DE69920113T2

DE69920113T2 - Escherichia coli Wirt/Vektorsystem basierend auf einer antibiotikafreien Selektion durch Komplementation einer Auxotrophie

Info

Publication number: DE69920113T2
Application number: DE69920113T
Authority: DE
Inventors: Erhard Kopetzki; Christian Schantz
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2019-07-09
Also published as: JP2000050888A; US6291245B1; AU4011599A; CN1241635A; KR20000011710A; ATE276371T1; AU720627B2; CA2274982C; CA2274982A1; ES2227938T3; KR100355963B1; CN1196792C; JP3801389B2; DE69920113D1

Description

Die Erfindung betrifft neue prokaryotische Expressionssysteme, welche eine antibiotikumfreie Selektion ermöglichen, sowie deren Verwendung zur Herstellung von rekombinanten Proteinen.
Bekannte prokaryotische Expressionsplasmide enthalten, zusätzlich zu einem oder mehreren Antibiotikumresistenz-Gen(en), zusätzliche DNA-Sequenzen, die nicht notwendig sind und den Zellmetabolismus belasten. Diese umfassen DNA-Sequenzen, die aus dem Klonierungsprozess resultieren, DNA-Segmente, welche Überreste von Mehrzweckvektoren sind, wie etwa z.B. spezifische Promotoren für die in vitro-Synthese von mRNA und spezifische Phagen-Replikationsursprünge für die Synthese von einzelsträngiger DNA, und erstrecken sich auf rudimentäre duplizierte Vektorsequenzen, welche die Ursache von unerwünschten Plasmid-Umstellungen sein können.
Die Gegenwart eines Plasmids und insbesondere eines Expressionsvektors verursacht eine zusätzliche metabolische Belastung für die Zelle. Dies führt zu einem Selektionsdruck, welcher die Bildung von Zellen ohne Plasmide begünstigt, die durch antibiotische Selektion im Wesentlichen verhindert werden kann.
Antibiotika wie etwa Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin und Chloramphenicol werden allgemein für die Selektion verwendet. Besonders die Verwendung von β-Lactam-Antibiotika, wie etwa Ampicillin, ist für die Herstellung (Fermentierung) von therapeutischen Produkten problematisch.
Aus den oben diskutierten Gründen wird eine antibiotische Plasmid-Selektion mit Hilfe von β-Lactam-Antibiotika in derzeitigen Verfahren nicht verwendet. In einigen Fällen stellte sich das verwendete Wirt/Vektor-System als so stabil heraus, dass es möglich war, eine Plasmidselektion während der Vorkultur und während der Hauptfermentierung wegzulassen (Weir, A.N.C. und Mountain, A., EP 0 651 803 ). Dies geht jedoch im Allgemeinen mit einer reduzierten Produktausbeute einher. In Fällen, in denen die antibiotische Selektion unerlässlich ist, wird Tetracyclin oft als Alternative zu Ampicillin verwendet (Carter, P. et al., 1992). Im Gegensatz zu den β-Lactam-Antibiotika sind die Tetracycline keine reaktiven chemischen Verbindungen und können nicht durch enzymatische Modifikation während der Fermentierung inaktiviert werden. Das Tetracyclin-Resistenzgen codiert für ein Protein, welches die Bakterienmembran modifiziert und somit das Antibiotikum am Eindringen in die Zelle hindert.
Struhl, K. und Mitarbeiter (Struhl, K. et al., 1976) zeigen unter Verwendung von Imidazol-Glycerin-Phosphat-Dehydratase (HIS3) als Beispiel, dass eine geeignete E.coli-Mutante (hisB) direkt mit Hilfe von Plasmiden komplementiert werden kann, welche Hefen-DNA enthalten, und dass das durch HIS3 codierte Hefeenzym in E.coli funktionell exprimiert wird. Diese Fähigkeit von Genen, Mutationen in E.coli zu komplementieren, wurde als Selektionskriterium zum Klonieren von beispielsweise (Komplementierungklonieren) weiteren Hefegenen verwendet (LEU2, URA3, TRP5 und ARG4).
E.coli-Wirtsstämme mit einer stabilen Mutation (Reversionrate > 10^–10; vorzugsweise nicht reversionsfähige Deletionsmutanten) sind für die Sektion durch Komplementierung erforderlich. Die Reversionsrate von bekannten Mutationen liegt jedoch in der Größenordnung von < 10^–10 (Schlegel, H.G., 1981).
Die bekannten E.coli-Laborstämme unterscheiden sich hinsichtlich ihres Genotyps in einzelnen Mutationen, weiche in vielen Fällen durch ungerichtete Mutagenese durch Bestrahlung (Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen), chemische Mutagene (z.B. Basenanaloga, salpetrige Säure und alkylierende Verbindungen) oder biologische Techniken (z.B. Phage Mu und Transposon-Mutagenese (Bachmann, B.J., 1986) erzeugt wurden.
Die Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines stabilen prokaryotischen (vorzugsweise E.coli) Wirt/Vektor-Systems (Expressionssystems), welches eine Plasmidselektion durch Antibiotika vermeidet. Das Selektionsprinzip basiert auf der Komplementierung einer stabilen Auxotrophie der prokaryotischen Wirtszelle durch ein geeignetes Hefegen.
Die Erfindung betrifft einen minimalen prokaryotischen Expressionsvektor, der mit dem Genom prokaryotischer Organismen nicht homolog rekombiniert werden kann, umfassend

a) einen Replikationsursprung,
b) ein eukaryotisches Auxotrophie-Markergen
c) einen Promotor, der in Prokaryoten funktionell aktiv ist, und
d) ein unter der Kontrolle des Promotors zu exprimierendes Fremdgen (Fremdsequenz).

Das eukaryotische Auxotrophie-Markergen kompensiert einen Defekt (Mutation) in einer lebensnotwendigen metabolischen Route des Organismus.
In diesem Zusammenhang befinden sich die Transkription des Auxotrophie-Markergens und die Transkription des zu exprimierenden Fremdgens vorzugsweise in entgegengesetzten Richtungen. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass das Markergen zu dem als Wirtszelle verwendeten prokaryotischen Organismus heterolog ist. Es ist zusätzlich bevorzugt, dass die Expression des Auxotrophie-Markergens in dem in dieser Erfindung beschriebenen Wirt/Vektor-System 1% oder weniger des gesamten Proteins, das in der Wirtszelle exprimiert wird, ausmacht, wenn die Auxotrophie in der Wirtszelle komplementiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Expressionsvektor dadurch gekennzeichnet, dass der Leserahmen des Auxotrophie-Markergens und des zu exprimierenden Gens entgegengesetzt orientiert sind und durch denselben Transkriptionsterminator oder in Serie angeordnete mehrere Transkriptionsterminatoren abgeschlossen werden.
Ein Auxotrophie-Markergen wird als ein solches Gen verstanden, welches unter selektiven Kulturbedingungen das Zellwachstum von auxotrophen Wirtsstämmen ermöglicht. Besonders bevorzugte Markergene sind Hefegene. Wenn E.coli als Wirtsorganismus verwendet wird, sind Mutanten mit einem Defekt in der Biosyntheseroute von Tryptophan, Leucin oder Uracil bevorzugt, welche dann durch das Markergen komplementiert werden können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryotische auxotrophe Wirtszelle, welche einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, wobei diese Wirtszelle eine Mutation (Deletion) in einem Gen aufweist, welche durch das Selektionsmarkergen des Expressionsvektors komplementiert wird, und wobei die Deletion oder Mutation die Wirkung hat, dass kein funktionelles Produkt des Wirtszellgens exprimiert wird. Die Deletion befindet sich vorzugsweise in einem essenziellen chromosomalen Gen, welches dem Auxotrophie-Markergen des Expressionsvektors entspricht. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, umfassend Einbringen eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors in eine prokaryotische auxotrophe Zelle mit einer Deletion in einem Gen, welches dem Auxotrophie-Marker des Expressionvektors entspricht, wobei die Deletion oder Mutation die Wirkung hat, dass kein funktionelles Produkt des Wirtszellgens exprimiert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins durch heterologe Expression eines gewünschten Proteins unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, und Isolieren des Expressionsprodukts aus den Zellen oder dem Überstand, wobei die Fermentierung in einem Minimalmedium oder in einem synthetischen Komplettmedium durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen Expressionssystems, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor in eine prokaryotische Wirtszelle mit einer Mutation in einem chromosomalen Gen, welches durch das Auxotrophie-Markergen des Expressionsvektors komplementiert wird, eingebracht wird, und die chromosomale Mutation die Wirkung hat, dass kein funktionelles Produkt des chromosomalen Wirtszellgens exprimiert werden kann.
In der vorliegenden Erfindung wurde anstelle der herkömmlichen Selektion mit Antibiotika ein neues E.coli-Wirt/Vektor-System entwickelt, welches auf der Komplementierung einer essenziellen chromosomalen E.coli-Auxotrophie (trpC, pyrF) durch die Plasmid-codierte Expression eines geeigneten Hefegens (TRP1, URA3) basiert. Zusätzlich:

i) neue Expressionsvektoren, die hinsichtlich der Größe optimiert wurden (minimiert wurden), wurden unter Verwendung minimaler funktioneller Elemente (Selektionsmarker, Replikationsursprung und Expressionskassette) konstruiert,
ii) nicht reversionsfähige Wirtsstämme wurden durch homologe Rekombination (Deletion) eines gewünschten chromosomalen E.coli-Gens (trpC, pyrF) isoliert, und
iii) die Komponenten des neuen Wirt/Vektors-Systems (Expressionsplasmide und Wirtsstämme) wurden hinsichtlich der Funktion und Leistung auf der Grundlage der Expression eines Vorlagegens (Interferon-α-2b) überprüft.

Hierfür wurden:

i) E.coli-Wirtsstämme mit stabilen Mutationen (Deletionen) der chromosomalen Gene trpC und pyrF und
ii) Vektoren, welche die komplementierenden Hefegene TRP1 (Tschumper, G., 1980) oder URA3 (Rose, M., 1984) enthalten,

Doppelmutanten oder Deletionsmutanten werden vorzugsweise als stabile Wirtsstämme konstruiert.
Die erfindungsgemäßen Minimalvektoren sind vorzugsweise sehr klein (kleiner als 2000 bp) und enthalten nur die absolut essenziellen Elemente eines Expressionsplasmids, d.h. einen Replikationsursprung, ein heterologes Selektionsmarkergen und eine heterologe Expressionskassette, und diese haben die kleinstmögliche Größe, um homologe Rekombination mit dem Genom der prokaryotischen Wirtszelle zu vermeiden. Eine homologe Rekombination im Sinne der Erfindung bedeutet den Austausch von DNA-Sequenzen zwischen dem erfindungsgemäßen Vektor und dem Genom der Wirtszelle. Eine homologe Rekombination kann auftreten, wenn eine beträchtliche Sequenz-Kompatibilität (mindestens 50–1000 bp) zwischen dem Vektor und dem Genom besteht. Weniger Übereinstimmung in der Sequenz (unterhalb von 50 bp) führt nicht in einem nachweisbaren Ausmaß zu homologer Rekombination in der Bedeutung der vorliegenden Erfindung.
Beispiele geeigneter Wirtszellen sind E.coli-TrpC-Mutanten, welche durch eine inaktive N-(5-Phospho-ribosyl)-anthranilat-isomerase (EC 5.3.1.24) gekennzeichnet sind, und pyrF-Mutanten, welche durch eine inaktive Orotidin-5-phosphat-decarboxylase (EC 4.1.1.23) gekennzeichnet sind. Die Mutanten sind nicht in der Lage, Tryptophan oder Uracil zu synthetisieren und können daher nicht auf Nährmedien wachsen, welche diese Komponenten nicht enthalten. Im Gegensatz dazu zeigen sie normales Wachstum auf Komplettmedium, da Tryptophan und Uracil in ausreichenden Mengen vorhanden sind.
Die auxotrophen trpC- und pyrF-Mutanten werden durch ein erfindungsgemäßes Plasmid komplementiert, welches das fehlende oder defekte Gen für die jeweilige Biosynthese ohne eine Mutation enthält. Die komplementierenden Gene stammen jedoch nicht aus E.coli sondern aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Sie codieren für dieselben Enzyme wie die korrespondierenden E.coli-Gene. Aufgrund der schwachen Funktion der Hefenpromotoren ist ihre Transkription in E.coli geringer als die Transkription endogener analoger E.coli-Gene des Wirts. Die Plasmid-codierte Expression des Hefegens URA3 (pBR₃₂₂-Plasmidderivat) beträgt z.B. nur ein Drittel der Expression des analogen chromosomalen pyrF-Gens (Rose, M., 1984). Dies hat den Vorteil, dass die Markergene trotz des Gendosiseffekts nicht überexprimiert werden und die Zelle nicht zusätzlich metabolisch gestresst wird.
Plasmide sind extrachromosomale (episomale) zirkuläre doppelsträngige DNA-Moleküle, welche eine Länge von mehreren Tausend Nukleotid-Bausteinen aufweisen und in einer Anzahl von mehreren bis zu mehreren Hundert Kopien pro Zelle existieren. Sie haben ein DNA-Segment, den sogenannten Replikationsursprung, welches eine autonome Plasmidreplikation/Amplifikation unabhängig von der chromosomalen DNA-Replikation erlaubt.
Es wurde ein stabiles E.coli-Wirt/Vektor-System entwickelt, welches die Plasmidselektion durch Antibiotika vermeidet. Das Selektionsprinzip basiert auf der Komplementierung einer stabilen E.coli-Auxotrophie durch ein geeignetes Hefegen.
Die E.coli-Wirtsstämme enthalten vorzugsweise eine stabile, vorzugsweise nicht reversionsfähige Mutation (Deletion) in den chromosomalen Genen trypC und/oder pyrF, sowie ein Expressionsplasmid, welches die komplementierenden Hefegene TRP1 und/oder URA3 enthält.
Die Basis-Expressionsplasmide sind gekennzeichnet durch:

i) die Abwesenheit von Antibiotika-Resistenzgenen, und
ii) ihre sehr geringe Größe (< 2000 bp).

Sie enthalten nur die absolut essenziellen Elemente für die Replikation in E.coli und die Expression eines gewünschten Gens:

i) einen Replikationsursprung,
ii) ein Selektionsmarkergen und
iii) eine prokaryotische oder eukaryotische Expressionskassette (Gentherapie), und die Größe dieser Plasmidelemente ist so gering wie möglich.

Der Replikationsursprung
Der Replikationsursprung für die autonome Replikation des Plasmids in der Zelle ist von einem prokaryotischen Plasmid abgeleitet, vorzugsweise von einem natürlichen E.coli-Plasmid. Die meisten heutzutage verwendeten E.coli- Plasmide sind Derivate des Klonierungsvektors pBR₃₂₂ (Boliver, F. et al., 1979), dessen Replikon (Ursprung der DNA-Replikation) auf dem Plasmid pMB1 basiert (Sutcliffe, G. et al. 1979), welches sich nur geringfügig von dem Plasmid ColE1 unterscheidet. Die Replikation des Plasmids pBR₃₂₂ wird auch als Replikation des ColE1-Typs bezeichnet (Backman, K. et al., 1978). Die minimale DNA-Sequenz, welche für eine autonome Replikation des pBR₃₂₂-Plasmids verantwortlich ist, wurde durch Backman, K. et al. 1978 reduziert auf eine 580–650 bp fange DNA-Sequenz. Die Plasmid-Kopienanzahl pro Zelle wird durch die Art des Replikationsursprungs bestimmt. Je nach der Anzahl von Kopien pro Zelle, die erreicht werden kann, bezeichnet man Plasmide als solche mit geringer Kopienanzahl (ca. 10 Kopien, pACYC-Plasmide), mit mittlerer Kopienanzahl (ca. 50 Kopien, pBR-Plasmide) und mit hoher Kopienanzahl (ca. 500 Kopien, pUC-Plasmide). Der Replikationsursprung für hohe Kopienanzahlen der pUC-Plasmide beruht auf einer Punktmutation im pBR-Replikationsursprung (Chambers, S.P. et al., 1988). Die Expressionsausbeute eines Gens korreliert im Allgemeinen mit der Kopienanzahl des zu exprimierenden Gens.
Die Expressionskassette
Eine Expressionskassette (heterologe Transkriptionseinheit) besteht aus:

i) einem Promotor,
ii) einer ribosomalen Bindungsstelle,
iii) einer Mehrfach-Klonierungsspaltstelle und
iv) einem Transkriptionsterminator (rho-unabhängige Termination).

Die Mehrfach-Klonierungsspaltstelle dient zur Insertion des Gens (strukturellen Gens), das exprimiert werden soll, und zu diesem Zweck besteht sie aus mindestens zwei Restriktionsendonukleasen-Spaltstellen, die in dem Vektor nur einmal vorhanden sind. Es sind solche Spaltstellen bevorzugt, welche dem Promotor gegenüber liegen, welche die Nukleotidsequenz für ein ATG-Startcodon in ihrer Erkennungssequenz enthalten, wie etwa die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme NcoI, BspHI, SpHI und NdeI.
Dies erleichtert die präzise Verbindung zwischen Promotor und strukturellem Gen.
Ein Promotor ist ein DNA-Fragment, welches die Kontrollsignale für den Start der mRNA-Synthese und für die Häufigkeit, mit der dieses mRNA-Molekül gebildet werden soll, enthält, und ist funktionell aktiv in einer Expressionskassette. Ein typischer natürlicher E.coli-Promotor ist 80–300 Basenpaare lang und enthält mehrere charakteristische (homologe) Regionen, welche den verschiedenen Promotoren gemeinsam sind und welche durch Sequenzvergleiche bestimmt worden sind (Rosenberg, M. und Court, D., 1979; Harley, C.B. und Reynolds, R.P., 1987). Diese hochkonservierten Regionen sind:

i) die Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase mit dem Motiv 5'-TTGACA-3', welches sich 35 Basenpaare vor dem Start der mRNA-Synthese befindet,
ii) die Pribnow-Schaller-Box oder sogenannte TATA-Box mit der Codon-Prototyp-Sequenz 5'-TATAAT-3', welche 10 Basenpaare vor dem Start der mRNA-Synthese positioniert ist, und
iii) eine AT-reiche Region um die Position "-43" herum in starken Promotoren.

Je nach der Häufigkeit, mit der ein Promotor gelesen wird, unterscheidet man zwischen schwachen und starken Promotoren. Ein Unterschied wird auch zwischen konstitutiven und regulierbaren (induzierbaren, dereprimierbaren) Promotoren gemacht. Ein guter Promotor im Sinne der industriellen Produktion von Proteinen ist im Allgemeinen ein starker, streng regulierter Promotor, der während der Zellvermehrung inaktiv ist und der falls erforderlich spezifisch angestellt werden kann, z.B. am Ende einer Fermentierung. Diese Erfordernisse einer sehr hohen und gleichzeitig streng kontrollierbaren Promotoraktivität haben zur Konstruktion der Hybridpromotoren geführt, die heutzutage vorzugsweise verwendet werden. Im Falle des Tac-Hybridpromotors, welcher einfach reguliert werden kann, wurde die "-35"-Region des starken konstitutiven trp-Promotors mit einer "-10"-Region des induzierbaren lac-Promotors fusioniert (DeBoer, H.A. et al., 1983; Amann, E. et al., 1983). Ein weiteres Beispiel ist der T5-P_N25/03/04-Hybridpromotor (Stüber, D. et al., 1990), welcher auf einem starken konstitutiven T5-Bakteriophagen-Promotor basiert und durch Kombination/Insertion von zwei lac-Operatoren (lacO) rekonstruiert wurde, um einen starken Promotor zu bilden, der einfach reguliert werden kann. Der tac- wie auch der T5-P_N25/03/04-Hybridpromotor werden durch den lacI-Repressor negativ reguliert, welcher die Transkription des Promotors durch Wechselwirkung mit dem lac-Operator(en) verhindert. Das Hinzufügen des natürlichen Induzierers Lactose oder des sehr starken nicht metabolisierbaren Lactoseanalogons Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) führt zu einer Ablösung des lacI-Repressors und somit zur Bildung der gewünschten mRNA und Proteinsynthese.
Transkriptionsterminatoren sind DNA-Sequenzen mit einer Länge von 50–100 Basenpaaren, welche der RNA-Polymerase das Signal für die Terminierung der mRNA-Synthese geben. Sie sind strukturell durch die Bildung einer Hairpinförmigen Sekundärstruktur charakterisiert, was aus komplementärer Basenpaarung resultiert (meistens G/C-reich). Funktionell agieren sie unabhängig von der Orientierung. Sehr effiziente (starke) Terminatoren am 3'-Ende einer Expressionskassette sind empfehlenswert, um die RNA-Polymerase daran zu hindern, "durchzulesen" (read through), insbesondere, wenn starke Promotoren verwendet werden. Ineffiziente Transkriptionsterminatoren können zur Bildung einer Operon-artigen mRNA führen, was der Grund sein kann für eine unerwünschte Plasmid-codierte Genexpression. Des Weiteren verhindert die Sekundärstruktur am 3'-Ende der mRNA, die durch den Terminator hervorgerufen wird, die Zersetzung durch 3'-Exonucleasen (Higgins, C.F. et al., 1993), was die Halbwertszeit der mRNA erhöhen kann und demnach auch die Menge an synthetisiertem Protein erhöhen kann. Beispiele oft verwendeter Transkriptionsterminatoren sind der Terminator T0 des Bakteriophagen λ (Schwarz, E. et al., 1978), der fd-Bakteriophagenterminator (Beck E. und Zink, B., 1981) und der Terminator T1 des E.coli-rrnB-Operons. (Brosius, J. et al., 1981).
Für eine effiziente Initiierung der Proteinbiosynthese ist auch eine ribosomale Bindungsstelle (RBS) erforderlich. Sie umfasst die Sequenz vom ATG- Startcodon bis zur sogenannten Shine-Dalgarno-Sequenz mit dem Konsens-Motiv AGGA. Der Abstand zwischen dem ATG-Startcodon und der SD-Sequenz variiert zwischen 5–15 Basenpaaren und ist A/T-reich. Der Abstand zwischen dem Startpunkt der mRNA-Synthese und dem ATG-Translationsstartcodon variiert im Allgemeinen zwischen 15–80 Basenpaaren.
Alle Sequenzen sind geeignet als Fremdsequenz im Sinne der Erfindung. Solche Nukleinsäuresequenzen codieren vorzugsweise für Polypeptide, welche eine Wirkung auf den Metabolismus im menschlichen Körper haben. Solche Proteine oder Polypeptide sind vorzugsweise therapeutisch relevante Polypeptide wie etwa Cytokine, Proteine oder Proteinhormone.
Es gibt eine große Anzahl von Techniken zur Herstellung von E.coli-Mutanten, welche für die Konstruktion von E.coli-Wirtsstämmen geeignet sind. Sie reichen von der Mutagenese der gesamten Zelle, gefolgt von einer Selektion des gewünschten Phänotyps bis zur spezifischen Mutagenese individueller Basen oder genau definierter Gene oder Genomabschnitte. Die Verfahren sind von Miller, J.H. (1972), Neidhardt, F.C. et al. (1987) und Winnacker, E.-L. (1985) beschrieben.
Ein stabiler, nicht reversionsfähiger Auxotrophie-Marker wurde durch die gezielte Deletion des kompletten Gens oder eines großen Genfragments durch homologe Rekombination nach der Methode von Hamilton C.M. et al., 1989 in Wirtsstämme eingeführt. Der ursprüngliche Genotyp wird bei dieser Technik bewahrt, d.h. es werden keine zusätzlichen Mutationen in das E.coli-Genom eingeführt. Das Prinzip der Genaustauschtechnik ist detaillierter unter Verwendung der Konstruktion einer tryC-Deletionsmutante als Beispiel erläutert.
Es ist vorgesehen, beispielsweise das komplette trpC-Gen (1355 bp) aus dem Tryptophan-Operon von E.coli zu deletieren (Yanofsky, C. et al., 1981). Hierzu werden die flankierenden Regionen (jeweils 700–800 bp) des trpC-Gens mit Hilfe von PCR unter Verwendung geeigneter Primer und chromosomaler E.coli-DNA als Matrize amplifiziert. Die Überhänge der Primer enthalten einmalige Spaltstellen für Restriktionsenzyme, um die amplifizierten DNA-Fragmente der Gene trpD und trpB in den Vektor pMAK705 in einer direkten Fusion zu ligieren. Der Vektor pMAK705 ist gekennzeichnet durch einen temperaturempfindlichen Replikationsursprung (einem Replikationsursprung aus pSC101), welcher bei 44°C inaktiv ist, sowie durch ein Chloramphenicol-Resistenzgen. Um das chromosomale trpC-Gen zu deletieren, wird das pMAK705-trpD/B-Plasmid in den gewünschten E.coli-Stamm transformiert. Eine Voraussetzung für eine homologe Rekombination zwischen dem Plasmid und dem E.coli-Chromosom ist ein Rekombinations-kompetenter E.coli-Stamm (recA⁺-Genotyp). Stämme mit einem recA^–-Genotyp können keine homologe Rekombination durchführen und sind daher nicht geeignet. Die transformierten Zellen werden bei 44°C in Gegenwart von Chloramphenicol kultiviert. Da das Plasmid bei 44°C aufgrund seines temperaturempfindlichen Replikationsursprungs (ori^ts) sich nicht repliziert, überleben nur jene Zellen, welche den Vektor in das Chromosom integriert haben, beispielsweise durch homologe Rekombination. Die Co-Integrate werden isoliert und unter Chloramphenicol-Selektion über mehrere Passagen bei 30°C kultiviert. Der chromosomal lokalisierte Replikationsursprung des Plasmids pMAK705-trpD/B, welcher bei dieser Temperatur aktiv ist, führt zu einer drastischen Reduktion der Wachstumsrate der Co-Integrate. Zellen, welche das Plasmid aus dem Chromosom durch eine zweite Rekombination entfernt haben, wachsen wieder normal. Sie enthalten das vom Chromosom abgetrennte Plasmid, welches sich bei 30°C in Gegenwart von Chloramphenicol repliziert. Das Ergebnis ist, dass Zellen, welche Plasmide enthalten, die Co-Integrate im Wachstum überholen und nach mehreren Passagen in der Kultur dominieren. Wie in 1 dargestellt, kann das integrierte Plasmid auf zwei verschiedene Arten A und B aus dem Chromosom herausgetrennt werden. Das Plasmid enthält dann das zu deletierende Gen trpC (B) oder es liegt wiederum in seiner ursprünglichen Form in der Zelle (A) vor, je nach dem homologen Rekombinationsereignis. Zellen, welche ein Plasmid mit dem chromosomalen trpC-Gen enthalten, haben sehr wahrscheinlich die gewünschte trpC-Deletion. Sie werden aufgrund von Restriktionsanalyse der Plasmide identifiziert und werden von dem Plasmid durch eine einzige Kultur bei 44°C und mehreren Kulturen bei 30°C in Abwesenheit von Chloramphenicol geheilt. Anschließend werden die Klone hinsichtlich der trpC-Auxotrophie durch Ausplattieren von einzelnen Kolonien auf einem Medium mit und ohne Tryptophan (Replika-Plattierung) getestet.
Spezielle E.coli-Wirt/Vektor-Systeme und Wirtsstämme
Ein sehr streng reguliertes Wirt/Vektor-System wurde speziell für die Expression von Proteinen entwickelt, die für E.coli toxisch sind, um eine Basisexpression eines Gens zu verhindern, welche immer noch Störungen hervorrufen könnte. Das T7-Polymerasesystem von Studier, F. et al., 1990 basiert auf einer speziellen RNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7, welcher absolut selektiv und spezifisch für den T7-Promotor ist. Da die E.coli-RNA-Polymerase des Wirts diesen T7-Promotor nicht erkennt, wird die T7-Polymerase zum Zeitpunkt der Induzierung bereitgestellt, durch

i) Infizieren der Kultur mit einem geeigneten Phagen, wie z.B. dem λ-Bakteriophagenderivat CE6 oder
ii) durch Induzieren einer chromosomal integrierten T7-Polymerase unter der Kontrolle eines lacUV5/lacI-Promotors.

Die speziellen E.coli-Wirtsstämme BL21 (DE3) und HMS174 (DE3), welche ein T7-Polymerasegen enthalten, wurden durch chromosomale Insertion des lysogenen λ-Bakteriophagenderivats DE3 erzeugt. Dieses System, welches oft in Forschungslaboratorien verwendet wird, ist für industrielle Zwecke weniger geeignet, denn:

i) nur eine beschränkte Anzahl von Wirtsstämmen (2) sind vorhanden,
ii) das DE3-Lysogen ist in einem Fermenter nicht absolut stabil und
iii) das Wachstum der Zellen stagniert nach der Induktion, und somit ist ein Wachstum auf hohe Zelldichten schwierig.

Die folgenden Beispiele, Publikationen, Sequenzprotokolle und Figuren erläutern die Erfindung weiter, deren Schutzbereich sich aus den Patentansprüchen ergibt. Die beschriebenen Verfahren sollen als Beispiele verstanden werden, welche den Gegenstand der Erfindung auch nach Modifikationen noch beschreiben.
Die Figuren zeigen:
1: Konstruktion von E.coli-trpC-Deletionsmutanten durch eine Genaustauschtechnik. Die Sequenzen, welche das zu deletierende trpC-Gen flankieren, werden in den Vektor pMAK705 integriert. Nur solche E.coli-Stämme, die durch homologe Rekombination transformiert sind und durch Integration das Plasmid in das Chromosom integriert haben und bei 44°C unter Zugabe von Chloramphenicol kultiviert wurden, überleben, da das Plasmid sich bei 44°C nicht replizieren kann (Co-Integratbildung).
Anschließendes Kultivieren bei 30°C unter Chloramphenicol-Selektion führt zu einer zweiten homologen Rekombination, in der das Plasmid aus dem Chromosom ausgeschnitten wird. Dieses Aufbrechen des Co-Integrats kann zu dem ursprünglichen Plasmid pMAK705-trpD/B (A) oder zu einem pMAK705-trpD/C/B-Plasmidderivat führen, welches zusätzlich das trpC-Gen enthält (B). Das trpC-Gen auf dem E.coli-Chromosom wird nur im Fall B deletiert.
2: Konstruktion der Basisvektoren OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET: Die Plasmide OripBR-TRP1 (1497 bp), OripBR-URA3 (1697 bp) und OripBR-TET (2012 bp) werden unter Verwendung der Spaltstellen SfiI und XhoI durch Ligieren der Markergene TET, URA3 und TRP1, die aus den Plasmiden pBR₃₂₂, yEP24 und yRP7 isoliert wurden, gebildet, zusammen mit einem DNA-Segment, welches den Replikationsursprung aus pBR₃₂₂ enthält.
3: Die Nukleotidsequenz der Expressionskassette, die aus dem T5-P_N25/03/04-Hybridpromotor, der ribosomalen Bindungsstelle RBSII, einer Mehrfach-Klonierungsspaltstelle (NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII) und dem λ-T0-Terminator besteht.
Allgemeine Methoden:
Standardmethoden wurden verwendet, um die DNA zu manipulieren, wie beschrieben in Sambrook, J. et al. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Die molekularbiologischen Reagenzien wurden gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet.
Als Replikationsursprung wurden der Replikationsursprung aus dem Vektor pBR₃₂₂ (mittlere Kopienanzahl) und aus dem Vektor pUC20 (hohe Kopienanzahl) verwendet. Die minimale DNA-Sequenz für die autonome Replikation dieser Plasmide ist zwischen 580 bis 650 bp (Backman, K. et al., 1978).
Die Hefegene TRP1 und URA3 wurden als Selektionsmarkergene ausgewählt. Das Tetracyclin-Resistenzgen wurde verwendet, um isogene Standardreferenzplasmide herzustellen.
Beispiel 1
Konstruktion der Basisvektoren OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET
1.1 Konstruktion des Basisvektors OripBR-TRP1
Das Plasmid OripBR-TRP1 setzte sich aus zwei DNA-Fragmenten zusammen, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäß dem Verfahren von Mullis, K.B. und Faloona, F.A., 1987 erhalten wurden. In einer ersten PCR-Reaktion wurde der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR₃₂₂ von bp-Position 2517–3160 gemäß der Publikation von Sutcliffe J.G., 1979 amplifiziert unter Verwendung der Primer N1 (SEQ ID NO:1) und N2 (SEQ ID NO:2).
und pBR₃₂₂ als Matrizen-DNA. Eine einmalige SfiI-Restriktionsendonukleasen-Spaltstelle wurde mit Hilfe des 5'-überhängenden Endes des PCR-Primers N1 eingeführt, und eine einmalige XhoI-Restriktionsendonukleasen-Spaltstelle wurde mit Hilfe des 5'-überhängenden Endes des PCR-Primers N2 eingefügt.
Das TRP1-Hefegen (5'-flankierende Region und das TRP1 strukturelle Gen) wurde von bp-Position 22–777 gemäß der Publikation von Tschumper, G. und Carbon, J., 1980 in einer zweiten PCR-Reaktion amplifiziert unter Verwendung der Primer N3 (SEQ ID NO:3) und N4 (SEQ ID NO:4).
und YRP7 (Kopetzki, E. et al., 1989) als Matrizen-DNA. Eine einmalige SfiI-Spaltstelle und NotI-Spaltstelle wurden mit Hilfe des 5'-überhängenden Endes PCR-Primers N3 eingefügt, und ein zweites Translations-Stoppcodon, der fd-Transkriptionsterminator des Bakteriophagen fd von Position 1522–1570 (Beck, E. und Zink, B., 1981), sowie zwei einmalige Restriktionsendonukleasen-Spaltstellen (MAKHI und XhoI) wurden am 3'-Ende der codierenden Region des TRP1 strukturellen Gens mit Hilfe des 5'-überhängenden Endes des PCR-Primers N4 eingefügt.
Die beiden mit SfiI und XhoI verdauten PCR-Fragmente wurden nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese ligiert. Anschließend wurde der E.coli-K12-Stamm JA300 (thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK, strR; DSMZ 4776) (Quelle: "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) mit Hilfe von Calciumchlorid gemäß dem Verfahren nach Hanahan, D., 1983 oder durch Elektroporation gemäß dem Protokoll von Fiedler, S. und Wirth, R., 1988 transformiert. Die Transformanten wurden auf Agarplatten in M9-Minimalmedium selektiert (Herstellung: siehe Sambrook, J. et al., 1989) und 0,5% (w/v) Casaminosäuren (Säure-hydrolysiertes Casein enthält kein Tryptophan) von der Difco Company selektiert und anschließend in Flüssigkultur kultiviert. Das gewünschte Plasmid OripBR-TRP1 (1497 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert.
1.2 Herstellung des Basisvektors OripBR-URA3
Das Plasmid OripBR-URA3 bestand aus zwei PCR-Fragmenten wie das Plasmid OripBR-TRP1. Es wurde jedoch anstelle des TRP1-Selektionsmarkergens das URA3-Hefegen verwendet. Erste PCR-Reaktion: siehe Beispiel 1.1.
Das URA3-Hefegen (5'-flankierende Region und das URA3 strukturelle Gen) von bp-Position 75–1030 gemäß der Publikation von Rose, M., 1984 wurde in einer zweiten PCR-Reaktion amplifiziert unter Verwendung der Primer N5 (SEQ ID NO:5) und N6 (SEQ ID NO:6).
und YEp24 (Botstein, D. et al., 1979) als Matrizen-DNA. Eine einmalige SfiI-Spaltstelle und NotI-Spaltstelle wurden mit Hilfe des 5'-überhängenden Endes des PCR-Primers N5 eingeführt, und ein zweites Translations-Stoppcodon, der fd-Transkriptionsterminator des Bakteriophagen fd (anti-native Orientierung) von Position 1522 bis 1570 (Beck, E. und Zink, B., 1981) sowie zwei einmalige Restriktionsendonukleasen-Spaltstellen (BamHI und XhoI) wurden am 3'-Ende der codierenden Region des TRP1 strukturellen Gens mit Hilfe des 5'- überhängenden Endes des PCR-Primers N6 eingefügt.
Die beiden mit SfiI und XhoI verdauten PCR-Fragmente wurden nach Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese ligiert. Anschließend wurde der E.coli-K12-Stamm CSH28 (Δlacpro, supF, trp, pyrF, his, strA, thi) (Quelle: Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Miller, J. H., 1972) mit Hilfe von Calciumchlorid gemäß dem Verfahren nach Hanahan, D., 1983 oder durch Elektroporation gemäß dem Protokoll von Fiedler, S. und Wirth, R., 1988 transformiert. Die Transformanten wurden auf Agarplatten in M9-Minimalmedium (Herstellung: siehe Sambrook, J. et al., 1989) enthaltend 0,5 (w/v) Casaminosäuren von der Difco Company und 5 mg/ml Tryptophan selektiert und anschließend in Flüssigkultur kultiviert. Das gewünschte Plasmid OripBR-URA3 (1697 bp) wurde Restriktionskartierung identifiziert.
1.3 Konstruktion des eine Antibiotikumresistenz enthaltenden Referenzvektors OripBR-TET
Das Plasmid OripBR-TET bestand aus zwei PCR-Fragmenten wie die Plasmide OripBR-TRP1 und OripBR-URA3. Anstelle des TRP1- oder URA3-Selektionsmarkergens wurde jedoch das Tetracyclin-Resistenzgen (TET) aus dem Plasmid pBR₃₂₂ verwendet. Erste PCR-Reaktion: siehe Beispiel 1.1.
Das TET-Resistenzgen (Promotor und das TET strukturelle Gen) von bp-Position 3–1275 gemäß der Publikation von Sutcliffe, J.G., 1979 wurde in einer zweiten PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer N7 (SEQ ID NO:7) und N8 (SEQ ID NO:8)
sowie pBR322 (Sutcliffe, J.G., 1979) als Matrizen-DNA amplifiziert. Eine einmalige SfiI-Spaltstelle und NotI-Spaltstelle wurden mit Hilfe des 5'überhängenden Endes des PCR-Primers N7 eingeführt, und der fd-Transkriptionsterminator des Bakteriophagen fd (anti-native Orientierung) von Position 1522 bis 1570 (Beck, E. und Zink, B., 1981) sowie zwei einmalige Restriktionsendonukleasen-Spaltstellen (XhoI und XbaI) wurden am 3'-Ende der codierenden Region des TET strukturellen Gens mit Hilfe des 5'- überhängenden Endes des PCR-Primers N8 eingefügt.
Die beiden mit SfiI und XhoI verdauten PCR-Fragmente wurden nach Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese ligiert. Anschließend wurde der E.coli-K12-Stamm JA300 (thr, leuB6, thi, thyA, trpC1117, hsrK, HsmK, strR; DSMZ 4776) (Quelle: "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) mit Hilfe von Calciumchlorid gemäß dem Verfahren nach Hanahan, D., 1983 oder durch Elektroporation gemäß dem Protokoll von Fiedler, S. und Wirth, R., 1988 transformiert. Die Transformanten wurden selektiert (Agarplatten) in LB-Komplettmedium (Herstellung: siehe Sambrook, J. et al., 1989) enthaltend 12,5 μg/ml Tetracyclin, und wurden anschließend in Flüssigkultur kultiviert. Das gewünschte Plasmid OripBR-TET (2012 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert.
1.4 Entfernen einer NdeI-Spaltstelle in den Plasmiden OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET
Eine unerwünschte NdeI-Spaltstelle, welche sich zwischen den beiden PCR-Fragmenten zwischen den Spaltstellen NotI und SfiI während der Ligierung der Basisvektoren OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET gebildet hatte, wurde anschließend mit Hilfe eines NotI/SfiI-Nukleotidadapters entfernt. Hierzu wurden die Plasmide OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET mit NotI und SfiI verdaut, die Vektorfragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt und mit einem NotI/SfiI-Nukleotidadapter ligiert. Die gewünschten Plasmide wurden durch Restriktionskartierung identifiziert (fehlende NdeI-Spaltstelle).
Der NotI/SfiI-Adapter wurde durch Hybridisierung von gegenseitig komplementären Oligonukleotiden N9 (SEQ ID NO:9) und N10 (SEQ ID NO:10) hergestellt. Hierzu wurden 10 nmol jedes der Oligonukleotide N9 und N10 in 100 μl 12,5 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/l MgCl₂ gemischt, das Gemisch wurde für 5 min auf 95°C erwärmt und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
N9: 5'-AGGCCGGGGGGGGGC-3'
N10. 5'-GGCCGCCCCCCCCCGGCCTATA-3'
NotI/SfiI Adapter
Beispiel 2
Konstruktion der prokaryotischen Expressionskassette
Die verwendete Expressionskassette (heterologe Transkriptionseinheit) bestand aus den folgenden Elementen:

i) dem regulierten T5-P_N25/03/04-Hybridpromotor (Bujard, H. et al., 1987; Stüber, D. et al., 1990),
ii) einer synthetischen ribosomalen Bindungsstelle RBSII (Stüber, D. et al., 1990),
iii) einer Mehrfach-Klonierungsspaltstelle mit den einmaligen Spaltstellen NdeI, SalI, XmaI, EcoRV und CelII und
iv) dem λ-T0-Bakteriophagen-Transkriptionsterminator (Schwarz, E. et al., 1978).

Der T5-P_N25/03/04-Hybridpromotor (3: bp-Position: 1–87) wurde mit dem λ-T0-Terminator verbunden (3: bp-Position: 146–241) mit Hilfe eines EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII-Linkers.
Die Expressionskassette wurde erhalten durch Rekonstruktion eines pDS56/RBSII-Plasmids (Stüber, D. et al., 1990). Hierzu wurde ein Derivat des pDS56/RBSII-Plasmids mit EcoRI und CelII verdaut, und das durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigte EcoRI/CelII-pDS56-Vektorfragment wurde mit einem EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII-Linker ligiert.
Der EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII-Linker wurde durch Hybridisieren der gegenseitig komplementären Oligonukleotide N11 (SEQ ID NO:11) und N12 (SEQ ID NO:12) hergestellt. 10 nmol jedes der Oligonukleotide N11 und N12 wurden in 100 μl 12,5 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5, mmol/l MgCl₂ gemischt, das Gemisch wurde für 5 min auf 95°C erwärmt und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
N11: 5'-CATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGTATGGTCGACCCCGGGGATATCGC-3'
N12: 5'-TCAGCGATATCCCCGGGGTCGACCATACCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATT-3'
EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII Linker
Das gewünschte Plasmid p16074a wurde durch Restriktionskartierung identifiziert, und die Expressionskassette wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Beispiel 3
Konstruktion der Expressionsplasmide OripBR-TRP1-EK, OripBR-URA3-EK und OripBR-TET-EK
Die Expressionskassette (3) des Plasmids p16074a, bestehend aus dem regulierten T5-PP_N25/03/04-Hybridpromotor, der synthetischen ribosomalen Bindungsstelle RBSII, einer Mehrfach-Klonierungsspaltstelle mit den einmaligen Spaltstellen NdeI, SalI, XmaI, EcoRV und CelII und dem λ-T0-Terminator wurde durch PCR amplifiziert und in die Plasmide OripBR-TRP1, OripBR-URA3 und OripBR-TET inseriert.
3.1 Konstruktion des Expressionsplasmids OripBR-TRP1-EK
Die Expressionskassette (3) wurde mit Hilfe von PCR unter Verwendung der Primer N13 (SEQ ID NO:13) und N14 (SEQ ID NO:14)
und mit dem Plasmid p16074a als Matrizen-DNA amplifiziert. Eine einmalige BamHI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende der Expressionskassette (λ-T0-Terminator) mit Hilfe des PCR-Primers N14 eingeführt.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und BamHI verdaut, und das ca. 255 bp lange XhoI/BamHI-Fragment wurde nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese in ein ca. 1490 bp langes XhoI/BamHI-OripBR-TRP1-Vektorfragment ligiert (Beispiel 2). Das gewünschte Plasmid OripBR-TRP1-EK (1728 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert und die durch PCR amplifizierte Sequenz der Expressionskassette wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
3.2 Konstruktion des Expressionsplasmids OripBR-URA3-EK
Das Expressionsplasmid OripBR-URA3-EK (1928 bp) wurde analog zu dem Plasmid OripBR-TRP1-EK hergestellt. Es wurde jedoch der Basisvektor OripBR-URA3 anstelle des Basisvektors OripBR-TRP1 verwendet.
3.3 Konstruktion des Referenzplasmids OripBR-TET-EK
Die Expressionskassette (3) wurde mit Hilfe von PCR unter Verwendung der Primer N13 (SEQ ID NO:13) und N14 (SEQ ID NO:15)
und dem Plasmid p16074a als Matrizen-DNA amplifiziert. Eine einmalige XbaI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende der Expressionskassette (λ-T0-Terminator) mit Hilfe des PCR-Primers N15 eingeführt.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und XbaI verdaut und das ca. 255 bp lange XhoI/XbaI-Fragment wurde nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese in das ca. 2000 bp lange XhoI/XbaI-OripBR-TET-Vektorfragment ligiert (Beispiel 2). Das gewünschte Plasmid OripBR-TET-EK (2243 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert und die Sequenz der durch PCR amplifizierten Expressionskassette wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 4
Konstruktion der Expressionsplasmide OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK und OripUC-TET-EK
Der Replikationsursprung für mittlere Kopienanzahl des Plasmids pBR322 wurde durch den Replikationsursprung für hohe Kopienanzahl aus einem pUC-Plasmid in den Plasmiden OripUC-Trp1-EK, OripUC-URA3-EK und OripUC-TET-EK ersetzt.
Hierzu wurde der pUC-Replikationsursprung mit Hilfe von PCR unter Verwendung der Primer N1 (SEQ ID NO:1) und N2 (SEQ ID NO:2) (Beispiel 1) und dem Plasmid pUC20 als Matrizen-DNA amplifiziert. Das mit SfiI und NotI verdaute ca. 650 bp lange SfiI/NotI-pUC-Replikationsursprungsfragment wurde nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese in die entsprechenden Vektorfragmente SfiI/NotI-OripBR-TRP1-EK, SfiI/NotI-OripBR-URA3-EK und SfiI/NotI-OripBR-TET-EK ligiert. Die gewünschten Plasmide OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK und OripUC-TET-EK wurden aufgrund ihrer erhöhten Plasmid-Kopienanzahl identifiziert (3-5-fach erhöhte Plasmidausbeute gemäß der Standardpräparation).
Beispiel 5
Konstruktion von IFN-α2b-Expressionsplasmiden
5.1 Synthese des Interferon-α2b-Vorlagegens
Die Expressionsvektoren wurden hinsichtlich der Plasmidstabilität und IFN-α2b-Synthese getestet unter Verwendung eines Interferon-α2b-Gens (Met-IFN-α2b strukturelles Gen ohne eine Signalsequenz) als Vorlagegen, welches heterolog exprimiert werden soll.
Das chemisch hergestellte Met-IFN-α2b strukturelle Gen basiert auf der im Index Nominum (International Drug Directory 1992/1993) angegebenen Aminosäuresequenz für das reife IFN-α2b. Das Met-IFN-α2b strukturelle Gen enthält zusätzlich ein ATG-Startcodon. Die synthetische ribosomale RBSII-Bindungsstelle und eine einmalige EcoRI-Spaltstelle befinden sich stromaufwärts am 5'-Ende des Met-IFN-α2b strukturellen Gens (Stüber D. et al., 1990). Die Codons, die in E.coli vorzugsweise verwendet werden (E.coli-Codonverwendung) wurden beim Gendesign des Met-IFN-α2b Gens berücksichtigt. Zusätzlich wurden geeignete einmalige Restriktionsendonukleasen-Spaltstellen innerhalb der codierenden Region und an den Enden des Met-IFN-α2b strukturellen Gens eingefügt (EcoRI und HindIII) zur Konstruktion von Varianten des Gens und zum Reklonieren des Met-IFN-α2b-DNA-Segments.
Das IFN-α2b-Gen (RBSII-Met-IFN-α2b-Gen) wurde von der Genosys Company (Genosys Biotechnologies Inc. Cambridge, England) aus Oligonukleotiden, die durch chemische Synthese hergestellt wurden, hergestellt. Das doppelsträngige RBSII-Met-IFN-α2b-Gen wurde durch Anheften und Ligieren der Oligonukleotide und anschließendes Klonieren in die EcoRI- und HindIII-Spaltstelle des E.coli-Standardvektors pBluescriptSK(+) der Stratagene Company (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) zusammengestellt. Die vorbestimmte DNA-Sequenz des klonierten RBSII-Met-IFN-α2b strukturellen Gens wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Anschließend wurde das ca. 535 bp lange EcoRI/HindIII-RBSII-Met-IFN-α2b-Segment in ein pDS56/RBSII-Plasmid, welches mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, hineinkloniert (pDS-IFN). Dies erlaubt die Übertragung des RBSII-Met-IFN-α2b-Gens in Form eines ca. 540 bp langen EcoRI/CelII-RBSII-Met-IFN-α2b-Fragments.
5.2 Konstruktion der IFN-α2b-Expressionsplasmide
Das RBSII-Met-IFN-α2b-Gen wurde aus dem Plasmid pDS-IFN in Form eines ca. 540 bp langen EcoRI/CelII-RBSII-Met-IFN-α2b-Fragments isoliert und anschließend in jedes der Plasmide OripBR-TRP1-EK, OripBR-URA3A3-EK, OripBR-TET-EK, OripUC-TRP1-EK, OripUC-URA3-EK und OripUC-TET-EK ligiert, welche mit EcoRI und CelII verdaut worden waren. Die gewünschten Plasmide OripBR-TRP1-EK-IFN, OripBR-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN wurden durch Restriktionskartierung identifiziert.
Beispiel 6
Konstruktion von nicht reversionsfähigen trpC- und pyrF-E.coli-Wirtsstämmen
Die gewünschten Auxotrophie-Marker trpC und pyrF wurden in leicht erhältliche Laborstämme durch gezielte Deletion des kompletten Gens oder eines größeren Genfragments mit Hilfe von homologer Rekombination gemäß dem Verfahren von Hamilton C.M. et al., 1989 eingeführt.
6.1 Konstruktion der Deletionsplasmide
6.1.1 Konstruktion des Deletionsplasmids pMAK705-trpD/B
Um das komplette chromosomale trpC-Gen (1355 bp) zu deletieren, wurden jeweils 700–800 bp der 5'-flankierenden Region (trpD) und der 3'-flankierenden Region (trpB) mit Hilfe von PCR kloniert, und wurden in den Vektor pMAK705 (Hamilton C.M. et al., 1989) in direkter Fusion (trpD/B) mit Hilfe einer gemeinsamen Spaltstelle (NotI) mit den PCR-Primern eingefügt. Die DNA-Sequenz des Tryptophan-Operons von E.coli ist von Yanofsky, C. et al., 1981 angegeben.
Die 5'-flankierende Region des trpC-Gens (trpD) wurde unter Verwendung der Primer N16 (SEQ ID NO:16) und N17 (SEQ ID NO:17)
und chromosomaler E.coli-DNA als Matrize amplifiziert. Eine einmalige BamHI-Spaltstelle wurde am 5'-Ende mit Hilfe der Primer N16 eingefügt, und eine einmalige NotI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende des amplifizierten trpD-Fragments mit Hilfe des Primers N17 eingefügt.
Die 5'-flankierende Region des trpC-Gens (trpB) wurde unter Verwendung der Primer N18 (SEQ ID NO:18) und N19 (SEQ ID NO:19)
und chromosomaler E.coli-DNA als Matrize amplifiziert. Eine einmalige NotI-Spaltstelle wurde am 5'-Ende mit Hilfe des Primers N18 eingefügt, und eine einmalige SpHI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende des amplifizierten trpB-Fragments mit Hilfe des Primers N19 eingefügt.
Das trpD-PCR-Fragment wurde mit BamHI und NotI verdaut (ca. 710 bp) und das trpB-PCR-Fragment wurde mit NotI und SpHI verdaut (ca. 820 bp). Nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese wurde das DNA-Fragment in das ca. 5650 bp lange BamHI/SpHI-pMAK705-Vektorfragment ligiert mit Hilfe einer 3-Fragmenten-Ligierung in einer direkten Fusion über die gemeinsame NotI-Spaltstelle. Das gewünschte Plasmid pMAK705-trpD/B (7104 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert und die durch PCR amplifizierte trpD/B-Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
6.1.2 Konstruktion des Deletionsplasmids pMAK705-ΔpyrF
Um ca. 260 bp von der codierenden Region des chromosomalen pyrF-Gens zu deletieren, wurden 700–800 bp der flankierenden pyrF-Region der jeweils mit Hilfe von PCR kloniert und in direkter Fusion (ΔpyrF) in den Vektor pMAK705 über die gemeinsame Spaltstelle (XbaI), welche durch die PCR-Primer eingefügt wurde, ligiert. Die DNA-Sequenz des pyrF-Operons von E.coli wurde veröffentlicht durch Turnbough, C.L. Jr. et al., 1987. Die 5'-flankierende Region des ΔpyrF-Gens wurde unter Verwendung der Primer N20 (SEQ ID NO:20) und N21 (SEQ ID NO:21)
und chromosomaler E.coli-DNA als Matrize amplifiziert. Eine einmalige BamHI-Spaltstelle wurde am 5'-Ende mit Hilfe des Primers N20 eingefügt, und eine einmalige XbaI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende des amplifizierten DNA-Fragments mit Hilfe des Primers N21 eingefügt.
Die 3'-flankierende Region des ΔpyrF-Gens wurde unter Verwendung der Primer N22 (SEQ ID NO:22) und N23 (SEQ ID NO:23)
und chromosomaler E.coli-DNA als Matrize amplifiziert. Eine einmalige XbaI-Spaltstelle wurde am 5'-Ende mit Hilfe des Primers N22 eingefügt, und eine einmalige SpHI-Spaltstelle wurde am 3'-Ende des amplifizierten DNA-Fragments mit Hilfe des Primers N23 eingefügt.
Das 5'-flankierende ΔpyrF-Fragment wurde mit BamHI und XbaI verdaut (ca. 600 bp), und das 3'-flankierende ΔpyrF-Fragment wurde mit XbaI und SpHI verdaut (ca. 690 bp). Nach der Aufreinigung durch Agarosegelelektrophorese wurden die DNA-Fragmente in einer direkten Fusion in das ca. 5650 bp lange BamHI/SpHI-pMAK705-Vektorfragment mit Hilfe einer 3-Fragmentenligierung über die gemeinsame XbaI-Spaltstelle einligiert. Das gewünschte Plasmid pMAK705-ΔpyrF (6788 bp) wurde durch Restriktionskartierung identifiziert, und die durch PCR amplifizierte pyrF-Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
6.2 Isolierung von E.coli-Deletionsmutanten
Der Vektor pMAK705 ist charakterisiert durch einen temperaturempfindlichen Replikationsursprung (Replikationsursprung aus pSC101), welcher bei 44°C inaktiv ist, und durch ein Chloramphenicol-Resistenzgen. Um ein chromosomales Gen zu deletieren, wird das geeignete pMAK705-Plasmidderivat in den gewünschten E.coli-Stamm transformiert. Eine Voraussetzung für eine homologe Rekombination zwischen dem Plasmid und dem E.coli-Chromosom ist ein Rekombinations-kompetenter E.coli-Stamm (recA⁺-Genotyp). Stämme, deren Genotyp recA^– ist, können keine homologe Rekombination durchführen und sind daher nicht geeignet.
Der E.coli-K12-Stamm UT5600 (ara, proC-14, leuB6, azi-6, lacY1, tsx-67, entA403, trpE38⁺, rpsL109, xyl-5, mtl-1, thi-1, ΔompT) (Grodberg, J. und Dunn, J.J., 1988) wurde mit dem Plasmid pMAK705-trpD/B und mit dem Plasmid pMAK705-ΔpyrF transformiert. Nach der Zugabe der Plasmid-DNA wurde der Transformationsansatz für 30 min auf Eis inkubiert, für 5 min bei 37°C (Hitzeschock) und für 30 min bei 30°C. Der Transformationsansatz wurde in 3 ml LB-Medium, welches 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt, gegeben, und die Zellen wurden über Nacht kultiviert. Um Plasmid-Co-Integrate zu selektieren, d.h. Zellen zu selektieren, welche das Plasmid in das Chromosom mit Hilfe homologer Rekombination integriert haben, wurden 300 μl einer 10^–5-Verdünnung der Über-Nacht-Kultur auf LB-Agarplatten, die 20 μg/ml Chloramphenicol enthielten, ausplattiert. Die Agarplatten wurden in einem Inkubator auf 50–60°C vorgewärmt und, nachdem die Zellen ausplattiert worden waren, unmittelbar bei exakt 44°C inkubiert. Da das pMAK705-Plasmid bei dieser Temperatur sich nicht repliziert, wachsen nur solche Zellen zu Kolonien heran, welche das Plasmid chromosomal integriert haben. Die Co-Integrat-Kandidaten wurden anschließend zwei- bis dreimal auf LB-Agarplatten, enthaltend 20 μg/ml Chloramphenicol, bei 44°C zur Aufreinigung für 2–3 Passagen kultiviert (Verdünnungsabstrich).
Um die Co-Integrate aufzubrechen und das Plasmid, welches sich von dem Chromosom abgelöst hat, zu entfernen, wurde ein aufgereinigter Co-Integrat-Klon für mehrere Passagen (2–6) in LB-Medium bei 30°C in Abwesenheit von Chloramphenicol kultiviert. Anschließend wurden die Zellen durch Verdünnung auf LB-Medium getrennt und auf den gewünschten Genotyp hin getestet.
6.2.1 Charakterisierung der Deletionsmutante UT5600 (ΔtrpC)
Die Zellen/Klone, die durch Verdünnung auf LB-Medium getrennt worden waren, wurden hinsichtlich der gewünschten trp-Auxotrophie durch Ausplattieren auf Medium (M9-Minimalmedium, enthaltend 0,5% Casaminosäuren) mit Tryptophan (50 mg/ml) und ohne Tryptophan (Replika-Plattierung) analysiert. Zusätzlich wurde die Chloramphenicol-Empfindlichkeit der Klone durch Ausplattieren auf LB-Medium mit Chloramphenicol (20 μg/ml) und ohne Chloramphenicol überprüft. Zusätzlich wurde die chromosomale trpC-Deletion durch vergleichende PCR-Analyse zwischen dem Ursprungsstamm und der Deletionsmutante unter Verwendung der PCR-Primer N1 und N4 und der entsprechenden chromosomalen DNA als Matrizen-DNA bestätigt. Das PCR-Produkt des ursprünglichen Stammes war ca. 2900 bp lang, wie theoretisch berechnet, und das der trpC-Deletionsmutante war ca. 1430 bp lang.
6.2.2 Charakterisierung der Deletionsmutante UT5600 (ΔpyrF)
Die durch Verdünnung auf LB-Medium getrennten Zellen/Klone wurden hinsichtlich der gewünschten pyrF-Auxotrophie durch Ausplattieren auf Medium (M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren) mit Uracil (20 mg/ml) und ohne Uracil analysiert. Zusätzlich wurde die Chloramphenicol-Empfindlichkeit der Klone durch Ausplattieren auf LB-Medium mit Chloramphenicol (20 μg/ml) und ohne Chloramphenicol überprüft. Zusätzlich wurde die chromosomale pyrF-Deletion durch vergleichende PCR-Analyse zwischen dem ursprünglichen Stamm und der Deletionsmutante unter Verwendung der PCR-Primer N5 und N8 und der entsprechenden chromosomalen DNA als Matrizen-DNA überprüft. Das PCR-Produkt des ursprünglichen Stammes war ca. 1550 bp lang, wie theoretisch berechnet, und das der pyrF-Deletionsmutante war ca. 1290 bp lang.
Beispiel 7
Expression eines heterologen Vorlagegens (IFN-α2b)
Das neue Wirt/Vektor-System basierend auf einer Antibiotikum-freien Selektion durch Komplementierung einer Auxotrophie wurde hinsichtlich seiner Funktion und Leistung unter Verwendung des Interferon-α2b als Vorlagegen, welches heterolog exprimiert werden sollte, ausgewertet.
7.1 Selektion durch Komplementierung der trpC-Auxotrophie
Um das IFN-α2b-Gen zu exprimieren, wurde der E.coli-K12-Stamm UT5600 (ΔtrpC) (Beispiel 6) jeweils mit einem der Expressionsplasmide OripBR-TRP1-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN, die in Beispiel 5 beschrieben sind, transformiert. Die transformierten UT5600 (ΔtrpC)/OripBR-TRP1-EK-IFN- und UT5600(ΔtrpC)/OripUC-TRP1-EK-IFN-Zellen wurden bei 37°C in einer Schüttelkultur in M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren (Difco) kultiviert, und die Referenzzellen UT5600 (ΔtrpC)/OripBR-TET-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN wurden in M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren (Difco) und 50 mg/ml Tryptophan und 12,5 μg/ml Tetracyclin bei 37°C bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm (OD₅₅₀) von 0,6–0,9 kultiviert und anschließend mit IPTG induziert (1–5 mmol/l endgültige Konzentration). Nach einer Induktionsphase von 4–8 Stunden (h) bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet (Sorvall RC-5B-Zentrifuge, GS3-Rotor, 6000 rpm, 15 min), mit 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7,2 gewaschen und bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
7.2 Selektion durch Komplementierung der pyrF-Auxotrophie
Um das IFN-α2b-Gen zu exprimieren, wurde der E.coli-K12-Stamm UT5600 (ΔpyrF) (Beispiel 6) jeweils mit einem der Expressionsplasmide OripBR-URA3-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN, die in Beispiel 5 beschrieben sind, transformiert. Die transformierten UT5600 (ΔtrpC)/OripBR-URA3-EK-IFN- und UT5600(ΔtrpC)/OripUC-URA3-EK-IFN- Zellen wurden bei 37°C in einer Schüttelkultur in M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren (Difco) kultiviert, und die Referenzzellen UT5600 (ΔtrpC)/OripBR-TET-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN wurden in M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren (Difco) und 20 mg/ml Uracil und 12,5 μg/ml Tetracyclin bei 37°C bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm (OD₅₅₀) von 0,6–0,9 kultiviert und anschließend mit IPTG induziert (1–5 mmol/l endgültige Konzentration). Nach einer Induktionsphase von 4–8 Stunden (h) bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet (Sorvall RC-5B-Zentrifuge, GS3-Rotor, 6000 rpm, 15 min), mit 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7,2 gewaschen und bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
7.3 Expressionsanalyse im Standardsystem
Die Synthese von IFN-α2b wurde in den UT5600(ΔtrpC)- oder UT5600(ΔpyrF)-Zellen, die mit den Expressionsplasmiden OripBR-TRP1-EK-IFN, OripUC-TRP1-EK-IFN, OripBR-URA3-EK-IFN, OripUC-URA3-EK-IFN, OripBR-TET-EK-IFN und OripUC-TET-EK-IFN transformiert worden waren, analysiert. Hierzu wurden Zellpellets aus drei Einheiten mit OD₅₅₀ (1 OD₅₅₀ = 1 ml Zellsuspension mit einem OD₅₅₀ von 1) des zentrifugierten Kulturmediums in 0,25 ml 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,2 resuspendiert, und die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert (2 Impulse von 30 sek bei 50% Intensität), durchgeführt mit einem Sonifier^® Cell Disruptor B15 von der Firma Branson (Heusenstamm, Deutschland). Die unlöslichen Zellkomponenten wurden sedimentiert (Eppendorf 5415 Zentrifuge, 14000 rpm, 5 min), und der Überstand wurde mit 1/5-Volumen (vol) 5 × SDS-Probenpuffer (1 × SDS-Probenpuffer: 50 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,001% Bromphenol-Blau) gemischt. Die Fraktion (Pellet) mit dem unlöslichen Zellrückstand wurde in 0,3 ml 1 × SDS-Probenpuffer enthaltend 6–8 M Harnstoff resuspendiert, die Proben wurden für 5 min bei 95°C inkubiert und wieder zentrifugiert. Anschließend wurden die Proteine durch SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (PAGE) aufgetrennt (Laemmli, U.K., 1970) und mit Coomassie Brilliant Blue R-Farbstoff gefärbt.
Das synthetisierte IFN-α2b-Protein war homogen und fand sich ausschließlich in der Fraktion mit dem unlöslichen Zellrückstand in Form von unlöslichen Proteinaggregaten, den sog. Einschlusskörpern (inclusion bodies, IBs). Die Expressionsausbeute war vergleichbar mit dem Ausmaß der Messgenauigkeit in allen Klonen/Zellen und betrug zwischen 30–50% bezogen auf das gesamte E.coli-Protein.
Beispiel 8
Untersuchung der Plasmidstabilität
Vor der Induktion der Zellen wurde eine Probe genommen (Beispiel 7) und ein Plasmidstabilitätstest wurde durchgeführt. Hierzu wurden die Proben direkt mit M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren verdünnt, und 300 μl jedes Verdünnungsschritts wurden auf einer nicht selektiven Agarplatte ausplattiert (M9-Minimalmedium, ergänzt mit 0,5% Casaminosäuren, 50 mg/ml Tryptophan and 20 mg/l Uracil). Anschließend wurden 400 einzelne Kolonien aus jedem Klon zunächst mit einem Zahnstocher auf einer geeigneten selektiven Agarplatte abgestrichen (M9-Minimalmedium enthaltend 0,5% Casaminosäuren oder M9-Minimalmedium ergänzt mit 0,5% Casaminosäuren, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/ml Uracil und 12,5 μg/ml Tetracyclin) und anschließend auf einer nicht selektiven Agarplatte (M9-Minimalmedium, ergänzt mit 0,5% Casaminosäuren, 50 mg/l Tryptophan und 20 mg/l Uracil). Die Anzahl von Plasmid enthaltenden Zellen wurde aus der Anzahl von Zellen bestimmt, welche eine Kolonie auf beiden Agarplatten bildeten. Zellen, welche auf der selektiven Agarplatte nicht wachsen, haben das Plasmid zur Komplementierung der Auxotrophie oder zur Bildung der Antibiotika-Resistenz (TET-Referenzplasmide) verloren. Vor der Induktion der Zellen betrug die Plasmidstabilität 100% für alle Kulturen, unabhängig von der Selektionsmethode und unabhängig vom Plasmidtyp.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Minimaler prokaryotischer Expressionsvektor, der mit dem Genom prokaryotischer Lebewesen nicht homolog rekombiniert werden kann, umfassend a) einen Replikationsursprung, b) ein eukaryotisches Auxotrophie-Markergen, c) einen Promotor, der in Prokaryoten funktionell aktiv ist, und d) ein zu exprimierendes Fremdgen, das sich unter der Kontrolle des Promotors befindet.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei das Auxotrophie-Markergen und das zu exprimierende Gen in entgegengesetzten Richtungen angeordnet sind und durch den gleichen Terminator terminiert sind.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Auxotrophie-Marker einen Tryptophan-, Leucin- oder Uracil-Mangel kompensiert.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Expressionsausbeute des Auxotrophie-Markergens 1% oder weniger des gesamten Proteins in der Wirtszelle ausmacht, wenn die Auxotrophie in der Wirtszelle komplementiert ist.
Prokaryotische Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Wirtszelle eine Mutation in einem chromosomalen Gen enthält, welches mit dem Auxotrophie-Markergen des Expressionsvektors korrespondiert, und das Ergebnis der Mutation ist, daß kein funktionelles Produkt des chromosomalen Wirtszellgens exprimiert werden kann.
Verfahren zur Konstruktion eines prokyrotischen Expressionssystems, wobei ein Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine prokaryotische Wirtszelle mit einer Mutation in einem chromosomalen Gen, welches durch das Auxotrophie-Markergen des Expressionsvektors komplementiert wird, eingebracht wird, und wobei das Ergebnis der chromosomalen Mutation ist, daß kein funktionelles Produkt des chromosomalen Wirtszellgens exprimiert werden kann.
Verfahren zur Produktion eines heterologen Proteins durch heterologe Expression eines Fremdgens in einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welcher in einer Wirtszelle nach Anspruch 5 enthalten ist, und Isolierung des Expressionsprodukts aus der Wirtszelle oder dem Überstand, wobei die Fermentierung der Wirtszelle in einem Minimalmedium oder einem synthetischen Komplettmedium durchgeführt wird.