CN114891801B - 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 - Google Patents

本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为马铃薯Y病毒科病毒，Pelota基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过克隆本氏烟中的Pelota基因并构建融合有Flag标签的双元转化载体，使用农杆菌介导的T‑DNA方式进行遗传转化，构建了本氏烟的转基因植物。本发明获得的本氏烟Pelota转基因植物能够对马铃薯Y病毒科内的多种病毒具有广谱的抗病功能。

Description

本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物 培育方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种抑制马铃薯Y病毒科病毒侵染的转基因 植物。
背景技术
植物病毒是危害粮食作物、经济作物、牧草、药材、果树的重要病原，自十九世纪初期 首次被人类发现，在世界范围内造成严重的经济损失。因此，提高作物抗病性、选育抗病品 种是当前粮食和经济作物育种的重要目标之一。
马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，是种类最多、危害最为严重的植物RNA病毒。而马铃 薯Y病毒属是最大的植物病毒属。该属病毒含有的典型病毒种有：芜菁花叶病毒、马铃薯Y 病毒、大豆花叶病毒、甘蔗花叶病毒、西葫芦黄花叶病毒、李痘病毒等。该属病毒寄主范围较广传播性强，侵染寄主以马铃薯、黄瓜、辣椒、番茄为主，还能够侵染茄科的烟草、豆科 的大豆、葫芦科的南瓜、藜科以及十字花科等多种作物，每年为全球作物产量造成了重大损失。
其中，马铃薯Y病毒(PVY)、芜菁花叶病毒、烟草脉带花叶病毒在农作物中最为常见， 作物感染病毒常表现出花叶、褪绿、环斑、叶脉坏死等症状，由于病毒株系不同而表现出不 同症状。
受PVY侵染的马铃薯植株常表现出多种不同症状，如花叶、皱缩、坏死等，侵染严重时 可导致植株矮化或早衰。
侵染烟草的症状主要有脉带花叶型、脉斑型和褪绿斑点型。脉带型：在烟株上部叶片呈 黄绿花叶斑驳，脉间色浅，叶脉两侧深绿，形成明显的脉带，严重时出现卷叶或灼斑，烟株 矮化。脉斑型：下部叶片发病，叶片黄褐，主侧脉从叶基开始呈灰黑或红褐色坏死，叶柄脆， 摘下可见维管束变褐，茎秆上现红褐或黑色坏死条纹。褪绿斑点型：初期与脉带型相似，但 上部叶片现褪绿斑点，后中下部叶产生褐色或白色小坏死斑，病斑不规则，严重时整叶斑点 密集，形成穿孔或脱落。该属病毒的许多种会对农作物的产量产生极其恶劣的影响，降低作 物产量20％～80％，更有甚者出现了绝收的状况。
植物病毒主要通过3种方式侵染寄主植物，分别为媒介传播、机械传播、种子传播等。 马铃薯Y病毒属病毒可通过虫媒的方式进行传播，在自然界中主要以蚜虫、植物汁液进行传 播，传播方式属于非持久性，一些病毒还可经过种子进行传播。
现阶段尚没有有效的化学药剂对该科病毒进行防治，在防治上仍然以治蚜防病和农业防 治为主，例如对零星发病烟株及早拔除、培育健康植株对种子消毒等措施，但这样的防治方 式有一定的困难且效率不高，对病毒病防控最重要的还是选育抗病品种。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用。
本发明的第二目的是提供一种本氏烟Pelota高表达植物的培育方法。
本发明通过叶盘法获得本氏烟Pelota转基因植物，获得的转基因植物能够显著减轻多种 马铃薯Y病毒科病毒的侵染，有效控制该病毒的危害。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为马铃薯Y病毒科病毒。 所述Pelota基因序列如SEQ ID NO:1所示。通过农杆菌感染叶片外植体并短期共培养的方式， 将Pelota基因导入目的植物中，获得的本氏烟Pelota高表达植物能够显著减轻马铃薯Y病毒 科病毒的侵染，抑制马铃薯Y病毒科病毒侵染所造成的病害。
其中，所述马铃薯Y病毒科病毒包括芜菁花叶病毒、辣椒叶脉斑驳病毒、槟榔坏死环斑 病毒及马铃薯Y病毒。
具体的，通过克隆本氏烟中的Pelota基因，并构建到融合有Flag标签的双元转化载体中； 以无菌培养的本氏烟叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的T-DNA方式进行遗传转化，将Pelota 基因导入目的植物中，获得本氏烟Pelota高表达植物。
一种抗马铃薯Y病毒科病毒的Pelota转基因植物的培育方法：通过农杆菌感染叶片外植 体并短期共培养的方式，将Pelota基因导入目的植物中，获得本氏烟Pelota基因高表达植物。
具体包括以下步骤：
(1)本氏烟草叶片取样，Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)18(5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)引物反转录获得cDNA；
(2)以上述cDNA为模板进行PCR扩增，使用引物NbPelota-F与NbPelota-R克隆得到Pelota基因；
NbPelota-F：ATGAAGATTGTTCGTAGAGACCTTGTT；
NbPelota-R：CATCTCTATATCTTCCAGTTCCGGC；
(3)将Pelota基因构建到构建到融合有Flag标签的双元转化载体中，获得NbPelota-Flag 重组质粒；
(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有NbPelota-Flag重组质粒的农杆菌；
(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染预培养的本氏烟外植体，经分化培养获得愈伤组织， 从愈伤组织分化T0代幼苗；
(6)T0代幼苗生根培养后，收取T1代转基因种子进行培养；
(7)对T1代萌发的幼苗进行相关表达水平的检测，首先，对T1代幼苗抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过Western blot分析，确定重组蛋白是否存在以及表达；
(8)同时，对这12个株系总RNA进行qRT-PCR检测过表达的RNA水平；在本氏烟过 表达Pelota的转基因稳定遗传植物进行全生育期观察并留种。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明发现了本氏烟中Pelota基因是一个新型抗病基因，并且通过农杆菌感染叶片外植 体并短期共培养的方式，将Pelota基因导入目的植物中，获得的本氏烟Pelota高表达转基因 植物。获得的Pelota转基因植物能够显著减轻马铃薯Y病毒科病毒TuMV的侵染。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中 的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。
附图说明
图1为载体构建示意图。
图2为过表达Pelota转基因植物筛选。
其中，(A)使用Flag特异性抗体对抗生素筛选存活的T1代萌发的幼苗进行鉴定，RbcL (The large Rubisco subunit)用于表示上样量的水平；
(B)提取这12个株系总RNA进行qRT-PCR检测过表达水平；
(C)本氏烟过表达Pelota的转基因稳定遗传植物进行全生育期观察。
图3为本氏烟Pelota过表达株系对芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)、辣椒叶脉斑驳病毒(PVMV-GFP)、槟榔坏死环斑病毒(ANRSV-GFP)以及马铃薯Y病毒(PVY)四种病毒的 抗性分析。
其中，(A)TuMV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第6天紫外灯照射下观察 到系统叶病毒积累；
(B)PVMV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第10天紫外灯照射下观察到系 统叶病毒积累；
(C)ANRSV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第16天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累；
(D)对不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测，PVMV-GFP和ANRSV-GFP 两个Pelota过表达株系中病毒RNA积累量显著低于野生型本氏烟；
(E)PVY摩擦接种野生型及过表达Pelota本氏烟，在第十八天观察植株表型，野生型 本氏烟表现为植株矮小、叶片黄化，而Pelota过表达本氏烟病毒症状明显轻于野生型；
(F)对Pelota过表达本氏烟及野生型进行qRT-PCR检测，Pelota过表达本氏烟及野生 型中的PVY病毒mRNA积累量显著低于野生型。
图4为四种马铃薯Y病毒科病毒均含有G1-2A7 motif，该motif能够被Pelota识别并降 解。
具体实施方式
一种抗马铃薯Y病毒属病毒的Pelota转基因植物的培育方法，具体包括以下步骤：
(1)本氏烟草叶片取样，使用Trizol法(Trizol采用英维捷基公司产品)抽提RNA，去 除基因组DNA后，使用oligo(dT)18(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')引物反转录获得cDNA；oligo(dT)18引物序列如SEQ ID NO:6所示。
(2)以上述cDNA为模板进行PCR扩增，使用引物NbPelota-F与NbPelota-R克隆得到Pelota基因，引物NbPelota-F与NbPelota-R序列如SEQ ID NO:2-3所示；
NbPelota-F：ATGAAGATTGTTCGTAGAGACCTTGTT；
NbPelota-R：CATCTCTATATCTTCCAGTTCCGGC；
(3)如图1所示，使用同源重组的方法将Pelota基因构建到构建到融合有Flag标签的 双元转化载体中，获得NbPelota-Flag重组质粒；
(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有NbPelota-Flag重组质粒的农杆菌；
(5)将次氯酸钠表面消毒后的野生型本氏烟种子在MS培养基中萌发，长至四片叶后移 栽到较大空间的组培盒中，组培室无菌培养4-6周；
取健康幼嫩的烟草叶片，使用蒸馏水冲洗一遍，70％的乙醇洗45秒，0.1％升汞消毒6-8 分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分；
将无菌叶片剪成若干0.5cm2的叶片组织，叶片近轴面向下，在诱导分化培养基上，预培 养2-3天；
挑取一个单菌落农杆菌，接种到培养液中，在28℃恒温摇床上培养至OD值为0.6-0.8。 取上述培养物按1％-2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的培养液中，继续培养6h，当OD值 为0.5左右时即可用于转化；
在超净工作台上将菌液倒入无菌小培养皿，取出预培养的外植体，放入菌液中泡5分钟。 取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后用无菌水清洗三次，每次清洗结束需用无菌 滤纸吸干。最后置于添加有AS(乙酰丁香酮)的共培养培养基上28℃暗培养2-4天；
将经过共培养的外植体转移到加有选择抗性的分化培养基上，在光照条件下，25℃进行 选择培养；
选择培养2-3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽，或者产生抗性愈伤组织。 从愈伤组织中共计分化12颗T0代幼苗；生根培养后，收取T1代转基因种子进行培养；
(7)对T1代萌发的幼苗进行相关表达水平的检测，首先，对T1代幼苗抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过Western blot分析，通过图2A发现NbPelota-OE 4、5和10 三个转基因株系的Pelota蛋白积累量较高；
如图2B所示，使用引物Nb_Pelota qFor和Nb_Pelota qRev对这12个株系总RNA进行 qRT-PCR检测过表达水平，与WB的结果一致，株系4、5和10的表达水平较高。其中，引 物Nb_Pelota qFor和Nb_Pelota qRev序列如SEQ ID NO:4-5所示；
Nb_Pelota qFor：CTCATGAACGAATGGCTGTC，
Nb_Pelota qRev：GAGCAGTACCACCTGAATCC；
如图2C所示，对本氏烟过表达Pelota的转基因稳定遗传植物进行全生育期观察，转基 因Pelota本氏烟生长发育状态与野生型没有明显差异。
(8)使用本氏烟Pelota过表达株系4和5对芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)、辣椒叶脉斑驳病毒(PVMV-GFP)、槟榔坏死环斑病毒(ANRSV-GFP)以及马铃薯Y病毒(PVY)四种 病毒抗性分析。
如图3A所示，TuMV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第六天紫外灯照射下 观察到系统有轻微的病毒积累；
如图3B所示，PVMV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第十天紫外灯照射下 观察系统叶病毒积累，野生型出现严重的叶片卷曲和萎蔫，Pelota过表达株系虽然系统叶中 也出现了TuMV-GFP荧光信号，但发病严重程度较低；
如图3C所示，ANRSV-GFP浸润接种Pelota转基因过表达植物，在第16天紫外灯照射下观察系统叶病毒积累，Pelota转基因过表达植物发病症状较轻；
如图3D所示，对不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测，TuMV-GFP、PVMV-GFP和ANRSV-GFP两个Pelota过表达株系中病毒RNA积累量显著低于野生型本氏 烟；
如图3E所示，PVY摩擦接种野生型及过表达Pelota本氏烟，在第18天观察植株表型， 野生型本氏烟表现为植株矮小，叶片黄化，而Pelota过表达本氏烟病毒症状明显轻于野生型；
如图3F所示，对Pelota过表达本氏烟及野生型进行qRT-PCR检测，Pelota过表达本氏 烟及野生型中的PVY病毒RNA积累量显著低于野生型。
上述实验结果表明：本发明通过叶盘法获得的本氏烟Pelota过表达植物能够显著减轻多 种马铃薯Y病毒科病毒的侵染，抑制马铃薯Y病毒科病毒造成的病害。
本发明通过分子机制研究发现，Pelota对于TuMV P3位置上的G1-2 A6-7区域较为敏感， 进而引发对病毒的降解。研究表明，Pelota介导的RNA质量控制机制能够识别多腺嘌呤序列 信息，这与G1-2 A6-7区域特征较为一致。通过对马铃薯Y病毒科病毒的序列比对发现，G1-2 A6-7区段作为该病毒科病毒滑动移码产生额外蛋白P3N-PIPO的位置，序列特征高度保守，存在 于所有马铃薯Y病毒科病毒的基因组中。基于此，本发明通过上文实验测试了Pelota对马铃 薯Y病毒科的四种病毒的抗病性。经过序列分析，这四种病毒均包含G1-2 A6-7区段(如图4 所示)。这一实验结果有力的证明了Pelota能够特异性识别马铃薯Y病毒科保守的G1-2 A6-7区段并介导对RNA的降解活动，抑制马铃薯Y病毒科病毒造成的病害。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
<130> DS221-014
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagattg ttcgtagaga ccttgttcct gatggccctg gtagcgtcaa gataattcca 60
gaggaagcgg atgatttatg ggttgcctat aatctgatag ctgaaggtga tactgtctta 120
gctgttactg tcaggaaggt tctaagggaa gctgcttctg gaggaagaga tgctgaacgg 180
gtgaaactga aattggaagt taaagttgag aatgttgagt atgacaaaga aggttctgcc 240
ttgcgtattc gtgggaagaa tatcctggag aatgaacatg taaagatagg agcctttcac 300
actctggaga ttgagcaaca cagacctttt gtgctaagaa aggtggtatg ggactcactg 360
gcgcgggagg ttcttcgtca agcttctgat ccatctgcaa gcgctgatct ggctgtggtt 420
ctgatgcaag aaggattggc acacatactt cttattggta aaagcgtgac tattactcgt 480
tctcgtatag agacttctat accacgcaag catggaccag ccattgcagg ttatgataag 540
gcgttaaaca agttctttga taatgttcta caggcctttg ttaagcatgt tgatttcaag 600
gtagttcgct gtgtagtgat tgcaagtcca ggatttacca aggatcagtt tcatcgtcac 660
ctgttgttgg aagccgaaag gaaacagcta agacctataa tagaaaataa gtcacgcata 720
attcttgtcc atacaacctc gggatacaaa catagtctga aagaggtttt ggaggctcca 780
aatgtaatga atatgataaa agatacaaaa gctgccaaag aggtccaagc cctaaaggaa 840
tttttctcca tgctttcaaa tgatcccgac cgtgcatgct acggaccaaa gcatgttgaa 900
gttgctcatg aacgaatggc tgtccagaca cttctaatta ctgacgagct ctttaggagt 960
tctgatgtag caacgagaaa aaagtatgct aatctggttg attcagtcaa ggattcaggt 1020
ggtactgctc tcattttctc gtcaatgcat gtttcaggag aacaattggc acagctaact 1080
ggcattgctg caatccttcg ttttcctttg ccggaactgg aagatataga gatgaagggc 1140
caattcgttt aa 1152
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagattg ttcgtagaga ccttgtt 27
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catctctata tcttccagtt ccggc 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcatgaacg aatggctgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcagtacc acctgaatcc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt tttttttt 18

Claims (5)

1.本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为马铃薯Y病毒科病毒；所述Pelota基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述植物为本氏烟。
2.根据权利要求1所述本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述马铃薯Y病毒科病毒为芜菁花叶病毒、辣椒叶脉斑驳病毒、槟榔坏死环斑病毒或马铃薯Y病毒。
3.根据权利要求2所述本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过克隆本氏烟中的Pelota基因，并构建到融合有Flag标签的双元转化载体中；以无菌培养的本氏烟叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的T-DNA方式进行遗传转化，将Pelota基因导入目的植物中，获得的本氏烟Pelota高表达植物能够显著减轻马铃薯Y病毒科病毒的侵染。
4.一种抗马铃薯Y病毒科病毒的Pelota转基因植物的培育方法，其特征在于：通过叶盘法将Pelota基因导入目的植物中，获得本氏烟Pelota基因高表达植物，所述Pelota基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述目的植物为本氏烟。
5.根据权利要求4所述的Pelota转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）本氏烟草叶片取样，Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)18引物反转录获得cDNA；
（2）以所述cDNA为模板进行PCR扩增，使用引物NbPelota-F与NbPelota-R克隆得到Pelota基因；所述NbPelota-F与NbPelota-R的序列如SEQ ID NO:2-3所示；
NbPelota-F：atgaagattgttcgtagagaccttgtt；
NbPelota-R：catctctatatcttccagttccggc；
（3）将Pelota基因构建到融合有Flag标签的双元转化载体中，获得NbPelota-Flag重组质粒；
（4）将1 μl重组质粒与100 μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500 V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有NbPelota-Flag重组质粒的农杆菌；
（5）将带有重组质粒的农杆菌侵染预培养的本氏烟外植体，经分化培养获得愈伤组织，从愈伤组织中分化T0代幼苗；
（6）T0代幼苗生根培养后，收取T1代转基因种子进行培养；
（7）对T1代萌发的幼苗进行相关表达水平的检测，对T1代幼苗抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过Western blot分析，确定重组蛋白是否存在以及表达；
（8）使用引物Nb_Pelota qFor和Nb_Pelota qRev对株系总RNA进行qRT-PCR检测过表达水平；对本氏烟过表达Pelota的转基因稳定遗传植物进行全生育期观察并留种；所述Nb_Pelota qFor与Nb_Pelota qRev的序列如SEQ ID NO:4-5所示；
Nb_Pelota qFor：ctcatgaacgaatggctgtc
Nb_Pelota qRev：gagcagtaccacctgaatcc。
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WO2014045206A1 (en) * 2012-09-23 2014-03-27 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Obtaining tomato plants resistant to tomato yellow leaf curl virus by using pelota gene
CN112575003A (zh) * 2020-12-17 2021-03-30 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

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The nonstop decay and the RNA silencing systems operate cooperatively in plants;István Szádeczky-Kardoss;《Nucleic Acids Res .》;第46卷(第9期);第4632-4648页 *

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