KR101098897B1 - 원핵생물 숙주 내 ｉｌ-21 생산 - Google Patents

원핵생물 숙주 내 ｉｌ-21 생산 Download PDF

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Abstract

IL-21의 대규모 생산을 위한 E.Coli 발현 시스템을 이용하는 발현 벡터 및 방법이 기재되어 있다. 상기 벡터는 E.Coli 내 번역을 위한 코돈 및 mRNA 2차 구조를 최적화하기 위해 뉴클레오티드의 특이적 변화를 갖는 IL-21 코딩 서열을 이용한다. 상기 발현 벡터를 이용함에 있어서, IL-21 유전자가 주입 회분식 발효 내 1g/L 이상의 수준으로 E.Coli에서 생산되었다. 또한 IL-21 발현 벡터를 이용하여 형질전환 된 OmpT 결핍 E.Coli 균주가 포함된다.
Figure 112005031146824-pct00013
Il-21 단백질, pTAP337 벡터, W3110 숙주 세포

Description

원핵생물 숙주 내 ＩＬ-21 생산{ＩＬ-21 PRODUCTION IN PROKARYOTIC HOSTS}
본 발명은 IL-21의 대규모 생산을 위한 E.Coli 발현 시스템을 이용하는 발현 벡터 및 방법에 관한 것이다.
사람 및 다른 게놈으로부터의 유전자의 증가된 이용가능성 및 동정은 재조합 단백질의 유효한 발현 및 정제에 대한 필요성의 증가를 이끌었다. 세균 내 단백질의 발현은 클로닝된 유전자의 생산에 관하여 가장 최고로 널리 사용되는 접근법이다. 여러가지 이유에서, 세균 내 발현은 진핵세포 내 발현보다 바람직하다. 예를 들어, 세균는 진핵 세포보다 성장하기가 훨씬 더 용이하다. 더 구체적으로, 정교해진 분자 유전학적 수단 및 수천의 돌연변이의 풍부한 이용가능성이 단백질 생산에 있어서 매우 유용한 발현 숙주로서 E.Coli를 만든다. 그러나, E.Coli, 특히 진핵세포 공급원으로부터의 그것에 있어서 기능적 단백질의 높은 수준의 생산이 종종 어려웠다.
IL-21(Zalpha11 리간드)는 또한 IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, 및 IL-15를 포함하는 사이토카인의 IL-2 과(family)의 구성원이다. 이 과의 단백질은 항암 및 항바이러스 효과 모두를 가지는 것으로 나타났다. IL-21은 헬퍼 T-세포에 의해 생산되는데, 이것은 면역의 중요한 조절자이다. 그것의 동족 수용체의 발현 패턴 및 단백 질의 투여를 기재로하여, IL-21은 종양 및 바이러스로 감염된 세포를 박멸하는 두개의 림프구 클래스인, CD8+ 킬러 T-세포 및 자연 세포 독성(NK) 세포를 활성화하는 것으로 나타났다. 또한 IL-21은 B-세포의 선택 클래스를 자극한다.(Parrish et al. , Nature 408: 57-63, 2000).
재조합 IL-21은 원핵 생물, 특히 E.Coli에서 생산되었다. 결과의 세균 생산된 단백질은 글리코실화되지 않으며, 응집 상태로 생산된다. E.Coli로부터 IL-21의 생산은 응집된 단백질이 불용성 봉입체로부터 용해되고 재생되거나 리폴딩되는 것이 필요하다. 재생하지 않으면, 재조합 단백질의 특이적 활성은 현저히 감소될 것이다.
세균 숙주 내 재조합 단백질의 발현의 진보에도 불구하고, 단백질 생산에 관한 보다 높은 수율을 가져오는 원핵세포계에 있어서 생물학적으로 활성이고 정제된 재조합 IL-21 단백질을 생산하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 여전하다. 이들 및 본 발명의 다른 양태는 하기 상세한 설명에 관하여 명백해질 것이다. 또한, 다양한 참고문헌이 아래에서 확인되고 그들 전체가 참고로서 인용된다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 원핵 생물의 복제 기원의 작동적으로 연결된 요소, 전사 개시 DNA 요소, 및 SEQ ID NO:27에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IL-21 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터 및 전사 종결자를 제공한다. 다른 양태에서, 발현 벡터는 벡터 pTAP337이다. 추가적 구체예에서, 발현 벡터는 선택가능 마커를 포함하여 제공할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:27을 포함하여 설명된 발현 벡터를 형질전환한 원핵생물 숙주 세포, SEQ ID NO:28의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 벡터 pTAP337을 제공한다. 다른 구체예에서, 숙주 균주는 버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, E.Coli 균주 W3110 또는 균주 zGOLD1이다.
다른 양태에서, 본 발명은 IL-21 단백질이 발현되는 조건 하에서 IL-21 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 pTAP337로 형질전환된 후 IL-21을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 SEQ ID NO:27을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 성장 배지로부터 숙주 세포를 회수한 후, 숙주 세포로부터 IL-21 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 주입 회분식 발효 공정 또는 회분식 발효 공정에 있어서, 상기 설명되는 바와 같은 단계를 포함하는 IL-21을 생산하기 위하 ㄴ방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같이 성장 배지의 5 내지 20의 OD600에 대한 진탕 플라스크에 있어서, 발효 용기를 숙주 세포를 함유하는 1 내지 12% v/v의 진탕 플라스크 배지로 접종하고, pH 6.2 내지 7.2에서 성장 배지의 숙주 세포를 배양하는데, 이 때 공급 용액을 발효 용기에 공급한 후 경과 발효 시간(EFT) 15 시간을 경과하고, 20 내지 30 시 EFT에 발효 용기에 유도 제제를 첨가하며, 48 내지 56 시간 EFT에 숙주 세포를 수확하는 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 IL-21 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 유도 제제는 0.5 내지 2 mM의 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)이다. 다른 구체예에서, 공급 용액은 글리세롤 및 글루코스로 구성된 군으로부터 선택된 탄수화물을 포함하며 이것의 공급은 시간 당 5 내지 15 그램의 탄수화물이다. 다른 구체예에서, 공급 용액 중 글리세롤은 40 내지 70% v/v 글리세롤이거나 글루코스는 40 내지 70% w/v 글루코스이다. 추가적 구체예에서, 글리세롤은 약 70% v/v이거나 글루코스는 약 60% w/v이다.
한 양태에서, 본 발명은 IL-21을 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 SEQ ID NO:28에 나타낸 바와 같은 IL-21 폴리펩티드를 발현하는 E.Coli W3110 숙주 세포, 또는 IL-21 폴리펩티드가 발현되고, 성장 배지는 약 5 g/l 글리세롤을 포함하는 pTAP337 벡터를 포함하는 E.Coli W3110 숙주 세포를 포함하는 접종물을 플라스크에 유도하는 단계, 약 30℃에서 16 내지 20 시간 동안 성장 배지 내 접종물을 배양하는 단계, 농도 0.5 내지 5% v/v 접종물에서 성장 배지 내 배양된 접종물을 회분식 발효기로 전달하는 단계, 약 37℃ 및 약 pH 6.8 iwht 약 2% 글리세롤에서 회분식 발효를 발효시키는 단계, 약 9.5 g 글루코스/리터/시의 약 8 시간 EFT에서 글루코스 공급을 유도하고 발효 실행의 끝까지 계속하는 단계, IPTG의 약 28 시간을 발효시키는 단계, 발효기로부터 발효 육즙을 수확하는 단계, 발효 육즙에 동일양의 물을 첨가하는 단계, 및 IL-21 단백질 물질을 포함하는 세포 침전물이나 세포 슬러리를 수집하기 위해 균질화하고 원심단리하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 불용성 IL-21 단백질을 단리시키는 방법을 제공하는데, 이는 세포 침전물이나 슬러리로부터 수 불용성 IL-21 단백질을 단리시키는 단계, 캐오트로픽(chaotropic) 용매에 불용성 IL-21 물질을 용해하는 단계, 캐오트로픽 용매를 희석하고 IL-21 단백질을 리폴딩하는 단계를 포함하며, IL-21 단백질을 단리시키는 단계로서, 단리된 IL-21 단백질은 생물학적으로 활성일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 단리된 IL-21 단백질은 적어도 90% 순도이다. 다른 구체예에서, 단리된 IL-21 단백질은 적어도 90% 순도이며 mg IL-21 단백질 당 10 내독소 유닛 이하의 내독소 수준을 갖는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 불용성 IL-21 단백질을 단리시키는 방법을 제공하는데, 이는 발효 육즙으로부터 수 불용성 IL-21 단백질 물질을 포함하는 세포 침전물이나 세포 슬러리를 단리시키는 단계, 봉입체를 수집하기 위해 세포 침전물이나 세포 슬러리를 균질화하는 단계, 구아니딘 염을 포함하는 캐오트로픽 용매에 불용성 IL-21 단백질을 용해시키는 단계, 아르기닌 염을 포함하는 리폴딩 완충액 및 산화 및 환원 성분의 혼합물을 첨가함으로써 캐오트로픽 용매를 희석하는 단계, 여과에 의해 폴딩되지 않고 응집된 단백질을 제거함으로써 IL-21 단백질을 단리시키는 단계, 및 양이온 교환 컬럼 상에서 IL-21 리폴딩된 단백질을 정제하는 단계로서, 상기 단리 및 정제된 IL-21은 생물학적으로 활성으로 존재하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 불용성 IL-21 단백질을 단리시키는 방법을 제공하는데, 이는 발효 육즙으로부터 수 불용성 IL-21 물질을 포함하는 세포 침전물이나 세포 슬러리를 단리시키는 단계, 봉입체를 수집하기 위해 세포 침전물이나 세포 슬러리를 균질화하는 단계, 구아니딘 염을 포함하는 캐오트로픽 용매에 불용성 IL-21 단백질 물질을 용해하는 단계, 아르기닌 염을 포함하는 리폴딩 완충액 및 산화 및 환원 성분의 혼합물을 첨가함으로써 캐오트로픽 용매를 희석하는 단계, 여과에 의해 폴딩되지 않고 응집된 단백질을 제거함으로써 IL-21 단백질을 단리시키는 단계, 양이온 교환 컬럼 상에서 IL-21 리폴딩된 단백질을 정제하는 단계, 및 소수성 상호작용 컬럼 상에서 IL-21 용출액을 정제하는 단계로서, 상기 단리 및 정제된 IL-21 단백질은 생물학적으로 활성으로 존재하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:28에 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 불용성 IL-21 단백질을 단리시키는 방법을 제공하는데, 이는 발효 육즙으로부터 수 불용성 IL-21 단백질 물질을 포함하는 세포 침전물이나 세포 슬러리를 단리시키는 단계, 봉입체를 수집하기 위해 세포 침전물이나 세포 슬러리를 균질화하는 단계, 실온에서 약 1시간 동안 약 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 40 mM 디트리오트레이톨(DTT)을 포함하는 캐오트로픽 용매에 불용성 IL-21 단백질 물질을 용해하는 단계, 용액 중에 용해된 봉입체를 2 mM DTT, 4 mM 시스틴 산화-환원 짝을 포함하는 리폴딩 완충액으로 적어도 20 배 희석하여 리폴딩하는 단계, 약 20% 아세트산을 갖는 5.5 까지 pH를 조졸하고 적어도 5 시간 동안 용액이 반응하도록 허용하는 단계, 약 1 + 1.4 부피 25 mM 아세테이트, pH 5.5를 포함하는 용액을 희석하는 단계, 상기 용액을 여과하는 단계, 상기 용액을 아세트산 나트륨 완충액을 사용하여 pH 5.5까지 평형이 유지된 Tosohaas SP-550C 수지 컬럼 상에 부하하는 단계, 약 0.4 M 염화나트륨으로 상기 수지 컬럼을 세척하는 단계, 약 0.75 M 염화나트륨으로 상기 수지 컬럼을 세척하여 결합된 IL-21 단백질을 용출하는 단계, 황산 암모늄을 약 1.5 M의 농도까지 첨가하여 용출하고 용출 용액을 여과하는 단계, 용출 용액을 아세트산 나트륨 완충액 중에 1.5 M 황산 암모늄, 0.05 염화나트륨으로 평형된 Tosohaas 부틸 650-M 컬럼 상으로 부하하는 단계, 용출액을 아세트산 나트륨 완충액으로 평형된 SP 세파로스 HP 컬럼 상에서 희석하는 단계, 0.3 내지 0.7 M 염화나트륨으로부터 20 컬럼 부피 선형 구배를 갖는 컬럼을 세척하는 단계, IL-21 단백질 콘트래이션, 및 완충액을 접선 유동 초여과를 사용하여 수식화 완충액으로 교체하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 불용성 IL-21 단백질을 단리하기 위한 상기 방법은 IL-21 수용체 결합 분석을 사용하여 생물학적 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 pH 5.3에서 약 10 mM 히스티딘, 4.7% 만니톨에 있어서 약 10 mg/ml IL-21 단백질의 농도로 SEQ ID NO:28의 아미노산 잔기 2-163에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 IL-21 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
도 1은 IL-21에 대하여 코돈 최적화된 서열을 함유하는 발현 플라스미드 pTAP337의 도해이다. 사람의 zalpha11 리간드의 명칭이 IL-21이다. 상기 플라스미드는 특허 기탁 명칭 PTA-4853에 속하여 버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.
발명의 설명
하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)와 같은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산된 단편, 및 리게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생산된 단편을 나타낸다. 핵산 분자는 천연 발생 뉴클레오티드(DNA 및 RNA와 같은), 또는 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연 발생 뉴클레오티드의 α-거울상체 형태), 또는 상기 모두의 조합인 모노머로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘이나 퓨린 염기 부분의 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 할로겐, 알킬 기, 아민, 및 아지도 기를 갖는 하나 이상의 히드록실 기의 치환을 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 부분은 입체적 및 전자적으로 유사한 구조, 예를 들어, 아자-당 및 탄소환 당 유사체로 치환될 수 있다. 염기 부분의 변형의 예는 알킬화 퓨린 및 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 기타 주지된 헤테로시클릭 치환기를 포함한다. 핵산 모노머는 포스포디에스테르 결합 또는 그러한 결합의 유사체로써 결합된다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 주(backbone)에 부착된 천연 발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하여, 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다.
용어 "핵산 분자의 보체"는 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하여 상보성 뉴클레오티드 서열 및 역 방위를 갖는 핵산 분자를 나타낸다.
"인핸서"는 전사의 개시 부위에 상대적인 인핸서의 거리 또는 방위에 관계없이, 전사의 효율성을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 유형이다.
"이종 DNA"는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 나타내는데, 이것은 제공된 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하지 않는다. 특정 숙주 세포에 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(예를 들어, 외인 DNA)와 결합되면 숙주 세포 종(예를 들어, 내인 DNA)으로부터 유도된 DNA를 함유할 수 있다. 예를 들어, 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 단편에 작동적으로 결합된 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 단편을 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자로 여겨진다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외인 프로모터로 작동적으로 연결된 내인 유전자를 포함할 수 있다. 다른 설명과 같이, 야생형 세포로부터 유도된 유전자를 포함하는 DNA 분자는 상기 DNA 분자가 야생형 유전자가 결핍하는 돌연변이 세포로 유도된다면, 이종 DNA인 것으로 여겨진다.
용어 "콘티그"는 인접한 신장의 다른 핵산 분자에 동일하거나 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 가리킨다. 인접 서열은 그들 전체가 또는 핵산 분자의 일부 신장을 따라서 핵산 분자의 제공된 신장을 "중첩"하는 것이라 말하여진다.
"상보성 DNA(cDNA)"는 역전사 효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일 가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 일부에 상보성인 프라이머는 역전사의 개시를 위해 사용된다. 또한 당업자는 용어 "cDNA"를 이러한 단일 가닥 DNA 분자 및 그것의 상보성 DNA 가닥으로 이루어진 이중 가닥 DNA 분자를 나타내는 데 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 나타낸다.
"단리된 핵산 분자"는 개체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 단리된 성장 인자를 코딩하는 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 단리된 핵산 분자의 다른 예는 개체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로-합성된 핵산 분자이다. 특정 종으로부터 단리된 핵산 분자는 그러한 종으로부터 염색체의 완전한 DNA 분자 보다 더 작다.
"선형 DNA"는 5' 및 3' 말단이 없는 비선형 DNA 분자를 이른다. 선형 DNA는 효소적 소화 또는 물리적 붕괴에 의해 폐쇄 원형 DNA 분자, 예를 들어, 플라스미드로부터 제조될 수 있다.
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다. 전사의 개시에 있어서 작용하는 프로모터 내 서열 요소는 종종 일치 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터는 예를 들어, 그러나 이에 한정되지는 않으나, IPTG-유도 프로모터, 박테리오파지 T7 프로모터 및 박테 리오파지 λpL을 포함한다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]을 참조하시오. 일반적인 프로모터는 그들 사이에 16 내지 19 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 -35 및 -10에 있어서 일치 서열로 이루어진 3개의 구성요소를 가질 수 있다(Lisset, S. 및 Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21 : 1512,1993). 이러한 종류의 프로모터는 lac, trp, trp-lac(tac) 및 trp-lac(trc) 프로모터를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터라면, 전사율은 유도제에 반응하여 증가한다. 반대로, 전사율은 프로모터가 구조성 프로모터라면 유도제에 의해 조절되지 않는다.
"핵심 프로모터"는 전사의 개시를 포함하는 프로모터 작용을 위한 필수적 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 정의에 의해, 핵심 프로모터는 특이적 서열의 부재에 있어서 검출 가능한 활성을 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있어서 활성을 증강시키거나 조직 특이적 활성을 수여할 수 있다.
"조절 요소"는 핵심 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 진핵 생물 조절 요소는 특정 세포, 조직, 또는 소기관에 있어서 배제적으로 또는 우위적으로 전사를 가능케하는 세포 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이러한 유형의 조절 요소는 일반적으로 "세포-특이적", "조직-특이적", 또는 "소기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 관련된다. 세균 프로모터는 활성제 또는 억제제 분자에 결합하는 예를 들어 작동자 서열과 같은 핵심 프 로모터의 활성을 결합하고 조절하는 조절 요소이다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포 내에서 자발적으로 복제하는 능력을 지니는 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 핵산 분자이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선택에 있어서 사용상 적합한 뉴클레오티드 서열 코딩 마커 유전자 뿐만 아니라, 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 확정할 수 있는 방식으로 핵산 분자의 삽입을 허용하는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포 내에서 발현된 핵산 분자 코딩 유전자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 복제 기원, 선택가능한 마커, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에서 발생하고, 이러한 유전자는 프로모터 "작동적으로 연결"되었다고 말하여진다. 이와 유사하게, 조절 요소 및 핵심 프로머터는 조절 요소가 핵심 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동적으로 연결된다. 발현 벡터는 또한 발현 구성으로 알려질 수 있다.
"재조합 숙주"는 예를 들어 클로닝 벡터나 발현 벡터와 같은 이종 핵산 분자를 함유하는 세포이다.
용어 "발현"은 유전자 생산의 생합성을 나타낸다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 또는 폴리펩티드로의 번역을 포함한다.
용어 "분비 신호 서열"은 대형 폴리펩티드의 성분으로서, 폴리펩티드가 합성 되는 세포의 분비 경로를 통하여 대형 폴리펩티드를 지시하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 의미한다. 대형 폴리펩티드는 보통 절단되어 분비 경로를 통한 전이 동안 분비 펩티드를 제거한다.
"폴리펩티드"는 천연 또는 합성적으로 생산된 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드는 보통 "펩티드"로 나타낸다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 고분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 기타 비-펩티드 치환기가 단백질에 첨가될 수 있다. 단백질은 본원에서 그들의 아미노산 주 구조에 관한여 정의되며; 탄화수소 기 및 비-펩티드 기와 같은 치환기가 일반적으로 명기되지만, 그럼에도 존재할 수 있다.
비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"단리 폴리펩티드"는 예를 들어 탄수화물, 지질, 또는 천연의 폴리펩티드와 관련된 기타 단백질성 불순물과 같은 오염성 세포 구성성분이 본질적으로 부존재하는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리 폴리펩티드의 제조는 고도로 정제된 형태, 예를 들어, 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 95% 이상 순도, 또는 99% 이상 순도의 폴리펩티드를 포함한다. 단리 폴리펩티드를 포함하는 특정 단백질 제조는 단백질 제조의 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 겔의 콤마시 브릴리언트 블루 염색에 따르는 단일 띠의 출 현에 의하는 한 방법을 나타낸다. 그러나, 용어 "단리"는 예를 들어 다이머 또는 택일적으로 글리코실화 또는 유도된 형태와 같은 양자택일의 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.
용어 "아미노-말단의" 또는 "N-말단의" 및 "카르복실-말단의" 또는 "C-말단의"은 본원에서 폴리펩티드 내 위치를 표시하는데 사용된다. 본 문맥은 이들 용어가 근접 또는 상대적 위치에 대한 폴리펩티드의 특정 서열이나 일부에 관하여 사용되느 ㄴ것을 허용한다. 예를 들어, 폴리펩티드 내 기준 서열에 대하여 카르복실-말단에 위치된 특정 서열은 상기 기준 서열의 카르복실 말단 근처에 위치하지만, 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에서 필수적인 것은 아니다.
"융합 단백질"은 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 하이브리드 단백질이다.
용어 "친화성 태그"는 본원에서 2차 폴리펩티드에 부착하여 2차 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나 기질에 2차 폴리펩티드의 부착을 위한 자리를 제공할 수 있는 폴리펩티드 분획을 나타내는데 사용된다. 주로, 항체 또는 기타 특이적 결합 제제가 이용가능한 임의의 펩티드 또는 단백질은 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J.4 : 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (Smith 및 Johnson, Gene 67: 31 (1988)), Glu-Glu 친화성 태그(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952 (1985) ), 물질 P, FLAG 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988) ), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 기타 항원 에피토프 또는 결합 도메인. 일반적으로, [Ford et al., Protein Expression 및 Purification 2: 95 (1991)]를 참조하시오. DNA 분자 코딩 친화성 태그는 시중 구매 가능하다(예를 들어, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
용어 "등장성"은 본원에서 그것의 전통적 의미로 사용되는데, 이는 0.9% NaCl 용액에 당량인 혈액의 그것과 동일한 삼투압이다. 염의 "등장성 양"은 등장액을 만들거나 동결건조 제조의 재구성에 있어서 등장액을 생산하기 위해 필요한 양이다.
농도는 본원에서 액체 조성물의 몰농도나 % w/v의 유닛으로 구체화된다. 조성물이 동결건조된 분말의 형태일 경우, 각각의 성분의 농도는 상기 분말의 재구성에 있어서 구체화된 농도를 제공하는 바와 같을 것이다.
표준 분석 방법의 부정확성으로 인하여, 폴리머의 분자 중량 및 길이는 근사값으로 이해될 것이다. 이러한 값이 "약" X 또는 "어림잡아" X로서 표현될 경우, X의 언급된 값은 ±10%의 정확도인 것으로 이해될 것이다.
재조합 IL-21의 발현
본 발명은 원핵생물 훅주로부터 재조합 IL-21 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터 및 방법을 제공한다. IL-21은 사전에 zalpha11 리간드로 칭하여졌고, 본원에 참고로 인용되는 공동 양도된 미국 특허 제6,307,024에서 전부 기술된다. 특히, 본 발명의 발현 벡터 및 방법은 코돈을 최적화하기 위해 뉴클레오티드의 특이적 변화를 갖는 IL-21 코딩 서열 및 E.Coli 내 번역을 위해 mRNA 2차 구조를 이용하는 IL- 21의 대규모 생산을 위한 E.Coli 발현 시스템을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터 및 방법을 이용함에 있어서, IL-21 유전자가 주입 회분시기 발효에서 1 g/L 보다 더 큰 수준으로 E.Coli 내에서 생산되었다. 본 발명자들은 생산 숙주로서 E.Coli OmpT 프로테아제 결핍 균주 UT5600의 사용이 IL-21 met을 포함하는 안정성 문제를 극복하였음을 발견하였다. IL-21 met은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 참가되는 N-말단의 Met를 코딩하는 코돈을 갖는 IL-21 코딩 서열이다. 본원에서 기술되는 발현 벡터를 사용은 박테리아로부터 회수된 재조합 단백질의 수율을 현저하게 향상시켰다. 이러한 생산 숙주 균주의 사용은 진탕 플라스크 배양으로부터 50 mg/L IL-21 met 봉입체 이상을 수율하였다. 다른 구체예에서, 고 세포 농도 주입 회분식 발효의 개선을 촉진하기 위해, 다른 E.Coli 균주, W3110이 IL-21의 대규모 생산을 위한 숙주로서 선택되었다. 이 숙주 균주는 비-병원성이며 최소한으로 한정된 발효 배지에서 고 세포 농도로 성장할 수 있다. E.Coli 균주 W3110 내 IL-21met의 생산은 진탕 플라스크 및 회분식 발효에서 생산되는 경우 E.Coli 균주 UT5600에서 획득된 것과 필적하였다.
본 발명은 또한 IL-21 단백질이 숙주 세포에 의해 발현되고 글리코실화되지 않은 불용성 봉입체로서 숙주 세포 내에서 발견되는 경우 원핵생물 숙주로부터 재조합 IL-21 단백질을 회수하는 방법을 제공한다. 원핵 세포가 용해되어 봉입체(굴절반사체라고도 칭함)를 단리하는 경우, 봉입체는 IL-21의 응집체이다. 따라서, 봉입체는 해리 및 용해되어 IL-21 단백질을 단리해야 하며, 일반적으로 이것은 변성 캐오트로픽 용매를 사용하여, 리폴딩되어 현저한 생물학적 활성을 반드시 갖는 폴 리펩티드를 회수하는 것이 필요하다. 일단 IL-21 단백질이 리폴딩되면, 단백질은 포획되고 정제되어야 한다. 따라서, 본 발명은 원핵세포로부터 불용성 IL-21 단백질을 단리하고, 캐오트로픽 용매에서 불용성 IL-21 단백질 물질을 용해하고, IL-21 단백질이 리폴딩되고 단리되는 방식으로 캐오트로픽 용매를 희석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 희석한 리폴딩 완충액으로부터 변성된 IL-21을 포획하고, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 리폴딩된 IL-21 단백질을 정제하는 방법을 포함한다. 또한 정제는 IL-21 수용체 등을 사용하여 결합 분석에서 음이온 교환을 이용하여 이루어진다.
사람 IL-21 유전자는 162 아미노산의 폴리펩티드를 코딩한다. 완전한 길이 서열은 SEQ ID NO:1에서 나타낸 바와 같이 29 아미노산의 시그날 펩티드, 및 잔기 162(Ser)에 잔기 30(Gln)을 포함하는 133 아미노산의 성숙 단백질을 포함한다. 원핵생물 발현 시스템을 사용하여 발현되는 바와 같이 IL-21 서열은 N-말단 Met, 및 뉴클레오티드를 포함하며 대응 아미노산 서열은 SEQ ID NO:27 및 28에 나타낸다. SEQ ID NO:27의 뉴클레오티드 서열은 본 발며의 범주 내에 해당하는 코돈 최적화 서열을 나타낸다.
포유동물 발현 시스템을 이용한 재조합 사람 IL-21의 생산은 약 20 mg/L의 단백질을 생산하였다. 따라서, 보다 비용 효율적인 발현 시스템이 IL-21의 대규모 생산에 바람직하였다. E.Coli 세스템은 대규모 생산에 대하여 보다 택일적인 것으로 밝혀졌다. 잠재적인 Asn-연관 글리코실화 자리가 존재하지만 포유동물 발현 시스템을 이용하는 CHO 셀라인에서 발현되는 단백질 또는 바큐로바이러스 발현 시스 템을 이용하는 곤충 세포에서는 존재하지 않는다. 이러한 구조적 특징은 IL-21을 원핵생물 발현에 있어서 좋은 후보자로 만든다. E.Coli 내 발현은 다른 발현 시스템 이상으로 상당한 이점, 특히 낮은 개발 비용 및 높은 생산 수득율을 제공한다.
E.Coli에서 발현되는 N-말단 잔기(IL-21met)를 포함하는 재조합 IL-21은 세포 붕괘 이후 불용성 봉입체로서 단리되었다. 이러한 물질은 부정확하게 리폴딩되며 소망하는 생물학적 활성을 지니지 않는다. 대부분의 경우 봉입체는 변성 캐오트로픽 용매에서 용해될 필요가 있었고 단백질은 캐오트로픽 제제의 희석에 의해 리폴딩 후 정제되었다. 단백질은 그들의 최적의 리폴딩 환경과 관련하여 많이 변화한다. ㅈ거당히 폴딩하고 생물학적으로 활성인 물질의 회수에 영향을 미치는 인자는 초기 단백질 농도, 산화 상태, pH, 부형제, 염, 계면활성제, 온도, 리폴딩 완충액 첨가의 방식 등을 포함한다. IL-21, Il-2와 유사한 서열 및 구조를 갖는 단백질은 E.Coli 시스템에서 발현되고 성공적으로 리폴딩되었다(Weir et al., J. Biochem. 245: 85, 1987). 사람 Il-2의 재조합 뮤테인 ALDESLEUKIN®은 E.Coli에서 봉입체로서 발현되었고 생체 외에서 리폴딩되었다.
사람 IL-21 cDNA에서 사용된 코돈의 조사는 그것이 E.Coli에서 가장 최소한의 빈도로 사용되는 코돈의 과잉을 포함하는 것을 나타낸다. 고함량의 거의 사용되지 않는 코돈을 갖는 유전자는 E.Coli에서 낮은 수준으로 발현되는 경향이 있다(Kane, Curr Opin Biotechnol. 6(5): 494-500,1995). E.Coli 내 사람 IL-21의 발현에 관련한 추가적인 관심사는 IL-21 서열 내에 위치한 4개의 잠재적 OmpT 절단 자리의 발생이었다. OmpT는 2개의 연속적 염기성 잔기 사이를 특이적으로 절단하는 엔도펩티다제이고 상기 효소는 8M 요소 및 6M 구아니딘-HCl과 같은 변성 조건 하에서 활성이다(White et al., J Biol Chem. 270 (22): 12990-4,1995 ; Dekker et al., Biochemistry, 40 (6): 1694-701, 2001). 이것은 OmpT의 단백질 가수분해 활성으로 인한 E.Coli로부터의 세포 추출물 내 IL-21의 안정성에 대한 관심을 일으킨다.
몇몇 연구소는 유전자가 코돈을 거의 함유하지 않는 단백질의 발현 수준은 특정 희박 tRNA의 수준이 숙주 내에서 증가될 때 극적으로 향상될 수 있음을 보여주었다(Zdanovsky et al.,Appl Environ Microbiol. 66(8): 3166-73,2000 ; Calderone et al. , J Mol Biol. 262(4): 407-12; Kleber-Janke et al., Protein Expr Purif. 19(3): 419-24,2000 ; You et al,. Biotechniques. 27(5) :950-4, 1999). pRARE 플라스미드는 E.Coli 내에서 희박한 tRNA에 대한 유전자(argU, argW, leuW, proL, ileX 및glyT)를 그들 고유의 프로모터를 이용하여 코딩한다(Novy et al., InNovations, 12: 2-3,2001). pRARE를 이용한 공동-발현은 E.Coli 내 IL-21met 생산을 약 5-10배까지 향상시켰다. pRARE를 이용한 공동-발현은 또한 보다 적합한 코돈을 갖는 IL-21met 유전자를 재합성하는 것이 이로울 것으로 암시하는 E.Coli 세포 용해질 내 절단된 IL-21met의 수준을 감소시켰다.
본 발명은 E.Coli 내 번역을 위하여 최적화된 코돈을 갖는 IL-21의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. IL-21met를 코딩하는 합성 유전자를 중첩 PCR에 의해 얻었다. 최종 PCR 생산물이 Tac 프로모터의 제어하에 발현을 위하여 P녀 벡터 내로 유도되었다. IL-21met cDNA의 2차 구조의 조사는 예외적으로 안정한 헤어핀 구조를 밝혀냈다. 이러한 헤어핀 루프는 완전히 최적화된 서열로부터 유효한 발현을 막는 구조적 요소라고 짐작되어다. 이 때 헤어핀 구조가 SEQ ID NO:1에서 나타낸 바와 같은 서열로 최적화된 서열의 1차 80 염기를 치환함으로써 제거되었다. 하이브리드 IL-21은 SEQ ID NO:27에 나타내고, 결과의 유전자는 높은 수준으로 E.Coli에서 발현되었다. 새로운 발현 구조를 갖는 발현 수준은 약 20%의 총 세포 단백질 또는 100 mg/L까지 증가하였다.
원핵세포에서 소망하는 단백질의 생산을 위해 적절한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 세균 숙주 내 발현 벡터의 유지를 위해 세균 기원에 대하여 코딩하는 원핵생물 DNA 요소; (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 억제하는 DNA 요소; (3) 전사 종결자와 같은 전사의 과정을 제어하는 DNA 요소; (4) 항생제 내성과 같은 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포는 발현 벡터의 유도 및 적절한 유도자의 첨가하에 IL-21를 생산한다. 따라서, 본 발명은 프로모터, IL-21 최적화 뉴클레오티드 서열, 및 종결자 서열을 포함하는 발현 벡터를 고려한다. 전형적인 최적화 IL-21 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO:27에 나타낸다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 선택가능한 마커를 더 포함한다. 한 구체예에서, 선택가능한 마커는 카나마이신 내성이다.
발현 벡터는 또한 펩티드 태그를 코딩하여 소망하는 단백질의 정제에 도움이 되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 재조합 폴리펩티드를 단리하는데 유용한 펩티드 태그는 예를 들어, 폴리히스티딘 태그(니켈-킬레이트화 수지에 대하여 친화성이 있음), c-myc 태그, 칼모듈린 결합 단백질(칼모듈린 친화성 크로마토그래피에 의해 단리됨), 물질 P, PYIRS 태그(항-RYIRS와 결함됨), Glu-Glu 태그, 및 FLAG 태그(항-FLAG 항체와 결합됨)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 및 Zheng et al., Gene 186: 55 (1997)]을 참조하시오. 이러한 펩티드 태그를 코딩하는 핵산 분자는 예를 들어 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)로부터 이용가능하다.
당업계 통상의 기술 중 하나는 발현 벡터의 제조를 위한 다수의 분자 기술과 유사할 것이다. 예를 들어, IL-21 폴리뉴클레오티드는 상호 기폭제, 긴 올리고뉴클레오티드 및 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 핵산 분자를 합성함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel (1995) 8-8 내지 8-9 페이지] 참조). 중합효소 연쇄 반응을 사용하는 확립된 기술은 적어도 길이가 2 킬로베이스인 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods 및 Applications 2: 266 (1993), Dillon et al.,"Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes, "in Methods in Molecular Biology, Vol.15 : PCR Protocols : Current Methods 및 Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), 및 Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)).
발현 시스템을 구성하는 다른 방법은 효모 시스템을 사용하여 동종 재조합을 유용화 한다. 참고로 본원에 인용된 미국 특허 제 6,207,442, 동종 재조합에 의한 플라스미드 구성을 참조하시오. 본 시스템은 폴리펩티드 융합을 포함하는 관심있는 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝하는데 사용될 수 있는 일반적인 억셉터 플라스미드를 제공한다. 상기 시스템은 관심있는 단백질을 코딩하는 부위를 포함하는 이중 가닥의 선형 DNA 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 관심있는 단백질, 예를 들어, IL-21을 코딩하는 하나 이상의 도너 DNA 분획은 Saccharomyces cerevisiae 숙주 세포 내에서 억셉터 플라스미드, 1차 DNA 연결자, 및 2차 DNA 연결자와 결합하며, 이로써 도너 DNA 분획은 도너 DNA, 억셉터 플라스미드, 및 연결자의 동종 재조합에 의해 억셉터 플라스미드에 결합되어 폐쇄된 선형 플라스미드르 형성한다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 예를 들어, 포스포라미다이트 방법과 같은 프로토콜을 사용하여 "유전자 기계"를 이용하여 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 이중 가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 분획의 합성과 같은 적용에 있어서 필요하고, 이 때 각각의 상보성 가닥은 단독으로 만들어진다. 짧은 유전자(60 내지 80 염기 쌍)의 생산은 기술적으로 간단하고 상보성 가닥을 합성한 후 그들을 아닐링함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 더 긴 유전자(300 염기 쌍 이상)의 생산을 위하여, 특별한 전략이 필요할 수 있으며, 이는 화학적 DNA 합성 동안 각각의 사이클의 커플링 효율이 거의 100%이기 때문이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 길이가 20 내지 100 뉴클레오티드에 이르는 단일 가닥 분획으로부터 모듈 형태로 모은다. 폴리뉴클레오티드 합성의 개관을 위해, 예를 들어, 문헌[Glick 및 Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles 및 Applications of Recombinant DNA(ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), 및 Climie et al., Proc.Nat'1 Acad. Sci. USA 87: 633 (1990)] 참조하시오.
IL-21 유전자 및 발현 벡터를 제조하는데 사용될 수 있는 선택적 기술의 예는 예컨대, 이들 모두가 당업계 주지인, 제한 엔도뉴클레아제 소화 및 리게이션, 및 중합효소 연쇄 반응을 포함한다.
매우 다양한 선택가능한 마커 유전자가 이용가능하다(예를 들어, 문헌[Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487(1990) ; Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537 (1990)] 참조하시오). 발현 벡터는 예를 들어, 테트라사이클린 내성, 암피실린 내성, 카나마이신 내성, 네오마이신 내성, 또는 클로로마페니콜 내성과 같은 선택 마커를 포함하는 것이 일반적이다. 선택가능한 마커는 형질전환되지 않은 세포로부터 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 세포의 선택 및/검출을 허용할 것이다. 발현 벡터는 하나 이상의 이러한 항생제 내성 유전자를 함유할 수 있다. 항생제 내성을 갖지 않는 선택가능한 마커의 예는 플라스미드 R1으로부터 hok/sok 시스템을 이용한다. hok 유전자는 52 아미노산의 독성 Hok 단백질을 코딩하고 sok 유전자는 안티센스 RNA를 코딩하는데, 이것은 hok mRNA 리더 서열에 상보적이다. 이러한 선택가능한 마커는 당업계 숙련자에 공지되어 있으며 문헌[Gerdes, K. et al., Genetic Engineering, 19: 49-61, 1997]에 보다 상세히 기술되어 있다.
매우 다양한 적합한 재조합 숙주 세포가 본 발명에 의해 포함되는데, 이에 한정하지는 않지만 그램-음성 원핵 생물 숙주 개체를 포함한다. E.Coli의 적합한 균주는 W3110, K12-유도 균주 MM294, TG-1, JM-107, BL21, 및 UT5600을 포함한다. 다른 적합한 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3) pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF',DH5IMCR, DH10B, DHlOB/p3, DH1 IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, E.coli K12, E.coli K12 RV308, E.coli K12 C600, E.coliHB101, E.coli K12 C600 R.sub. k-M.sub.k-, E.coli K12 RR1을 포함한다(예를 들어, 문헌[Brown(ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)]참조). 다른 그램-음성 원행생물 숙주는 Serratia, Pseudomonas, Caulobacter를 포함할 수 있다. 예를 들어, B. subtilis 및 B.thuringienesis와 같은 Bacillus, 및 Streptomyces뿐 아니라, 예를 들어 S. lividans, S.ambofaciens, S. fradiae, 및 S. griseofuscus와 같은 B. thuringienesis var. israelensis와 같은 그램-양성 미생물을 포함할 수 있다. Bacillus subtilus의 적합한 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170을 포함한다(예를 들어, 문헌[Hardy, "Bacillus Cloning Methods, "in DNA Cloning : A Practical Approach, Glover (ed. )(IRL Press 1985)] 참조). 원핵생물 숙주에서 증식하는 벡터에 대한 표준 기술은 당업자에게 주지이다(예를 들어, [Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology(CRC Press, Inc. 1997)]참조). 원핵생물에 있어서 프로테아제 불완전 균주의 개관을 위하여, 문헌[Meerman et al., Biotechnology 12: 1107-1110,1994]를 참조하시오. 본 발명은 W3110 균주를 사용하여 예증되고, 이것은 ATCC # 27325로서 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
클로닝 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포 내로 유도하는 기술은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 및 Ausubel et al.,eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 및 Sons, Inc., NY, 1987]에 의해 개시된다. 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분 및 기타 성분을 함유하는 배양 배지에서 전통적 방법에 따라 배양된다. 한정 배지 및 복합 배지를 포함하는 다양한 적당한 배지가 당업계 공지되어 있으며 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미테랄을 포함한다. 배지는 또한 필요로 하는 바와 같이, 성장 인자나 혈청과 같은 이러한 성분을 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 예를 들어, 약물 선택 또는 발현 벡터 상에 함유되거나 숙주 세포 내로 공동-형질감염된 선택가능한 마커에 의해 보충되는 필수 영양분의 결핍에 의해 외인적으로 첨가되는 DNA를 함유하는 세포에 대하여 선택될 것이다. 액체 배양은 예를 들어 소규모 플라스크의 진탕이나 발효기의 살포와 같은 전통적 방법에 의해 충분한 통기가 제공된다. 형질전환된 세포는 선택되고 증식되어 관심있는 유전자를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제공할 수 있다. IL-21은 MBP(말토스 결합 단백질) 융합 시스템(New Engl및 Biolabs (NEB; Beverly, MA))을 사용하여 E.Coli 내에서 발현될 수 있다. 이러한 시스템에서, IL-21 cDNA는 malE 유전자의 3' 말단에 부착되어 MBP-IL-21 융합 단백질을 형성한다. 융합 단백질 발현은 tac 프로모터에 의해 구동되고 프로모터가 1 mmol IPGT(이소프로필 b-티오갈락토실피라노시드)의 첨가에 의해 유도될 때 까지 " 오프"이다. 구조는 pMAL-c2 벡터(NEB)의 복합 클로닝 자리(MCS)에 따라서, 및 제조업자의 설명에 따라서 MBP와 프레임 내 융합으로서 제작될 수 있다.
발효
본 발명의 한 구체예에서 회분식 발효는 특히 본 발명의 발현 시스템을 사용하여 IL-21의 대규모 생산이 필요한 경우 사용될 수 있다. 일반적으로, 회분식 발효는 제 1 단계 종자 프라스크가 진탕 플라스크 배양에서 적합한 배지 내 IL-21을 발현하는 E.Coli 균주를 성장시킴으로써 제조되어 600 nm에서 5 내지 20의 광학 밀도(OD)까지 성장을 허용하는 것을 포함한다. 적합한 배지는 황산 암모늄, 인산 암모늄, 염화 암모늄, 효모 추출물, 가수분해된 동물 단백질, 가수분해된 식물 단백질 또는 가수분해된 카세인과 같은 공급원으로부터 질소를 함유할 것이다. 인산염은 인산 칼륨, 인삼 암모늄, 인산 또는 인산 나트륨으로부터 공급될 것이다. 기타 성분은 염화 마그네슘 또는 황산 마그네슘, 황산 제 2 철 또는 염화 제 2 철, 및 기타 미량 원소일 수 있다. 성장 배지는 과당, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 및 글리세롤과 같은 탄수화물로 보충되어 성장을 개선시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 탄수화물 첨가는 1L 배지 당 1 내지 20 g 첨가된 글리세롤 또는 글루코스일 것이다. 특정 구체예에서, 글리세롤 또는 글루코스는 1L당 5-10 g이다. 성장은 적절한 농도에서, 항생제 예를 들어 카나마이신 10-50 ㎍/ml를 함유하는 아가 배지 또는 냉동 저장 배양으로부터 E.Coli를 포함하는 바람직한 성장 배지를 함유하는 진탕 플라스크(500 ml 내지 2000 ml 조절 플라스크)를 접종합으로써 개시된다. 진탕 플라스크 내 성장은 28 내지 40℃온도이다. 특정 구체예에서, 진탕 플라스크는 30 내 지 37℃에서 성장된다. 플라스크는 200 내지 300 rpm의 교반 세트와 함께 배양된다.
발효 용기는 적당한 성장 배지를 포함하여 준비되고 살균된다. 배지의 pH는 pH 6.5 내지 7.5로 조절된다. 특정 구체예에서, pH는 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 또는 7.2 이다. 용기는 적당한 통기 및 교반 수준으로 셋팅되고 10 내지 20 시간 성장하고 600 nm에서 5 내지 20의 OD를 갖는 1차 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종된다. 접종 수준은 1% 내지 12% 부피/부피(v/v)이다. 특정 구체예에서, 접종 수준은 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% v/v이다. 용해된 산소 수준은 교반 속도를 증가시키거나, 통기율을 증가시키거나, 산소의 살포, 또는 다양한 조합으로써 20% 이상 포화로 유지된다. 배양은 OD 600이 600 nm에서 2 내지 20 OD 유닛에 이를 때 까지 성장된다. 그 후 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)를 농도 0.1 내지 2.0 mM까지 배양액에 첨가한다. IPTG는 tac 프로모터를 유도하여 IL-21을 발현한다. 택일적으로, 30% 용액에서 락토스가 유도을 위해 24 시간 동안 10 g/l로 첨가될 수 있다. 그 후 배양액은 2 내지 8 시간의 추가적 시간 동안 성장하도록 허용된다. 특정 구체예에서, 배양액은 3-4 시간 동안 성장된다.
다른 구체예에서, 주입 회분식 배양이 IL-21 단백질의 높은 수율을 생산하기 위해 사용된다. E.Coli 균주를 생산하는 IL-21은 진탕 플라스크 배양의 적합한 배지에서 성장되어 600 nm에서 5 내지 20의 OD까지 성장을 허용한다. 적합한 배지는 황산 암모늄, 인산 암모늄,염화 암모늄, 효모 추출물, 가수분해된 동물 단백질, 가수분해된 식물 단백질 또는 가수분해된 카세인과 같은 공급원으로부터 질소를 함유 할 것이다. 인산염은 인산 칼륨, 인산 암모늄, 인산 또는 인산 나트륨으로부터 공급될 것이다. 다른 성분은 염화 마그네슘 또는 황산 마그네슘, 황산 제 2 철 또는 염화 제 2 철, 및 기타 미량 원소일 수 있다. 성장 배지는 과당, 글루코스, 갈라토스, 락토스 및 글리세롤과 같은 탄수화물로 보충되어 성장을 향상시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 탄수화물 첨가는 1L 배지 당 1 내지 40 g 첨가된 글리세롤 또는 글루코스일 것이다. 한 구체예에서, 글리세롤 또는 글루코스는 5-10 g/L이다. 성장은 카나마이신(10-50 ㎍/ml)을 함유하는 아가 배지 또는 냉동 저장 배양으로부터 E.Coli를 갖는 바람직한 성장 배지를 함유하는 진탕 플라스크(배플 플라스크 500 ml 내지 2000 ml)를 접종함으로써 개시된다. 진탕 플라스크 내 성장은 28 내지 40의 온도이다. 플라스크는 200 내지 300 rpm의 교반 세트와 함께 배양된다.
제 2 단계 용기는 적합한 성장 배지로 준비되어 살균된다. 적합한 배지는 예를 들어, Super Broth II (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ), APS-Super Broth, Luria Broth, 또는 ZSM(표 1- 4 참조) 및 카나마이신일 것이다. 성장 배지는 성장을 향상시키기 위해 탄수화물로 보충될 수 있다. 특정 구체예는 1 L 배지 당 1 내지 40 g 첨가된 글리세롤이나 글루코스를 갖는 탄수화물 첨가를 제공한다. 한 구체예에서, 글리세롤 또는 글루코스는 5-10 g/L이다. 배지의 pH는 pH 6.5 내지 7.5로 조절된다. 특정 구체예에서, pH는 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 또는 7.2이다. 용기는 적절한 통기 및 교반 수준으로 세팅되어 있다. 성장은 10 내지 20 시간 성장되고 600 nm에서 5 내지 20의 OD를 갖는 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 용기에 접종시킴으로써 개시된다. 접종 수준은 1% 내지 12% v/v이다. 특정 구체예에서, 유 도 수준은 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% v/v일 것이다. 용존 산소 수준은 교반 속도를 증가시키거나, 통기율을 증가시키거나, 산소의 살포 또는 그들의 조합에 의해 20% 이상 포화로 유지된다.
발효 용기는 적당한 성장 배지(상기 설명되는 바와 같은 것)로 준비되어 살균된다. 배지의 pH는 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 또는 7.2 사이의 pH로 조절된다. 한 구체예에서, 배지는 pH 6.8로 조절된다. 성장 배지는 성장을 향상시키기 위해 탄수화물로 보충될 수 있다. 일부 구체예에서, 15-20 g/L로 글리세롤이나 글루코스를 갖는 특정 구체예에 있어서 탄수화물 첨가는 1L 배지 당 5 내지 40 g/L 첨가된 글리세롤 또는 글루코스이다. 용기는 적절한 통기 및 교반 수준으로 세팅되고 제 1 단계 종균 플라스크 배양 또는 10 내지 20 시간 까지 성장시키고 600 nm에서 5 내지 20의 OD를 갖는 제 2 단계 종균 용기로부터 접종된다. 접종 수준은 1% 내지 12% v/v이다. 특정 구체예에서, 접종 수준은 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% v/v이다. 용존 산소 수준은 교반 속도를 증가시키거나, 통기율을 증가시키거나, 산소의 살포 또는 그들의 조합에 의해 20% 이상 포화로 유지된다.
탄수화물 용액은 발효 실행의 초기에 사전 결정된 출발률로, 그러나 일반적으로 6 시간 경과 발효 시간(EFT)이후에, 그리고 12 시간 EFT를 넘지 않게 발효기로 공급된다. 공급은 발효의 끝까지 유지된다. 공급 용액은 40-70% v/v로 제제된 글리세롤 또는 40-70% 중량/부피(w/v)로 제제된 글루코스일 수 있다. 특정 구체예에서, 글리세롤 또는 글루코스는 70% v/v 글리세롤 및 60% w/v 글루코스로 제제된다. 공급 속도은 1 시간 1 리터 당 5-15 그램의 글루코스 또는 글리세롤로 변화할 수 있다. 한 구체예에서 공급 속도은 8, 9, 또는 10 g/L/hr이다. 20 내지 30 시간 EFT에서, 예를 들어 24 시간에, IPTG가 0.5 내지 2 mM의 농도로 배양액에 첨가된다. 택일적으로, 30% 용액에서 락토스가 유도를 위한 24 시간에 10 g/l로 첨가될 수 있다. 48 내지 56 시간 EFT에, 발효를 수확한다. 택일적으로, 추가적 0.5 내지 2 mmol/L의 IPTG가 발효기 배양에 첨가된다. 그 후 발효를 52 내지 56 시간 EFT에서 수확한다.
발효 실행의 끝에서 온도를 4° 내지 20℃으로 하향 조정하고, pH를 유지시키거나 5.0 내지 9.0으로 조정한다. 특정 구체예에서, 범위는 6.0 내지 8.0 pH 유닛이다. 발효 육즙을 용기의 과압 및 샘플 포트를 통한 육즙의 수집으로써 수확한다. 택일적으로, 육즙은 샘플 포트 중 하나를 통하여 퍼낼 수 있다. 발효 육즙은 10%-30% w/v 고체를 함유할 수 있다.
IL-21 회수
발효 이후 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 균질화 완충액에서 재현탁시키고 예를 들어, APV-Gaulin 균질화기(Invensys APV, Tonaw및a, New York) 또는 비드밀 및 초음파 발생장치와 같은 기타 유형의 세포 붕괘 장치에서 균질화한다. 택일적으로, 세포는 발효기로부터 직접 얻고 APV-Gaulin 균질화기에서 균질화한다. 택일적으로, 발효 육즙은 균질화 전에 물 또는 완충액으로 희석될 수도 있다.
한 구체예에서, 세포는 발효 육즙에서 직접 균질화 된다. 예를 들어, APV-Gaulin 1000 또는 APV-Gaulin 2000 균질화기를 적어도 30 분 동안 4°-15℃로 차게 한다. 발효 육즙을 균질화기를 통과시키고 세포 현탁액을 수집한다. 균질화기 압력 은 최대 세포 붕괘를 위해 6000 내지 14,000 psi에 세팅되어야 한다. 한 구체예에서, 압력은 10,000 psi로 세팅된다. 현탁액은 1-5 시간 사이에, 예를 들어 3번 통과 동안 균질화기를 통과한다. 다른 구체예에서, 육즙은 균질화 전에 같은 부피의 물로 희석된다. DNA의 양은 균질화 단계 동안 또는 그 이후에 PEI, 스페르민 또는 벤조나제의 첨가에 의해 증가될 수도 있다.
균등질을 원심분리하고, 봉입체를 함유하는 펠릿을 상청액을 따른 후 얻는다. 봉입체 펠릿을 물, 또는 다양한 수준의 다음 화합물을 포함하거나 포함하지 않는 Tris 완충액으로 세척한다: 염화나트륨, 요소, Triton X-100, 염화 아연, 황산 라우릴 나크륨, 수크로스.
다른 구체예에서, 세포는 발효 육즙을 원심분리 보틀로 옮기고 약 20-60 분 동안 2-8℃에서 원심분리함으로써 수확한다. 예를 들어, 7500 x G에서 KompSpin KAJ7.100 rotor(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 갖는 Beckman J6MI 원심분리기가 세포를 수확하는데 사용될 수 있다. 7500 X G에서 2.25 L 보틀을 구비하는 Beckman JLA-8.1 고정 앵글 로터(8,000-15,800 x G) 또는 Aries JS 5.0 Swinging Bucket 로터의 Beckman Avanti JHC 원심분리기 또한 사용될 수 있다. 카르 Separations, Inc.(Franklin, MA) 또는 Westfalia Separator, Inc.(Northvale, NJ)에 의해 공급되는 것과 같은 연속 원심분리기 또한 사용될 수 있다.
배양 육즙 또는 상청액은 원심분리기 보틀로부터 제거된다. 세포 펠릿을 10-30% w/v 고체에서 균질화 완충액(100 mM Tris, 5 mM ZnCl2, pH 7.5)에 재현탁시킨 다. 발효 육즙을 APV-Gaulin 균질화기를 통과시키고 세포 현탁액을 수집한다. 균질화기 압력은 최대 세포 붕괘를 위해 6000-14,000 psi에 세팅되어야 한다. 한 구체예에서, 압력은 10,000 psi이다. 현탁액을 1-5 통과, 예를 들어 3 번 통과 동안 균질화기를 통과시킨다.
추가적으로, IL-21을 회수하는 방법은 IL-21을 침전, 세척, 및 재용해하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세척된 봉입체를 6 M 구아니딘 또는 8 M 요소에 용해시키고, 물 도는 완충엑에 6-10 배 희석하고, 30분간 배양하고, 원심분리하여 여과한다. 택일적으로, 한외여과 또는 매크로여과가 균질화 후 봉입체를 세척하는데 사용될 수 있다. 결과의 침전물을 2-6 M 요소에 세척하고, IL-21을 함유한다. 그 후 침전물을 물로 세척한 후 용해화한다. AL3+ 또는 Fe3+ 또는 음이온 또는 양이온 중합체 또는 스페르민, PEI 및 벤조나제와 같은 약품의 첨가는 세포 잔여물, 가용성 단백질, DNA, RNA, 및 탄수화물을 침전시키기 위해 첨가될 수도 있다.
봉입체의 용해화
세척된 봉입체 제제는 베타 메르캅토에탄올(10-100 mM), 또는 디티오트레이톨(5-50 mM)과 같은 환원제를 함유하는 염산 구아니딘(5-8 M), 티오시안 구아니딘(5-6 M), 또는 요소(7-8 M)를 사용하여 용해될 수 있다. 용액은 Tris, 인산염, HEPES 또는 다른 적절한 완충액으로 제조될 수 있다. 봉입체는 또한 황산 라우릴 나트륨(0.1-2%)를 함유하는 요소(2-4 M)로 용해될 수 있다. 1 리터의 발효 육즙으로부터 봉입체는 상기 설명된 용액의 50-200 ml를 사용하여 용해도될 수 있다. 한 방법은 40 mM DTT를 함유하는 100 mM Tris, pH 8.0으로 제조되는 6 M GuHCl 150 ml 에서 1 리터의 발효 육즙으로부터 봉입체 펠릿을 용해하는 것을 제공한다. 다른 구체예에서, 봉입체 슬러기를 50-100 ml 8M GuHCl과 혼합한다. 슬러리를 주걱으로 혼합한 후 Omni EZ 균질화기(Omni International, Warrenton, VA)로 균질화하거나 기계적 장치로 혼합함으로써 재현탁시킨다. 현탁액을 3-37℃에서 30-120분 동안 혼합한다. 한 구체예에서, 용해화 과정을 끝마치기 위해 현탁액을 15-25℃에서 혼합한다. 그 후 샘플을 적절한 원심분리기를 사용하여 10-30분 동안 4℃에서 7,500-17,000 x G로 원심분리한다. 용해화된 IL-21을 함유하는 상청액 샘플을 따르고 보관한다.
용해화된 분류에서 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 결정된다. Jupiter C5 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA)을 이동 상으로서 아세토니트릴/트리플루오로아세트산을 포함하여 사용된다. IL-21 표준을 구아니딘/DTT/Tris-함유 완충액에서 희석하고 다른 양을 컬럼으로 주입한다. IL-21 피크에서 요소가 표준 곡선을 구성하는데 사용된다. 용해화 IL-21 샘플을 미세융합하여 미립자를 제거한 후 HPLC 컬럼 상에 주입한다. IL-21 피크에서 요소의 결정은 표준 곡선으로부터 IL-21 농도의 정량화를 허용한다.
추가적으로, 용해화 IL-21은 접선 유동 여과, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피의 역상 HPLC를 사용하여 이 단계에서 정제될 수도 있다.
리폴딩
본 발명의 한 양태에서, IL-21이 굴절반사 봉입체로서 발현되는 형질전환된 E.Coli 숙주 균주로부터 정제된 IL-21을 회수하는 과정은, 세포를 붕괘시키고 봉입 체를 원심분리에 의해 회수한다.
그 후 봉입체를 용해하고 환원제를 함유하는 6 M 염산 구아니딘에서 변성시킨다. 그 후 환원된 IL-21을 제한된 재생 단계에서 산화한다. 이 단계는 염산 아르기닌, 염, 및 산화-셔플링 시스템을 함유하는 리폴딩 완충액에서 희석을 포함한다. 산화-셔플링 시스템이 사용되어 IL-21 분자의 이황화 결합을 개시하고, 시스테인 및 시스틴과 같은 환원 및 산화 분자, DTT 및 시스틴, 환원 글루타티온 및 산화 글루타티온, 및 DTT 및 산화 글루타티온의 혼합물을 기재로 한다. 산화 대 환원 글루타티온의 비율은 0.5 내지 8 mM의 농도 범위에서 1:1 내지 6:1까지 다양할 수 있다. 한 구체예에서, 최적 농도는 4 mM 환원 글루타티온: 2 mM 산화 글루타티온이다. 시스테인 대 시스틴의 비율은 시약 또한 4 mM 내지 1 mM의 농도로 포함하며 2:1 내지 1:1의 범위에 이를 수 있다. 한 구체예에서, 최적 농도는 2 mM 시스틴과 함께, 4 mM 시스테인이다. 최적 리폴딩은 또한 4 mM 시스테인과 2 mM 시스틴을 형성하는 4 mM 시스테인 및 2 mM DTT를 사용하여 달성될 수도 있다. 리폴딩은 또한 나트륨 설파이트 및 나트륨 테트라티오네이트와 같은 시약의 존재하에서 설피토라이시스(sulfitolysis)에 의해 수행될 수도 있다. 재생된 IL-21은 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 희석 리폴딩 완충액으로부터 포획되고, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 고성능 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.
IL-21을 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액으로 신속하게(1-5 분), 또는 느리게(0.5-5 시간) 첨가시킨다. 리폴딩 완충액은 아르기닌(0.5 내지 1.25 M), PEG, 및 염을 함유한다. 그것은 또한 글리세롤, 구아니딘 HCl, 요소, EDTA, 프로테 아제 저해제 및 샤프롱, 알콜, 계면활성제, 글리세롤 및 황산 구리를 포함할 수도 있다. IL-21은 하나의 첨가, 복합 첨가, 또는 시간에 관한 공급으로 첨가될 수 있다. IL-21은 0.05 내지 1.2 mg/ml의 최종 농도까지 리폴딩 혼합물에 첨가된다. 온도 범위는 4-30℃이다. pH는 7.3 내지 8.5이다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기중에 열어두거나 재생하는 동안 공기나 질소를 살포할 수 있다. 리폴딩은 1 내지 26 시간 일어나도록 허용된다.
리폴딩은 또한 메티오닌 산화를 감소시키는 EDTA의 존재하에서, 또는 크기 배제 컬럼상에서, 또는 접선 유동 여과, 또는 전기 투석을 이용하여 수행할 수 있다.
리폴딩 된 IL-21의 정화 및 농축
리폴딩 된 IL-21을 pH 5.5로 조정한 후 정화 및 불용성 단백질의 제거를 위해 1.2 ㎛ 필터를 통과시킨다. 여과된 용액을 플레이트 및 프레임 시스템 상에서 접선 유동 여과를 이용하여 또는 중공사 카트리지를 이용하여 10-30 배 농축시킨다. 그 후 농도를 완충액이나 물로 3-10 배 희석하여 접히지 않고 응집된 단백질이 침전하도록 허용한다. 그 후 용액을 정화 및 불용성 단백질의 제거를 위하여 필터를 통과시킨다.
택일적으로, 리폴딩 된 IL-21을 물 또는 pH 5.5의 25 mM 아세트산 나트륨에 2배 내지 10배 희석시킨다. 침전물이나 응집제가 형성되고, 약 30분 내지 5 시간 후, 여과에 의해 제거된다. 1,2 ㎛ 공칭 필터에 이어서 0.45 ㎛ 공칭 필터, 또는 양성 제타전압을 갖는 깊이 필터가 응집제를 제거하는데 사용될 수 있다. 단계적 농도 필터와 같은 기타 필터를 사용하는 것이 가능할 것이다. 또한, 응집제를 제거하기 위해 원심분리 또는 미세여과를 사용하는 것이 가능하다.
IL-21의 포획
본 발명의 다른 양태에서, IL-21 단백질이 리폴딩되고 농축된 후, 본 발명의 방법은 양이온 교호나 컬럼 상에서 희석 완충액에 포획된 리폴딩 된 IL-21 단백질을 포획하고 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 고성능 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IL-21을 정제하는 단계를 포함한다.
포획 단계는 희석되고, 접혀진 IL-21을 포획하고 초기 정제를 수행하기 위해 설계되어 있다. 컬럼에 IL-21이 결합하기 위해 희석이 우선 수행된다. 정화되고, 희석된 IL-21이 pH 5.5에서 양이온 교환 컬럼 상에서 포획된다. 전형적으로, SP 세파로스 XL (애머르샴 바이오사이언스, Piscataway, NJ) 또는 TOYOPEARL SP 550C (Tosoh Biosep, Montgomery, PA)가 사용된다. 평형화 완충액은 25 mM 아세트산 나트륨, 0.2 내지 0.45 M 염화나트륨, pH 5.5이며, 결합된 IL-21은 증가하는 염 구배로 용리된다. IL-21을 약 0.6 M 염화나트륨에서 SP 세파로스 XL로부터 및 약 0.8 M 염화나트륨에서 TOYOPEARL SP 550C로부터 용리한다.
확장 베드 크로마토그래피는 또한 IL-21 포획 후 리폴딩을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우에 희석 단계는 IL-21을 컬럼상으로 부하하는 동안 그때 그때 즉시 수행된다. 스트림라인 SP XL (애머르샴 바이오사이언스)가 25 mM 아세트산 나트륨, 0.2 M NaCl, pH 5.5를 이용하여 평형화 된다. 그 후 IL-21을 평형화 된 스트림라인 SP XL 수지 상에 상류 방식으로 부하시키는데, 이것은 그때마다 즉시 물로 1:3 희석하는 동안, 정착된 베드 높이의 2배로 유지된다. 상류 및 하류 방식 모두로 세척한 후, IL-21을 0.6 M NaCl 단계 또는 NaCl 구배의 하류 방식으로 용리시킨다.
본 발명의 방법은 카르복시메틸과 같은 약한 양이온 교환, 아가로스 또는 셀룰로스와 같은 다른 유형의 고형 지지체, 및 다른 미립자 크기를 포함하는 이러한 단계를 위한 많은 상이한 양이온 교환 수지의 사용을 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 5.0 내지 7.0 범위의 상이한 pH에서의 컬럼, 및 상이한 완충액 및 염으로 실행하는 단계를 제공할 수 있다. 택일적으로, 소수성 상호작용, 음이온 교환, 및 금속 킬레이트와 같은 다른 크로마토그래피 방법이 사용되어 리폴딩 된 IL-21을 포획하는데 사용될 수도 있다.
정제
본 발명의 한 양태에서, IL-21 단백질의 중간 정제가 존재한다. 이 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 IL-21의 추가적 정제를 달성하도록 설계되어 있다. 전형적으로 Butyl 세파로스 FF(애머르샴 바이오사이언스) 또는 TOYOPEARL butyl 650M(Tosoh Biosep)가 이 단계에서 사용되는 수지이다. 상기 수지는 25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM NaCl, 1.5 M(NH4)2SO4, pH 5.5로 평형 유지된다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 IL-21을 1.5 M(NH4)2SO4로 조절한 후 0.45 ㎛ 공칭 필터를 통과시킨다. 그 후 조절되고 여과된 IL-21을 평형화 된 수지 상으로 부하시킨 후, 이것을 평형화 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제 거한다. IL-21을 구배를 이용하여 25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM NaCl, pH 5.5로 용리시킨다. IL-21을 컬럼으로부터 약 0.75 M(NH4)2SO4에서 0.3 M(NH4)2SO4 로 용리한다.
이 단계를 위해 사용될 수 있는 다른 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지는 예를 들어, 페닐 또는 헥실로 치환된 수지, 아가로스나 셀룰로스와 같은 다른 유형의 고형 지지체, 및 다른 미립자 크기를 포함한다. 본 발명은 또한 5.0 내지 9.0에 이르는 다른 pH에서, 및 다른 완충액 및 염을 이용한 컬럼을 실행하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 IL-21이 결합하지 않는 방식으로 컬럼을 실행하는 단계를 제공한다.
IL-21은 고성능 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제된다. 전형적으로, IL-21은 30 ms/cm의 전도율로 희석되고, 0.5 M 이염기 인산을 갖는 pH 6.0으로 조절되며 세파로스 SP HP(애머르샴 Bioscience)의 컬럼 상으로 부하된다. 컬럼은 25 mM 인산 나트륨, 0.3 M 염화나트륨, pH 6.0로 평형화된다. 그것을 평형화 완충액으로 세척한 후 IL-21을 염화나트륨 구배를 이용하여 용리한다. 본 발명은 또한 다른 고성능 양이온 교환 수지를 사용하는 단계를 제공한다. 컬럼은 인산염과 같은 다른 완충액으로 5.0 내지 7.5에 이르는 범위의 다른 pH 값에서 실행될 수 있다. 부하 물질은 5 내지 35 ms/cm 범위의 전도율 값으로 물 또는 완충액에 의해 희석될 수 있다.
IL-21을 정제하는 방법은 농축 및 단백질의 완충액 교환을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 고성능 양이온 교환 컬럼 용출물을 농축하고 그것을 공식화 완충액으로 교환하도록 설계되어 있다. 최종 컬럼 용출물 풀을 5 kDa 분자량 컷오프 접선 유동 여과 플레이트 및 프레임 막을 사용하여 약 10배 농축시키고, 인산염 완충 식염수, pH 6.0, 또는 10 mM 히스티딘, 4.72%(w/v) 만니톨, pH 5.0, 5.1, 5.2 또는 5.3에 대하여 정용여과 한 후, IL-21의 농도를 더 증가시키기 위해 2회 농축시킨다.
예를 들어 3 kDa 또는 8 kDa 분자량 컷오프 플레이트 및 프레임 막 또는 10 kDa 분자량 컷오프 중공사 시스템과 같이, 다른 막이 사용되어 이 한외여과/정용여과 단계를 달성하는데 사용될 수 있다. 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 이후의 IL-21의 순도는 나트륨 도데실 설파이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 적어도 95%, 및 전형적으로 98% 보다 더 크다. 양이온 교환 크로마토그래피 포획, 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제, 및 완충액 교환 이후의 IL-21 제조에서 내독소의 수준은 일반적으로 1 mg IL-21 단백질 당 < 10 내독소 유닛, 및 전형적으로 1 mg IL-21 단백질 당 <2 내독소이다. 고성능 양이온 교환 크로마토그래피 이후 인도톡신 수준은 일반적으로 1 mg IL-21 당 <1 내독소 유닛이다. 스트림라인 SP XL 및 butyl 세파로스 IF(양이온 교환 크로마토그래피 이전에 20배 농축하지 않음)를 이용하여 생산된 물질의 분석은 응집체가 크기 배제 HPLC에 의해 0.2% 이하이고, 양이온 교환 HPLC에 의한 전하 이질성이 약 10%이며, 역상 HPLC에 의한 순도 측정치는 약 90%임을 나타낸다. Toyopearl SP 550C, Toyopearl butyl 650 M 및 Separose SP HP를 이용하여 생산된 물질의 분석은 응집체가 크기 배제 HPLC에 의해 2% 이하이고, 역상 HPLC에 의한 순도는 약 90%이며, 양이온 교환 HPLC에 의한 전하 이질성 측정치는 약 4%임을 나타낸다.
남아있는 불순물 및 오염물을 제거하기 위한 IL-21의 추가적 정제가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 양이온 교환 컬럼은 내독소 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. IL-21을 <10 mS/cm의 전도율 수준으로 희석하고 pH를 8.0으로 조절한다. 그것은 20 mM Tris, pH 8.0으로 평형 유지된 Q 세파로스 FF column(애머르샴 바이오사이언스)에 사용된다. IL-21이 컬럼을 통해 지나가고 부하에 비하여 내독소의 약 80% 환원을 가진다. Mustang Q 또는 Mustang E(Pall, Port Washington, NY)막이 또한 pH 5.0 내지 9.0에서 내독소 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.
IL-21을 더 정제하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있는 다른 정제 단계는 금속 킬레이트 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 페닐 컬럼 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 또한 정제를 수행한 후 예를 들어 역상 HPLC, 이온 교환 크로마토그래피 또는 금속 킬레이트 크로마토그래피를 이용하여 IL-21을 리폴딩하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 추가적 정제의 단계를 포함하는 방법을 더 제공한다.
정제된 IL-21의 특성화
BaF3는 쥐의 골수(Palacios 및 Steinmetz, Cell 41: 727-734,1985; MatheyPrevot et al., Mol. Cell. Biol.6: 4133-4135,1986)로부터 유도된 인터로이킨-3(IL-3) 의존성 프리-림프계 셀라인이다. 완전한 길이 IL-21 수용체를 발현시키는 BaF3 세포가 미국 특허 제 6,307,024에 충분히 설명되는 대로 구조되었다. 이 셀라인은 생존을 위하여 IL-21 수용체-연결 경로에 의존적이며, 다른 성장 인자의 부재하에서 상기 셀라인을 배양하는 것이 생물학적으로 활성인 IL-21에 대한 분석에 이용될 수 있다. BaF3/IL-21R 세포의 증식은 세포에 첨가되는 정제된 IL-21 단백질의 다양한 희석을 이용함으로써 그리고 처리된 세포의 성장을 IL-21 단백질의 부재하에서 성장된 세포 성장과 비교함으로써 평가될 수 있다.
세포 증식 또는 분화를 측정하는 분석법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 증식을 측정하는 분석법은 중성 적색 염료에 대한 약제민감성(Cavanaugh et al.,Investigational New Drugs 8: 347-354,1990, incorporated herein by reference), 방사선 표지된 뉴클레오티드의 혼합(Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, incorporated herein by reference), 증식하는 세포의 DNA에 있어서 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 혼합(Porstmann et al. , J. Immunol. Methods 82: 169-179,1985, incorporated herein by reference), 및 테트라졸리움 염의 사용(Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63,1983 ; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601,1988 ; Marshall et al., Growth Reg.5: 69-84,1995 ; 및 Scudiero et al., Cancer Res.48:4827-4833, 1988; all incorporated herein by reference)과 같은 분석법을 포함한다. 분화를 측정하는 분석법은 예를 들어, 조직의 단계 특이적 발현과 관련된 세포 표면 마커, 효소 활성, 기능적 활성 또는 형태학적 변화를 측정하는 것을 포함한다(Watt, FASEB,5: 281-284,1991 ; Francis, Differentiation 57: 63-75,1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol.Bioprocesses, 161-171,1989 ; 모두 참고로서 본원에 인용됨). 본원에 설 명된 방법에 의해 생산되는 IL-21은 BaF3/IL-21R 세포의 증식을 자극할 수 있다.
정제된 IL-21은 여러가지 물리적 방법에 의해 특성화될 수 있다. 선택적으로, 아미노산 분석은 모든 잔여 아미노산 조성물이 예상 수치의 10% 내임을 나타낸다. N-말단 서열화는 메티오닌으로 시작하고 IL-21 발현 벡터로부터 예측된 서열에 대응하는 단일 서열을 제공한다. 질량 분광법을 사용하는 전체 질량 분석은 예측된질량의 IL-21(15593.84 Da)의 0.01% 내 수치를 제공한다. 엔도프로테나제 Lys C 소화 후 액체 크로마토그래피-질량 분광법은 펩티드 지도를 생산하는데 사용될 수 있는데, 여기서 모든 피크는 IL-21의 예측된 트립신 펩티드에 대한 질량에 대응하고, IL-21로부터 모든 예측된 트립신 펩티드는 동정된다. 또한 펩티드 지도화는 메티오닌 산화의 부재 뿐만 아니라, IL-2 과의 구성원인 단백질에 대하여 예측된 것과 일치하는 이황화물 결합을 나타낸다.
제제
SE-HPLC(가용성 다이머 형성, 함량 손실), CIE-HPLC(뚜렷한 아미노 분해), 및 RP-HPLC(아직 확인되지 않은 경로에 의한 산화 및 붕괘)에 의해 관찰되는 분해를 최소화하기 위해 pH를 조절하였다. 특정 구체예에서, pH의 범위는 완충능, 안정성, 및 비경구적 투여 적합성을 기재로 한 히스티딘 완충액을 사용하여 5.0-6.0이다. 택일적으로, 시트르산염 또는 숙신산염 완충액이 사용될 수도 있다. 한 구체예에서, 만니톨이 안정성, 및 동결건조의 적합성을 기재로 하여 삼투압 조절자(등장 용액)로서 선택되었다. 다른 구체예에서, 소르비톨 또는 글리신이 사용될 수 있다. NaCl이 사용될 수 있으나, 덜 안정할 수도 있다. 트레할로스 또는 수크로스가 사용 될 수 있으나, 이러한 약한 산성 조건하에서 잠재적으로 가수분해 할 수 있다. 그러나, 제제는 제제에 있어서 1 mg/ml 내지 100 mg/ml IL-21을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, IL-21 단백질은 10 mM 히스티딘, 4.7% w/v 만니톨, pH 5.3에 있어서 10 mg/ml IL-21의 농도로 제제된다. 생산물을 -20℃에서 냉동 저장하였다. 용액 생산이 실행 가능한지 여부의 결정은 허용가능한 것으로 여겨지는 구체화 한계에 의존적이며, 당업계 숙련자가 생산물 회수를 최대화하고, 응집을 최소화하며, 전하 이질성을 최소화하고, 불순물을 최소화하며 허용가능한 생물학적 활성을 유지하기 위한 한계를 규정할 것이다. <3% 다이머(고분자량), CIE- 및 RP-HPLC에 의한 >90% 순도, 및 함량의 >90% 표지 청구항의 함량이 세팅되는 경우, 냉각된 용액 생산물이 안정하였고 합리적인 대안으로 고려되었다. 0.1 내지 3 mg/kg의 IL-21의 투여는 일반적으로 IV 볼루스 전달에 대하여 30 ml를 초과하지 않을 것이다.
또한 동결건조 생산물이 제조될 수 있으며 본 발명의 범위 내에 해당할 것이다. 다른 부형제가 또한 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 허용가능한 부형제는 안정화제로서 0.5% 내지 10%에서 트레할로스 및 수크로서와 같은 이당류; 안정화제 또는 습윤제로서 0.001% 내지 0.1%에서 폴리에틸렌 글리콜; 안정화제 또는 습윤제로서 0.001% 내지 0.1%에서 트윈 20, 트윈 80 또는 트리톤 X-100과 같은 계면활성제; 또는 0.5% 내지 5% 범위에서 글리신, 히드록시에틸 녹말과 같은 기타 증량제를 포함한다.
안정성 실험은 25 내지 45의 고온에서의 저장 또는 교반과 같은 가속된 조건하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, IL-21 제제가 20 mg/ml의 농도에서 안정한 것 으로 나타내면서 복합 냉동-해동 사이클이 수행되었다. 한 구체예에서, pH 5.25가 분해율을 감소시키는데 사용된다. 그러나, 동결건조 생산물에 대한 최적 pH 범위는 4.75 내지 7.5이며, 비-동결건조된 생산물은 5 내지 5.6의 pH 범위이다.
또한 하나 이상의 보존제가 본 발명의 조성물, 특히 복합적 사용을 위한 패킹된 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 보존제는 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜, m-크레솔, 에틸메르큐리티오살일실레이트, 페놀, 티메로살 등과 같은 약학적 제제에 통상적으로 사용되는 것을 포함한다.
제약학적 사용을 위하여 의도된 IL-21 조성물은 무균 및 무-피로겐일 것이며, 허용되는 제약학적 방법에 따라서 제조되고 패킹될 것이다. 상기 조성물은 유닛 투여 또는 복합 유닛 투여량으로 패킹될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으ㅗㄹ 폴리테트라플루오로에틸렌-채워진 스토퍼 및 적절한 표지를 포함하여 봉인된 유리병으로 패킹될 것이다. 동결건조 조성물은 주입을 위한 물과같은 적당한 희석액의 적정량(WFI) 또는 WFI 중 5% 덱스트로스를 포함하는 키트로서 패킹될 수 있다.
본 발명은 다음의 제한 없는 실시예에 의해 더 설명된다.
실시예 1
발현벡터, pTAP237의 구성
플라스미드 pTAP237를 PCR-발생 링커를 동종 재조합에 의해 pTAP186의 SmaI 자리에 삽입함으로써 생성하였다. 플라스미드 pTAP186은 플라스미드 pRS316(Saccharomyces cerevisiae 셔틀 벡터) 및 pMAL-c2, pKK223-3으로부터 유도 되고 tac 프로모터 및 rrnB 종결자를 포함하는 E.Coli 발현 플라스미드로부터 유도되었다. pTAP186은 Sma I 자리가 파괴되었고 효모 ARS-CEN6 및 URA3 서열의 측면에 위치하고, NotI을 이용한 소화에 의해 플라스미드로부터 그들의 제거를 용이하게 하는 NotI 및 SfiI 자리를 갖는 카나마이신 내성 유전자를 함유한다. PCR-생산 링커가 합성 RBS II 서열을 갖는 pTAP186의 발현 커플러 서열을 대체하였다. 그것은 SEQ ID NO:3 및 4에서 각각 나타내는 바와 같이 100 pmoles의 각각의 올리고뉴클레오티드 zc29,740 및 zc29,741, 및 SEQ ID NO: 5 및 6에서 각각 나타내는 바와 같이 약 5 pmoles의 각각의 올리고뉴클레오티드 zc29,736 및 zc29,738로부터 제조하였다. 이들 올리고뉴클레오티드를 30초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 및 30 초 동안 72℃의 10번의 사이클 동안 PCR에 의해 결합시켰으며, 그 후 4℃에서 침지시켰다. 결과의 PCR 생산물을 100% 에탄올의 부피를 2배로 침전함으로써 농축하였다. 펠릿을 10μL 물에서 재현탁시켜서 합성 RBS II 서열을 함유하는 구조를 생산하기 위해 SmaI로 소화된 레시피언트 벡터 pTAP186 내로 재결합하는데 사용하였다. 약 1 ㎍의 PCR-생산 링커 및 100 ng의 SmaI로 소화된 pTAP186을 함께 혼합하였고 수행능 효소 세포(S. cerevisae)로 형질전환하였다. 그 후 효모를 -URA D 플레이트 상으로 평판배양하고 72 시간 동안 상온에 두었다. 그 후 하나의 플레이트로부터 Ura+ 형질전환체를 1 mL H2O에 재현탁하고 효모 세포를 펠릿으로 간략히 회전 시켰다. 세포 펠릿을 0.5 mL의 용해 완충액에 재현탁하였다. DNA를 회수하였고 E.Coli MC1061로 형질전환하였다. 클론을 SEQ ID NO:3 및 4에서 각각 나타내는 바와 같이, 20 pmoles의 각각의 올리고뉴클레오티드 zc29,740 및 zc29,741을 사용하여 상기 개시되는 바 와 같이 콜로니 PCR에 의해 스크리닝하였다. 아가로스 겔상에서 정확한 크기 밴드를 표시하는 클론을 서열 분석하였다. 정확한 플라스미드를 pTAP237이라 칭하였다.
실시예2
pTAP252의 구성
사람 IL-21 코딩 서열(SEQ ID NO:1)은 주형으로서 CD3+ cDNA 라이브러리 풀 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc29,084 및 zc22,127(각각 SEQ ID NO:7 및 8)을 사용하여 PCR 증폭에 의해 생산하였다. E.Coli 내 전사 과정을 최적화하기 위해, 프라이머 zc29,084(SEQ ID NO:7)를 IL-21 코딩 서열의 5'말단에 ATG 개시 코돈을 첨가하였다. 결과의 유전자 서열을 N-말단(IL-21met)에서 하나의 잉여 메티오닌을 갖는 성숙 IL-21을 코딩하였다. 최종 PCR 생산물을 효모 동종 재조합(Raymond et al., Biotechniques. 26(1): 134-8,140-1, 1999; U. S. Patent 6,027, 442, incorporated herein by reference)에 의해 발현 벡터 pTAP237(실시예 1에 설명됨)속으로 삽입하였다. 발현 구조, pTAP252를 효모로부터 추출하고 수행능 E.Coli MC 1061속으로 형질전화시켰다. 카나마이신 내성 클론을 콜로니 PCR에 의해 동정하였다. 양성 클론을 서열화에 의해 확인하고 이어서 생산 숙주 균주 E104 또는 UT5600으로 형질전환하였다.
실시예 3
코돈 최적화
pTAP252로부터 사람 IL-21met의 발현의 유도은 E.Coli 균주 E104에서 약 2-5%의 총 세포성 단백질을 생산하였다. IL-21 코딩 서열에서 사용되는 코돈의 조사 는 그것이 0.181과 같은 CAI 값을 갖는 E.Coli에서 최소 빈도로 사용하는 코돈의 잉여를 함유한 것을 나타내었다. CAI는 동일한 코돈 성향의 통계적 측정치를 이며 단백질 생산의 수준을 예측하는데 사용될 수 있다(Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95,1987). 고도로 발현된 단백질에 대한 유전자 코딩은 높은 CAI 값(>0.6)을 갖는 경향이 있는 반면, 낮은 CAI 값(<0.2)을 갖는 유전자에 의해 코딩된 단백질은 일반적으로 비효율적으로 발현된다. 이것은 E.Coli 내 IL-21의 부실한 생산의 이유를 암시하였다. 추가적으로, 드문 코돈은 전사 스탈링(stalling), 전사의 미성숙 종결, 및 아미노산 오결합의 높은 가능성을 이끄는 메시지의 후반부에서 뭉쳐있다(Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol.6 (5): 494-500,1995).
유전자가 드문 코돈을 함유하는 단백질의 발현 수준은 특정 드문 tRNA의 수준이 숙주 내에서 증가되는 때 극적으로 향상될 수 있다(Zdanovsky et al., ibid., 2000; Calderone et al., ibid., 1996; Kleber-Janke et al., ibid., 2000; You et al,. ibid., 1999). pRARE 플라스미드는 드물게 사용된 E.Coli의 몇몇 코돈에 대한 tRAN를 코딩하는 유전자를 함유한다(argU, argW, leuW, proL, ileX 및 glyT). 상기 유전자는 그들 고유의 프로모터의 제어하에 있다(Novy,ibid). pRARE를 이용한 공동-발현은 약 5-10 배 까지 E.Coli 내 IL-21met 생산을 증가시켰다. pRARE를 이용한 공동-발현은 또한 E.Coli 용해질 내 절단된 IL-21met의 수준을 감소시켰다. 이러한 데이타는 보다 적절한 코돈 사용의 IL-21met에 대한 유전자 코딩을 재-재합성하는 것이 대량의 IL-21의 발현에 대한 개선된 벡터를 제공한다는 것을 나타낸다.
코돈 최적화된 IL-21met 코딩 서열을 16개의 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 구조하였다: zc22,913 (SEQ ID NO : 9), zc22,914 (SEQ ID NO : 10), zc22,915 (SEQ ID NO : 11), zc22,916 (SEQID NO : 12), zc22,961 (SEQ ID NO : 13), zc22962 (SEQ ID NO : 14), zc22,963 (SEQID NO : 15), zc22,964 (SEQ ID NO : 16), zc22,965 (SEQ ID NO : 17), zc22,966 (SEQ ID NO : 18), zc22,968 (SEQID NO : 20), zc22,969 (SEQ ID NO : 21), zc22,967 (SEQ ID NO : 19), zc22,970 (SEQ ID NO : 22), zc22, 971 (SEQ ID NO : 23), 및 zc22,972 (SEQ ID NO : 24). 이들 중첩 올리고뉴클레오티드의 프라이머 확장 후 PCR 증폭은 E.Coli 내 발현을 위해 최적화된 코돈을 갖는 완전한 길이 IL-21met 유전자를 생산하였다. 최종 PCR 생산물을 효모 동종 재조합에 의해 발현 벡터 pTAP168로 삽입하였다. 발현 구조를 효모로부터 추출하고 수행능 E.Coli MC1061로 형질전환하였다. 카나마이신애 내성인 클론을 콜로니 PCR에 의해 동정하였다. 양성 클론을 서열화에 의해 확인하고 이어서 생산 숙주 균주 E104 또는 UT5600으로 형질전환하엿다. 최적화된 IL-21met 서열을 포함하는 발현 벡터를 pTAP196이라 칭하였다. 최종 PCR 생산물을 Tac 프로모터의 제어하에서 발현을 위해 벡터 pTAP168 내로 유도하였다. 그러나, 발현은 매우 저조하였고 생산물은 단지 프로브로서 IL-21에 표적하는 단일클론 항체를 이용하는 웨스턴 분석법에 의해 검출될 수 있었다.
IL-21met 메시지의 2차 구조의 조사는 염기 36 및 64(SEQ ID NO:1) 사이 부위에서 예외적으로 안정한 헤어핀 구조를 밝혔다. 그것은 이 구조적 요소가 IL-21met로부터 유효한 전사를 막는 것이라 짐작되었다. 따라서, 하이브리드 IL-21met 코딩 서열을 중첩 PCR에 의해 생산하였다. 비-최적화 IL-21met 서열의 첫번째 80개 의 염기를 함유하는 분획을 주형으로서 pTAP252 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc29,740(SEQ ID NO:3) 및 zc40,133(SEQ ID NO:25)를 사용하는 PCR 증폭에 의해 생산하였다. 염기 81 내지 450(SEQ ID NO:27)로부터의 IL-21met의 최적화 부위는 주형으로서 pTAP196 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc22,971(SEQ ID NO:23) 및 zc40,107(SEQ ID NO:26)을 사용하는 PCR 증폭에 의해 생산하였다. 이들 2가지 PCR 생산물을 결합시켜서 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc22,971(SEQ ID NO:23) 및 zc29,740(SEQ ID NO:3)을 사용하여 증폭시켜서 중첩 PCR에 의해 완전한 길이 IL-21met를 생산하였다. 최종 PCR 생산물을 효모 동종 재조합에 의해 발현 벡터 pTAP237내로 삽입하였다. 발현 구조를 효모로부터 추출하고 수행능 E.Coli MC1061로 형질전환하였다. 카나마이신 내성 클론을 콜로니 PCR에 의해 동정하였다. 양성 클론을 서열화에 의해 확인하고 이어서 생산 숙주 균주 E104 또는 UT5600 내로 형질전환하였다. 하이브리드 IL-21met 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 pTAP337이라 칭하였다.
일단 최적화 서열의 첫번째 80개의 염기를 비-최적화된 IL-21met 서열(SEQ ID NO:1에 나타냄)의 첫번째 80개 뉴클레오티드로 대체함으로써 헤어핀 구조가 제거되면, 결과의 유전자는 E.Coli 내에서 매우 양호하게 발현되었다. 새로운 구조를 갖는 발현 수준은 총 세포 단백질의 20% 부근까지 증가하였다.
실시예 4
IL-21met의 발현
E.Coli를 0.01% Antifoam 289(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 30 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 100 mL Superbroth II 배지(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 10 mL 접종물을 2 L 배양 플라스크에서 500 mL의 동일한 배지에 첨가하였으며, 이것은 배양이 OD600의 4로 유지될 때까지 37℃에서 275rpm으로 교반되었다. 그 후 IPTG를 최종 농도 1 mM에 첨가하고 교반을 추가의 2.5 시간 동안 유지하였다. 세포를 4℃에서 10분 동안 4,000 x g로 원심분리하엿다. 세포 펠릿을 다음 번 사용을 위해 -80℃로 냉각하였다.
삭제
IL-21met의 발현을 37℃에서 25 mL 배양의 대규모로 수행하였다. 배양의 한 mL를 IPTG 유도 2 시간 후에 수집하였다. E.Coli 세포를 4℃에서 동일 부피의 BugBuster® Protein Extraction Reagent(Novagen, Madison, WI)에서 재현탁시키고 20 분동안 배양하였다. 가용 및 불용성 단편을 4℃에서 10분동안 16,000 x g로 원심분리에 의해 분리하였다.
재조합 IL-21met가 불용성 봉입체로서 축적되었다. 대부분의 E.Coli 균주로부터 IL-21met의 회수율은 저조한 것으로 간주되었다. 봉입체 내의 IL-21met의 약 80 내지 90%가 세포 용해 및 4℃ 배양 이후 20 분 내에 손실되었다. 8 M 요소를 이용하여 세균을 용해하는 것은 회수를 향상시키지 않았다. 그러나, 프로테아제 저해제를 포함하여, 세포 용해 완충액 내에서, 5 mM ZnC12 및 0.5 mM 벤자미딘과 같은 것은 균주 E104(W3110 arabinose)로부터 IL-21met의 손실을 막았다. 이는 변성 조건하에서 IL-21met를 절단할 수 있는 세균 프로테아제는 봉입체와 공동-정제하였음 을 나타냈다. IL-21met가 균주 UT5600으로부터의 세포 용해질에서 안정하였으나, E104 세포 용해질에서는 그러하지 않았음이 관찰되었다. 이는 상기 프로테아제가 E104에는 존재하나 UT5600에는 존재하지 않음을 암시했다. 이들 균주에 대한 유전자형의 비교는 2염기성 잔기 사이를 절단하는 OmpT가 E104에는 존재하지만, UT5600에는 존재하지 않음을 밝혔다. OmpT는 열안정성이고 변성 조건하에서도 활성이다(White et al., ibid. 1995). IL-21의 아미노산 서열의 조사는 그것이 적어도 4개의 잠재적 OmpT 절단 자리를 함유함을 나타냈다. IL-21met은 또한 BL21, 다른 OmpT 결핍 E. coli 균주에서 탁월한 안정성을 보였다. 이들 데이타는 OmpT 프로테아제 활성이 안정성 및 IL-21의 회수에 있어서 중요하다는 것을 암시하였다. 생산 숙주로서 E. coli 균주 UT5600의 사용은 IL-21met의 회수를 향상시켰다. IL-21met의 총 수율은 구조의 조합 및 숙주 균주의 개선과 함께 2 mg/L 내지 50-100 mg/L로 증가하였다.
실시예 5
IL-21의 특성화
웨스턴 분석법을 위해, 단백질 샘플을 환원 조건 하에서 4-20% MES-SDS NuPAGE 겔(Invitrogen) 상에서 분리시키고 1 시간 동안 30 V에서 니트로셀룰로스 막(Invitrogen)으로 옮겼다. 막을 5% 무-지방 우유로 TTBS 완충액(20 mM Tris pH 7.4, 160 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)에서 차단하였다. 사람의 IL-21에 대하여 특이적인 폴리클론 항체를 5% 무-지방 우유를 포함하는 TTBS 완충액에 첨가하고 1 시간 동안 배양하였다. TTBS로 세척 후, 블롯을 1 시간 동안 HRP 결합된 염소-항 토끼 IgG(Bio-Rad)를 이용하여 프로브하였다. 후속하여 블롯을 TTBS로 3번 세척한 후 Pierce로부터의 ELC 시약으로 화학발광성 검출하였다.
실시예 6
플라스미드 안정성 분석
E.Coli를 0.01% Antifoam 289(Sigma) 및 30 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 25 mL Superbroth II 배지(Becton Dickinson)에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 25 μL 접종물을 25 mL 배양 플라스크에서 카나마이신이 없는 25 mL의 동일한 배지에 첨가하였으며, 이것은 배양이 37℃에서 275rpm으로 교반되었다. 100 μL 의 배양을 4개의 상이한 시간 지점에서 수집하였다(배양이 2,4,6 및 8ml의 OD600에 도달할 때). 샘플을 희석하고 어떠한 첨가제도 없이 LB 아가 플레이트 상에서 평판배양하엿다. 37℃에서 밤샘 배양 후, 100 E.Coli 콜로니를 LB 아가 플레이트 및 30 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 복사 평판배양하였다. 37℃에서 밤샘 배양 후, 각 플레이트 상에 형성된 콜로니의 수를 세고 비교하였다. 항생제 부재 플레이트 상에서 성장한 수에 비교한 LB 플러스 카나마이신 상에서 성장한 콜로니의 수는 발현 벡터를 여전히 지니는 세포의 퍼센트를 반영하였다.
pTAP337 발현 벡터를 함유하는 W3110의 클론이 카나마이신을 함유하지 않는 배지에서 12 시간 동안 배양되는 경우, 90% 이상으로 플라스미드가 보유되었다. IL-21 유전자가 부재하는 발현 벡터를 함유하는 클론은 유사한 플라스미드 보유력을 나타냈다. 이들 데이타는 IL-21을 함유하는 pTAP337 발현 벡터가 W3110에서 안정하다는 것을 입증한다.
E. coli 균주, TG1 및 MM294는 IL-21의 저조한 생산성 및 심각한 플라스미드 불안정성으로 인하여 생산 숙주로서 선택하지 않았다. 가장 희망적인 결과는 E. coli 균주 W3110(ATCC #27325)를 사용하여 IL-21를 생산하는 실험에서이다. W3110의 생산성은 UT5600의 생산성과 필적하였다. 플라스미드 안정성 실험은 발현 벡터, pTAP337가 W3110도 유지되었음을 입증하였다. UT5600은 영양요구 균주이며 대규모로 성장하기 더 어렵다. 이러한 고려는 IL-21의 생산을 위한 바람직한 숙주 균주로서 W3110의 선택을 이끌었다.
실시예 7
회분식 발효
제 1 단계 종균 플라스크(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 Difco APS Super Broth(Difco Laboratories, Detroit, MI)를 이용하여 제제하고, 5 g/L의 글리세롤 및 25 ug/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 24 시간 묵은 아가 플레이트(카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 Luria 아가(Difco Laboratories))로부터 발현 벡터 pTAP337(EE410)을 함유하는 루프 완전한 E.Coli W3110을 포함하는 진탕 플라스크를 접종합으로써 개시되었다. 진탕 플라스크 내 성장은 30℃의 온도였다. 플라스크를 250 rpm에서 교반 세트와 함께 배양하였다.
6 L 발효 용기를 3.0 L의 Difco APS Super Broth로 제제하고 살균하였다. 성장 배지를 10 g/L의 글리세롤 및 25㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 배지의 pH를 7.2로 조절하였다. 용기의 통기는 1 vvm으로 세팅하였고 교반을 350 rpm으로 세팅하였다. 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 600 nm에서 광학 밀도(OD) 16까 지 16시간 동안 성장한 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 종균하였다. 종균물은 5% v/v였다. 용존산소를 교반 속도 증가에 의해 20% 이상 포화로 유지시켰다.
OD600이 2.5에 이를 때까지 배양을 성장시켰다(약 2.5 시간). 이소프로필 티오갈락코피라노시드(IPTG)를 농도 1.0 M까지 배양에 첨가하였다. 그 후 배양을 추가적 3 시간 동안 성장하도록 허용하였다.
실시예 8
A. 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라스크(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 Difco APS Super Broth를 이용하여 제제하고, 5 g/L의 글리세롤 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 24 시간 묵은 아가 플레이트(카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 Luria 아가)로부터 발현 벡터 pTAP337(상기 기술)을 함유하는 루프 완전한 E.Coli W3110을 포함하는 진탕 플라스크를 접종합으로써 개시되었다. 진탕 플라스크는 250 rpm에서 교반 세트를 포함하여 30℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 3.0 L의f ZymoM 성장 배지로 제제하고 살균하였다. 성장 배지를 20g/L의 글리세롤 및 25㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 배지의 pH는 pH 6.4로 조절하였다. 통기는 1 vvm, 교반은 350 rpm, 그리고 온도는 32℃로 세팅하였다. 발효기는 OD600의 16까지 16 시간 동안 성장된 제1 단계 종균 플라스크로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 이상 포화로 유지시켰다.
탄수화물 용액을 10 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 상기 공급 은 발효의 끝까지 계속되었다. 공급 용액은 70% v/v로 제제된 글리세롤이었다. 공급 속도은 초기 시작 부피를 기재로하여 1시간 1리터 당 1 그램의 글리세롤이었다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 농도 2 mM까지 배양에 첨가하였다. 48 시간 EFT에서, 발효를 수확하였다.
대안적인 주입 회분식 공정에서, 제 1 단계 종균 플라스크(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM으로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25㎍/ml의카나마이신으로 보충하였다. 성장은 20% 글리세롤에서 냉각된 E. coli W3110을 포함하고 발현 벡터 pTAP337을 함유하는 진탕 플라스크를 접종함으로써 개시하였다. 배양은 250 rpm에서 교반을 포함하여 30℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 3.0 L의 ZymoM 성장 배지로 제제하고 살균하였다. 성장 배지를 20g/L의 글루코스 및 25㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm, 교반은 350 rpm, 그리고 온도는 37℃에 세팅하였다. 발효기를 OD600의 16까지 16 시간 동안 성장시킨 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% 부피/부피였고 용존 산소 수준은 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 이상 포화로 유지시켰다.
탄수화물 용액을 10 시간 EFT에서 시작하는 발효기 속으로 공급하였다. 공급을 발효의 끝까지 유지시켰다. 공급 용액은 60% v/v로 제제된 글루코스였고 공급 속도은 초기 시작 부피를 기초로하여 1시간 1리터 당 9.5 그램의 글루코스였다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 농도 2 mM까지 배양에 첨가하였다. 48 시간 EFT에서, 2 mmol/l의 IPTG를 IPTG 농도를 4 mM까지 이끄는 배양에 첨가하였다. 발효는 56시간 에 수확하였다.
Figure 112005031146824-pct00001
Figure 112005031146824-pct00002
Figure 112005031146824-pct00003
Figure 112005031146824-pct00004
B. PCOL22 배지를 이용한 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22 배지로 제제하고 살균하였다. 냉각 후에 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 배지의 pH를 5N 수산화 암모늄을 이용하여 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm에 세팅하였고, 교반은 350 rpm, 및 온도는 37℃에 세팅하였다. 발효기는 OD600nm의 16까지 16 시간 동안 성장한 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 종균하였다. 접종은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20%이상 포화로 유지시켰다. 5N NH40H의 첨가에 의해 pH를 6.8에서 제한하였다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
C. 카나마이신이 없는 PCOL22 배지를 이용한 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22 배지로 제제하여 살균하였다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 및 염화 칼슘으로 보충하였다. 카나마이신은 첨가하지 않았다. 배지의 pH를 5N 수산화 암모늄을 이용하여 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm에 세팅항고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 16시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 5 N NH40H의 첨가에 의해 pH를 6.8에서 제한하였다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기에 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
D. PCOL22-L 배지를 이용한 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22-L 배지로 제제하여 살균하였다. 이 배지는 시트르산을 함유하며 침전을 예방하기 위해 1/3 이하의 염을 가진다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 16시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 5 N NH40H의 첨가에 의해 pH를 6.8에서 제한하였다.
황산 마그네슘이 없는 글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
E. PCOL12-L 배지를 이용한 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22-L 배지로 제제하여 살균하였다. 이 배지는 침전을 예방하기 위해 1/4 이하로 염을 함유한다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 16시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 5 N NH40H의 첨가에 의해 pH를 6.8에서 제한하였다.
황산 마그네슘이 없는 글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
F. PCOL12-R 배지를 이용한 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22-R 배지로 제제하여 살균하였다. 이 배지는 글루코스 공급이 개시되기 전에 숙주 균주의 성장을 증가시키기 위해 효모 추출물 및 글루코스의 수준을 증가시켰다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 40 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 16시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
G. 20L 용기 내 주입 회분식 발효
대안적인 주입 회분식 공정에서, 제 1 단계 종균 플라크스(6 l)를 3.0 L의 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 3.0 ml의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 통기는 1 vvm에 세팅하였고, 교반은 250 rpm에 세팅하였으며, 온도는 32 ℃에 세팅하였다.
20 L 발효 용기를 10.8 L의 PCOL22 배지로 제제하여 살균하였다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 16시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 배양 pH는 5N 수산화 암모늄의 첨가를 통하여 6.8에서 제한하였다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
H. 2 단계 종균을 포함하는 주입 회분식 발효
제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 진탕 플라스크를 250 rpm의 교반 세트와 함께 32 ℃에서 배양하였다.
제 2 단계 종균 용기(6 l)를 3.0 L의 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 생산 균주 EE410(발현 벡터 pTAP337을 함유하는 E. coli W3110)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 100 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종합으로써 시작하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 32℃로 세팅하였다.
20 L 발효 용기를 10.8 L의 PCOL22 배지로 제제하여 살균하였다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 12시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 5N 수산화 암모늄의 첨가를 통하여 배양 pH를 6.8에서 제한하였다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
I. ZGOLD1을 포함하는 주입 회분식 발효
발현 벡터 zGOLD1의 구조는 실시예 19에서 설명된다. 제 1 단계 종균 플라크스(100 ml 배지를 포함하는 배플 500 ml 플라스크)를 ZSM 배지로 제제하고, 20 g/L의 글루코스 및 25 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충하였다. 성장은 발현 벡터 pTAP337을 함유하는 생산 균주 E. coli W3110 ompT-(ZGOLD1)를 함유하는 해동 냉동 바이알로부터 300 μl의 물질을 포함하는 플라스크를 접종함으로써 시작하였다. 진탕 플라스크는 32℃에서 250 rpm의 교반 세트로 배양되었다.
6 L 발효 용기를 2.7 L의 PCOL22 배지로 제제하고 살균하였다. 냉각 후 성장 배지를 글루코스 20 g/L, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 및 카나마이신 25 ㎍/ml로 보충하였다. 5N 수산화 암모늄을 이용하여 배지의 pH를 6.8로 조절하였다. 통기는 1 vvm로 세팅하였고, 교반은 350 rpm에 세팅하였으며, 온도는 37℃로 세팅하였다. 발효기를 OD600 nm의 16에서 12시간 동안 성장시킨 EE410의 제 1 단계 종균 플라스크 배양으로부터 접종시켰다. 접종물은 5% v/v였고 용존 산소는 교반 속도를 증가시킴으로써 20% 포화 이상으로 유지시켰다. 5N 수산화 암모늄의 첨가를 통하여 배양 pH를 6.8에서 제한하였다.
글루코스 용액(60% w/v)을 8 시간 EFT에서 시작하는 발효기로 공급하였다. 9.5 g의 글루코스의 일정 공급 속도/1 시간 당 1 L 시작 부피를 발효 기간 내내 유지시켰다. 24 시간 EFT에서, IPTG를 0.5 mM의 농도까지 배양에 첨가하였다. 발효는 48 시간 EFT에 수확하였다.
Figure 112005031146824-pct00005
Figure 112005031146824-pct00006
Figure 112005031146824-pct00007
Figure 112005031146824-pct00008
Figure 112005031146824-pct00009
실시예 9
IL-21 회수
A. 수확된 세포의 붕괴
수확된 E. coli 펠릿을 주입 회분식 발효에 의해 생산하였고, 봉입체 형태로 약 5-6 g/L의 IL-21met을 함유하였다. 발효 육즙(1L)을 30분 동안 8000 x g에서 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 상기 펠릿을 850 ml의 파손 완충액(100 mM Tris, pH 7.2, 5 mM ZnCl2)에 재현탁시킨후 얼음 위에서 냉각시켰다. 육즙을 10,000 psi에서 3 번 APV 균질화기를 통과시켰다. 그 후 육즙을 30분 동안 8000 x g에서 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 봉입체 펠릿을 -80℃에 저장하였고 냉각시키지 않고 리폴딩하였다.
B. 수확된 육즙의 직접 붕괴
수확된 E.Coli 육즙을 주입 회분식 발효에 의해 생산하고, 봉입체 형태로 약6-7 g/L의 IL-21met를 함유하였다. 발효 육즙(0.5L)을 이온제거한 물 1.0 L로 희석하고 10,000 psi에서 3번 APV 균질화기를 통과시켰다. 그 후 육즙을 30분 동안 15,000 x g에서 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 상기 펠릿을 500 ml의 DI 워터에 재현탁시키고 30분 동안 15,000 x g로 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 상기 세척 단계를 반복하였고 봉입체 펠릿을 -80℃에 저장하거나 냉동시키지 않고 리폴딩하였다.
C. 용해화 및 침전
1. 1 시간 동안 상온에서 200mL의 100 mM Tris, 6 M 염산 구아니딘, 5 mM ZnCl2, pH 7.2에 세척된 봉입체 펠릿의 현탁에 의해 용해화를 달성하였다. 그 후 현탁액을 30분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 4℃에서 유지시켰다. 상청액을 100 mM Tris, 5 mM ZnCl2, pH7.2로 1:8(v/v) 희석하였다. 현탁액을 10분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 버렸다. 펠릿을 200 ml의 100 mM Tris, 8 M 요소, pH 7.2에 재현탁시켰다. 현탁액을 30분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 버렸다. 세척 과정을 2회 더 반복하였다. 재용해화는 200mL의 100 mM Tris, 6 M 염산 구아니딘, 10 mM DTT, pH 7.2에 세척된 펠릿의 재현탁에 의해 달성하였다. 현탁액을 30분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. HPLC 단백질 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 상청액 내 단백질 농도는 10 mg/mL이었다. 그 후 IL-21 샘플을 4℃에서 저장하였다.
2. IL-21의 용해화는 6 M 염산 구아니딘, 100 Mm Tris, pH 8.0 (GDT40)에서 제조된 40 mM 디티오트레이톨(DTT)에 세척된 봉입체 바디 펠릿을 현탁시킴으로써 달성하였다. 약 150 ml의 GDT40을 원래의 발효 육즙의 1 리터당 사용하였다. 용해화는 1 시간 동안 상온에서 발생하였다. 그 후 현탁액을 원심분리하였다. 용해된 봉입체로부터 상청액을 0.75 M 아르기닌 플러스 DTT/시스테인 산화-환원 짝을 함유하는 리폴딩 완충액으로 희석(20-30 X)에 의해 리폴딩하였다. 리폴딩이 5-16 시간 동안 발생하도록 허용한 후 상기 혼합물의 pH를 pH 5.5로 조절하고 여과시킨 후 정제로 전달하였다.
D. ZGOLD1로부터 수확된 육즙의 직접 붕괘
수확된 E.coli ZGOLD1 육즙을 PCOL22 배지(상기 설명됨)의 주입 회분식 발효에 의해 생산하고, 봉입체 형태로 약 9-10g/L의 IL-21met를 함유하였다. 발효 육즙(0.5L)을 이온제거된 물 1.0 L에 희석하고 10,000 psi에서 3번 APV 균질화기를 통과시켰다. 그 후 육즙을 30분 동안 15,000 x g에서 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 펠릿을 500 ml의 DI 워터에 재현탁시키고 30분 동안 15,000 x g에서 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 펠릿을 500 ml의 DI 워터에 재현탁시키고 30분 동안 15,000 x g에서 원심분리하였다. 성긴 펠릿을 보유하도록 주의하면서 상청액을 버렸다. 봉입체 펠릿을 -80℃에서 저장하거나 냉동시키지 않고 리폴딩하였다.
실시예 10
A. 세척된 봉입체의 용해화
1 시간 동안 상온에서 150 mL의 100 mM Tris, 6 M 염산 구아니딘, 20 mM 디티오트레이톨, pH 7.5에 세척된 봉입체 펠릿의 현탁에 의해 용해화를 달성하였다. 그 후 현탁액을 30분 동안 15,000 x g에서 원심분리하였다. HPLC 단백질 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 상청액 내 단백질 농도는 29 mg/mL였다. 그 후 IL-21 샘플을 4℃에 저장하였다.
B. ZGOLD1으로부터 세척된 봉입체의 용해화
용해화를 1 시간 동안 실온에서 150 mL의 100 mM Tris, 6 M 염산 구아니딘, 40 mM 디티오트레이톨, pH 8.0에 1 리터의 발효 육즙으로부터의 세척된 봉입체 펠릿을 현탁시킴으로써 달성하였다. 이어서 현탁액을 15,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하였다. HPLC 단백질 분석법에 의해 측정된 바와 같이 상청액 내 단백질 농도는 29 mg/mL였다. 그 후 IL-21 샘플을 4℃에서 저장하였다.
C. 용해화된 봉입체의 정화
고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지를 용해된 IL-21 봉입체 펠릿을 정호하는데 사용하였다. 한 실시예에서, 세척된 봉입체 펠릿을 상온에서 1시간 동안 lOmM 이미다졸, pH 7.5를 함유하는 6M 구아니딘 HC1에 용해시키고, 1.0 ml His-트랩 컬럼(애머르샴 바이오사이언스)을 0.5 ml의 0.1 M NiS04로 하전시켰다. 하전 및 물 세척 후에, 6M GuHCl, 20mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 및 20mM 인산염으로 이루어진 5.0ml의 결합 완충액을 컬럼을 평형화하는데 사용하였다.
용질 샘플(1.0 ml)을 컬럼에 사용하였고, 상기 컬럼을 5.0 ml의 결합 완충액으로 세척하였다. IL-21은 상기 컬럼에 2.5ml의 용리 완충액(6M GuHCl, 0.5M 이미다졸, 0.5M NaCl, 및 20mM 인산염)을 사용함으로써 용리하였다. 용리 단계를 반복하였고, 샘플을 정제 및 정화를 위하여 SDS-Page 겔을 이용하여 분석하였다.
실시예 11
리폴딩
A. GSH 및 GSSG를 이용한 재생
용해화된 부분에서 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 21 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액 부피의 결정은 용질의 양 및 용질 내에 존재하는 IL-21의 농도에 기초하였다. 리폴딩 완충액(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KC1, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05%(w/v) PEG3350, 1.1 M L-아르기닌, 2mM GSH, 1 mM GSSG, pH 7.5)을 상온(21℃)으로 냉각시켰다. GSH 및 GSSG 용해 후 즉시 사용하였다.
IL-21(175 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(11 L)에 천천히(1.5 시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도 0.30 mg/ml로 하였다. 온도는 20-22℃ 사이였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21의 농도는 0.165 mg/ml로 결정되었고, 이것은 55% 재생율을 나타낸다.
B. DTT 및 GSSG를 이용한 재생
용해화된 부분의 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 15.02 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액 부피의 결정은 용질의 양 및 용질 내 존재하는 IL-21의 농도를 기초로 하였다. 리폴딩 버퍼(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaC12, 0.05% (w/v) PEG3350, 1.1 M L-아르기닌, 2 mM DTT, 4 mM GSSG, pH 7.5)을 상온(21℃)로 냉각하였다. DTT 및 GSSG를 용해 즉시 사용하였다.
IL-21(88 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(1.0L)에 천천히(1.0 시간) 첨가하였다. 온도 범위는 20-22℃ 사이 였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21의 농도는 0.27 mg/ml로 결정되었고, 이것은 59.5% 재생율을 나타낸다.
C. 시스테인 및 시스테인 디히드로클로라이드의 재행
용해화된 부분 내 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 18.6 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액 부피의 결정은 용질의 양 및 용질 내 존재하는 IL-21의 농도를 기초로 하였다. 리폴딩 버퍼(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaC12, 0.05% (w/v) PEG3350, 1.1 M L-아르기닌, 4 mM 시스테인, 2 mM 시스테인 HCl, pH 7.5)을 상온(21℃)으로 냉각하였다. 시스테인 및 시스틴 디히드로클로라이드를 용해 후 즉시 사용하였다.
IL-21(20.5 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(0.78 L)에 천천히(0.5 시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도 0.49 mg/ml로 하였다. 온도 범위는 20-22℃ 사이 였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 21 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21의 농도는 0.29 mg/ml로 결정되었고, 이것은 58% 재생율을 나타낸다.
D. DTT 및 시스틴 디히드로클로라이드를 이용한 재생
용해화된 부분 내 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 18.6 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액 부피의 결정은 용질의 양 및 용질 내 존재하는 IL-21의 농도를 기초로 하였다. 리폴딩 버퍼(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaC12, 0.05% (w/v) PEG3350, 1.1 M L-아르기닌, 2 mM DTT, 4 mM 시스틴 디히드로클로라이드, pH 7.5)를 상온(21℃)으로 냉각하였다. DTT 및 GSSG를 용해 후 즉시 사용하였다.
IL-21(20.5 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(0.78 L)에 천천히(0.5 시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도 0.49 mg/ml로 하였다. 온도 범위는 20-22℃ 사이 였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21의 농도는 0.28 mg/ml로 결정되었고, 이것은 58% 재생율을 나타낸다.
E. 시간-플러스 리폴딩
시간-플러스 리폴딩은 사람 IL-21met을 리폴딩하여 최종 농도 0.3-0.9 mg/mL로 하는 방법을 제공한다. 뱃치 리폴딩에서, 리폴딩 완충액 내 최종 IL-21 단백질 농도는 0.2-0.3 mg/ml 사이에서 최적화하였다. 아르기닌(1 M)의 고농도가 필요하였고, 리폴딩 단계의 수득율은 40% 내지 50%였다. 단백질 리폴딩의 전통적인 기준을 만족하면서, 훨씬 더 고농도에서 IL-21met를 리폴딩하는 것이 매우 바람직하다.
용해화된 봉입체의 제조는 최종 단백질 농도가 15 mg/ml로 존재하는 경우를 제외하고 실시예 4에 설명되는 바와 같았다. 용질의 1:50 희석은 설명되는 바와 같은 리폴딩 완충액을 이용하여 달성하였다. 그 후 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 3 시간 기간의 막바지에 취하고 원심분리하였다. 상청액을 HPLC 분석시켰다. 그 후 과정을 4번 더 반복하였다.
적절하게 리폴딩된 IL-21met의 %수율은 처음 3번 반복 동안 일정하게 유지되었지만, 4회 반복 후 떨어졌다. 수율의 희생없이 달성된 가장 높은 최종 단백질 농도는 0.9 mg/ml였다. 리폴딩 초기 단계 동안(<3 시간) 높은 단백질 농도(>0.3 mg/ml)는 응집으로 인한 낮은 수율을 결과로 가져왔다. 일단 리폴딩이 완수되면(>3 시간), 리폴딩 원료의 첨가는 수율의 희생없이 시작될 수 있다. 최종 리폴딩 완충액의 최대 염산 구아니딘은 0.3 내지 0.6 M이었다.
F. 감소된 아르기닌 농도에 있어서 DTT 및 시스틴을 이용한 리폴딩
용해화된 부분 내 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 14.53 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05% (w/v) PEG3350, 0.75 M L-아르기닌, 2 mM DTT, 4 mM 시스틴, pH 8.0)을 21℃ 냉각하였다. 시스틴을 0.25 M NaOH에 용해하여 농도를 80 mM로 하고 DTT와 함께 첨가한 후 즉시 사용하였다.
IL-21(96 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(1.0L)에 천천히(1.0 시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도를 0.61 mg/ml로 하였다. 온도 범위는 14-16℃사이 였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21은 0.40 mg/ml인 것으로 결정되었고, 이것은 66% 재생율을 나타낸다.
G. DTT 및 시스틴을 이용하는 부피측정 리폴딩
부피측정 리폴딩은 용질 내 IL-21의 농도가 아니라 IL-21 용질의 부피를 기초로 한다. 용해화된 부분 내 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 26.1 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05% (w/v) PEG3350, 0.75 M L-아르기닌, 2 mM DTT, 4 mM 시스틴, pH 8.0)를 15℃로 냉각하였다. 시스틴을 0.25 M NaOH에 용해하여 농도 80 mM로 하고 DTT와 함께 첨가한 후 즉시 사용하였다.
IL-21(935 ml)을 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액 (28.0 L)에 천천히(2.0 시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도를 0.83 mg/ml로 하였다. 온도 범위는 14-16℃ 사이였다. 리폴딩 혼합물을 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21은 0.51 mg/ml인 것으로 결정되었고, 이것은 61% 재생율을 나타낸다.
H. ZGOLD1로부터 부피측정 리폴딩 WIB
용해화된 부분 내 IL-21의 농도는 역상 HPLC에 의해 29.9 mg/ml인 것으로 결정되었다. 리폴딩 완충액(50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05% (w/v) PEG3350, 0.75 M L-아르기닌, 2 mM DTT, 4 mM 시스틴, pH 8.0)를 15℃로 냉각하였다. 시스틴을 0.25 M NaOH에 용해하여 농도를 80 mM로 하였고 DTT와 함께 첨가한 후 즉시 사용하였다.
IL-21(935 ml)를 함유하는 용질을 믹싱하여 리폴딩 완충액(27.3 L)에 천천히(2.0시간) 첨가하였다. IL-21을 리폴딩 혼합물에 첨가하여 최종 농도 0.96 mg/ml로 하였다. 온도 범위는 14-16℃였다. 리폴딩 혼합물 함유하는 용기를 대기 중에 열어두었다. 리폴딩이 16 시간 동안 발생하도록 허용하였다. 리폴딩된 IL-21은 0.60 mg/ml인 것으로 결정되었고, 이것은 62.3% 재생율을 나타낸다.
실시예 12
A. 리폴딩된 IL-21의 정화
이 단계는 리폴딩 반응을 막고 리폴딩된 IL-21 용액으로부터 미립자를 제거하는 것이다. 리폴딩된 IL-21은 전형적으로 pH5.5로 조절된 후 1.2 ㎛ 공칭 필터를 통과시킨다. 일부 경우에 여과 전에 pH가 조절되지 않으며, 다른 경우에 다른 크기(0.45-2.0 ㎛) 또는 다른 유형의 필터가 사용될 수 있었다. 카르 파워퓨지 연속 원심분리기(카르 Separations, Inc., Franklin, MA)를 사용하는 원심분리 또는 보틀 내 원심분리에 의해 미립자를 제거하는 것이 가능하다.
리폴딩 후, 완충용액의 전도율은 SP550 C 포획 수지 상에 로딩하기 위하여 감소되는 것이 필요하다. 혼탁 용액은 또한 폴딩되지 않은 IL-21을 제거하기 위해 여과되고 E.Coli 단백질을 침전시킨다. 한 실시예에서, 리폴딩된 IL-21을 함유하는 29.5 L의 리폴딩 완충액은 25 mM 아세테이트 완충액 pH 5.5의 1.4부(42.0L)로 희석하였다. 용액을 4시간 동안 실온에서 침전하도록 허용하였다. 그 후 용액을 1.2-0.8 ㎛ Cuno Zeta Plus 깊이 필터를 통과시켰다.
B. 리폴딩된 IL-21의 희석 및 정화
이 단계는 리폴딩 반응을 정지시키고, 양이온 교환 크로마토그래피에 결합가능하도록 리폴딩 물질을 희석하며, 리폴딩 IL-21 용액으로부터 미립자를 제거하는 것이다. 리폴딩 된 IL-21은 전형적으로 pH 5.5로 조절되고, 이어서 25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5를 이용하여 1.4배 희석하였다. 희석된 리폴딩 용액 내에 존재하는 가용성 및 불용성 단백질의 물리적 분리를 증가시키기 위하여 이 용액을 상온에서 액 4시간 동안 침전시키도록 허용하였다. 그 후 미립자가 거의 없는 침전시키고 희석한 리폴딩 용액을 전형적으로 1.2 내지 0.8 ㎛ 깊이 필터(Cuno Zeta Plus A30M03)를 통과시킨다.
실시예 13
정화되고 리폴딩 된 IL-21의 농축
정화되고 리폴딩 된 IL-21을 접선 유동 필터에 의해 10배 내제 30배 농축시킨다. 접선 유동 필터 장치 및 막(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa 분자량 컷오프 플레이트(Millipore, Bedford, MA) 및 프레임 시스템 또는 애머르샴 바이오사이언스 10 kDa 분자량 컷오프 중공사 시스템)을 0.5 M NaOH를 사용하여 깨끗하게 하고 물로 헹군다. 발효 육즙의 1L로부터 리폴딩 된 IL-21을 위하여, 0.2 m2 내지 0.3 m2의 막부위를 약 48L/시의 상호 유속 및 20 psi 내지 30 psi의 막횡단 압력에 이용한다.
실시예 14
리폴딩 된 IL-21의 포획
A. TOYOPEARL SP 550 C 수지를 사용하는 양이온 교환
농도에 따라서, IL-21을 양이온 교환 컬럼 상에서 포획한다. 한 구체예에서, 농축된 IL-21을 물이나 25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5를 이용하여 3배 희석한다. 형성되는 침전물을 상온에서 30분 동안 배양한 후 여과에 의해 제거한다. Millipore 1.2 Polysep II 여과(Millipore) 또는 1.2-0.8 ㎛ Cuno Zeta Plus A30MO3 막(Cuno, Meriden, CN)이 사용된다. 여과된 IL-21을 평형화 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 0.2 M NaCl, pH 5.5)에 따라 평형화 된 TOYOPEARL_SP550C 수지(Tosoh Biosep)의 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼은 1 L 수지 당 6-10 g IL-21의 용량으로 로딩되고, 베드 높이는 15 cm이고, 280 nm 및 215 nm에서 UV 흡광도를 모니터링하고, 150 cm/시의 유속가 사용된다. 로딩한 후 컬럼을 UV 흡광도가 베이스라인으로 되돌아 갈때 까지 평형화 완충액으로 세척한다. 그 후 컬럼을 4 컬럼 부피의 50% 평형화 완충액, 50% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 1.0 M NaCl, pH 5.5)으로 세척한다. IL-21은 25% 평형화 완충액, 75% 용리 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 용리된다. 택일적으로, 컬럼 상으로 IL-21의 로딩 및 평형화 완충액을 이용한 세척 후, IL-21은 100% 평형화 완충액 내지 100% 용리 완충액에 이르는 10 컬럼 부피 선형 구배를 갖는 컬럼으로부터 용리된다.
택일적으로, pH 조절, 희석, 정지 단계, 및 깊이 여과를 이용하는 여과 이후에, IL-21이 양이온 교환 크로마토그래피 상에 포획된다. 여과된 용액은 TOYOPEARL SP 550 C 수지(Tosoh Biosep)의 컬럼 상에 로딩되고 평형화 완충액 조건(25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.4 M NaCl)으로 평형된다. 컬럼은 1 L 수지 당 6 내지 15 g IL-21의 용량으로 로딩된다. 280 nm 및 215 nm에서 UV 흡광도가 모니터링되고, 150 cm/시의 유속가 사용된다. 로딩 후, UV 흡광도가 베이스라인으로 회복될 때까지 평형화 완충액으로 세척한다. IL-21을 100% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.75 MNaCl)에 단계 구배를 이용하여 컬럼으로부터 용리한다.
B. SP 세파로스 XL 수지를 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피
농축된 IL-21을 25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5를 사용하여 10배 희석한다. 형성되는 침전물을 실온에서 30분 배양 후 여과에 의해 제거한다. Millipore 1.2 ㎛ Polypro XL 필터(Millpore)에 이어서 0.45 ㎛ Whatman Polycap 75 AS 필터 (Maidstone, Kent, UK)를 사용한다. 여과된 IL-21를 평형화 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 0.2 M NaCl, pH 5.5)에 평형화된 애머르샴 바이오사이언스 SP 세파로스 XL 수지의 컬럼 상으로 로딩한다. 상기 컬럼은 1 L 수지 당 3-6 g IL-21의 용량으로 로딩하고, 베드 높이는 15 cm이며, 280 nm 및 215 nm에서 UV 흡광도를 모니터링하고, 150 cm/시의 유속가 사용된다. 로딩 후 컬럼을 UV 흡광도가 베이스라인으로 회복될 때 까지 평형화 완충액으로 세척한다. 그 후 컬럼을 4 컬럼 부피의 25% 평형화 완충액, 75% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 1.0 M NaCl, pH 5.5)을 이용하여 세척한다. IL-21을 50 % 평형화 완충액, 50 % 용리 완충액을 포함하는 컬럼으로부터 용리한다.
C. 스트림라인 SP XL 수지를 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피
다른 실시예에서, IL-21을 접선 유동 여과에 의해 농축하지 않고서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 포획한다. 리폴딩 후, pH를 5.5로 조절하고 상기 물질을 1.2 ㎛ 공칭 컷오프 필터를 통해 여과시킨다. 애머르샴 바이오사이언스 스트림라인 SP XL로 패킹된 애머르샴 바이오사이언스 스트림라인 컬럼이 평형화 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 0.2 M NaCl, pH 5.5)에 평형화 된다. 평형화 후, 여과되고 pH 조절되고 리폴딩 된 IL-21을 즉시 희석을 이용하여 컬럼 상으로 로딩하는데, 즉 30%의 여과되고, pH 조절되고, 리폴딩 된 IL-21과 70% 물을 크로마토그래피를 이용하여 로딩시켜서 정확도를 발생시킨다. IL-21은 안정화된 베드 높이에 비하여 수지의 2배 확장을 야기하는 유속을 이용하여 상류 방향으로 컬럼 상에 로딩된다. 일단 필터되고, pH 조절되고 리폴딩 된 IL-21이 로딩되면, 그것은 평형화 완충액으로 대체된다. 그 후 컬럼 입구에 기록된 전도율이 <10 mS/cm가 될 때까지 컬럼상으로 공급을 30% 평형화 완충액 및 70% 물로 유지시킨다. 그 후 280 nm에서 UV 흡광도가 베이스라인으로 회복될 때까지 컬럼을 2배 안정된 베드 높이 확장을 이용하여 상류 모드에서 평형화 완충액으로 세척한다. 그 후 유동이 정지되고 수지 베드가 안정화되도록 허용한다. 스트림라인 컬럼의 플런저를 안정화된 베드 높이로 낮추고 컬럼을 150 cm/시의 유속로 2 컬럼 부피에 대하여 하류 모드에서 평형화 완충액으로 세척한다. 그 후 IL-21을 150 cm/시로 하류 모드에서 50% 용리 완충액 (25 mM 아세트산 나트륨, 1.0 M NaCl, pH 5.5) 및 50% 평형화 완충액으로 용리한다.
실시예 15
소수성 상호작용 크로마토그래피의 의한 IL-21의 중간 정제
A. 부틸 세파로스 수지를 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
IL-21를 1 리터 IL-21 용액 당 198 gr 고체 황산 암모늄을 첨가함으로써 1.5 M 황산 암모늄에 조화시킨다. 황산 암모늄이 용해될 때 까지 용액을 교반한 후 고체 물질을 0.45 ㎛ 공칭 컷오프 필터를 통하여 여과에 의해 제거한다. 한 실시예에서 애머르샴 바이오사이언스 부틸 세파로스 4 FF의 15 cm 높은 컬럼이 평형화 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5 M 황산 암모늄, pH 5.5)에 평형화된다. 조화되고, 여과된 IL-21 용액을 150 cm/시의 유속로 1 L 수지 당 1.0-2.5 g IL-21의 용량으로 컬럼상에 부하시킨다. 280 nm 및 215 nm에서 UV 흡광도가 모니터링된다. 로딩 후 컬럼을 UV 흡광도가 베이스라인으로 회복되는 때까지 평형화 완충액으로 세척한다. IL-21을 50% 평형화 완충액 및 50% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM 염화나트륨, pH 5.5)으로 컬럼으로부터 용리한다. 택일적으로, 컬럼 상으로 IL-21을 로딩하고 평형화 완충액으로 세척한 후, IL-21을 100% 평형화 완충액으로부터 100% 용리 완충액에 이르는 10 컬럼 부피 선형 구배의 컬럼으로부터 용리한다.
B. TOYOPEARL 650M 수지를 이용하는 HIC
다른 실시예에서 다른 수지, Tosoh Biosep TOYOPEARL 부틸 650M이 IL-21을 정제하는데 사용된다. 방법은 다음을 제외하고 부틸 세파로스 FF 수지에 대하여 사용된 바와 같다: 양이온 교환 용출물을 3.5 M(NH4)2SO4 원액을 이용하여 1.5 M (NH4)2SO4에 조화시킨다; 조절되고 여과된 IL-21 용액을 1 L 수지 당 10-12 g IL-21 의 용량으로 커럼상으로 로딩한다; 로딩 후, 컬럼을 UV 흡광도가 베이스라인으로 회복될 때 까지 평형화 완충액으로 세척한다; IL-21을 100% 용리 완충액 (25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5, 0.05 M NaCl, 0.15 M(NH4)2SO4)으로 컬럼으로부터 용리한다.
실시예 16
A. 인산염 완충 식염수에 정제된 IL-21의 농축 및 완충 교환
정제 후 IL-21을 한외여과 및 정용여과하여 농축시키고 그것을 저장에 적합한 완충액으로 교환한다. 접선 유동 여과 장치 및 막(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa 분자량 컷오프 플레이트 및 프레임 시스템)을 0.5 M NaOH를 이용하여 깨끗이하고 물로 헹군다. 발효 육즙의 1 L로부터 정제된 IL-21을 위해, 0.1 m2 또는 그 이하의 막부위가 약 20-25 L/시의 상호 유속 및 10 psi 내지 15 psi의 막횡단 압력과 함께 사용된다. IL-21을 약 15-20 mg/ml로 농축시킨 후 약 5-10 다이어볼륨의 인산염 완충 식염수, pH 6.0에 정용여과한다. 농축되고 완충액 교환된 IL-21을 -80℃에 저장한다.
B. 히스티딘/만니톨 완충액에 정제된 IL-21의 농축 및 완충액 교환
SP HP 세파로스에 의한 정제 후, IL-21을 한외여과 및 정용여과하여 농축시키고 저장에 적합한 완충액으로 정제된 IL-21을 교환한다. 접선 유동 필터 장치 및 막(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa 분자량 컷오프 플레이트 및 프레임 시스템)을 0.5 M NaOH를 이용하여 깨끗이하고 물로 헹군다. 정제된 IL-21을 위해, 발효 육즙의 1 L로부터, 0.1 m2 또는 그 이하의 막부위가 25의 막횡단 압력에서 약 30 L/시의 상호 유속로 사용된다. IL-21을 약 10-15 mg/ml에 농축시킨 후, 5-10 다이어볼륨의 10 mM 히스티딘, 4.72%(w/v) 만니톨, pH 5.0-5.3에 대하여 정용여과한다. 결과의 용액을 살균 여과한다.
실시예 17
IL-21의 추가적 정제
A. 폴리싱을 위하여 SP HP 세파로스 수지를 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피
SP HP 세파로스를 이용하는 추가적 정제는 전체 순도를 더 향상시키도록 수행된다. TOYOPEARL 부틸 650M 용출액을 물과 함께 30 mS/cm에 희석한 후, 제2인산나트륨 원액을 사용하여 pH 6.0으로 조절한다. 그 후 조절된 용액을 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과시킨다. 여과된 물질을 50 mM 인산염, pH 6.0, 0.3 M NaCl으로 평형된 컬럼상에서 1 L 수지 당 10-15 g IL-21으로 컬럼상으로 로딩시킨다. UV 280 nm 및 UV 215 nm가 크로마토그래피를 모니터링하는데 사용된다. 로딩 후, 컬럼을 UV가 베이스라인에 도달할 때 까지 평형화 완충액으로 세척한다. 100% 용리 완충액(50 mM 인산염, pH 6.0, 0.7 M NaCl)에 20-컬럼 부피 구배를 이용하여 IL-21을 컬럼으로부터 용리한다.
B. 음이온 교환 크로마토그래피
IL-21을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜서 내독소를 제거한다. 애머르샴 바이오사이언스 Q 세파로스 FF의 컬럼은 평형화 완충액(20 mM Tris, pH 8.0)을 이용하여 평형화된다. IL-21 용액을 평형화 완충액을 이용하여 <10 mS/cm의 전도율로 조절한다. 조절된 IL-21 용액을 150 cm/시의 유속로 컬럼상에 로딩한다. IL-21은 컬럼에 결합하지 않고 플로우-스로우(flow-through)에 수집된다. 다른 실시예에서, 애머르샴 바이오사이언스 DEAE 세파로스 FF 수지 또는 Pall Mustang Q 막이 IL-21을 정제하기 위해 Q 세파로스 FF 대용으로 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 5.0 내지 9.0의 범위에 이르는 pH 값은 음이온 교환 배지를 통과하는 IL-21에 관한 결과를 나타냈다.
C. 소수성 상호작용 크로마토그래피
다른 실시예에서, 부틸 수지와 함께 상기 설명된 것과 다른 조건을 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피가 IL-21을 정제하는데 사용되었다. 애머르샴 바이오사이언스 페닐 세파로스 FF 고 서브, 애머르샴 바이오사이언스 Phenyl 세파로스 HP 및 애머르샴 바이오사이언스 부틸 세파로스 4 FF가 결합 및 유동 방식 플로우 스로우 방식 모두에 있어서 수지로서 사용될 수 있다. IL-21을 결합하기 위해, 컬럼은 25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5 M 황산암모늄, pH 5.5으로 평형된다. IL-21을 고체 황산암모늄을 첨가하고 용해될 때까지 교반함으로써 1.5 M 황산 암모늄에 조화시킨다. 조절된 IL-21용액을 150 cm/시의 유속에서 평형화된 컬럼 상으로 로딩한다. 280 nm 및 215 nm에서 UV 흡광도가 모니터링된다. 세척 후, IL-21을 100% 평형화 완충액 내지 100% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM NaCl, pH 5.5)의 10 컬럼 부피 선형 구배를 갖는 컬럼으로부터 용리한다. 플로우 스로우 방식에서 IL-21 함유 용액을 1.0 M 또는 그 이하의 황산 암모늄에 조화시키고, 25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM NaCl, 1.0 M 황산 암모늄, pH 5.5를 이용하여 평형화된 컬럼상으로 로딩한다. 플로우 스로우를 수집한다.
다른 실시예에서, 황산 암모늄보다는 염으로서 황산 나트륨을 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피가 IL-21을 정제하는데 사용되었다. 애머르샴 바이오사이언스 페닐 세파로스 FF 고 서브, Amershan 바이오사이언스 페닐 세파로스 HP 및 애머르샴 바이오사이언스 부틸 세파로스 4 FF가 수지로서 사용될 수 있다. 컬럼은 25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM 염화나트륨, 1.5 M 황산 나트륨, pH 5.5로 평형된다. I1-21은 고체 황산 나트륨을 첨가하고 황산 나트륨이 용해될 때 까지 교반함으로써 1.5 M 황산 나트륨에 조화된다. 조화된 IL-21 용액을 유속 150 cm/hr에서 평형화된 컬럼상으로 로딩한다. 280 nm 및 215 nm에서 흡광도가 모니터링된다. 세척 후, IL-21을 100% 평형화 완충액 내지 100% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, 50 mM NaCl, pH 5.5)으로부터 10 컬럼 부피 선형 구배를 이용하여 컬럼으로부터 용리한다.
다른 실시예에서, HIC FPLC 플로우-스로우가 Butyl 세파로스 4FF column (애머르샴 바이오사이언스)이 구비된 BIOCAD 700E FPLC 시스템 (Perseptive Biosystems, Framingham, MA)상에서 수행되었다. 컬럼을 25 mM NaOAc, 600 mM NaCl, 1 M(NH4)2SO4, pH 5.5로 조절하였다. 고체 (NH4)2SO4를 컬럼상으로 로딩하고 IL-21을 플로우-스로우에 수집하였다.
D. 금속 킬레이트화 세파로스를 이용하는 IMAC
애머르샴 바이오사이언스 킬레이트화 세파로스 (애머르샴)가 IL-21을 더 정제하는데 사용된다. 포획된 IL-21 CIE 용출액을 구리, 아연, 또는 니켈로 하전된 컬럼상으로 로딩시키고 이어서 25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5; 0.8 M NaCl로 평형화한다. UV 280 nm 및 UV 215 nm가 크로마토그래피를 모니터링하는데 사용된다. 그 후 컬럼을 베이스라인 까지 평형화 완충액으로 세척하고, 100% 용리 완충액(25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5 ; 0.8 M NaCl, 0.5 M 이미디졸)에 10CV 구배를 이용하여 용출한다.
실시예 18
A. 아세토니트릴 완충액 내 용해화된 IL-21의 역상 HPLC 분석
여기에 설명되는 방법은 용해된 봉입체 샘플 및 정제된 샘플 내 IL-21을 정량화하는데 사용된다. 4.6 x 50 mm Jupiter C5 컬럼(300Å, 5㎛, Phenomenex)이 자동온도조절된 자동샘플기 및 자동온도조절된 컬럼 구획을 구비하는 Agilent Technologies 1100 series HPLC 시스템에서 사용된다. 0.2 ㎛ 사전 컬럼 필터를 컬럼 전에 둔다. 이동 상 A는 HPLC 등급수에서 0.1% TFA이고 이동 상 B는 아세토니트릴에서 0.1% TFA이다.
정제된 샘플들에 대한 용출액 구배/시간 표는 하기와 같다:
Figure 112005031146824-pct00010
용해된 봉입체 샘플에 대한 용출액 구배/시간 표는 하기와 같다:
Figure 112005031146824-pct00011
안정한 베이스라인이 달성될 때 까지 컬럼을 용출액 구배/시간 표의 초기 조건으로 평형화시킨다.
방법 파라미터는 다음과 같다:
1. 유속 1 ml/분
2. 총 운행 시간 : 20분
3. 컬럼 온도 :40℃
4. 자동샘플기 온도 :8℃
5. 최대 컬럼 압력 :240 bar
6. 주입기 드로잉 속도 :100μL/분
7. 주입기 분사 속도 :100μL/분
8. 다이오드 어레이 검출기 데이타 수집 파장: 시그날 A:280 nm, 25 nm 대역폭
9. 다이오드 어레이 검출기 데이타 모니터링 파장 : 시그날 B:215 nm, 10 nm 대역폭
10. 다이오드 어레이 검출기 데이타 기준 파장 :시그날 A:350 nm, 25 nm 대역폭; 시그날 B:350 nm, 25 nm 대역폭
11. 다이오드 어레이 검출기 오토바란스: Prerun/Postrun 모드
12. 피크 폭 반응 시간 : >0.1분
13. 슬릿 너비 :4 nm
14. 니들 세척 작용 : 니들 및 니들 시트에 구아니딘의 축적을 감소시키기 위해 프로그램됨.
폴딩되지 않은 IL-21의 정량화를 위해, IL-21 참조 표준을 0.5 mg/mL의 50 mM Tris, pH 7.5, 6 M 구아니딘 HC1, 10 mM DTT에 희석하고 20분 동안 40℃로 가열한다. 희석된 참조 표준을 10 ㎍ 및 50 ㎍ 사이(예를 들어, 10, 20, 30, 40 및 50 ㎍ 주입)의 적어도 5 수준에서 컬럼상으로 주입시킨다. 용해된 IL-21 샘플을 마이크로퓨지에서 스핀하고 1:10으로 50 mM Tris, pH 7.5, 6 M 구아니딘 HCl에 희석한 후 25μl의 샘플을 주입한다.
폴딩된 IL-21의 정량화를 위해, IL-21 참조 표준을 인산염 완충 식염수, pH 6.0과 함께 1.0 mg/ml에 희석한다. 폴딩된 IL-21 샘플을 어떤 처리도 하지 않고 HPLC에 주입시킨다. 크로마토그래피한 후 IL-21 피크 아래 부위를 통합시킨다. 표준 곡선이 구성되고 샘플 내 IL-21의 농도가 표준 곡선에서 읽는다.
B. IL-21의 정량화를 위한 메탄올-기재 RP-HPLC
15분 메탄올-기재 RP HPLC 방법이 또한 최종 생산물을 통하여 용해된 봉입체로부터 분포하는 IL-21 제조를 평가하는데 사용될 수 있다.
IL-21 메탄올-기재 RP-HPLC 분석법은 다음과 같다:
컬럼 : Zorbax 300SB-CN (4.6 x 50 mm), 3.5 마이크론
이동 상 A: 0.154% TFA, HPLC 등급 수
이동 상 B: 0.154% TFA, 메탄올
용리 구배/시간 표
Figure 112005031146824-pct00012
총 실행 시간: 15 분
컬럼 온도 : 40℃
자동샘플기 온도: 5℃
주입기 드로잉 속도 :90μL/분
주입기 분사 속도 :90 μL/분
DAD 모니터링 파장 : 시그날 A : 280 nm, 8 nm 대역폭
시그날 B : 215 nm, 8 nm 대역폭
시그날 C : 280 nm, 6 nm 대역폭
(기준 파장 오프)
DAD 데이타 콜렉션 파장 : 시그날 A : 280 nm, 8 nm 대역폭
DAD 기준 파장 : 시그날 A 및 B, 360 nm, 16 nm 대역폭
DAd 자동발란스 시간 : >0.1 분
슬릿 폭 : 4 nm
음성 파장 한계 : 100 mAu
표준 곡선 로드 양 범위 : 1-20 ㎍
최소 주입 부피 : 5μL
최대 주입 부피 : 100μL
한계 압력 : 350 bar
정상 실행 압력 : 130-200 bar
실시예 19
IL-21을 발현시키기 위한 OmpT 결핍 균주
A. IL-21의 생산을 위한 새로운 균주의 구성
IL-21의 생산을 위한 통용되는 방법은 E.Coli 숙주 W3110[F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ-] 내 발현을 포함한다. W3110은 IL-21의 생산에 대하여 강건한 숙주인 반면, 다운스트림 과정에 있어서 이상적이지 않다. 세포 용해중에, IL-21은 외막에 존재하는 OmpT 프로테아제에 의해 리신 74(SEQ ID NO:28에 나타내는 바와 같음)에서 절단된다. 이 프로테아제는 FGF-18을 포함하는 다른 이종 재조합 단백질을 절단하는 것으로 알려져 있다. IL-21의 단백질 가수분해는 예를 들어 BL21[F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm lon]과 같은 OmpT 결핍인 숙주에서 발생하지 않는다. OmpT 활성은 ZnSO4 또는 CuSO4의 첨가와 함께 세포 용해 중에 최소화될 수 있는 반면, 정제 계획은 최종 생산물로부터 절단된 IL-21를 제거하도록 설계되어야 했다. IL-21의 생산을 위한 공정을 능률적으로 하기 위한 노력에 있어서, OmpT 프로테아제가 W3110으로부터 제거되어 새로운 생산 균주를 생산하였다. 이 새로운 E.Coli 숙주 균주의 구성은 아래에 설명된다.
B. Red 리콤비나제 오페론의 발현을 위한 플라스미드 pCHAN1의 구성
동종 재조합을 기초로 한 전략이 W3110으로부터 OmpT 프로테아제를 제거하기 위해 사용되었다. 동종 재조합에 의해 E.Coli 염색체로부터 유전자를 효율적으로 제거하기 위해, 리콤비나제 활성을 갖는 특정 효소가 세포 내에 존재해야 한다. 이것을 완수하기 위해, 플라스미드는 박테리오파지 λ로부터 Red 리콤비나제 오페론을 지니게 구성되었다. Red 리콤비나제 유전자를 함유하는 단편을 박테리오파지 λ DNA(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로부터 재조합-특이적 프라이머 ZC43,586(SEQ ID NO:29) 및 ZC43,587(SEQ ID NO:30)을 이용하여 PCR에 의해 합성하였다. 반응물은 100 pmole의 각각의 프라이머 ZC43,586 및 ZC43,587, 10μl의 10X PCR 완충액(Boehringer MAnnheim), 1μl Pwo 폴리머라제(Boehringer Mannheim), 10μl의 0.25 mM 뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스(Perkin Elmer), 및 dH2O를 최종 부피 100μl로 함유하였다. PCR 반응물은 94℃의 1회의 5분 사이클 후, 94℃의 1분의 30회 사이클, 50℃의 1분 및 72℃의 1분 사이클로 이루어졌다. 마지막 30회 사이클 후 72℃에서 5분 연장이 뒤따르고 반응물을 4℃에서 밤새 보유로 종결지었다. 결과의 1964 염기쌍(bp) 단편은 Red 리콤비나제 오페론(SEQ ID CO:31)를 함유하였다. SEQ ID NO:31에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 41-454로부터 나타낸 바와 같은 Gam(γ), 뉴클레오티드 463-1245로부터 나타낸 바와 같은 Bet(β), 및 뉴클레오티드 1245-1922로부터 나타낸 바와 같은 Exo의 세가지 유전자를 코드화한다.
Red 리콤비나제 오페론이 효모의 동종 재조합에 의해 플라스미드로 통합되었다. 수행능 효모 세포(100μl의 S.cerevisiae SF838-9Dα)가 100ng의 SmaI-소화된 pTAP339(버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁됨(출원시에 지정되지 않음)), 수용체 벡터 및 상기로부터의 1㎍의 PCR 단편과 결합된다. 효모/DNA 혼합물을 0.2 cm 전기천공 큐벳으로 옮기고 0.75 kV(5kV/cm), 무한대 Ω, 25 μF 콘덴서에서 펄스화 하였다. 그 후 형질전환 혼합물에 1 ml의 1.2 M 소르비톨을 첨가하고 1 시간 동안 30℃에서 배양하였다. 세포를 2개의 URA DS 플레이트(2% 덱스트로스, 2% 소르비톨)상에서 500μl 분취량으로 평판배양하고 2일 동안 30℃에서 배양하였다. 약 48 시간 후 플레이트로부터 Ura+ 효모 형질전환체를 2 ml H2O에 현탁시키고 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 1 ml의 Qiagen P1 용해 완충액(Qiagen)에 현탁시키고 1 ml의 0.5 mm 지르코니아/실리카 비드(Biospec Products Inc.)를 함유하는 새로운 관으로 옮겼다. 세포를 용해시키고, 샘플을 안정화하도록 허용하고, 250 μl의 용해질을 새로운 관으로 옮기고, 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라서 Qiagen Spin Miniprep 키트를 이용하여 분리시켰다.
전기수행능 E.Coli DH10B 세포(Invitrogen)를 1 μl의 효모 DNA 제제를 이용하여 형질전환시켰다. 상기 세포를 0.1 cm 큐벳에서 2.0 kV, 25μF 및 100Ω으로 펄스화하였다. 전기천공법 후, 250μl SOC(2% Bacto 트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10 nM NACl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코스)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 세포를 2 시간 동안 37℃에서 회수되도록 허용하였다. 전체 250μl 샘플을 25 mg/L 카나카이신(Sigma)을 함유하는 LB 플레이트(LB 육즙(Lennox), 1.8 % Bacto Agar(Difco))상에서 하나의 분취량으로 평판배양시켰다. 플레이트를 밤새 37℃에서 배양시켰다. Red 리콤비나제 오페론을 지니는 개개의 클론을 제한 소화에 의해 동정하여 삽입의 존재를 확인하였다. 양성 클론의 삽입은 서열 분석을 당하게 하였다. 정확한 삽입을 함유하는 플라스미드를 pCHAN1이라 칭하였다.
이어서 효모 서열을 pCHAN1의 벡터 주로부터 제거하였다. 3.0μl의 플라스미드 DNA를 37℃에서 24μl H2O, 2.7 μl 완충액 H(Roche) 및 2.0 μl NotI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 밤샘 배양하였다. 5μl의 밤샘 소화물을 1μl 6x DNA 샘플 염료(25% Ficoll Type 400 (Sigma), 0.25% 브로모페놀 블루(EM Science), 0.25% 자일렌 시아놀(Kodak Biomedicals Inc.))과 혼합시키고, 4μl의 이 용액을 1% 아가로스 겔(EM Science) 상에서 실행시켜서 완전한 소화를 확인하였다. 플라스미드를 재원형화하기 위해, 14μl의 밤샘 NotI 소화물을 4μl의 5x 리게이션 완충액(Invitrogen) 및 2μl 리가제(Invitrogen)과 혼합하였다. 상기 리게이션을 25℃에서 밤새 배앙시켰다.
재리게이션 된 pCHAN1을 W3110으로 형질전환시켰다. 전기수행능 W3110 세포(50μl)를 상기 설명된 E.Coli에 대한 전기천공법 프로토콜을 사용하여 1μl pCHAN1 DNA로 형질전환시켰다. 회수 이후에, 전체 250μl 형질전환 혼합물을 25 mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 하나의 분취량으로 평판배양하였다. 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하고 10개의 결과의 클론을 추가적 분석을 위해 골랐다. 그들을 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 2.0 ml Superbroth II(Becton Dickinson)에 37℃로 밤새 성장시켰다. 다음날, 1.0 ml의 밤샘 소화물을 pCHAN1의 존재를 확인하는데 사용하였다. Qiagen Spin Miniprep 키트를 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드 DNA를 제작하는데 사용하였다. 플라스미드의 동일성은 EcoRI(Gibco BRL) 및 NotI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 제한 소화에 의해 확인되었다. 단리 #3을 후속 실험을 위하여 선택하고 EE670이라 칭하였다.
W3110 내 유전자 치환을 위한 테트라시클린 단편의 생산
OmpT 유전자 비활성을 부여하는 OmpT 유전자 좌로 동종 재조합을 위한 적당한 마커로서 테트라시클린 유전자를 선택하였다. 테트라시클린 프로모터::테트라시클린(tetp::tet) 단편을 재조합-특이적 프라이머 ZG45,112(SEQ ID NO:32) 및 ZG45,171(SEQ ID NO:33)을 사용하여 pBR322 DNA(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로부터 PCR에 의해 생산하였다. 반응 혼합물은 100 pmole의 각각의 프라이머, ZG45,112 및 ZG45,171, 10μl의 10X PCR 완충액(Boehringer Mannheim), 1μl Pwo 폴리머라제(Boehringer Mannheim), 10μl 의 0.25 mM 뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스(Perkin Elmer), 및 dH2O를 최종 부피 100μl로 함유하였다. PCR 반응에 관한 조건은 94℃에서 2분의 1 사이클에 이어서, 94℃에서 30초의 30 사이클, 50℃에서 1분 및 72℃에서 2분이었다. 이어서 72℃에서 7분 확장 및 4℃에서 밤샘 보유하였다. 결과의 1590 bp 단편은 tetp::tet(SEQ ID NO:34)를 함유한다.
PCR 반응물을 1% 아가로스 제조 젤 상으로 로딩시켜서 tetp::tet 단편을 정제하였다. 상기 tetp::tet 단편을 겔로부터 절단하고 아쿠아리움 필터 플로스(Finny Products, Inc., Cincinnati, OH)으로 채워진 바닥의 작은 구멍을 갖는 0.5 ml 에펜도르프 관에 놓았다. 상기 관을 1.5 ml 에펜도르프 관으로 삽입사고 탁상용 원심분리기에서 25℃에서 10분 동안 14,000 rpm으로 스핀하였다. 1.5 ml 관의 바닥에서 액체를 10%(vol/vol) 3M NaOAc 및 2 부피의 100% 에탄올과 혼합시켰다. 샘플을 -20℃에서 10분동안 배양하고 탁상용 원심분리기에서 4℃로 10분 동안 원심분리하여 PCR 단편을 침전시켰다. 상청액을 흡입기로 빨아내고 펠릿을 50μl H2O에 재현탁시켰다. tetp::tet 단편은 50 ng/μl의 작업 농도였다.
PCR 단편을 유전자 치환 실험을 위한 양성 제한으로서 사용하기 위해 pCR4.0-BLUNT TOPO® 벡터(Invitrogen) 내로 리게이션 시켰다. 리게이션은 제저업자의 지시에 따라서 수행되었다. E.Coli DH10B 세포(Invitrogen)를 상기 설명되는 E.Coli에 대한 전기천공법 프로토콜을 사용하여 2μl의 tetp::tet DNA 단편을 이용하여 형질전환하였다. 회수 후, 전체 250μl 형질전호나 혼합물을 100mg/L 암피실린(Sigma)을 함유하는 LB 플레이트 상에서 평판배양하였다. 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하였다.
10개의 클론을 추가적 분석을 위해 골랐다. 그들을 37℃에서 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 2.0 ml Superbroth II (Becton Dickinson)에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 1.0 ml의 밤샘 배양액을 플라스미드 DNA의 존재를 확인하기 위해 사용하였다. Qiagen Spin Miniprep 키트가 제조업자의 지시에 따라서 플라스미드 DNA를 제작하는데 사용되었다. 플라스미드 DNA는 SalI(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 PstI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 제한 분석하여 플라스미드 동일성 및 삽입 오리엔테이션을 확인하였다. 단리 #1을 후속 실험을 위해 골라냈다. 상기 플라스미드를 pSDH185이라 칭하였고 클론은 EE686이었다.
W3110 내 유전자 치환: OmpT 유전자의 결손
W3110/pCHAN1의 500 ml 배양액을 37℃에서 SOB 배지[20 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출액, 0.5 g/L NaCl, 10ml/L의 250 mM KCl, 5 ml/L의 2M MgCl2, pH7.0]에서 0.6의 OD600에서 성장시켰다. 상기 배양액을 4개의 125 ml 배양으로 나누었다. 하나의 배양액을 비유도 대조군으로 두었고, 반면에 나머지 3개는 15분, 30분, 또는 60분 동안 1 mM IPTG로 유도하였다. 그들 각각의 배양의 마지막에, 수행능 세포를 다음 방식으로 모두 4개의 배양액으로부터 제작하였다. 세포를 10분 동안 5000 rpm에서 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 상청액을 배수시키고 각각의 펠릿을 62.5 ml 얼음 차가운 H2O에 재현탁시켰다. 배양액을 다시 펠릿화하고, 상청액을 배수시켰으며, 각각의 펠릿을 31.25 ml 차가운 10% 글리세롤에 재현탁시켰다. 그 후 배양액을 5분 동안 8000 rpm에서 ㎍원심분리하였다. 상기 펠릿을 잘 배수시키고 잔여 10% 글리세롤에서 재현탁시켰다.
모든 4개의 배양액을 6개의 50μl 분취량으로 나누는데 이것은 다음 방식으로 형질전환되었다: 1) DNA 없는 음성 대조군, 2) 1μl(1㎍/μl) pBR332(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 양성 대조군, 3) 1μl(1㎍/μl) pTAP279 양성 대조군, 4) 1μl pSDH185 양성 대조군, 5) 2μl(50㎍/μl) tept::tet 단편, 및 6)4μl(50㎍/μl)tetp::tet 단편. 세포를 E.Coli에 대하여 상기 설명되는 바와 같이 전기천공법에 의해 형질전화시켰다. 전체 형질전환 혼합물을 35 mg/L 클로람페니콜(Sigma)를 함유하는 LB 플레이트 상에서 평판배양하는 pTAP279 대조군을 제외하고는, 10 mg/L 테트라사이클린(Sigma)을 함유하는 LB 플레이트 상에서 평판배양하였다. 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하였다. 또한, 각각 4개의 배양액의 10-6 및 10-7 희석액을 LB 플레이트 상에서 평판배양하여 세포 수를 결정함에 의해 재조합 공정의 전반적인 효율성을 평가하였다.
다음날, 대조군 플레이트를 배양기로부터 꺼내어 평가하였다. tetp::tet 단편으로 형질전환 된 샘플을 추가적 24 시간 동안 배양시킨 후 분석하였다. 26개의 가장 큰 클론을 추가적 분석에 대하여 동정하였다.
ompT 결핍 클론의 특성화
26개의 선택된 각각의 클론을 5㎍/μl 테트라사이클린을 포함하는 1 ml LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, Genomic Prep DNA 단리 키트(애머르샴 Pharmavia)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 26개 클론 모두로부터 게놈 DNA를 생산하였다.
각각의 클론으로부터 게놈 DNA를 dH2O에 1:100 희석시켜서 PCR 분석을 위한 주형으로서 사용하였다. 각각의 희석된 샘플을 PCR 프라이머의 3개의 상이한 세트를 이용하여 분석하였다(1 클론당 3개의 PCR 반응). 반응물은 100 pmole의 각각의 프라이머 세트 #1:ZG45,357(SEQ ID NO:35) 및 ZG45,350(SEQ ID NO:36), 또는 프라이머 세트 #2:ZG45,353(SEQ ID NO:37) 및 ZG45,355(SEQ ID NO:38), 또는 프라이머 세트 #3:ZG45,354(SEQ ID NO:39) 및 ZG45,359(SEQ ID NO:40)를 함유하였다. 잔여 100 μl 최종 부피는 10μl의 10X PCR 완충액(Boehringer Mannheim), 1μl Pwo 폴리머라제(Boehringer Mannheim), 10μl의 0.25 mM 뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스(Perkin Elmer) 및 dH2O로 이루어져 있었다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 1 사이클에 이어서, 94℃에서 30초 동안 30 사이클, 50℃에서 1분 및 72℃에서 2분이었다. PCR을 72℃에서 7분 연장 및 4℃에서 밤샘 보유로 종결지었다. W3110 내 OmpT 유전자가 테트라시클린 유전자로 성공적으로 치환되었다면, 프라이머 세트 #1은 1584 bp 밴드(SEQ ID NO:41)를 증폭해야 하고, 프라이머 세트 #2는 1190 bp 밴드(SEQ ID NO:42)를 증폭해야만 한다. 결과는 스크리닝 된 26개의 클론 중 25개가 ompT 였음을 증명하였다. W3110 ompT 클론 #1 및 #3을 후속 분석을 위해 선택하였다.
단백질 가수분해 활성의 손실을 확인하기 위해, IL-21을 새로이 유도된 ompT 균주 및 W3110 부모로부터의 세포 용해질과 함께 배양시켰다. ompT 균주로부터의 용해질, BL21을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 세포를 Superbroth II 내로 접종시키고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 각각의 밤샘 배양액의 4개의 1 ml 분취량을 실온에서 펠릿화하고 BugBuster®(Novagen)을 제조업자의 지시에 따라 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해질을 1)IL-21의 0.332 mg/ml, 또는 2) 5mM ZnCl2가 존재하는 IL-21의 0.332 mg/ml를 함유하여 4시간 동안 25℃에서 배양시켰다. 각각의 샘플을 2% β-메르캅토에탄올(Sigma)를 함유하는 동일 부피의 NuPAGE 4x 샘플 완충액(Invitrogen)과 혼합시켰다. 환원된 샘플을 100℃에서 5분동안 가열시키고 10% NuPAGE 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen) 상으로 10μL를 로딩시켰다. 변성 조건(SDS-PAGE) 하에서 1x MES 실행 완충액(Invitrogen)을 사용하여 130v에서 전기영동을 수행하였다. 겔을 제조업자의 지시에 따라서 Simply Blus Safestain(Invitrogen)을 이용하여 염색시켰다.
결과는 OmpT 프로테아제가 유전자 치환 내내 불활성이었음을 나타냈다. IL-21은 BL-21, W3110 ompT- #1 및 W3110 ompT- #3로부터 용해질에 4 시간 배양한 후 완전히 손상시키지 않은 채 였으나, W3110 부모로부터의 용해질에서 완전히 붕괴되어 있었다. ompT 프로테아제의 활성은 아연에 의해 저해되었다. 5 mM ZnCl2를 함유하는 배양에 있어서, IL-21은 손상되지 않고, 붕괴의 원인이되는 OmpT를 지지하도록 유지되었다. 새로이 구성된 W3110 ompT 균주를 ZGOLD1(W3110 ompT- #1;(버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁됨(출원시에 지정되지 않음)) 및 ZGOLD3(W3110 ompT- #3)이라 칭하였다.
ZGOLD1 및 ZGOLD3의 특성화
ZGOLD1 및 ZGOLD3를 성장의 평가를 위해 W3110 부모와 함께 성장시켰다. 모든 3가지 균주의 배양액을 OD600의 1.0에서 LB에 있어서 37℃로 성장시켰다. 세포 밀도는 성장을 평가하기 위해 1시간 단위로 측정되었다. 각 배양액의 희석액(H2O 중 10-6, 10-7 및 10-8)을 세포 수를 결정하기 위해 LB 카나마이신 플레이트(상기 참조) 상에서 평판배양시켰다. 결과는 ZGOLD 균주의 성장이 W3110 부모 균주의 성장과 상응한다는 것을 나타낸다.
형질전환 효율성을 평가하기 위해, 세포를 수확하고 상기 설명되는 바와 같이 형질전환에 대하여 수행능을 만들었다. 각 균주로부터의 분취량을 1) 1μl pTAP337(IL-21 발현 플라스미드; ATCC No.PA-4853), 또는 2) DNA 부재(음성 대조군)을 이용하여 형질전환 하였다. 전기천공법을 상기 설명되는 바와 같이 수행하였다. 회수 후에, 각각의 형질전환 혼합물을 25 mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 평판배양하고 37℃에서 밤샘 배양하였다. 데이타는 W3110의 형질전환 효율성은 ompT의 제거에 의해 영향받지 않음을 나타낸다.
IL-21 발현 벡터를 이용하여 형질전환 된 각각의 ZGOLD 균주의 10개의 클론을 단백질 생산을 평가하기 위해 선택하였다. 상기 클론을 Superbroth II(25㎍/ml 카나마이신 함유)에서 37℃로 밤새 성장시켰다. 밤샘 배양액이 25㎍/ml 카나마이신을 포함하는 Superbroth II를 함유하는 롤러 드럼을 접종하는데 사용되었다. 세포를 37℃에서 성장시켰다. 상기 클론 중 하나의 2차 배양이 성장되었고 비유도 대조군으로서 역할을 하였다. 각 배양의 OD600이 1.5-2.0일 때, 그들을 1 mM IPTG(ICN Biomedicals Inc.)와 함께 유도시켰다. 배양액의 배양은 추가의 5 시간 동안 계속되었다. 각 배양액의 샘플을 상기 설명되는 바와 같은 환원 조건에서 4-12% 구배 NuPAGE 겔(Invitrogen) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 결과는 ZGOLD1 및 ZGOLD3에 의한 IL-21 생산이 W3110 부모 균주의 생산과 상응한다는 것을 나타낸다. ZGOLD1/pTAP337 #1(버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁됨(출원시에 지정되지 않음))를 IL-21 생산에 대한 공정의 추가적 개발을 위해 선택하였다.
상기로부터, 비록 본 발명의 특이적 구체예가 도해의 목적으로 본원에 설명되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 부가되는 청구항을 제외하고는 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> ZymoGenetics, Inc. <120> IL-21 PRODUCTION IN PROKARYOTIC HOSTS <130> 02-12PC <160> 42 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)...(535) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55 Met Arg Ser 1 agt cct ggc aac atg gag agg att gtc atc tgt ctg atg gtc atc ttc 103 Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe 5 10 15 ttg ggg aca ctg gtc cac aaa tca agc tcc caa ggt caa gat cgc cac 151 Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta 247 Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val 55 60 65 gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgt ttt cag aag gcc caa 295 Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln 70 75 80 cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca 343 Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser 85 90 95 att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga 391 Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg 100 105 110 115 cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa 439 Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 125 130 cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg 487 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met 135 140 145 att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt gaa gat tcc tga 535 Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser * 150 155 160 ggatctaact tgcagttgga cactatgtta catactctaa tatagtagtg aaagtcattt 595 ctttgtattc caagtggagg agccctatta aattatataa agaaata 642 <210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> oligonucleotide ZC29740Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC29740 <400> 3 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 50 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC29741 <400> 4 tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cg 42 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC29736 <400> 5 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaactc 60 cc 62 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC29738 <400> 6 gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca cccgggagtt aatttctcct ctttaatgaa 60 ttc 63 <210> 7 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC29084 <400> 7 atcaacacca acatcagcac cataaggagg agtagcatat gcaaggtcaa gatcgccaca 60 tg 62 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22127 <400> 8 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60 gtgttcta 68 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22913 <400> 9 ggaaccaggt cgttcacata gtttttcagc tgatcaacaa 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22914 <400> 10 ttgttgatca gctgaaaaac tatgtgaacg acctggttcc 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22915 <400> 11 tgtttctgac gacgacctgc gttggtggac ggcggtttac 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22916 <400> 12 gtaaaccgcc gtccaccaac gcaggtcgtc gtcagaaaca 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22961 <400> 13 gttttcacga gcacttcacc aacaaggacc atagattatg 40 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22962 <400> 14 aacaaggacc atagattatg caggatcgcc acatgattcg tatgcgtcag 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22963 <400> 15 gtttttcagc tgatcaacaa tatcgatcag ctgacgcata cgaatcatgt 50 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22964 <400> 16 tatgtgaacg acctggttcc ggaattcctg ccggctccgg aagatgttga gaccaactgt 60 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22965 <400> 17 tcagctgggc tttctggaaa caggagaaag cggaccactc acagttggtc tcaacatctt 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22966 <400> 18 tttccagaaa gcccagctga aatccgcaaa caccggtaac aacgaacgta tcatcaacgt 60 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22967 <400> 19 gttggtggac ggcggtttac gtttcagttt tttaatggaa acgttgatga tacgttcgtt 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22968 <400> 20 gcaggtcgtc gtcagaaaca ccgtctgacc tgcccgtcct gtgattctta tgagaaaaaa 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22969 <400> 21 gcagcaggga tttgaaacgt tccaggaatt ctttcggcgg ttttttctca taagaatcac 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22970 <400> 22 acgtttcaaa tccctgctgc agaaaatgat tcaccagcac ctgtcctctc gtacccacgg 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22971 <400> 23 aatcttatct catccgccaa aacatcagga atcttcggaa ccgtgggtac gagaggacag 60 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC22972 <400> 24 ttaatctgta tcaggctgaa aatcttatct catccgccaa 40 <210> 25 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC40133 <400> 25 ctcaacatct tccggagccg gcaggaattc cggaaccagg tcattcacat aatttttcag 60 ctg 63 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC40107 <400> 26 ttatagatat tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cctggttccg gaattcctgc 60 cggc 64 <210> 27 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized IL-21 <221> CDS <222> (1)...(405) <400> 27 atg caa ggt caa gat cgc cac atg att aga atg cgt caa ctt ata gat 48 Met Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 1 5 10 15 att gtt gat cag ctg aaa aat tat gtg aat gac ctg gtt ccg gaa ttc 96 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 20 25 30 ctg ccg gct ccg gaa gat gtt gag acc aac tgt gag tgg tcc gct ttc 144 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 35 40 45 tcc tgt ttc cag aaa gcc cag ctg aaa tcc gca aac acc ggt aac aac 192 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 50 55 60 gaa cgt atc atc aac gtt tcc att aaa aaa ctg aaa cgt aaa ccg ccg 240 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro 65 70 75 80 tcc acc aac gca ggt cgt cgt cag aaa cac cgt ctg acc tgc ccg tcc 288 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 85 90 95 tgt gat tct tat gag aaa aaa ccg ccg aaa gaa ttc ctg gaa cgt ttc 336 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 100 105 110 aaa tcc ctg ctg cag aaa atg att cac cag cac ctg tcc tct cgt acc 384 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 115 120 125 cac ggt tcc gaa gat tcc tga 405 His Gly Ser Glu Asp Ser * 130 <210> 28 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized IL-21 <400> 28 Met Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 1 5 10 15 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 20 25 30 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 35 40 45 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 50 55 60 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro 65 70 75 80 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 85 90 95 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 100 105 110 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 115 120 125 His Gly Ser Glu Asp Ser 130 <210> 29 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC43,586 <400> 29 acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60 tgag 64 <210> 30 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC43,587 <400> 30 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcatcgccat tgctccccaa 60 atac 64 <210> 31 <211> 1965 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the Red Recombinase operon amplified with ZC43,586 and ZC43,587 <400> 31 acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60 tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt ttcctaatca gcccggcatt 120 tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc atgaacgctt attacattca 180 ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag cagctcgccc gtgaagagaa 240 agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc cagcacctgt ttgaatcgct 300 atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa tccattaccc gtgcgtttga 360 tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc cggtacatgg ttgaaaccat 420 tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataaaac gaatgagtac tgcactcgca 480 acgctggctg ggaagctggc tgaacgtgtc ggcatggatt ctgtcgaccc acaggaactg 540 atcaccactc ttcgccagac ggcatttaaa ggtgatgcca gcgatgcgca gttcatcgca 600 ttactgatcg ttgccaacca gtacggcctt aatccgtgga cgaaagaaat ttacgccttt 660 cctgataagc agaatggcat cgttccggtg gtgggcgttg atggctggtc ccgcatcatc 720 aatgaaaacc agcagtttga tggcatggac tttgagcagg acaatgaatc ctgtacatgc 780 cggatttacc gcaaggaccg taatcatccg atctgcgtta ccgaatggat ggatgaatgc 840 cgccgcgaac cattcaaaac tcgcgaaggc agagaaatca cggggccgtg gcagtcgcat 900 cccaaacgga tgttacgtca taaagccatg attcagtgtg cccgtctggc cttcggattt 960 gctggtatct atgacaagga tgaagccgag cgcattgtcg aaaatactgc atacactgca 1020 gaacgtcagc cggaacgcga catcactccg gttaacgatg aaaccatgca ggagattaac 1080 actctgctga tcgccctgga taaaacatgg gatgacgact tattgccgct ctgttcccag 1140 atatttcgcc gcgacattcg tgcatcgtca gaactgacac aggccgaagc agtaaaagct 1200 cttggattcc tgaaacagaa agccgcagag cagaaggtgg cagcatgaca ccggacatta 1260 tcctgcagcg taccgggatc gatgtgagag ctgtcgaaca gggggatgat gcgtggcaca 1320 aattacggct cggcgtcatc accgcttcag aagttcacaa cgtgatagca aaaccccgct 1380 ccggaaagaa gtggcctgac atgaaaatgt cctacttcca caccctgctt gctgaggttt 1440 gcaccggtgt ggctccggaa gttaacgcta aagcactggc ctggggaaaa cagtacgaga 1500 acgacgccag aaccctgttt gaattcactt ccggcgtgaa tgttactgaa tccccgatca 1560 tctatcgcga cgaaagtatg cgtaccgcct gctctcccga tggtttatgc agtgacggca 1620 acggccttga actgaaatgc ccgtttacct cccgggattt catgaagttc cggctcggtg 1680 gtttcgaggc cataaagtca gcttacatgg cccaggtgca gtacagcatg tgggtgacgc 1740 gaaaaaatgc ctggtacttt gccaactatg acccgcgtat gaagcgtgaa ggcctgcatt 1800 atgtcgtgat tgagcgggat gaaaagtaca tggcgagttt tgacgagatc gtgccggagt 1860 tcatcgaaaa aatggacgag gcactggctg aaattggttt tgtatttggg gagcaatggc 1920 gatgatgttt tggcggatga gataagattt tcagcctgat acaga 1965 <210> 32 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC45,112 <400> 32 attgttacat tgaaatggct agttattccc cggggcgatt ttcacctcgg ggaaatttta 60 gttggcgttc tcaggtcgag gtggcccggc tc 92 <210> 33 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide ZC45,171 <400> 33 taattgactc attaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaaaa cgattgaatg 60 gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgt 99 <210> 34 <211> 1591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetracycline promoter::tetracycline gene (tetp::tet) PCR fragment amplified with ZC45,112 and ZC45,171 <400> 34 taattgactc attaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaaaa cgattgaatg 60 gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 120 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 180 cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 240 aggccttctc atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag 300 ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc 360 ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc 420 ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg 480 ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt 540 ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg 600 gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 660 gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 720 cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 780 gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 840 ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 900 ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 960 atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca 1020 gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg 1080 tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc 1140 accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc 1200 tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc 1260 gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac 1320 gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact 1380 ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca 1440 tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg 1500 agccgggcca cctcgacctg agaacgccaa ctaaaatttc cccgaggtga aaatcgcccc 1560 ggggaataac tagccatttc aatgtaacaa t 1591 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,357 <400> 35 tcattaagtt agatataaaa aatacatatt ca 32 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,350 <400> 36 taattgttac attgaaatgg ctagttatt 29 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,353 <400> 37 atgaaatcta acaatgcgct catcgtc 27 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,355 <400> 38 tcaggtcgag gtggcccggc tc 22 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,354 <400> 39 tctaccgaga ctttatcgtt tactcct 27 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucletide ZC45,359 <400> 40 ttaaaatgtg tacttaagac cagcagta 28 <210> 41 <211> 1585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the 1584bp PCR fragment amplified with primer set #1 (ZC45,357 and ZC45,350) <400> 41 tcattaagtt agatataaaa aatacatatt caatcattaa aacgattgaa tggagaactt 60 ttattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 120 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 180 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccttc 240 tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 300 ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 360 cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 420 ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 480 gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 540 cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac 600 acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 660 tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 720 cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact 780 gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 840 cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 900 cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 960 cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 1020 ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 1080 ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 1140 tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 1200 gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1260 cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1320 gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 1380 gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt 1440 aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc 1500 cacctcgacc tgagaacgcc aactaaaatt tccccgaggt gaaaatcgcc ccggggaata 1560 actagccatt tcaatgtaac aatta 1585 <210> 42 <211> 1191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the 1190bp PCR fragment amplified with primer set #2 (ZC45,353 and ZC45,355) <400> 42 atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60 ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120 atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180 cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240 cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300 gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360 gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420 ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480 gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540 atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600 agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660 atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720 tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780 ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840 atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900 tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960 caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020 gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080 gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140 tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191 12

Claims (24)

  1. 다음의 작동적으로 연결된 요소를 포함하는 IL-21 단백질을 생산하는 발현 벡터:
    (a) 원핵생물 복제 기원;
    (b) 전사 개시 DNA 요소;
    (c) SEQ ID NO:27에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (d) 전사 종결자.
  2. 제 1 항에 있어서, 선택가능한 마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 선택가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제 1 항에 따르는 발현 벡터로 형질전환된 원핵생물 숙주 세포.
  5. 제 4 항에 있어서, 숙주 세포는 E.Coli 균주 W3110인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  6. 제 5 항에 있어서, 숙주 세포는 특허 기탁 명칭 PTA-4853으로 버지니아주 마나사스의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제 4 항에 있어서, 숙주 세포는 OmpT 프로테아제가 결핍된 균주인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제 7 항에 있어서, 숙주 세포는 OmpT 프로테아제가 결핍된 E.Coli 균주 W3110 인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 다음 단계를 포함하는 IL-21 단백질의 생산방법:
    (a) IL-21이 발현되는 조건 하에서 성장 배지에서 제 4 항에 따르는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 성장 배지로부터 숙주 세포를 회수하는 단계; 및
    (c) 숙주 세포로부터 IL-21 단백질을 단리하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 숙주 세포는 주입 회분식 발효에 의해 배양되는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는,
    (a) 성장 배지에서 5 내지 20의 OD600까지 진탕 플라스크에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) 숙주 세포를 함유하는 진탕 플라스크 배지의 1 내지 12% v/v를 발효 용기에 접종하는 단계;
    (c) 15 시간 경과 발효 시간(EFT) 전에 발효 용기로 공급 용액을 공급하여, pH 6.2 내지 7.2의 성장 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 20 내지 30 시간 EFT에서 발효 용기에 유도제를 첨가하는 단계를 포함하고,
    상기 회수하는 단계는 48 내지 56 시간 EFT에서 숙주 세포를 수확하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 유도제는 0.5 내지 2 mM의 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)인 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 공급 용액은 글리세롤 및 글루코스로 구성되는 군으로부터 선택되는 탄수화물을 성장 배지의 농도로 포함하며, 1시간당 5-15그램의 탄수화물의 성장 배지의 농도 및 공급 속도로 공급하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 글리세롤이 40 내지 70% v/v 글리세롤이거나, 또는 상기 글루코스가 40 내지 70% w/v 글루코스인 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 글리세롤이 70% v/v이거나, 또는 상기 글루코스가 60% w/v인 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는,
    (a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 E.Coli W3110 숙주 세포를 포함하는 접종원, 및 5 g/L 글리세롤을 포함하는 성장 배지를 플라스크에 종균하는 단계;
    (b) 30℃에서 16-20 시간 동안 성장 배지에서 접종원을 배양하는 단계;
    (c) 0.5-5% v/v 접종원 농도에서 성장 배지 중의 배양된 접종원을 회분식 발효기로 옮기는 단계;
    (d) 37℃ 및 pH 6.8에서 2% 글리세롤과 함께 회분식 발효기내를 발효시키는 단계;
    (e) 9.5 g 글루코스/리터/시간의 8 시간 경과 발효 시간(EFT)에서 글루코스 공급을 시작하고, 발효 종료시까지 계속하는 단계;
    (f) 24 시간 EFT에서 최종 농도 0.5 내지 2 mM로 IPTG를 첨가하는 단계; 및
    (g) IPTG의 첨가 후 28 시간 발효시키는 단계를 포함하고,
    상기 회수하는 단계는 발효기로부터 발효 육즙을 수확하는 단계를 포함하고,
    상기 단리하는 단계는 발효 육즙에 동일한 부피의 물을 첨가하는 단계, 및 발효 육즙을 균질화하고 원심분리하여 IL-21 단백질 물질을 포함하는 세포 펠릿 또는 세포 슬러리를 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  17. 제 9 항에 있어서, 상기 IL-21 단백질은 SEQ ID NO:28에 나타낸 아미노산 잔기의 서열을 포함하고, 상기 단리하는 단계는
    (a) 세포 펠릿 또는 세포 슬러리로부터 수 불용성 IL-21 단백질 물질을 분리하는 단계;
    (b) 캐오트로픽 용매에 불용성 IL-21 단백질 물질을 용해하는 단계; 및
    (c) 캐오트로픽 용매를 희석하고, IL-21 단백질을 리폴딩하는 단계를 더 포함하고,
    상기 단리된 IL-21 단백질은 생물학적으로 활성일 수 있는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 단리하는 단계는 여과에 의해 IL-21 리폴딩 단백질로부터 폴딩되지 않고 응집된 단백질을 제거하는 단계를 더 포함하고, 상기 IL-21 단백질의 생산방법은 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법:
    (d) 양이온 교환 컬럼 상에서 IL-21 리폴딩 단백질을 정제하는 단계.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 단리된 IL-21 단백질은 적어도 90% 순도인 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 단리된 IL-21 단백질은 1 mg IL-21 단백질 당 10 내독소 유닛 이하의 내독소 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 IL-21 단백질의 생산방법은 수 불용성 IL-21 단백질 물질을 포함하는 세포 펠릿 또는 세포 슬러리를 발효 육즙으로부터 분리하는 초기 단계를 포함하고,
    상기 분리 단계 (a)는 세포 펠릿 또는 세포 슬러리를 균질화하여 봉입체를 수집하는 단계를 포함하고,
    상기 캐오트로픽 용매는 구아니딘 염을 포함하고,
    상기 캐오트로픽 용매는 아르기닌 염을 포함하는 리폴딩 완충액 및 산화 및 환원 성분의 혼합물의 첨가에 의해 희석되는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법:
    (e) 소수성 상호작용 컬럼 상에서 양이온 교환 컬럼으로부터의 IL-21 단백질의 용출물을 정제하는 단계로서, 이때 단리 및 정제된 IL-21 단백질은 생물학적으로 활성일 수 있는 단계.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 분리 단계 (a)는 세포 펠릿 또는 세포 슬러리를 균질화하여 봉입체를 수집하는 단계를 포함하고,
    상기 용해 단계 (b)는 1 시간 동안 실온에서 6 M 염산 구아니딘, 40 mM 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 캐오트로픽 용매에 불용성 IL-21 단백질을 용해하는 단계를 포함하고,
    상기 희석 및 리폴딩 단계 (c)는,
    (i) 0.75 M 아르기닌, 2 mM DTT/4mM 시스틴 산화-환원 쌍을 포함하는 적어도 20배의 리폴딩 완충액으로 희석함으로써 용액 중에 용해된 봉입체를 리폴딩하는 단계;
    (ii) 20% 아세트산을 이용하여 pH를 5.5로 조절하고, 용액을 적어도 5 시간 동안 반응시키는 단계; 및
    (iii) 리폴딩 완충액의 1.4배 부피의 25 mM 아세테이트, pH 5.5를 이용하여 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
    상기 정제 단계 (e)는
    (a) 용액을 여과하는 단계;
    (b) 아세트산 나트륨 완충액을 이용하여 pH 5.5로 평형화된 수지 컬럼 상에 용액을 로딩하는 단계;
    (c) 0.4 M 염화나트륨을 이용하여 수지 컬럼을 세척하는 단계;
    (d) 0.75 M 염화나트륨을 이용하여 수지 컬럼을 세척하여 결합된 IL-21 단백질을 용출하는 단계;
    (e) 용출물에 1.5 M 의 농도로 황산암모늄을 첨가하고, 용출물 용액을 여과하는 단계;
    (f) 아세트산 나트륨 완충액 중의 1.5 M 황산 암모늄, 0.05 M 염화나트륨으로 평형화된 Tosohaas 부틸 650-M 컬럼 위로 용출물을 로딩하는 단계;
    (g) 아세트산 나트륨 완충액 중의 0.15 M 황산 암모늄, 0.05 M 염화나트륨으로 컬럼을 세척하는 단계;
    (h) 물을 이용하여 30 mS/cm의 전도도로 용출물을 희석하는 단계;
    (i) 아세트산 나트륨 완충액으로 평형화된 SP 세파로오스(Sepharose) HP 컬럼 위로 용출물을 로딩하는 단계;
    (j) 0.3 내지 0.7 M 염화나트륨의 20-컬럼 부피 선형 구배를 이용하여 컬럼을 세척하는 단계;
    (k) IL-21 단백질을 농축하는 단계; 및
    (l) 접선 유동 한외여과를 이용하여 완충액을 조제물 완충액으로 교환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
  24. 제 17 항에 있어서, 생물학적 활성은 IL-21 수용체-결합 세포 분석법을 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 IL-21 단백질의 생산방법.
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