JP2009126829A - Gfp(緑色蛍光蛋白質)の機能賦活・回復方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】GFP(緑色蛍光蛋白質)の機能を賦活・回復する方法であって、GFPに、β型ゼオライトを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、GFPのリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させることからなるGFPの機能賦活・回復方法、及び上記のGFPの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性GFPに適用して機能を賦活・回復させた活性GFPを回収することからなる活性GFPの製造方法。
【効果】β型ゼオライトを用いた変性GFPの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
【選択図】図2
Description
(1)GFP(緑色蛍光蛋白質)の機能を賦活・回復する方法であって、該GFPに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、GFPのリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させることを特徴とするGFPの機能賦活・回復方法。
(2)β型ゼオライトが、NH4 +若しくはNa+フォームにしたゼオライトである、前記(1)に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
(3)アルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いる、前記(1)に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
(4)PEG(ポリエチレングリコール)とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させる、前記(1)に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
(5)GFPが、不活性乃至低活性のGFPである、前記(1)から(4)のいずれかに記載のGFPの機能賦活・回復方法。
(6)前記(1)から(5)のいずれかに記載のGFPの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性GFPに適用して機能を賦活・回復させた活性GFPを回収することを特徴とする活性GFPの製造方法。
本発明は、GFP(緑色蛍光蛋白質)の機能を賦活・回復する方法であって、GFPに、β型ゼオライトを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、GFPのリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、β型ゼオライトが、NH4 +又はNa+フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。
(1)β型ゼオライトを用いた変性GFPの新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
(2)変性GFPの活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
(3)活性GFPの回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
(4)アルギニン及びPEGとを組み合わせて、活性GFPの回収率を向上させたGFPのリフォールディング方法を提供することができる。
(5)封入体としての活性のないGFPから正しい立体構造及び活性を持った活性GFPを得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
(6)他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性GFPのリフォールディング技術を提供することができる。
(7)希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
本実施例では、96wellプレートを用いて、96通りの条件を振り、GFPのリフォールディング条件を調べた。
試験材料として、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,30mg
protein solution:変性GFP溶液,1mg/ml,1ml
変性buffer:20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl
wash buffer:1mM Tris−HCl pH7.5
(基本buffer)
・50mM MES−Na pH6.5
・50mM Tris−HCl pH7.5
・50mM Tris−HCl pH8.0
・50mM Tris−HCl pH8.5
・10mM 2−ME
・10mM Cysteine + 1 mM Cystine
また、Additiveとして、以下の材料を用いた。
・20% Glycerol
・1M Gdn−HCL
・0.5M NaCl
・0.5% Tween20
・1mM EDTA
これらのfactorを考慮に入れてマトリクス(表3)を作成した。
zeoliteを30mgずつ96wellのディープウェルプレートに測り取り、1mlの変性bufferを加えて平衡化した。3,000rpmで5分遠心分離して上清を捨てた。1mg/mlの変性GFP(緑色蛍光蛋白質)を1ml加え、ディープウェルにしっかりとフタをし、上下反転させてzeoliteを十分に懸濁した後、ローテーターで1時間回転させてzeoliteにGFPを吸着させた。
その結果を図1に示す。表1に、蛍光強度を示す。表2に、活性の高かったC1,C7,E1,E4,E7,E10,G1,G4,G7,G10,H3及びH9のタンパク濃度を測定し、回収率及び活性回復率を算出した結果を示す。また、表3に、上記factorを考慮に入れて作成したマトリックスを示す。
pH8.0
0.5M Arg
0.5% PEG20,000
0.5M NaCl
10mM 2−ME
930NHA(NH4+)に対して、変性GFPがどれくらい吸着するか調べた。
試験材料として、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,25mg
protein solution:変性GFP溶液,1ml
solvent:変性グアニジンbuffer(20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl)
protein concentration:5,4.18,3.14,2.09,1.05,0.523,0.261mg/ml
zeoliteを正確に25mgずつ2mlチューブに測り取り(2連)、各GFP solution 1mlを加えてvortexで混合した。3hローテーターで回転させて、zeoliteにGFPを吸着させた。最高回転数で10min遠心分離し、上清のタンパク濃度をBCA法で測定した。元のGFP solutionをstrandardとして、タンパク濃度と吸着量から、吸着等温線を作成した。
図2に、その結果を示す。930NHA(NH4+)に対する変性GFPの吸着量は、およそ50mg/g zeoliteであった。
本実施例では、930NHA(NH4+)に対して、変性GFPがどれくらいの速度で吸着するか調べた。
試験材料として、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,10mg
protein solution:変性GFP溶液,2mg/ml,0.5ml
solvent:変性グアニジンbuffer(20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl)
zeoliteを正確に10mgずつ1.5mlチューブに測り取り(3連)、zeoliteに変性buffer 0.5mlを加え、5分ローテーターで回して平衡化させた。最高回転数で5分遠心してbufferを除去し、GFP solution(2mg/ml)0.5mlを加えてvortexで混合した。
図3に、その結果を示す。この結果から、930NHAに対して、GFPは速やかに吸着し、吸着時間は1時間で十分であることが分かった。
本実施例では、930NHA−NH4によるGFPリフォールディングにおいて、高い回収率及び活性回復率の得られるリフォールディング時間を調べた。
材料は、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,50mg
protein solution:変性GFP溶液,1mg/ml,1ml
変性buffer:20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl
wash buffer:1mM Tris−HCl pH7.5
リフォールディングbuffer:20mM Tris−HCl pH8.0,0.5M Arg,10mM 2−ME
zeoliteを50mgずつ10mlチューブに測り取り(n=3)、zeoliteに変性buffer 1mlを加え、5分ローテーターで回して平衡化した。3,000rpm、5分遠心してbufferを除去し、変性GFP溶液(1mg/ml)を1mlずつ分注した。1時間以上ローテーターで回転させてzeoliteにGFPを吸着させ、最高回転数で10分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をBCA法で測定して、未吸着量を算出した。
図4に、その結果を示す。この結果から、リフォールディング時間は、GFPを回収するためには4時間で十分であるが、活性を回復させる(発色団を形成させる)ためには、16時間以上必要であることが分かった。8時間以降回収率は下がっていくので、回収もでき高い活性も得るには16時間リフォールディングさせることが好適と考えられる。8時間以降回収率が下がって行くのは、共存するzeoliteの影響であるかもしれないことを考慮して、zeoliteからGFPが剥がれた後にzeoliteを除去して、上清のみインキュベートして確認することにした。
本実施例では、930NHA−NH4によるGFPリフォールディングにおいて、リフォールディング8時間以降回収率を下げないために、リフォールディング開始1時間又は4時間後にzeoliteを除去することが有効か調べた。
試験材料として、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,50mg
protein solution:変性GFP溶液,1mg/ml,1ml
変性buffer:20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl
wash buffer:1mM Tris−HCl pH7.5
リフォールディングbuffer:20mM Tris−HCl pH8.0,0.5M NaCl,0.5% PEG20000,0.5M Arg,10mM 2−ME
zeoliteを50mgずつ10mlチューブに測り取り(n=3)、zeoliteに変性buffer 1mlを加え、5分ローテーターで回して平衡化した。3,000rpm、5分遠心してbufferを除去し、変性GFP溶液(1mg/ml)を1mlずつ分注した。1時間以上ローテーターで回転させてzeoliteにGFPを吸着させ、最高回転数で10分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をBCA法で測定して、未吸着量を算出した。
図5に、その結果を示す。これらの結果から、タンパクが剥がれてからzeoliteを除去して上清のみインキュベートすると、zeoliteとともにインキュベートしたときと比べて、回収率及び活性ともに低下すことが分かった。GFPは、リフォールド開始後4時間で剥がれてはくるが、活性が回復する16時間までzeoliteとともにインキュベートすることがよいと考えられる。
本実施例では、930NHA−NH4によるGFPリフォールディングにおいて、高い回収率及び活性回復率の得られる吸着量及びリフォールディングバッファー量を調べた。
試験材料として、以下の材料を用いた。
zeolite:930NHA(東ソー);NH4型,50mg
protein solution:変性GFP溶液,0.5,1,2mg/ml,1 ml
変性buffer:20mM Tris−HCl pH7.5,6Mグアニジン,0.5M NaCl
wash buffer:1mM Tris−HCl pH7.5
リフォールディングbuffer:20mM Tris−HCl pH8.0,0.5MNaCl,0.5% PEG20000,0.5M Arg,10mM 2−ME
zeoliteを50mgずつ2mlチューブ(リフォールディングbuffer 0.5,1,1.5ml)又は10mlチューブ(リフォールディングbuffer 2,3,4ml)に測り取り(n=3)、zeoliteに変性buffer 1mlを加え、5分ローテーターで回して平衡化した。3,000rpm、5分遠心してbufferを除去し、変性GFP溶液(0.5、1、2 mg/ml)を1mlずつ分注した。1時間以上ローテーターで回転させてzeoliteにGFPを吸着させ、最高回転数で10分遠心分離し、上清の未吸着タンパク濃度をBCA法で測定して、未吸着量を算出した。
図6に、その結果を示す。これらの結果から、refoldingバッファー量は、少なすぎると高い活性は得られず、多すぎると濃度が低すぎて回収できないため、1〜2mlがよいことが分かった。吸着量については、回収率と活性で一長一短があるが、zeolite 50mgに対して1mg(最大吸着量の約50%)が好適と考えられる。
Claims (6)
- GFP(緑色蛍光蛋白質)の機能を賦活・回復する方法であって、該GFPに、β型ゼオライト、及び酸化還元剤を含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、GFPのリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させることを特徴とするGFPの機能賦活・回復方法。
- β型ゼオライトが、NH4 +若しくはNa+フォームにしたゼオライトである、請求項1に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
- アルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いる、請求項1に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
- PEG(ポリエチレングリコール)とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行いGFPの機能を賦活・回復させる、請求項1に記載のGFPの機能賦活・回復方法。
- GFPが、不活性乃至低活性のGFPである、請求項1から4のいずれかに記載のGFPの機能賦活・回復方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載のGFPの機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性GFPに適用して機能を賦活・回復させた活性GFPを回収することを特徴とする活性GFPの製造方法。
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