DE3701623A1 - In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung - Google Patents

In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung

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Description

In Pflanzen wirksames Resistenzgen gegen Phosphinothricin und seine Verwendung (Zusatz zur Patentanmeldung P 36 28 747.4 und zur Zusatzmeldung P 36 42 829.9)
Die Hauptanmeldung P 36 28 747.4 betrifft ein Resistenzgen gegen Phosphinothricin (PTC), erhältlich aus der Gesamt-DNA von auf Phosphinothricyl-alanyl-alanin (PTT)-Resistenz selektiertem Streptomyces viridochromogenes DSM 40736 durch Schneiden mit BamHI, Klonieren eines 4,0 kb großen Fragments und Selektion auf PTT-Resistenz, sowie die Verwendung dieses Gens zur Herstellung PTC-resistenter Pflanzen, als PTT-Resistenz-Marker in Bakterien und als PTC-Resistenz-Marker in Pflanzenzellen. Das Resistenzgen ist durch eine Restriktionskarte (Fig. 1) charakterisiert, die das 4 kb große BamHI-Fragment näher definiert.
Durch Klonieren von Teilbereichen dieses 4 kb-Fragmentes wurde die Lage des Codierbereichs näher eingegrenzt. Hierbei zeigte sich, daß das Resistenzgen auf dem 1,6 kb SstII-SstI-Fragment (Positionen 0,55 bis 2,15 in Fig. 1 der Hauptanmeldung) liegt. Durch Verdauung mit BglII wird ein 0,8 kb großes Fragment gewonnen, das nach Einbau in ein Plasmid und Transformation von S. lividans PTT-Resistenz vermittelt. Diese Resistenz ist durch die N-Acetylierung von PTC bedingt. Das Resistenzgen codiert somit für eine Acetyltransferase.
In der Zusatzanmeldung P 36 42 829.9 ist die DNA-Sequenz des vorstehend genannten 0,8 kb-Fragments wiedergegeben. Aus der Sequenz läßt sich der offene Leseraster der Gensequenz bestimmen. Obwohl das Ende des Gens nicht auf dem 0,8 kb-Fragment liegt, wird die Resistenz vermittelt.
In der ersten Zusatzanmeldung ist als Start des Resistenzgens die Position 258 angegeben (Startcodon GTG), das günstig zu einer Streptomyceten-typischen "Shine- Dalgarno"-Sequenz liegt. Da dieses Gen aber auch in E. coli PTT-Resistenz ergibt, wird in diesen Zellen vermutlich von dem weiter "stromabwärts" im gleichen Leserahmen liegenden ATG-Startcodon (Position 309-311) Gebrauch gemacht.
Gene aus Streptomyceten besitzen mit einem Verhältnis Adenin (A) + Thymin (T) : Guanin (G) + Cytosin (C) von ca. 30% : 70% einen sehr hohen Anteil an G + C. Der GC-Anteil von Pflanzengenen liegt mit ca. 50% weitaus niedriger. Aus diesem Grunde wurde in weiterer Ausgestaltung des Erfindungsgedankens die DNA-Sequenz (Anhang) des Resistenzgens durch Neusynthese auf einen für die pflanzliche RNAPolymerase II günstigen Codongebrauch optimiert.
Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Weitere Ausgestaltungen werden im folgenden erläutert.
Der genetische Code ist bekanntlich entartet, d. h. daß nur für 2 Aminosäuren ein einziges Triplett codiert, während den restlichen 18 genetisch codierbaren Aminosäuren 2 bis 6 Tripletts zugeordnet sind. Für die Synthese des Gens steht somit theoretisch eine große Vielfalt von Codonkombinationen zur Auswahl. Da der genannte relative Anteil der einzelnen Nukleotide an der Gesamt-DNA-Sequenz von Einfluß ist, wurde er als eines der Kriterien bei der Sequenzoptimierung zugrunde gelegt.
Folgende Änderungen an dem sequenzierten Gen wurden durchgeführt:
  • 1. Innerhalb des Gens wurden die Streptomycetengencodons so verändert, daß in Pflanzengenen geeignete Codons daraus resultierten (G/C-Verhältnis).
  • 2. Zur Beendigung des Translationsvorgangs wurde an das Ende der Sequenz ein TGA-Stopcodon gesetzt.
  • 3. Anfang und Ende der Gensequenz wurden mit überhängenden Enden von Restriktionsstellen versehen, um das Gen amplifizieren und zwischen pflanzliche Regulationssequenzen ligieren zu können.
  • 4. Palindromische Sequenzen wurden auf ein Mindestmaß reduziert.
Die DNA-Sequenz I ist im Anhang wiedergegeben.
Drei interne singuläre Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XbaI (Position 101), BamHI (261) und XmaI (385) ermöglichen die Subklonierung von Teilsequenzen, die in gut untersuchte Klonierungsvektoren, wie etwa pUC18 oder pUC19, eingebaut werden können. Zusätzlich wurden innerhalb des Gens eine Reihe von weiteren singulären Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme eingebaut, die einerseits einen Zugang zu Teilsequenzen der Acetyltransferase schaffen und andererseits die Durchführung von Variationen erlauben:
RestriktionsenzymSchnitt nach Nucleotid-Nr.
(codierender Strang) SacII 13 EcoRV 23 HpaI 29 AatII 48 BstXI 88 ApaI181 ScaI221 AvrII257 AflII285 StuI334 BssHII398 FokI436 BglI485 BglII499
Der Aufbau der Teilsequenzen durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktion erfolgt in an sich bekannter Weise (EP-A 01 33 282, 01 36 472, 01 55 590, 01 61 504, 01 63 249, 01 71 024, 01 73 149 oder 01 77 827). Details wie Restriktionsanalysen, Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation von Plasmiden in E. coli sind ausführlich im Lehrbuch von Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Habour, 1982) beschrieben.
Die so klonierte Gensequenz wird dann unter der Kontrolle pflanzlicher Regulationssignale in Pflanzen eingeführt und zur Expression gebracht. Die EP-A 01 22 791 gibt eine Übersicht über bekannte Methoden.
Die Durchführung soll im folgenden am Beispiel der Regulationssignale des 35S-Transkripts aus Cauliflower Mosaic Virus beschrieben werden. Diese Regulationssignale werden vom pflanzlichen Transkriptionsapparat erkannt. Das an den Enden mit SalI-Schnittstellen versehene optimierte Resistenzgen wird in die Polylinkersequenz des Plasmids pDH51 (Pietrzak et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5857) zwischen Promotor und Terminator ligiert.
Die gesamte Transkriptionseinheit aus Promotor, optimiertem Resistenzgen und Terminator wird mit dem Restriktionsenzym HindIII ausgeschnitten und in den intermediären E. coli- Vektor pMPK110 ligiert (Peter Eckes, Dissertation, Univ. Köln, 1985, S. 91 f). Dieser intermediäre Vektor ist nötig, um das Resistenzgen mit seinen Regulationssequenzen in das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens zu überführen. Diese sogenannte Konjugation wird nach dem von Van Haute et al. EMBO J. 2 (1983) 411 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wird das Gen mit seinen Regulationssignalen durch homologe Rekombination über die im pMPK110-Vektor und im Ti-Plasmid pGV3850Km (Jones et al., EMBO J. 4 (1985) 2411) enthaltenen Sequenzen des Vektors pBR322 in das Ti-Plasmid integriert. Auf dem Ti-Plasmid pGV3850Km ist nun neben dem schon vorher vorhandenen, in Pflanzen wirksamen Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin auch das Resistenzgen gegen PTC lokalisiert. Beide Resistenzgene werden mittels der sogenannten "leaf disc" Transformationsmethode in Tabakpflanzen übertragen (Horsch et al., Science 227 (1985) 1229).
Transformierte Sprosse werden aufgrund der mitübertragenen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin selektioniert. Die Sprosse werden zu vollständigen Pflanzen regeneriert. Durch DNA-Analyse ("Southern Blotting") und RNA-Analyse ("Northern Blotting") der transformierten Pflanzen kann das Vorhandensein und die Expression des PTC-Resistenzgens nachgewiesen werden. Zur Überprüfung der Funktionalität des Resistenzgens werden Blattfragmente transformierter und nicht-transformierter Pflanzen auf M + S Nährmedien (Murashige T. u. Skoog F., Physiologia Plantarum 15 (1962) 473) mit 1 · 10-4 M/PTC überführt. Die Fragmente nicht-transformierter Pflanzen sterben ab, während aus den Fragmenten der transformierten Pflanzen neue Sprosse regeneriert werden können. Die transformierten Pflanzen werden aus dem Sterillabor in Feldbedingungen überführt und zeigen dort beim Besprühen mit 1,5 kg/ha PTC keine durch das Herbizid bedingte Wirkung.
In den folgenden Beispielen werden einige Ausgestaltungen der Erfindung im einzelnen erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiele 1. Chemische Synthese eines einzelsträngigen Oligonukleotids
Als Ausgang für die des Fragments II, Synthese eines der vier Teilfragmente I-IV, diente das endständige Oligonukleotid IIc (Nukleotide Nr. 168 bis 261 des codierenden Stranges der DNA-Sequenz I). Für die Festphasensynthese wird das am 3′-Ende stehende Nukleosid, im vorliegenden Fall also Guanosin (Nukleotid Nr. 261), über die 3′-Hydroxyfunktion kovalent an einen Träger gebunden verwendet. Trägermaterial ist mit langkettigen Aminoalkylresten funktionalisiertes CPG ("Controlled Pore Glass"). Im übrigen folgt die Synthese den (aus den auf Seite 4, Zeile 1-2 genannten EP-A) bekannten Methoden.
Der Syntheseplan ist in die DNA-Sequenz II (Anhang) eingezeichnet, die im übrigen der DNA-Sequenz I entspricht.
2. Enzymatische Verknüpfung der einzelsträngigen Oligonukleotide zu dem Genfragment II
Zur Phosphorylierung der Oligonukleotide am 5′-Terminus wurde je 1 nmol der Oligonukleotide IIb und IIc mit 5 nmol Adenosintriphosphat und 4 Einheiten T4- Polynukleotid-Kinase in 20 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Dithiothreitol (DTT) 30 Minuten bei 37°C behandelt. Das Enzym wird durch fünfminütiges Erhitzen auf 95°C desaktiviert. Die Oligonukleotide IIa und IId, welche im DNA-Fragment II die "überhängende" Sequenz bilden, werden nicht phosphoryliert. Dies verhindert bei der nachfolgenden Ligation die Ausbildung größerer Subfragmente als sie dem DNA-Fragment II entsprechen.
Die Oligonukleotide II (a-d) werden wie folgt zum Subfragment II ligiert: Je 1 mmol der Oligonukleotide IIa und IId sowie der 5′-Phosphate von IIb und IIc werden zusammen in 45 µl Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM Magnesiumchlorid, 25 mM Kaliumchlorid und 10 mM DTT, gelöst. Für das "Annealing" der Oligonukleotide gemäß DNA-Fragment II wird die Lösung der Oligonukleotide 2 Minuten auf 95°C erhitzt und dann langsam (2-3 Stunden) auf 20°C abgekühlt. Zur enzymatischen Verknüpfung setzt man dann 2 µl 0,1 m DTT, 8 µl 2,5 mM Adenosintriphosphat (pH 7) sowie 5 µl T4- DNA-Ligase (2000 Units) zu und inkubiert 16 Stunden bei 22°C.
Die Reinigung des Genfragments II erfolgt durch Gelelektrophorse auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (ohne Harnstoffzusatz, 20 · 40 cm, 1 mm Dicke), wobei als Markersubstanz ⌀X 174 DNA (Fa. BRL), geschnitten mit HinfI, oder pBR322, geschnitten mit HaeIII, diente.
Die Herstellung der Genfragmente I, III und IV erfolgt analog, wobei aber die "überhängenden" Sequenzen vor dem "Annealing" in die 5′-Phosphate übergeführt werden, da kein Ligationsschritt erforderlich ist.
3. Herstellung von Hybridplasmiden, die die Genfragmente I, II, III und IV enthalten. a) Einbau des Genfragmentes I in pUC18
Das handelsübliche Plasmid pUC18 wird in bekannter Weise mit den Restriktionsendonukleasen SalI und XbaI nach den Angaben der Hersteller geöffnet. Der Verdauungsansatz wird auf einem 1%igen Agarosegel durch Elektrophorese in bekannter Weise aufgetrennt und die Bruchstücke durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Plasmidbande (ca. 2,6 kb) wird anschließend aus dem Agarosegel herausgeschnitten und durch Elektroelution von der Agarose abgetrennt.
1 µg Plasmid, mit XbaI und SalI geöffnet, wird dann mit 10 µg des DNA-Fragments I über Nacht bei 16°C ligiert.
b) Einbau des Genfragmentes II in pUC18.
Analog zu a) wird pUC18 mit XbaI und BamHI aufgeschnitten und mit dem Genfragment II, das zuvor wie in Beispiel 2 beschrieben an den überhängenden Enden phosphoryliert wurde, ligiert.
c) Einbau des Genfragmentes III in pUC18
Analog zu a) wird pUC18 mit BamHI und XmaIII aufgeschnitten und mit dem Genfragment III ligiert.
d) Einbau des Genfragmentes IV in pUC18
Analog zu a) wird pUC18 mit XmaIII und SalI geschnitten und mit dem Genfragment IV ligiert.
4. Aufbau des kompletten Gens und Klonierung in einem pUC-Plasmid a) Transformation und Amplifikation der Genfragmente I-IV
Die so erhaltenen Hybridplasmide werden in E. coli transformiert. Hierzu wird der Stamm E. coli K 12 durch Behandlung mit einer 70 mM Calciumchloridlösung kompetent gemacht und mit der Suspension des Hybridplasmids in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 70 mM an Calciumchlorid ist, versetzt. Die transformierten Stämme werden wie üblich unter Ausnutzung der durch das Plasmid vermittelten Antibiotikaresistenzen bzw. -empfindlichkeiten selektriniert und die Hybridvektoren amplifiziert. Nach Abtöten der Zellen werden die Hybridplasmide isoliert, mit den ursprünglich eingesetzten Restriktionsenzymen aufgeschnitten und die Genfragmente I, II, III und IV durch Gelelektrophorese isoliert.
b) Verknüpfung der Genfragmente I, II, III und IV zum Gesamtgen
Die durch Amplifikation erhaltenen Subfragmente I und II werden wie folgt verknüpft. Je 100 ng der isolierten Fragmente I und II werden zusammen in 10 µl Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM Magnesiumchlorid und 10 mM DTT, gelöst und diese Lösung wird 5 Minuten auf 57°C erhitzt. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, gibt man 1 µl 10 mM Adensosintriphosphat (pH 7) sowie 1 Ül T4-DNA-Ligase (400 Units) zu und inkubiert 16 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Nachscheiden mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI wird das gewünschte 261 bp-Fragment (Nukleotide 1-261, SalI- BamHI) durch Gelelektrophorese auf einem 8%igen Polyacrylamidgel gereinigt, wobei als Markersubstanz ⌀X 174 RF DNA (Fa. BRL), geschnitten mit dem Restriktionsenzym HaeIII, dient.
In gleicher Weise werden die Genfragmente III und IV miteinander verknüpft, wobei man nach der Reinigung ein 246 bp-Fragment (Nukleotide 262-507, BamHI-SalI) erhält. Als Marker bei der Gelelektrophorese wird pBR322, geschnitten mit dem Restriktionsenzym MspI, verwendet.
Zum Aufbau des Gesamtgens (DNA-Sequenz I) werden je 15 ng des 261 bp-Fragmentes des 246bp- Fragmentes mit 1 µg des handelsüblichen Plasmids pUC18, das zuvor mit dem Restriktionsenzym SalI aufgeschnitten und an den Enden enzymatisch dephosphoryliert wurde, wie oben beschrieben ligiert. Nach der Transformation und Amplikation (wie in Beispiel 4a) beschrieben wird durch SalI- Verdauung der richtige Klon mit dem 507 bp-Fragment gemäß der DNA-Sequenz I identifiziert.
5. Transformation der Hybridplasmide
Komponente E. coli-Zellen werden mit 0,1 bis 1 µg des Hybridplasmids, das die DNA-Sequenz I enthält, transforiert und auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten plattiert. Anschließend lassen sich Klone, die die korrekt integrierten Sequenzen im Plasmid enthalten, durch DNA-Schnellaufarbeitung identifizieren (Maniatis a.a.O.).

Claims (9)

1. Resistenzgen gemäß Patent (Patentanmeldung P 36 28 747.4) und Zusatzpatent (Patentanmeldung P 36 42 829.9), dadurch gekennzeichnet, daß es an den Codongebrauch in Pflanzen angepaßt ist.
2. Resistenzgen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die DNA-Sequenz I (Anhang, Nukleotidposition 9-503).
3. Genstruktur, gekennzeichnet durch die DNA-Sequenz I (Anhang), gekoppelt an in Pflanzen wirksame Regulations- und Expressionssignale.
4. Vektor, gekennzeichnet durch das Resistenzgen nach Anspruch 1 oder 2.
5. Vektor, gekennzeichnet durch eine Genstruktur nach Anspruch 3.
6. Vektoren, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der Genfragmente I-IV.
7. Wirtszelle, gekennzeichnet durch einen Vektor nach Anspruch 4, 5 oder 6.
8. Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch ein Gen nach Anspruch 1, 2 oder 3.
9. Verwendung des Gens nach Anspruch 1 oder 2 bzw. der Genstruktur nach Anspruch 3 zur Erzeugung von Phosphinothricin-resistenten Pflanzen.
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