JP2003501035A - 安定性に関して改変されたサイトカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サイトカインの安定化のための方法、およびこのような方法により生成されるサイトカインに関する。本発明の方法は、溶媒に曝露される疎水性残基を除去するように、サイトカインのアミノ酸配列を変異させる工程、および／または分子内の１つ以上の二次構造エレメントを安定化するように、サイトカインのアミノ酸配列を変異させる工程を包含する。これらの工程は、天然にフォールディングされた状態におけるサイトカインの安定性と比較して、フォールディングプロセスの間に形成される中間体を不安定化する効果を有し、これによって、インビトロで生成される場合のサイトカインの収率を増加させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、サイトカインの安定化の方法およびこのような方法によって生成さ
れるサイトカインに関する。特に、本発明の方法は、サイトカインのフォールデ
ィングの間に形成される中間体を、その天然にフォールディングされた状態にお
けるサイトカインの安定性に比較して、不安定化する工程を包含する。これは、
インビトロで産生される場合、サイトカインの収量を増大させる効果を有する。

【０００２】 サイトカインは、約８と８０ｋＤａとの間の小タンパク質であり、免疫反応の
正および負の調節の両方において、ならびにこれらの反応を内分泌系および造血
系のようなその他の生理学的区画と一体化することにおいて、中心的な役割を有
する。

【０００３】 １００を優に超える異なるヒトサイトカインが今や同定されており、これらは
、広汎な種々の異なる機能を有する。これらの分子は、細胞膜において特異的な
レセプターに結合し、そして多数のサイトカイン調節遺伝子の誘導、増強、また
は阻害に至るシグナリングカスケードを開始することによって作用する。種々の
異なる型のサイトカインが存在し、それらには、インターロイキン、インターフ
ェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、成長因子、およびケモカインが含ま
れる。これらのサイトカインは、複雑なネットワークにおいて共同して機能し、
そのネットワークにおいて、１つのサイトカインの産生は、一般に、いくつかの
その他のサイトカインの産生またはそれらに対する応答に影響を与える。

【０００４】 臨床的に、サイトカインは、医学のいくつかの領域において重要な役割を有す
る（抗炎症剤としての用途、および多数の癌（非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄
腫、メラノーマ、および卵巣癌を含む）を処置するために使用される薬剤として
の用途を含む）。サイトカインはまた、ＨＩＶ、多発性硬化症、喘息、およびア
レルギー性疾患の処置における適用を有する。

【０００５】 サイトカインの活性は、特異的なサイトカインとそのレセプター系との相互作
用を妨げ、それにより、そのサイトカインの生物学的効果を担う細胞内シグナル
を抑制することによって阻害され得る。サイトカイン−レセプター相互作用を遮
断するために利用可能であるストラテジーは、一般的に、サイトカインまたはそ
のレセプターに対するモノクローナル抗体の使用を含む。さらに、可溶性レセプ
ターおよびサイトカインレセプターアンタゴニストが使用され得る（Ｆｉｎｋｅ
ｌｍａｎら、１９９３；Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，１９９４を参
照のこと）。レセプターアンタゴニストは、サイトカインレセプターに高親和性
で結合し得るが、シグナル伝達を誘導し得ず、そしてそのため生物学的応答を生
成しない、野生型サイトカインの変異体である。ＩＬ−４の場合、ＩＬ−４レセ
プターαに、野生型タンパク質のＫ_dと同様なＫ_dで結合するが、第二のレセプタ
ー成分を動員できない、２つの効率的なアンタゴニストが、文献に報告されてい
る。

【０００６】 しかし、可溶性レセプターおよびモノクローナル抗体の治療能は、必要とされ
る高用量、およびこれらのタンパク質が免疫原性である可能性に起因してかなり
限定されることが示されている（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら、１９９３；Ｍａｌｉｓ
ｚｅｗｓｋｉら、１９９４）。

【０００７】 これらの理由のために、かなりの注目が、サイトカインに由来するアンタゴニ
ストの、治療的分子としての利用可能性に注がれている。この新世代の生物学的
製剤は、他の物質と比較して毒性が低いことが予想される（Ｂｕｃｋｅｌ，１９
９６）。

【０００８】 Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌におけるサイトカイン（およびサイトカインアンタ
ゴニスト）の産生を最適化することに興味が存在するためのいくつかの実際的な
理由が存在する。いくつかの真核生物発現系（昆虫、真菌、酵母、および哺乳動
物細胞株を含む）が、ここ何年かにわたって開発されているが、細菌の相対的な
単純さが、この生物を多くの場合において有利な宿主にする。例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉは、迅速な増殖率を有し（代表的な倍化時間は、２０分である）、操作、な
らびにタンパク質発現および変異のスクリーニングが容易であり、比較的安価な
培地で増殖する。これらの利点の結果、現在市場で利用可能であるほとんどのタ
ンパク質薬物は、目的の遺伝子を保有するＥ．ｃｏｌｉの大規模な発酵によって
産生される（Ｓｔｅｖｅｎら、１９９８）。これらの高い細胞密度培養系は、Ｅ
．ｃｏｌｉについてかなり十分に確立されているが、他の宿主でのそれらの効率
および生存性についてはほとんど知られていない。

【０００９】 Ｅ．ｃｏｌｉおよびその他の原核生物発現系一般の利用に関連する不利な点に
は、この生物が、異種タンパク質を封入体中に産生する傾向、翻訳後修飾の非存
在、細菌リボザイムによるヒトｍＲＮＡの非効率的翻訳、特徴的なコドン使用頻
度、および細胞質においてジスルフィド結合を形成し得ないことが含まれる。こ
れらの事実は、発現されたタンパク質のフォールディングおよび安定性を条件化
し、そして凝集を引き起こし得る。

【００１０】 Ｅ．ｃｏｌｉにおいて封入体を形成することに影響を及ぼす因子には、細胞増
殖温度、シャペロンとの同時発現、融合タンパク質の使用、タンパク質の周辺質
への分泌、異なる発現系統の使用、およびそのプロ配列を含むタンパク質の発現
が含まれる。しかし、これらの方法の操作は、この問題を解決するにおいて、も
しあるとしても、部分的に有効であるに過ぎない。

【００１１】 封入体の形成が、決して、Ｅ．ｃｏｌｉに限定される異常な現象でないことに
注意すべきである。これは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅのような真核生物発現系およびさらには哺乳動物細胞について、（固有のタン
パク質および異種タンパク質の両方で）報告されている（ＢｏｗｄｅｎおよびＧ
ｅｏｒｇｉｏｕ、１９９０）。

【００１２】 タンパク質の封入体からの回収における義務的な工程は、尿素のようなカオト
ロピックな変性剤、またはＧｕｄｍＨＣｌ（塩化グアニジン）界面活性剤、また
は極端なｐＨを使用して凝集体を不溶化することを含む。不運にも、再生プロト
コルは、滅多に、簡単ではなく、そして封入体からのタンパク質の相当な収量で
の精製は、一般に、著しい挑戦の代表である。しばしば、目的のタンパク質は、
リフォールディングの間に沈降するか、または変性剤の存在に起因して、不可逆
的化学的修飾を受け得る。

【００１３】 タンパク質の商業的な産生のためのストラテジーを考案するときには、小規模
増殖試験に見出される条件はまた、そのプロセスが大規模発酵にまでスケールア
ップされる時に有効であるべきことを心に留めておかなければならない。例えば
、所定の標的のシャペロンとの同時過剰発現が、１リットルの振盪フラスコにお
けるその可溶性を増大するという事実は、同じことが、１００，０００リットル
の発酵の間に観察されることを保証しない。従って、複雑な封入体の問題に対す
る簡単な解決を見出すことが望ましい。

【００１４】 サイトカインのようなジスルフィド結合タンパク質の場合、還元型タンパク質
から酸化型タンパク質への変換は、ネイティブでない分子間ジスルフィド架橋に
よって特徴づけられる一連の中間体種を介して進行することが、示されている（
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９９７；Ｄｅ Ｆｅｌｉｐｐｉｓら、１９９３；Ｙｏｕ
ｎｇｍａｎら、１９９５）。種々の薬剤が、それらのネイティブな対形成のため
のジスルフィド結合の形成およびリシャッフリングの触媒に利用可能であるが、
完全で正確な酸化的リフォールディングのための最適な条件は、滅多に見出すこ
とができない。従って、サイトカインのようなほとんどのジスルフィド含有タン
パク質のインビトロフォールディングの間、一連のアイソフォームが得られる。
これらのアイソフォームのいくつかは、沈降し、そしてそのネイティブのアイソ
フォーム（しばしば少量の種である）は、ＨＰＬＣによって他の全てのものから
分離されなければならない。頻繁に、封入体中に蓄積するタンパク質は、所望の
量の純粋なタンパク質を得るために十分であるようであるが、封入体の調製およ
びそのタンパク質のリフォールディングの間に被る損失は、非常に大きく、その
ため、わずかな量の活性タンパク質しか回収され得ない。

【００１５】 従って、サイトカイン由来のアンタゴニストの治療的可能性は、これらのタン
パク質が、費用節約的に大量に産生することは困難であるという事実によって減
少する。これは、それらがＥ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現された場合、封入体を
形成する傾向があり、そしてそれらがインビトロにおいて非常に低収率でリフォ
ールディングするからである。

【００１６】 従って、サイトカインアンタゴニストのより効率的な産生を可能にするストラ
テジーおよびサイトカインとそれらのレセプターとの間の相互作用をブロックす
るための代替方法を考案することは非常に重要である。理想的には、そのレセプ
ターへの結合について、サイトカインと競合し得る小分子を設計することが望ま
しい。

【００１７】 従って、本発明の目的は、細菌中の可溶性タンパク質としてか、またはインビ
トロで効率的にフォールディングするタンパク質としてのいずれかで生成され得
る変異体サイトカインを設計することである。このようなストラテジーは、サイ
トカインアンタゴニストの工業的な産生をより手頃な値段にし、そして労力のよ
りかからないものにする。

【００１８】 （発明の要旨） 本発明に従って、以下の工程の一方または両方を包含する、サイトカインを安
定化する方法が提供される： ａ）サイトカインのアミノ酸配列を変異させて溶媒に曝露される疎水性残基を除
去する工程；および ｂ）そのサイトカインのアミノ酸配列を変異させてそのサイトカインにおける１
つ以上の二次構造エレメントを安定化する工程； その結果、そのサイトカインのフォールディングの間、サイトカインのフォール
ディングの間に形成される中間体は、そのフォールディングされた状態のそのサ
イトカインと比較して、不安定化される。これは、サイトカインのインビトロの
フォールディング収量を改善する効果を有する。

【００１９】 本発明の方法は、サイトカインの安定化を可能にし、その結果、それらが低コ
ストでかつ大量に組換え産生され得ることが示されている。この方法は、従って
、これらの分子の使用を多数の重要な疾患のための主流の治療に導く、これらの
分子の安価な産生についての道を開く。

【００２０】 インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、成
長因子、およびケモカインを含む任意のサイトカインが、本発明に従って安定化
され得る。

【００２１】 本発明に従う安定化のための好ましいサイトカインは、造血またはクラスＩサ
イトカインスーパーファミリーに属する「４ヘリックスバンドル」サイトカイン
である。これらのタンパク質の３次元構造は、３つのジスルフィド架橋を含む、
「アップアップダウンダウン」トポロジーを有する４ヘリックスバンドルからな
る。

【００２２】 そのポリペプチド鎖の長さおよび構造的特徴に基づいて、２つの主要なサブフ
ァミリーがこのスーパーファミリーにおいて同定され得る。さらに、インターフ
ェロンは、しばしば、４ヘリックスバンドルサイトカインの第３のサブファミリ
ーを構成すると考えられる。

【００２３】 このスーパーファミリーのメンバーには、とりわけ、ヒト成長ホルモン（ＨＧ
Ｈ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、エリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１３、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチン（ＯＳＭ
）、およびインターフェロンが含まれる。ＩＬ−４に類似の構造を有する、これ
ら３つのサブファミリーの公知のメンバーのいくつかは、以下の表Ｉに列挙され
ている。

【００２４】 造血サイトカインスーパーファミリーの驚くべき特徴は、それらの共通の形態
にも拘わらず、そのファミリーメンバーは、配列相同性をほとんどか全く有して
いないことである。しかし、これらのタンパク質が全て細胞外シグナリング分子
であるという事実、それらが同じ独特な４ヘリックスバンドルトポロジーおよび
類似の遺伝子構成を共有するという事実は、それらが全て、分岐進化のプロセス
において関連しているということを示唆する。

【００２５】 ４つのヘリックスバンドルサイトカインは、ヘマトポエチンレセプタースーパ
ーファミリーまたはＩ型サイトカインレセプタースーパーファミリーとして公知
のレセプターのクラスに結合する。これらのレセプターは、そのファミリー内で
高度に相同な細胞外サイトカイン結合ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および
固有のチロシンキナーゼ活性を欠失する細胞内ドメインを含む。その細胞外ドメ
インは、４つの保存されたシステイン、および、効率的なレセプターフォールデ
ィングに重要であると考えられている特徴的なトリプトファン−セリン−Ｘ−ト
リプトファン−セリン（いわゆるトリプトファンボックス）モチーフを有する（
総説については、Ｂａｚａｎ，１９９０およびＧｕｌｌｂｅｒｇら、１９９５を
参照のこと）。

【００２６】

【表１】 最も広汎に特徴づけられているサイトカインレセプター系は、ヒト成長ホルモ
ンのものである。同じレセプターの２つの鎖に結合したこのタンパク質の３次元
構造の決定（ｄｅ Ｖｏｓら、１９９２）は、４つのヘリックスバンドルのサイ
トカインおよびそれらのレセプターによる分子認識およびシグナル伝達に関与す
る原理を理解するための基礎を敷くことになった。その他のサイトカインレセプ
ター系に関する文献において利用可能であるデータから、そのリガンドにより誘
導されるレセプターホモまたはヘテロオリゴマー形成が、造血性サイトカインフ
ァミリーのメンバーによって使用される一般的なストラテジーであることは明ら
かである。

【００２７】 本発明を完全に理解するために、タンパク質のフォールディングを支配する原
理のいくつかを理解することは重要である。この分野における現在の理論は、フ
ォールディングの中間体が、ほとんどの天然に存在するタンパク質についてのフ
ォールディング経路に存在することを示す。これらの中間体のいくつかは、ネイ
ティブタンパク質への生産的なフォールディング経路を規定するが、一方、その
他は、凝集体を形成し得る経路外の種を代表し、そのタンパク質を不可逆的に非
ネイティブコンホメーションに指向する（Ｂａｌｄｗｉｎ、１９９６を参照のこ
と）。これらのフォールディング中間体のいくつかは安定であり、ネイティブコ
ンホメーションの特徴である三次相互作用を欠失するが、有意な量のネイティブ
様二次構造を含んでいる。ネイティブな状態は、これらの中間体における特異的
相互作用の「ファインチューニング」からのみ生み出される。これに鑑みて、凝
集の発生は、フォールディング反応が起こる環境に関して、フォールディング中
間体の可溶性および安定性の特性の関数として観察される。

【００２８】 温度感受性置換に関連するフォールディングの欠陥を軽減する効果を有する変
異が導入された研究から、成熟タンパク質の活性および安定性を変更せずに、フ
ォールディング経路を最適化することが可能であることが明らかになった。タン
パク質フォールディングの問題に関連する文献の詳細な議論は、Ｈｅｌｅｎａ
Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ（１９９９）のＰｈ．Ｄ．論文（「Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅ
ｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｆｏｌｄａｂｉｉｌｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｔｉｆ：ｔｈｅ ＩＬ−４ ｃａｓｅ」Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ Ｕｔｒｅｃｈｔ，ＩＳＢＮ ９０−３９３−２０８１−０）に見
出され得る。

【００２９】 この分野における背景文献から、インビトロおよびインビボの両方での凝集は
、会合する高い傾向を有し（Ｆｉｎｋ，Ａ．Ｌ．１９９８）、そしてタンパク質
を不活性なコンホメーションに導く非ネイティブ相互作用を確立する（Ｂｏｏｔ
ｈら、１９９７）フォールディング中間体の蓄積から、主に、生じることが導か
れる。タンパク質の独特の３Ｄ構造へのフォールディングは、図１に示される。
フォールディング中間体は、それらと遷移状態との間に高いエネルギー障壁が存
在するために、および／またはフォールディング状態と遷移状態との間のエネル
ギー障壁が低いことから、蓄積し得る。この図に示される最初の場合には、フォ
ールディングは、遅く、そしてフォールディング中間体の濃度は、高い。第二の
場合には、フォールディング状態は、頻繁に、生理学的条件下でアンフォールデ
ィングし、その結果として、フォールディング中間体の有意な濃度が存在し得る
。従って、フォールディング遷移状態に関して、フォールディング中間体の相対
的な不安定化および／またはフォールディング状態の安定化は、タンパク質がよ
り効率的にフォールディングすることを助け得る（Ｍｕｎｏｚら、１９９４ａ）
。

【００３０】 本発明は、サイトカインについてのフォールディング経路において任意の認識
可能な中間体を選択的に不安定化するアミノ酸置換の操作を組み込む方法に関す
る。このように得られる変異体は、発現の間に可溶性のままで、および／または
インビトロでより効率的にリフォールディングするかのいずれかである。同時に
、これらの変異体は、野生型タンパク質と類似の活性を有するものである。

【００３１】 本発明の方法の第１の局面は、サイトカインのアミノ酸配列を変異し、そうし
て、溶媒に曝露された疎水性残基を除去することを包含する。作製されたアミノ
酸置換は、疎水性残基（例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、メチオニン、プロリン）を、より極性の残基（例えば
、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミ
ン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）に置換することを含む。

【００３２】 この方法のこの局面は、フォールディング中間体が、しばしば、疎水性相互作
用によって安定化される有意な量の二次構造および不良に規定された三次構造の
存在によって特徴づけられるという観察に基づいている。従って、フォールディ
ング状態に曝露された疎水性残基は（三次フォールディングの結果として）、フ
ォールディング中間体に包埋されることが最もらしいようである。このような残
基のより極性のアミノ酸への変異は、フォールディング状態と比較して中間体を
、いわゆる逆疎水性効果へ不安定化する効果を有する。逆疎水性効果の模式図を
図２に示す。より親水性の残基による疎水性残基の置換は、変性された集団と中
間体との両方を、ネイティブの状態に比較して不安定化するはずである。これは
、フォールディング速度を増大し、そして中間体の蓄積から生じる動力学的凝集
プロセスを減少する。

【００３３】 溶媒に曝露された残基の同定のために利用可能な種々の方法が存在し、これら
には、標準的な分子グラフィックコンピュータプログラム（例えば、ＲａｓＭｏ
ｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍａｓｓ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｂｉｏ／ｒａｓｍ
ｏｌ／ｇｅｔｒａｓ．ｈｔｍで入手可能）、ＱＵＡＮＴＡ^TM（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａ
ｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１）およびＳｙｂｙｌ^TM（Ｔｒｉｐｏ
ｓ Ｉｎｃ．，１６９９ Ｓｏｕｔｈ Ｈａｎｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，６３１４４，ＵＳＡ））の使用が含まれる。さらに、タ
ンパク質の３次元構造が公知であることは必ずしも本質的ではない。多数の洗練
されたコンピュータプログラムおよびバイオインフォーマティックスプラットフ
ォームが、今や、利用可能になっており、これは、アミノ酸配列のみからタンパ
ク質構造がいくらかの正確性を有して予想されることを可能にする。その構造が
相同性モデリングまたはトレッディング法を使用して（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．１
９９７を参照のこと）入手可能である相同なオーソロガスまたは密接に関連する
サイトカインから未知の構造のサイトカインについて溶媒に曝露された残基の位
置を推定することもまた可能であり得る。その方法のこの工程において変異すべ
き残基を選択するときに、溶媒に曝露された疎水性残基は、理想的には、目的の
サイトカインとその他の相同なまたは密接に関連するサイトカインとの間で保存
されていないものが選択されるべきである。

【００３４】 例えば、ＩＬ−４の場合には、トリプトファン２３およびロイシン９１が、ヒ
ト配列において溶媒に曝露された残基であり；ＩＬ−４ファミリーのその他のメ
ンバーのほとんどにおいて、セリン残基（親水性）は、この位置に見出される。
従って、１つまたは好ましくは両方のこれらの残基が、変異についての良好な選
択を提供する。この場合には、セリンは、置換残基として勧められる選択である
。なぜなら、この残基は親水性であるばかりか、密接に関連するＩＬ−４タンパ
ク質におけるこの位置でのその存在は、この位置でのその存在が、おそらく、活
性に対して有害ではなく、そして有利でさえあり得ることを示唆することについ
ての支持を提供するからである。

【００３５】 その方法の第二の局面は、サイトカインのアミノ酸配列を変異させることを含
み、それにより、サイトカインにおける１つ以上の二次構造エレメントを安定化
させる。本発明のこの実施形態の好ましい局面において、ヘリックス安定化残基
は、そのタンパク質の配列に導入される。この方法のこのエレメントは、二次構
造エレメントが、近接する残基間の局所的相互作用のセットによって安定化され
るという観察に基づいている。二次構造エレメントにより、αヘリックスおよび
βシート、ループ、およびβターンを意味するが、好ましくは、αヘリックスで
ある。

【００３６】 好ましいαヘリックス促進アミノ酸残基には、アラニン、アスパラギン、シス
テイン、グルタミン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン
、トリプトファン、またはチロシンが含まれる。ヘリックスの構造を破壊するヘ
リックス破壊残基、例えば、プロリンおよびグリシンは、避けられるべきである
。

【００３７】 安定化した二次構造エレメントを含むタンパク質の合理的な設計を可能にする
多数の利用可能な技術が存在する。βシート構造の形成および安定性のもとにな
る原理は、今出現しようとしているところにすぎない。しかし、αヘリックスの
場合には、これらの原理は、特に十分に理解されている（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ
ｔｙおよびＢａｌｄｗｉｎ、１９９５を参照のこと）。この知識は、モデル合成
ペプチドでの研究から生じており、そしてまたそれらのαヘリックスにアミノ酸
置換を保有する変異タンパク質の熱力学および動力学的特性の分析からもまた生
じている。

【００３８】 重要な寄与は、ヘリックス構造の１つ以上のセグメント（いわゆるヘリックス
バンドル）（ＫｏｈｎおよびＨｏｄｇｅｓ、１９９８を参照）を有する新規なタ
ンパク質を設計するという意図から生じている。より頻繁には、設計されたタン
パク質は、フォールディングされたタンパク質に特徴的な特異的な三次相互作用
を欠くが、ヘリックスセグメントは、通常十分に規定されている。

【００３９】 これらの異なるタイプの研究から集められた情報は、水溶液中のペプチドのヘ
リックスの含有量を予想することができるアルゴリズムを開発しそして最適化す
るために使用されている。ＡＧＡＤＩＲと呼ばれるアルゴリズムは、これらの方
法の１つであり（Ｍｕｎｏｚら、１９９４ｂ、ｃ、ｄ；Ｍｕｎｏｚら、１９９７
；Ｌａｃｒｏｉｘら、１９９８）、高含量のヘリックス構造を有するペプチドの
設計において有用な道具であることが証明されている。

【００４０】 その方法のこのエレメントにおいて、構成アミノ酸配列のヘリックスの性向を
増大するために変異され得る残基を同定する場合、残基間の長距離相互作用は、
理想的には影響されないままであるべきである。標的残基は、理想的には、溶媒
に曝露されるべきであり、αヘリックス内での局所的な接触のみをなすべきであ
り、そしてその分子の残りとの広汎な相互作用に関与すべきではない。

【００４１】 所定のタンパク質のフォールディング動力学および安定性に対する改善された
局所的相互作用の効果は、フォールディング経路における最終的な中間体の熱力
学的および構造的特徴ならびにネイティブおよび変性状態のものに依存する。二
次構造のエレメントが遷移状態においてフォールディングされているが、フォー
ルディング中間体ではそうでない場合、有利なネイティブ様相互作用の導入を介
するその安定化は、フォールディングの遷移状態のエネルギー障壁を低くするべ
きであり、そのようにして、フォールディング反応を加速する（図３を参照）。
有利な静電対はまた、導入され得る。

【００４２】 サイトカインに変異するために適切なヘリックス（ｈｅｌｉｘ）の選択におい
て、いくつかの基準が検討され得る。第一に、密接に関連するサイトカインファ
ミリーのメンバーの中で保存されていないヘリックスを選択することは有利であ
る。第二に、例えば、ＩＬ−４の場合、このサイトカインのヘリックスＣのＮ末
端における残基のような、レセプター結合に関与しない残基が選択されるべきで
ある。第三に、構造上可撓性のヘリックスを選択することは有利であり得る。し
かし、これは必要な事例ではなく、そしてしばしば特定のヘリックスが可撓性で
あるか否かは公知ではない。特定のヘリックスまたはその一部が非常に可撓性で
あることが公知であり、次いで特にこの可撓性部分が機能的部位に対応していな
い場合、この部位は変異誘発による安定に明らかによい標的である。このことは
、関連するサイトカイン核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅ
ｓｉｄｅｎｃｅ）での¹⁵Ｎ緩和および水素交換の研究により予期され得る。

【００４３】 低い平均ヘリックス含量を有するタンパク質の範囲において、この領域の平均
ヘリックス含量を増加する変異は、導入され得る。これらの変異は、置換する残
基よりよいヘリックス形成物である残基を含む（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ １
９９５；Ｍｕｎ〜ｏｚおよびＳｅｒｒａｎｏ、１９９４ｅを参照のこと）。変異
もまた、好都合な静電対の形成を可能にするように導入され得る。

【００４４】 ヘリックス形成アミノ酸置換を設計しサイトカインの安定性を改善するために
サイトカインに組み込む場合、天然にフォールディングされたタンパク質に存在
する以外に、αヘリックスはまたフォールディング問題を引き起こす中間体に存
在する場合には、その安定化はフォールディング状態および中間状態の両方に同
程度影響し、従って、少なくとも低濃度の変性剤の下では、リフォールディング
における顕著な効率は、見られないことを心に留めておくべきである。中程度の
濃度または高濃度の変性剤において、中間体は、天然の状態に関して不安定であ
り、そしてフォールディングは、より速く進行する。

【００４５】 αヘリックスが中間体には存在しないが遷移状態において存在する場合、その
安定化は、中間体と遷移状態との間に低いエネルギー障壁を生じ、そして引き続
きフォールディング速度を増加する。従って、タンパク質フォールディング実験
において用いたものと同様に、中程度の濃度の変性剤の下で、αヘリックスの安
定化は、常にフォールディング反応を加速し、より生産的なフォールディングプ
ロセスを導く。

【００４６】 ヘリックスＣは、本発明者らによって本発明に従うサイトカインの安定化に好
ましいヘリックスであると考えられる。このヘリックスの安定化は、フォールデ
ィング中間体によって媒介されるタンパク質凝集を阻止することによって働くと
考えられ、おそらくは、フォールディング反応の加速および付随する優勢なフォ
ールディング中間体の濃度の減少に起因する。

【００４７】 ＩＬ−４の特定の例において、ヘリックスＣは、ＩＬ−４ファミリーのメンバ
ーの中であまり保存されていない。さらに、Ｎ末端の第一残基はレセプターへの
結合に関与しないことが公知であり（Ｗａｎｇら、１９９７）、そしてＩＬ−４
における核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
）での¹⁵Ｎ緩和および水素交換の研究は、ヘリックスＣのこの領域が非常に可撓
性であることを示した（Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、１９９２；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、
１９９４ａ；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、１９９４ｂ）。これらの観察のさらなる支持
として、アルゴリズムＡＧＡＤＩＲｌｓ−２はこのヘリックスについて低い平均
ヘリックス含量（４％）を予想する。

【００４８】 ＩＬ−４についてのヘリックス安定化変異の例は、以下の変異である：スレオ
ニン６９からセリンへ；グルタミン７１からアラニンへ；グルタミン７２からグ
ルタミン酸へ；フェニルアラニン７３からアラニンへ；ヒスチジン７４からアス
パラギンへ。次いで、配列ＳＡＡＥＡＮは、ＩＬ−４アミノ酸配列全長の６９〜
７４位に導入されＴＡＱＱＦＨを置換し得る。

【００４９】 ＩＬ−４のヘリックスＣを変異させる場合、よりよいヘリックス形成物である
アミノ酸残基を導入すると同時に、野生型タンパク質に存在するＮキャッピング
ボックスモチーフ（Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｑ）は、ヘリックスの形成を促進すると同時に
よりよい対象物（Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｅ）によって置換され得る。本発明のこの実施形
態において、野生型ＩＬ−４ヘリックス配列：

【００５０】

【化１】 は、配列

【００５１】

【化２】 によって置換され得る：下線を引いた残基はこれらの変異である。

【００５２】 ＩＬ−４機能的レセプターは、高親和性成分であるＩＬ−４Ｒα、および標的
細胞に依存してＩＬ−２共通γ鎖（Ｒｕｓｓｅｌら、１９９３）またはＩＬ−１
３Ｒα（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９５）のいずかであり得る低親和性サブユニ
ットを含むヘテロダイマーとして示された。Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９５に報
告されたデータは、ＩＬ−４は、２型ＩＬ−４レセプターと呼ばれる異なるレセ
プターに結合し得ることを示唆する。このレセプターは、ＩＬ−４Ｒα鎖および
ＩＬ−１３の低親和性結合レセプター（ＩＬ−１３Ｒα）から構成される。これ
らのデータは、ＩＬ−２およびＩＬ−１３が特定の型の細胞におけるＩＬ−４に
類似して生物学的応答を誘発し得ることの理由を説明する。従って、ＩＬ−４の
特定の場合において、本発明者らは、ＩＬ−４Ｒαへのサイトカインの結合を可
能にするがＩＬ−１３Ｒαおよび／またはγ_c鎖へのサイトカインの結合を妨げ
るようにサイトカインを変異することは有利であると考える。２つのサイトカイ
ンを同時に阻害する可能性は、アレルギー性疾患に関連する徴候を阻止するに有
効な手段を実証し得る；この理由によって、これらのＩＬ−４アンタゴニストは
、治療的関心が高い。

【００５３】 本発明に従う変異誘発が実施されると同時に天然のタンパク質のフォールディ
ングを安定にする目的の変異以外に、変異を導入することはまた有利であり得る
。例えば、ＩＬ−４の２つの有効なアンタゴニストは、すでに文献に報告されて
いる。これらは、ＩＬ−４Ｙ１２４Ｄ（Ｙ）（Ｋｒｕｓｅら、１９９２）および
ＩＬ−４Ｒ１２１ＤＹ１２４Ｄ（ＲＹ）（Ｋｒｕｓｅら、１９９３；Ｔｏｎｙら
、１９９４）である。これらのＩＬ−４変異体は、野生型タンパク質のＫ_dに類
似するＫ_dでＩＬ−４Ｒαに結合するが、第二のレセプター成分を集め得ない（
Ｄｕｓｃｈｌら、１９９５）。これは、ＩＬ−４Ｒαとの非生産的な複合体の形
成を生じ、検出可能な生物学的活性を有さない。ＩＬ−４アンタゴニストもまた
、ＩＬ−１３を阻害することが示されている（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、１９９８
；Ｔｏｎｙら、１９９４）。なぜなら、このサイトカインのレセプター系は、シ
グナル伝達のためにＩＬ−４Ｒαを必要とするからである（Ｓｍｅｒｚ−Ｂｅｒ
ｔｌｉｎｇら、１９９５；Ｔｏｎｙら、１９９４）。従って、１つの局面におい
て、本発明は、ＩＬ−４アミノ酸配列全長における１２１位および／または１２
４位のアスパラギン酸残基の置換に関する。

【００５４】 本明細書中に示された発見は、タンパク質中のαヘリックス配列がタンパク質
の最大安定性のために必ずしも最適化されない知見を支持する。タンパク質が合
成されそしてそれらの天然の環境において作用し、それらの生物学的役割を果た
すように発展する場合、これは、何ら問題を示さない。しかし、フォールディン
グ経路において天然のタンパク質の安定性および他の種の安定性を調整し得る異
種性環境においてタンパク質が合成されそして操作される場合、状況は異なる。
この場合、αヘリックスの安定性における改善は、天然の状態の安定性およびフ
ォールディング反応の速度の両方を増加し得る。

【００５５】 さらに、ＡＧＡＤＩＲのような特定のアルゴリズムは、増強された安定性を有
するヘリックス配列の合理的な設計のための優れた道具として見出された。

【００５６】 本発明のさらなる局面に従って、この方法は、そのＮ末端においてサイトカイ
ンのプロ配列を含むさらなる工程ｃ）を包含する。種々のプロテアーゼ、増殖因
子、ポリペプチドホルモン、神経ペプチドおよび血漿タンパク質を含む多くのタ
ンパク質が、プレプロタンパク質の形態でインビボで合成されることは公知であ
る。プレ配列は、タンパク質を小胞体（ＥＲ）内へ輸送するためおよび細胞外へ
分泌するためにタンパク質を標的化する。プロ配列は、通常プレ配列に続いてＮ
末端に付加されるが、Ｃ末端または両方の組合せにおいてもまた見出され得る。
タンパク質フォールディングにおけるプロ配列の役割は、異なるプロテアーゼを
用いる研究から示唆された（総説に関してはＳｈｉｎｄｅら、１９９３；Ｅｄｅ
ｒおよびＦｅｒｓｈｔ、１９９５を参照のこと）。

【００５７】 プロ配列媒介性フォールディングの最も広範に調査された事例は、サブチリシ
ン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（Ｅｄｅｒら、１９９３）およびαリチック（α−
ｌｙｔｉｃ）プロテアーゼ（Ｂａｋｅｒら、１９９２）のものである。プロペプ
チドの非存在下で、これらのタンパク質は、安定で部分的にフォールディングさ
れたモルテングロビュール状態の特性を有するが酵素活性を欠く中間体にフォー
ルディングされる。プロ配列の添加は、フォールディングについての遷移状態の
安定化か非天然の中間体の不安定化のいずれかによってフォールディング反応の
活性化エネルギー障壁を低くし、天然のコンホメーションの形成を生じる（図４
を参照のこと）。

【００５８】 本発明のさらなる局面に従って、この方法は、フォールディング酵素および／
またはシャペロンタンパク質と関連して宿主細胞中にサイトカインを発現するさ
らなる工程ｄ）を包含する。

【００５９】 近年、細胞におけるタンパク質のフォールディングがフォールディング酵素お
よびシャペロンとして公知の異なる２つのクラスのアクセサリータンパク質によ
って媒介されることが明らかになってきた。フォールディング酵素は、ジスフィ
ルド結合の形成および異性化、およびプロリン残基の前方にあるペプチド結合の
異性化のような工程を触媒する。多くの研究において、フォールディング酵素の
同時発現は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム内に分泌されたタンパク質のフォール
ディングを促進することが見出された（総説に関してはＧｅｏｒｇｉｏｕおよび
Ｖａｌａｘ １９９６；Ｈｏｃｋｎｅｙ、１９９４を参照のこと）。

【００６０】 ２つの最も広範に特徴付けられたシャペロンのファミリーは、Ｈｓｐ７０（Ｄ
ｎａＫならびにそのヘルパータンパク質であるＤｎａＪおよびＧｒｐＥを含む）
およびＨｓｐ６０である。後者はまた、シャペロニンファミリーとして公知であ
り、そして細菌性ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ系ならびにミトコンドリアおよび葉緑
体において見出されるいくつかのアナログを含む（総説に関してはＨａｒｔｌら
、１９９４；ＭａｒｔｉｎおよびＨａｒｔｌ、１９９４）。ＧｒｏＥＬ／Ｇｒｏ
ＥＳ系は、構造的（Ｂｒａｉｇら、１９９４；Ｍａｎｄｅら、１９９６）にも機
構的にも（ＣｏｒｒａｌｅｓおよびＦｅｒｓｈｔ、１９９６）両方とも深く研究
された。ＧｒｏＥＬは、互いの先端に２つの七量体環を含み、その先端に蓋を有
する２重のドーナッツを形成する（ＧｒｏＥＳ）。実験的証拠は、Ｈｓｐ７０お
よびＨｓｐ６０が連続的に関連するＥ．ｃｏｌｉの細胞質におけるタンパク質フ
ォールディングについてのモデルを指摘する（Ｌａｎｇｅｒら、１９９２）。Ｈ
ｓｐ７０ファミリーのメンバーは、タンパク質が合成され、そしてモルテングロ
ビュール様状態に達するまで第一のフォールディング工程を通して先導するよう
に同時翻訳的にタンパク質を結合する。次いで、これらの中間体の表面上に曝露
された疎水性の斑は、フォールディングの能力のある状態にこれらを維持するＧ
ｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ系によって認識される。ポリペプチド鎖のフォールディン
グは、ＧｒｏＥＬのハロ構造の内側に生じ、そしてこのタンパク質はＡＴＰ加水
分解の際に開放される。１サイクルが適切なフォールディングに十分でない場合
、正確にフォールディングされた状態が達成されるまで手順は反復される（Ｈｅ
ｙｒｏｖｓｋａら、１９９８）。

【００６１】 シャペロン関連タンパク質の発現を実施するために、細菌は２つの異なるプラ
スミドで形質転換されるべきである。１つは目的のタンパク質をコードする遺伝
子を含み、そして他方はシャペロンをコードする遺伝子を含む。これらのプラス
ミドは、異なる複製起点を有し、その結果、これらは同一の細菌細胞内に安定的
に維持され得る。さらに、これらのプラスミドは、両方のプラスミドが同時に存
在するための選択を可能にするために異なる抗生物質耐性マーカーを保有すべき
である。プロモーターは通常これら２つのプラスミドについて同一であり、その
結果、標的タンパク質およびシャペロニンの発現は付随して誘導され得る。いく
つかの場合において、異なるプロモーターを使用することは、シャペロニンをよ
り早く誘導し得るために有用であり得る。次いで、シャペロニンのレベルがフォ
ールディングを効率的に媒介するためにすでに十分高い場合、標的タンパク質の
発現は、後期で誘導される（Ｃｏｌｅ、１９９６）。

【００６２】 ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳまたはＤｎａＫ／Ｊのオペロンの同時発現が可溶性タ
ンパク質の量を増加することが報告された文献において十分に証明された、いく
つかの事例が存在する。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、ＧｒｏＥＬ
／Ｓの非存在下で封入体として産生されるタンパク質の１つである。このシャペ
ロニン系はタンパク質と同時発現される場合、可溶性画分に存在するタンパク質
の量は劇的に増加し、１リットルの細菌培養当たり３〜５ｍｇの活性な酵素の精
製を可能にする（Ｄａｌｅら、１９９４）。同様の効果が、ＧｒｏＥＬ／Ｓまた
はＤｎａＫといくつかのチロシンキナーゼとの同時発現について観察された（Ａ
ｍｒｅｉｎら、１９９５）。ＤｎａＫの同時産生はまた、ｈＧ−ＣＳＦ（Ｐｅｒ
ｅｚ−Ｐｅｒｅｚら、１９９５）およびｈＧＨ（Ｂｌｕｍら、１９９２）、ＩＬ
−４ファミリーの２つのサイトカインの改善された溶解度を示した。

【００６３】 好ましくは、工程ｄ）において使用されるシャペロニンは、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ
系またはチオレドキシンである。しかし、特定のタンパク質のインビボにおける
フォールディング特性を改善するために選択されるシャペロンとしての一般的な
役割はない。凝集しがちな中間体に結合し得るシャペロンは、最も適切なもので
あるが、実験を行うことによってのみこの答えが見出され得る。さらに、いくつ
かのタンパク質について、シャペロンの発現は、可溶性タンパク質を得るに十分
ではなく、そして上述されたいくつかの因子を連結するアプローチがより適切で
あり得る。ウシピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼの触媒サブユニット
に関して、可溶性で活性なタンパク質を得るために増殖温度を３０℃まで低下さ
せることが必要であることが見出された（Ｌａｗｓｏｎら、１９９３）。考慮に
入れられるべき別の因子は、シャペロンとの同時発現は標的タンパク質の発現レ
ベルを減少させ得るということである。おそらくは、この効果は、リボソーム、
アミノ酸またはｔ−ＲＮＡのようなタンパク質合成に要求される成分について、
シャペロンとタンパク質との間の競争から生じる（Ｄａｌｅら、１９９４）。さ
らに、高レベルのシャペロン発現は、Ｅ．ｃｏｌｉに有害であり得（Ｂｌｕｍら
、１９９２）そして、生物薬剤学の大スケール産生に使用される醗酵槽において
シャペロンを過剰発現する細胞の挙動についでほとんど知られていない（Ｇｅｏ
ｒｇｉｏｕおよびＶａｌａｘ、１９９６）。

【００６４】 本発明のさらなる局面に従って、上述された本発明の局面のいずれか１つに従
う方法によって作製された変異サイトカインおよびそのフラグメント、そしてそ
の機能的に等価な改変体が提供される。このようなサイトカインは、インターロ
イキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、増殖因子または
ケモカインであり得る。好ましくは、本発明に従って安定化されたサイトカイン
は、例えば、造血系またはクラスＩのサイトカインスーパーファミリーに属する
「４ヘリックスの束」のサイトカインであり、ＨＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＦ
Ｃ、ＬＩＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−６が挙げられ
る。哺乳動物についての薬物の商業的価値を向上させるために、哺乳動物（特に
ヒト）由来のサイトカインは、本発明に従う安定化についての好ましい標的であ
る。

【００６５】 用語「機能的に等価な」とは、変異サイトカインタンパク質が野生型のタンパ
ク質が有する生物学的機能の１つ以上を維持することを意味する。ＩＬ−４の場
合、このような機能は、免疫細胞の増殖および分化の制御、駆虫大寄生虫に対す
る防御、特定の腫瘍の拒絶およびＩｇＥ抗体の特異的な誘導のような機能を含む
。他のサイトカインの生物学的機能は、当業者に明らかである。用語「改変体」
は、例えば、天然の生物学的改変体（例えば、サイトカイン分子が由来した種に
おける対立遺伝子改変体または地理的な改変）と同様に、野生型のサイトカイン
の配列からのアミノ酸の置換、挿入または欠失をふくむ変異体を含む。野生型の
配列の機能から改善された機能を有する改変体は、タンパク質配列における特定
の残基の組織的または方向性を有する変異を通じて設計され得る。この用語もま
た、野生型サイトカインに構造的に類似する分子、または類似もしくは同一の三
次構造を含む分子をいう。

【００６６】 上述の分子の誘導体、改変体および機能的等価物はまた、本発明のこの局面の
実施形態として含まれる。このような誘導体は、改変されたサイトカインのアミ
ノ末端またはカルボキシ末端に融合される１つ以上のさらなるペプチドまたはポ
リペプチドを含み得る。さらなるペプチドまたはポリペプチドの目的は、タンパ
ク質の検出、発現、分離または精製を補助することであり得るか、あるいはこの
タンパク質に所望のさらなる特性を与え得る。潜在的な融合パートナーの例とし
ては、βガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェ
ラーゼ、ポリヒスチジンタグ、Ｔ７ポリメラーゼフラグメント、分泌シグナルペ
プチドまたは別のサイトカインもしくはサイトカインレセプターが挙げられる。
このような誘導体は、遺伝的にかまたは化学的にかのいずれかでペプチドを融合
することによって調製され得る。

【００６７】 好ましくは、本発明の方法によって産生された変異サイトカインは、少なくと
も２倍のフォールディング収率の増加を示し、好ましくは、５倍以上、またはよ
り好ましくは１０倍以上である。

【００６８】 本発明の１つの好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−４またはそ
の誘導体である。ＩＬ−４は非常に重要な免疫調節サイトカインであり、種々の
型の免疫細胞の増殖および分化を制御し、これは、駆虫大寄生虫に対する防御、
および特定の腫瘍の拒絶に関する。おそらくは、ＩＬ−４の最も重要な臨床的役
割は、代表的には、アレルギー性反応に関与する症例の発達に関与するＩｇＥ抗
体の特異的な誘導である。ＩＬ−４がアレルギー性応答において優勢な役割を有
することは、Ｂ細胞がＩｇＥまたは他の型の抗体を惹起するかをこのタンパク質
が決定するように、現在明白である。従って、ＩＬ−４の活性を妨害し得る薬物
は、ＩｇＥレベルを減少する補助をし、そしてアレルギー性反応を薬学的コント
ロールに反応するようにする。このような薬物の設計の必須条件は、ＩＬ−４の
そのレセプター系への結合を決定する原理の詳細な理解である。全長配列におい
て２３位、９１位または２３位と９１位の両方が変異されたヒトＩＬ−４、およ
びその機能的に等価なフラグメントまたは改変体は、本発明の特に好ましい局面
を形成する。有利なことに、これらの部位に導入されたいずれの変異も、セリン
残基であり得る。あるいは、またはさらに、ＩＬ−４タンパク質は、以下の変異
の１つ以上を含み得る：６９位のスレオニンからセリンへ；７１位のグルタミン
からアラニンへ；７２位のグルタミンからグルタミン酸へ；７３位のフェニルア
ラニンからアラニンへ；７４位のヒスチジンからアスパラギンへ。次いで、配列
ＳＡＡＥＡＮは、全長のＩＬ−４アミノ酸配列の６９〜７４位に導入され、ＴＡ
ＱＱＦＨを置換し得る。

【００６９】 本発明のなおさらなる局面に従って、全長のアミノ酸配列の６８〜９５位に配
列ＡＳＡＡＥＡＮＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧを含むヒトＩＬ
−４、およびその機能的に等価なフラグメントまたは改変体が提供される。

【００７０】 本発明の方法によって作製されたＩＬ−４タンパク質およびその誘導体は、Ｉ
Ｌ−４Ｒαの精製に使用され得る。従って、本発明は、ＩＬ−４Ｒαタンパク質
の調製のための方法を提供する。この方法は、ＩＬ−４Ｒαを含む組成物を変異
ＩＬ−４タンパク質が結合するアフィニティカラムに通す工程、そのカラムを洗
浄する工程、そしてそのカラムからＩＬ−４Ｒαを溶出する工程を包含する。好
ましくは、変異ＩＬ−４タンパク質は、全長配列の２３位、９１位または２３位
および９１位の両方において変異され、最も好ましくは、これらの位置のいずれ
かまたは両方においてセリンに変異される。あるいは、またはさらに、ＩＬ−４
タンパク質は、１つ以上の以下の変異を含み得る：スレオニン６９からセリンへ
；グルタミン７１からアラニンへ；グルタミン７２からグルタミン酸へ；フェニ
ルアラニン７３からアラニンへ；ヒスチジン７４からアスパラギンへ。

【００７１】 現在、ＩＬ−４Ｒαは、ＩＬ−４ＷＴでパックされる非常に高価な精製カラム
でアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。上述の方法によって産
生された安定化された変異ＩＬ−４タンパク質は、大量に産生するにさほど高価
ではなく、従って、精製カラムを低価格で作製することを可能にし、治療用の使
用のためのＩＬ−４Ｒαタンパク質の調製の費用を減少させる。

【００７２】 本発明のなおさらなる局面に従って、上述の本発明の局面のいずれか１つに従
って変異されたサイトカインの使用が提供され、サイトカインに対する抗体が作
製される。特に、上述のような変異ＩＬ−４タンパク質は、本発明のこの局面に
使用され得る。本方法によって作製された抗体は、診断道具および治療道具とし
て重要な用途を有する。

【００７３】 本発明のなおさらなる局面に従って、上述のような変異サイトカインのフラグ
メントを含むペプチド、またはその機能的等価物が提供される。

【００７４】 このようなペプチドは、野生型サイトカイン由来であり得るか、または合成的
にかもしくは遺伝子操作の技術を使用して調製され得る。特に、サイトカインの
３次構造または活性部位を模倣するように設計される合成分子は、有利であると
見なされる。ペプチドは理想的な治療薬物ではないが、化学合成法によって容易
に入手され得るという事実は、ペプチドの本質的な安定性およびタンパク質分解
に対する耐性を増加し得る、非天然のアミノ酸、改変ペプチド結合または化学基
の組込みを可能にする。さらに、活性ペプチドは、コンビナトリアルスクリーニ
ングを通してさらに最適化され得る導入化合物として使用され得、そして治療用
薬物に要求される生物安定性および生物学的利用能を示す小さな有機骨組みによ
って競い合い得る（Ｅｍｍｏｓら、１９９７を参照のこと）。

【００７５】 重要な問題は、最も効率的な方法で所望の生物学的効果を媒介し得る最も可能
性のあるペプチド候補をいかにして見出すかである。分子力学（ＭＤ）シュミレ
ーションは、フォールディングに関して最も見込みのある候補の選択において合
理的な設計を補助し得る１つの方法を提供する（Ｃｒｅｇｕｔら、１９９９を参
照のこと）。従って、合理的なストラテジーを多様な機能的特性を有する化合物
のライブラリーをスクリーニングすることによって最良のペプチドリガンドが選
択される非合理的なアプローチと結合することは、しばしば都合がよい。ファー
ジディスプレイ技術は膨大なペプチドライブラリーの作製およびスクリーニング
において役立ってきた（Ｃｗｉｒｌａら、１９９０；Ｓｍｉｔｈら、１９８５）
。この方法論は、首尾よく使用され、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）のペプチド
模倣物が単離された（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）。これらのペプチドの１
つは、推定０．２μＭのＫ_dでＥＰＯレセプターを結合し得、そしてＥＰＯレセ
プターとの複合体におけるこのペプチドの３次元構造もまた、決定された（Ｌｉ
ｖｎａｈら、１９９６）。小ペプチド（２０残基）は二量体化して、２つのＥＰ
Ｏレセプター分子に結合し得る４重鎖の逆平行βシートを形成し、そしてインビ
ボにおける細胞増殖およびマウスにおける赤血球生成を刺激することが示されて
いる（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６）。

【００７６】 スクリーニング法の主要な不利益は、標的への結合のためにライブラリーをパ
ンするに長時間を要することである。次いで、最良のヒットを特徴付けそして時
間を浪費する選択の別の周回を開始することが必要である。従って、構造的デー
タおよび突然変異誘発のデータを統合する合理的なストラテジーを考案すること
が重要である。この方法で設計された分子模倣物は、コンビナトリアルスクリー
ニング研究の第一の周回において（代表的には高いμＭの範囲において）見出さ
れたものと比較し得る親和性を有する確実な開始点を提供するようである。ファ
ージディスプレイおよび合理的な設計を結合するアプローチは、以前使用され、
プロテインＡの３ヘリックスＺドメインの２ヘリックス誘導体の安定性および親
和性を改善する。この５９残基の３ヘリックスの束は、免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）のＦｃ部分と１０ｎＭのＫ_dで結合する。結合ドメインは、野生型タンパク
質と実質的に同様の親和性でＩｇＧと結合し得る３３残基のペプチドにまで減少
した（Ｂｒａｉｓｔｅｄら、１９９６）。

【００７７】 本発明のさらなる局面に従って、上述のような本発明の局面のいずれか１つに
従う変異サイトカインまたはペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明
はまた、サイトカインまたはペプチドをコードする核酸を宿主細胞（例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉ細菌）に導入する工程を包含する、上記のようなサイトカインおよび
ペプチドの産生の方法を含む。

【００７８】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の上記の局面のいずれか１つに従
う変異サイトカインまたはペプチドが、製剤としての使用のために提供される。
本発明のさらなる局面は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける疾患の処置または
予防のための医薬の製造におけるこのようなサイトカインまたはペプチドの使用
を提供する。有利なことに、疾患は、アレルギー関連状態であり得る。本発明は
また、上記のような変異サイトカインまたはペプチドを患者に投与する工程を包
含するアレルギーを予防または処置する方法を提供する。

【００７９】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の上述の局面のいずれか１つに従
う変異サイトカインまたはペプチドを、必要に応じて薬学的に受容可能な塩とし
て、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む薬学的組成物が提供される
。本発明はまた、このような薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する
。ここで、このような変異サイトカインまたはペプチドは、薬学的に受容可能な
キャリアと一体にされる。

【００８０】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の上記の局面のいずれか１つに従
う変異サイトカインまたはペプチドを含む診断キットが提供される。

【００８１】 本発明はまた、本発明の上記の局面のいずれか１つに従う変異サイトカインま
たはペプチドをコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック非ヒト哺乳
動物を提供する。本発明のさらなる局面は、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウス
の胚に変異サイトカインまたはペプチドをコードする核酸分子を導入する工程を
包含する、このようなトランスジェニック動物を作製するためのプロセスを提供
する。

【００８２】 本発明の種々の局面および実施形態は、特にＩＬ−４の安定化のための方法に
関して、実施例の目的でより詳細に記載される。細部の改変が本発明の範囲を逸
脱せずになされ得ることが明らかである。

【００８３】 （実施例１：ｈＩＬ−４の凝集を妨害するように合理的に設計された変異誘発
） インターロイキン４は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける過剰発現の際に封入体を形成し
、そしてこのタンパク質のインビトロでのリフォールディングは、非常に非効率
であり、非常に少量の活性タンパク質しか得られない。インビトロおよびインビ
ボの両方における凝集は、会合する傾向が高いフォールディング中間体の蓄積か
ら主に生じ（Ｆｉｌｉｍｏｎｏｖら、１９９３）、そしてこのタンパク質を不活
性なコンホメーションに指向させる非ネイティブ相互作用を確立する（Ｂｏｏｔ
ｈら、１９９７）と考えられる。

【００８４】 本発明者らは、ＩＬ−４のフォールディング経路における任意の推定の中間体
を選択的に不安定化するために、２つの異なるストラテジーを用いた。

【００８５】 （１．１ 方法） （クローニング） ＩＬ−４遺伝子を、ＰＣＲによって、以前に記載されたプ
ラスミドＲ^tsｐｒＣ１０９／ＩＬ４（Ｋｒｕｓｅら，１９９１）から得た。Ｎｃ
ｏＩおよびＢａｍＨＩを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれ５’末
端および３’末端に導入した：Ｏｌｉｇｏ５’：ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＣ Ｃ ＡＴＧ Ｇ ＡＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＧＡＴ；Ｏｌｉｇｏ３’：Ａ
ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＡＣＡ。野生型Ｉ
Ｌ−４をコードする遺伝子および変異タンパク質をコードする遺伝子を、Ｎｃｏ
Ｉクローニング部位とＢａｍＨＩクローニング部位との間でＰＢＡＴ４（Ｐｅｒ
ａｅｎｅｎら、１９９６）中に挿入した。５’末端でのＮｃｏＩ部位の導入に起
因して、野生型ＩＬ−４タンパク質およびＩＬ−４変異タンパク質は、さらなる
アミノ酸（Ａｓｐ）をＮ末端に伴って発現される。

【００８６】 （部位特異的変異誘発） 変異体ＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４ＢＣｈｅｌ
ｉｘを、ＰＣＲ（Ｈｏら、１９８９）によって、オリゴ５’およびオリゴ３’を
隣接配列として用いて、そして以下の変異誘発プライマー（５’から３’）を用
いて得た：ＩＬ−４Ｌ２３Ｓａ：ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＴＡ Ｇ
ＴＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＴ ＴＧＡ ＣＣＧ：ＩＬ−４Ｌ２３Ｓｂ：ＣＧＧ
ＴＣＡ ＡＣＴ ＣＧＧ ＴＧＣ ＡＡＣ ＴＡＧ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＣＴ
ＣＴＧ。ＩＬ−４Ｗ９１Ｓａ：ＡＧＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ Ｃ
ＴＧ ＧＣＧ ＧＧＣ ＴＴＧ；ＩＬ−４−Ｗ９１Ｓｂ：ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＧ
Ｃ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＣＴ。ＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉ
ｘａ：ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＣＧ ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ Ａ
ＡＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＡＡＧ Ｃ。ＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘｂ：Ｇ ＣＴＴ
ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＣＧＣ
ＡＣＣ ＣＡＧ。二重変異体ＩＬ−４Ｌ２３Ｓ Ｗ９１Ｓを、ＩＬ−４Ｌ２３Ｓ
をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用い、そして上記に列挙したＩＬ−４
Ｗ９１Ｓプライマーを用いて作製した。

【００８７】 （ペプチド合成） ペプチドを、連続フロー装置中でポリオキシエチレン−ポ
リスチレングラフト樹脂上で合成した。ペプチド鎖のアセンブリーを、Ｆｍｏｃ
化学（Ｃａｒｐｉｎｏら、１９７２）およびＰｙＢＯＰによるアミノ酸基本骨格
のインサイチュ活性化（Ｃｏｓｔｅら、１９９０）を用いて行った。このペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣによって精製し、そしてレーザーデソープション質量分析法（
ＭＡＬＤＩ）によって特徴付けた。

【００８８】 （１．２ 極性残基による、フォールディング状態で露出した疎水性残基の置
換） フォールディング中間体はしばしば、顕著な量の二次構造および不明確な三次
構造の存在によって特徴付けられ、疎水性相互作用によって安定化されている。
それゆえ、三次フォールディングの結果としてフォールディング状態で露出して
いる疎水性残基が、フォールディング中間体内に埋もれていることが極めて最も
らしい。極性アミノ酸へのこれらの残基の変異は、いわゆる逆の疎水性効果（Ｐ
ａｋｕｌａおよびＳａｕｅｒ、１９９０）を通して、中間体をフォールディング
状態に対して不安定化するに違いない。

【００８９】 ２つの非保存的な、溶媒露出アミノ酸残基がＩＬ−４において同定された：Ｔ
ｒｐ ９１およびＬｅｕ Ｌ２３。ＩＬ−４ファミリーの他のメンバーの大部分
では、セリンが、対応する位置に見出され、それゆえ、このアミノ酸を選択して
、ヒトタンパク質においてＷ９１およびＬ２３を置換した。このようにして得ら
れた２つの点変異体は、ＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４Ｌ２３Ｓと命名し、そ
して両方の変異を保有する変異体をＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓと命名する。

【００９０】 （１．３ 二次構造エレメントの安定化） 二次構造エレメントは、隣接残基間の局所相互作用のセットによって安定化さ
れる。

【００９１】 （１．３．１ ＡＧＡＤＩＲを用いたα−ヘリックスの安定化） ＡＧＡＤＩＲは、溶液中のモノマーペプチドのコンホメーション研究に由来す
る経験的データに基づく。このアルゴリズムは、この情報を用い、ヘリックス−
コイル遷移理論に基づいて、所定のヘリックスセグメントの自由エネルギー（Δ
Ｇ_helix）を算出する。この自由エネルギーは、このヘリックス内の種々の相互
作用の寄与を反映し、そしてランダムコイル状態とヘリックス状態との間での自
由エネルギーの差に対応する。最新のバージョンのアルゴリズム（ＡＧＡＤＩＲ
１ｓ−２，Ｌａｃｒｏｉｘら，１９９８）では、ヘリックスセグメントの自由エ
ネルギーは、以下に従って記載される： ΔＧ_helix＝ΔＧ_int＋ΔＧＨ_bond＋ΔＧ_SD＋ΔＧ_nonH＋ΔＧ_dipole＋ΔＧ_{elec t} ここで、ΔＧ_intは、所定のアミノ酸がヘリックスコンホメーションにある固有
の傾向であり（Ｍｕｎ〜ｏｚら、１９９４ｅ）、そしてアミノ酸をヘリックス二
面角に固定する際に生じるコンホメーションエントロピーの損失を表す。ΔＧＨ _bond は、ｉ，ｉ＋４主鎖−主鎖水素結合のエンタルピーの寄与（ｅｎｔｈａｌｐ
ｉｃ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）であり；ΔＧ_SDは、ヘリックスセグメントに
おけるｉ，ｉ＋３およびｉ，ｉ＋４の位置での側鎖−側鎖非荷電相互作用の寄与
を表す。イオン化可能な側鎖を有するアミノ酸残基については、これらの型の相
互作用のｐＨ依存性を考慮する。ΔＧ_dipoleは、ヘリックスセグメント内または
ヘリックスセグメント外の荷電した基間の、ヘリックス巨大双極子（ｈｅｌｉｘ
ｍａｃｒｏｄｉｐｏｌｅ）による相互作用を反映する。荷電した基の存在とは
独立している別の型の相互作用は、イオン強度の増加に伴って観察されるα−ヘ
リックスの安定性における増加を伴って行われなければならない（Ｓｃｈｏｌｔ
ｚら，１９９１）。α−ヘリックスはランダムコイルよりもずっと大きな双極子
モーメントを有するので、イオン強度の増加は好ましくは、α−ヘリックスを安
定化して、平衡をこのコンホメーションの方にシフトさせる。この効果もまた、
所定のイオン強度を有する溶液中および純水中での特定のα−ヘリックスのフォ
ールディングの自由エネルギーの差を考慮することにより、ＡＧＡＤＩＲ１ｓ−
２によって考慮される。ΔＧ_electは、ヘリックス巨大双極子に関する、ヘリッ
クスセグメントの内側および外側の２つの荷電した残基（ＮｃａｐおよびこのＮ
ｃａｐの前にある残基、ならびにＣｃａｐおよびこのＣｃａｐの次にある残基）
およびヘリックス内の残基の全ての静電相互作用を含む。この静電相互作用は、
イオン強度の増加に対する荷電スクリーニングの効果を考慮して算出される。そ
して２つの相互作用する荷電した基の間の平均距離は、データベースの統計学的
分析から誘導された。ランダムコイルおよびヘリックスのコンホメーションにお
ける個々のアミノ酸の荷電は、それらのｐＫａを算出し、そしてｐＨ依存性を考
慮することによって決定される。ＡＧＡＤＩＲ１ｓ−２はまた、Ｎ末端ブロック
基およびＣ末端ブロック基の効果を考慮する。Ｎ末端でのアセチル基の次の残基
またはＣ末端のアミド基の前の残基は、キャッピング残基の役割を果たす、アセ
チル基およびアミド基とのヘリックス角をとらせられる。

【００９２】 （１．３．２ ＩＬ−４のヘリックスＣの安定化） ＩＬ−４のα−ヘリックスをいくつかの理由から標的として選択した。このヘ
リックスは、ＩＬ−４ファミリーのメンバー間でさほど保存的ではない；Ｎ末端
の最初の残基はそのレセプターへの結合に関与しないことが公知である（Ｗａｎ
ｇら、１９９７）；そしてＩＬ−４についての核磁気共鳴¹⁵Ｎ緩和および水素交
換研究により、ヘリックスＣのこの領域が非常に可撓性であることが示されてい
る（Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、１９９２；Ｒｅｄｆｉｅｌｄら、１９９４ａ；Ｒｅｄ
ｆｉｅｌｄら、１９９４ｂ）。事実、ＡＧＡＤＩＲ１ｓ−２は、このヘリックス
についての低い平均ヘリックス含量（４％）を予測する。

【００９３】 ＡＧＡＤＩＲ１ｓ−２を使用して、本発明者らは、平均ヘリックス含量を２０
％まで増加させ、そしてα−ヘリックスの安定性を約１．８Ｋｃａｌ／モルだけ
増加させた、３つの異なるタイプの変異を設計した。本質的に、本発明者らは、
野生型タンパク質に存在するＮ−キャッピングボックスモチーフ（Ｔ−Ｘ−Ｘ−
Ｑ）をより良好な対応物（Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｅ）により置換した。より良好なヘリッ
クス形成物（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙら、１９９５；Ｍｕｎｏｚら、１９９４
ｅ）が、ヘリックスの配列中に導入されている：Ｑ７１およびＦ７３はアラニン
に変異され；そしてＨ７４はアスパラギンによって置換された。Ｈ７４を置換す
るにアスパラギンがアラニンより好ましい理由は、この位置でなお別のアラニン
の導入が、そのタンパク質の溶解度を減じ、そして凝集を生成し得る、５つのア
ラニン残基を含むＮ末端で疎水性クラスターを生じるからである。最後に、本発
明者らは、２つの好適な静電対（Ｅ−Ｘ−Ｘ−ＲおよびＥ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｈ）を
導入した。

【００９４】 ヘリックスのＣ末端には変異を設計しなかった。なぜなら、Ｃ末端は、機能的
なＩＬ−４エピトープの部分を含むからである（Ｗａｎｇら、１９９７）。さら
に、９３位のロイシン残基と８８位のアルギニンとの間のＳｃｈｅｌｌｍａｎモ
チーフ（Ｓｃｈｅｌｌｍａｎら、１９８０）が野生型配列に存在する。このモチ
ーフは、これら２つの残基の間の２つの主鎖／主鎖水素結合の形成に関与するは
ずであり、そしてヘリックスの安定性に約１Ｋｃａｌ／モル寄与すると予測され
る（Ｖｉｇｕｅｒａら、１９９５）。安定化されたヘリックスＣを有する変異体
を、本明細書中でＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘと呼ぶ。

【００９５】 円偏光二色性により、変異体ペプチドのヘリックス含量の明らかな増加が示さ
れる。野生型および変異体ペプチドのヘリックス含量についてＡＧＡＤＩＲ１ｓ
−２により推定される値は、２２２ｎｍにおける楕円形性値から実験的に決定さ
れるものと見事に一致する（図５を参照）。

【００９６】 野生型（ＩＬ４Ｃｈ＿ｗｔ）および変異体ペプチド（ＩＬ４ＢＣｈ）の核磁気
共鳴研究を実施した（図６を参照）。ＩＬ４Ｃｈ＿ｗｔについては、ヘリックス
構造の形成を示すＮＯＥのいずれも見出し得なかった。他方、ＩＬ４ＢＣｈの場
合、本発明者らは、ペプチドの全体配列を通じて、長いレンジのｄαβ（ｉ，ｉ
＋３）ＮＯＥ（Ｗｕｔｒｉｃｈら、１９９６）を一義的に割り当てることが可能
であった。ＮＯＥデータにより、ＩＬ４ＢＣｈのＮ末端（Ｓ２とＥ５との間）で
のキャッピングボックスモチーフおよび残基Ｓ２〜Ｆ１５にわたる十分に規定さ
れたヘリックス領域の形成が明らかになる。残基Ｆ１５〜Ｄ２０の間の領域はあ
まり十分に規定されておらず、そしてＣ末端ではＲ２１〜Ｗ２４とＷ２４〜Ａ２
７を連結する２つの長いレンジのＮＯＥが観察される。

【００９７】 Ｈαプロトンの配座シフト（図７）は、変異ペプチドにおけるα−ヘリックス
の形成のさらなる証拠を提供する。残基Ｉ１３、Ｌ１６、Ｒ１８およびＬ１９は
、スペクトル中の他の共鳴との重複のために、一義的に割り当てられ得ない。Ｌ
２３はαプロトン化学シフトの、トリプトファン残基が近いことに起因してより
高い場への大きな偏位を示す。

【００９８】 （実施例２：ＩＬ−４改変体のインビボフォールディング） 設計された変異体および野生型タンパク質を、３つの異なるＥ．ｃｏｌｉ株に
おいて、多くの異なる条件で過剰発現させた。

【００９９】 ＤＥ３株のみを使用してＴ７に基づく発現プラスミを用いる発現を可能にした
。これらの株は、ｌａｃＵＶ５制御下に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染
色体コピーを含む。増殖培地へのＩＰＴＧの添加が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
の転写を誘導する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、次いで、発現プラスミドにお
けるＴ７プロモーターの制御下での標的遺伝子の転写を媒介し得る（Ｆｕｒｌｏ
ｎｇら、１９９２）。

【０１００】 野生型タンパク質および変異体の両方を、異なる株において高レベルまで発現
させて、合計、総細胞タンパク質の６０％にした。ＩＬ−４ＷＴは、試験したす
べての条件下で、３つの株においていつも封入体を形成した。しかし、変異体（
ＩＬ−４Ｌ２３Ｓ、ＩＬ−４Ｗ９１Ｓ、ＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓ、およびＩＬ
−４ＢＣｈｅｌｉｘ）をＡＤ４９４（チオレドキシンレダクターゼ欠損株：ｔｒ
ｘＢ^-）において過剰発現させた場合、生成したタンパク質の約５０％が上清中
に見出された（図８）。

【０１０１】 ＡＤ４９４は主要な還元経路のうちの１つを欠くので、ジスルフィド結合は、
原則的には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中で形成されことが可能なはずである（Ｄｅ
ｒｍａｎら、１９９３）。確かに、この株は、ＢＬ２１のようなより通常の発現
株において作成される場合には封入体を形成するいくつかのタンパク質の溶解度
を改善するために既に使用されている。ＢＬ２１におけるＩＬ−４変異体の発現
はまたタンパク質凝集を生じた。さらに、このタンパク質の溶解度は、ＧｒｏＥ
Ｌ／ＥＳシャペロニン系またはチオレドキシンとの同時発現の際には、増大しな
かったが、発現レベルは有意に減少した。

【０１０２】 これら株のいずれにおいても、より低い温度（１５℃〜３０℃）でのこのタン
パク質の発現は、可溶性産物の量に対して何らの効果も有さないことが見出され
、また発現を開始するために使用された濃度のインデューサーも同様であった。

【０１０３】 上記の結果を下記の表２にまとめる。

【０１０４】 表２ ＩＬ−４封入体（ＩＢ）の形成を減少させるために使用されたストラテ
ジーのまとめ。６００ｎｍでの細胞の光学密度をＩＯＤで示し、プロ配列が有り
または無しの発現を、それぞれ＋ｐｒｏ／−ｐｒｏで示す。

【０１０５】

【表２】 （実施例３：可溶性ＩＬ−４変異体の特徴付け） （３．１ 方法） （溶解度試験） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）
、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＷ３１１０（ＤＥ３）を、ＩＬ−４ＷＴおよび変異
体タンパク質をコードするプラスミドで形質転換した。それぞれの場合において
、ＬＢ培地を含む１Ｌフラスコに単一コロニーを接種し、振盪機上で１５〜３７
℃の範囲の温度にて１００ｍｇ／ｌのアンピシリンの存在下でインキュベートし
た。タンパク質発現をＯＤ₆₀₀ ０．４〜１．０で、異なる温度にて、０．１〜
１ｍＭの範囲のＩＰＴＧ濃度を使用して誘導した。ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＷ
３１１０（ＤＥ３）の場合、培養物を誘導後３時間インキュベートし、そして細
胞を遠心分離により採集した。ＡＤ４９４（ＤＥ３）の場合、タンパク質発現を
一晩誘導した。全ての場合で、採集した細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０中に再懸濁した。細胞破壊を、細胞を１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｕｇ／
ｍｌリゾチームおよび１０ｕｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅと共にインキュベートするこ
とにより開始し、次いでＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌを使用して
完了させた。可溶性画分を、４００００ｒｐｍにて１時間の超遠心により細胞残
渣から分離した。可溶性画分および不溶性画分からのサンプルを回収し、１２％
ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。可溶性産物お
よび不溶性産物の定量を、ゲルのデンシトメータ分析により行った。

【０１０６】 （ＧｒｏＥＬ／Ｓおよびとチオレドキシンとの同時発現） このタンパク質を
ＧｒｏＥＬ／ＥＳシャペロニンおよびチオレドキシンと共に過剰発現させるため
に、ＰＴ−ｇｒｏＥまたはＰＴ−Ｔｒｘを有するＢＬ２１のコンピテント細胞を
、それぞれのムテインをコードするプラスミドおよびＩＬ−４野生型をコードす
るプラスミドで形質転換した。ＬＢを含む振盪中の１Ｌフラスコにおいて、３０
〜３７℃の範囲の温度にて１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｌの
クロラムフェニコールの存在下で単一コロニーから細菌を増殖させた。一旦ＯＤ
６００_mmが０．７に達したら、ＩＰＴＧを増殖培地へ０．１６ｍＭの最終濃度ま
で添加してＩＬ−４改変体とシャペロンとの発現を同時に誘導した。

【０１０７】 （ＡＤ４９４における可溶性タンパク質の発現） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）を、ＩＬ−４ＷＴおよび変異体タンパク質をコ
ードするプラスミドで形質転換した。ＬＢ培地を含む１Ｌフラスコに単一コロニ
ーを接種し、振盪機上で３７℃にてインキュベートした。ＯＤ₆₀₀が０．７〜０
．８に達したら、ＩＰＴＧを、０．１６ｍＭの最終濃度が得られるよう添加した
。培養物を一晩インキュベートして、そして細胞を遠心分離により採集した。

【０１０８】 （可溶性タンパク質の精製） 採集した細胞を２５ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ
６．５中に再懸濁し、そして氷上で１時間、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｕｇ／ｍ
ｌリゾチームおよび１０ｕｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅと共にインキュベートし、次い
でさらにＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌを使用して溶解させた。可
溶性画分を、４００００ｒｐｍにて１時間の超遠心により細胞残渣から分離した
。可溶性画分および不溶性画分からのサンプルを、１２％ポリアクリルアミドゲ
ル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。可溶性産物および不溶性産物の定量
を、ゲルのデンシトメータ分析により行った。

【０１０９】 タンパク質精製をＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣシステムにて行った。細胞上
清を最初に、２５ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６．５で予め平衡化したＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅ Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流した。タンパク質の溶出を、０
〜０．５Ｍ ＮａＣｌの線形塩グラジエントを流すことにより行った。４つのＩ
Ｌ−４改変体が１２０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。次いで、回収した画分をサイ
ズ排除クロマトグラフィーに供し、そしてタンパク質を９０％の均質性まで精製
した。精製工程の収率は、１リットルの細胞培養物あたり、１ｍｇのＩＬ−４Ｌ
２３Ｓ、ＩＬ−４Ｗ９１Ｓ、ＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓが得られ、そして約２ｍ
ｇのＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘが得られるような収率であった。

【０１１０】 （ＡＤ４９４における封入体としてのタンパク質発現） この発現を、タンパク質発現を０．５のＯＤ₆₀₀で誘導したことを除いて、可
溶性タンパク質の作成について上記したように行った。

【０１１１】 （１０Ｌ規模および１００Ｌ規模での醗酵） より大量のタンパク質を生成す
るため、１０ｌのバイオリアクター中での醗酵を行った。これらの醗酵のために
、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＤＥ３）中に形質転換した。その細
胞を、複合培地（３０ｇ／Ｌ ダイズペプトン、２０ｇ／Ｌ 酵母抽出物、２０
ｇ／Ｌ グリセロール、５ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄、１００
ｍｇ／ｌ アンピシリン）における３７℃でのバッチ醗酵により、ＯＤ₆₀₀が３
．０になるまで増殖させた。この段階で、組換えタンパク質の発現を、０．４ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの添加により誘導した。４時間の誘導期の後、遠心分離により細胞
を採集した。

【０１１２】 （封入体からのタンパク質精製） 採集した細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８．０中に再懸濁した。細胞破壊をリゾチーム（１ｇの細胞乾燥重量あ
たり１ｍｇ）の添加および室温での３０分間のインキュベーションにより酵素的
に行った。放出された封入体を８０００ｇ（３０分間）での遠心分離により採集
した。ペレットを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％
ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４緩衝液ｐＨ８中への再懸濁および遠心分離（
８０００ｇ、１５分間）により４回洗浄した。洗浄した封入体を、８Ｍ Ｇｄｎ
ＨＣｌ／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）中に可溶化した。（Ｋｅｌｌａ
ら１９８８；Ｋｅｌｌａら、１９８５）に記載されるように、過剰のスルファイ
トおよびテトラチオネートの添加により、ＳＨ基をＳ−ＳＯ₃に改変した。

【０１１３】 ５つの容量の５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４ｍ
Ｍ Ｌ−システイン、０．６ｍＭアルギニンに対する５時間（１容量交換／時間
）のクロスフロー限外濾過により、リフォールディングを２００〜３００ｍｇ／
Ｌのタンパク質濃度にて行った。トリフルオロ酢酸−アセトニトリルの線形グラ
ジエントを適用するＶｙｄａｃ Ｃ４樹脂でのＲＰ−ＨＰＬＣによりプロセス期
間中の分析を行った。全ピーク面積（総タンパク質）に対する、正確にフォール
ディングされたイソフォームのピーク面積のパーセント比を比較することにより
、リフォールディング収率を得た。

【０１１４】 （円偏光二色性） Ｊａｓｃｏ−７１０装置にて２ｍｍの光路を有するキュベ
ット中で遠ＵＶ ＣＤスペクトルを記録した。２秒の応答時間および１ｎｍの帯
域幅で５０ｎｍ／分の走査速度にて測定を０．１ｎｍごとに行った。本明細書中
に示されたスペクトルは２０回の走査の平均を表す。２８０ｎｍの吸光度から算
出された（Ｐａｃｅら、１９９５）タンパク質濃度は１０μＭであった。実験は
２５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ６．５）中５℃にて行った。

【０１１５】 （熱変性） ２２２ｎｍにおけるシグナルの変化を、６〜９０℃の温度範囲に
わたって、２ｍｍの経路を有するキュベット内でモニタリングすることにより、
熱変性を測定した。測定を、０．５℃の増分で、２秒の応答時間および１ｎｍの
帯域幅を用いて、５０℃／時間の温度勾配で行った。２８０ｎｍにおける吸光度
から算出したタンパク質濃度は、１０μＭであり（Ｐａｃｅら、１９９５）、そ
して測定を、２５ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ６．５）中で実施した。曲線を、中
点温度（Ｔ_m）、この中点温度におけるエンタルピー変化（ΔＨ_m）および過剰熱
容量変化（ΔＣ_p）を、当てはめパラメータとして使用して、以下の等式に従っ
て、２状態モデルに当てはめた：

【０１１６】

【数１】 ここで、Ｆ_umfは、アンフォールディングされたタンパク質の、温度（Ｔ）の関
数としての画分を表し、そしてＦ_NおよびＦ_Uは、それぞれ、遷移領域に先行する
ベースラインおよび遷移領域に続くベースラインの直線当てはめにより得られる
、完全にネイティブなタンパク質および完全にアンフォールディングされたタン
パク質の画分を表す。

【０１１７】 （化学的安定性） 化学的な変性および再生の実験を、２５℃で、５０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ６．５）中で実施した。使用したタンパク質濃度は、ＩＬ−
４野生型およびＩＬ−４Ｗ９１Ｓについては７μＭであり、そしてＩＬ−４ＢＣ
ｈｅｌｉｘについては５μＭであった。Ｊａｓｃｏ自動滴定システムを使用して
、変性剤およびタンパク質を混合した。ＧｄｎＨＣｌ濃度を、Ｐａｃｅら（１９
９０）により記載されるように、この溶液の屈折率を測定することにより、算出
した。このタンパク質のアンフォールディングおよびりフォールディングを、２
２２ｎｍにおけるＣＤシグナルの変化を追跡して、モニタリングした。楕円性読
み取りを、以下の標準的な等式を使用して、アンフォールディングした画分につ
いて標準化した： Ｆ_unf＝（θ−θ_N）／（θ_D−θ_N） Ｅｑ．２ ここで、θは、特定の濃度の変性剤における楕円率値であり、そしてθ_Nおよび
θ_Dは、各変性剤濃度における完全にネイティブな種および完全にアンフォール
ディングした種の楕円率を表し、そしてこれらは、フォールディング前後のベー
スラインの直線回帰から、算出した。２状態モデルを仮定して、各変性剤濃度に
おける、変性のための平衡定数は、以下の等式を使用して、算出され得る： Ｋ_D＝（Ｆ_N−Ｆ）／（Ｆ−Ｆ_U） Ｅｑ．３ ここで、Ｆ_NおよびＦ_Uは、それぞれ、遷移領域に先行するベースラインおよび遷
移領域に続くベースラインの、直線当てはめにより得られる、完全にネイティブ
なタンパク質および完全にアンフォールディングされたタンパク質の画分を表す
。ＧｄｎＨＣｌの存在下でのアンフォールディングの自由エネルギーは、変性剤
の濃度に直線的に関係することが、実験的に見出された（Ｐａｃｅ、１９８６）
：

【０１１８】

【数２】 ｍおよび

【０１１９】

【数３】 （変性剤の非存在下でのアンフォールディングの見かけの自由エネルギー）の値
は、以下から算出され得る： ΔＧ_D＝−ＲＴｌｎＫ_D Ｅｑ．５ 比例定数ｍは、遷移の協同性を反映し、そしてネイティブな状態と変性された状
態との間での、溶媒に曝露される疎水性表面の差異に関係すると考えられる。こ
れら全ての依存性を考慮する場合に、楕円率の、変性剤の濃度の関数としての変
化は、以下の等式に当てはめられ得る：

【０１２０】

【数４】 ここで、内因性の楕円率の、変性剤濃度への依存は、ネイティブ状態と変性状態
との両方において、それぞれａ［ＧｄｎＨＣｌ］およびｂ［ＧｄｎＨＣｌ］の項
により、考慮される（直線近似、ＳａｎｔｏｒｏおよびＢｏｌｅｎ、１９８８）
。

【０１２１】 （ＮＭＲ分光法） ＩＬ−４および変異タンパク質のＮＭＲサンプルを、凍結
乾燥したタンパク質を４５ｍＭの変性酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃｄ₄）（ｐＨ
５．３、１０％ Ｄ₂Ｏ、０．１ｍＭ ＴＳＰ、０．２％ ＮａＮ₃）に溶解して
５００μＭのタンパク質濃度を得ることにより、調製した。スペクトルを、標準
的なパルス系列および位相サイクリングを使用して、３０３Ｋで記録した。

【０１２２】 （レセプター結合アッセイ） 結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して、表面プラスモン共鳴によ
り測定した。レセプターα鎖の組換え細胞外ドメイン（［Ｃ１８２Ａ、Ｑ２０６
Ｃ］ＩＬ４−ＢＰ）を、Ｓｈｅｎら、（１９９６）により記載されるように、バ
イオセンサーＣＭ５で、１５００〜２０００ｐｇ／ｍｍ²の密度に固定化した。
結合を、２５℃で、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐｓＨ ７．４／１
５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ／０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０
）プラス０．５Ｍ ＮａＣｌによる５０μｌ／分の流速での潅流により分析した
。

【０１２３】 （３．２ 結果） 可溶性細胞画分に存在する産物を、ＩＬ−４の高いｐＰＩ（９．２）を利用し
て、陰イオン（ａｃｔｉｏｎ）交換クロマトグラフィーにより精製し、続いてゲ
ル濾過工程を行った。約１ｍｇのＩＬ−４Ｌ２３Ｓ、ＩＬ−４Ｗ９１Ｓおよび二
重変異体ＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓを、１Ｌの細胞培養物から得た。

【０１２４】 収率は、Ｃヘリックス変異体であるＬＩ−４ＢＣｈｅｌｉｘについて、わずか
に高く、１リットルの培養物あたり１．６ｍｇが精製された。ＩＬ−４Ｌ２３Ｓ
、およびより低い程度までＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓは、精製の間に大いに分解
し、そして１ｍｇ／ｍｌに濃縮した場合に、沈殿した。しかし、ＩＬ−４Ｗ９１
ＳおよびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘは、より良好に挙動し、そして１ｍｇ／ｍｌに
濃縮した場合に、沈殿しなかった。

【０１２５】 これら２つのタンパク質がフォールディングされたか否かを調査するために、
遠ＵＶ ＣＤスペクトルを、精製したサンプルにおいて記録し、そして野生型タ
ンパク質のスペクトルと比較した（データは示さない）。ＩＬ−４Ｗ９１Ｓおよ
びＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘの両方のＣＤスペクトルは、高含有量のαヘリックス
を有するタンパク質について予測した形状を示すが、特に２１０〜２２５ｎｍの
間の波長範囲において、ＩＬ−４ＷＴのスペクトルと異なる。両方の変異体が、
野生型タンパク質のように、２０８ｎｍにおいて十分に規定された極小値を示し
たが、ＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘの場合には、２２２ｎｍにおけるシグナルは、予
測したほど負ではなかった。この効果は、ランダムコイルシグナルからのより強
い寄与から生じるようではない。なぜなら、このタンパク質は、Ｔ_mが５４℃で
ある、協同的な温度アンフォールディング遷移を示すからである。２２２ｎｍに
おいて観察される楕円性の減少は、恐らく、さほど構造を保っていないかもしれ
ないタンパク質のいくらかの部分の寄与を反映する。

【０１２６】 協同的な温度誘導遷移はまた、ＩＬ−４Ｗ９１Ｓにおいて観察され（データは
示さない）、両方の変異体における三次相互作用の存在を示唆した。この場合に
は、２０８〜２２０ｎｍの間の楕円性値は、野生型タンパク質における値より負
であり、そして２２２ｎｍにおける極小値が、２１８ｎｍにシフトする。これら
の差異は、トリプトファン残基の除去に起因して、解釈が困難である。芳香族残
基は、遠ＵＶ ＣＤシグナルに寄与するが、この寄与は、その残基が位置する環
境に依存し、そして予測が困難である。

【０１２７】 しかし、温度誘導遷移は、両方の変異体に対して完全には可逆的ではなく、９
０℃から５℃に戻してのサンプルの冷却後に、シグナルの５０％のみが回復し、
そしてサンプルの一部が、この実験の間に、キュベット内に沈殿した。さらに、
サンプルは不安定であり、そして凍結−解凍の際に沈殿した。質量分析およびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、両方のサンプルにおいて、分解を示す、いくらかの低分
子量の種を同定した。ＩＬ−４Ｗ９１ＳもＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘもいずれも、
プラスモン共鳴実験において実証されたように、ＩＬ−４Ｒαを結合し得なかっ
た。

【０１２８】 （３．２．１ ＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘのインビトロ
特徴付け） Ｅ．ｃｏｌｉに可溶の、産生されたＩＬ−４変異体がＩＬ−４レセプターを結
合し得なかったという事実は、これらのタンパク質が恐らくフォールディングさ
れていないことを示唆する。しかし、本発明者らは、これらの変異体のインビト
ロでのリフォールディング挙動を調べることが興味深いと考えた。本発明者らの
考えは、上清に存在するタンパク質は活性ではないが、封入体内の画分は依然と
して、野生型タンパク質よりさらに効率的に、インビトロでリフォールディング
し得るということであった。

【０１２９】 ＩＬ−４ＷＴならびに２つの変異体であるＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４Ｂ
Ｃｈｅｌｉｘを、ＡＤ４９４中で過剰発現させた。このとき、発現条件を、溶解
度ではなくタンパク質産生の最大化に対して、最適化した。より高い発現レベル
は、細胞を、０．１６ｍＭ ＩＰＴＧを用いて０．４〜０．５の光学密度におい
て誘導する場合に、得られた。タンパク質の、封入体からの精製およびインビト
ロリフォールディングを、以前に記載された手順に従って、実施した（Ｋａｔｏ
ら、１９８５；Ｗｅｉｇｅｌら、１９８９）。

【０１３０】 （３．２．２ リフォールディング収率および活性アッセイ） 本発明者らは、不溶性細胞画分から再生したＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４
ＢＣｈｅｌｉｘの、ＩＬ−４Ｒαレセプターに対する結合定数を測定した（表３
を参照のこと）。

【０１３１】

【表３】 ＩＬ−４ＷＴおよび変異タンパク質法フォールディング収率を、表４に示す。
これらの値は、正しくリフォールディングされたタンパク質の量を表し、そして
４つの独立した実験において得られたデータの平均である。これらの実験のうち
の２つにおいて、タンパク質を、方法に記載するように、１Ｌの振盪フラスコ中
で過剰発現させた。別の２つの実験において、ＩＬ−４ＷＴおよび２つの変異タ
ンパク質を、１０Ｌ〜１００Ｌのスケールでの低細胞密度醗酵の後に得られた細
胞から単離した（方法を参照のこと）。これら４つの実験において、ＩＬ−４Ｂ
Ｃｈｅｌｉｘは、ＩＬ−４ＷＴの収率の約２倍の収率でリフォールディングし、
一方でＩＬ４Ｒαについてのｋ_dは、野生型タンパク質のｋ_dと同じままである。
ＩＬ−４の酸化的リフォールディングについての予備的なデータは、ＩＬ−４Ｂ
Ｃｈｅｌｉｘのリフォールディング収率の観察される増加が、野生型タンパク質
のリフォールディングの間に蓄積する、非ネイティブなアイソフォームの不安定
化から生じることを示唆する（図９を参照のこと）。他方で、セリンによるＷ９
１の置換は、このタンパク質のリフォールディングを改善しない。さらに、この
変異は、ＩＬ４Ｒαの結合親和性の２倍の減少をもたらし、このことは、以前の
研究と良好に一致し、レセプター結合におけるＷ９１の小さな役割を示唆する（
Ｗａｎｇら、１９９７）。

【０１３２】 （３．２．３ タンパク質の熱力学および構造的特徴付け） ＩＬ−４Ｗ９１ＳおよびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘの精製したサンプルは、野生
型のＮＭＲスペクトルと類似のＮＭＲスペクトルを示す（図１０）。

【０１３３】 設計した変異体の、タンパク質の安定性に対する効果を調査するために、本発
明者らは、平衡熱的変性研究（図１１ａ）および化学的変性研究（図１１ｂ）を
実施した。ＩＬ−４は、非常に安定なタンパク質であるので、０〜１００℃の範
囲の温度により変性しない。従って、完全なアンフォールディング遷移を観察す
るために、熱的変性実験を、２Ｍ ＧｄｍＨＣｌの存在下で実施した。これらの
条件下で、全遷移が観察され得る。興味深いことに、低温変性が、ＷＴタンパク
質に対して観察され得る（２０℃未満）。より高いＧｄｍＨＣｌ濃度においては
、これらのタンパク質は高温で完全に変性するが、これらは低温では完全にはフ
ォールディングしない。その結果、作成した曲線から正確な熱力学的データを得
ることは不可能であるが、タンパク質の半分が変性する温度Ｔ_mが、合理的な正
確さで決定され得る（表４）。

【０１３４】

【表４】 ２つの変異体の、これらの酸化形態での安定性を決定し、そして野生型タンパ
ク質と比較した。４．３ｋｃａｌ／ｍｏｌのアンフォールディング自由エネルギ
ーが、ＩＬ−４ＷＴに対して得られた。この値は、以前に公開された研究におい
て見出された値より１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ低い（Ｗｉｎｄｓｏｒら、１９９１
）。しかし、後者の研究のデータの当てはめは正確ではなく、そして誤差が提供
されていない。そこに提示されるデータのより面密な調査は、ＩＬ−４ＷＴにつ
いての約４．５ｋｃａｌ／ｍｏｌのアンフォールディングの自由エネルギーを示
唆し、これは本発明者らの結果と一致する。

【０１３５】 溶媒に曝露される疎水性残渣の除去は、「逆疎水性効果」によって、標的タン
パク質を安定化するべきである（ＰａｋｕｌａおよびＳａｕｅｒ、１９９０）。
本発明者らの場合において、セリンによるＷ９１の置換は、野生型タンパク質を
１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定化し、そしてＴ_m値の８℃のシフトを引き起こす。
観察された安定化は、アンフォールディングプロセスの急勾配の増加から生じ、
これは、ｍ値の増加に反映される。この急勾配の増加は、フォールディング中間
体の不安定化、変性状態、または両方に起因し得る（わかりやすい総説について
は、Ｓｈｏｒｔｌｅ Ｄ．１９９６を参照のこと）。類似の効果（ΔＧの１．４
ｋｃａｌ／ｍｏｌの増加およびｍ値の１．６から１．９への増加）が、溶媒に曝
露されるＰｈｅ残基（Ｆ１４）をＡｓｎで置換した場合に、走化性タンパク質Ｃ
ｈｅＹにおいて見出された（Ｍｕｎ〜ｏｚら、１９９４ａ；Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒ
ｎａｎｄｅｚら、１９９７）。この場合には、勾配の変化は、フォールディング
中間体の相対的不安定化に起因し、これは、速度論的にのみ検出され得る。本発
明者らは、３状態モデルを仮定して、ＩＬ−４の平衡状態の変性曲線と再生曲線
とを当てはめることを試みた。Ｃｈｅ Ｙに対してと同様に、本発明者らは、こ
れらの曲線の当てはめの際に、有意な改善を何も検出し得なかった。従って、現
在、本発明者らは、ｍの変化を、酸化されたタンパク質のフォールディングに存
在する平衡状態のフォールディング中間体の不安定化に割り当て得ない。

【０１３６】 ヘリックス安定化が考慮される限り、これは、タンパク質安定性の増加を常に
もたらし、そしていくつかの場合においては、熱安定性タンパク質を生成し得る
ことが示された（Ｖｉｌｌｅｇａｓら、１９９６、第２章を参照のこと）が、安
定性の増加は常に、理論的予測から予測されるより低い。このことは、ネイティ
ブな条件下での変性状態の同時の安定化に起因する。ヘリックスＣに導入される
変異は、より低い程度まで（０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）タンパク質を安定化し、
そしてＩＬ−４ＷＹのＴ_mにおいて、より小さなシフト（６℃）を誘導する。こ
の場合には、この安定化効果は、遷移の急勾配の増加（ｍ値）と、タンパク質の
半分が変性するために必要とされるＧｄｎＨＣｌの濃度［ＧｄｎＨＣｌ］_1/2の
わずかな増加との組合せから生じる。この変異体に対して観察されたｍ値の増加
は大きくないが、２つの独立した変性および再生の実験において、一致して観察
された。

【０１３７】 この研究において得られたｍ値（表１）がＩＬ−４の大きさ（１５ｋＤａ）の
タンパク質については非常に小さいことに注目することは、価値がある。このこ
とは、アンフォールディングおよびリフォールディングの実験が、還元剤の非存
在下で実施されたという事実に起因し得る。従って、３つのジスルフィド架橋が
、変性状態において形成され、これは、何らかの残余の構造の存在を導き得る。

【０１３８】 （参考文献）

【０１３９】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アミノ酸の直線状配列（アンフォールディング状態−Ｕ）から独特の
三次構造（フォールディング状態−Ｆ）へのタンパク質のフォールディングの概
略図である。これは、通常、エネルギー障壁（‡）によってアンフォールディン
グ状態およびフォールディング状態から分離される、安定なフォールディング中
間体（Ｉ）の形成を含む、複雑なプロセスである。これらの中間体は、フォール
ディング反応中に高濃度まで蓄積してタンパク質の凝集を導き得る。中間体の蓄
積は、この中間体とフォールディングのための遷移状態（‡^*）との間の高エネ
ルギー障壁、またはフォールディング状態と遷移状態との間の低エネルギー障壁
に起因し得る。従って、フォールディング中間体の選択的不安定化（Ｉ’）およ
び／またはフォールディング状態の安定化（Ｆ’）は、タンパク質のフォールデ
ィングをより効率的に助け得る。

【図２】 図２は、逆疎水性効果の概略図である。ＵおよびＵ_mは、野生型タンパク質お
よび変異体における、アンフォールディングなコンホメーションの集団（ｅｎｓ
ｅｍｂｌｅ）を示す。ＩおよびＦ、Ｉ_mおよびＦ_mは、それぞれ、野生型における
中間体およびフォールディング状態ならびに変異体における中間体およびフォー
ルディング状態を示す。Ｋ_uおよびＫ_fは、アンフォールディング反応速度定数お
よびフォールディング反応速度定数であり、そして‡は、遷移状態を象徴する。
疎水性残基の、より親水性な残基での置換は、原則として、ネイティブな状態に
関して、変性集団および中間体の両方を不安定化するはずである。これは、フォ
ールディング速度を上昇させ、そして中間体の蓄積に起因する速度論的凝集プロ
セスを低下させる。

【図３】 図３は、局所的相互作用の最適化によるフォールディング反応の加速である。
Ｕは、アンフォールディングなコンホメーションの集団を示す。ＩおよびＦ、Ｉ _m およびＦ_mは、それぞれ、野生型タンパク質における中間体およびフォールディ
ング状態ならびに変異体における中間体およびフォールディング状態を示す。Ｋ _u およびＫ_fは、アンフォールディング反応速度定数およびフォールディング反応
速度定数であり、そして‡は、遷移状態を象徴する。

【図４】 図４は、分子内シャペロンがタンパク質のフォールディングを媒介する、可能
な経路である。タンパク質が、そのプロ配列の非存在下でフォールディングする
場合、モルテングロビュール状態のコンホメーションになる。モルテングロビュ
ール状態のコンホメーションは、ネイティブ様の二次構造を有するが、生物学的
活性に必要な三次相互作用を欠失する。このモルテングロビュールは安定であり
、そしてモルテングロビュールをフォールディング状態と分離する、エネルギー
障壁を突破し得ない。このペプチドの増加は、モルテングロビュール状態と遷移
状態との間のエネルギー障壁を低下させ、ネイティブな状態へのフォールディン
グの進行を可能にする。

【図５】 図５は、５℃で２５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ６．５におけるＩＬ−４のヘリ
ックスＣの野生型ペプチド（黒丸）および変異体（黒菱形）ペプチドのＦａｒ−
ＵＶ ＣＤスペクトルである。このペプチドのヘリックス含量についてＡＧＡＤ
ＩＲ１ｓ−２によって予測された値、および実験的に決定された値を挿入する。

【図６】 図６は、野生型（ＩＬ４Ｃｈ＿Ｗｔ）ペプチドおよび変異体ペプチド（ＩＬ４
ＢＣｈ）の２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルの比較である。このスペクトルを、１４
０ｍｓの混合時間で得た。このペプチドの配列の下のバーの太さは、ＮＯＥデー
タに基づいたＩＬ４ＢＣｈにおけるヘリックスの編成を示す。

【図７】 図７は、変異体ペプチドのＨαプロトンの化学シフト値とランダムコイル値（
Ｍｅｒｕｔｋａら、１９９５）との間の差異である。負の値は、ヘリックス構造
の形成を示す。Ｈαが、明白に割り当てられ得ない残基は、アステリスク（^*）
によってマークされる。

【図８】 図８は、ＩＬ−４ ＷＴタンパク質および変異体タンパク質を発現するＥ．ｃ
ｏｌｉ ＡＤ４９４から得られた細胞画分である。レーン１：ＩＬ−４Ｌ２３Ｓ
Ｗ９１Ｓの不溶性画分。レーン２：ＩＬ−４Ｌ２３ＳＷ９１Ｓの可溶性画分。レ
ーン３：ＩＬ−４Ｌ２３Ｓの可溶性画分。レーン４：ＩＬ−４Ｗ９１Ｓの可溶性
画分。レーン５：ＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘの可溶性画分。レーン６：野生型タン
パク質の可溶性画分。ＳＤＳゲルの濃度分析によって決定したとき、変異体タン
パク質の５０％〜６０％とは対照的に、野生型タンパク質は、ごくほんの少しの
画分（１０％未満）しか、細胞上清において見出されない。

【図９】 図９は、野生型ＩＬ−４（パネルＡ）タンパク質および変異体ＩＬ−４ＢＣｈ
ｅｌｉｘ（パネルＢ）タンパク質のＨＰＬＣである。

【図１０】 図１０は、ＩＬ−４ ＷＴ、ＩＬ−４Ｗ９１Ｓ、およびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉ
ｘの一次元ＮＭＲスペクトルである。ＮＭＲシグナルの優れた分散は、タンパク
質がフォールディングされていることを示す。

【図１１】 図１１Ａは、ＣＤによるＩＬ−４ＷＴ（黒丸）ならびに設計した変異体ＩＬ−
４Ｗ９１Ｓ（黒菱形）およびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘ（白丸）の温度変性プロフ
ィールである。この変性プロセスは、ＩＬ４Ｗｔおよび２つの変異体タンパク質
の両方について可逆的である。図１１Ｂは、ＣＤによるＩＬ４ＷＴ（＋）ならび
に２つの改変体ＩＬ−４Ｗ９１Ｓ（白丸）およびＩＬ−４ＢＣｈｅｌｉｘ（黒丸
）の化学変性プロフィールである。この実験データは、散乱したシンボルによっ
て表され、そして実線は、実験データとの最良の適合を示し、これは式６に従う
２状態転移モデルを仮定する。この適合から得られた熱力学的パラメーターは、
温度変性データとともに、表４に要約される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オシュキナート， ハルトムート ドイツ国 デー−10315 ベルリン， ア フレッドコヴァルクシュトラーセ ４ (72)発明者 ゼラーノ， ルイス ドイツ国 デー−69126 ハイデルベルグ， ツェーリンガーシュトラーセ 19 (72)発明者 ペータース， ヨルク ドイツ国 デー−42096 エルプエアフェ ルト， ビルディング ナンバー 46 ペ ーハー−オーペー−エルプ−ベーテー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA26 CA02 DA06 HA01 4B064 AG03 CA02 CA19 CC24 DA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 DA01 DA16 NA03 ZB132 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 DA02 EA22 FA74

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サイトカインを安定化する方法であって、以下の工程： ａ） 溶媒に曝露される疎水性残基を除去するように、該サイトカインのアミ
   ノ酸配列を変異させる工程；および ｂ） 該サイトカイン中の１つ以上の二次構造エレメントを安定化するように
   、該サイトカインのアミノ酸配列を変異させる工程、 のうちの一方または両方を包含し、 その結果、該サイトカインのフォールディングの間に、該サイトカインのフォ
   ールディングの間に形成される中間体が、該サイトカインのフォールディングさ
   れた状態における該サイトカインと比較して不安定化される、方法。
2. 【請求項２】 工程ｂ）が、ヘリックス安定化残基を導入するように、前記
   サイトカインのアミノ酸配列を変異させる工程を包含する、請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 前記変異させる工程が、前記サイトカインのヘリックスＣに
   適用される、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記サイトカインがＩＬ−４である、請求項１〜３のいずれ
   か１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ＩＬ−４がヒトＩＬ−４である、請求項４に記載の方法
   。
6. 【請求項６】 工程ａ）が、セリン残基を、全長ＩＬ−４アミノ酸配列の２
   ３位および／または９１位に導入することを包含する、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 全長ＩＬ−４アミノ酸配列の６９位にセリン残基を導入し、
   そして７１〜７４位に配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎを導入することを包
   含する、請求項５に記載の方法。
8. 【請求項８】 さらに、以下の工程： ｃ） 前記サイトカインのＮ末端において、プロ配列を含める工程； を包含する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記サイトカインがＩＬ−４Ｒαに結合することを可能にす
   るが、該サイトカインがＩＬ−１３Ｒαおよび／またはγｃ鎖に結合することを
   阻止するように、該サイトカインがさらに変異される、請求項１〜８のいずれか
   １項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 全長ＩＬ−４アミノ酸配列において、１２１位および／ま
    たは１２４位のアスパラギン酸残基の置換を含む、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により改変さ
    れた、サイトカイン。
12. 【請求項１２】 全長配列において、２３位、９１位、もしくは２３位およ
    び９１位の両方において変異された、ヒトＩＬ−４、ならびにその機能的等価フ
    ラグメントまたは改変体。
13. 【請求項１３】 全長配列の２３位、９１位、もしくは２３位および９１の
    両方における前記変異が、セリン残基に対する変異である、請求項１２に記載の
    ヒトＩＬ−４。
14. 【請求項１４】 スレオニン６９の、セリンへの変異；グルタミン７１の、
    アラニンへの変異；グルタミン７２の、グルタミン酸への変異；フェニルアラニ
    ン７３の、アラニンへの変異；ヒスチジン７４の、アスパラギンへの変異、のう
    ちの１つ以上を含む、ヒトＩＬ−４。
15. 【請求項１５】 前記全長アミノ酸配列の６８〜９５位において配列ＡＳＡ
    ＡＥＡＮＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧをコードする、ヒトＩＬ
    −４、およびその機能的等価フラグメントまたは改変体。
16. 【請求項１６】 請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカインの
    フラグメントを含むペプチド、またはその機能的等価物。
17. 【請求項１７】 請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、
    または請求項１６に記載のペプチドの産生のための方法であって、該サイトカイ
    ンまたはペプチドをコードする核酸を、宿主細胞に導入する工程を包含する、方
    法。
18. 【請求項１８】 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項１７に
    記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記サイトカインのＮ末端において、該サイトカインのプ
    ロ配列を含めることをさらに包含する、請求項１７または１８のいずれか１項に
    記載の方法。
20. 【請求項２０】 さらに、以下の工程： ｄ） 前記サイトカインを、前記宿主細胞において、シャペロンタンパク質と
    ともに発現させる工程、 を包含する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 シャペロニンが、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ系またはチオレドキシ
    ンである、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 製剤としての使用のための、請求項１１〜１５のいずれか
    １項に記載のサイトカイン、または請求項１６に記載のペプチド。
23. 【請求項２３】 哺乳動物、好ましくはヒトにおける、アレルギーの処置ま
    たは予防のための医薬の製造における、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載
    のサイトカイン、または請求項１６に記載のペプチドの使用。
24. 【請求項２４】 請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、
    または請求項１６に記載のペプチドを、必要に応じて薬学的に受容可能な塩の形
    態で、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有する、薬学的組成物。
25. 【請求項２５】 請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、
    または請求項１６に記載のペプチドが、薬学的に受容可能なキャリアと会合され
    る、請求項２４に記載の薬学的組成物を調製するためのプロセス。
26. 【請求項２６】 アレルギーを予防または処置する方法であって、患者に、
    請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、または請求項１６に記
    載のペプチドを投与する工程を包含する、方法。
27. 【請求項２７】 請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、
    または請求項１６に記載のペプチドを含む、診断キット。
28. 【請求項２８】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、ま
    たは請求項１６に記載のペプチドをコードする、導入遺伝子を保有する、トラン
    スジェニック非ヒト哺乳動物。
29. 【請求項２９】 トランスジェニック動物を作製するためのプロセスであっ
    て、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のサイトカイン、または請求項１６
    に記載のペプチドをコードするＤＮＡを、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスの
    胚に導入する工程を包含する、プロセス。
30. 【請求項３０】 ＩＬ−４Ｒαタンパク質の調製のための方法であって、Ｉ
    Ｌ−４Ｒαを含有する組成物を、変異ＩＬ−４タンパク質が結合したアフィニテ
    ィーカラムに通す工程、該カラムを洗浄する工程、および該カラムからＩＬ−４
    Ｒαを溶出する工程を包含する、方法。