CN110714023A - 番茄cti1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用，包括步骤：(1)分别构建含番茄CTI1基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄CTI1基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B；(2)将根癌农杆菌工程菌A和B分别介导转化目标植物外植体，制备得到CTI1基因过表达植株和突变体植株；(3)将CTI1基因过表达植株和突变体植株进行接种根结线虫胁迫处理，观察植株根结数目和表型。本发明研究发现，南方根结线虫感染可迅速诱导番茄根系中CTI1基因表达，cti1突变体增加了根结线虫敏感性，JA含量和JA相关基因的表达同时也受抑制，而CTI1过表达则相反。即CTI1参与RKN诱导的JA生物合成和信号转导通路的调控。

Description

番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用。

背景技术

进入21世纪以来，现代农业发展已经成为世界农业发展的主流。设施农业作为现代农业主要形式，已经成为各国农业发展重点。从20世纪80年代开始，我国保护地蔬菜种植面积总体呈上升趋势，据统计，2011年中国蔬菜产值达到1.26万亿元，首次超过粮食总产值，成为中国产值最大的农产品，而与之伴随的是种类繁多的蔬菜病虫害大量发生。我国设施农业的总体发展水平还不高，土壤连作问题严重，特别是土传虫害根结线虫(Root-knotnematodes；RKN；Meloidogyne spp.)以其隐蔽性和危险性已经成为我国保护地蔬菜生产的瓶颈。

根结线虫是在世界范围内造成农业重要经济作物损失的重要病害类型之一，每年造成约12.3％的作物产量损失和1570亿美元的经济损失。世界范围内发现并报道的根结线虫已经超过80种，根结线虫具有广泛的寄主范围，可以危害超过3000种的植物。据调查显示，南方根结线虫(M.incognita)、北方根结线虫(M.hapla)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)是造成我国农作物损失的4种常见线虫。由于南方根结线虫在我国大部分的蔬菜种植区均有分布，因此成为很多农业科研机构的重要研究对象。

番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科(Solanaceae)茄属中的一年生或多年生草本植物，别名西红柿、洋柿子，是世界范围内栽培最广、消费量最大的蔬菜作物。番茄品种类型丰富，既可鲜食作蔬菜又可作水果，番茄中的番茄红素成分可预防各种癌症，是世界上最流行的健康食品之一。番茄是我国设施栽培面积最大的蔬菜之一，其对根结线虫高度敏感，其产量和品质受到严重影响。

根结线虫危害保护地蔬菜的问题越来越严重，同时其还可因为传播和诱发一些真菌和细菌性病害而造成产量的大幅减少。南方根结线虫作为危害面积最大，程度最严重的优势种群，严重制约番茄产量和品质。虽然温室根结线虫的综合防治手段(农业操作、物理防治、生物防治、化学防治)在生产上应用普遍，但是并没有从根本上阻断根结线虫的危害，甚至在一定程度上可能对环境造成破坏。因此加快根结线虫抗性机制的研究以及抗性基因的发掘成为今后番茄抗线虫品种分子改良的重要依据，具有十分重要的科学和现实意义。

植物抵御根结线虫侵染的过程中，除了R基因介导的ETI，还可通过激活线虫相关分子模式(NAMPs)激活对根结线虫侵染的PTI基础防御抗性。JA信号在植物的ETI和PTI调控对根结线虫的抗性中起着重要作用。已有大量报道证明，E3泛素连接酶广泛参与调控植物生命活动，然而目前对其在植物根结线虫(RKNs)抗性中的作用机制尚不清楚。

发明内容

泛素化在感知各种内部激素和外部环境信号的信号转导中发挥重要的作用。本发明研究发现了RKN感染可迅速诱导番茄根中一种环型E3泛素连接酶基因CTI1(Solyc01g105620，CSNs-interacting-protein 1)的表达，见附图1，为了分析CTI1在番茄不同组织的表达情况，提取番茄叶、茎、根、果的RNA进行qRT-PCR检测，结果表明该基因在番茄根中的表达量显著高于叶片等其他组织。据此，本发明提供了一种番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用。

番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用，在目标植物中过表达番茄CTI1基因，包括步骤：

(1)分别构建含番茄CTI1基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄CTI1基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B；

(2)将所述根癌农杆菌工程菌A和B分别介导转化目标植物外植体，制备得到CTI1基因过表达植株和突变体植株；

(3)将所述CTI1基因过表达植株和突变体植株进行接种根结线虫胁迫处理，观察植株根结数目和表型。

本发明的应用是指碱基序列如SEQ ID NO：1所示的CTI1基因编码的蛋白在调控植物根结线虫抗性中的至少一种应用。具体表现为根结数目增加或减少以及根结线虫抗性增强或降低。

CTI1基因在植物中的表达量越低，在根结线虫侵染时所述植物根结数目越多，对根结线虫侵染越敏感；CTI1基因在所述植物中的表达量越高，在根结线虫侵染时所述植物根结数目越少，植株根结线虫抗性增强。

本发明所提供的培育抗根结线虫侵染的方法，具体可分为如下(A)或(B)。

(A)培育具有根结数目减少和/或植株对根结线虫抗性增强目的性状的转基因植物，包括如下步骤：

a)向目标植物中导入CTI1基因的超表达载体进行过表达，得到CTI1基因过表达的转基因植株；

b)将CTI1基因过表达的转基因植株与未处理的目标植物相比，得到具有根结数目减少和/或植株对根结线虫抗性增强目的性状的转基因植物。

(B)培育具有根结数目增加和/或植株对根结线虫抗性减弱目的性状的转基因植物，包括如下步骤：

a)向目标植物中导入CTI1基因的CRISPR/Cas9载体进行抑制表达，得到CTI1基因抑制表达的突变体植株；

b)将CTI1基因抑制表达的突变体植株与未处理的目标植物相比，得到具有根结数目增加和/或植株对根结线虫抗性减弱目的性状的转基因植物。

在上述方法(A)中，CTI1基因可通过含有所述基因的重组表达载体导入目的植物中，重组表达载体可用已有的pFGC5941、pCAMBIA1300和pBI121等或其它衍生植物表达载体，使用植物表达载体构建重组载体时，可以使用组成型、组织特异型或诱导型启动子。

在上述方法(B)中，在目的植物中对CTI1基因进行抑制表达，可为任何可降低目的植物中所述CTI1基因的表达的方法。在本发明中，在目的植物中对CTI1基因进行抑制表达是通过构建该基因的CRISPR/Cas9载体进而通过农杆菌侵染的方式实现的。

所述番茄CTI1基因选自以下两种中任意一种：

a、所述番茄CTI1基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

b、任一其碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的DNA分子。

所述根癌农杆菌工程菌A和根癌农杆菌工程菌B的制备方法如下：

(a)从野生型番茄幼嫩叶片中提取总RNA；

(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；

(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，SlCTI1-OE-F(SEQ ID NO：3)和SlCTI1-OE-R(SEQ ID NO：4)为引物(含AscI和KpnI限制性酶切位点)对CTI1基因进行PCR扩增，得到番茄CTI1基因的CDs全长1056bp；将CaMV 35S启动子驱动的植物转化载体pFGC1008-3HA，用AscI和KpnI限制性内切酶进行酶切使其线性化，然后进行片段与载体的同源重组，构建番茄CTI1基因的过表达载体，命名为pFGC1008-SlCTI1-3HA。

(d)番茄CTI1基因，全长1612bp，由两个外显子组成，在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄CTI1基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，在距离起始密码子12bp和638bp处分别设计引物sgRNA-CTI1-12-F(SEQ IDNO：5)，sgRNA-CTI1-12-R(SEQ ID NO：6)，sgRNA-CTI1-638-F(SEQ ID NO：7)，sgRNA-CTI1-638-R(SEQ ID NO：8)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个gRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。

将合成的sgRNA正反向引物进行退火形成含有粘性末端接头的双链sgRNA，稀释200倍后与经过BbsI酶切过的sgRNA-Cas9骨架载体进行16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄(Amp⁺)的LB固体培养基37℃过夜培养后，挑取单克隆，用M13F通用引物和退火时的下游引物进行菌液PCR，阳性单克隆进行测序鉴定，获得阳性sgRNA-CTI1-12、sgRNA-CTI1-638克隆。

以AtU6-F-KpnI为前引物，AtsgR-R-EcoRI为后引物，以阳性载体sg RNA-CTI1-638为模板，扩增第二个sgRNA序列，然后连入含有sgRNA-CTI1-12和Cas9序列的骨架载体。将测序正确的阳性质粒sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638和植物表达载体pCAMBIA1300分别用HindIII和Eco RI双酶切，将回收的sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9片段和线性化的pCAMBIA1300进行过夜连接，转化到DH5α感受态中，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基中37℃过夜培养，挑单克隆培养，用1300-seq-R和AtUBQ-seq-R引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆后测序。将阳性质粒命名为pCAMBIA1300-sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9。

(e)将步骤(c)和(d)获得的过表达载体pFGC1008-SlCTI1-3HA和CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Ca s9分别转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄CTI1基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄CTI1基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B。

本发明中根结数目的观察方法如下：

采用酸性品红染色法，用于根结线虫感染的根系表型观察。具体方法为：

(1)将根结线虫侵染过的番茄根系用自来水冲洗干净后，根据根系的幼嫩程度，选用1.5％～5％的次氯酸钠溶液对根系进行漂白，此过程需5～10分钟，以除去根系内影响染色的杂质；

(2)然后用自来水反复冲洗直至没有次氯酸钠的刺鼻味，以免影响后续染色效果；

(3)用吸水纸将根系水分吸干，在3.5％的酸性品红溶液中浸泡，加热煮沸后室温冷却；

(4)倒掉品红染色液，番茄根系用自来水冲洗，除去表面多余的品红液体；

(5)加入酸性甘油后加热煮沸后立即将根系转移到常温酸性甘油中；

(6)24h后进行拍照和根结数统计。

所述目标植物为双子叶植物或单子叶植物，本发明中优选双子叶植物番茄。

所述接种根结线虫胁迫处理具体为：当番茄CTI1基因过表达植株和突变体植株长至五叶一心时，接种根结线虫。

作为优选，接种的根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。

南方根结线虫的培养与接种处理的步骤为：

(1)南方根结线虫由中国农业科学院彭德良教授馈赠，在农业试验站温室中用普通栽培番茄在沙壤土中繁殖线虫，室温维持在22～26℃。2个月左右番茄根系形成肉眼可见的根结块。

(2)将收获的根结用自来水冲洗干净后，用0.5％的次氯酸钠水溶液浸泡5min，再用蒸馏水清冲洗至没有次氯酸钠的刺鼻味为止。

(3)将根系绞碎，将匀浆混合液依次过80目、200目、500目筛子，继续用无菌水反复冲洗根系碎渣3次后过滤，最后在500目筛子上富集根结线虫虫卵。

(4)将虫卵用蒸馏水冲洗到烧杯中。将虫卵悬浮液搅拌均匀，用移液枪吸取10μL于载玻片上，在50倍光学显微镜下观察统计虫卵数目并估算虫卵总量。按照10％～20％的孵化率计算本次所得线虫数量。

(5)用移液枪将卵悬浮液吸打到铺于10cm×10cm的方形培养皿中的灭菌吸水纸。将培养皿置于28℃恒温培养箱中，期间注意保持吸水纸呈湿润状态。

(6)2～3天后，用蒸馏水从吸水纸上方冲洗后下渗到培养皿，实验用的J2期线虫随蒸馏水被冲洗出来。所获得的J2期线虫尽量在24h内接种使用，避免虫体死亡。

(7)在CTI1基因过表达和突变体植株长至五叶一心时进行接种，每株约接种1000条J2期线虫，期间正常浇水。

植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，每次用Hoagland营养液浇灌。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m^-2s^-1光照强度。

接种根结线虫胁迫处理的时间为4周。

CTI1基因转基因植株以番茄栽培品种Ailsa Craig为空白对照。

线虫处理结束后与相同种植条件下未进行线虫处理的对照组进行比对，观察CTI1基因转基因植株及其空白对照与未经胁迫处理的植株间的差异。

番茄根中JA、JA-Ile含量测定步骤为：

JA、JA-Ile的提取和定量按下述方法：

(1)将100mg番茄根系样品装于带有钢珠的2mL离心管，置于液氮中，在磨样仪中研磨成粉末；

(2)加入1mL色谱级乙酸乙酯，样品中含有终浓度为100ng mL^-1同位素标记的内参标样D₅-JA、D₅-JA-Ile，匀浆样品于4℃层析柜中避光震荡过夜；

(3)在4℃，12000g，离心10min。收集上清液，再加入1mL乙酸乙酯对沉淀进行再提取，4℃，12000g，离心10min；

(4)合并上清液于10mL离心管中，N₂吹干；

(5)加500μL 70％(v/v)色谱级甲醇，充分涡旋，将离心管中提取物复溶，4℃，12000g，离心10min；

(6)将上清液转移到棕色玻璃小瓶中，然后用HPLC-MS/MS进行分析测定(AgilentTechnologies，California，America)。

本研究表明，南方根结线虫感染可迅速诱导番茄根系中CTI1基因表达，cti1突变体增加了根结线虫敏感性，JA含量和JA相关基因的表达同时也受抑制，而CTI1过表达则相反。

附图说明

图1为qRT-PCR检测CTI1基因在番茄植株的叶、茎、根、果实中的组织特异性表达结果。

图2为35S：CTI1过表达载体的构建。其中，图2A为pFGC1008-3HA过表达载体简易示意图；图2B为CTI1 CDs PCR扩增产物凝胶电泳图。

图3为用于大片段删除的CRISPR/Cas9载体构建示意图。其中，图3A为载体gRNAs位置结构图；图3B为两个gRNA在番茄CTI1基因组上的位置及序列，gRNA特异识别序列为蓝色字体，位于番茄CTI1基因的第一个外显子上。

图4为CTI1过表达转基因阳性植株的验证。其中，图4A为CTI1过表达载体烟草瞬时表达蛋白大小；图4B为实时荧光定量PCR检测过表达转基因阳性植株；图4C为转基因阳性植株在蛋白水平上的检测。WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig；OE为CTI1过表达植株；OE-CTI1-1和OE-CTI1-2为CTI1过表达植株的两个株系。

图5为番茄CTI1 CRISPR/Cas9敲除植株测序结果。

图6为野生型番茄Ailsa Craig在接种根结线虫0h，24h，48h，72h等不同时间点时CTI1的表达量分析。

图7为番茄CTI1不同基因型植株接种根结线虫4周后的根结线虫表型观察。图7A为植株根部代表性的酸性品红染色结果，标尺＝2cm；图7B为对A图的根结数量统计结果。

图8为根结线虫侵染24h后CTI1不同基因型植株中JA含量变化。

图9为根结线虫侵染24h后CTI1不同基因型植株中JA-Ile含量变化。

图10为根结线虫侵染24h后CTI1不同基因型植株中JA相关基因表达量分析。LOXD、AOC为JA合成基因，COI1、PI-2为JA响应基因。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

番茄CTI1基因的克隆及载体构建

1.番茄总RNA提取

采用Tiangen Plant total RNA extraction kit提取番茄幼嫩叶片的总RNA，其步骤为：

(1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液RZ，涡旋混匀；

(2)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)4℃，12000rpm离心5min，去上清，转入一个新的无RNase的离心管中；

(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；

(5)4℃，12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在上层水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；

(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；

(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；

(8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；

(9)重复操作步骤(8)；

(10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余废液；

(11)吸附柱于超净台吹干5min后，转入一个新的无RNase离心管中，加入50μLRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；

(12)用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀检验RNA样品含量与纯度，浓度为781ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.10。

2.基因克隆和根癌农杆菌工程菌构建

采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。以所得cDNA为模板，SlCTI1-OE-F(SEQ ID NO：3)和SlCTI1-OE-R(SEQ ID NO：4)为引物(含AscI和KpnI限制性酶切位点)对CTI1基因进行PCR扩增，得到番茄CTI1基因的CDs全长1056bp；将CaMV 35S启动子驱动的植物转化载体pFGC1008-3HA，用AscI和KpnI限制性内切酶进行酶切使其线性化，然后进行片段与载体的同源重组，构建番茄CTI1基因的过表达载体，命名为pFGC1008-SlCTI1-3HA。图2为35S：CTI1过表达载体的构建。其中，图2A为pFGC1008-3HA过表达载体简易示意图；图2B为CTI1 CDs PCR扩增产物凝胶电泳图。

由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，结果表明所克隆的序列与solgenomics中公布的序列(Solyc01g105620)一致。

番茄CTI1基因，全长1612bp，由两个外显子组成，在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄CTI1基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，在距离起始密码子12bp和638bp处分别设计引物sgRNA-CTI1-12-F(SEQ IDNO：5)，sgRNA-CTI1-12-R(SEQ ID NO：6)，sgRNA-CTI1-638-F(SEQ ID NO：7)，sgRNA-CTI1-638-R(SEQ ID NO：8)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个gRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。将合成的sgRNA正反向引物进行退火形成含有粘性末端接头的双链sgRNA，稀释200倍后与经过BbsI酶切过的sgRNA-Cas9骨架载体进行16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄(Amp⁺)的LB固体培养基37℃过夜培养后，挑取单克隆，用M13F通用引物和退火时的下游引物进行菌液PCR，阳性单克隆进行测序鉴定，获得阳性sgRNA-CTI1-12、sgRNA-CTI1-638克隆。以AtU6-F-KpnI为前引物，AtsgR-R-EcoRI为后引物，以阳性载体sgRNA-CTI1-638为模板，扩增第二个sgRNA序列，然后连入含有sgRNA-CTI1-12和Cas9序列的骨架载体。将测序正确的阳性质粒sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638和植物表达载体pCAMBIA1300分别用HindIII和EcoRI双酶切，将回收的sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9片段和线性化的pCAMBIA1300进行过夜连接，转化到DH5α感受态中，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基中37℃过夜培养，挑单克隆培养，用1300-seq-R和AtUBQ-seq-R引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆后测序。将阳性质粒命名为pCAMBIA1300-sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9。图3为用于大片段删除的CRISPR/Cas9载体构建示意图。其中，图3A为载体gRNAs位置结构图；图3B为两个gRNA在番茄CTI1基因组上的位置及序列，gRNA特异识别序列为蓝色字体，位于番茄CTI1基因的第一个外显子上。

将获得的过表达载体pFGC1008-SlCTI1-3HA和CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9分别转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄CTI1基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄CTI1基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌B。

所用引物序列如下：

SlCTI1-OE-F:5′-ttacaattaccatggggcgcgccATGGTGTTCCATGATCGAAA GC-3′(SEQID NO：3)，

SlCTI1-OE-R:5′-aacatcgtatgggtaggtaccTCACCGAAGAAGAACAGCAC TCT-3′(SEQID NO：4)，

sgRNA-CTI1-12-F:5′-TGATTGCAAAGATGAGCTTTCGATCA-3′(SEQ ID NO：5)，

sgRNA-CTI1-12-R:5′-AAACTGATCGAAAGCTCATCTTTGCA-3′

(SEQ ID NO：6)，

sgRNA-CTI1-638-F:5′-TGATTGGCACGGCACGTGGGACAAT-3′

(SEQ ID NO：7)，

sgRNA-CTI1-638-R:5′-AAACATTGTCCCACGTGCCGTGCCA-3′

(SEQ ID NO：8)。

实施例2

构建番茄CTI1基因过表达植株和突变体植株

总的来说，利用叶盘法，通过农杆菌介导侵染番茄子叶，将目的载体pFGC1008-SlCTI1-3HA和pCAMBIA1300-sgRNA-CTI1-12-sgRNA-CTI1-638-Cas9转化进番茄子叶，利用潮霉素初步筛选出候选转基因植株。以潮霉素基因序列的正向引物和反向引物配对，PCR扩增方法筛选所获得的转基因植株。

具体步骤如下：

1)培养基的配置

播种培养基：2.15g/L MS粉+100mg/L肌醇+10g/L蔗糖+8g/L琼脂。PH值为5.8。

看护培养基：醇+1.3g/L盐酸硫胺素+0.2mg/L 2,4-D+200mg/L KH₂PO₄+0.1mg/L KT+7.5g/L琼脂。PH值为5.8。

2Z选择再生培养基：4.44g/L MS粉+30g/L蔗糖+100mg/L肌醇+2mg/L ZR+300mg/Ltimentin+6mg/L潮霉素。PH值为5.8。

0.2Z选择再生培养基：4.44g/L MS粉+30g/L蔗糖+100mg/L肌醇+0.2mg/L ZR+300mg/L timentin+6mg/L潮霉素。PH值为5.8。

生根培养基：4.44g/L MS粉+30g/L蔗糖+100mg/L肌醇+300mg/L timentin+6mg/L潮霉素。PH值为5.8。

液体MS0.2培养基：4.44g/L MS粉+20g/L蔗糖+100mg/L肌醇+0.2mg/L盐酸硫胺素。PH值为5.8。用于悬浮侵染的农杆菌。

YEB培养基：5g牛肉膏，5g蛋白胨，1g酵母提取物，5g蔗糖，0.5g MgSO₄·7H₂O，用蒸馏水定容至1L，调节pH值为7.0，121℃高压灭菌20min备用。YEB固体培养基每升加琼脂粉15g，其它分成份同液体培养基。

2)无菌苗的培养

番茄种子用自来水浸泡(或用摇床28℃200r/min)6～8h，然后用75％酒精消毒30sec，之后在10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至露白后转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。

3)准备外植体、培养农杆菌

种子发芽后一周左右，待子叶伸展开真叶尚未长出时，将无菌苗的子叶用新的手术刀切成两段，子叶带有一小截叶柄，平铺于看护培养基中预培养24h(避光，过夜即可，看护培养时间过长容易导致侵染过度)。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于30mL含有抗生素的LB(150mL锥形瓶)中，28℃、200r/min过夜培养至对数中期(OD600≈1.0，约16～24h)。先摇菌，再切子叶(12～20h之间接种)。

4)转化再生

将含有目的载体质粒的根癌农杆菌工程菌A菌液和B菌液从-80℃冰箱中取出，在含有抗生素的YEB平板上活化后，挑取农杆菌单菌落，接种于2mL含有抗生素的YEB中，28℃，200rpm震荡过夜培养，再按1:100比例扩摇30mL，28℃，200rpm过夜培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0。培养好的农杆菌，4℃4000r/min离心10min；弃上清，再加入15mL悬浮培养基MS 0.2将菌体悬浮备用。将预培养的子叶外植体转移到倒有15ml体积的MS 0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液，避光侵染2～3min，并轻轻晃动培养皿。用镊子将外植体轻轻捞起，将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，转移到灭菌滤纸上吸干残留的菌液，反面朝上平铺回原来的看护培养基中，22℃黑暗共培养48h。

共培养后的外植体，正面朝上转入2Z培养基上，25℃、16h光照/8h黑暗光周期下培养，每隔两周更换一次新鲜的2Z培养基，待分化出芽后将褐化的外植体切除，将分化好的芽转入0.2Z培养基中选择培养。每隔三周更换一次新鲜培养基。

5)生根培养与移栽

待再生芽长至1cm左右时，将芽切下(可以不切，以免伤害生根部位)，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至草炭：蛭石＝3:1基质的营养钵中，得番茄CTI1基因过表达植株和突变体植株。

实施例3

转基因植株的分子检测

(1)PCR法在DNA水平上检测转基因植株

以CTAB法小量快速提取番茄转基因植株的DNA，步骤如下：

1.取50～100mg番茄叶片于1.5mL离心管中，加入钢珠，液氮中速冻，将样品研磨成粉末后加500μL CTAB buffer；

2.55℃水浴15min，期间颠倒混匀几次；

3.加500μL氯仿：异戊醇(24:1)，涡旋混匀，离心，12000rpm，5min；

4.将上清移至新的离心管中，加1/10体积的醋酸钠(3M)和2倍体积的冰无水乙醇，涡旋混匀，-20℃沉淀1h；

5.离心，12000rpm，3min，可见底下白色沉淀，即为DNA，弃上清；

6.加1mL预冷的70％乙醇，上下摇晃洗涤，12000rpm离心1min，弃上清；

7.重复洗涤一次，尽量去除残留液体，在超净台上吹干，加50μL ddH₂O溶解，-20℃保存。

1)番茄CTI1过表达植株的PCR检测

过表达载体pFGC1008中含有整合到植物基因组的潮霉素抗性基因，因此，用潮霉素筛选基因的引物可以鉴定过表达阳性转基因植株。引物如下，检测片段长度为812bp。图4为CTI1过表达转基因阳性植株的验证。其中，图4A为CTI1过表达载体烟草瞬时表达蛋白大小；图4B为实时荧光定量PCR检测过表达转基因阳性植株；图4C为转基因阳性植株在蛋白水平上的检测。WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig；OE为CTI1过表达植株；OE-CTI1-1和OE-CTI1-2为CTI1过表达植株的两个株系。

HRH-F:5′-CGACAGCGTCTCCGACCTGA-3′

HRH-R:5′-CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3′

2)CTI1 CRISPR/Cas9突变体植株的PCR检测

在番茄CTI1基因的sgRNAs的序列位置附近设计特异性引物检测靶基因序列的变化情况。引物如下，检测片段长度为1003bp。可以根据PCR产物条带的大小及测序结果筛选出CTI1敲除转基因植株中的纯合突变体。PCR检测结果送测，图5为番茄CTI1 CRISPR/Cas9敲除植株测序结果。

CRISPR-CTI1-F:5′-AGGTTTGGTGAGACAAGCAG-3′

CRISPR-CTI1-R:5′-AAGCTACACCTCGCTATCAC-3′

(2)利用qRT-PCR在转录水平检测番茄CTI1过表达阳性植株

番茄总RNA用植物总RNA提取试剂盒(Tiangen，DP419)提取。具体步骤如下：

1)RNA样品在液氮中研磨成粉末，加入1mL预冷的TrizolRNA提取液，涡旋后室温放置5min。

2)4℃，12000g离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管。

3)在通风橱加200μL三氯甲烷到上清中，剧烈震荡10s，室温放置2min，待溶液分层。此时RNA溶解在上层水相中。

4)4℃，12000L离心10min，用移液枪小心将上清转移到新的1.5mL离心管，注意不要吸出下层液体。

5)往上清中加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后转移到吸附柱中，4℃，12000g离心30s，倒掉下层液体。

6)吸500μL的去蛋白液RD到吸附柱中，4℃，12000g离心30s，倒掉下层液体。

7)吸600μL的漂洗夜RW到吸附柱中，室温静置2min后4℃，12000g离心30s，倒掉下层液体。

8)重复步骤7。

9)将吸附柱4℃，12000g离心空转2min后取出在超净工作台吹干残余的酒精。

10)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，加入RNAase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000g离心2min。用NanoDrop仪器检测样品RNA浓度。用RNAase-Free ddH₂O将浓度调成一致后-80℃保存。

1μg总RNA采用反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT kit，Toyobo)，反转录成cDNA。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用Roche Light

480II实时荧光检测系统，并使用SYBR Green RT-PCR Kit荧光染料试剂盒(南京诺唯赞)进行基因表达分析，引物见表1。在20μL反应体系中包含10μL 2×SYBR Green Supermix，0.4μL正义及反义端的引物(10μM)，1μL cDNA模板以及8.2μL ddH20。PCR反应条件为：95℃3min；95℃变性10S，58℃退火30S，40个循环。在每个循环的延伸末期采集荧光数据。番茄Actin基因作为内参。根据熔解曲线判断引物的特异性。引物序列如表1所示。基因相对表达量参照Livak和Schmittgen(Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand the22DDCT method,Methods,2001,25:402～408)的方法计算。试验均为三次重复的结果。qRT-PCR结果见附图5B。

表1实时荧光定量PCR引物

(3)利用Western Blot在蛋白水平检测番茄CTI1过表达阳性植株

取0.3g番茄叶片于1.5mL离心管中，放入钢珠，在磨样仪中研磨成粉末，加入适量的蛋白提取液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，1mMphenylmethylsulphonyl fluoride(PMSF)和0.2％β-mercaptoethanol)混合成匀浆，在冰上放置15min，4℃，12000g离心20min，取上清。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。蛋白变性后用10％的SDS-PAGE胶分离。SDS-PAGE胶分离蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Tween 20)室温封闭1h，用鼠的HA单克隆抗体(Abcam，ab187915)室温孵育1h，再用羊抗鼠(Millipore，AP124P)的HRP二抗室温孵育1h，抗原抗体复合物利用鲁米诺化学发光检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，34080)检测。Western Blot结果见附图5C。

实施例4

对得到的番茄CTI1基因过表达植株和突变体植株进行接种根结线虫处理。

番茄CTI1基因过表达植株和突变体植株接种根结线虫处理的具体方法如下：

将野生型WT、过表达植株和突变体植株均分为两组，一组为对照组，一组为实验组。

当番茄长至五叶一心时，对实验组进行接种线虫处理，每株约接种1000条J2期线虫，期间正常浇水。

植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，每次用Hoagland营养液浇灌。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m^-2s^-1光照强度。

线虫处理时间为4周。

实验结束即进行取样并测定相关指标。结果如图6～10所示。

图6为野生型番茄Ailsa Craig在接种根结线虫0h，24h，48h，72h等不同时间点时CTI1的表达量分析。

图7为番茄CTI1不同基因型植株接种根结线虫4周后的根结线虫表型观察。图7A为植株根部代表性的酸性品红染色结果，标尺＝2cm；图7B为对A图的根结数量统计结果。

图8为根结线虫侵染后CTI1不同基因型植株中JA含量变化。

图9为根结线虫侵染后CTI1不同基因型植株中JA-Ile含量变化。用1000条J2期线虫侵染生长5周的番茄后24小时取根样进行JA和JA-Ile含量的测定。

图10为根结线虫侵染后CTI1不同基因型植株中JA相关基因表达量分析。用1000条J2期线虫侵染5周大小的番茄，24小时后取根样分析CTI1不同基因型植株中JA合成基因LOXD、AOC和JA响应基因COI1、PI-2的表达量变化。

由图1可知，CTI1基因在野生型番茄根中的表达量显著高于叶片等其他组织。为了验证CTI1是否参与番茄对RKN的抗性，生长5周大小的番茄用1000条J2期线虫接种后分别在0h，24h,48h,72h取根样后提取RNA后进行CTI1的表达量分析，发现在野生型番茄根系中该基因受RKN的诱导，且在RKN侵染24h表达量最高，比对照提高3.8倍，如图6所示。因此，我们认为CTI1可能介导番茄对RKN的抗性。

用cti1突变体cti1-1，cti1-2和CTI1过表达株系OE-CTI1-1，OE-CTI1-2以及野生型WT对照植株为实验材料，每株番茄接种1000条孵化的J2期幼虫，培养4周后，我们发现cti1突变体比野生型的根结数目显著性增多，而CTI1过表达植株的根结数目比野生型显著性减少，从根系品红染色结果可以明显看到该差异。如图7所示。

由于JA和JA-Ile在植物RKN基础防御反应中扮演重要的角色，故对其含量进行测定。如图8和图9所示，cti1突变体cti1-1，cti1-2在正常情况下JA和JA-Ile的含量比野生型植株少，CTI1过表达植株正好相反。当RKN侵染后，JA和JA-Ile的含量在野生型中迅速增加，过表达植株比野生型受RKN诱导的JA和JA-Ile的合成显著性增加，而突变体的含量几乎不受RKN的诱导。结果显示CTI1参与RKN的抗性。

如图10所示，过表达CTI1增加了本底的JA和JA-Ile含量，且JA的合成基因AOC、LOXD与JA响应基因COI1和PI-2的本底表达量也较野生型增加，在RKN侵染后，JA和JA-Ile含量和JA相关的基因AOC、LOXD、COI1和PI-2的表达量则显著性提高，而在基因敲除突变体cti1-1、cti1-2中正好相反。以上结果表明CTI1正调控JA介导的RKN抗性。综上，这些结果表明CTI1参与RKN诱导的JA生物合成和信号转导通路的调控。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 1

atggtgttcc atgatcgaaa gctcatcttt gaatcacttg ataattctac tggtaaaact 60

tgtaacagtt attattgtaa cccaaaagag aatctttctc caatttgtcc aatttcatgt 120

atgtatattt gttacccaat ttgtagtttt cccctgtttt ctgaaatcga accaccattg 180

ccaccaaact ttttcacccc caaagttcct gtttctcagt ctccacataa acccattatt 240

tctatgtcct tgattattct gttttctgtc ttggctactt ctttcttcct tttttgttgc 300

ttcgtggttt acagaattcg caaagcaaga attttgtcac gaccgcagga accagttgaa 360

gaagaagaag aagagtttgg tgatatcgtt gatgaagata ttcatggacc tatggtggat 420

caccctatat ggtatattag aacagtgggt cttcaaccat caatcatcag tgccatcacg 480

atttgcaagt ataaaacaga ggaaggaata attgaaggaa cagattgctc tgtttgcttg 540

tgtgagtttc aagaagatga aactcttagg attttgccaa actgtaacca tgcttttcac 600

ataccttgta ttgacacttg gcttagatca cataccaatt gtcccacgtg ccgtgccggc 660

attgtcattg ccccagctgc tgatccatct ttccctgaac agatttcagg gcggagacat 720

gaagaagaag ctcattcggg aaattcagag aatggcacag aattatctct tgacatggaa 780

aacgaaggcg agtcattaga actacgtagt atggatatga gtggaaattc caaggaagat 840

gtggggaatg gtactaatga aggagtactg ttaagtgaat ttagtgcgtc aaggagatca 900

acatcatttg aatctttatc tacagcttca acattaactt gtacttcagt atcacagagt 960

tgtgagatgt cagcacgaat gaaaaatctt tgtttggaca gagcaatgca agaacatcaa 1020

atgataagaa gaagccagag tgctgttctt cttcggtga 1059

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 2

Met Val Phe His Asp Arg Lys Leu Ile Phe Glu Ser Leu Asp Asn Ser

1 5 10 15

Thr Gly Lys Thr Cys Asn Ser Tyr Tyr Cys Asn Pro Lys Glu Asn Leu

20 25 30

Ser Pro Ile Cys Pro Ile Ser Cys Met Tyr Ile Cys Tyr Pro Ile Cys

35 40 45

Ser Phe Pro Leu Phe Ser Glu Ile Glu Pro Pro Leu Pro Pro Asn Phe

50 55 60

Phe Thr Pro Lys Val Pro Val Ser Gln Ser Pro His Lys Pro Ile Ile

65 70 75 80

Ser Met Ser Leu Ile Ile Leu Phe Ser Val Leu Ala Thr Ser Phe Phe

85 90 95

Leu Phe Cys Cys Phe Val Val Tyr Arg Ile Arg Lys Ala Arg Ile Leu

100 105 110

Ser Arg Pro Gln Glu Pro Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Phe Gly Asp

115 120 125

Ile Val Asp Glu Asp Ile His Gly Pro Met Val Asp His Pro Ile Trp

130 135 140

Tyr Ile Arg Thr Val Gly Leu Gln Pro Ser Ile Ile Ser Ala Ile Thr

145 150 155 160

Ile Cys Lys Tyr Lys Thr Glu Glu Gly Ile Ile Glu Gly Thr Asp Cys

165 170 175

Ser Val Cys Leu Cys Glu Phe Gln Glu Asp Glu Thr Leu Arg Ile Leu

180 185 190

Pro Asn Cys Asn His Ala Phe His Ile Pro Cys Ile Asp Thr Trp Leu

195 200 205

Arg Ser His Thr Asn Cys Pro Thr Cys Arg Ala Gly Ile Val Ile Ala

210 215 220

Pro Ala Ala Asp Pro Ser Phe Pro Glu Gln Ile Ser Gly Arg Arg His

225 230 235 240

Glu Glu Glu Ala His Ser Gly Asn Ser Glu Asn Gly Thr Glu Leu Ser

245 250 255

Leu Asp Met Glu Asn Glu Gly Glu Ser Leu Glu Leu Arg Ser Met Asp

260 265 270

Met Ser Gly Asn Ser Lys Glu Asp Val Gly Asn Gly Thr Asn Glu Gly

275 280 285

Val Leu Leu Ser Glu Phe Ser Ala Ser Arg Arg Ser Thr Ser Phe Glu

290 295 300

Ser Leu Ser Thr Ala Ser Thr Leu Thr Cys Thr Ser Val Ser Gln Ser

305 310 315 320

Cys Glu Met Ser Ala Arg Met Lys Asn Leu Cys Leu Asp Arg Ala Met

325 330 335

Gln Glu His Gln Met Ile Arg Arg Ser Gln Ser Ala Val Leu Leu Arg

340 345 350

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttacaattac catggggcgc gccatggtgt tccatgatcg aaagc 45

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacatcgtat gggtaggtac ctcaccgaag aagaacagca ctct 44

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgattgcaaa gatgagcttt cgatca 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgatcg aaagctcatc tttgca 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgattggcac ggcacgtggg acaat 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacattgtc ccacgtgccg tgcca 25

Claims (9)

1.番茄CTI1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达番茄CTI1基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括步骤：

(1)构建含番茄CTI1基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；

(2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到CTI1基因过表达植株；

(3)将所述CTI1基因过表达植株进行接种根结线虫胁迫处理，观察植株根结数目和表型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述番茄CTI1基因的碱基序列如SEQ IDNO：1所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述目标植物为双子叶植物或单子叶植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目标植物为番茄。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述接种根结线虫胁迫处理具体为：当番茄CTI1基因过表达植株长至五叶一心时，接种根结线虫。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，接种的根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述接种根结线虫胁迫处理的时间为4周。

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