CN110283833A - cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途，其中，所述的cry2Ab12基因在GenBank序列号为EF157306.1。本发明首次发现该基因具有良好的抗蚜虫效果。

Description

cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途。
背景技术
我国是一个人口多耕地少的农业生产大国，作物的种类多，有害生物的种类亦多。提高单位耕地面积的产量是解决粮食问题的主要措施，而农药在保护农作物免受有害生物为害、改善农作物的抗性以及促进农业增产方面起着重要的作用。化学农药虽然在防治害虫上取得显著的经济效益，但随着时间的推移，其弊端(对人体健康的危害、对有益生物的杀伤、对环境和食品的污染以及害虫抗药性剧增等)日益突出，因而抗虫转基因植物的构建与应用，具有重大应用前景。
苏云金杆菌制剂是迄今最为成功的微生物杀虫剂，已被广泛应用于农林卫生害虫的防治。苏云金杆菌产生的最主要杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白(Cry蛋白)，其编码基因已经被广泛应用于构建抗虫转基因植物，已成为抗鳞翅目和鞘翅目害虫的常规手段。
但是，仍然有不少重要的农林卫生害虫，现有苏云金杆菌制剂及其Cry蛋白对其防效低下。尤其是蚜虫这类体型很小的刺吸式昆虫，其能够通过取食、蜜露污染、传播病毒等方式危害众多植物，造成植株生长迟缓、萎蔫，并诱发多种病毒病、黑霉病等，严重时可导致植株死亡，是重要的农林业害虫。
应用苏云金杆菌及其Cry蛋白，构建对应的抗虫转基因植物是最佳途径，然而目前缺乏对蚜虫有效的抗蚜转基因植物。虽然转苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的毒素蛋白基因的植物对鳞翅目与鞘翅目昆虫有着良好的抵抗性，但是Bt毒素对刺吸性昆虫(半翅目)几乎没有毒性。随着转Bt基因植物的种植面积逐渐增大，由于蚜虫存在对Bt蛋白的不敏性，导致蚜虫逐渐从次要害虫升格为主要害虫。目前已经报道的Bt蛋白针对蚜虫毒性处于一个比较低水平。
目前蚜虫的防控还是以化学防控为主。大多数商业杀虫剂都属于有机磷(OP)，氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类。所有这些杀虫剂都是酯类，而酯类的化学键容易裂解。这也是蚜虫容易对其产生抗性的原因，以桃蚜为例，桃蚜具有至少三种共存的抗性机制：(i)桃蚜中过量产生的羧酸酯酶赋予对有机磷酸酯(OPs)和氨基甲酸酯的抗性以及对拟除虫菊酯的抗性；(ii)乙酰胆碱酯酶的突变(AChE)产生对某些氨基甲酸酯的抗性；(iii)由钠离子通道调控蛋白的突变给与对拟除虫菊酯的抗性。这些机制赋予桃蚜对几乎所有可用的杀蚜剂的强抵抗力。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种对蚜虫种群发展具有抑制作用的转基因植物的方法，该发明可应用于抗蚜转基因植物的构建及优良抗蚜植物品种的选育，大幅减少化学农药的使用。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种对蚜虫具有抑制作用的转基因植物的构建方法,将苏云金芽胞杆菌的Cry2Ab12基因转入植物基因组中，使植物获得抑制蚜虫种群的能力，所述的cry2Ab12基因在GenBank序列号为EF157306.1。
更具体地，前述的构建方法，包括如下步骤：
(1)克隆或合成cry2Ab12基因；
(2)将cry2Ab12基因转移到植物的基因组上；
(3)考察转基因植物对蚜虫的作用，从中选择出具有抗蚜效果的转基因植株。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明首次发现了cry2Ab12基因具有良好抗蚜虫效果，本发明将该cry2Ab12基因转入植物基因组中，使植物获得抑制蚜虫种群在其植株上发展壮大的能力。本发明可应用于抗蚜转基因植物的构建及优良抗蚜植物品种的选育，大幅减少化学农药的使用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为pET-2Ab12质粒所用的载体pET-32a(+)的结构示意图。
图2为表达载体质粒图谱pBWA(V)KS-2Ab12。
图3为图2.11烟草总DNA提取结果电泳图
M:DNA ladder(DL2000)；泳道1-7:烟草总DNA。
图4为转基因烟草的PCR鉴定
M:DNA ladder(DL2000)；泳道1-3:pBWA(V)KS-2Ab12PCR片段；泳道4-10：其它组转基因PCR片段。
图5为cry2Ab12转基因烟草抗蚜特性结果图。
具体实施方式
供试昆虫：试验所选桃蚜(Myzus persicae)采自厦门天马山附近农田，在人工气候箱中接种在上海青植株叶片上用以传代。人工气候箱饲养温度为20±2℃，相对湿度(RH)为70-80％，光照周期为16：8(L：D)。
cry2Ab12基因：由申请人发现并已公开，在GenBank序列号为EF157306.1，其序列具体如下：
atgaatagtgtattgaatagcggaagaactactatttgtgatgcgtataatgtagcggctcatgatccatttagttttcaacacaaatcattagataccgtacaaaaggaatggacggagtggaaaaaaaataatcatagtttatacctagatcctattgttggaactgtggctagttttctgttaaagaaagtggggagtcttgttggaaaaaggatactaagtgagttacggaatttaatatttcctagtggtagtacaaatctaatgcaagatattttaagagagacagaaaaattcctgaatcaaagacttaatacagacactcttgcccgtgtaaatgcggaattgacagggctgcaagcaaatgtagaagagtttaatcgacaagtagataattttttgaaccctaaccgaaacgctgttcctttatcaataacttcttcagttaatacaatgcaacaattatttctaaatagattaccccagttccagatgcaaggataccaactgttattattacctttatttgcacaggcagccaatttacatctttcttttattagagatgttattctaaatgcagatgaatggggaatttcagcagcaacattacgtacgtatcgagattacttgaaaaattatacaagagattactctaactattgtataaatacgtatcaaagtgcgtttaaaggtttaaacactcgtttacacgatatgttagaatttagaacatatatgtttttaaatgtatttgagtatgtatctttctggtcggtttttaaatatcaaagtcttctagtatcctccggtgctaatttaaatgccaggggtaggggaccacagcaggcccaatcatttacttcaccaggatgggcatttttaaattctcttttccaagttaattcaaattatgtgtttaatggatttaggggtgctaggctttttaattcctttcctaatataatcggtttacctggttttactacaactcacccattgcttgctgccaaggttaattacaagggaagaatttcgtctggtgatataggtgcatctccggttaatcaaaattttaattgtagcaaatttctccccccattgttaacgccatttgttaggagttggctagattcaggttcagatcgggagggcgttgccaccgttacaaattggcaaacagaatcctttgagacaactttagggttaaggagtggtgcttttacagctcgcggtaattcaaactatttcccagattattttattcgtaatatttctggagttcctttagttgttagaaatgaagatttaagaagaccgttacactataatgaaataagaaatatagcaagtccttcaggaacacctggtggagcacgagcttatatggtatctgtgcataacagaaaaaataatatccatgctgttcatgaaaatggttctatgattcatttagcgccaaatgactatacaggatttactatttcgccgatacatgcaactcaagtgaataatcaaacacgaacatttatttctgaaaaatttggaaatcaaggtgattctttaaggtttgaacaaaacaacacgacagctcgttatacgcttagagggaatggaaatagttacaatctttatttaagagtttcttcaataggaaattccactattcgagttactataaacggtagggtatatactgctacaaatgttaatactactacaaataacgatggagttaatgataatggagctcgtttttcagatattaatatcggtaatgtagtagcacgtagtaattctgatgtatcattagatataaatgtatcattaaactcccgtactctaattgatcttatgaatattatgcttgtaccaactaatatttcaccactttattaa。
pET-2Ab12质粒：载体pET-32a(+),由德泰生物科技(南京)有限公司将cry2Ab12基因插入该载体中。EcoR I与sal I双酶切验证。目标片段cry2Ab12在1.9kb左右。
也可以根据以上公开的序列另外合成质粒。
表1，质粒
转基因烟草
转基因烟草由武汉伯远生物公司进行转化，然后将烟草幼苗转移到温室中进行培养。
在已有的pET-2Ab12质粒基础之上，由武汉伯远生物将目的基因Cry2Ab12克隆到质粒载体pBWA(V)KS(武汉伯远公司提供)上,成功构建了pBWA(V)KS-2Ab12表达载体，该载体的结构如图2所示。
然后同样由武汉伯远生物将该质粒转化进入烟草K326植株进行表达，然后将烟草幼苗移入温室种植。
转基因烟草目的基因的鉴定
烟草总DNA的提取(简易CTAB法)
(1)打开水浴锅，设置温度为65℃，将2％CTAB提取缓冲液置于其中预热；
(2)取1g烟草叶片用剪刀剪成小块，置入组织研磨器中冰上研磨；
(3)在组织研磨器中加入700ul的2％CTAB抽提缓冲液，用移液枪轻轻吸打使其充分混匀；
(4)将抽提液倒入1.5ml的离心管中，抽提液不能超过管的三分之二；
(5)将离心管置于65℃的水浴锅中，每隔10min轻轻摇动，水浴60min；
(6)冰上静置2min，加入氯仿-异戊醇(24：1)至管口，振荡2～3min，使两者充分混合均匀；
(7)10 000rpm，4℃离心10min，与此同时，用移液枪吸取600ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
(8)10 000rpm，4℃离心1min后，用移液枪吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
(9)10 000rpm，4℃离心1min后，弃去上清，将离心管倒立于吸水纸上，静置1min；
(10)加入720ul的75％乙醇及80ul 5M的醋酸钠，震荡离心管，使沉淀重悬，然后静置30min，使DNA溶解；
(11)10 000rpm离心1min后，弃去上清，再加入800ul 75％的乙醇，将DNA再洗30min；
(12)10 000rpm离心30s后，弃去上清，将离心管倒立于吸水纸上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)；
(13)加入50ul 0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱过夜，使RNA消解，然后置于-20℃保存；
(14)将提取的总DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测提取结果。
其结果见图3.
PCR鉴定目的基因
根据构建的转基因质粒，使用oligo7软件设计设计Cry2Ab12的PCR鉴定引物，PCR目的条带为150bp左右，如下表所示。
表2引物表
将所提取的烟草总DNA作为模板，建立PCR反应体系，如下表3所示。
表3PCR体系
表4扩增反应温度
PCR扩增完成后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，按照引物的设计情况，扩增条带应在150bp附近。
PCR结果见图4
抗蚜的生物测定
将健康的蚜虫(桃蚜)30只接到转入了cry2Ab12活性区编码基因的植株上及不含cry2Ab12活性区编码基因的对照植株上，植株各自单独用养虫网隔离，每天观察记录其上的蚜虫数和后代蚜虫数，发现含有cry2Ab12活性区编码基因的烟草K326品种的植株，10天后其桃蚜种群数量已由最初的30只减少到25只，再过8天，其上的桃蚜种群已全部死亡，植株仍然保持正常状态，而不含cry2Ab12活性区编码基因的烟草K326品种的植株上，10天后其桃蚜种群数量已由最初的30只增加到80多只，植株受桃蚜取食已显示出明显的长势衰弱状态。
结果见图5。
本发明以上实施例以烟草和桃蚜为例。本领域技术人员可以知晓，本发明的基因同样可以转入其它植物中获得抗蚜效果。所述的蚜虫不限于桃蚜，也包括其它种类的蚜虫。
序列表
<110> 华侨大学
<120> cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1902
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
atgaatagtg tattgaatag cggaagaact actatttgtg atgcgtataa tgtagcggct 60
catgatccat ttagttttca acacaaatca ttagataccg tacaaaagga atggacggag 120
tggaaaaaaa ataatcatag tttataccta gatcctattg ttggaactgt ggctagtttt 180
ctgttaaaga aagtggggag tcttgttgga aaaaggatac taagtgagtt acggaattta 240
atatttccta gtggtagtac aaatctaatg caagatattt taagagagac agaaaaattc 300
ctgaatcaaa gacttaatac agacactctt gcccgtgtaa atgcggaatt gacagggctg 360
caagcaaatg tagaagagtt taatcgacaa gtagataatt ttttgaaccc taaccgaaac 420
gctgttcctt tatcaataac ttcttcagtt aatacaatgc aacaattatt tctaaataga 480
ttaccccagt tccagatgca aggataccaa ctgttattat tacctttatt tgcacaggca 540
gccaatttac atctttcttt tattagagat gttattctaa atgcagatga atggggaatt 600
tcagcagcaa cattacgtac gtatcgagat tacttgaaaa attatacaag agattactct 660
aactattgta taaatacgta tcaaagtgcg tttaaaggtt taaacactcg tttacacgat 720
atgttagaat ttagaacata tatgttttta aatgtatttg agtatgtatc tttctggtcg 780
gtttttaaat atcaaagtct tctagtatcc tccggtgcta atttaaatgc caggggtagg 840
ggaccacagc aggcccaatc atttacttca ccaggatggg catttttaaa ttctcttttc 900
caagttaatt caaattatgt gtttaatgga tttaggggtg ctaggctttt taattccttt 960
cctaatataa tcggtttacc tggttttact acaactcacc cattgcttgc tgccaaggtt 1020
aattacaagg gaagaatttc gtctggtgat ataggtgcat ctccggttaa tcaaaatttt 1080
aattgtagca aatttctccc cccattgtta acgccatttg ttaggagttg gctagattca 1140
ggttcagatc gggagggcgt tgccaccgtt acaaattggc aaacagaatc ctttgagaca 1200
actttagggt taaggagtgg tgcttttaca gctcgcggta attcaaacta tttcccagat 1260
tattttattc gtaatatttc tggagttcct ttagttgtta gaaatgaaga tttaagaaga 1320
ccgttacact ataatgaaat aagaaatata gcaagtcctt caggaacacc tggtggagca 1380
cgagcttata tggtatctgt gcataacaga aaaaataata tccatgctgt tcatgaaaat 1440
ggttctatga ttcatttagc gccaaatgac tatacaggat ttactatttc gccgatacat 1500
gcaactcaag tgaataatca aacacgaaca tttatttctg aaaaatttgg aaatcaaggt 1560
gattctttaa ggtttgaaca aaacaacacg acagctcgtt atacgcttag agggaatgga 1620
aatagttaca atctttattt aagagtttct tcaataggaa attccactat tcgagttact 1680
ataaacggta gggtatatac tgctacaaat gttaatacta ctacaaataa cgatggagtt 1740
aatgataatg gagctcgttt ttcagatatt aatatcggta atgtagtagc acgtagtaat 1800
tctgatgtat cattagatat aaatgtatca ttaaactccc gtactctaat tgatcttatg 1860
aatattatgc ttgtaccaac taatatttca ccactttatt aa 1902

Claims (5)

1.cry2Ab12基因在制备抗蚜虫转基因植物的用途，其中，所述的cry2Ab12基因在GenBank序列号为EF157306.1。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的植物为烟草。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的蚜虫为桃蚜。
4.一种对蚜虫具有抑制作用的转基因植物的构建方法,将苏云金芽胞杆菌的基因Cry2Ab12转入植物基因组中，使植物获得抑制蚜虫种群的能力，所述的cry2Ab12基因在GenBank序列号为EF157306.1。
5.根据权利要求4所述的一种对蚜虫具有抑制作用的转基因植物的构建方法，包括如下步骤：
(1)克隆或合成cry2Ab12基因；
(2)将cry2Ab12基因转移到植物的基因组上；
(3)考察转基因植物对蚜虫的作用，从中选择出具有抗蚜效果的转基因植株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113180046A (zh) * 2021-03-31 2021-07-30 中国农业科学院植物保护研究所 杀虫蛋白在防治蚜虫中的应用
CN113180046B (zh) * 2021-03-31 2022-04-12 中国农业科学院植物保护研究所 杀虫蛋白在防治蚜虫中的应用

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