JP5358840B2 - Ｇｆｐ（緑色蛍光蛋白質）の機能賦活・回復方法 - Google Patents

Description

本発明は、不活性ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の機能賦活・回復方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）（以下、ＧＦＰと記載することがある。）、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活したＧＦＰをβ型ゼオライト（ゼオライトベータと記載することがある。）を含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせ、該ＧＦＰ固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性ＧＦＰの機能賦活・回復方法、及び該方法を利用した活性ＧＦＰの製造方法に関するものである。

生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。

タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。

これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。

ところが、ヒト等の高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。

当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。

従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されている。しかし、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多い。現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。

最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを、界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＦｏｌｄＩｔキット）である。

一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを、単に希釈して行くことで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。

透析と希釈の両方に対し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ等の、極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められているに過ぎず（非特許文献２参照）、この方法は、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。

リフォールディングに、ゲル濾過、又はサイズ排除カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは、必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。

構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それが、ある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。

また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ 、ＤｓｂＡ（大腸菌のｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰＰＩ （ｈｕｍａｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こることも報告されている（非特許文献５参照）。しかしながら、これについては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑で、コスト高となるという問題もある。

カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。該方法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑で、コスト高となることは、前記方法と同じである。

人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程で、タンパク質が巻き戻るとの報告もある（非特許文献７〜９参照）。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ等で成功しているに過ぎない。しかも、この方法は、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。

一方、本発明者らは、これまで、ＺＳＭゼオライトやゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、１１、特許文献１、２参照）等のゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象（非特許文献１２参照）について、研究を続けてきた過程で、ゼオライトベータを用いたタンパク質巻き戻し材料を開発することに成功した（特許文献３）。

前述のように、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現系は、コスト、スケールアップの容易さ等から、医学的、産業的に有用なタンパク質を大量に生産する技術として最も注目される重要技術となっている。しかしながら、外来タンパク質を大量に発現させると、しばしば異常な立体構造を持ち、活性のないタンパク質が封入体として菌体内に蓄積する現象が観察される。そこで、該封入体から正しい立体構造及び活性を持ったタンパク質を得るためのリフォールディング技術の発展が望まれている。

リフォールディングを行う際には、バッファーｐＨ、温度、添加剤の種類等、タンパク質ごとに条件検討を行う必要がある。また、分泌タンパク質等には、立体構造の安定化にシステイン残基間のＳ−Ｓ結合を必要とするものがあり、その場合、リフォールディングによる正しい立体構造の形成に加え、適切なＳ−Ｓ結合の形成が必要となる。

本発明者らは、これまで、ゼオライトベータを用いて、タンパク質のリフォールディングを効率よく行わせることに成功し、更に、ゼオライトを用いたタンパク質のリフォールディングにおける汎用性の検討の一環として、各種不活性タンパク質の機能賦活・回復化を種々試みてきた。しかし、リフォールディング技術は適用可能なタンパク質が特定のものに限られており、リフォールディング技術が有効か否かは適用対象のタンパク質との関係で好適な条件が設定し得るか否かにかかっている。ゼオライトベータによるリフォールディング技術を含めて、ＧＦＰについては、従来法では高効率のリフォールディング手法が確立されておらず、当技術分野では、該ＧＦＰのリフォールディングを可能とする新しいリフォールディング手法の開発が強く要請されていた。

特開平６−１２７９３７号公報 特開平８−３１９１１２号公報 ＷＯ２００５／００５４５９ Ａ１ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２１０（１９９３）１７９−１８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８（１９９９）：１４７５−１４８３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７） ３５７６−３５７８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１７（１９９９）１８７−１９１ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５ Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）８４２−８４５ Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，Ｖｏｌ．８（１９９６）５１７−５２０ Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７（２００１）１５５５−１５６０

このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、不活性ＧＦＰの機能賦活・回復方法として有用な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、β型ゼオライトを含むリフォールディングバッファーを用いた新しい不活性ＧＦＰの機能賦活・回復方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、不活性ＧＦＰの機能賦活・回復方法及び該方法を用いた活性ＧＦＰの製造方法を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の機能を賦活・回復する方法であって、１）該ＧＦＰに、β型ゼオライト、及び少なくとも酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、ＧＦＰのリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記リフォールディングバッファーとしてＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いること、３）それにより発色団が形成され活性が回復するまでゼオライトとともにインキュベーションすることによりリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させること、を特徴とするＧＦＰの機能賦活・回復方法。
（２）β型ゼオライトが、ＮＨ_４ ^＋若しくはＮａ^＋フォームにしたゼオライトである、前記（１）に記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法。
（３）ＧＦＰが、不活性乃至低活性のＧＦＰである、前記（１）又は（２）に記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性ＧＦＰに適用して機能を賦活・回復させた活性ＧＦＰを回収することを特徴とする活性ＧＦＰの製造方法。

次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の機能を賦活・回復する方法であって、ＧＦＰに、β型ゼオライトを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、ＧＦＰのリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、β型ゼオライトが、ＮＨ_４ ^＋又はＮａ^＋フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。

また、本発明では、アルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いること、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させること、を実施の態様としている。更に、本発明は、上記のＧＦＰの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性ＧＦＰに適用して機能を賦活・回復させた活性ＧＦＰを回収することからなる活性ＧＦＰの製造方法の点に特徴を有するものである。

本発明では、機能賦活の対象として、例えば、不活性乃至低活性のＧＦＰ、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したＧＦＰが用いられる。本発明では、これらのＧＦＰをゼオライトベータ（β型ゼオライト）で処理して該ＧＦＰの立体構造をリフォールディングすることにより、該ＧＦＰ固有の本来機能の賦活・回復を行う。

賦活操作は、通常、該ＧＦＰを、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該ＧＦＰをゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。

本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び、例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。

ゼオライトベータに吸着前のＧＦＰの分散溶媒としては、好適には、例えば、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該ＧＦＰと反応を起こさないもの、及び、該ＧＦＰの立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールを挙げることができる。

該ＧＦＰの吸脱着は、一般には、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、で行われる。

この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００やＦｉｃｏｌ１４００等を挙げることができる。

また、該ＧＦＰの脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には該ＧＦＰの脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該ＧＦＰの脱着を促す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤やハロゲン化アルカリ等の塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィーでの溶離に用いられるもの等、種々のものが使用可能である。

以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２．参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータが挙げられる。

該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該ゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。

該ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性ＧＦＰの活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。

該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性ＧＦＰのリフォールディング剤となり得ることは同様である。

本発明では、リフォールディング剤は、ＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータ単味、又はゼオライトベータとそれを支持する基材（支持体）とから構成することができる。前者は、支持体無しで、後者は、支持体付きである。一般的に言って、ゼオライトという物質は、自己焼結性が乏しいため、単味単独では成形しにくいことが多いので、リフォールディング剤の作製、すなわち形態・形状の設計・制御に関しては、前者に比べ後者が、予め形が整えられた支持体上にゼオライトベータを固定・被覆すること等が可能なため、自由度が高く、有利である。

該ゼオライトベータの形態・形状につては、例えば、チップ状、膜状、ペレット状、ビーズ状等、該ゼオライトベータの利用方法・使用形態に応じて、適宜選定される。特に、支持体付き該ゼオライトベータでは、ゼオライトベータの固定・被覆を種々の形状、例えば、板、球、円筒、チューブ、カラム、溝、Ｕ字路等の支持体上に、前記方法等で行うことができるので、該ゼオライトベータの形状を如何様にも所望の形にすることができるという利点がある。この場合の支持体については、ガラス、石英、アルミナ、シリカ、コージェライトやムライト等の種々のセラミックス、濾紙等のセルロース、テフロン（登録商標）、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ペット）等、種々の有機ポリマーを挙げることができる。

本発明において、変性還元ＧＦＰは、ゼオライトと混ぜると、急速に吸着される。また、６Ｍの高濃度のＧｄｎ−ＨＣｌ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）存在下においても変性還元ＧＦＰは強く吸着される。酸化還元剤の有無にかかわらず、リフォールディングバッファー中にＧＦＰが回収されるが、このことは、まず、ＧＦＰが凝集しない正しい立体構造を持った状態で溶出されることを示唆している。

ＧＦＰのリフォールディングバッファーとしては、アルギニン、ＰＥＧ及び還元剤を添加したリフォールディングバッファーが用いられる。９３０ＮＨＡ（ＮＨ_４ ^＋）に対する変性ＧＦＰの吸着量は、おおよそ５０ｍｇ／ｇ ｚｅｏｌｉｔｅである。また、９３０ＮＨＡに対して、ＧＦＰは、速やかに吸着し、吸着時間は１時間で十分である。また、リフォールディング時間は、ＧＦＰを回収するためには４時間程度で十分であるが、活性を回復させる（発色団を形成させる）ためには、約１６時間以上必要である。

約８時間以降では、回収率は下がっていくので、回収ができ、高い活性を得るには１６時間程度リフォールディングさせる必要がある。ＧＦＰは、リフォールド開始後約４時間で剥がれてくるが、活性が回復する約１６時間までｚｅｏｌｉｔｅとともにインキュベートすることが必要である。また、リフォールディングバッファー量は、少なすぎると高い活性は得られず、多すぎると濃度が低すぎてＧＦＰを回収できないため、ＧＦＰ吸着量１ｍｇ（最大吸着量の約５０％）に対して１〜２ｍｌが好適である。

アルギニン添加により、ＧＦＰの回収率が増加し、また、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）と相乗効果を示す。このことから、アルギニンは、ゼオライトによるリフォールディングにおいても、ＧＦＰの凝集防止に有効であり、ＰＥＧと組み合わせることにより、更に、多くのＧＦＰを回収することができる。

本発明により、次のような効果が奏される。
（１）β型ゼオライトを用いた変性ＧＦＰの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
（２）変性ＧＦＰの活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
（３）活性ＧＦＰの回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
（４）アルギニン及びＰＥＧとを組み合わせて、活性ＧＦＰの回収率を向上させたＧＦＰのリフォールディング方法を提供することができる。
（５）封入体としての活性のないＧＦＰから正しい立体構造及び活性を持った活性ＧＦＰを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
（６）他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性ＧＦＰのリフォールディング技術を提供することができる。
（７）希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

（９６ｗｅｌｌプレートを用いたＧＦＰリフォールディング条件の検討）
本実施例では、９６ｗｅｌｌプレートを用いて、９６通りの条件を振り、ＧＦＰのリフォールディング条件を調べた。

（１）材料
試験材料として、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，３０ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，１ｍｇ／ｍｌ，１ｍｌ
変性ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５

リフォールディングｂｕｆｆｅｒとして、以下の基本ｂｕｆｆｅｒに、０．５Ｍ Ａｒｇ＋０．５％ＰＥＧ２０，０００を加えたもの、又は０．５Ｍ Ａｒｇ＋０．５％ＰＥＧ２０，０００＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたもの、を用いた。
（基本ｂｕｆｆｅｒ）
・５０ｍＭ ＭＥＳ−Ｎａ ｐＨ６．５
・５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
・５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０
・５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５

Ｒｅｄｏｘ ｒｅａｇｅｎｔとして、以下の材料を用いた。
・１０ｍＭ ２−ＭＥ
・１０ｍＭ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＋ １ ｍＭ Ｃｙｓｔｉｎｅ
また、Ａｄｄｉｔｉｖｅとして、以下の材料を用いた。
・２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
・１Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣＬ
・０．５Ｍ ＮａＣｌ
・０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０
・１ｍＭ ＥＤＴＡ
これらのｆａｃｔｏｒを考慮に入れてマトリクス（表３）を作成した。

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを３０ｍｇずつ９６ｗｅｌｌのディープウェルプレートに測り取り、１ｍｌの変性ｂｕｆｆｅｒを加えて平衡化した。３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清を捨てた。１ｍｇ／ｍｌの変性ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）を１ｍｌ加え、ディープウェルにしっかりとフタをし、上下反転させてｚｅｏｌｉｔｅを十分に懸濁した後、ローテーターで１時間回転させてｚｅｏｌｉｔｅにＧＦＰを吸着させた。

３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌで計５回ｗａｓｈし、５回目の洗浄で上清を除いた後、更に３，０００ｒｐｍで１分遠心して、残っている液をできるだけ除いた。１ｍｌのリフォールディングバッファーを加え、フタをしてボルテックスで混合した。４℃で一晩回転させてリフォールドさせた。３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清の活性測定を行った。

活性測定は、ＣＯＲＯＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−８０００を用いて、Ｅｘ：４８６ｎｍ，Ｅｍ：５１１ｎｍで蛍光強度を測定した。可溶性ＧＦＰ溶液をリフォールディングバッファーで希釈して、０，１．８７５，３．７５，７．５，１５，３０，６０μｇ／ｍｌのときの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｓａｍｐｌｅは、そのまま測定した。活性の高かったｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ及びｓｔａｎｄａｒｄ（変性ＧＦＰ）をＴＣＡ沈澱してから、ＢＣＡ法でタンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した。

（３）結果
その結果を図１に示す。表１に、蛍光強度を示す。表２に、活性の高かったＣ１，Ｃ７，Ｅ１，Ｅ４，Ｅ７，Ｅ１０，Ｇ１，Ｇ４，Ｇ７，Ｇ１０，Ｈ３及びＨ９のタンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した結果を示す。また、表３に、上記ｆａｃｔｏｒを考慮に入れて作成したマトリックスを示す。

Ｅ７及びＥ１０の回収率、活性回復率が最も良好であった。Ｅ７とＥ１０は、条件がほぼ同じであり、Ｅ７のバッファーにＲｅｄｏｘ ｒｅａｇｅｎｔであるＣｙｓｔｅｉｎｅ／Ｃｙｓｔｉｎｅを添加したものがＥ１０である。ＧＦＰは、Ｓ−Ｓ結合がないので、Ｒｅｄｏｘ ｒｅａｇｅｎｔは必要がないこと、ＧＦＰのリフォールディングの好適条件は、以下のとおりであり、回収率は３８．８％及び活性回復率は２６．９％であった。

（ＧＦＰのリフォールディング条件）
ｐＨ８．０
０．５Ｍ Ａｒｇ
０．５％ ＰＥＧ２０，０００
０．５Ｍ ＮａＣｌ
１０ｍＭ ２−ＭＥ

（９３０ＮＨＡ（ＮＨ４^＋）に対するＧＦＰの吸着等温線）
９３０ＮＨＡ（ＮＨ４^＋）に対して、変性ＧＦＰがどれくらい吸着するか調べた。

（１）材料
試験材料として、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，２５ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，１ｍｌ
ｓｏｌｖｅｎｔ：変性グアニジンｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ）
ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：５，４．１８，３．１４，２．０９，１．０５，０．５２３，０．２６１ｍｇ／ｍｌ

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを正確に２５ｍｇずつ２ｍｌチューブに測り取り（２連）、各ＧＦＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌを加えてｖｏｒｔｅｘで混合した。３ｈローテーターで回転させて、ｚｅｏｌｉｔｅにＧＦＰを吸着させた。最高回転数で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清のタンパク濃度をＢＣＡ法で測定した。元のＧＦＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎをｓｔｒａｎｄａｒｄとして、タンパク濃度と吸着量から、吸着等温線を作成した。

（３）結果
図２に、その結果を示す。９３０ＮＨＡ（ＮＨ４^＋）に対する変性ＧＦＰの吸着量は、およそ５０ｍｇ／ｇ ｚｅｏｌｉｔｅであった。

（９３０ＮＨＡ（ＮＨ４^＋）に対するＧＦＰの吸着速度）
本実施例では、９３０ＮＨＡ（ＮＨ４^＋）に対して、変性ＧＦＰがどれくらいの速度で吸着するか調べた。

（１）材料
試験材料として、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，１０ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，２ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｌ
ｓｏｌｖｅｎｔ：変性グアニジンｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ）

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを正確に１０ｍｇずつ１．５ｍｌチューブに測り取り（３連）、ｚｅｏｌｉｔｅに変性ｂｕｆｆｅｒ ０．５ｍｌを加え、５分ローテーターで回して平衡化させた。最高回転数で５分遠心してｂｕｆｆｅｒを除去し、ＧＦＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを加えてｖｏｒｔｅｘで混合した。

ローテーターで回転させて（室温）、ｚｅｏｌｉｔｅにタンパクを吸着させ、１０，２０，３０，４５，６０，９０及び１２０分後にサンプリングした。最高回転数で５分遠心分離し、上清のタンパク濃度をＢＣＡで測定した。元のＧＦＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎをｓｔａｎｄａｒｄとした。尚、９３０ＮＨＡに対するＧＦＰの吸着量：５０ｍｇ／ｇ

（３）結果
図３に、その結果を示す。この結果から、９３０ＮＨＡに対して、ＧＦＰは速やかに吸着し、吸着時間は１時間で十分であることが分かった。

（リフォールディング時間による９３０ＮＨＡのＧＦＰリフォールディング効率）
本実施例では、９３０ＮＨＡ−ＮＨ４によるＧＦＰリフォールディングにおいて、高い回収率及び活性回復率の得られるリフォールディング時間を調べた。

（１）材料
材料は、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，５０ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，１ｍｇ／ｍｌ，１ｍｌ
変性ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
リフォールディングｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．５Ｍ Ａｒｇ，１０ｍＭ ２−ＭＥ

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを５０ｍｇずつ１０ｍｌチューブに測り取り（ｎ＝３）、ｚｅｏｌｉｔｅに変性ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを加え、５分ローテーターで回して平衡化した。３，０００ｒｐｍ、５分遠心してｂｕｆｆｅｒを除去し、変性ＧＦＰ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌずつ分注した。１時間以上ローテーターで回転させてｚｅｏｌｉｔｅにＧＦＰを吸着させ、最高回転数で１０分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をＢＣＡ法で測定して、未吸着量を算出した。

５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で５ｍｌ×４回ｗａｓｈした。リフォールディングｂｕｆｆｅｒを２ｍｌ加えて（０．５ ｍｇ／ｍｌ）、４℃で回転させてリフォールディングさせ、１，２，４，８，１６，２４，４８時間後にサンプリングした。３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清の活性測定を行った。活性測定は、ＣＯＲＯＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−８０００を用いて、Ｅｘ：４８６ｎｍ，Ｅｍ：５１１ｎｍで蛍光強度を測定した。

可溶性ＧＦＰ溶液をリフォールディングバッファーで希釈して、０，１．８７５，３．７５，７．５，１５，３０，６０μｇ／ｍｌのときの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。リフォールディングｓａｍｐｌｅは、そのまま測定した。リフォールディングｓａｍｐｌｅ及びｓｔａｎｄａｒｄ（変性ＧＦＰ）をＴＣＡ沈澱してから、ＢＣＡ法でタンパク濃度を測定した。回収率及び活性回復率を算出した。

（３）結果
図４に、その結果を示す。この結果から、リフォールディング時間は、ＧＦＰを回収するためには４時間で十分であるが、活性を回復させる（発色団を形成させる）ためには、１６時間以上必要であることが分かった。８時間以降回収率は下がっていくので、回収もでき高い活性も得るには１６時間リフォールディングさせることが好適と考えられる。８時間以降回収率が下がって行くのは、共存するｚｅｏｌｉｔｅの影響であるかもしれないことを考慮して、ｚｅｏｌｉｔｅからＧＦＰが剥がれた後にｚｅｏｌｉｔｅを除去して、上清のみインキュベートして確認することにした。

（リフォールディング時間（１ｏｒ４時間後ｚｅｏｌｉｔｅ除去）による９３０ＮＨＡのＧＦＰリフォールディング効率）
本実施例では、９３０ＮＨＡ−ＮＨ４によるＧＦＰリフォールディングにおいて、リフォールディング８時間以降回収率を下げないために、リフォールディング開始１時間又は４時間後にｚｅｏｌｉｔｅを除去することが有効か調べた。

（１）材料
試験材料として、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，５０ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，１ｍｇ／ｍｌ，１ｍｌ
変性ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
リフォールディングｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ ＰＥＧ２００００，０．５Ｍ Ａｒｇ，１０ｍＭ ２−ＭＥ

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを５０ｍｇずつ１０ｍｌチューブに測り取り（ｎ＝３）、ｚｅｏｌｉｔｅに変性ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを加え、５分ローテーターで回して平衡化した。３，０００ｒｐｍ、５分遠心してｂｕｆｆｅｒを除去し、変性ＧＦＰ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌずつ分注した。１時間以上ローテーターで回転させてｚｅｏｌｉｔｅにＧＦＰを吸着させ、最高回転数で１０分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をＢＣＡ法で測定して、未吸着量を算出した。

５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で５ｍｌ×４回ｗａｓｈし、リフォールディングｂｕｆｆｅｒを２ｍｌ加えて（０．５ｍｇ／ｍｌ）、４℃で回転させてリフォールディングさせた。１又は４時間後にｚｅｏｌｉｔｅを除去して、その後は上清のみインキュベートして、１，２，４，８，１６，２４，４８時間後にサンプリングし、３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清の活性測定を行った。活性測定は、ＣＯＲＯＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−８０００を用いて、Ｅｘ：４８６ｎｍ，Ｅｍ：５１１ｎｍで蛍光強度を測定した。

可溶性ＧＦＰ溶液をリフォールディングバッファーで希釈して、０，１．８７５，３．７５，７．５，１５，３０，６０μｇ／ｍｌのときの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。リフォールディングｓａｍｐｌｅは、そのまま測定した。リフォールディングｓａｍｐｌｅ及びｓｔａｎｄａｒｄ（変性ＧＦＰ）をＴＣＡ沈澱してから、ＢＣＡ法でタンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した。

（３）結果
図５に、その結果を示す。これらの結果から、タンパクが剥がれてからｚｅｏｌｉｔｅを除去して上清のみインキュベートすると、ｚｅｏｌｉｔｅとともにインキュベートしたときと比べて、回収率及び活性ともに低下すことが分かった。ＧＦＰは、リフォールド開始後４時間で剥がれてはくるが、活性が回復する１６時間までｚｅｏｌｉｔｅとともにインキュベートすることがよいと考えられる。

（吸着量及びリフォールディングバッファー量による９３０ＮＨＡのＧＦＰリフォールディング効率）
本実施例では、９３０ＮＨＡ−ＮＨ４によるＧＦＰリフォールディングにおいて、高い回収率及び活性回復率の得られる吸着量及びリフォールディングバッファー量を調べた。

（１）材料
試験材料として、以下の材料を用いた。
ｚｅｏｌｉｔｅ：９３０ＮＨＡ（東ソー）；ＮＨ４型，５０ｍｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：変性ＧＦＰ溶液，０．５，１，２ｍｇ／ｍｌ，１ ｍｌ
変性ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，６Ｍグアニジン，０．５Ｍ ＮａＣｌ
ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
リフォールディングｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．５ＭＮａＣｌ，０．５％ ＰＥＧ２００００，０．５Ｍ Ａｒｇ，１０ｍＭ ２−ＭＥ

（２）方法
ｚｅｏｌｉｔｅを５０ｍｇずつ２ｍｌチューブ（リフォールディングｂｕｆｆｅｒ ０．５，１，１．５ｍｌ）又は１０ｍｌチューブ（リフォールディングｂｕｆｆｅｒ ２，３，４ｍｌ）に測り取り（ｎ＝３）、ｚｅｏｌｉｔｅに変性ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを加え、５分ローテーターで回して平衡化した。３，０００ｒｐｍ、５分遠心してｂｕｆｆｅｒを除去し、変性ＧＦＰ溶液（０．５、１、２ ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌずつ分注した。１時間以上ローテーターで回転させてｚｅｏｌｉｔｅにＧＦＰを吸着させ、最高回転数で１０分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をＢＣＡ法で測定して、未吸着量を算出した。

５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５でｗａｓｈした（２ｍｌチューブは１．５ ｍｌ×４回、１０ｍｌチューブは５ｍｌ×４回）。リフォールディングｂｕｆｆｅｒを、０．５、１、１．５、２、３又は４ｍｌ加えて、４℃で１６時間回転させてリフォールディングさせた。３，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清の活性測定を行った。活性測定は、ＣＯＲＯＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ−８０００を用いて、Ｅｘ：４８６ｎｍ，Ｅｍ：５１１ｎｍで蛍光強度を測定した。

可溶性ＧＦＰ溶液をリフォールディングｂｕｆｆｅｒで希釈して、０，１．８７５，３．７５，７．５，１５，３０，６０μｇ／ｍｌのときの蛍光強度を測定し、検量線を作成した。リフォールディングｓａｍｐｌｅは、そのまま測定した。リフォールディングｓａｍｐｌｅ及びｓｔａｎｄａｒｄ（変性ＧＦＰ）をＴＣＡ沈澱してから、ＢＣＡ法でタンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した。

（３）結果
図６〜９に、その結果を示す。これらの結果から、ｒｅｆｏｌｄｉｎｇバッファー量は、少なすぎると高い活性は得られず、多すぎると濃度が低すぎて回収できないため、１〜２ｍｌがよいことが分かった。吸着量については、回収率と活性で一長一短があるが、ｚｅｏｌｉｔｅ ５０ｍｇに対して１ｍｇ（最大吸着量の約５０％）が好適と考えられる。

以上詳述したように、本発明は、ＧＦＰの機能賦活・回復方法に係るものであり、本発明により、β型ゼオライトを用いた変性ＧＦＰの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。本発明により、封入体としての活性のないＧＦＰから正しい立体構造及び活性を持った活性ＧＦＰを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性ＧＦＰのリフォールディング技術を提供することを可能にするものとして有用である。

蛍光強度を測定した結果を示す。 蛋白質濃度と吸着量の関係を示す。 吸着時間と吸着量の関係を示す。 リフォールディング時間とＧＦＰリフォールディング効率の関係を示す。 リフォールディング時間とｓＧＦＰ回収率の関係を示す。 リフォールディング時間とｓＧＦＰ全活性の関係を示す。 ＧＦＰ吸着量によるｂｕｆｆｅｒ量と回収濃度の関係を示す。 ＧＦＰ吸着量によるｂｕｆｆｅｒ量と回収率の関係を示す。 ＧＦＰ吸着量によるｂｕｆｆｅｒ量と全活性の関係を示す。

Claims (4)

1. ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の機能を賦活・回復する方法であって、１）該ＧＦＰに、β型ゼオライト、及び少なくとも酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、ＧＦＰのリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させること、２）その際に、上記リフォールディングバッファーとしてＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いること、３）それにより発色団が形成され活性が回復するまでゼオライトとともにインキュベーションすることによりリフォールディングを行いＧＦＰの機能を賦活・回復させること、を特徴とするＧＦＰの機能賦活・回復方法。
2. β型ゼオライトが、ＮＨ_４ ^＋若しくはＮａ^＋フォームにしたゼオライトである、請求項１に記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法。
3. ＧＦＰが、不活性乃至低活性のＧＦＰである、請求項１又は２に記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のＧＦＰの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性ＧＦＰに適用して機能を賦活・回復させた活性ＧＦＰを回収することを特徴とする活性ＧＦＰの製造方法。