JP2015508662A - １→３リーディングフレームシフトを減少させるための方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドの組換え産生法が報告される。前記方法は、前記ポリペプチドをコードし、それにより前記ポリペプチドを産生する核酸を含む細胞か、該細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する工程を含み、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcag aaa aaaまたはオリゴヌクレオチドcaa aag aaaによってコードされることを特徴とする。

Description

本発明は、組換えポリペプチドの産生の分野に属する。本明細書において、副産物の含量の減少したポリペプチドを組換え産生するための方法が報告され、前記副産物の含量の減少は、翻訳または転写プロセス中のフレームシフトを減少させるコード核酸の改変によって達成される。

発明の背景
タンパク質は今日の医学ポートフォリオで重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、あらゆる薬学的物質が個別に異なる基準を満たさなければならない。ヒトへの生物学的製剤の安全性を確実するために、深刻な害を引き起こすであろう核酸、ウイルスおよび宿主細胞のタンパク質は、特に除去されなければならない。規制の仕様書に沿うために、１回以上の精製工程を、製造プロセス後に行わなければならない。

組換えポリペプチドは、例えば大腸菌などの原核細胞によって産生され得る。組換え産生されたポリペプチドは、前記原核細胞のポリペプチド含量の大半を占め、そしてしばしば不溶性の凝集物として、すなわちいわゆる封入体として、前記原核細胞内に堆積する。前記組換えポリペプチドの単離のために、細胞を解体しなければならず、そして封入体に含まれる組換えポリペプチドを、細胞片から封入体を分離した後に可溶化しなければならない。可溶化のために、カオトロピック試薬（尿素または塩化グアニジニウムなど）を使用する。ジスルフィド結合を切断するために、特にアルカリ条件下で、ジチオエリトリトール、ジチオトレイトール、またはβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を加える。凝集したポリペプチドの可溶化後、生物学的活性に必須である組換えポリペプチドの球状構造を再確立しなければならない。このいわゆる再生プロセス中に、変性剤の濃度を、例えば、変性したポリペプチドをその生物学的に活性な構造へとリフォールディングすることを可能とする適した緩衝液に対する透析によって（ゆっくりと）減少させる。再生後、組換えポリペプチドを、目的とする用途のために許容可能な純度まで精製する。例えば、治療タンパク質として使用するために、９０％超の純度を確立しなければならない。

組換え産生ポリペプチドは、例えば、通常、産生細胞に由来する核酸、内毒素、および／またはポリペプチドを伴う。宿主細胞に由来する副産物の他に、ポリペプチドに由来する副産物も粗ポリペプチド調製物中に存在する。とりわけ、対象のポリペプチドの短縮された変異体が存在し得る。

国際公開公報第９５／２５７８６号では、細菌発現系におけるヒトアポリポタンパク質ＡＩの産生が報告されている。Karathanasis, S.K., et al.は、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子の単離および特徴付けを報告する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6147-6151)。有意なレベルのフレームシフトを指令する配列は、Escherichia coliのコード領域に頻繁に存在することは、Gurvich, O.L., et al. in the EMBO Journal (22 (2003) 5941-5950)によって報告されている。Graversen, J.H., et al.は、アポリポタンパク質Ａ−１の三量体化は、血漿クリアランスを遅延させ、そして抗アテローム硬化特性を保存することを報告する(J. Cardiovascular Pharmacology 51 (2008) 170-177)。

発明の要約
トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドは、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸の転写または翻訳プロセス中の１→３フレームシフトの場所であり得ることが判明した。フレームシフトの発生に因り、非コードアミノ酸配列を有するナンセンスポリペプチドが産生される。

従って、本明細書において、１つの局面として、トリペプチドＱＫＫ（配列番号０６）を含むポリペプチドの組換え産生法が報告され、前記方法は、以下の工程：
− 前記ポリペプチドをコードし、それにより前記ポリペプチドを産生する核酸を含む、細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程
を含み、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされることを特徴とする。

１つの態様において、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされる。

本明細書において報告された１つの局面は、そのアミノ酸配列にトリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸であり、前記トリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされている。

本明細書において報告された１つの局面は、そのアミノ酸配列にトリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸であり、前記トリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされている。

本明細書において報告された１つの局面は、本明細書において報告された核酸を含む細胞である。

本明細書において報告された１つの局面は、大腸菌において発現されるポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、大腸菌において発現されるポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）の使用である。

以下に、本明細書において報告された全ての局面の態様が明記されている。

１つの態様において、トリペプチドＱＫＫはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）によってコードされている。

１つの態様において、トリペプチドＱＫＫはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされている。

１つの態様において、前記の（完全長）ポリペプチドは、約５０個ないし約５００個のアミノ酸残基を含む。１つの態様において、前記の（完全長）ポリペプチドは、約１００個ないし約４００個のアミノ酸残基を含む。１つの態様において、前記の（完全長）ポリペプチドは約２５０個ないし約３５０個のアミノ酸残基を含む。

１つの態様において、前記細胞は原核細胞である。１つの態様において、前記原核細胞は大腸菌細胞、または桿菌細胞である。

１つの態様において、前記細胞は真核細胞である。１つの態様において、前記細胞はＣＨＯ細胞、またはＨＥＫ細胞、またはＢＨＫ細胞、またはＮＳ０細胞、またはＳＰ２／０細胞、または酵母細胞である。

１つの態様において、前記ポリペプチドはヘテロ多量体ポリペプチドである。１つの態様において、前記ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。

１つの態様において、前記ポリペプチドはホモ多量体ポリペプチドである。１つの態様において、前記ポリペプチドはホモ二量体またはホモ三量体である。

１つの態様において、前記ポリペプチドはヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたはその変異体またはそれを含む融合ポリペプチドであり、前記変異体または融合ポリペプチドは、in vitroおよびin vivoにおいてヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの機能を示す。１つの態様において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ変異体は、配列番号０９ないし配列番号１４の群から選択されたアミノ酸配列を有する。

発明の詳細な説明
定義：
「アミノ酸」という用語は、直接的にまたは前駆体の形態で、核酸によってコードされ得る、カルボキシα−アミノ酸の群を示す。個々のアミノ酸は、いわゆるコドンまたはトリプレットと呼ばれる、３つのヌクレオチドからなる核酸によってコードされている。各アミノ酸は、少なくとも１つのコドンによってコードされている。異なるコドンによる同じアミノ酸のコード化は、「遺伝子コードの縮重」として知られている。「アミノ酸」という用語は、天然カルボキシα−アミノ酸を示し、そしてアラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。

「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ」という用語は、タンパク質−脂質およびタンパク質−タンパク質相互作用特性を有する両親媒性のラセン状ポリペプチドを示す。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、アミノ酸残基２６７個のプレプロ−アポリポタンパク質として肝臓および小腸によって合成され、これはプロ−アポリポタンパク質として分泌され、そして切断されて、アミノ酸残基２４３個を有する成熟ポリペプチドとなる。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、リンカー部分（しばしばプロリンであり、そしていくつかの場合においてはいくつかの残基で作られた配列からなる）によって隔てられた各々２２個のアミノ酸残基からなる６〜８個の異なるアミノ酸反復配列からなる。例示的なヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベース登録ＮＭ−００００３９またはデータベース登録Ｘ００５６６；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ−００００３０．１（ｇｉ４５５７３２１）に報告されている。ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（配列番号０７）の中で、Ｐ２７Ｈ、Ｐ２７Ｒ、Ｐ２８Ｒ、Ｒ３４Ｌ、Ｇ５０Ｒ、Ｌ８４Ｒ、Ｄ１１３Ｅ、Ａ−Ａ１１９Ｄ、Ｄ１２７Ｎ、Ｋ１３１の欠失、Ｋ１３１Ｍ、Ｗ１３２Ｒ、Ｅ１３３Ｋ、Ｒ１５１Ｃ（アミノ酸残基１５１がＡｒｇからＣｙｓへと変化している、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｐａｒｉｓ）、Ｅ１６０Ｋ、Ｅ１６３Ｇ、Ｐ１６７Ｒ、Ｌ１６８Ｒ、Ｅ１７１Ｖ、Ｐ１８９Ｒ、Ｒ１９７Ｃ（アミノ酸残基１７３がＡｒｇからＣｙｓへと変化している、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−Ｍｉｌａｎｏ）およびＥ２２２Ｋなどの天然の変異体が存在する。また、保存的アミノ酸改変を有する変異体も含まれる。

「コドン」という用語は、規定のアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを示す。遺伝子コードの縮重に因り、いくつかのアミノ酸は１つを超えるコドンによってコードされている。同じアミノ酸をコードするこれらの異なるコドンは、個々の宿主細胞において異なる相対的使用頻度を有する。従って、特定のアミノ酸は、異なるコドンの群によってコードされ得る。同様に、ポリペプチドのアミノ酸配列は、異なる核酸によってコードされ得る。それ故、特定のアミノ酸は、異なるコドンの群によってコードされ得、これらの各コドンは、所与の宿主細胞内の使用頻度を有する。

例示的変化は、以下の表に、「例示的置換」の表題で提供されている。保存的置換は、以下の表に、「好ましい置換」の表題で示され、そしてアミノ酸側鎖クラスに言及して以下にさらに記載されている。

非保存的置換は、これらの１つのクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴う。

「保存的アミノ酸改変」という用語は、ポリペプチドの特徴に影響を及ぼさないまたは変化させない、アミノ酸配列の改変を示す。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸改変は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

「ポリペプチドの変異体」という用語は、アミノ酸配列が、「親」ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、１０個以下の、１つの態様において約２〜約５個の付加、欠失および／または置換だけ異なる、ポリペプチドを示す。アミノ酸配列の改変は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載された分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって実施され得る。

異なるアミノ酸配列の相同性および同一性は、BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、またはBLOSUM 90などの周知のアルゴリズムを使用して計算され得る。１つの態様においてアルゴリズムはBLOSUM 30である。

「宿主細胞」、「宿主細胞系」および「宿主細胞培養液」という用語は同義語として使用され、そして外来性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これらは最初の形質転換細胞、および継代数に関わらずそれから派生した子孫を含む。子孫は、親細胞と比較して核酸含量に関して完全に同一でないかもしれないが、突然変異を含み得る。元の形質転換細胞についてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫がそこに含まれる。

「核酸」および「核酸配列」という用語は、個々のヌクレオチド（塩基とも呼ばれる）、すなわち「ａ」、「ｃ」、「ｇ」および「ｔ」（またはＲＮＡにおいては「ｕ」）からなるポリマー分子、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡまたはその改変体を示す。このポリヌクレオチド分子は、天然のポリヌクレオチド分子もしくは合成ポリヌクレオチド分子、または１つ以上の天然のポリヌクレオチド分子と１つ以上の合成ポリヌクレオチド分子との組合せであり得る。また、この定義によって、１つ以上のヌクレオチドが変化（例えば突然変異誘発によって）、欠失または付加されている天然のポリヌクレオチド分子が包含される。核酸は、単離されているか、または別の核酸（例えば発現カセット、プラスミド、または宿主細胞の染色体）に組み込まれているかのいずれかであり得る。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、最大で１０個の個々のヌクレオチド（塩基とも呼ばれる）、すなわち「ａ」、「ｃ」、「ｇ」および「ｔ」（またはＲＮＡにおいては「ｕ」）からなるポリマー分子を示す。

当業者には、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列へと変換するための手順および方法は周知である。それ故、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって、および同様にそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。

基準ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」は、配列をアラインさせ、そして必要であればギャップを導入して、配列同一部分として保存的置換は全く考慮せずに、最大の配列同一率を達成した後に、基準ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。アミノ酸配列同一率を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技能範囲内である種々の方法で、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して達成することができる。当業者は、比較しようとする配列の全長におよび最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一率の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して算出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc.によって作成され、そしてソースコードは、ユーザー文書と共にワシントンD.C.、20559の米国著作権局に届け出され、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはGenentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、そして変化しない。

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列の比較のために使用される状況においては、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一率（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一率を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は以下のように計算される：
Ｘ／Ｙの割合の１００倍
ここで、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２による同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、そしてＹは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一率は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一率と等しくないであろうことが理解されるだろう。特記しない限り、本明細書において使用された全てのアミノ酸配列同一率の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して直前の段落で記載されたように得られる。

「組換えポリペプチド」および「組換え産生ポリペプチド」という用語は、組換え手段によって調製、発現または作製されたポリペプチド、例えば宿主細胞、例えば大腸菌、ＮＳ０、ＢＨＫ、またはＣＨＯ細胞から単離されたポリペプチドを示す。

「置換」という用語は、親核酸中の１つの特定のヌクレオチドが変化して、置換／変化した核酸が得られることを示す。

本明細書において報告された方法：
本発明を実施するために有用である当業者に公知の方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III, John Wiley and Sons, Inc., New York (1997); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855;米国特許第5,202,238号および米国特許第US 5,204,244号に記載されている。

各生物について、規定のアミノ酸をコードするコドンの特徴的な（個々の）使用法が与えられ得る。例えば、アミノ酸のグルタミン（一文字コードではＱ）は、２つの異なるコドン（すなわちcagおよびcaa）によってコードされ得る（遺伝子コードの縮重に因り）。ヒトにおいては２つのグルタミンコドンは、それぞれ７４％および２６％の使用頻度を有する。大腸菌においても使用頻度は同等であり、すなわちそれぞれ８２％および１８％である。アミノ酸のリジン（Ｋ）も、２つの異なるコドン（すなわちaagおよびaaa）によってコードされ得る。ヒトにおいてはリジンをコードする２つの異なるコドンは、それぞれ５９％および４１％の使用頻度を有するが、大腸菌においてはリジンをコードする２つの異なるコドンは、それぞれ２０％および８０％という均等ではない使用頻度を有する。トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸に含まれるトリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドは、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸の転写または翻訳プロセス中の１→３フレームシフト（突然変異）の場所であり得ることが判明した。フレームシフトの発生に因り、非コードアミノ酸配列、最も可能性が高いのはナンセンスまたは短縮化されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが産生される。

より詳細に言えば、トリペプチドＱＫＫをコードし、そしてより大きな、すなわち少なくともアミノ酸残基５０個のポリペプチドをコードする核酸に含まれるオリゴヌクレオチドに依存して、オリゴヌクレオチドの転写または翻訳プロセス中の１→３フレームシフトが起こることが判明した。フレームシフトの頻度は、個々のコドンの組合せに依存する（以下の表を参照）。

大腸菌において、トリペプチドＱＫＫが核酸caa aaa aagおよびcaa aag aagによってコードされていれば、１→３フレームシフトが起こることが分かる。今回、驚くべきことに、このフレームシフトは、核酸配列cag aag aag（配列番号０３）、またはcaa aag aaa（配列番号０４）、またはcag aaa aaa（配列番号０５）を使用することによって防ぐことができることが判明した。従って、完全長ポリペプチドの発現収率を、前記ポリペプチド中のトリペプチドＱＫＫをコードする、配列番号０３、または配列番号０４、または配列番号０５の核酸を使用することによって向上させることができる（同様に、完全長ではないポリペプチドの副産物の形成を減少させることができる）。

従って、本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫ（配列番号０６）を含む大腸菌における（完全長）ポリペプチドの組換え産生法であり、前記方法は、以下の工程：
− 前記ポリペプチドをコードし、それにより前記ポリペプチドを産生する核酸を含む、細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程
を含み、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされることを特徴とする。

従って、本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫ（配列番号０６）を含む大腸菌における（完全長）ポリペプチドの組換え産生法であり、前記方法は、以下の工程：
− 前記ポリペプチドをコードし、それにより前記ポリペプチドを産生する核酸を含む、細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程
を含み、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされることを特徴とする。

１つの態様において、前記方法は以下の工程を含む：
− ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を準備する工程、
− 細胞を培養する工程（ポリペプチドの発現に適した条件下で）、
− 細胞または培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程、
− 場合により、１回以上のクロマトグラフィー工程を用いて産生されたポリペプチドを精製する工程。

１つの態様において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）含むポリペプチドをコードする核酸は、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）中の１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得ることによって得られる。

１つの態様において、産生されたポリペプチドを、１〜５回のクロマトグラフィー工程で精製する。１つの態様において、産生されたポリペプチドを２〜４回のクロマトグラフィー工程で精製する。１つの態様において、産生されたポリペプチドを、３回のクロマトグラフィー工程で精製する。

一般的なクロマトグラフィー法およびその使用は、当業者に公知である。例えば、Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5^th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989);またはAusubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I〜III, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)を参照されたい。

本明細書において報告された１つの局面は、そのアミノ酸配列にトリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドをコードする核酸であり、トリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）によってコードされている。

本明細書において報告された１つの局面は、本明細書において報告された核酸を含む細胞である。

本明細書において報告された１つの局面は、前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫをコードする、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）の使用である。

本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫを含む大腸菌における（完全長）ポリペプチドの組換え産生中の副産物の形成を減少させるための方法であり、以下の工程を含む：
− 前記ポリペプチドをコードする核酸において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）中の１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得、これにより、置換されたポリペプチドをコードする核酸を産生する工程、および
− 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を含む細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収して、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドの組換え産生中の副産物の形成を減少させる工程。

本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫを含む大腸菌における（完全長）ポリペプチドの組換え産生中の副産物の形成を減少させるための方法であり、以下の工程を含む：
− 前記ポリペプチドをコードする核酸において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）中の１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得、これにより、置換されたポリペプチドをコードする核酸を産生する工程、および
− 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を含む細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収して、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドの組換え産生中の副産物の形成を減少させる工程。

本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫを含む大腸菌における組換え産生された（完全長）ポリペプチドの発現を増加させるための方法であり、以下の工程を含む：
− 前記ポリペプチドをコードする核酸において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）中の１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得、これにより、置換されたポリペプチドをコードする核酸を産生する工程、および
− 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を含む細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収して、前記ポリペプチドの発現を増加させる工程。

本明細書において報告された１つの局面は、トリペプチドＱＫＫを含む大腸菌における組換え産生された（完全長）ポリペプチドの発現を増加させるための方法であり、以下の工程を含む：
− 前記ポリペプチドをコードする核酸において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）またはオリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）中の１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得、これにより、置換されたポリペプチドをコードする核酸を産生する工程、および
− 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を含む細胞または細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収して、前記ポリペプチドの発現を増加させる工程。

個々の以前の各々の局面の１つの態様において、前記方法は、以下の１つ以上のさらなる工程を含む：
− トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドのアミノ酸配列またはコード核酸を準備する工程、および／または
− 細胞を、前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を用いてトランスフェクションする工程、および／または
− 置換された核酸を用いてトランスフェクションされた細胞を培養する工程（ポリペプチドの発現に適した条件下で）、および／または
− 細胞または培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程、および／または
− 場合により、１回以上のクロマトグラフィー工程を用いて産生されたポリペプチドを精製する工程。

１つの態様において、産生されたポリペプチドを、１〜５回のクロマトグラフィー工程で精製する。１つの態様において、産生されたポリペプチドを２〜４回のクロマトグラフィー工程で精製する。１つの態様において、産生されたポリペプチドを３回のクロマトグラフィー工程で精製する。

本明細書において報告された方法は、以下において、原核細胞で産生された組換えポリペプチド、すなわち、大腸菌において産生されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを用いて例示されている。

テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向へ）ヒトテトラネクチン三量体形成構造エレメントおよび野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む。ヒトテトラネクチン三量体構造エレメントのアミノ酸配列は、最初の９個のアミノ酸だけ短縮することができ、従って、天然の切断短縮部位である１０位のイソロイシン残基から始まる。この切断短縮の結果として、４位のトレオニン残基のＯ−グリコシル化部位が欠失する。テトラネクチン三量体構造エレメントとヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの間の５個のアミノ酸残基ＳＬＫＧＳ（配列番号０８）は除去された。

向上した発現および精製のために、Ｎ末端精製タグ（例えばヘキサヒスチジンタグ）および精製タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を含む構築物を作製することができる。１つの態様において、プロテアーゼはＩｇＡプロテアーゼであり、そしてプロテアーゼ切断部位は、ＩｇＡプロテアーゼ切断部位である。プロテアーゼの特異的な切断の結果、プロテアーゼ切断部位のいくつかのアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に保持され、すなわち、ＩｇＡプロテアーゼ切断部位の場合には、２つのアミノ酸残基（１番目としてアラニンまたはグリシンまたはセリンまたはトレオニン、２番目としてプロリン）が、ポリペプチド（例えばテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド）のＮ末端に維持される。

テトラネクチン三量体形成構造エレメントは、個々のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体の各々の間の非共有結合的相互作用によって構成されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉホモ三量体の形成を可能とするドメインを提供する。

１つの態様において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含む変異体である。

１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、発現タグおよび精製タグを含み、そして

のアミノ酸配列を有する。

１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＩＶＮ）は、

のアミノ酸配列を有する。

従って、１つの好ましい態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＰＩＶＮ）は、

のアミノ酸配列を有する。

１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＸＰＩＶＮ）は、

のアミノ酸配列を有する。

従って、１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＡＰＩＶＮ）は、

のアミノ酸配列を有する。

１つの態様において、ヘキサヒスチジンタグを含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＸＩＶＮ）は、

のアミノ酸配列を有し、Ｘは、以下のアミノ酸配列のいずれかであり得る：

ポリペプチドが大腸菌株において組換え産生されている場合、Ｎ末端メチオニン残基は、通常、大腸菌プロテアーゼによって効率的に切断されないことに留意しなければならない。従って、Ｎ末端メチオニン残基は、一部、産生されたポリペプチドに存在する。

配列番号０９のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、大腸菌において組換え産生された。主な副産物（全タンパク質の約１０％）を検出することができた。

Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピング（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）およびトップダウンＭＳを介して、アミノ酸残基１〜１４８のＮ末端アミノ酸配列（リジン）が正しかったことが確認された（配列番号１３に示したように）。短縮された副産物のＣ末端アミノ酸配列は、VARRNGTVQTES（配列番号５３）であった。ターゲットのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドの配列からの逸脱は、トリペプチドＱＫＫで始まった。Ｃ末端アミノ酸配列の変化は、翻訳または転写プロセス中のリーディングフレームの１→３フレームシフトに起因していた（図１参照）。

トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドの種々の変異体を試験した。オリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）は、短縮された副産物の量を３０％までさらに増加させることが判明した。それに対して、オリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）、caa aag aaa (配列番号０４)およびcag aaa aaa（配列番号０４）を使用することによって、短縮された副産物の形成を、使用したＬＣ−ＭＳ法の検出限界未満に減少させることができた（図２参照）。

以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を行なうことができることが理解される。

配列表の記載
配列番号０１ オリゴヌクレオチドcaa aaa aag
配列番号０２ オリゴヌクレオチドcaa aag aag
配列番号０３ オリゴヌクレオチドcag aag aag
配列番号０４ オリゴヌクレオチドcaa aag aaa
配列番号０５ オリゴヌクレオチドcag aaa aaa
配列番号０６ トリペプチドＱＫＫ
配列番号０７ ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
配列番号０８ 除去されたＳＬＫＧＳポリペプチド
配列番号０９ 発現タグおよび精製タグを含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド
配列番号１０ テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＩＶＮ）
配列番号１１ テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＰＩＶＮ）
配列番号１２ テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＸＰＩＶＮ）
配列番号１３ テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＡＰＩＶＮ）
配列番号１４ ヘキサヒスチジンタグを含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（ＸＩＶＮ）
配列番号１５〜５２ リンカーポリペプチド
配列番号５３ 主な副産物のＣ末端アミノ酸配列
配列番号５４ インターフェロンフラグメント
配列番号５５ ヘキサヒスチジンタグ
配列番号５６ ＩｇＡプロテアーゼ切断部位

異なるリーディングフレームにより、異なるアミノ酸配列がもたらされ、１→３フレームシフトにより、Ｃ末端アミノ酸配列の決定された短縮された産物（Δ分子量＝−１４３６９Ｄａ）が得られる。 １→３フレームシフトの副産物の形成に関する、トリペプチドＱＫＫをコードする種々のオリゴヌクレオチドを含む構築物のＬＣ−ＭＳ分析。

材料および方法
タンパク質の測定：
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０nmにおける吸光度（ＯＤ）を決定することによって決定された。

組換えＤＮＡ技術：
標準的な方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されたようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の説明書に従って使用した。

実施例１
大腸菌発現プラスミドの作製および説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを組換え手段によって調製した。Ｎ末端からＣ末端方向への発現された融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである：
− アミノ酸メチオニン（Ｍ）、
− CDLPQTHSL（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列のフラグメント、
− ＧＳリンカー、
− HHHHHH（配列番号５５）のアミノ酸配列を有するヘキサヒスチジンタグ、
− ＧＳリンカー、
− VVAPPAP（配列番号５６）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ切断部位、および
− 配列番号１０のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。

前記したようなテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、前駆体ポリペプチドであり、これから、最終的なテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドが、ＩｇＡプロテアーゼを使用したin vitroにおける酵素的切断によって遊離した。

前駆体ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、公知の組換え法および技術を用いて、適切な核酸セグメントとの連結によって構築された。化学合成によって作製された核酸配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認された。配列番号０９の融合ポリペプチドをコードする配列番号１０のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドの産生のための発現プラスミドは、以下のように調製された。

大腸菌発現プラスミドの作製：
プラスミド４９８０（４９８０−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−ＳＡＣ）は、大腸菌におけるコア−ストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド１９６６（１９６６−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−Ｔ−リピート；ＥＰ−Ｂ１４２２２３７において報告されている）に由来する３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩベクターフラグメントを、４３５ｂｐ長のコア−ストレプトアビジンをコードするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントとライゲーションすることによって生成された。

コア−ストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
− 大腸菌における複製のためのベクターｐＢＲ３２２の複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、２５１７〜３１６０ｂｐ位に相当する）、
− 大腸菌ｐｙｒＦ突然変異株の相補性（ウラシル栄養要求性）によるプラスミドの選択を可能とする、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするSaccharomyces cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）、
− 以下を含むコア−ストレプトアビジン発現カセット
− Stueber, D., et al.（前記参照）による合成リボソーム結合部位を含む、Ｔ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
− コア−ストレプトアビジン遺伝子、
− ２つのバクテリオファージ由来転写終結因子、すなわちλ−Ｔ０終結因子（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）およびｆｄ−終結因子（Beck, E.およびZink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58）、
− 大腸菌由来のｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。

テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体ポリペプチドの発現のための最終発現プラスミドは、単一のフランキングしているＥｃｏＲＩおよびＣｅｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使用してベクター４９８０からコア−ストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、そして前駆体ポリペプチドをコードするＥｃｏＲＩＩ／ＣｅｌＩＩ制限酵素部位にフランキングしている核酸を、３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ−４９８０ベクターフラグメントに挿入することによって調製された。

実施例２
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発現
融合タンパク質の発現のために、大腸菌栄養要求性（ＰｙｒＦ）の相補による抗生物質を用いないプラスミドの選択を可能とする大腸菌宿主／ベクター系を使用した（欧州特許第０９７２８３８号および米国特許第６，２９１，２４５号を参照）。

大腸菌Ｋ１２ ＣＳＰＺ−２株（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈ−１、ΔｐｙｒＦ）を、発現プラスミドｐ（ＩＦＮ−Ｈｉｓ６−ＩｇＡ−テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を用いての電気穿孔によって形質転換した。形質転換された大腸菌細胞をまず３７℃で寒天プレート上で増殖させた。

発酵プロトコール１：
前発酵のために、約１ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約１ｇ/ｌのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミン−ＨＣｌが添加された、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))によるＭ９培地を使用した。

前発酵のために、整流装置を有する１０００mlのエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlのＭ９培地に、初代種子バンクアンプルからの２mlを接種した。培養を、１〜３の吸光度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振とう機で実施した。

発酵のために、Riesenberg et al.によるバッチ培地を使用した（Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27): ２７．６g/l グルコース＊Ｈ_２Ｏ、１３．３g/l ＫＨ_２ＰＯ_４、４．０g/l （ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、１．７g/l クエン酸塩、１．２g/l ＭｇＳＯ_４＊７ Ｈ_２Ｏ、６０mg/l クエン酸鉄(III)、２．５mg/l ＣｏＣｌ_２＊６ Ｈ_２Ｏ、１５mg/l ＭｎＣｌ_２＊４ Ｈ_２Ｏ、１．５mg/l ＣｕＣｌ_２＊２ Ｈ_２Ｏ、３mg/l Ｈ_３ＢＯ_３、２．５mg/l Ｎａ_２ＭｏＯ_４＊２ Ｈ_２Ｏ、８mg/l Ｚｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２＊２ Ｈ_２Ｏ、８．４mg/lチトリプレックスIII、１．３ml/l シンペロニック１０％消泡剤）。バッチ培地に、それぞれ５．４mg/lのチアミン−ＨＣｌ並びに１．２g/lのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを添加した。フィード１溶液は、１９．７g/l ＭｇＳＯ_４＊７ Ｈ_２Ｏが添加された７００g/lのグルコースを含んでいた。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、それぞれ５０g/lのＬ−ロイシンおよび５０g/lのＬ−プロリンが添加された１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ_３水溶液であった。全ての成分を脱イオン水に溶解した。

１０リットルのバイオスタットＣ ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で発酵を実施した。６．４リットルの無菌の発酵バッチ培地と前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、バッチ発酵を、３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に添加したグルコースを枯渇させた後、温度を２８℃にシフトし、そして発酵はフェッドバッチモードに入った。ここで溶存酸素（ｐＯ_２）の相対値を、一定して増加する撹拌速度（１０時間以内に５５０rpmから１０００rpmに、そして１６時間以内に１０００rpmから１４００pmに）および通気速度（１０時間以内に１０リットル/分から１６リットル/分に、そして５時間以内に１６リットル/分から２０リットル/分に）と組み合わせてフィード１に加えることによって５０％に維持した（DO-stat、例えば Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85参照）。追加のアミノ酸の供給は、約８時間の培養後にｐＨが調節下限（６．７０）に達した場合に、アルカリ溶液の添加からもたらされた。組換え治療タンパク質の発現は、吸光度７０で１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。

発酵終了時に、細胞質内および可溶性の発現テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、加熱工程（発酵槽中の全培養ブロスを収集前に１〜２時間、５０℃まで加熱する）により、不溶性のタンパク質凝集物（いわゆる封入体）へと移行する（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。その後、発酵槽の内容物を、フロースルー遠心機（１３，０００rpm、１３リットル/ｈ）を用いて遠心分離し、そして収集したバイオマスをさらに処理するまで−２０℃で保存した。合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質は、不溶性のタンパク質凝集物、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で、不溶性細胞片画分においてのみ認められた。

発酵槽から回収された試料（１つは誘導前、そしてその他はタンパク質発現の誘導後の特定の時点でのもの）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも、同量の細胞（ＯＤ_{ターゲット}＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして超音波を介して氷上で破砕した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性発現ターゲットタンパク質と、不溶性発現ターゲットタンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液３００μLを、および各ペレット（＝不溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液４００μL（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を１５分間９５℃で振とう下で加熱し、試料中の全てのタンパク質を可溶化および還元する。室温まで冷却した後、５μLの各試料を４〜２０％のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）に移す。さらに既知の製品タンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する５μlの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）および３つの量の（０．３μl、０．６μl、および０．９μl）定量標準物質をゲル上に配置する。

電気泳動を２００Ｖで６０分間行ない、その後、ゲルをGelDOC EZ Imager (Bio-Rad)に転写し、そしてＵＶ照射により５分間処理した。ゲルの画像を、Image Lab分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて、直線回帰曲線を、０．９９超の係数を用いて計算し、そして元の試料中のターゲットタンパク質の濃度を計算した。

発酵プロトコール２：
前発酵のために、約１ｇ/ｌのＬ−ロイシン、約１ｇ/ｌのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミン−ＨＣｌが添加された、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))によるＭ９培地を使用した。

前発酵のために、整流装置を有する１０００mlのエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlの改変Ｍ９培地に、寒天プレートから、または初代種子バンクアンプルからの１〜２mlを接種した。培養を、１〜３の吸光度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振とう機で実施した。

テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発酵および高収率での発現のために、以下のバッチ培地およびフィードを使用した。

８．８５ｇ/ｌのグルコース、６３．５ｇ/ｌの酵母抽出物、２．２ｇ/ｌのＮＨ_４Ｃｌ、１．９４ｇ/ｌのＬ−ロイシン、２．９１ｇ/ｌのＬ−プロリン、０．７４ｇ/ｌのＬ−メチオニン、１７．３ｇ/ｌのＫＨ_２ＰＯ_４＊Ｈ２_Ｏ、２．０２ｇ/ｌのＭｇＳＯ_４＊７ Ｈ_２Ｏ、２５．８mg/lのチアミン−ＨＣｌ、１．０ml/lのシンペロニック１０％消泡剤。フィード１溶液は、１．６７ｇ/ｌのＬ−メチオニン並びに各々５ｇ/ｌのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンが添加された、３３３ｇ/ｌの酵母抽出物および３３３ｇ/ｌの８５％グリセロールを含んでいた。フィード２は、６００ｇ/ｌのＬ−プロリン溶液であった。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は１０％（ｗ／ｖ）ＫＯＨ溶液であり、そして酸として７５％グルコース溶液を使用した。全ての成分を脱イオン水に溶解した。

発酵を、１０リットルのバイオスタットＣ ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で行なった。５．１５リットルの無菌の発酵バッチ培地と前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、フェッドバッチ発酵を、２５℃、ｐＨ６．７±０．２、３００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に添加したグルコースが枯渇する前に、培養液は吸光度１５（５７８nm）に達し、そしてフィード１を７０ｇ/ｈで開始した場合、発酵はフェッドバッチモードに入った。培養液中のグルコース濃度をモニタリングしながら、フィード１を、グルコース蓄積を回避しつつ、そしてｐＨを調節上限６．９付近に保持しながら、最大１５０ｇ/ｈまで増加させた。吸光度５０（５７８nm）でフィード２を一定フィード速度１０ml/ｈで開始した。溶存酸素（ｐＯ_２）の相対値を、撹拌速度（５００rpmから１５００rpmに）、通気速度（１０リットル/分から２０リットル/分に）および圧力（３００mbarから５００mbarに）を平行して増加させることによって５０％超に保持した。組換え治療タンパク質の発現は、吸光度９０で１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。

発酵槽から回収された７つの試料（１つは誘導前、そしてその他はタンパク質発現の誘導後の特定の時点でのもの）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも、同量の細胞（ＯＤ_{ターゲット}＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして超音波を介して氷上で破砕した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性発現ターゲットタンパク質と、不溶性発現ターゲットタンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液３００μLを、および各ペレット（＝不溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液２００μL（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を１５分間９５℃で振とう下で加熱し、試料中の全てのタンパク質を可溶化および還元する。室温まで冷却した後、５μLの各試料を１０％Ｂｉｓ−トリスポリアクリルアミドゲル（Novagen）に移す。さらに既知の製品タンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する５μlの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）および３つの量の（０．３μl、０．６μl、および０．９μl）定量標準物質をゲル上に配置する。

電気泳動を２００Ｖで３５分間行ない、その後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ色素で染色し、加熱した水で脱染し、そしてデジタル化のために吸光光度計に移す（GS710, Bio-Rad）。ゲル画像を、Quantity One 1-D分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて、直線回帰曲線を、０．９８超の係数を用いて計算し、そして元の試料中のターゲットタンパク質のその濃度を計算した。

発酵終了時に、細胞質内および可溶性の発現テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、加熱工程（発酵槽中の全培養ブロスを収集前に１または２時間、５０℃まで加熱する）により、不溶性のタンパク質凝集物（いわゆる封入体）へと移行する（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。加熱工程後、合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体タンパク質は、ＩＢの形態で不溶性細胞片画分においてのみ認められた。

発酵槽の内容物を４〜８℃まで冷却し、フロースルー遠心機（１３，０００rpm、１３リットル/ｈ）を用いて遠心分離し、そして収集したバイオマスをさらに処理するまで−２０℃で保存する。収集した全バイオマスは、発現構築物に依存して、３９ｇ/ｌから９０ｇ/ｌの乾燥物の範囲であった。

実施例３
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの調製
封入体の調製は、リン酸カリウム緩衝溶液（０．１Ｍ、１mMのＭｇＳＯ_４が添加されている、ｐＨ６．５）中に収集された細菌細胞を再懸濁することによって実施された。ＤＮＡｓｅの添加後、細胞を、９００ｂａｒの圧力でホモジナイズすることによって破砕した。１．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝溶液を、ホモジナイズされた細胞懸濁液に加えた。２５％（ｗ／ｖ）ＨＣｌを用いてｐＨ値を５．０に調整した後、最終の封入体スラリーがさらなる遠心分離工程の後に得られた。スラリーは、さらなる処理まで、単回使用の無菌プラスチックバッグに−２０℃で保存された。

７ｇの封入体を、１４０mlの可溶化緩衝液（８Ｍの塩化グアニジニウム、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０）に一晩かけて可溶化した。遠心分離して、不溶性材料を除去した後、緩衝液を、SG Hydrosart １０ｋＤａメンブラン(Sartorius Stedim)を使用して７．２Ｍの塩化グアニジニウム、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０へとダイアフィルトレーションによって変化させた。前記溶液を、５０mMのトリス（ｐＨ８．０）の添加によって２Ｍの塩化グアニジニウムまで希釈した。遠心分離後、可溶化タンパク質を、２Ｍ塩化グアニジニウム、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０中で平衡化したＩＭＡＣ（Ｚｎ^２＋をローディングしたFractogel（登録商標）ＥＭＤキレート、Merck Chemicals）にローディングした。基線に到達した後、カラムを、２０％エチレングリコール、５０mMのトリス、１０mMのメチオニンで洗浄し、その後、１Ｍのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０で再度平衡化した。

カラムでのＩｇＡプロテアーゼによる切断を、１Ｍトリス（ｐＨ８．０）中のＩｇＡプロテアーゼ（ＩｇＡプロテアーゼ：タンパク質＝１：１００ｗ／ｗ）を用いて一晩かけて実施した。切断されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを、１Ｍのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８を用いてカラムから洗浄した。７．５Ｍの尿素、２０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０への緩衝液の交換は、限外濾過によって達成された。テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドを、同緩衝液中で平衡化したＱ−セファロース（商標）Fast Flow (GE Healthcare)にローディングした。カラムを、７．５Ｍの尿素、２０mMのトリス、ｐＨ８．０で洗浄し、その後、平衡緩衝液中で７５mMのＮａＣｌまでの塩勾配にかけた。融合ポリペプチドが溶出し始めたらすぐに、塩濃度を、１０カラム容量で一定に維持した。その後、塩勾配を続け、さらなる溶出工程を同緩衝液中２５０mMおよび５００mMのＮａＣｌを用いて実施した。回収した画分を、７．２Ｍの塩化グアニジニウム、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０に対して透析し、そして４℃で保管した。

実施例４
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドの分析
ＩＭＡＣ（Ｚｎ^２＋をローディングしたFractogel（登録商標）ＥＭＤキレート）およびＱ−セファロース（商標）精製カラムからのプールおよび画分を脱塩し、そしてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。

脱塩は、セファデックスＧ２５スーパーファイン材料（Amersham Bioscience 17-0851-01）を用いて社内で充填されたＨＲ５／２０カラム（０．７×２２cm、Amersham Bioscience）、および４０％アセトニトリル、２％ギ酸を含む均一濃度の溶出を１ml/分の流速で使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって非直結式で実施された。シグナルを２８０nmの波長でモニタリングし、そして溶出したテトラネクチン−アポリポタンパク質融合ポリペプチドのピークを手作業で集めた。

フラグメントの存在をモニタリングするためのＥＳＩ−ＭＳを、デクラスタリング電圧５０およびフォーカシング電圧２００を使用して、Triversa NanoMateソースシステム(Advion, Ithaka, USA)の装備されたQ-Star Elite QTOF質量分析計（Applied Biosystems (ABI), Darmstadt, Germany）で実施した。５秒間あたりに１５回のスキャンを、７００〜２０００のｍ／ｚ範囲で記録した。

ＥＳＩ−ＭＳデータを、２つのソフトウェアパッケージ、すなわちAnalyst (Applied Biosystems (ABI), Darmstadt, Germany)およびMassAnalyzer (社内で開発されたソフトウェアプラットフォーム)を使用して分析した。質量分析を、それぞれのＱＫＫトリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドにおけるフレームシフトから生じる、タンパク質フラグメントの分子量を有するシグナルの存在について手作業で確認した（予想される完全長の融合ポリペプチドの分子量と比較してΔ−１４３６９Ｄａ）。

Claims (7)

1. トリペプチドＱＫＫを含む大腸菌細胞における（完全長）ポリペプチドの組換え産生法であって、以下の工程：
   − 前記ポリペプチドをコードし、それにより前記ポリペプチドを産生する核酸を含む、細胞または大腸菌細胞培養の培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程を含み、
   前記ポリペプチドに含まれるトリペプチドＱＫＫは、オリゴヌクレオチドcag aaa aaaまたはオリゴヌクレオチドcaa aag aaaによってコードされることを特徴とする、方法。
2. 以下の工程：
   − ポリペプチドをコードする核酸において、トリペプチドＱＫＫをコードするオリゴヌクレオチドcaa aaa aag（配列番号０１）またはオリゴヌクレオチドcaa aag aag（配列番号０２）またはオリゴヌクレオチドcag aag aag（配列番号０３）のうちの１〜３個のヌクレオチドを置換して、オリゴヌクレオチドcaa aag aaa（配列番号０４）またはオリゴヌクレオチドcag aaa aaa（配列番号０５）を得、これにより、置換されたポリペプチドをコードする核酸を産生する工程と、
   − 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸を含む細胞か、細胞培養の培地かから前記ポリペプチドを回収して、トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドの組換え産生中の副産物の形成を減少させる工程とを含む、
   トリペプチドＱＫＫを含む完全長ポリペプチドの大腸菌細胞における組換え産生中の副産物の形成を減少させる方法。
3. 前記方法は、以下の１つ以上のさらなる工程：
   − トリペプチドＱＫＫを含むポリペプチドのアミノ酸配列か、該配列をコードする核酸を準備する工程、および／または
   − 前記ポリペプチドをコードする置換された核酸で細胞をトランスフェクションする工程、および／または
   − （ポリペプチドの発現に適した条件下で）前記置換された核酸でトランスフェクションされた細胞を培養する工程、および／または
   − 前記細胞または培地から前記ポリペプチドを回収する工程、および／または
   − 場合により、１回以上のクロマトグラフィー工程を用いて産生された前記ポリペプチドを精製する工程を含む、
   請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
4. 産生された前記ポリペプチドは、１ないし５回のクロマトグラフィー工程を用いて精製されることを特徴とする、請求項２ないし３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記ポリペプチドは、アポリポタンパク質Ａ−Ｉか、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの機能を有するその変異体か、その融合ポリペプチドかであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記ポリペプチドが、配列番号０９ないし配列番号１４を含む群から選択されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５記載の方法。
7. 前記ポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項５ないし６のいずれか１項記載の方法。

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