta tgaactataa 360

aattaactac ttttagggta attttcttgc ttctaaaatc cgtgtccatt acattttcag 420

aaatagttct ttaagaatcc ttcaaacgca taaaattact tttaaaaacc tattcttagc 480

gcgcgctctc tctctttttt ccgaagaaac tccattttat gacaattctt ccagtgaaat 540

catggaattt ttagttacgg taattataac aaaacagaat ttgtaatagt tttgaagaaa 600

atttcaaagc tacaactacc gacagtactt gttctctaca acgattaaaa cagtaatctt 660

tgaatatata gattatagat tacatgggaa aagtttttga acttgtgcca tctttgggac 720

cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt 780

aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga 840

atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt 900

ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accattctag 960

agtcgacctg caggcagtct tactttggat tcaaatatac acctcattta aacggaggga 1020

catgtgtcat cgtcctattg atcaattcaa aatatctcct aattaattaa aaagacccat 1080

tacccatacc cgaaaaataa ttttctaaag caattttatt tttggtaaaa actgaaaaaa 1140

actaaaaaca aattttacta aaaactgaaa aaaacgaaaa tattgttttt caagttttta 1200

caaaaaaaaa ctgctttaaa gaactgaaaa atattttcta aaataatatt tttgtaaaaa 1260

ctgaaaaaaa agcagaaaag taattttcta aagtaattaa aaactggaaa aaacttaaat 1320

atttttaact aaaaactgaa aaaaagaaga aaatattttt tttttagttt ttacaaaaat 1380

attgttttag aaaatatttt cagctttttt taaagcagtt ttttttgtaa aaattagaaa 1440

aaaaaatatt ttcatttttt cagtttttag tagtttttcc agattttaca aataaaattg 1500

ctttagaaaa ttgattttca gcttcttttt tttcagtttt tacaaaaaca ttgttttaga 1560

aaatatcttt caattttttc taaaatagtt tttttgtaaa aactgaaaaa aaactatttt 1620

cgtttttttc aatttttagt aaaaataatt tcagtttttc cattttttat aaaaaaatat 1680

tgctttaaaa aatatttttc ggatatgggt aatgagtctt tttaattaat taggagatat 1740

ttagaattga ccaacaggac gatgacacgt gtccctccgt ttaaatgagg ggtatatttg 1800

aacccaaaat atgactgcaa aggtatagat aacctaataa tataacgaga ggtattatta 1860

gactattttt aaaagtaaat aggtatattt ggccctttgt cgctgatttt aacccatata 1920

gtcaaaaatc tctcccacct aacaaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 1980

ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 2040

ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 2100

tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga tcagattatc tatacctttg cagtcatatt 2160

ttgggttcaa atatacccct catttaaacg gagggacacg tgtcatcgtc ctgttggtca 2220

attctaaata tctcctaatt aattaaaaag actcattacc catatccgaa aaatattttt 2280

taaagcaata tttttttata aaaaatggaa aaactgaaat tatttttact aaaaattgaa 2340

aaaaacgaaa atagtttttt ttcagttttt acaaaaaaac tattttagaa aaaattgaaa 2400

gatattttct aaaacaatgt ttttgtaaaa actgaaaaaa aagaagctga aaatcaattt 2460

tctaaagcaa ttttatttgt aaaatctgga aaaaactact aaaaactgaa aaaatgaaaa 2520

tatttttttt tctaattttt acaaaaaaaa ctgctttaaa aaaagctgaa aatattttct 2580

aaaacaatat ttttgtaaaa actaaaaaaa aaatattttc ttcttttttt cagtttttag 2640

ttaaaaatat ttaagttttt tccagttttt aattacttta gaaaattact tttctgcttt 2700

tttttcagtt tttacaaaaa tattatttta gaaaatattt ttcagttctt taaagcagtt 2760

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<213> 人工序列(Synthetic sequence)

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<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

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gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 12780

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 12840

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 12900

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaact aggataaatt atcgcgcgcg 12960

gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattc atcatgagcg gagaattaag ggagtcacgt 13020

tatgaccccc gccgatgacg cgggacaagc cgttttacgt ttggaactga cagaaccgca 13080

acgttgaagg agccactcag ccgcgggttt ctggagttta atgagctaag cacatacgtc 13140

agaaaccatt attgcgcgtt caaaagtcgc ctaaggtcac tatcagctag caaatatttc 13200

ttgtcaaaaa tgctccactg acgttccata aattcccctc ggtatccaat tagagtctca 13260

tattcactct caatccaaat aatctgcacc ggatctggat cgtttcgcat gattgaacaa 13320

gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 13380

gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 13440

ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 13500

gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 13560

actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 13620

tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 13680

acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 13740

cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 13800

ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgatgatctc 13860

gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 13920

ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 13980

acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 14040

ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 14100

tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 14160

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 14220

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgggatct 14280

ctgcggaaca ggcggtcgaa ggtgccgata tcattacgac agcaacggcc gacaagcaca 14340

acgccacgat cctgagcgac aatatgatcg ggcccggcgt ccacatcaac ggcgtcggcg 14400

gcgactgccc aggcaagacc gagatgcacc gcgatatctt gctgcgttcg gatattttcg 14460

tggagttccc gccacagacc cggatgatcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 14520

tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 14580

acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 14640

tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 14700

actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggcc tgaattcttg 14760

ttaggtggga gagatttttg actatatggg ttaaaatcag cgacaaaggg ccaaatatac 14820

ctatttactt ttaaaaatag tctaataata cctctcgtta tattattagg ttatctatac 14880

ctttgcagtc atattttggg ttcaaatata cccctcattt aaacggaggg acacgtgtca 14940

tcgtcctgtt ggtcaattct aaatatctcc taattaatta aaaagactca ttacccatat 15000

ccgaaaaata ttttttaaag caatattttt ttataaaaaa tggaaaaact gaaattattt 15060

ttactaaaaa ttgaaaaaaa cgaaaatagt tttttttcag tttttacaaa aaaactattt 15120

tagaaaaaat tgaaagatat tttctaaaac aatgtttttg taaaaactga aaaaaaagaa 15180

gctgaaaatc aattttctaa agcaatttta tttgtaaaat ctggaaaaac tactaaaaac 15240

tgaaaaaatg aaaatatttt tttttctaat ttttacaaaa aaaactgctt taaaaaaagc 15300

tgaaaatatt ttctaaaaca atatttttgt aaaaactaaa aaaaaaatat tttcttcttt 15360

ttttcagttt ttagttaaaa atatttaagt tttttccagt ttttaattac tttagaaaat 15420

tacttttctg cttttttttc agtttttaca aaaatattat tttagaaaat atttttcagt 15480

tctttaaagc agtttttttt tgtaaaaact tgaaaaacaa tattttcgtt tttttcagtt 15540

tttagtaaaa tttgttttta gtttttttca gtttttacca aaaataaaat tgctttagaa 15600

aattattttt cgggtatggg taatgggtct ttttaattaa ttaggagata ttttgaattg 15660

atcaatagga cgatgacaca tgtccctccg tttaaatgag gtgtatattt gaatccaaag 15720

taagactgcc tcgagaatca agcttatcga taccgtcgac ctcgagtttc tccataataa 15780

tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg 15840

agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt 15900

tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat cccccgaatt aattcggcgt 15960

taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 16020

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tgaacccacc atctttggga cctgccccca aatttagttc atcaataatt ttgcttctta 16140

gaaaattaaa ataaaatggc acgacactag taatagattc atatatgaac gttggtattg 16200

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taattgagct agtgtaaata catgccaacc tcatttttgg gtttcaaatc acagtctaca 16320

ccataatata gcagagatga actggagttg ttgaaggaga ttatatggga agatgaagaa 16380

ggaaaagaag ctttttgagg tgcgatgcaa gaactccaat tgttggtctt gagttgcttt 16440

aatggcggcc tttccaagac gtcgagctga tgataagaag cttcattaat ggatgaacca 16500

ttgatttttg gataggatga atagctttca gattggaaat tgaaatcatc aaatggatac 16560

tcaatagggt tggtcgtttc atattgtgtg aaaaaagtgg gatcctccat ttcgtgtaaa 16620

tcaaacatac ataacagtga tttccatcaa agaagctcct acaaagagcg ccatgaaaac 16680

aataaattct tagaaattaa ggcaccacaa ttaattaaaa gcttggcacc ccataattat 16740

atttgatttg actgaaaata tgatagaaaa tcacaaaaaa aaacccagta attaataaag 16800

gaattc 16806

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 18

gtctccaaga actgaattct tgtc 24

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 19

gttcaagatg cctctgccga cagtg 25

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 20

attgggtatc gaagttctca tcatag 26

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 21

attgatcaat aggacgatga cacatg 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 22

gtcggacaag agtatctacc cgacac 26

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 23

gttcccagat aagggaatta gggttcc 27

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 24

cgctctttgt aggagcttct ttgat 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 25

taccgtcgac ctcgagtttc tccat 25

Claims (6)

1.一种核酸分子，其DNA序列如SEQ ID NO：17所示。

2.用于检测权利要求1所述的核酸分子的引物对，其由特异性识别权利要求1所述的核酸分子的任一侧的侧翼棉花基因组序列的第一引物和特异性识别权利要求1所述的核酸分子的T-DNA插入序列的第二引物组成。

3.权利要求2所述的引物对，其中所述第一引物的序列为SEQ ID NO:18，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21；或者所述第一引物的序列为SEQ ID NO:20，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21；或者所述第一引物的序列为SEQ ID NO:22，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25；或者所述第一引物的序列为SEQID NO:24，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25。

4.一种鉴定棉花生物样品中权利要求1所述的核酸分子的方法，其包括:

(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；

(b)以提取的DNA样品为模板,使用权利要求2或3所述的引物对进行PCR扩增；

(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID NO：17上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中所述核酸分子的存在。

5.一种获得转基因抗虫棉花材料的方法，包括：

将含有权利要求1所述的核酸分子的棉花材料与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有权利要求1所述的核酸分子的新材料；

在杂交及回交过程中，利用权利要求4所述的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认权利要求1所述的核酸分子的存在。

6.权利要求1所述的核酸分子、权利要求4或权利要求5所述的方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行棉花育种以及用作分子标记的用途。

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