CN113913456A - 一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法 - Google Patents

一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法，在番茄中敲除MYC2基因；所述MYC2基因选自以下两种中任意一种：a、所述MYC2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；b、任一其碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA分子。本发明研究发现，MYC2参与了RKN的抗性，并且发现myc2突变体增强了根结线虫敏感性，即MYC2负向调控番茄南方根结线虫抗性。

Description

一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法。
背景技术
众所周知，植物通过激活模式触发免疫(PTI)和效应触发免疫(ETI)来应对病原体。PTI是一种基本防御反应，由微生物或病原体相关分子模式(PAMP)诱导，可以有效抵抗大多数不适应的病原体，在病原体感染期间导致植物的基底免疫。细胞质抵抗(R)-蛋白质激活的ETI是第二个免疫反应，通常与识别病原体分泌的毒性效应器。
目前，植物激素也作为重要的细胞信号分子参与对病原体的响应，一些致命的病原体已经发展出各种策略来操纵茉莉酸(JA)信号，以促进它们对植物宿主的利用。植物激活特定的防御信号通路，以应对病原体感染或昆虫攻击，植物激素在这些途径中发挥着关键的调节作用。一般来说，水杨酸信号会触发植物对生物营养或半生物营养病原体和吸虫的免疫力，而JA信号激活植物对坏死病原体和咀嚼昆虫的抵抗力。积累的证据表明，水杨酸和JA对植物免疫力有相互抑制作用。根据感染病原体的性质，JA信号通过MYC或ERF分支运行。通过ERF分支对JA信号的监管由乙烯(ET)、EIN3和EIL1进行调解。EIN3和EIL1 TFs诱导ERF1和ORA59的转录。ERF1和ORA59 TF反过来招募MED25，从而激活JA响应基因(例如PDF1.2)，抵抗坏死病原体和异质病原体的感染；通过MYC2的释放诱导防御蛋白的产生，例如VSP2，从而抵抗食草昆虫。
在过去的研究中已证明，MYC2整合来自各种路径的信号，以协调植物防御。MYC2、MYC3和MYC4是由26S蛋白酶体降解的非常不稳定的蛋白质。MYC2蛋白质水平会随着昼夜节律、茉莉亚甲酯(MeJA)和特定光条件等信号而变化。深色、远红色的光线等会破坏MYC2、MYC3和MYC4的稳定，而MeJA、红灯和蓝光则使它们稳定。通过改变红光与远红光的比率对MYC2稳定性的差异调节可调节JA依赖性防御(Chico等，2014)。咖啡时间(TIC)在生物钟的控制下抑制MYC2蛋白的积累。因此，TIC以MYC2依赖性方式调节JA介导的表型，例如根生长抑制、基因表达和防御反应。也有报道称删除MYC2中的破坏元素使其更稳定，而MYC2磷酸化促进其自身的激活。近几年来，也有越来越多的研究发现MYC2参与植物病虫害的防御调控，但大多数在拟南芥中报道。
与细菌病原体一样，南方根结线虫也会激发植物防御反应。根结线虫(RKNs)是一种植物寄生线虫，宿主范围广泛，它对许多经济上重要的作物造成了相当大的损害，包括水解质作物。到目前为止，大量土壤熏蒸剂和线虫剂正被用于控制线虫，这引发了有关食品安全、环境污染和人类健康的问题，也威胁到可持续农业发展。因此，制定线虫控制的环境友好型战略以确保食品安全和可持续作物生产是必不可少的。
尽管目前对RKN的抗性研究越来越多，但JA途径在番茄对线虫的防御反应中的作用在一定程度上仍然未知，尤其是MYC2。因此，在当前的研究中，我们研究了MYC2对番茄植物线虫感染防御反应的影响。
发明内容
本发明提供了一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法，通过CRISPR/CAS9技术构建了myc2突变体植株，并且在野生型番茄和myc2突变体植株中接种线虫4周后发现myc2突变体植株的根结数目较野生番茄少，野生型番茄根结也比myc2突变体番茄根结更为明显。
一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法，在番茄中敲除MYC2基因；
所述MYC2基因选自以下两种中任意一种：
a、所述MYC2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；
b、任一其碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的DNA分子。
理论上，在上述方法中，在目的植物中对MYC2基因进行抑制表达，可为任何可降低目的植物中所述MYC2基因的表达的方法。
所述的方法具体包括步骤：
(1)构建含所述MYC2基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)工程菌；
(2)将所述根癌农杆菌工程菌介导转化目标番茄外植体，制备得到MYC2基因敲除的突变体植株。
MYC2基因在植物中的表达量越低，在根结线虫侵染时根结数目越少，植株根结线虫抗性增强；MYC2基因在所述植物中的表达量越高，在根结线虫侵染时所述植物根结数目越多，对根结线虫侵染越敏感。
步骤(2)中，所述番茄外植体优选为番茄子叶。
将所述MYC2基因敲除的突变体植株进行正常生长管理，获得稳定遗传的转基因F2代及以后种子。
通过将敲除MYC2基因的番茄植株接种南方根结线虫，记录植株根结数目和表型。
接种南方根结线虫胁迫处理具体可为：当敲除MYC2基因的番茄植株长至五叶一心时，接种南方根结线虫。
接种的南方根结线虫可为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。
接种南方根结线虫处理的时间可为4周。
所述根癌农杆菌工程菌的制备方法如下：
(a)从野生型番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(c)在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄MYC2基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，设计引物sgRNA-MYC2-F1(SEQ ID NO：3)，sgRNA-MYC2-R1(SEQ ID NO：4)，sgRNA-MYC2-F2(SEQ ID NO：5)，sgRNA-MYC2-R2(SEQ IDNO：6)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个sgRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。
将合成的sgRNA正反向引物进行退火形成含有粘性末端接头的双链sgRNA，稀释200倍后与经过BbsI酶切过的sgRNA-Cas9骨架载体进行16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄(Amp+)的LB固体培养基37℃过夜培养后，挑取单克隆，用M13F通用引物和退火时的下游引物进行菌液PCR，阳性单克隆进行测序鉴定，获得阳性sgRNA-MYC2-1、sgRNA-MYC2-2克隆。
以AtU6-F-KpnI为前引物，AtsgR-R-EcoRI为后引物，以阳性载体sgRNA-MYC2-2为模板，扩增第二个sgRNA序列，然后连入含有sgRNA-MYC2-1和Cas9序列的骨架载体。将测序正确的阳性质粒sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2用HindIII和EcoRI双酶切，将回收的sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2片段和线性化的pCAMBIA1300进行过夜连接，转化到DH5α感受态中，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基中37℃过夜培养，挑单克隆培养，用1300-seq-R和AtUBQ-seq-R引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆后测序。将阳性质粒命名为pCAMBIA1300-sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-Cas9。
(d)将步骤(c)获得的CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-MYC2-sgRNA-MYC2-Cas9转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄MYC2基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌。
本发明中南方根结线虫的培养与接种处理的步骤为：
1)南方根结线虫由中国农业科学院彭德良教授馈赠，在农业试验站温室中用普通栽培番茄在沙壤土中繁殖线虫，室温维持在22～26℃。2个月左右番茄根系形成肉眼可见的根结块。
2)将收获的根结用自来水冲洗干净后，用0.5％的次氯酸钠水溶液浸泡5min，再用蒸馏水清冲洗至没有次氯酸钠的刺鼻味为止。
3)将根系绞碎，将匀浆混合液依次过80目、200目、325目、500目筛子，继续用无菌水反复冲洗根系碎渣3次后过滤，最后在500目筛子上富集根结线虫虫卵。
4)将虫卵用蒸馏水冲洗到烧杯中。将虫卵悬浮液搅拌均匀，用移液枪吸取10μL于载玻片上，在50倍光学显微镜下观察统计虫卵数目并估算虫卵总量。按照10％～20％的孵化率计算本次所得线虫数量。
5)用移液枪将卵悬浮液吸打到铺于10cm×10cm的方形培养皿中的灭菌吸水纸。将培养皿置于28℃恒温培养箱中，期间注意保持吸水纸呈湿润状态。
6)2～3天后，用蒸馏水从吸水纸上方冲洗后下渗到培养皿，实验用的J2期线虫随蒸馏水被冲洗出来。所获得的J2期线虫尽量在24h内接种使用，避免虫体死亡。
7)在myc2突变体植株长至五叶一心时进行接种，每株约接种1000条J2期线虫，期间正常浇水。
植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，每次用Hoagland营养液浇灌。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m-2s-1光照强度。
接种根结线虫胁迫处理的时间为4周。
MYC2基因转基因植株以番茄栽培品种Ailsa Craig为空白对照。
线虫处理结束后与相同种植条件下未进行线虫处理的对照组进行比对，观察myc2突变体植株及其空白对照与未经胁迫处理的植株间的差异。
根结数目的观察方法如下：
采用酸性品红染色法，用于根结线虫感染的根系表型观察。具体方法为：
a)将根结线虫侵染过的番茄根系用自来水冲洗干净后，根据根系的幼嫩程度，选用1.5％～5％的次氯酸钠溶液对根系进行漂白，此过程需5～10分钟，以除去根系内影响染色的杂质；
b)然后用自来水反复冲洗直至没有次氯酸钠的刺鼻味，以免影响后续染色效果；
c)用吸水纸将根系水分吸干，在3.5％的酸性品红溶液中浸泡，加热煮沸后室温冷却；
d)倒掉品红染色液，番茄根系用自来水冲洗，除去表面多余的品红液体；
e)加入酸性甘油后加热煮沸后立即将根系转移到常温酸性甘油中；
f)24h后进行拍照和根结数统计。
所述接种根结线虫胁迫处理具体为：当番茄myc2突变体植株长至五叶一心时，接种根结线虫。
作为优选，接种的根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。
本研究表明，myc2突变体植株增加了根结线虫敏感性提高了番茄对南方根结线虫的抗性。
附图说明
图1为番茄MYC2基因CRISPR/Cas9载体构建及各基因敲除测序结果，其中包括载体gRNAs位置结构图；番茄MYC2 CRISPR/Cas9敲除植株测序结果。
图2为myc2突变体植株接种RKN四周后根结数目统计与表型记录，Bar＝1cm，图2A为根结表型图；图2B为根结数目统计。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
番茄myc2突变体植株构建及检测
1.番茄总RNA提取
采用Tiangen Plant total RNA extraction kit提取番茄嫩根的总RNA，其步骤与上述总RNA提取方法相同。
2.基因克隆及根癌农杆菌工程菌构建
在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄MYC2基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，设计引物sgRNA-MYC2-F1(SEQ ID NO：3)，sgRNA-MYC2-R1(SEQ ID NO：4)，sgRNA-MYC2-F2(SEQ ID NO：5)，sgRNA-MYC2-R2(SEQ IDNO：6)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个sgRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。
将合成的sgRNA正反向引物进行退火形成含有粘性末端接头的双链sgRNA，稀释200倍后与经过BbsI酶切过的sgRNA-Cas9骨架载体进行16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄(Amp+)的LB固体培养基37℃过夜培养后，挑取单克隆，用M13F通用引物和退火时的下游引物进行菌液PCR，阳性单克隆进行测序鉴定，获得阳性sgRNA-MYC2-1、sgRNA-MYC2-2克隆。
以AtU6-F-KpnI为前引物，AtsgR-R-EcoRI为后引物，以阳性载体sgRNA-MYC2-2为模板，扩增第二个sgRNA序列，然后连入含有sgRNA-MYC2-1和Cas9序列的骨架载体。将测序正确的阳性质粒sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2用HindIII和EcoRI双酶切，将回收的sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2片段和线性化的pCAMBIA1300进行过夜连接，转化到DH5α感受态中，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基中37℃过夜培养，挑单克隆培养，用1300-seq-R和AtUBQ-seq-R引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆后测序。将阳性质粒命名为pCAMBIA1300-sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2-Cas9。图1A为载体gRNAs位置结构图。
将获得的CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-2-Cas9转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄MYC2基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌。
所用引物序列如下：
sgRNA-MYC2-F1：CTGGTCTCTATTGaacaaagcaccagtggtctagtg(SEQ ID NO：3)
sgRNA-MYC2-R1：CTGGTCTCTATTGaacaaagcaccagtggtctagtg(SEQ ID NO：4)
sgRNA-MYC2-F2：GCTGGTCTCTGAATgttttagagctagaaatagcaagtta(SEQ ID NO：5)
sgRNA-MYC2-R2：GCTGGTCTCTAAACGAGCAGGAGCATCGGAAGtgc accagccgggaatcg(SEQID NO：6)。
3.构建番茄myc2突变体植株
通过农杆菌介导侵染番茄子叶，将目的载体pCAMBIA1300-sgRNA-MYC2-1-sgRNA-MYC2-Cas9转化进番茄子叶，利用潮霉素初步筛选出候选转基因植株。以潮霉素基因序列的正向引物和反向引物配对，PCR扩增方法筛选所获得的转基因植株。关于培养基的制备及无菌苗的培养方法与上述过表达植株相同，转化再生时采用含有目的载体质粒的根癌农杆菌工程菌菌液，通过生根培养、移栽，最后得突变体植株。
4.番茄myc2突变体植株的PCR检测
在番茄MYC2基因的sgRNAs的序列位置附近设计特异性引物检测靶基因序列的变化情况。引物如下，检测片段长度，可以根据PCR产物条带的大小及测序结果筛选出MYC2敲除转基因植株中的纯合突变体。PCR检测结果送测，图1B为番茄MYC2 CRISPR/Cas9敲除植株测序结果。
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：7)
M36-R：ggtattggtttatctcatcggaactgca(SEQ ID NO：8)
实施例2
对myc2突变体植株和野生型番茄进行接种RKN处理。
番茄myc2突变体植株和野生型番茄接种根结线虫处理的具体方法如下：
将野生型WT和突变体植株均分为两组，一组为对照组，一组为实验组。
当番茄长至五叶一心时，对实验组进行接种线虫处理，每株约接种1000条J2期线虫，期间正常浇水。
植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，每次用Hoagland营养液浇灌。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m-2s-1光照强度。
线虫处理时间为4周。
实验结束即进行取样并测定相关指标。结果如图2所示。
图2为myc2突变体植株接种RKN四周后根结数目统计与表型记录。图2A为根结表型图；图2B为根结数目统计Bar＝1cm。
用myc2突变体植株及野生型WT对照植株为实验材料接种根结线虫处理，培养4周后，我们发现突变体比野生型的根结数目显著性减少，且根结小于野生型如图2所示。这些结果表明MYC2参与了RKN的抗性，且MYC2负向调控番茄南方根结线虫抗性。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2070
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 1
atgactgaat acagcttgcc caccatgaat ttgtggaaca atagtactag cgatgataac 60
gtttctatga tggaagcttt tatgtcttct gatctttctt tttgggctac taataattct 120
acttctgctg ctgtggttgg tgtcaattca aatcttcctc atgctagtag taatactccc 180
tctgtttttg caccatcttc ttctacatct gcatctactt tatccgcagc tgcgactgtg 240
gatgcttcca aatctatgcc gtttttcaac caagaaaccc ttcagcagcg tcttcaagct 300
cttattgatg gtgctagaga gacgtggact tatgctatct tttggcaatc gtcggttgtt 360
gatttctcaa gtccgtctgt gttgggttgg ggagatggtt attacaaagg ggaagaagat 420
aaagcaaaaa ggaaattatc ggtgtcatca cctgcttata ttgctgagca ggagcatcgg 480
aagaaggttc tacgggagct gaattcgttg atttccgggg caccacccgg aacggatgat 540
gcggttgatg aagaagttac cgacaccgaa tggttctttc ttatctccat gacccaatcg 600
tttgttaatg gaagtgggct tcctggtcag gcgttgtata gttccagccc gatttgggtc 660
gccggaactg agaaattggc agcttcacac tgtgaacgtg tgaggcaagc acaagggttc 720
gggcttcaga cgattgtctg tattccttca gctaacggcg tggttgaatt gggctcgacg 780
gagttgattg ttcaaagttc tgatcttatg aacaaggtta gagtattgtt taacttcagt 840
aatgatttgg gttctggttc atgggctgtg cagccggaga gcgacccatc ggcgctctgg 900
ctcactgatc catcgtcctc aggtatggaa gttagagagt ctttaaatac agttcaaaca 960
aattcagttc catctagtaa tagtaataag caaattgctt atggaaatga gaataatcat 1020
ccatctggaa atggtcagag ttgttacaat cagcaacaac agaagaatcc tcctcagcaa 1080
caaacacaag gattcttcac gagggagttg aatttttcgg aattcggttt cgatggaagt 1140
agtaatagga atggaaattc atcggtttct tgcaagcctg aatcaggaga aatcttgaat 1200
tttggtgata gtactaaaaa aagtgcttcc agtgccaatg tgaacttgtt tacaggtcag 1260
tcccaatttg gggctgggga ggagaataat aacaagaaca agaaaagatc agctacttcc 1320
aggggaagca atgaagaagg aatgctttca tttgtttcag gtacagtttt gccttcttcg 1380
ggcatgaagt caggtggagg cggaggcgaa gactctgaac attcagatct cgaggcttca 1440
gtggtgaaag aagctgatag tagtagagtg gtagagcctg aaaagaggcc aaggaagcga 1500
ggtagaaagc cagcgaatgg acgggaggag ccattgaatc acgtcgaggc agagaggcaa 1560
aggagggaga aattgaacca aagattctac gcgcttagag ctgttgtacc aaatgtgtct 1620
aagatggaca aggcatcact ccttggagat gctatttcct atataaacga gttgaaatcg 1680
aagcttcaaa atacagagtc agataaagaa gacttgaaga gccaaataga agatttaaag 1740
aaagaatcaa ggcgccccgg tcctcctcca ccaccaaatc aagatctcaa gatgtctagc 1800
cacactggag gcaagattgt agacgtggat atagacgtta agatcatcgg atgggatgca 1860
atgattcgta tacaatgtaa taaaaagaat catccagccg caaggctaat ggcagcgctc 1920
atggaattag acctagacgt gcatcatgcc agtgtttcag ttgtcaacga tttgatgatc 1980
caacaagcca cagtgaaaat gggtagcaga cattacactg aagagcagct tagggtagcg 2040
ttgacatcga aaattgctga aacacactaa 2070
<210> 2
<211> 689
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 2
Met Thr Glu Tyr Ser Leu Pro Thr Met Asn Leu Trp Asn Asn Ser Thr
1 5 10 15
Ser Asp Asp Asn Val Ser Met Met Glu Ala Phe Met Ser Ser Asp Leu
20 25 30
Ser Phe Trp Ala Thr Asn Asn Ser Thr Ser Ala Ala Val Val Gly Val
35 40 45
Asn Ser Asn Leu Pro His Ala Ser Ser Asn Thr Pro Ser Val Phe Ala
50 55 60
Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ala Ser Thr Leu Ser Ala Ala Ala Thr Val
65 70 75 80
Asp Ala Ser Lys Ser Met Pro Phe Phe Asn Gln Glu Thr Leu Gln Gln
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Leu Ile Asp Gly Ala Arg Glu Thr Trp Thr Tyr Ala
100 105 110
Ile Phe Trp Gln Ser Ser Val Val Asp Phe Ser Ser Pro Ser Val Leu
115 120 125
Gly Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Gly Glu Glu Asp Lys Ala Lys Arg
130 135 140
Lys Leu Ser Val Ser Ser Pro Ala Tyr Ile Ala Glu Gln Glu His Arg
145 150 155 160
Lys Lys Val Leu Arg Glu Leu Asn Ser Leu Ile Ser Gly Ala Pro Pro
165 170 175
Gly Thr Asp Asp Ala Val Asp Glu Glu Val Thr Asp Thr Glu Trp Phe
180 185 190
Phe Leu Ile Ser Met Thr Gln Ser Phe Val Asn Gly Ser Gly Leu Pro
195 200 205
Gly Gln Ala Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Ile Trp Val Ala Gly Thr Glu
210 215 220
Lys Leu Ala Ala Ser His Cys Glu Arg Val Arg Gln Ala Gln Gly Phe
225 230 235 240
Gly Leu Gln Thr Ile Val Cys Ile Pro Ser Ala Asn Gly Val Val Glu
245 250 255
Leu Gly Ser Thr Glu Leu Ile Val Gln Ser Ser Asp Leu Met Asn Lys
260 265 270
Val Arg Val Leu Phe Asn Phe Ser Asn Asp Leu Gly Ser Gly Ser Trp
275 280 285
Ala Val Gln Pro Glu Ser Asp Pro Ser Ala Leu Trp Leu Thr Asp Pro
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Met Glu Val Arg Glu Ser Leu Asn Thr Val Gln Thr
305 310 315 320
Asn Ser Val Pro Ser Ser Asn Ser Asn Lys Gln Ile Ala Tyr Gly Asn
325 330 335
Glu Asn Asn His Pro Ser Gly Asn Gly Gln Ser Cys Tyr Asn Gln Gln
340 345 350
Gln Gln Lys Asn Pro Pro Gln Gln Gln Thr Gln Gly Phe Phe Thr Arg
355 360 365
Glu Leu Asn Phe Ser Glu Phe Gly Phe Asp Gly Ser Ser Asn Arg Asn
370 375 380
Gly Asn Ser Ser Val Ser Cys Lys Pro Glu Ser Gly Glu Ile Leu Asn
385 390 395 400
Phe Gly Asp Ser Thr Lys Lys Ser Ala Ser Ser Ala Asn Val Asn Leu
405 410 415
Phe Thr Gly Gln Ser Gln Phe Gly Ala Gly Glu Glu Asn Asn Asn Lys
420 425 430
Asn Lys Lys Arg Ser Ala Thr Ser Arg Gly Ser Asn Glu Glu Gly Met
435 440 445
Leu Ser Phe Val Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ser Gly Met Lys Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp Ser Glu His Ser Asp Leu Glu Ala Ser
465 470 475 480
Val Val Lys Glu Ala Asp Ser Ser Arg Val Val Glu Pro Glu Lys Arg
485 490 495
Pro Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Asn Gly Arg Glu Glu Pro Leu
500 505 510
Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu Lys Leu Asn Gln Arg
515 520 525
Phe Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val Pro Asn Val Ser Lys Met Asp Lys
530 535 540
Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Ile Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Lys Ser
545 550 555 560
Lys Leu Gln Asn Thr Glu Ser Asp Lys Glu Asp Leu Lys Ser Gln Ile
565 570 575
Glu Asp Leu Lys Lys Glu Ser Arg Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro
580 585 590
Asn Gln Asp Leu Lys Met Ser Ser His Thr Gly Gly Lys Ile Val Asp
595 600 605
Val Asp Ile Asp Val Lys Ile Ile Gly Trp Asp Ala Met Ile Arg Ile
610 615 620
Gln Cys Asn Lys Lys Asn His Pro Ala Ala Arg Leu Met Ala Ala Leu
625 630 635 640
Met Glu Leu Asp Leu Asp Val His His Ala Ser Val Ser Val Val Asn
645 650 655
Asp Leu Met Ile Gln Gln Ala Thr Val Lys Met Gly Ser Arg His Tyr
660 665 670
Thr Glu Glu Gln Leu Arg Val Ala Leu Thr Ser Lys Ile Ala Glu Thr
675 680 685
His
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggtctcta ttgaacaaag caccagtggt ctagtg 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtctcta ttgaacaaag caccagtggt ctagtg 36
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctggtctct gaatgtttta gagctagaaa tagcaagtta 40
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctggtctct aaacgagcag gagcatcgga agtgcaccag ccgggaatcg 50
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtattggtt tatctcatcg gaactgca 28

Claims (8)

1.一种提高番茄对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，在番茄中敲除MYC2基因；
所述MYC2基因选自以下两种中任意一种：
a、所述MYC2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；
b、任一其碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括步骤：
(1)构建含所述MYC2基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)工程菌；
(2)将所述根癌农杆菌工程菌介导转化目标番茄外植体，制备得到MYC2基因敲除的突变体植株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述番茄外植体为番茄子叶。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，将所述MYC2基因敲除的突变体植株进行正常生长管理，获得稳定遗传的转基因F2代及以后种子。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将敲除MYC2基因的番茄植株接种南方根结线虫，记录植株根结数目和表型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，接种南方根结线虫胁迫处理具体为：当敲除MYC2基因的番茄植株长至五叶一心时，接种南方根结线虫。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，接种的南方根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，接种南方根结线虫处理的时间为4周。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606260A (zh) * 2022-03-24 2022-06-10 浙江大学 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602686A (zh) * 2013-09-11 2014-02-26 上海交通大学 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用
CN107075519A (zh) * 2014-08-18 2017-08-18 瑞克斯旺种苗集团公司 允许产生螨的番茄植物
CN110229222A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 广西壮族自治区农业科学院 番茄抗南方根结线虫相关基因及其应用
CN111662368A (zh) * 2020-07-24 2020-09-15 石河子大学 橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602686A (zh) * 2013-09-11 2014-02-26 上海交通大学 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用
CN107075519A (zh) * 2014-08-18 2017-08-18 瑞克斯旺种苗集团公司 允许产生螨的番茄植物
CN110229222A (zh) * 2019-05-23 2019-09-13 广西壮族自治区农业科学院 番茄抗南方根结线虫相关基因及其应用
CN111662368A (zh) * 2020-07-24 2020-09-15 石河子大学 橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIN D，等: "Solanum lycopersicum transcription factor MYC2 (MYC2), mRNA", 《GENBANK登录号NM_001324483.1》 *
魏婧薇，等: "番茄中MYC2调控南方根结线虫的敏感性", 《北京农学院学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606260A (zh) * 2022-03-24 2022-06-10 浙江大学 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法
CN114606260B (zh) * 2022-03-24 2023-09-01 浙江大学 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法

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