MXPA06009608A - Plantas injertadas resistentes a enfermedades virales y metodos de produccion de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a plantas injertadas que comprenden un rizoma transgenico resistente a una enfermedad viral y un renuevo susceptible, en donde la resistencia a la enfermedad se confiere al renuevo procedente del rizoma transgenico resistente a virus, de tal manera que la planta injertada entera es resistente a la enfermedad viral; la invencion se refiere tambien a metodos de producir las plantas injertadas resistentes a virus y a las plantas producidas mediante el mismo.

Description

PLANTAS INJERTADAS RESISTENTES A ENFERMEDADES VIRALES Y MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a plantas resistentes a enfermedades virales que comprende un rizoma resistente a virus transgénico y un vastago injertado, en el cual la resistencia a la enfermedad se confiere al vastago a partir del rizoma resistente a virus transgénico, y a métodos de producción de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un virus patogénico vegetal ocasiona pérdidas significativas en productos frescos de agricultura en todo el mundo. Las prácticas modernas de agricultura, incluyendo el crecimiento de especies particulares en regiones amplias, y la demanda de productos frescos durante todo el año lleva a un incremento en el área de invernadero, agravando el problema de ia extensión viral e incrementando e! daño resultante. Los programas de cruza tradicional para la producción de plantas resistentes a la infección viral se han utilizado de manera exitosa en el pasado. No obstante, dichos programas de cruza dependen de las fuentes naturales para la resistencia, las cuales no siempre están disponibles. Por ejemplo, el Virus del Mosaico de la Calabaza Amarilla (ZYMV) ocasiona daños severos en la familia Cucurbitaceae cada año en todo el mundo. El virus se transfiere de planta a planta por los áfidos de las hojas, y se ha encontrado que los insecticidas son ineficientes en la prevención de la extensión del virus. Además, se han identificado fuentes de resistencia limitadas. Powell-Abel et al. (Powell-Abel et al., 1986. Science 232: 738-J43) fueron los primeros en mostrar que las plantas transformadas con y que expresan el gen de la proteína de la cubierta (CP) del virus del mosaico del tabaco (TMV) son resistentes a TMV. Desde entonces, se ha mostrado resistencia mediada por la proteína de la cubierta viral con al menos 25 virus en 15 grupos taxonómicos incluyendo virus del mosaico de la alfalfa, virus en cascabel del tabaco, virus X de la patata, virus del mosaico del pepino (CMV), potivirus, y plantas transformadas tanto con el virus X de la patata como con el virus Y de la proteína de la cubierta de la patata. En general, la resistencia mediada por CP es efectiva en contra de un intervalo más amplio de cepas virales, pero es comúnmente menos eficiente que la resistencia mediada por ARN, por ejemplo en donde la expresión de los fragmentos de ARN viral no se traduce hacia proteína que imparte resistencia viral. Por ejemplo, la Patente de E.U.A No. 6,649,813 describe resistencia inducida por el virus que se puede transferir de una generación vegetal a otra en la cual las plantas transgénicas que contienen una secuencia codificante, tomada a partir de la porción de lectura de la porción de replicasa del genoma viral, son resistentes a una enfermedad subsecuente por el virus. El uso de la secuencia codificante de 54 kDa a partir del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV) se describe específicamente. La resistencia mediada por replicasa se limita a cepas que comparten una alta homología de secuencia, no se afecta por el título del virus de prueba, y no se correlaciona con el nivel de expresión del transgén. El silenciamiento post-transcripcional del gen (PTGS) es un mecanismo de defensa específico de la secuencia que puede dirigir tanto los ARNm celulares como virales, y es una herramienta ampliamente utilizada para la inactivación de la expresión del gen. Se sabe que PTGS se presenta en las plantas, mientras que un fenómeno cercanamente relacionado, el ARN de interferencia (RNAi), se sabe que se presenta en un amplio intervalo de otros organismos (Baulcombe, D. 2000. Science, 290: 1108-1109). Se ha mostrado que el ARN de interferencia se presenta, por ejemplo, en Caenorhabditis elegans, Neurospora crassa, Drosophila melanogaster y en mamíferos. Además, se han mostrado los transgenes y virus para inducir el silenciamiento del gen en plantas, y actualmente se cree que PTGS es un mecanismo de defensa natural en contra de la acumulación del virus (Hamilton A. y Baulcombe, D. 1999. Science 286: 950-952; Matzke et al., 2001. Curr. Opin. Genet. Dev. 11 : 221-227). El silenciamiento del gen inducido por virus (VIGS) se ha demostrado bien para numerosos virus de ARN vegetal. El proceso se inicia por moléculas de ARN de cadena doble (ARNds). Posiblemente las moléculas de ARNds se generan mediante intermediarios replicantes de ARN virales o por ARNs codificados por el transgén aberrante, los cuales se vuelven dsRNA mediante actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN. Los ARNds se escinden por un miembro de la familia de ribonucleasa lll hacia ARNs cortos de interferencia (ARNsi), los cuales generalmente tienen un intervalo en el tamaño de 21 a 26 nucleótidos. Se cree que los ARNsi promueven así ia degradación de ARN mediante la formación de un complejo de nucleasa multi componente RISC (Complejo de silenciamiento Inducido por ARN) que destruye el ARNm cognado. Desde el descubrimiento del ARNsi, se han utilizado los métodos basados en este descubrimiento para silenciar los genes blanco específicos, como una herramienta de investigación para elucidar la función del gen y para la prevención de la expresión no deseada del gen. El documento WO 99/61631 describe métodos para alterar la expresión de un gen blanco es una planta utilizando fragmentos de ARN sentido y antisentido del gen. Los fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de aparejarse y formar una molécula de ARN de cadena doble, alterando así la expresión del gen. El documento WO99/53050 describe métodos y medios para la reducción de la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés en células eucariontes, particularmente en células vegetales, mediante la introducción de genes quiméricos que codifican moléculas de ARN sentido y antisentido dirigidas hacia el ácido nucleico blanco, las cuales son capaces de formar una región de ARN de cadena doble mediante aparejamiento de bases entre las regiones con la secuencia nucleotídica sentido y antisentido o mediante la introducción de las mismas moléculas de ARN. El documento WO 00/68374 se refiere a los métodos para alterar la expresión de un gen viral en una céiula utilizando fragmentos de ARN sentido y antisentido del gen. Los fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de aparejarse y formar una molécula de ARN de cadena doble, alterando así la expresión del gen. La invención también se refiere a células, plantas o animales, obtenidos utilizando el método de la invención, los cuales son preferiblemente resistentes o tolerantes a ios virus. El documento WO 2004/009779 describe composiciones que comprenden construcciones de ARN precursoras para la expresión de un ARN precursor. La construcción de ARN precursor comprende un promotor que se expresa en una célula vegetal que dirige la expresión de un ARN precursor que tiene un ARNmicro. El ARNmi es complementario o parcialmente complementario a una porción de un gen blanco o secuencia nucleotídica y funciona para modular la expresión de la secuencia blanco o gen. De esta manera, la construcción del ARN precursor se puede diseñar para modular la expresión de cualquier secuencia nucleotídica de interés, ya sea un gen endógeno de una planta o alternativamente un transgén. El injerto es una técnica antigua utilizada por granjeros y jardineros para combinar atributos deseables del rizoma con aquellos del vastago. En el pasado, el injerto se utilizó principalmente en plantas perennes, específicamente plantas herbáceas y árboles. Actualmente, esta técnica también se utiliza para plantas anuales, y el porcentaje de vastagos vegetales injertados que comprenden un rizoma y un vastago se incrementa constantemente. Smirnov et al. (Smirnov et al., 1997. Plant Physiol. 114: 1 113-1121 ) utilizó la técnica de injerto para injertar plantas de tabaco de tipo silvestre sobre plantas de tabaco transgénicas que expresan la proteína anti-viral pokeweed. Ellos demostraron que la expresión de la proteína anti-viral en el rizoma transgénico de las plantas injertadas induce la resistencia a la infección viral en el vastago de tipo silvestre. No obstante, la resistencia fue dependiente de la actividad enzimática de la proteína anti-virai pokeweed. En adelante, los intentos para producir plantas resistentes a infección por patógenos se concentraron principalmente en el empleo de métodos de transformación para incorporar un rasgo relacionado con la resistencia dentro del genoma vegetal. No obstante, los productos de agricultura obtenidos a partir de plantas transgénicas no son deseables en muchos países. Alternativamente, se utilizó la técnica de injerto. Aunque se ha mostrado el uso de un rizoma resistente a una cierta enfermedad, el vastago injertado fue susceptible a la transmisión del patógeno. Por lo tanto, existe una necesidad reconocida para, y podría ser altamente ventajoso tener plantas resistentes a patógenos, específicamente al virus, en donde el producto de agricultura se produce por una parte vegetal la cual no está genéticamente modificada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención provee plantas injertadas que comprenden un rizoma transgénico resistente a virus y un vastago susceptible, en donde toda la planta es resistente a la enfermedad viral. Las plantas de la presente invención pueden ser plantas perennes o anuales. La presente invención provee adicionalmente composiciones y métodos para ia producción de las plantas resistentes injertadas. La naturaleza de la resistencia viral depende de las características específicas de la composición empleada para producir una planta particular. De conformidad con ciertos aspectos, la presente invención provee plantas injertadas protegidas a partir de un virus con origen en el suelo. De conformidad con otros aspectos, las plantas de la presente invención son resistentes a la infección del follaje ocasionada por un virus. Las plantas de la presente invención se pueden producir mediante diversos tipos de injertos; el método de injerto típicamente se utiliza cuando el vastago produce el producto de agricultural deseado. De manera ventajosa, el producto de agricultura producido por las plantas de la presente invención no está genéticamente modificado, puesto que el rizoma es la única parte transgénica de la planta. Sin desear atenerse a ninguna teoría particular o mecanismo, la resistencia de las plantas de la presente invención a la enfermedad viral se puede atribuir a la resistencia viral mediada por el ARN impartida a un rizoma transgénico, en cual confiere resistencia a un vastago susceptible injertado.

Por lo tanto, de conformidad con un aspecto, la presente invención provee una planta que comprende un rizoma transgénico resistente a la enfermedad viral diferente por medio de la expresión de una proteína antiviral, y un vastago susceptible a la enfermedad viral, en donde la planta injertada es resistente a dicha enfermedad viral. De conformidad con diversas modalidades, la presente invención provee resistencia viral conferida al vastago injertado por un rizoma transgénico que expresa una secuencia de transcrito de ácido nucleico seleccionado a partir de una secuencia que codifica una proteína viral o parte de la misma y un ARNsi. Por lo tanto, de conformidad con ciertas modalidades, el rizoma transgénico resistente a la infección viral comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral. De conformidad con una modalidad adicional, el rizoma transgénico resistente a la infección viral que comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento del genoma viral. Como se utiliza en la presente invención, el término "segmento" se refiere a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de una región codificante del genoma viral, una región no codificante, partes de la misma y combinaciones de la misma. De conformidad con una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral codifica una proteína o parte de la misma. De conformidad con otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína seleccionada a partir del grupo que consiste de una proteína de cubierta, una proteína para replicación, una proteína para movimiento o partes de la misma. De conformidad con una modalidad, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que es un segmento de ia porción de la replicasa del genoma viral. De conformidad con otra modalidad, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína putativa de 54 kDa que es un fragmento de la proteína de replicación de virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino (CFMMV). De conformidad con una modalidad actualmente preferida, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. De conformidad con incluso otra modalidad, la construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral comprende: (a) al menos un promotor que se expresa en planta operativamente asociado a; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco dei genoma viral y una segunda secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de ia secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y opcionalmente (c) una señal para término de la transcripción. De conformidad con una modalidad preferida, la construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral comprende: (a) al menos un promotor que se expresa en planta operativamente asociado a; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble en la forma de tallo-asa, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleotídica de a! menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco del genoma viral; una segunda secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y una secuencia espaciadora; y opcionalmente, (c) una señal para término de la transcripción. Se debe entender que la práctica de la presente invención no se limita a ninguna construcción del ADN específico, la provisión de la construcción se diseñó para dirigir la generación de ARNsi dentro de la célula vegetal, en donde los ARNsi se direccionan a al menos un segmento de un genoma viral. De conformidad con ciertas modalidades, la construcción comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos una molécula de ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble media la escisión de la secuencia viral blanco. La construcción de ADN se puede diseñar para formar ARN de cadena doble de diversas formas. Además, se debe entender que aunque la presente invención se practica con una construcción que genera ARNsi, cualquier método conocido en la técnica para la generación de ARNsi dentro de una célula vegetal también está comprendido dentro del alcance de la presente invención. Previamente se ha descrito el uso de siRNA como un medio para escindir un segmento de un genoma viral dentro de una célula vegetal. También se ha mostrado que cuando un gen cromosomal (ya sea un gen endógeno o heterólogo) se silencia en un rizoma, el silenciamiento se transmite a partir del rizoma silenciado hacia un vastago blanco que expresa el gen cromosomal correspondiente. No obstante, la presente invención describe que sorprendentemente, la transformación de un rizoma con una construcción que genera ARNsi dirigido a al menos un segmento del genoma de un virus patogénico, que confiere resistencia a un vastago injertado, el cual de otra manera es susceptible a la infección por el virus.

De conformidad algunas modalidades, la primera y la segunda secuencias nucleotídicas están operativamente asociadas con el mismo promotor. En otras modalidades, cada una de la primera y la segunda secuencias nucleotídicas está operativamente asociada con un promotor separado, en donde los promotores separados pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. De conformidad con una modalidad, la primera secuencia nucleotídica incluye una secuencia de al menos 20 nucleótidos contiguos los cuales son al menos 95% idénticos, preferiblemente 100% idénticos con la secuencia de la secuencia nucleotídica sentido del al menos un segmento del genoma viral. De conformidad con otra modalidad, la segunda secuencia nucleotídíca incluye una secuencia de al menos 20 nucleótidos contiguos los cuales son al menos 95% idénticos, preferiblemente 100% idénticos con la secuencia del complemento de la secuencia nucleotídica sentido de al menos un segmento del genoma viral. No existe un límite superior para la longitud de la primera y la segunda secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar, de tal manera que la construcción de la presente invención puede incluir secuencias nucleotídicas de longitudes variables, incluyendo aquellas a partir de aproximadamente 20 nucleótidos a longitud total del ARN blanco. Preferiblemente, la longitud del primero y del segundo nucleótido de conformidad con la presente invención es de aproximadamente 1 ,000 nucleótidos en longitud. De conformidad con otra modalidad, la longitud del primero y del segundo nucleótido es de aproximadamente 22 nucleótidos en longitud. De conformidad con una modalidad preferida, la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que tiene 90% de identidad, preferiblemente 95%, más preferiblemente 100% de identidad con la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. De conformidad con otra modalidad actualmente preferida, la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que tiene 90% de identidad, preferiblemente 95%, más preferiblemente 100% de identidad con el complemento de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. De conformidad con una modalidad, la estructrura de la molécula inhibidora de ARN comprende además de la primera y la segunda secuencias nucleotídicas una secuencia espadadora, por lo tanto el ARN de cadena doble se encuentra en una forma de ARN tallo-asa (ARN en horquilla, ARNhp). En una modalidad preferida, la longitud de la secuencia espaciadora es de 1/5 a 1/10 de la longitud del primero y del segundo nucleótidos. De conformidad con ciertas modalidades, el espaciador comprende una secuencia nucleotídica derivada a partir de un intrón del gen para mejorar la producción de ARNsi. De conformidad con una modalidad, el espaciador comprende una secuencia nucleotídica que comprende un intrón a partir del gen de la catalasa de la semilla de ricino, que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

Opcionalmente, la construcción que codifica el ARNsi comprende una señal para término de la transcripción. De conformidad con una modalidad, la señal de término de la transcripción es el terminador NOS. De conformidad con ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia al vastago injertado, comprende adicionalmente elementos reguladores para la expresión de la secuencia de ácido nucleico dentro de una célula vegetal. Los elementos para el control de la expresión se seleccionan a partir del grupo que consiste de un promotor, un potenciador, un factor de transcripción, una señal de procesamiento, y una secuencia de terminación. De conformidad con una modalidad, el promotor es un promotor constitutivo. De conformidad con una modalidad actualmente preferida, el promotor constitutivo es el promotor del virus de vena en banda de la fresa. De conformidad con otra modalidad, el promotor es un promotor específico de tejido. De conformidad con otras modalidades, el rizoma transgénico transformado con una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral es resistente a una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo. De conformidad con una modalidad, la planta injertada que comprende dicho rizoma transgénico se protege a partir de un virus con origen en el suelo seleccionada a partir del grupo que consiste de virus transmitidos por nemátodo, virus transmitido por hongos, virus transmitido vía herida de la raíz y virus transmitido via un vector desconocido.

De conformidad con una modalidad, los virus transmitidos por nemátodo se seleccionan a partir de, pero no se limitan a, Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de ia iesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento. De conformidad con otra modalidad, los virus transmitidos por hongos se seleccionan a partir del grupo que consiste de, pero no se limitan a, virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo. De conformidad con una modalidad adicional, los virus transmitidos vía herida de la raíz se seleccionan a partir del grupo que consiste de, pero no se limitan a, género Tobamovirus: virus dei mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular del Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve de! pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del tabaco. De conformidad con incluso otra modalidad, los virus transmitidos por una ruta desconocida se seleccionan a partir del grupo que consiste de, pero no se limitan a, virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea ciorótica de la caña de azúcar. De conformidad con una modalidad, la planta injertada se protege a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo del género tobamovirus. De conformidad con otra modalidad, la planta injertada se protege a partir de una enfermedad ocasionada por el tobamovirus CFMMV. De conformidad con incluso otra modalidad, la planta injertada se selecciona a partir de la familia Cucurbitaceae. La presente invención muestra por primera vez que es posible impartir resistencia contra patógenos virales con origen en el suelo a las plantas susceptibles, utilizando la técnica de injerto. El injerto de un vastago susceptible con un rizoma resistente, en donde el rizoma resistente comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral con origen en el suelo, revierte al vastago de ser susceptible a ser protegido hacia el patógeno con origen en el suelo. De conformidad con modalidades adicionales, las plantas injertadas que comprenden una rizoma transgénico resistente a un virus que comprende una construcción de ADN diseñado para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento del genoma viral y un vastago, comprenden plantas de cualquier especie. Además, se puede producir una planta para que exhiba resistencia a cualquier virus vegetal seleccionado, en donde también se puede obtener resistencia a una pluralidad de virus vegetales. De conformidad con ciertas modalidades, la planta es resistente a un virus con origen en el suelo seleccionado a partir del grupo anteriormente descrito en la presente invención. De conformidad con otras modalidades, la planta es resistente a un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la planta. De conformidad con una modalidad, el virus que afecta la parte aérea de la planta es de una familia viral seleccionada a partir del grupo que consiste de Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartitiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae. De conformidad con otra modalidad, el virus se selecciona a partir del grupo que consiste de Tobamovirus, Tobravírus, Potexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Vitivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tymovirus, Idaeovirus, Ourmivirus, y Umbravirus.

De conformidad con ciertas modalidades, las plantas injertadas que comprenden un rizoma que comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi son resistentes a un virus vegetal a partir de la familia Potyviridae. En la siguiente descripción, el uso de siRNA direccionado hacia el extremo 3' del genoma del Virus del Mosaico de la Calabaza Amarilla (ZYMV), incluyendo el gen de la proteína de cubierta y la región no codificante hacia 3' imparte resistencia al virus en risoma transgénico de Nicotiana benthamiana y además el vastago de N. benthamiana se describe como un ejemplo específico de la tecnología más amplia de conformidad con la presente invención. Las secuencias de ácido nucleico transformadas con los rizomas de la presente invención preferiblemente comprenden adicionalmente un marcador de selección, de tal manera que solamente las plantas transgénicas pueden germinar y desarrollarse. Adicionalmente o alternativamente, se puede incorporar un gen reportero dentro de la contrucción, de manera que permite la selección de plantas transgénicas que expresan el gen reportero. De conformidad con una modalidad, el marcador de selección es un gen que induce la resistencia al antibiótico dentro de la planta. Las regulaciones recientes dirigidas con respecto al crecimiento de plantas transgénicas en campos abiertos excluye el uso de plantas transgénicas que comprenden un gen que induce la resistencia al antibiótico. Por lo tanto, la selección de las plantas transgénicas se puede llevar a cabo mediante co-transformación de una primera construcción diseñada para conferir resistencia viral de conformidad con la presente invención y una segunda construcción que comprende un gen reportero. La transformación exitosa de la construcción que confiere resistencia viral se verifica entonces mediante métodos conocidos por una persona experta en la técnica, por ejemplo mediante PCR, solamente en plantas que expresan el gen reportero e indicando así una transformación exitosa. La secuencia de ácido nucleico de la presente invención se puede incorporar dentro de un vector para transformación vegetal utilizado para transformar plantas, como se conoce en la técnica. De conformidad con un aspecto adicional, la presente invención provee un método para la producción de una planta resistente a la infección mediante un virus que comprende los pasos de (a) proveer un rizoma transgénico resistente a la infección viral diferente por medio de la expresión de una proteína anti-viral; (b) proveer un vastago susceptible a la infección por dicho virus; y (c) injertar el vastago sobre el rizoma para obtener una planta injertada resistente a dicha infección viral. De conformidad con una modalidad, el rizoma se transforma con una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento de un genoma viral para producir un rizoma transgénico resistente a la infección viral. De conformidad con otra modalidad, el rizoma se transforma con una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral para producir un rizoma transgénico resistente a la infección viral. De conformidad con modalidades preferidas de la invención, el segmento afectado del genoma viral es esencial para el virus para la infeción vegetal y/o replicación, de manera que su escisión previene ia infección viral y/o replicación, proveyendo así una planta resistente. La transformación de plantas con un polinucleótido o una construcción de ADN para producir rizomas resistentes se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, como se conocen por un experto en la técnica. Los métodos comunes se ejemplifican por, pero no se restringen a, transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo de microproyectil, transferencia mediada por polen, transformación mediada por liposoma, transferencia directa del gen (por ejemplo mediante microinyección) y electroporación de callos embriogénicos. De conformidad con una modalidad, las plantas resistentes se producen utilizando transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas transgénicas que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden seleccionar empleando métodos estándares de genética molecular, conocidos por una persona experta en la técnica. De conformidad con una modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia al antibiótico. De conformidad con ciertas modalidades, el antibiótico que sirve como un marcador de selección es uno del grupo aminoglicósido que consiste de paromomicina y canamicina.

De conformidad con otra modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia a la infección viral. De conformidad con una modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia a un virus con origen en el sueio seleccionado a partir del grupo que consiste de, pero no se limita a, virus transmitidos por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus dei oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo; virus transmitido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar. De conformidad con otra modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia a un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la planta, seleccionado a partir del grupo que consiste de una familia viral: Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartitiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae; Tobamovirus, Tobravirus, Potexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Vitivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tynzovirus, Idaeovirus, Ourmivirus, Umbravirus. De conformidad con otro aspecto, la presente invención se refiere a plantas injertadas generadas por los métodos de la presente invención. Las plantas, que comprenden un vastago las cuales de otra manera son susceptibles a la infección viral, son injertadas sobre un rizoma transgénico, resistente al virus, y éstas son resistentes a la infección viral. La planta injertada podría ser resistente a la misma especie de virus a la cual es resistente el rizoma. El rizoma comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención establemente integrada dentro de su genoma, en donde la naturaleza de la construcción de ADN determina la especie de virus a la cual es resistente. Estas características y características adicionales de la presente invención se explican con mayor detalle en las figuras anexas, descripción y reivindicaciones a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 B muestran una representación esquemática de la organización del genoma de CFMMV y de la construcción de ADN de 54 kDa. La figura 1A muestra la organización del genoma de CFMMV. Los números de los nucleótidos se refieren a las posiciones en los genes putativos. Los tres ARN sub-genómicos que codifican los genes de la proteína putativa de 54 kDa (ARN-11 ), la proteína para movimiento (MP) y la proteína de cubierta (CP) se encuentran marcados. La figura 1B muestra la composición de la construcción utilizada en la transformación vegetal, entre los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) del ARN-T. El gen de 54 kDa de CFMMV se fusionó con la región no codificante hacia 5' de ZYMV (NCR) entre el promotor truncado de SVBV (SV) y el terminador poli-A de NOS (T). Se insertó el gen selectivo NPTII bajo el control del promotor SVBV de longitud total. La figura 2 muestra una representación esquemática de la construcción de ADN para la generación de ARNsi, pCddCP-ZY entre el borde izquierdo (LB) y derecho (RB) del ADN-T. Se fusionaron los repetidos invertidos de un polinucleótido que comprende la proteína de cubierta del gen de ZYMV (CP) y la región no codificante hacia 3' (NCR) del virus a partir de cada lado de un intrón, entre el promotor de SVBV (SV) y el terminador poli-A de NOS (Ter). Se insertó el gen selectivo a NPTII y GUS cada uno bajo el control de promotor de 35S Las figuras 3A y 3B demuestran la respuesta de plantas resistentes 144 y plantas control a la infección con diferentes tobamovirus que infectan a las cucurbitáceas; CFMMV (CF), CGMMV (CG), KGMMV (KG) y ZGMMV (ZG), como se ensaya mediante la acumulación de viriones ver figura 3A y RT- PCR ver figura 3B. Las figuras 4A-4C muestran los productos de RT-PCR indicando la infección por CFMMV. El ARN total a partir de la línea 144 y plantas "lian" no transformadas, ya sea no inoculadas (H) o tres semanas después de la inoculación con CFMMV (inoculación), sirvieron como un molde para RT-PCR figuras 4A-4B y PCR figura 4C como un análisis control negativo. Figura 4A: Iniciadores para el gen de 54 kDa. Figura 4B: Iniciadores para el gen de CP. MW: peso molecular de 100 pb señalado por el marcador de peso molecular.

Las figuras 5A-5D muestran la respuesta de las plantas de pepino a la inoculación por CFMMV. Las figuras 5A y 5C muestran la línea transgénica 144. Las figuras 5B y 5D muestran el cultivar "lian" no transformado. Las hojas y los frutos exhibieron síntomas de enfermedad tres y siete semanas después de la inoculación, respectivamente. La figura 6 muestra la presencia de transcritos de 54 kDa en plantas transformadas 144. El ARN total se extrajo a partir de la segunda y tercera hojas verdaderas de las plantas transformadas (144) y plantas no transformadas ("lian"), ya sea no inoculadas o 18 dpias post-inoculación con CFMMV (CF) o con ZYMV (ZY). El ARN se analizó mediante desnaturalización con electroforesis en gel de agarosa e hibridación tipo Northern blot. La cantidad de ARN cargado por línea fue de ya sea 3 µg (a partir de plantas no transformadas "lian" infectadas con CFMMV), o de 30 µg (todas las otras líneas). Se utilizó una sonda de ARN de marcada con 32P complementaria a ¡a secuencia codificante de 54 kDa para detectar el transgén así como el ARN viral. Las posiciones eiectroforéticas del ARN de CFMMV y del ARN-11 subgenómico se indican adyacentes a ios paneles. El transcrito del transgén está marcado (transcrito de 54 kDa). La línea llan+CF (planta no transformada infectada con CFMMV) se expuso por 4 horas, mientras que las otras líneas se expusieron por 3 días. Panel inferior: Nivel de ARN 18S como se determina mediante tinción con bromuro de etidio del gel antes de la transferencia a la membrana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a plantas injertadas resistente a la enfermedad viral, que comprenden un rizoma y un vastago. Las plantas transformadas con una construcción de ADN que confiere resistencia a un virus vegetal diferente vía la expresión de una proteína anti-viral sirve como una fuente de rizomas, y las plantas susceptibles a la enfermedad viral sirven como una fuente de vastagos. Después del injerto el vastago sobre el rizoma, toda la planta se protege a partir de la infección viral. Antes de explicar al menos una modalidad de la invención en detalle, se debe entender que la invención no se limita en esta solicitud a los detalles de construcción y al arreglo de los componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de llevar a cabo otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de diversas formas. También, se debe entender que la fraseología y terminología empleada en la presente invención es para el propósito de descripción y no debe considerarse como limitante.

Definiciones El término "planta" se utiliza en la presente invención en su sentido más amplio. Esto incluye, pero no se limita a, cualesquiera especies de plantas leñosas, herbáceas, perennes o anuales. También se refiere a una pluralidad de células vegetales que están diferenciadas en gran parte hacia una estructura que está presente en cualquier etapa de desarrollo de la planta. Dichas estructuras ¡ncluyen, pero no se limita a, una raíz, tallo, brote, hoja, flor, pétalo, fruto, etc. Como se utiliza en ia presente invención, ei término "planta injertada" se refiere a una planta que comprende un rizoma y un vastago, en donde el vastago se injerta sobre el rizoma mediante cualquier método conocido en la técnica. Como se utiliza en la presente invención, el término "rizoma" se refiere a una población de raíces para injertar que comprende la parte de raíz de una planta. El término "vastago" se refiere a una porción viva separada de una planta diseñada o preparada para la unión con una población de raíces en el injerto, usualmente abasteciendo solamente o predominantemente partes aéreas al injerto. Como se utiliza en la presente invención, el término "virus" se refiere a un virus vegetal, por ejemplo un virus capaz de infectar una célula vegetal y propagarse dentro de la célula vegetal. Típicamente, el virus es patogénico, de tal manera que la infección vira! sustancial ocasiona una pérdida en la producción de cosechas de agricultura. Como se utiliza en la presente invención, el término virus "con origen en el suelo" se refiere a virus que se transmiten por vectores del suelo incluyendo nemátodos, hongos o vectores desconocidos del suelo, y virus los cuales permanecen en los restos de plantas y se transmiten por el suelo vía una herida en la raíz.

Los términos "planta resistente" y "planta resistente a la enfermedad viral" se refieren a una planta que tiene una tolerancia incrementada al virus en comparación con una planta no resistente (susceptible). La tolerancia incrementada se examina por la infección deliberada de la planta con el virus en cuestión. Las plantas que muestran una menor intensidad de síntomas en comparación con la planta susceptible, de conformidad con una escala de síntomas específica para cada virus, se definen como plantas resistentes al virus. Las plantas pueden ya sea resistir la infección (por lo tanto la resistencia se refiere como inmunidad) o se someten a una fase preliminar de infección a partir de la cual se recuperan (por lo tanto la resistencia se refiere como recuperación). La resistencia puede ser un rasgo estable, el cual se puede heredar en la población de descendientes. Alternativamente, la resistencia existe solamente siempre y cuando la planta injertada comprenda un rizoma y un vastago. En la última situación, una planta resistente a una enfermedad viral también se refiere como una planta protegida a partir de la enfermedad viral. El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de ARN o un polipéptido. Un polipéptido que puede codificar por una secuencia codificante de longitud total o por cualquier parte de la misma. El término "partes de la misma" cuando se utiliza en referencia con un gen se refiere a fragmentos de ese gen. Los fragmentos pueden tener un intervalo en tamaño desde unos pocos nucleótidos a la secuencia génica total menos uno de los nucleótidos. Por lo tanto, "una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos una parte de un gen" puede comprender fragmentos del gen o todo el gen. El término "gen" también comprende las regiones codificantes de un gen estructural e incluye secuencias localizadas adyacentes a la región codificante en ambos extremos 5" y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb en cualquiera de dichos extremos de manera que el gen corresponde a la longitud de ARNm de longitud total. Las secuencias las cuales se localizan hacia 5' de la región codificante y las cuales están presentes en el ARNm se refieren como secuencias no traducidas hacia 5'. Las secuencias las cuales se localizan hacia 3' o cascada abajo de ia región codificante y las cuales están presentes en el ARNm se refieren como secuencias no traducidas hacia 3". Como se utiliza en la presente invención, el término "intrón" se refiere a una secuencia no codificante que interrumpe la región codificante de un gen. Los intrones se remueven o "procesan" a partir del transcrito nuclear o primario, y por lo tanto están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El término "ácido nucleico" como se utiliza en la presente invención se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, de cadena sencilla o doble, o un híbrido del mismo. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los términos "elemento promotor", "promotor", o "secuencia promotora" como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia de ADN que se localiza en el extremo 5' (por ejemplo precede) la región codificante de la proteína de un polímero de ADN. Se sabe que la ubicación de la mayoría de los promotores conocidos en la naturaleza precede a la región transcrita. El promotor funciona como un interruptor, que activa la expresión de un gen. Si el gen está activado, se dice que se transcribe, o que participa en la transcripción. La transcripción incluye la síntesis de ARNm a partir de! gen. Por lo tanto, el promotor, sirve como un elemento regulador de la transcripción y también provee un sitio para el inicio de la transcripción del gen hacia ARNm. Los términos "gen heterólogo" o "genes quiméricos" se refieren a un gen que codifica un factor que no se encuentra en su ambiente natural (por ejemplo, ha sido alterado por la mano del hombre). Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen a partir de una especie introducida dentro de otra especie. Un gen heterólogo también ¡ncluye un gen nativo a un organismo que ha sido alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, añadido en múltiples copias, asociado a un promotor no nativo o secuencia potenciadora, etc.). Los genes heterólogos pueden comprender secuencias de genes vegetales que comprenden formas de ADNc de un gen vegetal; las secuencias de ADNc se pueden expresar ya sea en orientación sentido (para producir ARNm) o antisentido (para producir un transcrito de ARN anti-sentido que es complementario al transcrito de ARNm). Los genes vegetales heterólogos se distinguen a partir de genes vegetales endógenos en que las secuencias de genes heterólogos típicamente están unidas a secuencias nucleotídicas que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran naturalmente asociados con el gen para la proteína codificada por el gen heterólogo o con secuencias del gen vegetal en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en ioci en donde el gen no se expresa normalmente). Un gen vegetal endógeno a una especie vegetal particular (gen vegetal endógeno) es un gen el cual se encuentra naturalmente en esa especie vegetal o el cual se introduce en esa especie vegetal mediante cruza convencional. El término "transgénico" cuando se utiliza en referencia a una planta o fruto o semilla (por ejemplo, una "planta transgénica" o "fruto transgénico" o una "semilla transgénica") se refiere a una planta o fruto o semilla que contiene al menos un gen heterólogo en una o más de sus células. El término "material vegetal transgénico" se refiere ampliamente a una planta, una estructura vegetal, un tejido vegetal, una semilla vegetal o una célula vegetal que contiene al menos un gen heterólogo en al menos una de sus células. Los términos "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula transformada primaria y cultivos derivados a partir de esa célula sin importar el número de transferencias. Toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma funcionalidad como se selecciona para la célula originalmente transformada se incluye en la definición de los transformantes.

La presente invención describe un sistema utilizando la técnica de injerto para producir plantas transgénicas resistentes a la infección viral, en donde el rizoma es la única parte genéticamente modificada de la planta. Por lo tanto, las plantas de la presente invención son ventajosas sobre las plantas resistentes hasta ahora conocidas en que los métodos de transformación se pueden utilizar para impartir resistencia a la infección viral, mientras que los productos de agricultura producidos por las plantas no están genéticamente modificados. Ei injerto de un vastago sobre un rizoma es una práctica común en horticultura utilizada por muchos años en la propagación de plantas leñosas. Una vez injertadas, el agua y los nutrientes se transportan a partir del rizoma hacia el vastago para mantener el crecimiento del vastago. Actualmente, el injerto se utiliza ampliamente con una variedad de especies vegetales, para mejorar los rasgos horticulturales de la planta injertada resultante. El porcentaje de plántulas injertadas que comprenden un rizoma y un vastago utilizada en cosechas de campo está en crecimiento constante en la práctica moderna de agricultura. Por ejemplo, aproximadamente 60% de las plántulas de pepino y melón crecidas en Grecia, Italia y España son plántulas injertadas. Para satisfacer la demanda en crecimiento de plántulas injertadas, se han desarrollado diversos métodos para la alta producción de injertos. En todos los métodos empleados, los extremos complementarios del vastago y del rizoma se colocan juntos para formar una unión de injerto. El tejido de callo se forma en la unión del injerto como parte del proceso de cicatrización normal de la planta y sirve como un conducto para el agua y los nutrientes entre el vastago y el rizoma. De conformidad con un aspecto, la presente invención provee una planta que comprende un rizoma transgénico resistente a la enfermedad viral diferente por medio de la expresión de una proteína anti-viral y de un vastago susceptible a la enfermedad viral, en donde la planta injertada es resistente a dicha enfermedad viral. Se pueden emplear diversos métodos para producir plantas transgénicas resistentes a la enfermedad viral que pueden servir como rizomas. La presente invención se refiere específicamente a rizomas transgénicos que expresan transcritos homólogos a los segmentos del genoma viral blanco. Sin desear atenerse a un mecanismo específico, ia resistencia se puede asociar con silenciamiento de ARN. El silenciamiento de ARN, denominado silenciamiento post-transcripcíonal del gen (PTGS) en plantas, de la eliminación en hongos, y el ARN de interferencia en animales, se refiere al fenómeno por medio del cual los niveles del transcrito específico del gen se reducen en la presencia de ARN relacionados. El gen silenciado puede ser endógeno o exógeno al organismo, se puede presentar integrado dentro de un cromosoma o puede estar presente en una forma transitoria, tal como vector de transfección o virus que no se integra dentro del genoma. La expresión del gen se inhibe ya sea completamente o parcialmente. PTGS también se pueden considerar para inhibir la función to de ARN blanco, completamente o parcialmente. De conformidad con ciertas modalidades el rizoma transgénico resistente a la infección viral comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral. Se ha mostrado que la introducción de un transgén de manera constitutiva que expresa parte del genoma de un virus lleva a la resistencia de la planta a la infección por el virus (Marathe et al., 2000. Plant Mol. Biol. 43: 295-306). La presente invención actualmente muestra que el injerto de un vastago susceptible sobre un rizoma transgénico transformado como se describió anteriormente, resulta en la impartición de la resistencia viral a partir del rizoma hacia el vastago. Particularmente, la presente invención muestra que dicha planta injertada se protege a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo. Como un ejemplo no limitante, la presente invención describe la protección de un cultivar de pepino susceptible en contra del tobamovirus en mosaico de la fruta del pepino con origen en el suelo (CFMMV) mediante el injerto sobre un rizoma de pepino transgénico, resistente. CFMMV es un tobamovirus recientemente reportado que infecta a las cucurbitáceas aislado a partir de pepinos que crecen en invernadero (Cucumis sativus L.) en Israel (Antignus et al., 2001. Phytopathology 91 : 565-571 ). Las variedades de pepino son susceptibles a cuatro tobamovirus distintos que pertenecen a dos subgrupos. CFMMV está cercanamente relacionado biológicamente y de manera secuencia a secuencia con el virus Mosaico jaspeado verde de Kyuri (KGMMV) y con el virus mosaico jaspeado verde de la calabaza (ZGMMV), pero exhibe una afinidad serológica más débil y una menor homología de la proteína de cubierta (CP) con el virus del mosaico jaspeado verde del pepino (CGMMV-W). El genoma de ARN de CFMMV consiste de 6,562 nucleótidos (Genebank no. de acceso AF321057, SEQ ID NO: 4) con tres ARN subgenómicos, que codifican cuatro marcos abiertos de lectura (figuras 1A-1 B). La región próxima! hacia 5' de CFMMV codifica dos proteínas co-iniciadas esenciales para ia replicación: las proteínas de 132 kDa y de 189 kDa. La proteína de 189 kDa se crea por la lectura de un codón terminador UAG débil en el extremo 3' de la proteína de 132 kDa en la posición 3629 (Antignus et al., 2001 , anteriormente mencionado). En el virus del mosaico del tabaco (TMV) un ARN subgenómico denominado 11 -ARN inicia a partir del extremo del gen corto de la replicasa (132 kDa) y codifica la porción de lectura del marco de la replicasa, resultando en una proteína putativa de 54 kDa, aún no identificada en plantas infectadas por tobamovirus (Zaitlin, M. 1999. Phil Trans R Soc Lond B 354: 587-591 ). Bajo condiciones comerciales de invernadero, los síntomas de CFMMV se reconocen inicialmente en los frutos y hojas apicales en una etapa de crecimiento relativamente avanzada. Los síntomas de la hoja incluyen mosaico severo, formación de bandas en la vena y jaspeado de color amarillo. En algunos casos, las plantas completamente desarrolladas muestran síntomas severos de marchitamiento que llevan al colapso de la planta. La extensión viral rápida dentro de los invernaderos puede llevar a pérdidas significativas de cosechas económicas. El virus se extiende fácilmente vía el contacto mecánico de órganos vegetales con una fuente de inócuio. El virus puede persistir por largos períodos en los residuos vegetales o en el suelo infestado del invernadero. La ausencia de fuentes de resistencia natural eficientes en el pepino excluye la introducción de resistencia dentro de variedades comerciales mediante los programas de cruce tradicional. Por lo tanto, de conformidad con una modalidad, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína putativa de 54 kDa que es un fragmento de la proteína de replicación de virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino (CFMMV). De conformidad con una modalidad actualmente preferida, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. Como se ejemplifica en la presente invención a continuación, los pepinos partenocárpicos transformados con el gen no estructural putativo de 54 kDa de CFMMV exhibieron un alto nivel de resistencia (inmunidad) a la infección por CFMMV, y no se pudieran detectar trazas del virus en las plantas inoculadas mediante los métodos biológicos o moleculares. Se examinaron varios parámetros asociados con la respuesta de resistencia. En experimentos repetidos, el nivel de acumulación del transcrito del locus de 54 kDa en la línea transgénica fue consistentemente bajo (figura 6), a pesar de ser activado por un promotor constitutivo fuerte. Sin desear atenerse a un mecanismo específic, la resistencia se puede relacionar con la degradación específica dei transcrito del transgén, como se reportó previamente por la resistencia mediada por silenciamiento al virus vegetal. De manera interesante, la inoculación de las plantas transgénicas con CFMMV o ZYMV no afecta el nivel de expresión del ARN de la secuencia codificante de 54 kDa (figura 6). En contraste, en varios estudios en donde el silenciamiento estaba implicado en el mecanismo de resistencia, la inoculación de las plantas transgénicas resistentes con el virus homólogo redujo el nivel del ARN viral (Savenkov, E.l. y Vaikonen, J. P. 2002. J Gen Virol 83: 2325-2335). Antes de la infección con el virus que se sabe que contiene un gen supresor del silenciamiento no se elimina la resistencia de las plantas transgénicas a la infección de prueba con CFMMV. Esta observación difiere de los reportes sobre la resistencia mediada por silenciamiento de la N. benthamiana transgénica al virus A de la patata o del virus que produce irritación de la ciruela, lo cual se logró mediante la pre-infección con el virus de la patata Y y, respectivamente. La presente invención muestra la protección de pepinos susceptibles en contra de !a inoculación en suelo con CFMMV, mediante el injerto en un rizoma transgénico, resistente. Por lo tanto, la presente invención demuestra por primera vez, que los vastagos susceptibles se pueden proteger en contra de los virus con origen en suelo, al injertarlos en un rizoma transgénico que expresa un transcrito homólogo a un segmento del genoma viral. La protección mediada por el rizoma transgénico que se describe en la presente invención tiene aplicaciones significativas en agricultura, permitiendo que los productos no genéticamente modificados (no-GMO) se crezcan y se protejan adecuadamente en contra de los patógenos del suelo. De conformidad con modalidades adicionales, el rizoma transgénico resistente a la infección viral comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral. El fenómeno de silenciamiento post-transcripcional dei gen se puede activar mediante dos tipos de loci transgénicos. El primer tipo corresponde a un transgén particular altamente transcrito, como se describió anteriormente en la presente invención. El segundo tipo de loci del transgén que activa eficientemente PTGS es aquel que porta dos copias del transgén dispuestos como un repetido invertido (IR) produciendo ARNds mediante transcripción por lectura. El ARN de doble cadena (ARNds) es remarcablemente efectivo para suprimir la expresión específica del gen en numerosos organismos, incluyendo plantas. El silenciamiento del gen inducido por virus (VIGS), por ejemplo, se ha demostrado para numerosos virus de ARN vegetal (Vanee y Vaucheret, 2001. Science 292: 2277-2280). El proceso se inicia por moléculas de ARN de cadena doble (ARNds). Posiblemente las moléculas de ARNds se generan mediante intermediarios replicantes de ARN virales o por ARNs codificados por el transgén aberrante, los cuales se vuelven ARNds mediante actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN (Dalmay et al., 2000. Cell 101 : 543-553; Waterhouse et al., 2001. Nature 411 : 834-842). De tal manera que las moléculas de ARNds han sido incorporadas dentro de células vegetales, y son útiles en la supresión o inhibición de la expresión del gen viral (véase, por ejemplo, Solicitud de E.U.A. No. 20020169298). Dentro de la célula vegetal, los ARNds se escinden por un miembro de la familia de ribonucleasa lll hacia ARNs cortos de interferencia (ARNsi), los cuales generalmente tienen un intervalo en el tamaño de 21 a 26 nucleótidos. Se cree que los ARNsi promueven así la degradación del ARN mediante la formación de un complejo de nucleasa multi componente RISC (Complejo del Silenciamiento Inducido por ARN) que destruye el ARNm cognado (Elbashir et al., 2001. EMBO J 20: 6877-6888; Zamore et al., 2000. Cell 101 : 25-33). Recientemente, sé ha mostrado el dicho ARNsi tiene un intervalo de tamaño de 21 a 26 nucleótidos, un intermediario de la ruta de ARNi, son igualmente efectivos para la supresión de la expresión dei gen en sistemas animales y en mamíferos. Por lo tanto, el uso de ARNsi, se ha vuelto una herramienta poderosa para sub-regular la expresión del gen. El silenciamiento post-transcripcional del gen se extiende sistemáticamente hacia todas las plantas individuales en una manera muy característica reminiscente de la extensión viral. Esto ha llevado a hipótesis de que una señal sistémica de silenciamiento que se produce en los tejidos en donde inicia el silenciamiento y luego se transmite hacia las partes distantes de la planta en donde puede iniciar el silenciamiento de manera secuencia específica. La especificidad de secuencia del silenciamiento sugiere que la señal es un ácido nucleico, pero la identidad de la señal permanece desconocida (Kalantidis, K. 2004. PloS Biology 2: 1059-1061 ). El silenciamiento se extiende principalmente en ia dirección de la fuente de carbono hacia el producto final de carbono, es decir, a partir de los tejidos tales como hojas que exportan los productos de azúcar de la fotosíntesis, hacia los tejidos tales como raíces que importan estos productos, y puede tomar varias semanas hasta que se establecen en la planta total. La existencia de una señai de siienciamiento se ha mostrado en plantas injertadas, en donde el silenciamiento se transmite a partir de rizoma silenciado hacia el vastago blanco. No obstante, dicha transmisión de la señal depende de la expresión del transgén correspondiente por el vastago. Además, se demostró que la sobre-expresión de un gen que corresponde al cromosoma, ya sea un gen endógeno o un gen exógeno establemente integrado en el vastago es un pre-requisito esencial para la activación de la degradación del ARN mediada por la transmisión de la señal a partir del rizoma hacia el vastago. La presente invención demuestra que el rizoma transgénico que expresa ARNds dirigido para silenciar una secuencia genómica vira! confiere resistencia viral a un vastago susceptible después del injerto. La resistencia viral impartida al vastago implica que la señal transferida a partir del rizoma al vastago es efectiva en la escisión de la secuencia genómica viral. Por lo tanto, la presente invención muestra por primera vez que una señal transferida a partir de un rizoma hacia un vastago interfiere con una expresión funcional de una secuencia de ácido nucleico que no se expresa por el genoma vegetal, de manera específica de secuencia. Este hallazgo sugiere que la señal transmitida es ARN. Smirnov et al. (anteriormente mencionado) mostraron que la expresión de la proteína antiviral pokeweed (PAP) en plantas transgénicas induce la resistencia al virus en plantas injertadas. Los autores demostraron adicionalmente que la resistencia adquirida por el vastago no es dependiente de la acumulación de ácido salicílico y de la síntesis de proteínas relacionadas con la patogénesis. No obstante, estos resultados difieren sustancialmente en comparación con el fenómeno descrito por la presente invención, se requiere una actividad enzimática de PAP para la generación de la señal que vuelve al vastago resistente a la infección viral. Además, la actividad de PAP confiere resistencia viral no específica, en oposición a la resistencia específica de la secuencia impartida a las plantas injertadas de la presente invención. De conformidad con una modalidad, la presente invención describe la protección de un vastago de tabaco susceptible (Nicotiana benthamiana) en contra del virus del mosaico de la calabaza amarilla (ZYMV) al injertar sobre un rizoma de tabaco resistente transgénico, en donde el rizoma resistente que comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi se dirige a un segmento de! genoma de ZYMV, incluyendo el gen que codifica para una proteína de cubierta y la región no traducida hacia 3' del genoma viral. Esta modalidad sirve como un ejemplo limitante que demuestra el amplio alcance de la invención como se describió anteriormente en la presente invención. Las composiciones y métodos de la presente invención se pueden emplear para conferir resistencia a cualquier planta la cuai es susceptible a la infección viral. Los ejemplos no limitantes incluyen plantas de la familia Cucurbitaceae, frijol de soya, trigo, avena, sorgo, algodón, tomate, patata, tabaco, pimiento, arroz, maíz, cebada, Brassica, y Arabidopsis. De conformidad con una modalidad, la planta injertada, resistente al virus es de la familia Cucurbitaceae. De conformidad con una modalidad preferida, la pianta transgénica, resistente al virus se selecciona a partir del grupo que consiste de sandía, melón, calabaza, calabacita, calabaza amarilla y pepino. La especificidad del virus se podría determinar mediante el tipo y diseño de la secuencia de ácido nucleico transformada dentro de la planta. La secuencia de ácido nucleico puede codificar un transcrito que se dirige para silenciar un segmento correspondiente del genoma viral o más, y más de una secuencia de ácido nucleico se puede transformar dentro de la planta. De conformidad con ciertas modalidades, la presente invención provee una planta que comprende un rizoma transgénico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento de un genoma de un virus con origen en el suelo para que sea resistente a la enfermedad ocasionada por el virus con origen en el suelo y un vastago susceptible a la enfermedad, en donde la planta injertada se protege a partir de dicha enfermedad ocasionada por dicho virus con origen en el suelo. De conformidad con una modalidad, la planta es resistente a una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo seleccionado a partir del grupo que consiste de, pero no se limita a, virus transmitido por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano dei chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de cebada, virus del mosaico amarillo de cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo; virus transmitido vía herida de la raíz: Género Tobamovirus: virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar. De conformidad con una modalidad, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína putativa de 54 kDa que es un fragmento de la proteína de replicación de virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino (CFMMV). De conformidad con una modalidad actualmente preferida, el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. De conformidad con modalidades adicionales, la presente invención provee una planta que comprende un rizoma transgénico que comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral para que sea resistente a una enfermedad ocasionada por el virus y un vastago susceptible a la enfermedad ocasionada por dicho virus, en donde la planta injertada es resistente a dicha infección por dicho virus.

Se pueden diseñar plantas para que sean resistentes a cualquier virus, dependiendo del segmento dirigido del genoma viral. De conformidad con ciertas modalidades, las plantas son resistentes a un virus con origen en el suelo así como a los virus transmitidos por vectores los cuales afectan la parte aérea de la planta, como se describió anteriormente en la presente invención. De conformidad con una modalidad, la construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral comprende: (a) al menos un promotor que se expresa en planta operativamente asociado a; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco del genoma viral y una segunda secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y opcionalmente (c) una señal para término de la transcripción. De conformidad con algunas modalidades, la construcción de ADN de conformidad con la presente invención se diseña para expresar un ARN tallo-asa, que comprende además de la primera secuencia nucleotídica (sentido) y la segunda secuencia nucleotídica (antisentido) una secuencia polinucleotídica espaciadora, localizada entre la región de ADN que codifica la primera y segunda secuencias nucieotídicas. La longitud de ¡a secuencia polinucleotídica espaciadora puede variar de conformidad con la estructura específica del ARN tallo-asa. Típicamente, la relación de la longitud del espaciador con respecto a la longitud de la primera y segunda secuencias nucleotídicas se encuentra en el intervalo de 1 :5 a 1 :10. De conformidad con una modalidad preferida, la construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral comprende: (a) al menos un promotor que se expresa en planta operativamente asociado a; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble en la forma de tallo-asa, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco de! genoma viral; una segunda secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y una secuencia espaciadora; y opcionalmente, (c) una señal para término de la transcripción. De conformidad con una modalidad, el espaciador comprende una secuencia nucleotídica derivada a partir de un intrón de! gen, que se sabe en la técnica que mejora la producción de ARNsi. De conformidad con una modalidad, el espaciador comprende una secuencia nucleotídica que comprende un intrón a partir del gen de la catalasa de la semilla de ricino, que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3. El término "construcción de ADN" y "secuencia de ácido nucleico" como se utiliza en la presente invención se refiere a una molécula de polinucleótido que comprende al menos un polinucleótido que se expresa en una célula hospedera u organismo. Típicamente dicha expresión se encuentra bajo el control de ciertos elementos reguladores que actúan en cis incluyendo promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejido, y elementos potenciadores. De manera común en la técnica, se dice que dicha secuencia(s) polinucleotídica(s) está "operativamente asociada a" los elementos reguladores. Las secuencias de ácidos nucleicos transferidas dentro de una célula eucarionte típicamente incluyen también marcadores de selección derivados de células eucarionte o de bacterias que permiten la selección de células eucariontes que contienen la secuencia de ácidos nucleicos. Estas pueden incluir, pero no se limitan a, diversos genes que confieren resistencia a antibióticos y diversos genes reporteros, los cuales se conocen bien en la técnica. Opcionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos comprende adicionalmente sitios de clonación, uno o más orígenes procariontes de replicación, uno o más sitios de inicio de la traducción, una o más señales de poliadenilación, y los similares. Como se utiliza en la presente invención, el término "expresión de una secuencia de ácidos nucleicos", o expresión de un polinucleótido" se refiere al proceso en donde una región de ADN la cual está operativamente asociada con regiones reguladoras apropiadas, particularmente con una región promotora, se transcribe dentro de un ARN el cual es biológicamente activo por ejemplo, el cual es ya sea capaz de interaccionar con otro ácido nucleico o el cual es capaz de ser traducido hacia un polipéptido o proteína. Se debe entender que de conformidad con las enseñanzas de la presente invención, la traducción de una proteína no se requiere necesariamente para obtener el silenciamiento de un gen viral o parte del mismo. El término "expresión del gen" se refiere al proceso para la conversión de la ¡nformación genética codificada en un gen hacia ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, o ARNsn) a través de la "transcripción" del gen (por ejemplo, vía la acción enzimática de una ARN polimerasa), y hacia la proteína, a través de la "traducción" del ARNm. La expresión del gen se puede regular en muchas etapas en el proceso. La "sobre-regulación" o "activación" se refiere a la regulación que incrementa la producción de productos de expresión del gen (por ejemplo, ARN o proteína), mientras que la "sub-regulación" o "represión" se refiere a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción) que participan en la sobre-regulación o sub-regulación frecuentemente son denominadas "activadores" y "represores", respectivamente. Las secuencias nucleotídicas de la presente invención, que son un segmento de un genoma viral, pueden ser un gen de longitud total, una parte del mismo, una región no codificante o parte de la misma o una combinación de los mismos. Como se utiliza en la presente invención, el término "homología" cuando se utiliza en relación con las secuencias del ácidos nucleicos se refiere a un grado de similitud o identidad entre al menos dos secuencias nucleotídicas. Puede existir homología parcial u homología completa (por ejemplo, identidad). La "identidad de secuencia" se refiere a una medida de relación entre dos o más secuencias nucleotídicas, expresada como un porcentaje con referencia a la comparación de la longitud total. El cálculo de la identidad toma en cuenta aquellos residuos de nucleótidos que son idénticos y que se encuentran en las mismas posiciones relativas en sus secuencias respectivas. Un espacio, por ejemplo una posición en un alineamiento en donde un residuo está presente en una secuencia pero no está presente en la otra con respecto a una posición con residuos no idénticos. La homología se determina por ejemplo utilizando las búsquedas basadas en BLAST con espacios (Altschul et. al. 1997. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) y "BESTFIT". Como se utiliza en la presente invención, "un complemento de una secuencia nucleotídica" es la secuencia nucleotídica ia cual podría ser capaz de formar una molécula de ADN de cadena doble con la secuencia nucleotídica, y la cual se puede derivar a partir de la secuencia nucleotídica mediante el reemplazo del nucleótido a través de su nucleótido complementario de conformidad con las reglas del Chargaff (AT; GC) y leyendo en la dirección 5' a 3', por ejemplo en dirección opuesta a la secuencia nucleotídíca. Como se utiliza en la presente invención, la secuencia nucleotídica de la molécula de ARN se puede identificar con referencia a la secuencia nucleotídica del ADN del listado de secuencias. No obstante, la persona experta en la técnica entenderá si se pretende ei uso del ARN o ADN dependiendo del contexto. Además, la secuencia nucleotídica es idéntica excepto que ia base T se reemplaza por uracilo (U) en la molécula de ARN. Se apreciará que conforme es más larga la longitud total de la secuencia de ácidos nucleicos homologa al segmento del genoma viral, los requerimientos para identidad de secuencia con respecto a la secuencia del segmento de! genoma viral son menos severos. La secuencia total de ácidos nucleicos puede tener una identidad de secuencia de ai menos aproximadamente 90% con el segmento correspondiente del genoma viral, así como una mayor identidad de secuencia de aproximadamente 95% o 100%. De conformidad con cierta modalidad, en donde el rizoma que comprende una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi se direcciona a al menos un segmento del genoma viral, la longitud de la segunda secuencia nucleotídica (antisentido) de la construcción de ADN se determina en gran parte por una longitud de la primera secuencia nucleotídica (sentido), y puede corresponder a la longitud de la última secuencia. No obstante, es posible utilizar las secuencias antisentido que difieren en longitud por aproximadamente 10%. De manera similar, la secuencia nucleotídica de la región antisentido se determina en gran parte por ia secuencia nucleotídica de la región sentido, y puede tener una identidad de secuencia de aproximadamente 90% con la secuencia complemento de la región sentido, así como mayores identidades de secuencia de aproximadamente 95% o 100%. La primera y segunda secuencias nucleotídicas de la construcción de ADN diseñadas para generar ARNsi pueden ser de cualquier longitud para proveer las secuencias que comprenden al menos 20 nucleótidos contiguos. Por lo tanto, el primero y segundo nucleótidos pueden comprender una porción de una secuencia blanco o una longitud total de ia secuencia blanco. De conformidad con algunas modalidades, la longitud de las secuencias nucleotídicas es de 20 nucleótidos a 1 ,200 nucleótidos. De conformidad con una modalidad, el ARNsi que se genera mediante la construcción de ADN de la presente invención se dirige para silenciar un segmento del genoma de ZYMV, incluyendo la región codificante para la proteína de la cubierta viral. De conformidad con una modalidad preferida, la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que tiene 90% de identidad, preferiblemente 95%, más preferiblemente 100% de identidad con la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. De conformidad con otra modalidad preferida, la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que tiene 90% de identidad, preferiblemente 95%, más preferiblemente 100% de identidad con el complemento de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. De conformidad con ciertas modalidades, la primera y la segunda secuencias nucleotídicas están operativamente asociadas con el mismo promotor. Las cadenas transcritas, las cuales son al menos parcialmente complementarias, son capaces de formar ARNds. De conformidad con otras modalidades, la primera y la segunda secuencias nucleotídicas se transcriben como dos cadenas separadas. Cuando el ARNds se produce así, la secuencia de ADN a ser transcrita está flanqueada por dos promotores, uno que controla la transcripción de la primera secuencia nucleotídica, y el otro que controla Sa transcripción de la segunda secuencia nucleotídica complementaria. Estos dos promotores pueden ser idénticos o diferentes. De conformidad con una modalidad, la primera y la segunda secuencias nucleotídicas están operativamente asociadas con el mismo promotor. Los promotores que se expresan en planta se conocen en la técnica. La selección de un promotor adecuado será dirigida por las especies vegetales en las cuales se pretende utilizar la construcción de ADN de la invención, la disponibilidad, y el modo requerido de acción. Los promotores preferidos de conformidad con las enseñanzas de la presente invención son promotores constitutivos, ya sea generales o específicos del tejido. El término "constitutivo" cuando se utiliza en referencia con un promotor significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos operativamente asociada en la ausencia de un estímulo (por ejemplo, choque térmico, químicos, luz, etc.). Típicamente, los promotores constitutivos son capaces de dirigir la expresión de un transgén en sustancialmente cualquier célula y cualquier tejido. Los promotores frecuentemente utilizados para la expresión constitutiva de genes en plantas incluyen el promotor de CaMV 35S, el promotor mejorado de CaMV 35S, el promotor del Virus del Mosaico de la Higuera (FMV), el promotor de la manopina sintasa (mas), el promotor de la nopalina sintasa (nos), y el promotor de la octopina sintasa (oes). Un promotor constitutivo aislado a partir del virus de la vena en banda de la fresa (SVBV) aislado por los inventores de la presente invención y colaboradores (Wang et al., 2000. Virus Genes 20: 11-17) se utiliza de manera preferible. El uso potencial de la regulación del gen post-transcripcional para la supresión de genes específicos ha llevado al desarrollo de diversos métodos novedosos para la obtención de ARNsi activos dentro de una célula. Por ejemplo, la solicitud de E.U.A. No. 20040262249 describe la introducción directa de ARNsi para silenciar a un gen blanco, específicamente un gen viral dentro de una célula vegetal. Las enseñanzas de la presente invención se pueden practicar con cualquier método conocido en la técnica para la generación de ARNsi dentro de una célula vegetal, o la introducción directa de ARNsi dentro de la célula vegetal. Moléculas nucleotídicas las cuales hibridan de manera cruzada con las secuencias de ácido nucleico anteriormente descritas en la presente invención, específicamente con (i) un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada a partir de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o (ii) el complemento de una secuencia nucleotídica seleccionada a partir de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y fragmentos de ia misma también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La hibridación exitosa depende en gran parte de las condiciones de hibridación. Como se utiliza en la presente invención, los términos "condiciones severas" o "severidad", se refieren a las condiciones para hibridación como se define por el ácido nucleico, sal, y temperatura. Estas condiciones se conocen bien en la técnica y se pueden alterar con el objeto de identificar o detectar secuencia polinucleotídicas idénticas o relacionadas. Numerosas condiciones equivalentes que comprenden ya sea severidad baja o alta dependen de factores tales como la longitud y naturaleza de la secuencia (ADN, ARN, composición de bases), naturaleza del blanco (ADN, ARN, composición de bases), medio (en solución o inmovilizados sobre un sustrato sólido), concentraciones de sales y otros componentes (por ejemplo, formamida, sulfato de dextrán y/o polietilenglicol), y la temperatura de las reacciones (dentro del intervalo a partir de aproximadamente 5°C a aproximadamente 25°C por debajo de la temperatura de fusión de la sonda). Uno o más factores pueden variar para generar condiciones ya sea de baja severidad o de alta severidad. Las condiciones de hibridación y de lavado se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY. 1989, particularmente el capítulo 11. De conformidad con una modalidad, se lleva a cabo la hibridación cruzada bajo severidad moderada de SSC 1.0-2.0 X a 65°C. Las construcciones diseñadas para ia transformación de las secuencias nucleotídicas dentro de células vegetales típicamente también incluyen marcadores de selección que permiten la selección de células vegetales que contienen la construcción de la invención. El término "marcador de selección" se refiere a un gen el cual codifica una enzima que tiene una actividad que confiere resistance a un antibiótico o fármaco dependiendo de la célula en la cual se expresa el marcador de selección, o el cual confiere expresión de un rasgo el cual se puede detectar (por ejemplo, luminiscencia o fluorescencia). Típicamente, los genes que confieren resistencia al antibiótico, y los cuales se conocen bien en la técnica se utilizan como un marcador de selección. No obstante, el crecimiento de plantas genéticamente modificadas que comprenden gen(es) que confieren resistencia al antibiótico en campos abiertos, específicamente cosechas de agricultura, no se permite en un número en incremento de países occidentales ¡ncluso cuando el producto final no contiene el material genético extraño. Por lo tanto, de conformidad con ciertas modalidades, se utiliza un método de co-transformación para seleccionar plantas transformadas con la construcción de ADN de la presente invención. De conformidad con una modalidad, se lleva a cabo la co-transformación con una construcción de ADN que confiere silenciamiento del gen viral de conformidad con la presente invención y una construcción de ADN que comprende al menos un marcador de selección. Los métodos de co-transformación se conocen en la técnica, y se basan en parte en el hallazgo de que un alto porcentaje de las células transformadas contiene ambas construcciones de ADN. Las plantas que expresan el marcador de selección se examinan para la presencia de la construcción de ADN que confiere silenciamiento del gen viral, por ejemplo mediante reacción de PCR. Las plantas seleccionadas se crecen hasta su madurez y se auto-polinizan. En la progenie resultante, las dos construcciones de ADN se segregan independientemente, permitiendo la selección de plantas que comprenden solamente la construcción deseada de ADN. Opcionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos que confiere la escisión del gen viral comprende una señal para término de la transcripción. Se puede emplear una variedad de terminadores en las construcciones de la presente invención que se conoce bien por aquellos expertos en la técnica. El terminador puede ser a partir del mismo gen como la secuencia promotora o a partir de un gen diferente. De conformidad con una modalidad, la señal de término de la transcripción es el terminador NOS. De conformidad con un aspecto adicional, la presente invención provee un método para la producción de una planta injertada resistente a la infección por un virus que comprende los pasos de (a) proveer un rizoma transgénico resistente a la infección viral diferente por medio de la expresión de una proteína anti-viral; (b) proveer un vastago susceptible a la infección por dicho virus; y (c) injertar el vastago sobre el rizoma para obtener una planta injertada resistente a dicha infección viral. El injerto incluye la combinación de dos partes vegetales independientes dentro de una planta. Dicha combinación se puede llevar a cabo de diversas formas, incluyendo, pero no se limitan a injerto de lienzo y lengüeta, injerto de procesamiento, un injerto de punta-surco, injerto lateral, injerto en forma de cubierta e injerto de yema (para detalles adicionales véase Garner R. J., The Grafter's Handbook, 5a Ed edición (Marzo 1993) Cassell Academic; ISBN: 0304342742). De conformidad con una modalidad, el rizoma se transforma con una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento de un genoma viral para producir un rizoma transgénico resistente a la infección viral. De conformidad con una modalidad adicional, el rizoma se transforma con una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionado a al menos un segmento de un genoma viral para producir un rizoma transgénico resistente a ia infección viral. De conformidad con modalidades preferidas de la invención, el segmento afectado del genoma viral es esencial para el virus para la infeción vegetal y/o replicación, de manera que su escisión previene la infección viral y/o replicacíón, proveyendo así una planta resistente. Los métodos para la transformación de un rizoma con una secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la presente invención para volver el rizoma resistente a la infección viral se conocen en la técnica. Como se utiliza en la presente invención el término "transformación" o "transformar" describe un proceso por medio del cua! un ADN extraño, ta! como una construcción de ADN, entra y cambia a una célula recipiente hacia una célula transformada, genéticamente modificada o transgénica. La transformación puede ser estable, en donde la secuencia de ácido nucleico se integra dentro del genoma vegetal y como tal representa un rasgo estable y heredable, o transitoria, en donde la secuencia de ácido nucleico se expresa por la célula transformada pero no se integra dentro del genoma, y como tal representa un rasgo transitorio. De conformidad con modalidades preferidas la secuencia de ácido nucleico de la presente invención se transforma de manera estable en una célula vegetal. Existen diversos métodos para la introducción de genes extraños dentro de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I. 1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. 1989. Nature (1989) 338, 274-276). Los métodos principales para la integración estable de ADN exógeno dentro del ADN genómico vegetal incluyen dos métodos principales: Transferencia del gen mediada por Agrobacterium: el sistema mediado por Agrobacterium ¡ncluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos definidos de ADN los cuales se integran dentro del ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de las especies vegetales y del sistema de administración de Agrobacterium. Un método ampliamente utilizado es el procedimiento de disco de hoja, el cual se puede llevar a cabo con cualquier explante de tejido que provee una buena fuente para el inicio de la diferenciación de la planta total (Horsch, R. B. et al. 1988. Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). Un método suplementario emplea el sistema de administración de Agrobacterium en combinación con la infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente útil para la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas. Toma directa de ADN. Existen varios métodos de transferencia directa del ADN dentro de las células vegetales. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte, abriendo mini-poros para permitir que entre el ADN. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente de manera directa dentro de las células utilizando micropipetas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente hacia las células o tejidos vegetales. Después de la transformación estable, ocurre la propagación de la planta. El método más común de propagación vegetal es mediante semilla. No obstante, la desventaja de la regeneración por propagación mediante semilla, en la ausencia de uniformidad en la cosecha debido a la heterocigosidad, puesto que las semillas se producen por plantas de conformidad con las variaciones genéticas dirigidas por las reglas Mendelianas. En otras palabras, cada semilla es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la regeneración se lleve a cabo de tal manera que la planta regenerada tenga dichos rasgos idénticos y características similares a aquellas plantas transgénicas parenterales. El método preferido para la regeneración de una planta transformada es mediante micropropagación, lo cual provee a una reproducción rápida, consistente de las plantas transformadas. La micropropagación es un proceso de crecimiento de plantas de segunda generación a partir de una muestra de tejido particular escindida a partir de una planta parental selecciona o cultivar. Este procedimiento permite la reproducción en masa de plantas que tienen el tejido preferido y que expresan una proteína de fusión. Las plantas recientemente generadas son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de la planta original. La micropropagación permite la producción en masa de materia vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una rápida multiplicación de los cultivares seleccionados con conservación de las características de la planta transgénica original o transformada. Las ventajas de este método de clonación vegetal incluyen la velocidad de multiplicación vegetal y la calidad y uniformidad de las plantas producidas. La micropropagación es un procedimiento de múltiples etapas que requiere la alteración del medio de cultivo o de las condiciones de crecimiento entre las etapas. El procedimiento de micropropagación incluye cuatro etapas básicas: etapa uno, cultivo inicial dei tejido; etapa dos, multiplicación del tejido de cultivo; etapa tres, diferenciación y formación de la planta; y etapa cuatro, cultivo en invernadero y endurecimiento. Durante la etapa uno, se establece el cultivo de tejido y se certifica que se encuentre libre de contaminantes. Durante la etapa dos, el cultivo inicial de tejido se multiplica hasta un número adecuado de muestras de tejido producidas para alcanzar los objetivos de la producción. Durante la etapa tres, las muestras de tejido recientemente crecidas se dividen y se crecen hacia plántulas individuales. En la etapa cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para endurecimiento en donde gradualmente se incrementa la tolerancia de las plantas a la luz de manera que pueden continuar creciendo en el ambiente natural. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los diversos componentes de las secuencias de ácido nucleico y los vectores de transformación descritos en la presente invención están operativamente asociados, de manera que resultan en la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico. Las técnicas para la asociación operativa de los componentes de las construcciones y vectores de la presente invención se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen el uso de enlazadores, tales como enlazadores sintéticos, por ejemplo incluyendo uno o más sitios para la enzima de restricción. Como se ejemplifica en la presente invención a continuación, los rizomas transgénicos de la presente invención expresan moléculas exógenas de ARN, específicamente secuencias de ARN homologas a al menos un segmento de genoma del virus blanco. La expresión se puede monitorear mediante métodos conocidos por una persona experta en la técnica, por ejemplo mediante aislamiento de ARN para la clasificación y evaluación de la planta transgénica para la presencia del ARN viral mediante el empleo de iniciadores específicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presente invención también se refiere a una célula vegetal o a otras partes de la misma transformadas con una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la presente invención para servir como un rizoma. Además, también se comprende por la presente invención una semilla producida por la planta transgénica, en donde la semilla también comprende la secuencia de ácidos nucleicos transformada dentro de la planta. La planta transgénica resistente se puede propagar para producción a gran escala de los rizomas mediante un esquema de cruza convencional. Además, la cruza se puede utilizar para introducir la construcción de ADN dentro de otras variedades de la misma planta o de especies vegetales relacionadas, o en plantas híbridas. Por lo tanto, las semillas obtenidas a partir de las plantas transgénicas que contienen la secuencia de ácido nucleico como un inserto genómico estable, también comprendidas por la presente invención son la progenie transgénica de las plantas transgénicas descritas en la presente invención, crecidas a partir de semillas de las plantas transgénicas. Cualesquiera de las plantas transgénicas anteriormente descritas puede servir como un rizoma sobre el cual se injerta un vastago de conformidad con las enseñanzas de la presente invención. La selección de plantas transformadas con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención que provee un rizoma transgénico resistente se lleva a cabo empleando métodos estándares de genética molecular, conocidos por una persona experta en la técnica. De conformidad con una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto que confiere resistencia a un antibiótico, y por lo tanto las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia al antibiótico. De conformidad con ciertas modalidades, el antibiótico que sirve como un marcador de selección es uno del grupo aminoglicósido que consiste de paromomicina y canamicina. De conformidad con otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente un gen reportero que codifica un producto detectable, y por lo tanto se seleccionan las plantas transgénicas en las cuales se detecta el producto. De conformidad con ciertas modalidades, el gen reportero se selecciona a partir del grupo que consiste de GUS, GFP y los similares. De conformidad con otra modalidad, las plantas transformadas para proveer rizomas resistentes se seleccionan de conformidad con su resistencia a la infección viral. Por lo tanto el virus seleccionado para probar las plantas comprende en su genoma la secuencia de ácido nucleico transformada dentro de las plantas. De conformidad con una modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia a un virus con origen en el suelo seleccionado a partir del grupo que consiste de, pero no se limita a, virus transmitidos por nemátodos: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de cebada, virus del mosaico amarillo de cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo; virus transmitido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus dei mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus dei mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar. De conformidad con otra modalidad, las plantas transgénicas se seleccionan de conformidad con su resistencia a un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la planta, seleccionado a partir del grupo que consiste de, pero no se limita a, una familia viral: Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartitiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae; Tobamovirus, Tobravirus, Potexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Vitivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tymovirus, Idaeovirus, Ourmivirus, Umbravirus.

De conformidad con otro aspecto la presente invención se refiere a las plantas injertadas resistentes a virus generadas por los métodos de la presente invención. Las plantas, que comprenden un vastago el cual es susceptible de otra manera a una enfermedad viral, se injerta sobre un rizoma transgénico, resistente, y éstas son resistentes a la enfermedad viral. El rizoma comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención establemente integrada dentro de su genoma. La naturaleza de la secuencia de ácido nucleico, ya sea en un transgén particular que se transcribe altamente, o un transgén que produce ARNsi como se describió anteriormente en la presente invención, determina las características de resistencia conferidas por la planta injertada. De conformidad con ciertas modalidades, el rizoma confiere protección a partir de la enfermedad ocasionada por virus con origen en el suelo. De conformidad con otras modalidades, el rizoma confiere resistencia a una enfermedad ocasionada por un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la planta. Los siguientes ejemplos no limitantes en la presente invención a continuación describen las plantas resistentes que comprenden un rizoma y un vastago de conformidad con la presente invención. A menos que se establezca de otra manera en los ejemplos, todas las técnicas de ADN y ARN recombinantes, así como los métodos de horticultura, se llevan a cabo de conformidad con los protocolos estándares como se conoce por una persona experta en la técnica.

EJEMPLOS Procedimientos experimentales Construcción del vector binario pCAMSV de 54 kDa Las secuencias codificantes putativas de 54 kDa con 22 nucleótidos adicionales cascada arriba del AUG en la posición 3629 (figural A), fueron clonadas dentro del vector binario pCambia2301 (no. de acceso AF234316; Hajdukiewicz et al., 1994. Plant Mol Biol 25: 989-994) utilizando la clona de longitud total generada por Antignus et al., anteriormente mencionado. La secuencia codificante de 54 kDa se fusionó en su extremo hacía 5' con respecto a la región no codificante (NCR) de ZYMV y al terminador poli-A NOS en su extremo hacia 3' (T) (figura 1B). El gen clonado y el gen marcador NPTII se clonaron cascada abajo del promotor truncado del caulimovirus de la formación de bandas en la vena de la fresa (SVBV) (por lo tanto designado como SV) y el promotor de longitud total SVBV, respectivamente (Wang et al., 2000. Virus Genes 20: 11-17 (figura 1 B). Esta construcción de ADN se clonó entre los bordes del ADN-T izquierdo (LB) y derecho (RB) (figura 1 B). El promotor SV unido al 5' NCR de ZYMV se amplificó mediante PCR a partir del molde de la clona ?SVBVpr-ZYMV-FLC (Wang et al., anteriormente mencionado) con el SV iniciador sentido (SEQ ID NO: 5: 5'CGCTAGCTATCACTGAAAAGACAGC3') y el iniciador ZYMV NCR antisentido que contiene un sitio Ncol (subrayado) (SEQ ID NO: 6: 5' GGCCATGGTTATGTC TGAAGTAAACG 3'). El fragmento de PCR (470 pb) se clonó dentro del vector pGEM-T (Promega, Madison, Wl, E.U.A.) y se designó adicionalmente como p?SVBV-NCRzy. La secuencia codificante de 54 kDa se amplificó mediante PCR a partir de ia clona pUC3'-3.3 kb con los siguientes iniciadores: 5'CGGCCATGGCATCGAAGGCGGGTTTTTGGACG3' (54 kDa sentido con el sitio Ncol subrayado, SEQ ID NO: 7), 5'GAGGTGACCTAGACACTAGGCTTAATGAATAG3' (54 kDa antisentido con el sitio BstEII subrayado, SEQ ID NO: 8). El fragmento de PCR putativo de 54 kDa (1461 pb) se digirió previamente mediante Ncol/BstEll y se clonó dentro de p?SVBV-NCRzy digerido por Ncol/BstEll. La clona obtenida p?SVBV-NCR54-kDa se digirió doblemente por EcoRI/BstEII y el inserto resultante se clonó dentro del vector binario pCAMBIA2301 , el cual se digirió doblemente con EcoRI/BstEII antes de la clonación. El promotor 35S (localizado cascada arriba del gen NPTII) a partir de pCAM35S-SV54-kDa se reemplazó por el promotor intacto SVBV como sigue: el promotor SVBV, previamente clonado dentro de pGEM-T y denominado SVBVpr (Want et al., anteriormente mencionado), se escindió mediante digestión doble de los sitios EcoRI/BglII, y se clonó dentro del mismo sitio en el vector binario, actualmente designado como pCAMSV54-kDa. Esta construcción final (figura 1B) se introdujo dentro de Agrobacterium tumefacíens cepa EHA105 y se utilizó para transformar la planta deseada.

Construcción de ia construcción de ADN para la generación de ARNsi, pCddCP-ZY. El extremo hacia 3' del genoma ZYMV, incluyendo el gen intacto que codifica la proteína de la cubierta del virus y ia región no codificante hacia 3' (NCR) (SEQ ID NO: 2, no. de acceso M35095) se amplificó mediante PCR con iniciadores que contienen sitios BamHI y Kpnl (iniciador sentido 5'ATGGATCCCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGC3'SEQ ID NO: 10) y el iniciador anti-sentido que contiene sitios Narl y Pstl (5'ATGGCGCCGGTACCAGGCTTGCAAACGGAGTC3'SEQ ID NO: 11). Este segmento se aisló a partir de un aislado de ZYMV Israel, y es homólogo a la secuencia de ácidos nucleicos a partir de la posición 8538 a 9588 del genoma de ZYMV que tiene el número de acceso NC_0033224 (SEQ ID NO: 9). Previamente, se clonó un intrón de la catalasa dentro del polienlazador de KS Bluescript. El intrón clonado de la catalasa clonada contenía los sitios BamHI y Pstl en el extremo 5', un Narl y Kpnl en el extremo 3". El producto de PCR del extremo 3' del genoma de ZYMV (1050 pb) se cortó inicialmente con Kpnl y Narl, y el producto resultante se clonó cascada abajo (extremo 3') del intrón de la catalasa en el plásmido KS. Subsecuentemente, El producto de PCR se cortó con BamH! y Pstl, y el producto se clonó dentro del extremo 5' del intrón de la catalasa en el plásmido KS. Esto resultó en un repetido invertido del extremo 3' del genoma de ZYMV en KS, separado por el intrón de la catalasa. La clona novedosa se designó pKSddCP-ZY. El promotor 35SCaMV a partir de un vector binario pCambia 2301 se reemplazó por el promotor SVBV. La construcción previamente descrita, pKSddCP-ZY, se cortó mediante BamHI y Kpnl, y se clonó dentro de los sitios apropiados BamHI y Kpnl cascada abajo a partir del promotor SVBV, y cascada arriba a partir de un terminador NOS. La clona novedosa se designó pCddCP-ZY (figura 2).

Transformación mediada por Agrobacterium Los cultivos de Agrobacterium se crecieron durante toda la noche a 28°C en medio LB que contienen antibióticos para selección apropiados y 100 uM de acetosiringona, y luego se sub-cultivan por 4 horas bajo las mismas condiciones en medio sin antibióticos. Las bacterias se sedimentaron y se re-suspenden en medio MS líquido (Murashige, T. y Skoog, F. 1962. Physiology Plantarum 15: 473-497) que contenía 3% de sacarosa a una densidad final de 0.5 DO. El método de transformación fue como se describió previamente (Tabei et al., 1998. Plant cell report 17: 159-164), con varias modificaciones.

Transformación de pepino Las semillas de pepino pelado de cv. "lian" (Zeraim Gedera Co., Israel) se esterilizaron en su superficie mediante incubación por 1 minuto en 70% de etanol y luego en 2% de solución de hipoclorito por 20 minutos.

Después de un lavado extensivo, las semillas se incubaron por 1-2 días sobre medio MS que contenía 3% de sacarosa y 0.8% de agar oxoide, a 25°C en la oscuridad. Los embriones de semilla se disecaron y se incubaron cotiledones individuales por 1-2 días a 25°C en la oscuridad, sobre medio para regeneración (medio MS, 3% de sacarosa, 2 mg/l de bencilaminopurina (BAP), 1 mg/l de ácido abscísico (ABA), 0.8% de agar oxoide) suplementado con 200 uM de acetosiringona. Los cotiledones se sumergieron en suspensión de Agrobacterium por 5 minutos, se secaron sobre papel filtro y se regresaron a las mismas placas por 2 días de co-cultivo en la oscuridad. Luego se transfirieron los explantes al medio para selección (medio para regeneración suplementado con 500 mg/l de Cefatoxima y 100 mg/l de canamicina) y se incubaron en un régimen de fotoperiodo de 16/8-horas con subcultivos bisemanales. Los retoños regenerados se escindieron y transfirieron a medio para elongación (MS, 3% de sacarosa, 1 mg/l de ácido giberélico, 0.1 mg/l de BAP, 0.1 mg/l de ABA, 0.8% de agar oxoide, 500 mg/l de Cefatoxima y 100 mg/! de canamicina). La formación de raices de los retoños se indujo en MS, 3% de sacarosa, 0.5 mg de ácido indol butírico, 0.8% de agar oxoide, 500 mg/l de Cefatoxima y 100 mg/l de canamicina. Las plántulas que formaron raíces se transplantaron en concentrados Jiffy 7 peat para endurecimiento, antes de ser transferidas a un invernadero para crecimiento adicional.

Transformación de tabaco Los explantes de hoja a partir de plantas axénicas se incubaron por 1-2 días a 25°C en la oscuridad, sobre medio para regeneración (medio MS, 3% de sacarosa, 1 mg/l de bencilaminopurina (BAP), 0.1 mg/l de ácido naftalenacético (NAA), 0.8% de agar oxoide) suplementado con 200 uM de acetosiringona. Los explantes se sumergieron en suspensión de Agrobacterium por 5 minutos, se secaron sobre papel filtro y se regresaron a las mismas placas por 2 días de co-cuitivo en ia oscuridad. Luego ios explantes se transfirieron al medio para selección (medio para regeneración suplementado con 500 mg/l de Cefatoxima y 250 mg/l de canamicina) y se incubaron en un régimen de fotoperiodo de 16/8-horas con subcultivos bisemanales. Los retoños regenerados se escindieron y transfirieron a medio para formación de raíz (MS, 3% de sacarosa, 0.8% de agar oxoide, 500 mg/i de Cefatoxima y 250 mg/l de canamicina). Las plántulas que formaron raíces se transplantaron en concentrados Jiffy 7 peat para endurecimiento, antes de ser transferidas a un invernadero para crecimiento adicional.

Ensavo de segregación en vastagos R^ Las progenies a partir de plantas individuales transformadas se seleccionaron para segregación de la construcción de ADN, como sigue: las semillas Ri se esterilizaron en la superficie y se germinaron como se describió anteriormente, en la presencia de 100 mg/l de canamicina. Las semillas transgénicas (que contenían el gen NPT II) mostraron desarrollo normal de la raíz, mientras que las plantas de progenies no transgénicas se detectaron fácilmente de conformidad con sus raíces atrofiadas y no ramificadas. Se registró la relación resistente/susceptible a canamicina, y los vastagos transgénicos se utilizaron en experimentos adicionales.

Evaluación de la respuesta a la resistencia Los vastagos R1 resistentes a canamicina se seleccionaron bajo condiciones de invernadero para resistencia al virus.

Resistencia a CFMMV Las plantas de pepino resistentes a canamicina se inocularon mecánicamente con CFMMV purificado a 1 mg/ml en 50 mM de regulador de pH con fosfato (pH 7.4), o con ARN viral a 400 ug/ml en 50 mM de regulador de pH con fosfato (pH 8.0). Para la mayoría de las progenies transgénicas, se seleccionaron inicialmente más de 10 vastagos mediante inoculación. Los vastagos inoculados se mantuvieron por varias semanas bajo condiciones de invernadero. Las respuestas a la inoculación se determinaron mediante inspección visual de los síntomas, y para la presencia de CFMMV mediante DAS-ELISA con un antisuero específico preparado a una dilución de 1 :1 ,000 (Antignus et al., anteriormente mencionado). El análisis de resistencia adicional se llevó a cabo mediante re-inoculación mecánica a N. benthamiana y Datura stramonium tres semanas post-inoculación.

Resistencia a ZYMV Las plantas de tabaco que expresan GUS resistentes a canamicina se inocularon mecánicamente con sap diluido a una relación 1 :5, a partir de plantas de tabaco co-infectadas con ZYMV y un tobamovirus tentativamente identificado como virus del mosaico jaspeado verde del pepino (CGMMV), que sirve como auxiliar para obtener la extensión sistémica de ZYMV. Para la mayoría de las progenies transgénicas, se seleccionaron iniciaimente más de 10 vastagos mediante inoculación. Los vastagos inoculados se mantuvieron por varias semanas bajo condiciones de invernadero. Las respuestas a la inoculación se determinaron mediante ELISA con un antisuero específico ZYMV-CP preparado a una dilución de 1 :2,000. Los vastagos de pepino en la etapa de cotiledón se utilizaron para injerto. Se utilizó un método de injerto en la parte superior, en el cual el vastago no transformado se injertó después de un corte diagonal dei talio bajo el nodo del cotiledón y se instaló en la parte superior de un vastago de rizoma transgénico o no transformado, el cual también se cortó diagonalmente en el nodo del cotiledón de manera que retuvo un cotiledón particular (de manera que el vastago injertado contenía tres cotiledones). Los vastagos de tabaco de tres semanas de edad se injertaron en la parte superior mediante la elaboración de un corte diagonal en el tallo del rizoma y se instaló un vastago el cual se cortó diagonalmente de manera similar. La unión del vastago/rizoma se aseguró en su lugar con sujetadores pequeños de plástico. Durante la primera semana las plantas injertadas se mantuvieron con alto contenido de humedad.

Inoculación de plantas Los vastagos de pepino se utilizaron como plantas fuente para mantener los cultivos de CFMMV KGMMV, ZGMMV CGMMV y virus de coloración amarilla en la vena del pepino (CVYV). Las plantas de calabacita se utilizaron como la fuente del inoculo para ZYMV y CMV-Fny. Los inóculos se prepararon mediante el molido de hojas jóvenes de plantas fuente en agua destilada. Los cotiledones (3 días post emergencia) se inocularon mecánicamente después de la formación de polvo con carborundo. La inoculación de la raíz se llevó a cabo mediante el transplante de las plantas evaluadas a partir de bandejas de poliestireno hacia macetas de plástico (10 cm de diámetro) que contienen medio perlite infestado con virus. Ei inoculo sin purificar se preparó mediante el molido de hojas de pepino infectadas con el virus en 0.01 M de regulador de pH con fosfato pH 7 a una relación de 1 :100. La inoculación del injerto se llevó a cabo mediante la elaboración de un corte diagonal en el tallo de una planta infectada con el virus en la etapa de cuatro hojas verdaderas. La parte apical de la planta a ser inoculada se removió y la parte inferior de su tallo se cortó hasta una forma en cuña antes de ser insertado dentro del corte diagonal del rizoma infectado. El punto de contacto del vastago y del rizoma se unió con una tira de parafilm para proveer una buena fusión. Durante la primera semana las plantas injertadas se mantuvieron en bolsas de plástico para mantener un alto nivel de humedad. Los viriones se purificaron parcialmente a partir de plantas infectadas como se describió (Chapman S. N. 1998. en: Plant Virology Protocols. G. D. Foster y S. C. Taylor, Eds. Humana Press, New Jersey: 123-129). Los viriones parcialmente purificados se mezclaron a una relación 1 :1 con regulador de pH para carga 2X SDS-PAGE y se hirvieron por 5 minutos. (Sambrook et al., 1989. Molecular cloning-A LABORATORY MANUAL, segunda edición). Ei material hervido (10 ul) se fraccionó mediante SDS-PAGE sobre un gel de poliacrilamida al 12.5%.

Extracción y análisis de ARN, Northern blot y RT-PCR La transcripción del ARN viral se determinó mediante Northern blot y análisis de RT-PCR del ARN total extraído a partir de vastagos tres semanas después de la germinación. El tejido de hoja joven (300 mg) se molió hasta un polvo fino en nitrógeno líquido y el ARN se extrajo con el equipo TRI-REAGENT (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, E.U.A.), de conformidad con las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió mediante GeneQuant (Pharmacia Biotech), y se cargaron cantidades comparables de ARN a partir de diferentes fuentes en un gel. Aproximadamente 30 ug de cada muestra se procesaron en un gel desnaturalizante de agarosa al 1.5% que contenía formaldehído. El ARN separado en el gel se sometió a blot sobre membranas Hybond-NX (Amersham, NJ, E.U.A.) y se fijó mediante exposición a una lámpara de 80W UV (Vilber Lourmat BLX-254, Francia) por 2 minutos. La prehibridación con regulador de pH Rapid-hyb (Amersham Pharmacia) se llevó a cabo por 2 horas. El ARN de CFMMV se detectó en plantas transformadas mediante hibridación con una sonda de ADN marcada con 32P del gen de 54 kDa de CFMMV (nucleótidos 3824-4693) con una sonda de ADN marcada con 32P cebada al azar (equipo Random Primer ADN labeling mix; Biological Industries, Beit HaEmek, Israel). El RT-PCR para la detección de ARN de CFMMV en plantas inoculadas se llevó a cabo en un método de un solo paso en un tubo con 2-5 ug del ARN total de conformidad con Arazi et al. (2001. J Biotechnol 87: 67-82) con iniciadores específicos del gen de 54 kDa (sentido: 5'GCTACGGAGCGTCCGCGG3', SEQ ID NO: 12, y antisentido: 5'CGCGGTCGACTGTATGTCAT3', SEQ ID NO: 13). Los ciclos de RT-PCR fueron como sigue: 46°C 30 minutos; 94°C 2 minutos, seguido por 35 ciclos a 94°C, 58°C y 72°C, cada uno de 30 segundos, y un ciclo final de 5 minutos a 72°C. Se llevaron a cabo los RT-PCR para ensayo de infectividad de diversos tobamovirus (figuras 3A-3B) en dos pasos con iniciadores específicos del genoma de CP del siguiente virus: CGMMV (5TCTGACCAGACTACCGAAAA3", SEQ ID NO: 14 y 5?TGGCTTACAATCCGATCAC3', SEQ ID NO: 15); KGMMV (5'GAGAGGATCCATGTTTCTAAGTCAGGTCCT3', SEQ ID NO: 16 y 5'GAGAGAATTCTCACTTTGAGGAAGTAGCGCT3', SEQ ID NO: 17); ZGMMV (5TCTATCGCTTAACGCAGC3', SEQ ID NO: 18 y 5?TGTCTTACTCTACTTCTGG3', SEQ ID NO: 19); y CFMMV (5'CAAGACGAGGTAGACGAAC3', SEQ ID NO: 20 y 5?TGCCTTACTCTACCAGCG3', SEQ ID NO: 21 ). El RT-PCR se llevó a cabo mediante el equipo RT- PCR AmpTaq (Perkin Elmer) en un i-cycler (Bio-Rad) y el paso del ciclo fue de 37°C por 1 hora y 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 40 segundos a una temperatura de fijación de 53°C (KGMMV), 52°C (ZGMMV, CGMMV) o 44°C (CFMMV), 1 minuto a 72°C, y finalmente 72°C por 10 minutos.

Extracción de ADN y análisis de PCR El ADN genómico total se extrajo a partir de hojas jóvenes (3 semanas después de la germinación) mediante el método CTAB (Chen, D. H. y Ronald, P. C. 1999. Plant Mol Biol Repórter 17: 53-57). La solución de ADN (1 ul) se diluyó en 25 ul de una mezcla de reacción para PCR, que contenía iniciadores de conformidad con la secuencia del gen CFMMV 54-kDa (no. de acceso AF321057, SEQ ID NO: 4). Se utilizaron dos series de iniciadores para la detección dei gen de 54-kDa: la primera serie de iniciadores en las posiciones 3824 y 4693 (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13; figuras 4A-4C) y una segunda serie de iniciadores en las posiciones 3785 y 4479 (5'GAAAAAGGAGTTTTTGATCCCGCT3', SEQ ID NO: 22 y 5?CTGATATGCGTCTTCTTATGCCC3', SEQ ID NO: 23; figuras 3A-3B). Las condiciones de PCT fueron: un ciclo de 2 minutos a 94°C y 35 ciclos a 94, 58 y 72°C, cada uno de 30 segundos, y finalmente 5 minutos a 72°C.

EJEMPLO 1 Identificación y caracterización de las líneas resistentes de pepino Después de la transformación mediada por Agrobacterium con la construcción pCAMSV 54-kDa, los transformantes individuales R0 se crecieron hasta madurez y se autocruzaron para obtener semillas R-i. La presencia del gen CFMMV 54-kDa dentro del genoma de la planta se confirmó mediante análisis de PCR para todas las líneas R-i resistentes a canamicina indicadas en el cuadro 1. Después de la selección de la resistencia, ocho de 14 líneas Ri exhibieron una respuesta total a la resistencia (cuadro 1 ). Algunas de las líneas remanentes fueron completamente susceptibles; otras se caracterizaron como parcialmente resistentes. No se hizo ningún intento para evaluar la acumulación de ARN de CFMMV en los cotiledones inoculados. No obstante, no se detectó la acumulación del virus en las hojas superiores de las ocho líneas resistentes a la replicasa, como se muestra en la mayoría de las líneas mediante ELISA y en los ensayos de re-inoculación. De manera similar, la respuesta a la resistencia permaneció inalterada cuando las plantas se crecieron a mayores temperaturas (30-35°C).

CUADRO 1 Selección para resistencia a CFMMV en líneas transqénicas R1 de pepino que contenían el gen de 54-kDa a Cada línea numerada representa la progenie de plantas transgénicas R0 individuales. "Han" es el cultivar parental no-transformado. b los vastagos Ri resistentes a canamicina se evaluaron para resistencia a CFMMV mediante la inoculación mecánica con virus purificado a 1 mg/ml. Se muestra en número de vastagos susceptibles del total inoculados (infectados/inoculados). Las líneas completamente resistentes se indican en negritas. c Los vastagos que no muestran síntomas se ensayaron para acumulación de CFMMV mediante re-inoculación a N. benthamiana. Los síntomas sistémicos (+) o ausencia de síntomas (-) en N. benthamiana se registraron tres semanas post-inoculación. n. t. -No evaluado.

EJEMPLO 2 Caracterización de la resistencia en la línea homociqota 144 Se llevaron a cabo estudios extensiovos adicionales para caracterizar la resistencia de la línea R44 (cuadro 1 ), la cual muestra la segregación putativa esperada por un solo inserto de NPT! I. Para la consistencia genética, las semillas a partir de diez plantas Ri diferentes de la línea R44 se germinaron en la presencia de canamicina como se describió anteriormente en la presente invención y se identificó una línea homocigota R2 (por lo tanto designada como la línea I44) que no se segrega para el locus transgénico y se utilizó para estudios adicionales. Las plantas I44 exhibieron un fenotipo normal y desarrollo normal del fruto, indistinguible del cultivar original ("lian"). La línea parental ("lian") fue altamente susceptible la inoculación de CFMMV (cuadro 2) y se desarrollaron fuertes síntomas del mosaico 14 días después de la inoculación, con subsecuentes deformaciones de la hoja, debilitamiento de la planta, y frutos anormales con frutos amarillos (figuras 5A-5D). En contraste, las plantas I44 fueron completamente resistentes a la inoculación mecánica con extracto vegetal (cuadro 2, figuras 5A-5D) y ARN purificado (datos no mostrados). La inoculación mediada por suelo de CFMMV en el invernadero es un factor activador para el inicio de las epidemias virales (Antignus, no publicado). Por lo tanto, se examinó la respuesta de los vastagos 144 plantados en suelo deliberadamente infestado con inoculo de CFMMV. Además, la línea 144 también se probó mediante un método de inoculación más agresivo, es decir, injerto en la parte superior de un rizoma susceptible a la infección (cv. "lian"). Las plantas 144 permanecieron sin síntomas, y no se detectó acumulación del virus ya sea mediante ELISA o mediante re-ínoculación a los hospederos susceptible (N. benthamiana y pepino), sin importar el método de inoculación utilizado (cuadro 2).

CUADRO 2 Respuesta de la línea 144 a la inoculación mecánica, en suelo e injerto con CFMMV a La inoculación del injerto se llevó a cabo mediante el injerto de vastagos I44 o "lian" en la parte superior del rizoma infectado "Han". b Las relaciones de infectividad en plantas 144 y no transformadas "Han" se evaluaron 4 semanas post inoculación como el número de plantas sintomáticas del número total de plantas inoculadas. c La re-inoculación se llevó a cabo mediante inoculación mecánica de N. benthamiana con sap extraído a partir de plantas inoculadas 4 semanas post inoculación, n. t = no evaluado EJEMPLO 3 Caracterización molecular de la línea 144 resistente La presencia de la secuencia de ácidos nucleicos virales en el genoma de la línea 144 se identificó mediante PCR (figura 4C) y Southern blot (datos no mostrados). La transcripción de la secuencia codificante de 54-kDa se detectó mediante RT-PCR en plantas 144 inoculadas y no inoculadas (figura 4A). Por el contrario, La reacción de PCR con la preparación de ARN total a partir de plantas 144 fue negativo (figura 4C), indicando que la banda que se amplificó mediante RT- PCR que se muestra en la figura 4A no se debe a residuos de ADN contaminante en la preparación de ARN. Se llevó a cabo un ensayo de RT-PCR para evaluar si la ausencia de síntomas en la línea 144 inoculada con CFMMV se debía a la falta de acumulación del virus. No se observó ninguna banda amplificada con iniciadores específicos para la proteína de cubierta de CFMMV (CP) en la línea 144, en contraste con la presencia de una banda positiva a CP en plantas "lian" inoculadas (figura 4B).

Estos resultados confirman la observación de que no se pudieron detectar trazas de la acumulación del virus en plantas 144.

EJEMPLO 4 Selección para resistencia en contra de otros tobamovirus Se ha mostrado previamente que la resistencia mediada por replicasa exhibe una alta especificidad de secuencia. Por lo tanto, se examinó la respuesta de la línea 144 en contra de ia infección con diversos tobamovirus que infectan a las cucurbitáceas. La línea 144 y el cultivar "lian" no transformado se inocularon con tres tobamovirus adicionales: KGMMV, ZGMMV y CGMMV. El cv.'?an" no transformado mostró síntomas con KGMMV y ZGMMV iniciando a los 8 días post inoculación (dpi), y 2 días después con CFMMV y CGMMV (cuadro 3). Se observó un retraso signifícativo de la aparición de los síntomas en la línea 144: los síntomas fueron visibles solamente a los 14 dpi con CGMMV y ZGMMV, y a los 20 dpi con KGMMV. Además, se observó una marcada atenuación de los síntomas en las plantas I44 infectadas con CGMMV a lo largo de todo el experimento (30 dpi), en contraste con los diversos síntomas exhibidos por las plantas no transformadas (cuadro 3). La respuesta de la línea I44 a las infecciones por tobamovirus se confirmó mediante SDS-PAGE para la detección de viriones purificados, y mediante RT-PCR para el ARN viral (figuras 3A-3B). La acumulación de viriones ZGMMV, CGMMV y KGMMV se detectó claramente tanto en plantas 144 como en plantas control "Han"; no obstante, los viriones CFMMV se detectaron solamente en estas últimas plantas (figura 3A). Además, aunque el ARN viral de CGMMV, KGMMV y ZGMMV se detectó mediante RT-PCR en plantas I44, así como en las plantas control no transformadas, el ARN de CFMMV solamente se encontró en las plantas control "Han" (figura 3B).

CUADRO 3 Respuesta de las plantas 144 a la infección con diversos tobamovirus de cucurbitáceas a Las plantas de pepino se inocularon en la etapa de cotiledón, y se evaluó la severidad de los síntomas (extensión del mosaico y debilitamiento) de 1+ a 5+ por un periodo de 30 días post inoculación (dpi). (-) Sin síntomas. Los datos se resumen para dos experimentos inependientes con 10 plantas para cada tratamiento.

EJEMPLO 5 Transcripción de la secuencia transformada de ácido nucleico en plantas inoculadas con el virus La especificidad y la resistencia remarcable exhibida por la línea 144 a la infección de CFMMV pueden indicar la prevalencia de un mecanismo de resistencia mediado por ARN, posiblemente asociado con el silenciamiento de ARN. Para evaluar esta hipótesis, el ARN total fue extraído a partir de la línea 144 y a partir de las plantas "lian", antes y después de la inoculación con CFMMV. Las muestras con una cantidad equivalente del ARN total se analizaron mediante hibridación tipo Northern blot con una sonda marcada de 54-kDa. La sonda hibridó con ARN genómico de CFMMV (banda superior), el ARN 11 putativo subgenómico que contenía el 54-kDa, y con los transcritos del transgén 54-kDa. Como se esperaba, el transcrito en las plantas I44 fue más corto que el ARN 11 subgenómico detectado en ias plantas control infectadas (figura 6). Los transcritos de 54-kDa se observaron solamente en las plantas de la línea I44, y el nivel de acumulación del transcrito no se afectó sustancialmente por la inoculación previa de las plantas I44 con CFMMV o ZYMV (figura 6). Se ha mostrado que la resistencia viral mediada por silenciamiento se puede suprimir mediante la inoculación con potivirus antes de la prueba de las plantas con el virus (Savenkov, E.l. y Vaikonen, J. P. 2002. J Gen Virol 83: 2325- 2335), o mediante el cambio de las condiciones de temperatura (Szittya et ai., 2003. EMBO J 22: 633- 640). Las plantas de la línea 144 se evaluaron para resistencia a CFMMV, después de la pre-inoculación con uno de los siguientes potivirus: ZYMV, virus del mosaico en flequillo de la calabacita (ZFMV) y virus del color amarillo de la vena del pepino (CVYV, género Ipomovirus; familia Potyviridae), o con el virus del mosaico del pepino (CMV) (cuadro 4). Las plantas 144 mostraron síntomas típicos de potivirus individuales o CMV, pero permanecieron resistentes a CFMMV en las infecciones secuenciales, como se confirmó mediante ELISA y re-inoculación a Datura stramonium. Además, la resistencia de la línea 144 a la infección por CFMMV no se afectó por el crecimiento de ias plantas inoculadas en las cámaras de crecimiento a diferentes temperaturas (20, 28 o 35°C).

CUADRO 4 Resistencia de 144 a la infección por CFMMV después de la inoculación con otros virus EJEMPLO 6 Protección de vastagos susceptibles por un rizoma 144 Las partículas del Tobamovirus sobreviven por largos periodos en el suelo, y la infección por CFMMV a través de las raíces en suelos infestados es un fenómeno común. Puesto que la línea 144 mostró resistencia a la inoculación en suelo con CFMMV (cuadro 2), los inventores ensayaron la posibilidad de que esta línea sirve como un rizoma protector para vastagos no transformados. Las plantas control lian se injertaron sobre la línea 144 o sobre rizomas Han y se plantaron en suelo infestado con CFMMV. La mayoría de las plantas (12/16) injertadas sobre los rizomas no transformados Han mostraron síntomas claros de CFMMV, y probaron ser positivas mediante ELISA. No obstante, ninguno de los vastagos (0/16) injertados obre I44 se volvieron infectados a lo largo de la duración del experimento (5 semanas), como se evaluó mediante síntomas visuales, las pruebas de ELISA y la re-inoculación a N. benthamiana. En experimentos paralelos, los vastagos "Han" injertados obre el rizoma 144 fueron susceptibles a la inoculación mecánica directa con CFMMV.

EJEMPLO 7 Protección de vastagos susceptibles mediante rizoma de N. benthamiana resistente Los discos de hojas de N. benthamiana se transformaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía la contrucción pCddCP-ZY, como se describió anteriormente en la presente invención. Después de la selección en medio para regeneración, los transformantes putativos individuales se identificaron mediante expresión en GUS. Los transformantes confirmados se auto-cruzaron para producir la generación R-i. Las progenies a partir de plantas individuales transformadas se seleccionaron para segregación de la construcción de ADN, como sigue: las semillas Ri se esterilizaron en la superficie y se germinaron en la presencia de 250 mg/l de canamicina. Las semillas transgénicas (que contenían el gen NPT II) mostraron desarrollo normal de la raíz, mientras que las plantas descendientes no transgénicas se detectaron fácilmente de conformidad con sus raíces atrofiadas y no ramificadas. Se registro la relación de resistente/susceptible a canamicinaratio, y los vastagos transgénicos se utilizaron en experimentos de inoculación. Los vastagos Ri del tabaco que expresan GUS resistentes a canamicina se inocularon mecánicamente con sap diluido a una relación 1 :5, a partir de plantas de tabaco co-infectadas con ZYMV y un tobamovirus tentativamente identificado como virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV), que sirve como auxiliar para obtener la extensión sistémica de ZYMV. Para la mayoría de las progenies transgénicas, se seleccionaron inicialmente más de 10 vastagos mediante inoculación. Los vastagos inoculados se mantuvieron por varias semanas bajo condiciones de invernadero. La respuesta a la inoculación se determinó mediante ELISA con un antísuero a la proteína de cubierta ZYMV preparado a una dilución de 1 :2,000.

Las líneas transgénicas seleccionadas se utilizaron como rizoma en los experimentos subsecuentes de injerto. Los vastagos del tabaco de tres-semanas-de edad se injertaron en la parte superior mediante la elaboración de un corte diagonal en ei talio del rizoma y se instaló un vastago se cortó similarmente de manera diagonal. La unión del vastago/rizoma se aseguró en su lugar con sujetadores pequeños de plástico. Durante la primera semana las plantas injertadas se mantuvieron con alto contenido de humedad. La inoculación mecánica de los vastagos se llevó a cabo de 3 a 4 semanas postinjerto con sap diluido a una relación 1 :5, a partir de plantas de tabaco co-infectadas con ZYMV y un tobamovirus como se describió anteriormente en la presente invención. Las plantas injertadas inoculadas se mantuvieron por varias semanas bajo condiciones de invernadero. La respuesta a la inoculación se determinó mediante ELISA con un antisuero específico a ZYMV- CP preparado a una dilución de 1 :2,000. En algunos experimentos, la presencia de ZYMV en los vastagos inoculados se determinó mediante reinoculación de plantas de calabaza susceptibles. Los resultados se resumen en el cuadro 5 a continuación.

CUADRO 5 Resistencia a ZYMV impartida a un vastago mediante rizoma transgénico Los controles de tabaco no injertados o vastagos injertados sobre rizomas no transgénicos exhibieron una alta relación de infección de 89% y 70%, respectivamente. La respuesta de los vastagos injertados sobre líneas transgénicas se puede dividir en 2 grupos: aquellos injertados sobre líneas de rizoma Z89, Z99 o Z102 fueron completamente protegidos en contra de la infección sistémica por ZYMV; a partir de aquellos injertados sobre líneas de rizoma Z97, Z100 o Z101 pocos exhibieron síntomas de la enfermedad. En pocos rizomas protegidos, la ausencia de ZYMV en vastagos inoculados se confirmó mediante re-inoculación de plantas de calabaza. La descripción precedente de las modalidades específicas revelará así la naturaleza general de la invención, mediante la aplicación del conocimiento actual, modificando fácilmente y/o adaptando diversas aplicaciones de dicgas modalidades específicas sin llevar a cabo experimentación y sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deben y se consideran comprendidas dentro del significado e intervalo de equivalentes de las modalidades descritas. Se debe entender que la fraseología o terminología empleadas en la presente invención es para el propósito de descripción y no de limitación. Los significados, materiales, y pasos para llevar a cabo las diversas enstructuras químicas descritas y funciones pueden tomar una variedad de formas alternativas sin apartarse de la invención.

Claims (67)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una planta que comprende un rizoma transgénico resistente a una enfermedad viral diferente por medio de la expresión de una proteína anti-viral y un vastago susceptible a la enfermedad viral, en donde la planta injertada es resistente a dicha enfermedad viral.

2.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el rizoma transgénico resistente a una enfermedad viral comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con al menos un segmento del genoma viral.

3.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el rizoma transgénico resistente a una enfermedad viral que comprende una construcción de ADN se diseña para generar ARNsi direccionados a al menos un segmento del genoma viral.

4.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque ei al menos un segmento del genoma viral codifica una proteína viral o partes de la misma.

5.- La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracíerizada además porque la proteína viral se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína de revestimiento viral, una proteína para replícación viral, una proteína para movimiento viral o partes de la misma.

6.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la proteína viral es una proteína para replicación viral o parte de la misma.

7.- La planta de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el rizoma transgénico es resistente a una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo.

8.- La planta de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque está protegida a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en ei suelo seleccionado a partir dei grupo que consiste de virus transmitidos por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus de! mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo; virus transmitido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus del mosaico dei tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus dei mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar.

9.- La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el al menos un segmento del genoma viral codifica una proteína putativa de 54 kDa es un fragmento de la proteína de replicación de virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino (CFMMV).

10.- La planta de conformidad con la . reivindicación 9, caracterizada además porque el al menos un segmento del genoma viral que codifica una proteína putativa de 54 kDa tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

11.- La planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque está protegida a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo del género tobamovirus.

12.- La planta de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque se protege a partir de una enfermedad ocasionada por CFMMV.

13.- La planta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque es de la familia Cucurbitaceae.

14.- La planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es una planta de pepino.

15.- La planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la construcción de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos una molécula de ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble media la escisión del al menos un segmento del genoma viral.

16.- La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la construcción de ADN comprende: a. al menos un promotor que se expresa en planta operativamente asociado a; b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco del genoma viral y una segunda secuencia nucleotídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y opcionalmente o una señal para término de la transcripción.

17.- La planta de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la primera y la segunda secuencias nucleotídicas están separadas por una secuencia espaciadora.

18.- La planta de conformidad con la reivindicación 17, caracferizada además porque la secuencia espaciadora comprende una secuencia de un intrón.

19.- La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la secuencia espaciadora comprende un intrón del gen de la catalasa de la semilla de ricino, que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

20.- La planta de conformidad con la reivindicación 19, caracíerizada además porque la consírucción de ADN comprende la primera y la segunda secuencias nucleotídicas operativamente asociadas con el mismo promotor.

21.- La planta de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque es resistente a un virus seleccionado a partir del grupo que consiste de un virus con origen en el suelo y un virus transmitido por un vector que afecía la parte aérea de la planta.

22.- La planta de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el virus con origen en el suelo se selecciona a partir del grupo que consiste de virus transmitidos por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite dei tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla dei pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la patata, virus de la necrosis en tira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus del mosaico amarillo del trigo; virus transmitido vía herida de la raíz: género Tobamovírus: virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, Virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de ia lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar.

23.- La planta de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el virus transmitido por un vector que afecta las partes aéreas de la planta es de una familia seleccionada a partir del grupo que consiste de Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartitiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae; Tobamovirus, Tobravirus, Potexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Vitivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tymovirus, Idaeovirus, Ourmivírus, Umbravirus.

24.- La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el al menos un segmento del genoma viral comprende el extremo 3' del genoma del Virus del Mosaico de la Calabaza Amarilla (ZYMV).

25.- La planta de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el al menos un segmento del genoma viral comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 2.

26.- La planta de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la primera secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 y fragmentos de la misma.

27.- La planta de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con el complemento de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 2 y fragmentos de la misma.

28.- La planta de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque es resistente a una enfermedad ocasionada por un virus a partir de la familia Potyviridae.

29.- La planta de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque es resistente a ZYMV.

30.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente al menos una secuencia control de la expresión, seleccionada a partir del grupo que consiste de un promotor, un potenciador, un factor de transcripción, una señal de procesamiento, y una secuencia de terminación.

31.- La planta de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el promotor es un promotor constitutivo.

32.- La planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente un marcador de selección.

33.- La planta de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el marcador de selección se selecciona a partir de una secuencia polinucleotídica que codifica un producto que confiere resistencia ai antibiótico y un gen reportero que codifica un producto detectable.

34.- La planta de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la señal de término de la transcripción es el terminador NOS.

35.- Un método para ia producción de una planta resistente a una enfermedad viral que comprende: a. proveer un rizoma transgénico resistente a la enfermedad viral diferente por medio de la expresión de una proteína anti-viral; b. proveer un vastago susceptible a dicha enfermedad viral; y c. injertar el vastago sobre el rizoma; para obtener una planta injertada resistente a dicha enfermedad viral.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el rizoma se transforma con una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de ideníidad con al menos un segmenío del genoma viral para producir un rizoma íransgénico resisfente a la enfermedad viral.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el rizoma se íransforma con una construcción de ADN diseñada para generar ARNsi direccionados a al menos un segmento del genoma viral.

38.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el al menos un segmento del genoma viral codifica una proteína viral o partes de ia misma.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la proteína viral se selecciona a partir del grupo que consisíe de una proíeína de revesíimienío viral, una proíeína para replicación viral, una proíeína para movimiento viral o partes de la misma.

40.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 39, caracíerizado además porque la proíeína viral es una proíeína para replicación viral o parte de la misma.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el rizoma íransgénico es resisíeníe a una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la planta se protege a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo seleccionado a partir del grupo que consiste de virus transmiíidos por nemáíodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomaí , y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento temprano del chícharo, virus en cascabel del tabaco y virus de la lesión anular del pimiento; virus transmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrólica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satéliíe del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la palala, virus de la necrosis en íira del arroz, virus del mosaico del írigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del írigo y virus del mosaico amarillo del írigo; virus transmitido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimiento, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del tabaco; y virus transmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorótica de la caña de azúcar.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el rizoma transgénico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proíeína puíaíiva de 54 kDa que es un fragmenío de la proíeína de replicación de virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino (CFMMV).

44.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 43, caracíerizado además porque el rizoma íransgéníco comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proíeína puíaíiva de 54 kDa que íiene la secuencia esíablecida en SEQ ID NO: 1.

45.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 44, caraclerizado además porque la plañía se proíege a partir de una enfermedad ocasionada por un virus con origen en el suelo del género tobamovirus.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la planta se protege a partir de una enfermedad ocasionada por CFMMV.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la planta es de la familia Cucurbiíaceae.

48.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 47, caracíerizado además porque la plañía es una plañía de pepino.

49.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 37, caracíerizado además porque la consírucción de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos una molécula de ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble media la escisión del al menos un segmento del genoma viral.

50.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 49, caracíerizado además porque la construcción de ADN comprende: a. al menos un promotor que se expresa en planta operalivameníe asociado a; b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de ARN que forma al menos un ARN de cadena doble, en donde la molécula de ARN de cadena doble comprende una primera secuencia nucleoíídica de al menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica sentido del segmento blanco del genoma viral y una segunda secuencia nucieotídica de ai menos 20 nucleótidos contiguos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de ia secuencia nucleotídica sentido de dicho segmento blanco de dicho genoma viral; y opcionalmente c. una señal para íérmino de la transcripción.

51.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque la primera y la segunda secuencias nucleotídicas están separadas por una secuencia espaciadora.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque la secuencia espaciadora comprende una secuencia de un infrón.

53.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 52, caracíerizado además porque la secuencia espaciadora comprende un inírón del gen de la cafalasa de la semilla de ricino, que fiene la secuencia esíablecida en SEQ ID NO: 3.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque la construcción de ADN comprende la primera y la segunda secuencias nucleotídicas operativameníe asociadas con el mismo promotor.

55.- El método de conformidad con ia reivindicación 54, caracterizado además porque la planta es resistenfe a un virus seleccionado a partir del grupo que consisíe de un virus con origen en el suelo y un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la plañía.

56.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque el virus con origen en el suelo se selecciona a partir del grupo que consisíe de virus fransmiíidos por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del íomaíe, y virus de la lesión anular del íabaco; Tobravirus: virus del oscurecimienío íemprano del chícharo, virus en cascabel del labaco y virus de la lesión anular del pimienlo;virus íransmiíido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en saíéliíe del íabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimienío, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agolpamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la palaía, virus de la necrosis en lira del arroz, virus del mosaico del írigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del trigo y virus dei mosaico amarillo del trigo; virus transmiíido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del tomate, tobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruto del pepino, virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odontogiossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimienío, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del fabaco; y virus íransmilido por una ruía desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchiíamienío necróíico de frijol, virus del mosaico en rósela del durazno y virus de la línea cloróíica de la caña de azúcar.

57.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el virus transmitido por un vector que afecta las partes aéreas de la plañía es de una familia seleccionada a partir del grupo que consiste de: Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartitiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae; Tobamovirus, Tobravirus, Potexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Vitivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tymovirus, Idaeovirus, Ourmivirus, Umbravirus.

58.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el al menos un segmento del genoma viral comprende el extremo 3' del genoma de Virus del Mosaico de la Calabaza Amarilla (ZYMV).

59.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el al menos un segmento del genoma viral comprende la secuencia de ácido nucleico esíablecida en SEQ ID NO: 2.

60.- El méíodo de conformidad con la reivindicación 50, caracíerizado además porque la primera secuencia nucieoíídica comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia nucleotídica esíablecida en SEQ ID NO: 2 y fragmentos de la misma.

61.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque la segunda secuencia nucleotídica comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90% de ideníidad con el complemento de la secuencia nucleoíídica esíablecida en SEQ ID NO: 2 y fragmeníos de la misma.

62.- El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracferizado además porque la plañía es resisíeníe a una enfermedad ocasionada por un virus a partir de la familia Poíyviridae.

63.- El mélodo de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque la planta es resistente a ZYMV.

64.- Una planta injertada producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-63.

65.- La planta de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada además porque es resistente a un virus seleccionado a partir del grupo que consiste de un virus con origen en el suelo y un virus transmitido por un vector que afecta la parte aérea de la planta.

66.- La planta de conformidad con ia reivindicación 65, caracterizada además porque es resistente a un virus con origen en el suelo seleccionado a partir del grupo que consiste de virus transmitidos por nemátodo: Nepovirus: virus de mosaico de Arabis, virus de la hoja en abanico de la vid, virus del anillo negro del tomate, virus de la lesión anular de la frambuesa, virus de la lesión anular del tomate, y virus de la lesión anular del tabaco; Tobravirus: virus del oscurecimiento íemprano del chícharo, virus en cascabel del labaco y virus de la lesión anular de! pimienío; virus íransmitido por hongos: virus de la lesión foliar del pepino, virus de la necrosis del pepino, virus de la lesión necrótica del melón, virus del mosaico necrótico del trébol rojo, virus de la necrosis de la calabaza, virus de la necrosis en satélite del tabaco, virus de la vena grande de la lechuga, virus de la vena amarilla del pimiento, virus necrótico de la vena amarilla de la remolacha, virus con origen en el suelo de la remolacha, virus de la tira dorada de la avena, virus del agrupamiento del cacahuate, virus de la cubierta superior de la paíaía, virus de la necrosis en íira del arroz, virus del mosaico del trigo con origen en el suelo, virus del mosaico moderado de la cebada, virus del mosaico amarillo de la cebada, virus del mosaico de la avena, virus de la necrosis en mosaico del arroz, virus del mosaico de la línea en huso del írigo y virus del mosaico amarillo del írigo; virus íransmiíido vía herida de la raíz: género Tobamovirus: virus del mosaico del íabaco, virus del mosaico del tomate, lobamovirus del mosaico verde jaspeado del pepino, virus del mosaico jaspeado del fruío del pepino, virus del mosaico verde jaspeado del Kyuri, virus de la lesión anular de Odoníoglossum, virus del jaspeado leve de la paprika, virus del jaspeado leve del pimienío, virus del mosaico del césped duro y virus del mosaico moderado verde del íabaco; y virus íransmitido por una ruta desconocida: virus de la lesión anular amarilla del berro, Virus del marchitamiento necrótico de frijol, virus del mosaico en roseta del durazno y virus de la línea clorólica de la caña de azúcar.

67.- La plañía de conformidad con la reivindicación 65, caracíerizada además porque es resisíeníe a un virus transmiíido por un veclor que afecía las partes aéreas de la planta de una familia seleccionada a partir del grupo que consiste de: Caulimoviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Reoviridae, Tartiíiviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Sequiviridae, Clostroviridae y Luteoviridae; Tobamovirus, Tobravirus, Poíexvirus, Cariavirus, Allexivirus, Capillovirus, Foveavirus, Trichovirus, Viíivirus, Furovirus, Pecluvirus, Pomovirus, Benyvirus, Hordeivirus, Sobemovirus, Marafivirus, Tymovirus, Idaeovírus, Ourmivirus, Umbravirus.