DE60023006T2

DE60023006T2 - Neues verfahren zur herstellung und auswahl von transgenen flachspflanzen und leinsamen

Info

Publication number: DE60023006T2
Application number: DE60023006T
Authority: DE
Inventors: Ernst Heinz; Jodi Scheffler; Hjördis VOSS
Original assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Current assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: ATE305718T1; ES2250173T3; EP1196024A1; WO2001005221A1; DE60023006D1; AU6696700A; CA2375940A1; AU778695B2; DK1196024T3; EP1196024B1; US20030074686A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Selektion von transgenen Pflanzenzellen und transgenem Gewebe sowie transgenen Pflanzen der Gattung Linum. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzenzellen, transgenes Gewebe und transgene Pflanzen, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten wurden, und deren Verwendung in der Pflanzenzellkultur und Gewebekultur und Pflanzenzüchtung.
Die Pflanzenfamilie Linaceae umfasst Pflanzen wie Leinsamen oder Flachs (Linum usitatissimum), eine der ältesten kultivierten Pflanzen. Die Bastfasern des Stammes werden verwendet, um Flachs herzustellen, und der Samen wird zur Herstellung von Leinöl verwendet. Das Öl aus Flachssamen ist beispielsweise reich an Linolensäure und wird bei der Herstellung von Farbprodukten und zur Herstellung von Linoleum verwendet. Trotz der umfangreichen Arbeit, was die Vorschriften zur Transformation von Flachs anbelangt, blieben alle Versuche unbefriedigend, transformierte Flachspflanzen durch Kultivierung von Hypokotylsegmenten mit Agrobacterium und Züchtung der Hypokotylsegmente auf Schalen, die optimierte Hormonkombinationen enthalten, und fakultativ auf Medien herzustellen, die ein Antibiotikum zur Erstselektion von mutmaßlichen Transformanten enthalten.
Bei allen Vorschriften mit Ausnahme von Bretagne-Sagnard et al. (Transgenic Research 5 (1996), 131–137) wurde das npt II-Gen als selektierbarer Marker verwendet, und das Antibiotikum war Kanamycin. Bei Bretagne-Sagnard war das Selektionsmarkerresistenzgen aad, wobei Spectinomycin als selektierbarer Marker verwendet wurde. Für einige Vorschriften wurden weitere Tests durchgeführt, in dem Bestreben, zu beweisen, dass die ausgewählten Pflanzen nicht Entkommene („escapes") waren, sondern wirklich transformiert waren. Leider waren dies gewöhnlich nur weitere Tests für den selektierbaren Marker unter Verwendung desselben Antibiotikums oder von PCR-Amplifikation. Häufig wurde keine Southern-Blot-Analyse durchgeführt und die Nachkommen wurden nicht produziert oder analysiert. Beim Verfahren von Lawrence et al. (Proc. 6th International Congress SABRAO (1989), 535–538) wurden Kotyledone als Zielgewebe verwendet. McHughen und Jordan (Plant Cells Report 7 (1989), 611–614) bewerteten ebenfalls die Verwendung von Kotyledonen. Sie wurden bisher als weniger effizient bewertet als Hypokotyle als Zielgewebe. Eine andere Variation ist ein von Ling beschriebenes Protoplastenverfahren (Versuche zur Entwicklungsbiologie und somatische Genetik in vitro mit Arten der Gattung Linum. Dissertation des Doktorgrades, in der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel (1997)). Im Vergleich zum Hypkotylverfahren produzierten Protoplasten signifikant weniger transgene Pflanzen, und diejenigen, die produziert wurden, zeigten häufig morphologische Anomalitäten. Zhan et al., Plant Molecular Biology 11 (1988), 551–559, verwendeten Agrobacterium-Rhizogene anstelle von Agrobacterium tumefaciens als Ti-Plasmid-Träger. Es wurden einige transformierte Pflanzen erhalten, aber sie wiesen alle morphologische und/oder physiologische Anomalitäten auf.
Zwei Gruppen berichteten über die Produktion einiger Transformanten. McHughen und Mitarbeiter produzierten die Flachsvarietät Triffid (herbicide resistance, McHughen et al., Canadian J. of Plant Science 77 (1997), 641–643), während Ellis und Mitarbeiter (Ellis et al., Theoretical and Applied Genetics 85 (1992), 46–54) Transposon enthaltende Linien entwickelten und rostresistente Gene einführten. Die Ergebnisse werden jedoch nur für eine Varietät dargestellt, und die Häufigkeit von mutmaßlichen erfolgreichen Transformanten wird nicht angegeben.
Daher schien die Produktion von primären Flachs-Transformanten, falls überhaupt möglich, genotypabhängig sowie zeitraubend zu sein und/oder zuerst zu Pflanzen mit anomaler Morphologie zu führen.
Daher besteht das technische, der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem darin, ein verlässliches und effizientes Verfahren zur Herstellung und Selektion stabiler transformierter Pflanzen der Gattung Linum bereitzustellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird erreicht, indem die in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitgestellt werden.
Demnach betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen der Gattung Linum, umfassend

(a) Einführen eines rekombinanten DNA-Moleküls, das zumindest ein selektierbares Markergen umfasst, das Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum vermittelt, in Pflanzenzellen;
(b) Induzieren von transgenem Kallus aus den Zellen von (a); und
(c) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus dem induzierten Kallus, wobei
(i) nach Kallusinduktion und/oder Kultivieren der Kalli auf einem Medium, das ein erstes Antibiotikum enthält,
(ii) die daraus regenerierten Kalli oder Sprosse werden auf ein Medium übertragen, das ein zweites Antibiotikum enthält, das sich vom ersten Antibiotikum unterscheidet.

Obwohl Verfahren zur Transformation und Regeneration von transgenen Pflanzen der meisten dikotyledonen und monokotyledonen Pflanzen entwickelt wurden, waren Versuche, diese Vorschriften bei Pflanzen der Familie Linaceae, insbesondere Flachs, anzuwenden, bisher nicht erfolgreich. Nach der vorliegenden Erfindung wurde ein neues Verfahren entwickelt, das auf dem überraschenden Befund basiert, dass die Anwendung von zwei verschiedenen Antibiotika zur Selektion von mutmaßlichen Flachs-Transformanten für eine neue und verlässliche Pflanzentransformation, -Regeneration und einen Selektionsprozess verwendet werden kann, der zu transgenen Pflanzen führt, die phänotypisch normal und fertil sind. Im Prinzip kann jedes im Fachgebiet bekannte Grundmedium im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, beispielsweise diejenigen, die bei Murashige und Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473–497 und Gamborg, Exp. Cell Res. 50 (1968), 151–158, beschrieben werden.
Einer der wichtigsten Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, wachsende Kalli oder davon stammende Sprosse sukzessiv von einem Medium, das ein erstes Antibiotikum enthält, auf ein Medium zu übertragen, das ein zweites Antibiotikum enthält, das sich vom ersten unterscheidet. Das erste und zweite Antibiotikum kann durch das/die Genprodukt(e) desselben oder von unterschiedlichen Markergenen entgiftet werden, das/die in dem rekombinanten DNA-Molekül vorliegt/vorliegen, das beim Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeführt werden soll. Es sollte klar sein, dass der kritische Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung Schritt (c) ist. Daher werden auch Verfahren, die von Pflanzenmaterial ausgehen, bei dem Pflanzenzellen bereits mit einem rekombinanten DNA-Molekül wie in Schritt (a) transformiert wurden und die Kallusbildung fakultativ induziert wurde, von der vorliegenden Erfindung umfasst, solange der vorstehend beschriebene und nachstehend erklärte Schritt (c) durchgeführt wird.
Das Verfahren ist geeignet, homologe und heterologe DNA-Sequenzen in die vorstehend erwähnten Pflanzen einzuführen. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt die Untersuchung der Funktion und Interaktion von Genen zu, die in den Pflanzen exprimiert werden. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet und nützlich zur Herstellung von transgenen Pflanzen, transgenem Pflanzengewebe und transgenen Pflanzenzellen, die vorzugsweise verbesserte Eigenschaften bei der Transformation zeigen. Das Transformationsverfahren der vorliegenden Erfindung besitzt mehrere Vorteile. Beispielsweise ist es nicht notwendig, irgendwelche Vorkulturen anzulegen oder die Epidermis von einzelnen Hypokotylsegmenten zu entfernen. Beide Verfahren erfordern mehr Zeit und Anstrengung und nach den Erfahrungen von Mlynarova et al. (Plant Cell Reports 13 (1994), 282–285) ist keines für die Herstellung einer ausreichenden Transformantenanzahl wichtig. Ferner ist es nicht notwendig, die Kallus-Hypokotyle auf neue Selektionsplatten zu übertragen oder den Kallus einer Subkultur auf neuen Selektionsplatten zu unterziehen. Dies wurde in gewisser Form bei allen anderen, im Stand der Technik beschriebenen Verfahren durchgeführt und führte zu einer Verlängerung der Selektionsphase von drei auf sechs Wochen. Nach der Vorschrift der vorliegenden Erfindung können Mehrfachernten auf derselben Platte erfolgen, ausgehend von drei Wochen bis sechs Wochen, nachdem die Hypokotyle zuerst auf die Selektionsplatten gegeben wurden.
Wie weiter nachstehend in der vorliegenden Vorschrift detailliert beschrieben, wurden Sprosse, die aus dem Kallus hervorgingen, vorzugsweise direkt auf Kulturbehälter übertragen, die ein zweites Antibiotikum enthalten, um unter den regenerierten Sprossen zu selektieren. In allen anderen Vorschriften wurde dasselbe Antibiotikum zur Selektion während des gesamten Selektionsvorganges verwendet. In den Beispielen wurde ein Zwei-Schritt-Verfahren mit Kanamycin als erstes Antibiotikum während der Kallusentwicklung und Spross-Initiationsphase verwendet, und dann G-418 als zweites Antibiotikum für die Spross-Selektionsphase.
Zusätzlich können vorläufige Tests für die Fähigkeit von Sprossen verwendet werden, auf Medien zu wurzeln, die G-418 enthalten, und dann auf Kanamycin plus Carbenicillin zu wurzeln. Die Fähigkeit, auf Kanamycin zu wurzeln, wird als manchmal erfolgreicher Indikator beschrieben. Nach der vorliegenden Erfindung wurde sie zu einem verlässlichen Indikator entwickelt.
Nach zwei bis drei Wochen kann der wurzelnde Spross dann in Erde übertragen werden und verwendet werden, um Samen für die nächste Generation zu bilden, so dass die Zeit vom Beginn der Transformationsphase zur Produktion des reifen Samens weiter verkürzt wird.
Schließlich wurde die Fähigkeit eines 2 mm-Segments aus dem Sprossstamm getestet, grünen proliferierenden Kallus zu produzieren. Dies wurde als verlässlicher Indikator der erfolgreichen Transformation bestätigt. Diese grünen Kalli konnten auch schnell mehr Sprosse produzieren, die dann zur Wurzelung gebracht und in Erde übertragen oder verwendet werden konnten, um weitere Tests wie einen ELISA-Test oder einen Southern-Blot-Test durchzuführen.
Der vorstehend beschriebene „Test zur Wurzelbildung" und „grüne Proliferationstest" repräsentieren entweder allein oder in Kombination ebenfalls einen wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Zusammengefasst wurden die transformierten wurzelnden Pflanzen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von drei verschiedenen im Handel erhältlichen Flachsvarietäten erzeugt. Diese Pflanzen können blühen und haben Samen produziert. Die Pflanzen sind morphologisch ähnlich zu ihrer Wildtypkontrollvarietät. Ferner wurden drei verschiedene Gene verwendet, um mehrere verschiedene Promotorgenkombinationen zu erzeugen. Dies zeigt, dass das System auch robust und nicht streng genotypabhängig ist. Angesichts seiner wirtschaftlichen Bedeutung wird Flachs oder Leinsamen vorzugsweise für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Bevorzugte erste und zweite Antibiotika schließen Kanamycin, Paromycin, Neomycin, Gentamycin, G-418, Streptomycin, Spectinomycin und Imidazol ein. Der hier verwendete Begriff „Imidazol" umfasst antibiotische oder Herbizidverbindungen, die Imidazol oder Imidazolinon als reaktive Gruppe enthalten. Es werden vorzugsweise Selektionsmarkergene verwendet, die Neomycinphosphotransferase, Streptomycinphosphotransferase oder Aminoglycosid-3-adenyltransferase codieren, oder Gene sind, die eine Resistenz gegenüber Imidazol verleihen. Nützliche Imidazol-Resistenzgene werden beispielsweise bei Hill (Biochem. J. 335 (1998), 653–661), Mourad (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 178–184), Zhu (Nat. Biotechnol. 18 (2000), 555–558), Burke (Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 169–176) und Doignon (Plasmid 30 (1993), 224–233) beschrieben. Andere geeignete Markergene und entsprechende Agenzien zur Identifikation und/oder Selektion von transformierten Zellen, transformiertem Kallus und transformierten Pflanzen werden im Fachgebiet beschrieben; vgl. De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513–2518; Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987–995 und als Übersichtsartikel Gelvin und Schilperoot, Plant Molecular Biology Manual. Kluver Academic Publishers Dordrecht, Boston, London (1988).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erste Antibiotikum Kanamycin, und das zweite Antibiotikum ist G-418.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Konzentration des ersten Antibiotikums im Bereich von 150 bis 200 mg/l. Die optimale Konzentration hängt von der verwendeten Flachsvarietät ab. Beispielsweise werden bei der Kultivar McGregor vorzugsweise 200 mg/l verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt die Konzentration des zweiten Antibiotikums zwischen 40 und 100 mg/l. Die optimale Menge hängt von der Varietät und der Selektionsphase ab. Beispielsweise werden für den ersten Transfer vom 1. Antibiotikum zum 2. bei der Varietät McGregor vorzugsweise 80 mg/l verwendet.
Wie in den Beispielen im Anhang beschrieben, wird das Hypokotyl von Pflanzen vorzugsweise für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durchgeführt, wobei die Pflanzenzellen z.B. die Hypokotyle von Schritt (a), von Pflanzen stammen, die sich im Wesentlichen in demselben Entwicklungsstadium befinden. Dies kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren erreicht werden, beispielsweise können die Pflanzen von synchronisierten keimenden Samen stammen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das DNA-Molekül durch ein Verfahren eingeführt, umfassend:

(a) Inokulation mit Agrobacterium tumefaciens;
(b) Partikelbombeschuss; oder
(c) Mikroinjektion

Verfahren zur Transformation unter Verwendung biolistischer Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt; vgl. z.B. Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37–48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553–1558 und Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423–431. Die Mikroinjektion kann durchgeführt werden, wie bei Potrykus und Spangenberg (Herausg.), Gene Transfer to Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995), beschrieben.
Geeignete Agrobacterium tumefaciens-Stämme und Vektoren sind dem Fachmann bekannt und werden im Stand der Technik beschrieben (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383–396; C58C1 (pGV 3850kan), Debleare, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467–8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963–976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. In: Plant Molecular Biology Manual Bd. 2, Gelvin und Schilperoort (Herausg.), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publ. (1994), 1–22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Kapitel V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1–46; An, EMBO J. 4 (1985), 277–287).
Verfahren zur Inokulation und Inkubation der Hypokotyle mit Agrobacterium tumefaciens sind im Fachgebiet gut bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren, wobei die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe oder die Pflanze mit Agrobacterium tumefaciens in Gegenwart einer Phenolverbindung, vorzugsweise Acetosyringon, beimpft wird. Das rekombinante DNA-Molekül umfasst, insbesondere wenn vorzugsweise Agrobacterium tumefaciens für die Transformation verwendet wird, einen binären Vektor.
Die Regeneration von transgenen Pflanzen aus transformiertem Pflanzengewebe oder transformierten Zellen erfordert Änderungen der Konzentration und des Verhältnisses von Auxin und Cytokinin, um die Kallus- und Sprossentwicklung zu induzieren. Dies erfolgt vorzugsweise, indem das Gewebe und die Zellen bzw. der Kallus sukzessiv auf feste Medien gegeben werden, die die geeigneten Hormone enthalten. Insbesondere ist die Zugabe von Cytokininen und Auxinen oder Substanzen mit derselben biologischen Funktion erforderlich, um die Zellteilung zu fördern und z.B. Pflanzen aus einer einzelnen Zelle zu erzeugen. Ferner müssen die Konzentrationen der beiden Hormone während der verschieden Stadien der Zellteilung oder Organogenese gegebenenfalls geändert werden und variieren für verschiedene Pflanzenarten und Varietäten (Davies, (Herausg.) Plant Hormones. Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers (1995)). Die Verwendung geeigneter Hormonkonzentrationen und das Verhältnis zueinander bei der Regeneration transformierter Pflanzen kann durch den Fachmann eingestellt werden, wie beispielsweise in den folgenden Ausführungsformen oder in den Beispielen beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung enthält das Medium, das das erste Antibiotikum enthält, mindestens 0,05 mg/l Auxin und mindestens 0,002 mg/l Cytokinin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das Auxin NAA und das Cytokinin TDZ und/oder BAP.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beträgt die Konzentration von Auxin und Cytokinin TDZ (0,002 mg/l) und NAA (0,05 mg/l) oder BAP (2 mg/l) und NAA (0,1 mg/l).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das Medium, das das zweite Antibiotikum enthält, im Wesentlichen frei von Auxinen und/oder Cytokininen.
Die Züchtungsschritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können wie folgt durchgeführt werden.
Die Hypokotyle werden auf einem Medium gezüchtet, das die zuvor erwähnten Hormone und das erste Antibiotikum enthält. Eine Antibiotikakombination, die Carbenicillin und Cefotaxim oder Ticarcillin/Kaliumclavulanat enthalten kann, wird zugegeben, um Agrobacterium zu entfernen. Das Medium wird auch mit Gamborg-B5-Vitaminen ergänzt.
Die Sprosse werden auf einem Medium mit dem zweiten Antibiotikum und derselben Antibiotikakombination gezüchtet, um Agrobacterium zu entfernen. Das Medium wird auch mit denselben Vitaminen ergänzt, jedoch mit der halben Konzentration.
Die Sprosse, die grün bleiben und wachsen, werden auf ein Medium zur Wurzelbildung übertragen, das ausschließlich das Selektionsantibiotikum und manchmal das Auxin IBA (0,1 mg/l) enthält, um das Wurzeln zu fördern.
Mehrfachsprosse von demselben Ursprungsspross werden schnell produziert, indem Blatt- oder Stammsegmente aus dem Ursprungsspross abgeschnitten werden und die Segmente auf ein Medium gegeben werden, das demjenigen ähnelt, das für die Hypokotyle verwendet wird. Segmente von Sprossen, die wirklich transformiert wurden und nicht Entkommene sind, bilden einen Kallus, der anschließend Sprosse bildet. Diese Sprosse werden auf ein Medium zur Wurzelbildung gegeben.
Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Medien umfassen 2 bis 10 g/l Agar, am meisten bevorzugt 6 bis 7 g/l. Die geeignete Menge Agar kann auch vom Hersteller abhängen. Die nach der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigten beispielsweise, dass es vorteilhafter ist, Agar von Duchefa zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Verfahren, wie vorstehend beschrieben und in den Beispielen im Anhang veranschaulicht, ist allgemein für die Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, transgenem Pflanzengewebe und transgenen Pflanzen anwendbar. Die optimalen Bedingungen für das Kalluswachstum und die Pflanzenregeneration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können durch die Änderungen in der Medienzusammensetzung innerhalb der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bewertet werden. Da jede Kultivar oder jede Linie leicht unterschiedlich auf Änderungen der Medienzusammensetzung ansprechen kann, können die Transformation und Regeneration von transgenen Pflanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beschleunigt werden, indem die verschiedenen Linien/Kultivare durch die Vorschrift getestet werden, wie in den Beispielen dargestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Erfindung umfasst das DNA-Molekül, das in die Pflanzen eingeführt werden soll, eine nicht codierende Region eines Gens und/oder eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid, Peptid, eine Antisense-RNA, Sense-RNA, virale RNA oder ein Ribozym codiert. Aufgrund des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich, die Expression eines Entwicklungsgens, regulatorischen Gens und/oder Strukturgens und seines Genprodukts in Pflanzen der Gattung Linum zu untersuchen und spezifisch zu beeinflussen, beispielsweise Proteine, die am Stoffwechsel von Pflanzen beteiligt sind, die entweder von der Pflanzenfamilie oder von irgendeinem anderen Organismus wie Mikroorganismen, Algen, Tieren, Insekten, Viren etc. oder beispielsweise von anderen Pflanzenarten, vorzugsweise von monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanzen stammen, insbesondere von einer Pflanze von Interesse in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder in der Holzwirtschaft wie Feldfrüchte, nämlich diejenigen der Familie Poaceae, anderen stärkeproduzierenden Pflanzen wie Kartoffel, Maniok oder Leguminosenpflanzen, ölproduzierenden Pflanzen wie Raps; Leinsamen etc., Pflanzen, die ein Polypeptid als Speichersubstanzen nutzen wie Sojabohne, Pflanzen, die Saccharose als Speichersubstanzen nutzen, wie Zuckerrübe oder Zuckerrohr, Bäumen, Zierpflanzen, Pflanzen, die von medizinischer Relevanz sind, beispielsweise Pflanzen, die Alkaloide, Flavonoide und dergleichen enthalten.
Einige Beispiele zur (Über-)Expression von homologen oder heterologen Genen und Antisense-Hemmung und Cosuppression, die auf die Manipulation bestimmter Stoffwechselwege in transgenen Pflanzen abzielen, werden bei Herbers (TIBTECH 14 (1996), 198–205) besprochen.
Ribozyme verschiedener Art, die spezifisch die (Prä-)mRNA eines Zielgens spalten können, werden z.B. in EP-B1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und EP-A2 0 360 257 beschrieben. Die Auswahl geeigneter Zielorte und entsprechender Ribozyme kann erfolgen, wie beispielsweise bei Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. Herausg. Academic Press, Inc. (1995), 449–460, beschrieben. Ein Beispiel für Ribozym vermittelte Virusresistenz wird bei Feyter (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329–228) beschrieben. Daher ist es für den Fachmann sofort offensichtlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um transgene Pflanzen der Gattung Linum mit jedem gewünschten Merkmal herzustellen (vgl. als Übersichtsartikel TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312–397), die umfassen (i) Herbizidtoleranz (DE-A-3701623; Stalker, Science 242 (1988), 419), (ii) Insektenresistenz (Vaek, Plant Cell 5 (1987), 159–169), (iii) Virusresistenz (Powell, Science 232 (1986), 738–743; Pappu, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11 (1995), 426–437; Lawson, Phytopathology 86 (1996), 56 Ergänz.), (iv) Ozonresistenz (Van Camp, BioTech. 12 (1994), 165–168), (v) Verbessern der Konservierung von Früchten (Oeller, Science 254 (1991), 437–439), (vi) Verbesserung der Stärkezusammensetzung und/oder Produktion (Stark, Science 242 (1992), 419; Visser, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289–296), (vii) Änderung der Lipidzusammensetzung (Voelker, Science 257 (1992), 72–74), (viii) Herstellung von (Bio)polymeren (Poirer, Science 256 (1992), 520–523), (ix) Änderung der Blütenfarbe, z.B. durch Manipulation des Anthocyanin- und Flavonoidbiosynthese-Weges (Heidmann, Nature 330 (1987), 667–678, WO90/12084), (x) Resistenz gegen Bakterien, Insekten und Pilze (Duering, Molecular Breeding 2 (1996), 297–305; Strittmatter, Bio/Technology 13 (1995), 1085–1089; Estruch, Nature Biotechnology 15 (1997), 137–141), (xi) Änderung der Alkaloid- und/oder Herzglycosidzusammensetzung, (xii) Induzieren von aufrechterhaltener männlicher und/oder weiblicher Sterilität (EP-A1 0 412 006; EP-A1 0 223 399; WO93/25695) und (xiii) höhere Lebensdauer der Infloreszenzen/Blüten, (xiv) chemische Verbindungen von industriellem Interesse wie Modifikation der Faserzusammensetzung (Grima-Pettenati, Somatic cell genetics and molecular genetics of trees (1996), Kluwer, Boston), (xv) Änderung der Wege, um spezifische chemische Verbindungen von industriellem Interesse herzustellen (John, PNAS 93 (1996), 12768), einschließlich derjenigen, die zu spezifischen Organellen geleitet werden können (Rooijen, Biotechnology 13 (1995), 72–77), oder (xvi) Herstellung neuartiger mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAS). Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Insertionsmutagenese unter Verwendung von beispielsweise Gentargeting-Vektoren verwendet werden, die im Fachgebiet bekannt sind. (vgl. z.B. Hayashi, Science 258 (1992), 1350–1353; Fritze und Walden, Gene activation by T-DNA tagging. In Methods in Molecular Biology 44 (Gartland, K.M.A. und Davey, M.R., Herausg.). Totowa: Human Press (1995), 281–294) oder Transposon-Markierung (Chandlee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105–115).
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten DNA-Moleküle können weitere funktionale Elemente enthalten, beispielsweise Sequenzen des "linken Randes" und des "rechten Randes" der T-DNA von Agrobacterium, die eine stabile Integration in das Pflanzengenom zulassen. Ferner sind dem Fachmann Verfahren und Vektoren bekannt, die die Herstellung von markerfreien transgenen Pflanzen erlauben, d.h. das selektierbare oder skalierbare Markergen geht in einem bestimmten Stadium der Pflanzenentwicklung oder Pflanzenzucht verloren. Dies kann beispielsweise durch gemeinsame Transformation (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151–161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91–104) und/oder durch Verwendung von Systemen erreicht werden, die Enzyme nutzen, die die homologe Rekombination in Pflanzen fördern können (vgl. z.B WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353–361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653–657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170–176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373–6378). Verfahren zur Herstellung geeigneter DNA-Moleküle werden z.B. von Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die nicht codierende Region oder die Nucleotidsequenz oder der Komplementärstrang davon, die/der in dem rekombinanten, nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden DNA-Molekül enthalten ist, funktional mit den Transkriptions- und/oder Expressionskontrollsequenzen verbunden. Die regulatorischen Elemente, die die Transkription und Expression in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen sicherstellen, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen gewöhnlich Promotoren, die die Initiation der Transkription und fakultativ poly-A-Signale sicherstellen, die die Transkriptionstermination und die Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können sowohl Transkriptions- als auch Translationsenhancer einschließen. Derartige Elemente, z.B. der 3'-Bereich des Octopin-Synthasegens von Agrobacterien, werden im Stand der Technik beschrieben (vgl. z.B. Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23–29).
Zur Transkription und/oder Expression in Pflanzenzellen werden die nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz oder der Komplementärstrang davon unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen gestellt, die im Hinblick auf die zu exprimierende, nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz sowie im Hinblick auf die zu transformierenden Pflanzenarten heterolog oder homolog sein können. Im Allgemeinen umfassen derartige regulatorische Elemente einen Promotor, der in Pflanzenzellen aktiv ist. Um Expression in allen Geweben einer transgenen Pflanze zu erhalten, werden vorzugsweise konstitutive Promotoren wie der 35 S-Promotor von CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810–812) oder Promotoren des Polyubiquitingens von Mais (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675–689) verwendet. Um eine Expression in spezifischen Geweben einer transgenen Pflanze zu erhalten, ist es möglich, gewebe- und zellspezifische Promotoren zu verwenden (vgl. z.B. Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245–2251). Es sind auch Promotoren bekannt, die in Samen verschiedener Pflanzenarten wie Mais, Vicia, Weizen, Gerste etc. spezifisch aktiv sind. Es wurden auch Mikrosporen-spezifische regulatorische Elemente und ihre Verwendungen beschrieben (WO96/16182). Induzierbare Promotoren können verwendet werden, um die Expression exakt zu kontrollieren. Ein Beispiel für induzierbare Promotoren sind die Promotoren von Genen, die Hitzeschock-Proteine codieren. Ferner kann das chemisch induzierbare Tet-System verwendet werden (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991), 229–237). Weitere geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. bei Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361–366) beschrieben.
Im Falle, dass die Nucleotidsequenz in der Sense-Orientierung exprimiert wird, ist es im Prinzip möglich, die codierende Sequenz so zu modifizieren, dass sich das Polypeptid in jedem gewünschten Kompartiment der Pflanzenzelle befindet. Diese schließen das endoplasmatische Retikulum, die Vakuole, die Mitochondrien, die Plastiden, den Apoplasten, das Cytoplasma etc. ein. Verfahren, wie diese Modifikationen durchgeführt werden, und Signalsequenzen, die die Lokalisierung in einem gewünschten Kompartiment sicherstellen, sind dem Fachmann gut bekannt. Bevorzugte Promotoren sind embryospezifische Promotoren wie der Napin- oder Oleosinpromotor. Diese Ausführungsform ist zur Manipulation des Samens praktisch verwendbar, beispielsweise, um den Ölgehalt der Pflanze zu erhöhen und/oder zu ändern.
Eine entsprechende Strategie ist Folgende. Beispielsweise kann der Schritt im Biosyntheseweg zwischen der Linolsäure (18:2) und Linolensäure (18:3) geändert werden. Normaler Flachs weist ungefähr 58% Linolensäure auf, daher ist bereits bekannt, dass diese Reaktion bevorzugt wird. Unter Verwendung eines zweiten in hohem Ausmaß exprimierten Enzyms sollte es möglich sein, den Linolensäuregehalt um 10% bis 25% zu erhöhen. Das zweite Gen kann von Raps stammen, das die Delta-15-Desaturase codiert. Dieses Gen kann vollständig unter der Kontrolle eines starken samenspezifischen Promotors sein und in Flachs transformiert werden. In Samen sollten die Gene überexprimiert und der Prozentsatz der Linolsäure erhöht werden. Die GC-Analyse von Flachssamen auf den Fettsäuregehalt war erfolgreich, wobei dieselbe für Raps entwickelte Halbkorntechnik verwendet wurde, oder indem die Samen Wasser aufnahmen und das halbe Kotyledon abgeschnitten wurde. Die voll gesogenen Samen ließ man dann auf Filterpapier keimen und sie wurden in Erde übertragen, wo sie sich zu normalen Pflanzen entwickelten. Die Transformationsexperimente wurden unter Verwendung des JH5-Vektors und entweder der Flachsvarietät Flanders oder McGregor durchgeführt. Der Vektor JH5 enthält den Napin-Promotor aus Brassica napus, die Delta-15-Desaturase und den Thioesterase-Terminator.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um die Qualität der Bastfasern in Pflanzen der Familie Linaceae zu modulieren, vorzugsweise zu verbessern. Dies kann beispielsweise durch die Expression von Enzymen erreicht werden, die an der Cellulosebiosynthese oder deren Hemmung beteiligt sind, beispielsweise durch Expression der entsprechenden Antisense-RNAs. Beispiele für derartige Enzyme schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf β-Glucan-β-glucosyltransferase, Saccharosesynthase, Xylanase und andere Enzyme, die an der Biosynthese der Pflanzenzellwand und Polysaccharide beteiligt sind. Ähnliche Ansätze für gentechnisch hergestellte Pflanzen für veränderte Fasern, die an Pflanzen der Familie Linaceae nach der vorliegenden Erfindung angepasst werden können, werden im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise für Baumwollpflanzen in US-A-5,495,070, US-A-5,792,933, US-A-5,869,720. Promotoren, die spezifisch in Bastfaserzellen exprimiert werden, werden vorzugsweise verwendet und sind dem Fachmann bekannt oder können durch gut etablierte Verfahren leicht identifiziert und isoliert werden. Beispielsweise können differentielle Durchmusterungsverfahren oder die Isolierung von cDNAs verwendet werden, die spezifisch in Bastfasern exprimiert werden. Derartige DNAs können dann für die Durchmusterung einer genomischen DNA-Genbank zur Isolierung der regulatorischen Sequenzen verwendet werden, die zur gewebe- und zellspezifischen Expression einer heterologen DNA-Sequenz in Bastfaserzellen fähig sind. Ein entsprechender Ansatz wird beispielsweise bei John, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5769–5773, beschrieben.
Ferner kann man sich vorstellen, dass Pflanzen der Gattung Linum mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gentechnisch modifiziert werden, so dass Pigmente oder Farbstoffe in die Bastfasern interkaliert werden, sozusagen als (Vor)färbung der Bastfasern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das vorstehend beschriebene DNA-Molekül einen weiteren selektierbaren und/oder skalierbaren Marker. Selektionsmarkergene, die für die Selektion von transformierten Pflanzenzellen, transformiertem Kallus, transformierten Pflanzengewebe und transformierten Pflanzen nützlich sind, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen beispielsweise die Resistenz gegen Antimetaboliten als Basis zur Selektion auf dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Reiss, Plant Physol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143–149); npt, das Resistenz gegenüber den Aminoglycosiden Neomycin, Kanamycin und Paromycin verleiht (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1993) 987-995), hygro, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Marsh, Gene 32 (1984), 481–485), aad, das Resistenz gegenüber Spectinomycin verleiht (Svab, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 197–205) und spt, das Resistenz gegenüber Streptomycin verleiht (Maliga, Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 456–459). Es wurden zusätzliche selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das den Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu nutzen; hisD, das den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu nutzen (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); Mannose-6-phosphatisomerase, die den Zellen erlaubt, Mannose zu nutzen (WO 94/20627) und ODC (Ornithindecarboxylase), die Resistenz gegenüber dem Ornithindecarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO, verleiht (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Herausg.) oder Desaminase aus Aspergilius terreus, die Resistenz gegenüber Blasticidin S verleiht (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336–2338).
Nützliche skalierbare Marker sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und im Handel erhältlich. Vorzugsweise ist der Marker ein Gen, das Luciferase (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59–72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), grünes fluoreszierendes Protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44–47) oder β-Glucuronidase codiert (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901–3907).
Wie vorstehend erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Transformation und Regeneration von im Wesentlichen jeder Pflanze der Gattung Linum verwendet werden. Vorzugsweise ist die Pflanze Linum usitatissimum, beispielsweise die im Handel erhältlichen Varietäten McGregor, Flanders oder Ed 45.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere nützlich für die genetische Manipulation von Pflanzenzellen und Pflanzengewebe, um Pflanzen mit modifizierten, vorzugsweise mit verbesserten oder nützlichen Phänotypen zu erhalten.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch transgene Pflanzenzellen und transgenen Kallus, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, und die stabil in das Genom ein DNA-Molekül integriert enthalten, wobei das DNA-Molekül für die transgene Pflanzenzelle fremd ist. Mit „fremd" ist gemeint, dass ein DNA-Molekül entweder im Hinblick auf die Wirtszelle heterolog ist, d.h. von einer Zelle oder einem Organismus mit unterschiedlichem genomischem Hintergrund stammt, oder im Hinblick auf die Wirtszelle homolog ist, sich aber in einer unterschiedlichen genomischen Umgebung als das natürlich auftretende Gegenstück des DNA-Moleküls befindet. Das bedeutet, dass, falls das DNA-Molekül im Hinblick auf die Wirtszelle homolog ist, es sich nicht an seinem natürlichen Ort im Genom der Pflanzenzelle befindet; insbesondere ist es von unterschiedlichen Genen oder anderen genomischen Sequenzen umgeben. In diesem Fall kann das DNA-Molekül, d.h. die darin enthaltene nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz entweder unter der Kontrolle seines eigenen Promotors oder unter der Kontrolle eines heterologen Promotors stehen. Der Begriff „heterolog" im Hinblick auf das DNA-Molekül, d.h. die darin enthaltene nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz, die funktional mit dem Promotor verbunden ist, bedeutet, dass die nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz nicht natürlich mit dem Promotor verbunden ist. Andererseits kann die nicht codierende Region oder Nucleotidsequenz, die in dem DNA-Molekül umfasst ist, das in die Pflanze nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt werden soll, unter die Kontrolle eines endogenen Promotors der Pflanze geraten, beispielsweise aufgrund einer Zufallsinsertion in das Genom der Pflanzenzelle, die ausreichend benachbart zu den Sequenzen liegt, die die Transkription und die fakultative Expression der nicht codierenden Region oder Nucleotidsequenz in der Pflanzenzelle verleihen können. In dieser Hinsicht sollte auch klar sein, dass das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in die Pflanze eingeführte DNA-Molekül verwendet werden kann, um ein mutiertes Gen über homologe Rekombination wiederherzustellen (Paszkowski (Herausg.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)).
Das Vorliegen und die fakultative Expression des DNA-Moleküls, d.h. der darin umfassten nicht codierenden Region oder Nucleotidsequenz, in den transgenen Pflanzenzellen und im transgenen Pflanzengewebe führen vorzugsweise zu physiologischen und phänotypischen Veränderungen in Pflanzen, die derartige Zellen enthalten, vorzugsweise wie vorstehend beschrieben.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch transgene Pflanzen, die transgene Pflanzenzellen und Gewebe umfassen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
In einem noch anderen Aspekt betrifft die Erfindung erntefähige Teile oder Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, oder Pflanzenzellen, Gewebe oder Pflanzen, die davon stammen. Erntefähige Teile können im Prinzip alle nützlichen Teile einer Pflanze sein, beispielsweise Blätter, Stämme, Früchte, Samen, Wurzeln etc. Vermehrungsmaterial schließt beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Sämlinge, Knollen, Wurzelstöcke etc. ein.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Bestandteilen, wie in dem vorstehend beschriebenen Verfahren definiert, zur Herstellung transgener Pflanzen der Gattung Linum. Die erfindungsgemäße Verwendung kann beispielsweise zur Förderung der Kallusinduktion, Organogenese, Sprossinduktion und/oder Wurzelinduktion eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von transgenen Pflanzenzellen, transgenem Pflanzengewebe und transgenen Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, zur Pflanzengewebekultur und/oder Züchtung. Beispielsweise können die Pflanzenzellen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, für Protoplastenfusionsexperimente verwendet werden. Ferner können die transgenen Pflanzenzellen, das transgene Pflanzengewebe und die transgenen Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, für ein Verfahren zur Identifizierung von chemischen und/oder biologischen Verbindungen verwendet werden, beispielsweise indem die transgene Pflanzenzelle, das transgene Gewebe oder die transgene Pflanze, die vorzugsweise aufgrund des Vorliegens eines vorstehend beschriebenen DNA-Moleküls einen skalierbaren und/oder selektierbaren Phänotyp zeigen und in die transgene Pflanzenzelle, das transgene Gewebe oder die transgene Pflanze nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt werden, mit einer (Vielzahl von) Verbindung(en) in Kontakt gebracht werden und indem jene Verbindungen bestimmt werden, die den skalierbaren und/oder selektierbaren Phänotyp der Pflanzenzellen, des Pflanzengewebes oder der Pflanze ändern können. Die chemischen oder biologischen Verbindungen können (Poly)Peptide, Nucleinsäuren, beispielsweise eine cDNA-Expressionsgenbank, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika oder PNAs sein (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879–880; Hupp, Cell 83 (1995), 237–245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193–198). Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von transgenen Pflanzenzellen, transgenem Pflanzengewebe und transgenen Pflanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, zur Erzeugung männlicher und/oder weiblicher Sterilität und zur Änderung oder Modifikation der Pflanze/Krankheitserreger-Interaktion, insbesondere die gentechnische Herstellung von gegen Krankheiten resistenten Pflanzen. Diese Ziele können durch im Fachgebiet bekannte Strategien erreicht werden, vgl. a.a.O. Der Begriff „Krankheitserreger" schließt beispielsweise Bakterien, Viren, Insekten und Pilze sowie Protozoen ein. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Herstellung von Pflanzen mit modifizierter Faserzusammensetzung oder mit spezifischen chemischen oder biologischen Verbindungen produziertem Gewebe spezifisch nützlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die (verbesserte) Herstellung aller Arten transgener Pflanzen der Pflanzenfamilien verwendet werden, die bisher nicht oder wenig zugänglich für die Pflanzentransformation und -Regeneration waren. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf wünschenswerte Weise bei Pflanzen der Gattung Linum, vorzugsweise Flachs, angewendet werden, obwohl andere Pflanzenvarietäten auch von den hier beschriebenen Verfahren und Anwendungen umfasst werden.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt (oben links) eine Platte mit Kallussegmenten aus Hypokotylen, die ohne Agrobacterium inkubiert und ohne Kanamycin regeneriert wurden, (mitte links) eine Platte mit Kallussegmenten aus Hypokotylen, die ohne Agrobacterium inkubiert wurden, aber mit Kanamycin regeneriert wurden, (oben und mitte rechts) sind Kalli aus Hypokotylen, die mit Agrobacterium inkubiert wurden, enthaltend den Vektor JH5, und die mit Kanamycin regeneriert wurden. Das untere Photo zeigt transformierte Sprosse, die 2 Wochen mit 60 mg/l G-418 gezüchtet wurden, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, die mit 40 und 60 mg/l in demselben Zeitraum gezüchtet wurden.
2 zeigt (oben rechts) mutmaßliche Sprosse in Kulturröhrchen, (oben links) wurzelnde Sprosse, die bereit für den Transfer in Erde sind, (unten links und rechts) bestätigte transgene Pflanzen (rosa Markierungen) im Vergleich zur Wildtypkontrolle Flanders (weiße Markierungen). Alle Pflanzen waren phänotypisch ähnlich zu den Wildtypkontrollpflanzen.
3 zeigt die Struktur des binären, in Beispiel 3 beschriebenen JH5-Vektors.
4 zeigt die Struktur des binären, in Beispiel 4 beschriebenen pPZP111-Vektors.
5 zeigt die Struktur des binären, in Beispiel 5 verwendeten pBI101.2-Vektors.
6 zeigt die Struktur des binären, in Beispiel 6 beschriebenen pHL9000-Vektors.
7 gibt eine schematische Karte der in Beispiel 6 verwendeten Genkassette wieder.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung
Beispiel 1: Bestimmen der geeigneten Selektionsmittel
Tests, die nach der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten, das die Hypokotylsegmente, die für die Inokulation von Agrobacterium tumefaciens verwendet wurden, gegenüber allen getesteten Antibiotika mit Ausnahme von Kanamycin sensitiv waren. Sogar bei niedrigen Konzentrationen wurden die Hypokotyle braun und produzierten keinen Kallus oder keine Sprosse. Andere vorläufige Tests zeigten, dass, obwohl kein Kallus bei Verwendung von G-418 als Selektionsantibiotikum für die Anfangstransformation produziert wurde, die Tests unter Verwendung von regenerierten Sprossen zeigten, dass es von Vorteil war, dass Wildtypflachs keine natürliche Toleranz gegenüber G-418 besaß. Nachfolgende Tests zeigten, das G-418 als Selektionsmittel zum Nachweis transformierter Sprosse in späteren Selektionsrunden verwendet werden könnte (Tabelle 1). Vorzugsweise erfolgt das Testen der beiden Antibiotikasysteme in den Transformationsexperimenten unter Verwendung von Kanamycin für die Erstselektion und G-418 für die zweite und dritte Selektionsrunde (1).
Tabelle 1 Fähigkeit transgener Sprosse und ihrer Wildtyp-Gegenstücke, auf Medium mit variierenden G-418- Konzentration zu überleben

a. Für jede Kombination der Varietät (Flanders, McGregor oder Ed 45) und G-418-Konzentration wurden vier Sprosse einer Wildtypkontrolle und vier Sprosse aus einer Transformante in einen sterilen Behälter gegeben, der in zwei Hälften geteilt wurde.
b. 301, 324 und 288 sind alle mit dem in 3 beschriebenen JH5-Vektor transformiert.
c. Anzahl der Sprosse, die 24 Tage auf einem Medium mit G-418 überleben.

Beispiel 2: Allgemeines Leinsamen/Flachs-Transformationssystem
Samen der gewünschten Flachsvarietät sterilisieren, beispielsweise die Flachsvarietät Flanders
Sterilisation

50 min Ethanol
25 min 9% Hypochlorid
4 × mit bidestilliertem H₂O spülen
1 × 5 min in bidestilliertem H₂O
2 × 15 min in bidestilliertem H₂O

Die sterilisierten Samen auf ein steriles Medium in Kulturbehältern aussähen, die bedeckt sind, so dass Licht nur von oben in den Behälter gelangt. 1 Liter Saat-Medium

MS-Medium 4,4 g

Myoinosit 400 mg

MES 500 mg

Saccharose 5 g

Agar 7,8 g

pH-Wert 6,2 und autoklavieren

Unter niedriger Lichtstärke von etwa 500 Lux 6 bis 7 Tage keimen lassen, um etiolierte Hypokotyle zu erhalten. Einen Tag vor Beginn der gemeinsamen Züchtung mit Agrobacterium eine Übernachtkultur ansetzen, die mit der gewünschten Agrobacterium-Plasmidkombination beimpft wird. YEP-Medium mit der richtigen Antibiotikakombination sollte verwendet werden. Beispielsweise für den binären PRE1-Vektor Spectinomycin 100 mg/l, Streptomycin 200 mg/l und Rifampicin 80 mg/l verwenden. Am nächsten Tag die OD₆₀₀ messen, dann die Kultur zentrifugieren und den Überstand entfernen. Das Agrobacterium-Pellet in Waschmedium resuspendieren. 1 Liter Waschmedium

MS-Medium 4,4 g

Myoinosit 400 mg

MES 500 mg

pH-Wert 5,8 und autoklavieren

Unter sterilen Bedingungen die Hypokotyle in 0,5 cm Segmente schneiden. Hypokotylegmente in die Agrobacterium-Lösung geben und zwei Stunden inkubieren. Die Hypokotylsegmente auf gemeinsame Kultivierungspetrischalen 94 × 16 mm (50 pro Schale) geben und 4 Tage inkubieren. Die Hypokotylsegmente in einer Antibiotikalösung waschen, um Agrobacterium abzutöten. Beispielsweise Waschmedium verwenden, das 400 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l Cefothaxim enthält. Die Segmente viermal und jedes Mal 15 Minuten waschen. Die gewaschenen Hypokotylsegmente in Petrischalen 145 × 20 mm (50 pro Schale) überführen, die eine optimierte Hormonkombination, ein Antibiotikum zur Selektion transformierter Zellen und Antibiotika zur Hemmung und Abtötung von jeglichem verbleibenden Agrobacterium enthalten. Beispielsweise: Selektionsmedium

MS-Gamborg-Medium 4,4 g

Myoinosit 400 mg

MES 500 mg

Saccharose 20 g

Agar 7,8 g

pH-Wert 5,8 und autoklavieren, nach dem Autoklavieren zugeben
BAP 1 mg/l
NAA 0,075 mg/l
Carbenicillin 400 mg/l
Cefotaxim 200 mg/l
Kanamycin 160 mg/l

Die Selektionsschalen in einen Kulturraum mit etwa 1000 Lux und einer Temperatur von 23°C bis 26°C stellen. Es ist wichtig, die Bedingungen zu regulieren, so dass so gut wie möglich ein übermäßiges Absetzen von Kondensationsflüssigkeit auf dem Deckel der Petrischalen vermieden wird. Die Selektionsschalen 6 Wochen im Kulturraum lassen und während dieses Zeitraums die Sprosse, wie sie erscheinen, abschneiden und übertragen. Sprosse, die aus dem Kallus hervorgehen, werden direkt in Kulturbehälter übertragen, die Spross-Medium enthalten. Spross-Medium

MS-Medium 4,4 g

Myoinosit 400 mg

MES 500 mg

Saccharose 15 g

Agar 7,8 g

pH-Wert 6,2 und autoklavieren, nach dem Autoklavieren 60 mg/l G-418, 400 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l Cefotaxim zugeben.

Bei Sprossen, die das erste Mal auf G-418-Selektion keine Wurzeln produzieren, sondern vollkommen grün bleiben und wachsen, wird die Spitze abgeschnitten und sie werden in einen zweiten Kulturbehälter mit G-418 übertragen. Sprosse, die Wurzeln unter G-418-Selektion produzieren, werden abgeschnitten, und die Spitze wird in ein Röhrchen überführt, das 50 mg/l Kanamycin und 400 mg/l Carbenicillin enthält. Zwei 2-mm Stammsegmente werden auf eine Selektionsschale übertragen (dieselbe; die zuvor verwendet wurde) und auf grüne Kallusbildung und anschließende Sprossbildung getestet. Sprosse, die positiv für diese drei Tests getestet werden, können unmittelbar eingepflanzt werden. Es können auch schnell mehr Sprosse vom Kallustestgewebe erhalten und innerhalb von ein paar Wochen ebenfalls eingepflanzt oder zur weiteren Analyse mittels Southern-Blots verwendet werden (Sambrook, Molec. Cloning a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) NPT II ELISA allay (5 Prime – 3 Prime Inc., Boulder Colorado USA).
Unter den richtigen Wachstumsbedingungen blühen die Pflanzen innerhalb von 4 bis 6 Wochen, abhängig von der Varietät. Die Samen sind innerhalb von 8 bis 10 Wochen vollständig reif. Falls die Samen nicht vollkommen reif sein müssen, können sie keimen und ohne Probleme nach 6 Wochen und mit Spezialbehandlung häufig früher wachsen.
Beispiel 3: Experiment unter Verwendung der Flachs-Varietät Flanders und des binären Vektors JH5
Der in diesem Beispiel verwendete binäre Vektor JH5 ist in 3 dargestellt und wurde wie folgt konstruiert:
Die cDNA, die eine Delta-15-Desaturase codiert, wurde ursprünglich aus Brassica napus von Arondel (Science 258 (1992), 1353–1355) isoliert und vom Arabidopsis Biological Resource Center (1060 Carmack Road, Columbus, Ohio USA) erhalten. Das Plasmid wurde als pBNDES3 identifziert. Ein XbaI/SalI-Fragment wurde aus pBNDES3 herausgeschnitten und in pTE200, gespalten mit BamHI und Xhol, cloniert. pTE200 ist ein pBluescript-Derivat (Martini, BioEngineering fuer Rapssorten nach Mass (1999), Vortraege fuer Pflanzenzuechtung Heft 45, S. 133–154; Liddy Halm, Goettingen, Deutschland), das die Promotor- und Terminatorbereiche einer Acyl-ACP-Thioesterase enthält, die als FatB4 bezeichnet wird. PTE200 wurde dann mit BspI20I und SmaI gespalten, und ein 2200 bp NotI/HindIII-Fragment des Napin-Promotors (Scofield J., Biol. Chem. 262 (1987), 12202–12208) wurde eingebaut. Das sich ergebende Plasmid wurde JH3 genannt.
Das Fragment, das den Napin-Promotor, die delta-15-cDNA und den FatB4-Terminator enthält, wurde herausgeschnitten, indem mit BspI20I und NotI gespalten wurde, und in die ApaI-Schnittstelle des binären Vektors pRE1 (Martini, BioEngineering fuer Rapssorten nach Mass (1999) Vortraege fuer Pflanzenzuechtung Heft 45, S. 133–154; Liddy Halm, Goettingen, Deutschland) cloniert. Der sich ergebende binäre Vektor wurde als JH5 bezeichnet.
Die regenerierten Pflanzen wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Hypokotylsegmente von 6 Tage alten etiolierten Hypokotylen der Varietät Flanders wurden 1,5 Stunden in einer Agrobacterium-Lösung inkubiert und dann auf einem gemeinsamen Kultivierungsmedium ausplattiert und 4 Tage stehen gelassen. Der JH5-Vektor befand sich in dem Agrobacterium-Stamm C58 (Hood, J. Bacteriol. 168 (1986), 1291–1301). Die Negativkontrolle bestand aus Hypokotylsegmenten, die in Waschmedium ohne Agrobacterium inkubiert wurden. Nach 4 Tagen wurden die Hypokotylsegmente auf Selektionsplatten übertragen und 6 Wochen stehen gelassen. Die ersten Sprosse wurden von den Selektionsplatten 3 Wochen später entnommen und die letzten nach 6 Wochen. Alle Sprosse wurden in sterile Behälter mit Medium, enthaltend G-418, überführt. Jene Sprosse, die Wurzeln oder grünen Kallus am Stammende bildeten, wurden in Röhrchen überführt. Kallustests und Tests zur Wurzelbildung sowie ein NPT II-ELISA-Test wurden durchgeführt. Sprosse mit Wurzeln wurden in Erde übertragen und man ließ sie Samen produzieren (Tabelle 2). Es wurden insgesamt 1200 Hypokotylsegmente mit Agrobacterium beimpft und 26 mutmaßliche Transformanten überlebten die Selektion auf G-418. Nach anschließenden Tests erwiesen sich 21 der ursprünglich 26 als transformiert (Tabelle 2).
Tabelle 2: Sprosse, die nach der Selektion unter Verwendung von Kanamycin gefolgt von G-418 überleben
Beispiel 4: Experiment unter Verwendung der Flachsvarietät Flanders und des binären Vektors pPZPHV5
Der binäre Vektor pPZPHV5 enthält eine cDNA, die eine Kaninchen-Lipoxygenase unter der Kontrolle des LeB4-Promotors und des CaMV35S-Terminators codiert. Die Lipoxygenase aus Kaninchen-Retikulocyten wurde ursprünglich von Schewe et al. (Methods Enzymol. 71 (1981), 430–441) isoliert. Das dabei verwendete Plasmid pRL ist ein Derivat des pBluescript II SK+–Vektors. Die cDNA, die die Lipoxygenase codiert, wurde unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen SmaI und HindIII gespalten, das vorstehende Ende der HindIII-Spaltung wurde mit glatten Enden versehen, und das so erhaltene Fragment wurde in den Vektor pRT103-4214 cloniert (Fiedler, 1996, Hochexpression rekombinanter Antikörperfragmente in transgenen Pflanzen; Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades, in der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg), der den LeB4-Promotor und den CaMV35S-Terminator trägt, wobei der Vektor unter Verwendung von Smal geschnitten wurde. Aus dem sich ergebenden Vektor pRTHV5 wurde die gesamte Genkassette unter Verwendung von HindIII herausgeschnitten und in den binären Vektor pPZP111 ligiert (4; Hajdukiewicz et al., Plant. Mol. Biol. 25 (1994), 989–994). Dieses Konstrukt wurde als pPZPHV5 bezeichnet.
Regenerierte Pflanzen wurden hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Abgesehen von den Kallus- und Wurzeltests wurden die Pflanzen auch mittels PCR getestet, um ihre Transgenität nachzuweisen.
Tabelle 3 Sprosse aus einem Transformationsereignis, die nach der Selektion unter Verwendung von Kanamycin gefolgt von G-418 überlegen
Beispiel 5: Experiment unter Verwendung der Flachsvarietät Flanders und des binären Vektors pJH7
Der in diesem Beispiel verwendete binäre Vektor pJH7 wurde durch Clonieren des KCS-Promotors des Gens, das die β-Ketoacyl-CoA-Synthase aus Brassica napus codiert, in den binären Vektor pBI 101.2 (5) stromaufwärts des GUS-Gens hergestellt (Han, 1999, β-Ketoacyl-CoA-Synthase aus Brassica napus L.: Functional Characterization and Promoter Analysis; Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades am Fachbereich Biologie der Universität Hamburg). Der Clonierungsschritt erfolgte unter Verwendung der beiden Restriktionsschnittstellen SmaI und HindIII. Das sich ergebende Produkt wird als pJH7 bezeichnet.
Regenerierte Pflanzen wurden hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Abgesehen von den Kallus- und Wurzeltests wurden die Pflanzen auch mittels PCR getestet, um ihre Transgenität nachzuweisen.
Tabelle 4 Sprosse von einen Transformationsereignis, die nach der Selektion unter Verwendung von Kanamycin gefolgt von G-418 überlegen
Beispiel 6: Experiment unter Verwendung der Flachsvarietät Flanders und des binären Vektors pHLHVO
Der binäre Vektor pHLHVO ist ein Derivat des binären Vektors pHL9000 (6; Martini, BioEngineering für Rapssorten nach Maß (1999), Vorträge für Pflanzenzüchtung Heft 45, 155–171, Liddy Halm, Göttingen), in den die in 7 dargestellte Genkassette cloniert wurde. Die Genkassette wurde über PCR unter Verwendung zweier spezifischer Primer und dem Vektor pBI121-LBLOX (Hause et al., Planta 210 (2000), 708–714) als Matrize amplifiziert. Die Sequenz der Primeroligonucleotide lautet:
Spe35: 5' act agt aga gga cct aac aga ac 3' (SEQ2 ID NO: 1); und
NoXho: 5' ctc gag cga tct agt aac ata gat gac 3' (SEQ ID NO: 2).
Am 5'-Ende besitzt der Primer Spe35 eine Spel-Schnittstelle und der Primer NoXho eine XhoI-Schnittstelle (beide durch fettgedruckte Buchstaben gekennzeichnet). Unter Verwendung dieser beiden Restriktionsschnittstellen wurde die Genkassette in pHL9000 cloniert, das mit SpeI und SalI geschnitten wurde. Das sich ergebende Produkt wurde als pHLHVO bezeichnet.
Regenerierte Pflanzen wurden hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Abgesehen von den Kallus- und Wurzeltests wurden die Pflanzen auch mittels PCR getestet, um ihre Transgenität nachzuweisen.
Tabelle 5 Sprosse von einem Transformationsereignis, die nach der Selektion mit Kanamycin gefolgt von G-418 überleben
Legende für Tabellen 2 bis 5

Trfm Nr. bezeichnet, aus welchem Experiment die Transformante stammte.
Pflanzen ID ist eine einzigartige Nummer, die jeder mutmaßlichen, produzierten Transformante gegeben wurde.
G-418 Selekt. Schema beschreibt, wie oft der Spross auf G-418 gezüchtet wurde, bevor er in ein Röhrchen überführt und weiter getestet wurde.
Wurzel oder grüner Kallus gibt an, ob der Spross eine Wurzel oder nur grünen Kallus bei Züchtung auf G-418 bildete.
Kallus-Test zeigt, ob kleine Stammabschnitte, die von Spross entnommen wurden, wachsen und grünen Kallus produzieren konnten. pos zeigt an, dass der Test positiv war und neg zeigt an, dass der Test negativ war.
Wurzeltest testet die Fähigkeit des Sprosses, Wurzeln bei Züchtung auf Kanamycin zu bilden.
NPT II-Test zeigt die Ergebnisse eines NPT II-ELISA-Tests, der unter Verwendung des Kits von 5 Prime – 3 Prime Inc. (Boulder Colorado USA) durchgeführt wurde. PCR-Test zeigt, ob eine Pflanze das npt II-Gen aufgrund des Vorliegens eines spezifischen PCR-Produkts enthält.
Transfer in Erde zeigt, welche Transformanten Sprosse hatten, die in die Erde übertragen wurden.
Samen produziert zeigt, welche der Sprosse, die in die Erde übertragen wurden, Samen produzieren.
Kontrollen WT1 und WT2 sind die Varietät Flanders, die regeneriert wurden, aber nicht mit Agrobacterium transformiert wurden. 288 (Ed45), 301 (Flanders), 324 und 326 (McGregor) sind Transformanten, die in früheren Experimenten erhalten wurden und früher durch Southern-Blot-Analyse bestätigt wurden, dass sie transgen sind.

Alle für dieses Verfahren verwendeten Reagenzien und Behälter können von der Firma Duchefa (Haarlem, Niederlande, E-Mail DUCHEFA@WXS.NL) bezogen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen der Familie Linaceae umfassend (a) Einführen eines rekombinanten DNA-Moleküls, das zumindest ein selektierbares Markergen umfasst, das Resistenz gegen mindestens zwei Antibiotika vermittelt, in Pflanzenzellen; (b) Induzieren von transgenem Kallus aus den Zellen von (a); und (c) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus dem induzierten Kallus, wobei (i) nach Kallusinduktion und/oder Kultivieren der Kalli auf einem Medium, das ein erstes Antibiotikum enthält, (ii) die Kalli oder Sprosse, die daraus regeneriert wurden, auf ein Medium transferiert werden, das ein zweites Antibiotikum enthält, das sich von dem ersten Antibiotikum unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze Linum usitatissimum ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pflanze Flachs oder Leinsamen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest eines der ersten und zweiten Antibiotika aus der Gruppe bestehend aus Kanamycin, Paromycin, Neomycin, Gentamycin, G-418, Streptomycin und Spectinomycin ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das selektierbare Markergen Neomycinphosphotransferase, Streptomycinphosphotransferase oder Aminoglycosid-3-adenyltransferase codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das erste Antibiotikum Kanamycin und das zweite Antibiotikum G-418 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Konzentration des ersten Antibiotikum im Bereich von 150 bis 200 mg/l liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Konzentration des zweiten Antibiotikum 40 bis 100 mg/l beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanzenzellen im Hypocotyl der Pflanzen enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Pflanzen von synchronisierten keimenden Samen stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das rekombinante DNA-Molekül durch ein Verfahren eingeführt wird, umfassend: (a) Inokulieren mit Agrobacterium tumefaciens; (b) Partikelbombardierung; oder (c) Microinjektion.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Inokulation mit Agrobacterium tumefaciens in Anwesenheit von Acetosyringon erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das rekombinante DNA-Molekül einen binären Vektor umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Medium, das das erste Antibiotikum enthält, mindestens 0,05 mg/l Auxin und mindestens 0,002 mg/l Cytokinin enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Auxin NAA ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Cytokinin TDZ und/oder BAP ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Konzentration von Auxin und Cytokinin TDZ (0,002 mg/l) und NAA (0,05 mg/l) oder BAP (2 mg/l) und NAA (0,1 mg/l) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Medium, das das zweite Antibiotikum enthält, im wesentlichen frei ist von Auxinen und/oder Cytokininen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das rekombinante DNA-Molekül zusätzlich eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid, Peptid, eine antisense-RNA, sense-RNA, virale RNA oder ein Ribozym codiert.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Nucleotidsequenz mit Transkriptions- und/oder Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das rekombinante DNA-Molekül zumindest ein weiteres selektierbares und/oder quantifizierbares Markergen umfasst.
Transgene Pflanzenzellen, Gewebe oder eine Pflanze erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 oder Pflanzenzellen, Gewebe oder eine Pflanze, die davon abgeleitet ist, umfassend zumindest ein rekombinantes DNA-Molekül, das mindestens zwei selektierbare Markergene umfasst, die Resistenz gegen mindestens zwei Antibiotika vermitteln.
Erntebare Teile oder Vermehrungsmaterial einer Pflanze gemäß Anspruch 22 umfassend Pflanzenzellen gemäß Anspruch 22.
Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 definiert, Agrobacterium tumefaciens, Antibiotika oder von Hormonen für das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.
Verwendung von Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen nach Anspruch 22 zur Pflanzenzüchtung, für ein Verfahren zur Identifizierung von chemischen und/oder biologischen Verbindungen, zur Herstellung von männlich und/oder weiblich sterilen Pflanzen, krankheitsresistenten Pflanzen oder Pflanzen, die spezifische chemische oder biologische Verbindungen gewebsspezifisch herstellen.