KR20150009953A

KR20150009953A - 1→3 해독 프레임 이동의 감소 방법

Info

Publication number: KR20150009953A
Application number: KR1020147024094A
Authority: KR
Inventors: 아델베르트 그로스만; 프리데리케 헤쎄; 에르하드 코페츠키; 빌마 라우; 크리스티안 샨츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2015-01-27
Also published as: US20150064746A1; RU2014138583A; EP2820039A1; HK1199045A1; CA2863108A1; MX2014009979A; WO2013127752A1; JP2015508662A; CN104136460A

Abstract

본원에는, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하되, 이때 상기 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa, 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드의 재조합 제조 방법이 보고되어 있다.

Description

1→3 해독 프레임 이동의 감소 방법{METHOD FOR REDUCTION OF 1→3 READING FRAME SHIFTS}

본 발명은 재조합 폴리펩티드 제조 분야에 관한 것이다. 본원에는 감소된 부산물 함량하에 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 방법이 보고되어 있으며, 이때 부산물 함량의 감소는 번역 또는 전사 과정동안 프레임 이동을 감소시키는 암호화 핵산의 변형에 의해 달성된다.

단백질은 오늘날의 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 인간 용도에 있어서, 모든 약학 물질은 별개의 기준을 만족시켜야 한다. 인간에 대한 생물약제의 안전성을 보장하기 위해, 심각한 해를 야기하는 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질이 특히 제거되어야 한다. 조절 규정을 충족시키기 위해 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 이어져야 한다.

재조합 폴리펩티드는, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; 이. 콜라이)와 같은 원핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 재조합적으로 생성된 폴리펩티드는 원핵 세포의 폴리펩티드 함량의 대부분을 차지하며, 종종 불용성 응집체로서, 즉, 소위 봉입체(inclusion body)로서 원핵 세포 내에 침적된다. 재조합 폴리펩티드의 분리를 위해, 세포는 붕해되어야 하고, 봉입체에 함유된 재조합 폴리펩티드는 세포 파편들로부터 봉입체의 분리 후에 가용화되어야 한다. 가용화를 위해 우레아 또는 구아니디늄 클로라이드와 같은 카오트로픽(chaotropic) 시약을 사용한다. 다이설파이드 결합을 분리하기 위해, 특히 알칼리성 조건하에서 환원제, 예를 들면, 다이티오에리트리톨, 다이티오트레이톨 또는 β-머캅토에탄올을 첨가한다. 응집된 폴리펩티드의 가용화후에, 생물 활성에 필수적인 재조합 폴리펩티드의 구형 구조가 복구되어야 한다. 상기 소위 재생 과정동안 변성제의 농도는, 예를 들면, 적합한 완충액에 대해 투석시킴으로써 (서서히) 감소되어, 변성된 폴리펩티드가 그의 생물 활성 구조로 리폴딩되게 한다. 재생후에 재조합 폴리펩티드는 의도한 용도에 허용가능한 순도로 정제된다. 예를 들면, 치료용 단백질로 사용하기 위해 90%보다 높은 순도가 확립되어야 한다.

재조합적으로 생성된 폴리펩티드는 통상적으로 생성 세포로부터의 핵산, 내독소 및/또는 폴리펩티드가 동반된다. 숙주 세포 유래 부산물 이외에, 폴리펩티드-유래 부산물도 또한 조 폴리펩티드 제제에 존재한다. 특히, 해당 폴리펩티드의 단축 변이체가 존재할 수 있다.

WO 95/25786 호에는 세균 발현 시스템에서 인간 아포지단백질 A1의 생성이 보고되어 있다. 문헌 [Karathanasis, S.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6147-6151 (1983)]은 인간 아포지단백질 A-I 유전자의 분리 및 특성화를 보고하고 있다. 직접적인 상당한 수준의 프레임 이동이 이. 콜라이의 암호화 영역에서 빈번함이 문헌 [Gurvich, O.L., et al., EMBO Journal 22, 5941-5950 (2003)]에 보고되어 있다. 문헌 [Graversen, J.H., et al., J. Cardiovascular Pharmacology 51, 170-177 (2008)]은 아포지단백질 A-I의 3량체화가 혈장 청소를 지연시키고 항-아테롬성경화 성질을 보존하는 것으로 보고하고 있다.

트라이펩티드 QKK를 암호화하는 올리고뉴클레오티드는 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 번역 또는 전사 과정동안 1→3 프레임 이동 지점일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 프레임 이동의 발생으로 인해, 비-암호화된 아미노산 서열을 갖는 넌센스(nonsense) 폴리펩티드가 생성된다.

따라서, 본원에서는 한 양태로 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트라이펩티드 QKK(서열번호 6)를 포함하는 폴리펩티드의 재조합 제조 방법이 보고된다:

- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 생성하되, 이때 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

한 태양에서, 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 아미노산 서열에 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로서, 이때 상기 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 아미노산 서열에 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로서, 이때 상기 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 본원에 보고된 바와 같은 핵산을 포함하는 세포이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 이. 콜라이에서 발현될 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK를 암호화하기 위한, 상기 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 이. 콜라이에서 발현될 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK를 암호화하기 위한, 상기 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)의 용도이다.

하기에서, 본원에 보고된 바와 같은 모든 양태들의 태양을 상술한다.

한 태양에서, 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4)에 의해 암호화된다.

한 태양에서, 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

한 태양에서, (전장) 폴리펩티드는 약 50 내지 약 500개 아미노산 잔기를 포함한다. 한 태양에서, (전장) 폴리펩티드는 약 100 내지 약 400개 아미노산 잔기를 포함한다. 한 태양에서, (전장) 폴리펩티드는 약 250 내지 약 350개 아미노산 잔기를 포함한다.

한 태양에서, 세포는 원핵 세포이다. 한 태양에서, 원핵 세포는 이. 콜라이 세포 또는 바실러스 세포이다.

한 태양에서, 세포는 진핵 세포이다. 한 태양에서, 세포는 CHO 세포, 또는 HEK 세포, 또는 BHK 세포, 또는 NSO 세포, 또는 SP2/0 세포, 또는 효모 세포이다.

한 태양에서, 폴리펩티드는 헤테로-다량체 폴리펩티드이다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다.

한 태양에서, 폴리펩티드는 호모-다량체 폴리펩티드이다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 호모-이량체 또는 호모-삼량체이다.

한 태양에서, 폴리펩티드는 인간 아포지단백질 A-I, 또는 그의 변이체 또는 그를 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 이때 상기 변이체 또는 융합 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내에서 인간 아포지단백질 A-I의 기능을 나타낸다. 한 태양에서, 아포지단백질 A-I 변이체는 서열번호 9 내지 서열번호 14의 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

도 1은 상이한 해독 프레임이 상이한 아미노산 서열을 야기하며, 이때 1→3 프레임 이동이 결정된 C-말단 아미노산 서열을 갖는 단축 생성물(ΔMW = -14369 Da)을 야기함을 나타낸 것이다.
도 2는 1→3 프레임 이동 부산물의 생성에 관해 트라이펩티드 QKK를 암호화하는 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조물의 LC-MS 분석을 나타낸 것이다.

정의:

용어 "아미노산"은 직접적으로 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 암호화될 수 있는 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다. 개개 아미노산은 3개의 뉴클레오티드, 소위 코돈 또는 염기-3중체로 이루어진 핵산에 의해 암호화된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 암호화된다. 상이한 코돈에 의한 동일한 아미노산의 암호화는 "유전자 코드의 변성"으로 알려져 있다. 용어 "아미노산"은 천연 카복시 α-아미노산을 의미하며, 알라닌(3개 문자 코드: ala, 1개 문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함한다.

용어 "아포지단백질 A-I"은 단백질-지질 및 단백질-단백질 상호작용 특성을 갖는 양친매성, 나선형 폴리펩티드를 의미한다. 아포지단백질 A-I은 간 및 소장에 의해, 243개 아미노산 잔기를 갖는 성숙 폴리펩티드로 분열되는 프로-아포지단백질로서 분비되는 267개 아미노산 잔기의 프리프로-아포지단백질로서 합성된다. 아포지단백질 A-I은 종종 프롤린이면서 일부 경우에서는 여러 잔기들로 구성된 연장서열(stretch)로 이루어지는 링커 잔기에 의해 분리된 22개 아미노산 잔기들 각각으로 이루어진 6 내지 8개의 상이한 아미노산 반복서열로 이루어진다. 예시적인 인간 아포지단백질 A-I 아미노산 서열은 진펩트(GenPept) 데이터베이스 등록번호 NM_000039 또는 데이터베이스 등록번호 X00566; 진뱅크(GenBank) NP-000030.1(gi 4557321)에 보고되어 있다. 인간 아포지단백질 A-I(서열번호 7) 중에 천연 변이체, 예를 들면, P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D, D127N, K131의 결실, K131M, W132R, E133K, R151C(아미노산 잔기 151이 Arg에서 Cys로 변화됨, 아포지단백질 A-I-Paris), E160K, E163G, P167R, L168R, E171V, P189R, R197C(아미노산 잔기 173이 Arg에서 Cys로 변화됨, 아포지단백질 A-I-Milano) 및 E222K가 존재한다. 보존적 아미노산 변형을 갖는 변이체들도 또한 포함된다.

용어 "코돈"은 정의된 아미노산을 암호화하는 3개 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 유전자 코드의 축중(degeneracy)으로 인해 일부 아미노산은 하나보다 많은 코돈에 의해 암호화된다. 동일 아미노산을 암호화하는 이러한 상이한 코돈들은 개개 숙주 세포에서 상이한 상대적 사용 빈도를 갖는다. 따라서, 특정 아미노산이 일군의 상이한 코돈들에 의해 암호화될 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상이한 핵산들에 의해 암호화될 수 있다. 그러므로, 특정 아미노산이 일군의 상이한 코돈들에 의해 암호화될 수 있으며, 이때 상기 코돈들 각각은 해당 숙주 세포내에서 사용 빈도를 갖는다.

[표 1]

에스케리키아 콜라이 코돈 사용빈도(코돈/암호화된 아미노산/사용 빈도[%])

예시적 변화는 하기 표 2에 "예시적 치환"의 표제로 나타내었다. 보존적 치환은 하기 표 2에 "바람직한 치환"의 표제로 나타내었으며, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 더 기술되어 있다.

[표 2]

비-보존적 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

용어 "보존적 아미노산 변형"은 폴리펩티드의 특성에 영향을 미치거나 특성을 변화시키지 않는 아미노산 서열의 변형을 의미한다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들면, 부위-지향 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 변형을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류들이 당해 분야에 정의되어 있다. 상기 부류로는 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들이 포함된다.

용어 "폴리펩티드의 변이체"는 10개 이하, 한 태양에서는 약 2 내지 약 5개의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 분자를 말한다. 아미노산 서열 변형은 문헌 [Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1988); and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)]에 기술된 바와 같은 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.

상이한 아미노산 서열들의 상동성 및 동일성은 BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 또는 BLOSUM 90과 같은 공지된 알고리즘을 이용하여 계산할 수 있다. 한 태양에서, 알고리즘은 BLOSUM 30이다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.

용어 "핵산" 및 "핵산 서열"은 개개 뉴클레오티드(염기로도 불린다) 'a', 'c', 'g' 및 't'(또는 RNA에서 'u')로 이루어진 중합체 분자, 즉, DNA, RNA 또는 그의 변형을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 천연 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 합성 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 하나 이상의 천연 폴리뉴클레오티드 분자와 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 조합일 수 있다. 상기 정의에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 변화(예를 들면, 돌연변이유발에 의해)되거나, 결실되거나 또는 부가된 천연 폴리뉴클레오티드 분자도 포함된다. 핵산은 분리되거나, 또는 또 다른 핵산, 예를 들면, 발현 카세트, 플라스미드 또는 숙주 세포의 염색체 중에 통합될 수 있다. 핵산은 개개 뉴클레오티드로 이루어진 그의 핵산 서열에 의해 규정된다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 10개 이하의 뉴클레오티드(염기로도 불린다) 'a', 'c', 'g' 및 't'(또는 RNA에서 'u')로 이루어진 중합체 분자를 의미한다.

당해 분야에 숙련된 자에게, 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 상기 아미노산 서열을 암호화하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키기 위한 절차 및 방법은 공지되어 있다. 그러므로, 핵산은 개개 뉴클레오티드로 이루어진 그의 핵산 서열에 의해서 및 마찬가지로 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 규정된다.

참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 " 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 창시되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 파일링되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:

100 x 분수 X/Y

상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.

용어 "재조합 폴리펩티드" 및 "재조합적으로 생성된 폴리펩티드"는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 또는 생성된 폴리펩티드, 예를 들면, 이. 콜라이, NS0, BHK 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다.

용어 "치환하는"은 치환/변화된 핵산을 수득하기 위한 모 핵산중 하나의 특정 뉴클레오티드의 변화를 의미한다.

본원에 보고된 바와 같은 방법:

본 발명을 수행하는데 유용한, 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 방법 및 기술은, 예를 들면, 문헌 [Ausubel, F.M.(ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III, John Wiley and Sons, Inc., New York (1997); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호에 기술되어 있다.

각 유기체에 있어서, 정의된 아미노산을 암호화하기 위한 코돈의 특징적인(개별적) 사용빈도가 주어질 수 있다. 예를 들면, 아미노산 글루타민(1개 문자 코드로 Q)은 2개의 상이한 코돈, 즉 cag 및 caa에 의해(유전자 코드의 축중으로 인해) 암호화될 수 있다. 인간에서, 2개의 글루타민 코돈은 각각 74% 및 26%의 사용 빈도를 갖는다. 이. 콜라이에서, 상기 사용 빈도는 필적할 만하다, 즉 각각 82% 및 18%이다. 아미노산 라이신(K)은 또한 2개의 상이한 코돈, 즉 aag 및 aaa에 의해 암호화될 수 있다. 인간에서, 상기 2개의 상이한 라이신 암호화 코돈은 각각 59% 및 41%의 사용 빈도를 갖는 반면, 이. 콜라이에서 2개의 상이한 라이신 암호화 코돈은 각각 20% 및 80%의 동등하지 않은 사용 빈도를 갖는다. 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 포함된 트라이펩티드 QKK를 암호화하는 올리고뉴클레오티드는 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사 또는 번역 과정 동안 1→3 프레임 이동(돌연변이) 지점일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 프레임 이동의 발생으로 인해, 비-암호화 아미노산 서열, 십중팔구 넌센스 또는 단축 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 생성된다.

보다 상세하게, 트라이펩티드 QKK를 암호화하고 더 큰, 즉, 50개 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 암호화 핵산에 포함되는 올리고뉴클레오티드에 따라서, 올리고뉴클레오티드의 전사 또는 번역 과정시 1→3 프레임 이동이 상이한 빈도하에 일어난다. 프레임 이동의 빈도는 개개 코돈들의 조합에 따라 달라진다(하기 표 3 참조).

[표 3]

이. 콜라이에서 트라이펩티드 QKK가 핵산 caa aaa aag 및 caa aag aag에 의해 암호화되는 경우 1→3 프레임 이동이 일어남을 볼 수 있다. 현재 놀랍게도 상기 프레임 이동이 핵산 서열 cag aag aag(서열번호 3), 또는 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 cag aaa aaa(서열번호 5)를 사용함으로써 방지될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 전장 폴리펩티드의 발현 수율은 폴리펩티드중 트라이펩티드 QKK를 암호화하기 위해 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 핵산을 사용함으로써 개선될 수 있다(마찬가지로 비-전장 폴리펩티드 부산물의 생성이 감소될 수 있다).

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이. 콜라이에서 트라이펩티드 QKK(서열번호 6)를 포함하는 (전장) 폴리펩티드의 재조합 제조 방법이다:

- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 생성하되, 이때 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

한 태양에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하고,

- 상기 세포를 배양하고(폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서),

- 폴리펩티드를 세포 또는 배양 배지로부터 회수하고,

- 임의적으로, 생성된 폴리펩티드를 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 정제한다.

한 태양에서, 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 포함하는 폴리펩티드 암호화 핵산은, 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag(서열번호 1) 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2) 중 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 치환시켜 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 수득함으로써 수득된다.

한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 1 내지 5개의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제된다. 한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 2 내지 4개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다. 한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 3개 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다.

일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z.(ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); or Ausubel, F.M., et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)]을 참조하시오).

본원에 보고된 바와 같은 항 양태는 그 아미노산 서열에 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로, 이때 상기 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)에 의해 암호화된다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK를 암호화하기 위한 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 이. 콜라이에서 트라이펩티드 QKK를 포함하는 (전장) 폴리펩티드의 재조합 제조시 부산물 생성을 감소시키는 방법이다:

- 폴리펩티드 암호화 핵산 중에서 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag(서열번호 1) 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2) 중 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 치환시켜 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 수득함으로써 치환된 폴리펩티드 암호화 핵산을 수득하고,

- 폴리펩티드를 암호화하는 치환된 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드의 재조합 제조시 부산물 생성을 감소시킨다.

- 폴리펩티드 암호화 핵산 중에서 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag(서열번호 1) 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2) 중 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 치환시켜 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 수득함으로써 치환된 폴리펩티드 암호화 핵산을 수득하고,

본원에 보고된 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 이. 콜라이에서 트라이펩티드 QKK를 포함하는 재조합적으로 생성된 (전장) 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법이다:

- 폴리펩티드를 암호화하는 치환된 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드의 발현을 증가시킨다.

- 폴리펩티드 암호화 핵산 중에서 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag(서열번호 1) 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2) 또는 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3) 중 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 치환시켜 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4), 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 수득함으로써 치환된 폴리펩티드 암호화 핵산을 수득하고,

개별적 이전 양태들의 각각의 한 태양에서, 상기 방법은 하기의 추가 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

- 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 암호화 핵산을 제공하고/하거나,

- 폴리펩티드를 암호화하는 치환된 핵산으로 세포를 형질감염시키고/시키거나,

- 치환된 핵산으로 형질감염된 세포를 배양(폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서)하고/하거나,

- 폴리펩티드를 세포 또는 배양 배지로부터 회수하고/하거나.

- 임의적으로, 생성된 폴리펩티드를 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제한다.

한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 1 내지 5개의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제된다. 한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 2 내지 4개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다. 한 태양에서, 생성된 폴리펩티드는 3개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다.

본원에 보고된 바와 같은 방법은 하기에서 원핵 세포에서 생성된 재조합 폴리펩티드, 즉, 이. 콜라이에서 생성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드를 사용하여 예시된다.

테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 (N- 에서 C-말단 방향으로) 인간 테트라넥틴 3량체화 구조 요소 및 야생형 인간 아포지단백질 A-I을 포함한다. 인간 테트라넥틴 3량체화 구조 요소의 아미노산 서열은 처음 9개 아미노산만큼 단축될 수 있으므로, 천연적인 절두(truncation) 부위인 위치 10의 이소류신 잔기에서 시작된다. 상기 절두의 결과로서, 위치 4의 트레오닌 잔기에서의 O-글리코실화 부위가 결실되었다. 테트라넥틴 3량체화 구조 요소와 인간 아포지단백질 A-I 사이에, 5개의 아미노산 잔기 SLKGS(서열번호 8)가 제거되었다.

개선된 발현 및 정제를 위해, N-말단 정제 태그, 예를 들면, 헥사히스티딘-태그, 및 정제 태그의 제거를 위한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조물을 제조할 수 있다. 한 태양에서, 프로테아제는 IgA 프로테아제이고, 프로테아제 절단 부위는 IgA 프로테아제 절단 부위이다. 프로테아제의 특이적 절단의 결과로서, 프로테아제 절단 부위의 일부 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 N-말단에서 유지된다, 즉, IgA 프로테아제 절단 부위의 경우에, 2개의 아미노산 잔기 - 첫번째로서 알라닌 또는 글리신 또는 세린 또는 트레오닌 및 두번째로서 프롤린 -가 폴리펩티드, 예를 들면, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드의 N-말단에서 유지된다.

테트라넥틴 3량체화 구조 요소는, 개개의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체들 각각의 사이에서 비-공유적 상호작용에 의해 구성되는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 호모-3량체의 생성을 가능하게 하는 도메인을 제공한다.

한 태양에서, 아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체이다.

한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 발현 및 정제 태그를 포함하고, 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 9).

한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(IVN)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 10).

따라서, 바람직한 한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(PIVN)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 11).

한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(XPIVN)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 12).

따라서, 한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(APIVN)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 13).

한 태양에서, 헥사-히스티딘-태그를 포함하는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(XIVN)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:

(서열번호 14);

상기에서, X는 하기의 아미노산 서열들 중 임의의 서열일 수 있다:

폴리펩티드가 이. 콜라이 균주에서 재조합적으로 생성되는 경우, N-말단 메티오닌 잔기는 통상적으로 이. 콜라이 프로테아제에 의해 효과적으로 절단되지 않음을 주지해야 한다. 따라서, N-말단 메티오닌 잔기는 생성된 폴리펩티드에 부분적으로 존재한다.

서열번호 9의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 이. 콜라이에서 재조합적으로 생성되었다. 주요 부산물(전체 단백질의 약 10%)이 검출될 수 있다.

Lys-C 펩티드 지도작성(LC-ESI-MS/MS) 및 하향식(top-down) MS에 의해, 아미노산 잔기 1 내지 148(라이신)의 N-말단 아미노산 서열이 정확함(서열번호 13으로 나타낸 바와 같이)이 확인하였다. 단축 부산물의 C-말단 아미노산 서열은 VARRNGTVQTES(서열번호 53)이었다. 목표 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드의 서열로부터의 이탈은 트라이펩티드 QKK에서 시작되었다. C-말단 아미노산 서열의 변화는 번역 또는 전사 과정동안 해독 프레임의 1→3 프레임 이동에 기인하였다(도 1 참조).

트라이펩티드 QKK를 암호화하는 올리고뉴클레오티드의 상이한 변이체들을 시험하였다. 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2)는 심지어 단축 부산물의 양을 30%로 더 증가시킨 것으로 밝혀졌다. 그와 반대로, 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3), caa aag aaa(서열번호 4) 및 cag aaa aaa(서열번호 5)를 사용함으로써 단축 부산물의 생성이 이용된 LC-MS 방법의 검출 한계 미만으로 감소될 수 있었다(도 2 참조).

하기의 실시예, 서열표 및 도면은, 그 진정한 범위를 첨부된 특허청구범위에 나타낸 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의에서 벗어나지 않고 나타낸 절차들에 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

서열표

서열번호 1 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag.

서열번호 2 올리고뉴클레오티드 caa aag aag.

서열번호 3 올리고뉴클레오티드 cag aag aag.

서열번호 4 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa.

서열번호 5 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa.

서열번호 6 트라이펩티드 QKK.

서열번호 7 인간 아포지단백질 A-I.

서열번호 8 제거된 SLKGS 폴리펩티드.

서열번호 9 발현 및 정제 태그를 포함하는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드.

서열번호 10 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(IVN).

서열번호 11 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(PIVN).

서열번호 12 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(XPIVN).

서열번호 13 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(APIVN).

서열번호 14 헥사-히스티딘-태그를 포함하는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드(XIVN).

서열번호 15 내지 52 링커 폴리펩티드.

서열번호 53 주요 부산물의 C-말단 아미노산 서열.

서열번호 54 인터페론 단편.

서열번호 55 헥사-히스티딘 태그.

서열번호 56 IgA 프로테아제 절단 부위.

재료 및 방법

단백질 측정:

단백질 농도는 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰흡광계수를 이용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.

재조합 DNA 기술:

문헌 [Sambrook, J., et at., Moclecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.

실시예 1

이. 콜라이 발현 플라스미드의 제조 및 설명

테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드를 재조합 방법에 의해 제조하였다. 발현된 융합 폴리펩티드의 N- 에서 C-말단 방향으로의 아미노산 서열은 다음과 같다:

- 아미노산 메티오닌(M),

- CDLPQTHSL(서열번호 54)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편,

- GS 링커,

- HHHHHH(서열번호 55)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,

- GS 링커,

- VVAPPAP(서열번호 56)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위, 및

- 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I.

전술한 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 IgA 프로테아제를 사용하여 시험관내에서 효소적 절단에 의해 그로부터 최종 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드가 방출된 전구체 폴리펩티드이다.

전구체 폴리펩티드 암호화 융합 유전자를 공지된 재조합 방법 및 기술을 사용하여 적절한 핵산 절편들의 연결에 의해 구성하였다. 화학 합성에 의해 제조된 핵산 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 서열번호 9의 융합 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 10의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드의 생성을 위한 발현 플라스미드는 다음과 같이 제조하였다.

이. 콜라이 발현 플라스미드의 제조:

플라스미드 4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 이. 콜라이에서 코어-스트렙타비딘의 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 플라스미드 1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-반복서열; EP-B 1 422 237 호에 보고됨)로부터 유도된 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-벡터 단편을 435 bp 길이의 코어-스트렙타비딘 암호화 EcoRI/CelII-단편과 접합시켜 제조되었다.

코어-스트렙타비딘 이. 콜라이 발현 플라스미드는 하기 요소들을 포함한다:

- 이. 콜라이에서의 복제를 위한 벡터 pBR322로부터의 복제 기점(문헌 [Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43, 77-90 (1979)]에 따르면 bp 위치 2517-3160에 상응),

- 이. 콜라이 pyrF 돌연변이 균주(우라실 영양요구성)의 상보성에 의한 플라스미드 선택을 가능하게 하는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 URA3 유전자[Rose, M. et al., Gene 29, 113-124 (1984)],

- 다음을 포함하는 코어-스트렙타비딘 발현 카세트: - 문헌 [Stueber, D., et al. Immunol. Methods IV, 121-152 (1990)]에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터(문헌 [Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155, 416-433 (1987) and Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990)]에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터); - 코어-스트렙타비딘 유전자; - 2개의 박테리오파지-유래 전사 종결인자, λ-T0 종결인자[Schwarz, E., et al., Nature 272, 410-414 (1978)] 및 fd-종결인자[Beck, E. and Zink, B., Gene 1-3, 35-58 (1981)],

- 이. 콜라이로부터의 lacI 억제 유전자[Farabaugh, P.J., Nature 274, 765-769 (1978)].

단일 측면인접(flanking) EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 이용하여 벡터 4980으로부터 코어-스트렙타비딘 구조 유전자를 절제하고 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 측면인접한 EcoRI/CelII 제한효소 부위를 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-4980 벡터 단편 내에 삽입시킴으로써 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 폴리펩티드의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드를 제조하였다.

실시예 2

테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I의 발현

융합 단백질의 발현을 위해 이. 콜라이 영양요구성(PyrF)의 상보성에 의해 무항생물질 플라스미드 선택을 가능하게 하는 이. 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(EP 0 972 838 호 및 US 6,291,245 호 참조).

이. 콜라이 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를 전기천공에 의해 발현 플라스미드 p(IFN-His6-IgA-테트라넥틴-아포지단백질 A-I)로 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이 세포는 먼저 37 ℃에서 아가 플레이트 상에서 성장시켰다.

발효 프로토콜 1:

예비-발효를 위해, 약 1 g/l L-류신, 약 1 g/l L-프롤린 및 약 1 mg/l 티아민-HCl로 보충된, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.

예비-발효를 위해, 배플을 갖는 1000 ml 엘렌메이어(Erlenmeyer)-플라스크 중의 300 ml의 M9-배지에 1차 종자 은행 앰플중 2 ml를 접종하였다. 1 내지 3의 광학 밀도(578 nm)가 수득될 때까지 37 ℃에서 13 시간동안 회전 교반기 상에서 배양을 수행하였다.

발효를 위해 문헌 [Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20, 17-27 (1991)]에 따른 배치 배지를 사용하였다: 27.6 g/l 글루코스*H₂O, 13.3 g/l KH₂PO₄, 4.0 g/l (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/l 시트레이트, 1.2 g/l MgSO₄*7H₂O, 60 mg/l 철(III)시트레이트, 2.5 mg/l CoCl₂*6H₂O, 15 mg/l MnCl₂*4H₂O, 1.5 mg/l CuCl₂*2H₂O, 3 mg/l H₃BO₃, 2.5 mg/l Na₂MoO₄*2H₂O, 8 mg/l Zn(CH₃COO)₂*2H₂O, 8.4 mg/l 티트리플렉스(Titriplex) III, 1.3 ml/l 신페로닉(Synperonic) 10% 소포제. 배치 배지는 5.4 mg/l 티아민-HCl 및 1.2 g/l L-류신 및 L-프롤린 각각으로 보충하였다. 공급물 1 용액은 19.7 g/l MgSO₄*7H₂O로 보충된 700 g/l 글루코스를 함유하였다. pH 조절을 위한 알칼리성 용액은 50 g/l L-류신 및 50 g/l L-프롤린 각각으로 보충된 12.5%(w/v) NH₃ 수용액이었다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해시켰다.

발효는 10 l 바이오스타트(Biostat) C DCU3 발효조(사토리우스(Sartorius), 독일 멜중엔)에서 수행하였다. 6.4 l 멸균 발효 배치 배지와 예비-발효로부터의 300 ml 접종원으로부터 시작하여, 37 ℃, pH 6.9 ± 0.2, 500 밀리바 및 10 l/분의 통기율에서 배치 발효를 수행하였다. 초기 보충된 글루코스가 고갈된 후, 온도를 28 ℃로 변경하였으며, 발효는 유가식으로 시작되었다. 이때, 용존 산소량의 상대값(pO₂)은, 일정하게 증가하는 교반기 속도(10 시간 이내에 550 rpm에서 1000 rpm으로 및 16 시간 이내에 1000 rpm에서 1400 rpm으로) 및 통기율(10 시간내에 10 l/분에서 16 l/분으로 및 5 시간내에 16 l/분에서 20 l/분으로) 하에 공급물 1을 첨가함으로써 50%에서 유지시켰다(DO-스타트, 예를 들면, 문헌 [Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2, 79-85 (1987)] 참조). 약 8 시간 배양 후에 pH가 조절 하한치(6.70)에 이르렀을 때, 알칼리성 용액의 첨가로부터 추가 아미노산의 공급이 비롯되었다. 재조합 치료 단백질의 발현은 70의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.

발효 말기에, 발효조중 전체 배양액을 수거전 1 또는 2 시간동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계하에(예를 들면, EP-B 1 486 571 호 참조), 세포질 및 가용성 발현된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I이 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체로 전환되었다. 그 후에, 발효조의 내용물을 관류(flow-through) 원심분리기(13,000 rpm, 13 l/h)로 원심분리시키고, 수거된 바이오매스를 추가 처리까지 -20 ℃에서 저장하였다. 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 단백질은 오직 불용성 세포 파편 분획중에서만 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 발견되었다.

발효조로부터 취한 샘플들, 곧 단백질 발현 유도 전에 하나 및 단백질 발현 유도후 정해진 시점들에서 나머지 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD_Target = 5)를 5 ml PBS 완충액에 재현탁하고 얼음위에서 초음파처리에 의해 파괴시켰다. 이어서, 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리(15,000 rpm, 5 분)하고, 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮겼다. 이것은 가용성 및 불용성 발현 목표 단백질을 구분하기 위한 것이다. 각각의 상등액(= 가용성) 분획에 SDS 샘플 완충액[Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)] 300 ㎕ 및 각각의 펠릿(= 불용성) 분획에 상기 완충액 400 ㎕를 가하였다. 샘플을 교반하에 95 ℃에서 15 분동안 가열하여 샘플중 모든 단백질을 가용화시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 5 ㎕의 각 샘플을 4 내지 20% TGX 크리테리온 스테인 프리(Criterion Stain Free) 폴리아크릴아미드 겔(바이오-래드(Bio-Rad))로 옮겼다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준물(프리시젼 플러스 프로테인 스탠다드(Precision Plus Protein Standard), 바이오-래드) 및 3개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의, 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 알고 있는 정량화 표준물을 겔 위에 배치시켰다.

전기영동은 200 V에서 60 분간 실행한 후, 겔을 GelDOC EZ 이미저(Imager)(바이오-래드)로 옮기고 UV 조사하에 5 분간 처리하였다. 겔 영상은 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 이용하여 분석하였다. 3개의 표준물을 사용하여 선형 회귀 곡선을 0.99 초과의 계수하에 산출하고 그로부터 원래 샘플중 목표 단백질의 농도를 산출하였다.

발효 프로토콜 2:

예비-발효를 위해, 약 1 g/l L-류신, 약 1 g/l L-프롤린 및 약 1 mg/l 티아민-HCl로 보충된, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.

예비-발효를 위해, 배플을 갖는 1000 ml 엘렌메이어-플라스크 중의 300 ml의 변형 M9-배지에 아가 플레이트로부터 또는 1차 종자 은행 앰플중 1 내지 2 ml로 접종하였다. 1 내지 3의 광학 밀도(578 nm)가 수득될 때까지 37 ℃에서 13 시간동안 회전 교반기 상에서 배양을 수행하였다.

발효 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 고수율 발현을 위해 하기의 배치 배지 및 공급물을 사용하였다: 8.85 g/l 글루코스, 63.5 g/l 효모 추출물, 2.2 g/l NH₄Cl, 1.94 g/l L-류신, 2.91 g/l L-프롤린, 0.74 g/l L-메티오닌, 17.3 g/l KH₂PO₄*H₂O, 2.02 g/l MgSO₄*7H₂O, 25.8 mg/l 티아민-HCl, 1.0 ml/l 신페로닉 10% 소포제. 공급물 1 용액은 1.67 g/l L-메티오닌 및 5 g/l L-류신 및 L-프롤린 각각으로 보충된 333 g/l 효모 추출물 및 333 g/l 85%-글리세롤을 함유하였다. 공급물 2는 600 g/l L-프롤린의 용액이었다. pH 조절을 위한 알칼리성 용액은 10%(w/v) KOH 용액이었으며, 산으로서 75% 글루코스 용액을 사용하였다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해시켰다.

발효는 10 l 바이오스타트 C DCU3 발효조(사토리우스, 독일 멜중엔)에서 수행하였다. 5.15 l 멸균 발효 배치 배지와 예비-발효로부터의 300 ml 접종원으로부터 시작하여, 25 ℃, pH 6.7 ± 0.2, 300 밀리바 및 10 l/분의 통기율에서 유가식 발효를 수행하였다. 초기 보충된 글루코스가 고갈되기 전에 배양물은 15의 광학 밀도(578 nm)에 도달했으며, 공급물 1을 70 g/h로 공급하기 시작했을 때 발효는 유가식으로 시작되었다. 배양물중 글루코스 농도를 모니터링했을 때, 공급물 1은 글루코스 축적은 피하면서 pH를 6.9의 조절 상한치 부근으로 유지하면서 최대 150 g/h로 증가되었다. 50의 광학 밀도(578 nm)에서 공급물 2를 10 ml/h의 일정한 공급률로 공급하기 시작하였다. 용존 산소량의 상대값(pO₂)은, 동시에 증가하는 교반기 속도(500 rpm에서 1500 rpm으로), 통기율(10 l/분에서 20 l/분으로) 및 압력(300 밀리바에서 500 밀리바로)에 의해 50%보다 높게 유지되었다. 재조합 치료 단백질의 발현은 90의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.

발효조로부터 취한 7개의 샘플, 곧 단백질 발현 유도 전에 하나 및 단백질 발현 유도후 정해진 시점들에서 나머지 샘플들을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD_Target = 5)를 5 ml PBS 완충액에 재현탁하고 얼음위에서 초음파처리에 의해 파괴시켰다. 이어서, 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리(15,000 rpm, 5 분)하고, 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮겼다. 이것은 가용성 및 불용성 발현 목표 단백질을 구분하기 위한 것이다. 각각의 상등액(= 가용성) 분획에 SDS 샘플 완충액[Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)] 300 ㎕ 및 각각의 펠릿(= 불용성) 분획에 상기 완충액 200 ㎕를 가하였다. 샘플을 교반하에 95 ℃에서 15 분동안 가열하여 샘플중 모든 단백질을 가용화시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 5 ㎕의 각 샘플을 10% 비스-트리스(Bis-Tris) 폴리아크릴아미드 겔(노바겐(Novagen))로 옮겼다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준물(프리시젼 플러스 프로테인 스탠다드, 바이오-래드) 및 3개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의, 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 알고 있는 정량화 표준물을 겔 위에 배치시켰다.

전기영동은 200 V에서 35 분간 실행한 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염료로 염색하고, 온수로 탈염색시키고 디지털화를 위해 광학밀도 측정기(GS710, 바이오-래드)로 옮겼다. 겔 영상은 퀀티티 원(Quantity One) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 이용하여 분석하였다. 3개의 표준물을 사용하여 선형 회귀 곡선을 0.98 초과의 계수하에 산출하고 그로부터 원래 샘플중 목표 단백질의 농도를 산출하였다.

발효 말기에, 발효조중 전체 배양액을 수거전 1 또는 2 시간동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계하에(예를 들면, EP-B 1 486 571 호 참조), 세포질 및 가용성의 발현된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I이 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)로 전환되었다. 가열 단계 후에, 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 단백질은 오직 불용성 세포 파편 분획중에서만 IB의 형태로 발견되었다.

발효조의 내용물을 4 내지 8 ℃로 냉각시키고, 관류 원심분리기(13,000 rpm, 13 l/h)로 원심분리시키고, 수거된 바이오매스를 추가 처리까지 -20 ℃에서 저장하였다. 전체 수거된 바이오매스 수율은 발현된 구조물에 따라서 39 내지 90 g/l의 범위였다.

실시예 3

테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I의 제조

봉입체 제조는 인산칼륨 완충액(0.1 M, 1 mM MgSO₄로 보충, pH 6.5)에 수거된 세균 세포를 재현탁시켜 수행하였다. DNAse 첨가후에, 세포를 900 바의 압력에서 균질화시켜 파괴하였다. 1.5 M NaCl을 포함하는 완충액을 균질화된 세포 현탁액에 첨가하였다. pH 값을 25%(w/v) HCl로 5.0으로 조정한 후, 추가의 원심분리 단계후에 최종 봉입체 슬러리를 수득하였다. 상기 슬러리는 추가 처리까지 -20 ℃에서 1회용 멸균 비닐 봉지에 저장하였다.

7 g의 봉입체를 140 ml의 가용화 완충액(8 M 구아니디늄 클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8)에 밤새 가용화시켰다. 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후에, 완충액을 정용여과(diafiltration)에 의해 SG 하이드로사트(Hydrosart) 10 kDa 막(사토리우스 스테딤(Sartorius Stedim))을 이용하여 7.2 M 구아니디늄 클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8.0으로 바꾸었다. 50 mM 트리스, pH 8.0을 첨가하여 용액을 2 M 구아니디늄 클로라이드로 희석시켰다. 원심분리후, 가용화 단백질을 2 M 구아니디늄 클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8.0에서 평형화시킨 IMAC(Zn² ⁺ 부하된 프락토겔(Fractogel, 등록상표) EMD 켈랏(Chelat), 메르크 케미칼스(Merck Chemicals)) 상에 부하시켰다. 기준치에 도달한 후, 컬럼을 20% 에틸렌 글리콜, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌으로 세척한 후, 1 M 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8.0으로 재평형화시켰다.

온-컬럼(on-column) IgA 프로테아제 절단은 1 M 트리스, pH 8.0 중에서 IgA 프로테아제를 사용하여 밤새 수행하였다(IgA 프로테아제:단백질 = 1:100 w/w). 절단된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드를 컬럼 밖에서 1 M 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8로 세척하였다. 7.5 M 우레아, 20 mM 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8.0으로의 완충액 교환은 정용여과에 의해 달성하였다. 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 동일 완충액에서 평형화시킨 Q-세파로스(등록상표) 패스트 플로우(GE 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 컬럼을 7.5 M 우레아, 20 mM 트리스, pH 8.0으로 세척한 후, 평형 완충액 중에서 75 mM NaCl까지 염 구배시켰다. 융합 폴리펩티드가 용출되기 시작하자마자, 염 농도를 10개 컬럼 부피에 대해 일정하게 유지시켰다. 그 후에, 염 구배를 지속하고, 추가의 용출 단계는 동일 완충액에서 250 mM 및 500 mM NaCl을 사용하여 수행하였다. 수거된 분획들을 7.2 M 구아니디늄 클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌, pH 8.0에 대해 투석시키고, 4 ℃에서 유지시켰다.

실시예 4

테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드의 분석

IMAC(Zn² ⁺ 부하된 프락토겔(등록상표) EMD 켈랏) 및 Q-세파로스(등록상표) 정제 컬럼으로부터의 취합물 또는 분획들을 탈염시키고 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)으로 분석하였다.

탈염은 하우스에 세파덱스 G25 슈퍼파인(Sephadex G25 Superfine) 물질(아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience) 17-0851-01)로 패킹된 HR5/20 컬럼(0.7 x 22 cm, 아머샴 바이오사이언스)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피, 및 1 ml/분의 유량하에 40% 아세토니트릴, 2% 폼산을 사용한 등용매 용출에 의해 오프라인으로 수행하였다. 신호는 280 nm의 파장에서 모니터링하였으며, 용출되는 테트라넥틴-아포지단백질 융합 폴리펩티드 피크는 수동으로 취합하였다.

단편의 존재를 모니터링하기 위한 ESI-MS는 50의 디클러스터링(declustering) 전위 및 200의 집속 전위를 이용하여 트리버사 나노메이트(Triversa NanoMate) 광원 시스템(애드비온(Advion), 미국 이타카)이 장착된 Q-스타 엘리트(Q-Star Elite) QTOF 질량 분석계(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(ABI), 독일 다름스타트) 상에서 수행하였다. 5초당 15 스캔을 700 내지 2000의 m/z 범위에서 기록하였다.

ESI-MS 데이터는 2개의 소프트웨어 패키지, 애널리스트(Analyst)(어플라이드 바이오시스템즈(ABI), 독일 다름스타트) 및 매스어낼라이저(MassAnalyzer)(내부 개발된 소프트웨어 플랫폼)를 사용하여 분석하였다. 질량 스펙트럼은 각각의 QKK 트라이펩티드 암호화 올리고뉴클레오티드에서의 프레임 이동으로부터 야기된 단백질 단편의 분자 질량(전장 융합 폴리펩티드의 예상 분자 질량에 비해 -14369 Da의 델타)을 갖는 신호의 존재에 대해 수동으로 검사하였다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for reduction of 1->3 reading frame shifts <130> 30894 WO <140> PCT/EP2013/053753 <141> 2013-02-26 <150> EP12157513.8 <151> 2012-02-29 <150> EP12162814.3 <151> 2012-04-02 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide encoding oligonucleotide 1 <400> 1 caaaaaaag 9 <210> 2 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide encoding oligonucleotide 2 <400> 2 caaaagaag 9 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide encoding oligonucleotide 3 <400> 3 cagaagaag 9 <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide encoding oligonucleotide 4 <400> 4 caaaagaaa 9 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide encoding oligonucleotide 5 <400> 5 cagaaaaaa 9 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QKK tripeptide <400> 6 Gln Lys Lys 1 <210> 7 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 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Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu 100 105 110 Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu 115 120 125 Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu 130 135 140 Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys 145 150 155 160 Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu 165 170 175 Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu 180 185 190 Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser 195 200 205 Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala 210 215 220 Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala 245 250 255 Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys 260 265 270 Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu 275 280 285 Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys 290 295 300 Lys Leu Asn Thr Gln 305 <210> 10 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide (IVN) <400> 10 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 35 40 45 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 50 55 60 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 65 70 75 80 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 85 90 95 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 100 105 110 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 130 135 140 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 165 170 175 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 180 185 190 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 195 200 205 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 210 215 220 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 245 250 255 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 260 265 270 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 <210> 11 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide (PIVN) <400> 11 Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu 1 5 10 15 Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu 20 25 30 Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro 35 40 45 Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys 50 55 60 Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly 65 70 75 80 Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser 85 90 95 Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe 100 105 110 Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser 115 120 125 Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp 130 135 140 Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val 145 150 155 160 Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His 165 170 175 Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg 180 185 190 Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser 195 200 205 Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu 210 215 220 Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His 225 230 235 240 Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg 245 250 255 Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser 260 265 270 Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 <210> 12 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (XPIVN) <220> <221> MISC_FEATURE <223> X = G or S or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Xaa Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 13 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide (APIVN) <400> 13 Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 14 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetranectin-apolipoprotein A-I fusion polypeptide (XPIVN) with hexa-histidine-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = any one of AP, GP, SP, PP, GSAP, GSGP, GSSP, GSPP, GGGS, GGGGS, GGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGSGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGSAP, GGGSGP, GGGSSP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = any one of GGGSPP, GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGSGGGSAP, GGGSGGGSGP, GGGSGGGSSP, GGGSGGGSPP, GGGSGGGSGGGSAP, GGGSGGGSGGGSGP, GGGSGGGSGGGSSP, GGGSGGGSGGGSPP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = any one of GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSSP, GGGGSGGGGSPP, GGGGSGGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSGGGGSSP, and GGGGSGGGGSGGGGSPP. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 14 His His His His His His Xaa Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val 1 5 10 15 Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala 20 25 30 Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp 35 40 45 Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 50 55 60 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 65 70 75 80 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 85 90 95 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 100 105 110 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 115 120 125 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 130 135 140 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 145 150 155 160 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 165 170 175 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 180 185 190 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 195 200 205 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 210 215 220 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 225 230 235 240 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 245 250 255 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 260 265 270 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 275 280 285 Thr Gln 290 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 15 Gly Ser Ala Pro 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 16 Gly Ser Gly Pro 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 17 Gly Ser Ser Pro 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 4 <400> 18 Gly Ser Pro Pro 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 19 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 6 <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 7 <400> 21 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 8 <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 9 <400> 23 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 10 <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 11 <400> 25 Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 12 <400> 26 Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 13 <400> 27 Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 14 <400> 28 Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 15 <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 16 <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 17 <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 18 <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 19 <400> 33 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 20 <400> 34 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 21 <400> 35 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 22 <400> 36 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 23 <400> 37 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 24 <400> 38 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 25 <400> 39 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 26 <400> 40 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 27 <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 28 <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 29 <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 30 <400> 44 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 31 <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 32 <400> 46 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 33 <400> 47 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 34 <400> 48 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 35 <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 36 <400> 50 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 37 <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Pro <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 38 <400> 52 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Pro <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal amino acid sequence of the shortened by-product <400> 53 Val Ala Arg Arg Asn Gly Thr Val Gln Thr Glu Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human interferone fragment <400> 54 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hexa-histidine tag <400> 55 His His His His His His 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 56 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 1 5

Claims

하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이. 콜라이 세포에서 트라이펩티드 QKK를 포함하는 (전장) 폴리펩티드의 재조합 제조 방법:
- 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이. 콜라이 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 폴리펩티드를 생성하되, 이때 폴리펩티드에 포함된 트라이펩티드 QKK는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa에 의해 암호화되는 단계.
하기 단계를 포함하는, 이. 콜라이에서 트라이펩티드 QKK를 포함하는 전장 폴리펩티드의 재조합 제조시 부산물 생성을 감소시키는 방법:
- 폴리펩티드 암호화 핵산 중에서 트라이펩티드 QKK 암호화 올리고뉴클레오티드 caa aaa aag(서열번호 1) 또는 올리고뉴클레오티드 caa aag aag(서열번호 2) 또는 올리고뉴클레오티드 cag aag aag(서열번호 3) 중 1 내지 3개의 뉴클레오티드를 치환시켜, 올리고뉴클레오티드 caa aag aaa(서열번호 4) 또는 올리고뉴클레오티드 cag aaa aaa(서열번호 5)를 수득함으로써 치환된 폴리펩티드 암호화 핵산을 수득하고,
- 폴리펩티드를 암호화하는 치환된 핵산을 포함하는 세포 또는 세포의 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수함으로써 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드의 재조합 제조시 부산물 생성을 감소시키는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
하기의 추가 단계들 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 트라이펩티드 QKK를 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 암호화 핵산을 제공하고/하거나,
- 폴리펩티드를 암호화하는 치환된 핵산으로 세포를 형질감염시키고/시키거나,
- 치환된 핵산으로 형질감염된 세포를 (폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서) 배양하고/하거나,
- 폴리펩티드를 세포 또는 배양 배지로부터 회수하고/하거나.
- 임의적으로, 생성된 폴리펩티드를 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제하는 단계.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
생성된 폴리펩티드가 1 내지 5개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제되는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩티드가 아포지단백질 A-I, 또는 그의 변이체, 또는 아포지단백질 A-I의 기능을 갖는 그의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서,
폴리펩티드가 서열번호 9 내지 서열번호 14를 포함하는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
폴리펩티드가 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.