JP2011046686A - タンパク質リフォールディング条件設定キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】BEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤と、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分と、リフォールディング制御因子としてのタンパク質S−S架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの1種以上を含む組み合わせと、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管もしくは試験プレートと、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うことを可能とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。
【効果】上記リフォールディング条件設定キットを用いることは、High−throughputのタンパク質リフォールディング スクリーニング手法及びシステムを提供することができる。
【選択図】図1
Description
(1)高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の高次構造を整えて活性型にするタンパク質のリフォールディング操作・工程を実施する際に、好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に導き出すことができるタンパク質リフォールディング条件設定キットであって、
タンパク質変性剤により変性状態となって可溶化しているタンパク質を、変性剤中で吸着する担体として機能するBEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を必須構成成分とし、
該BEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分である、純水成分又はpH調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質S−S架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの1種以上を含む組み合わせから構成され、
更に、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うキット製品であることを特徴とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(2)BEA構造ゼオライトの骨格構造が、酸素と、それ以外の1種又は2種以上の元素からなる、あるいは、ケイ素と酸素又はケイ素とアルミニウムと酸素のみからなる、前記(1)に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(3)BEA構造ゼオライトが、NH4 +もしくはNa+フォームにしたゼオライトである、前記(1)又は(2)に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(4)BEA構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状に造粒されている、前記(1)から(3)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット
(5)BEA構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状で、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化されている、前記(1)から(4)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(6)BEA構造ゼオライトを造粒するための糊料、あるいは、一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化するための糊料が、タンパク質に悪影響を与えない材料である、前記(1)から(5)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(7)タンパク質変性剤が、塩酸グアニジン、又は尿素である、前記(1)から(6)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(8)pH調整剤が、トリスアミノメタン三塩酸塩(Tris−HCl)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、又はN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−ジンエタンスルホン酸(HEPES)である、前記(1)から(7)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(9)タンパク質S−S架橋形成制御剤が、シスチン、システイン、2−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、又はチオフェノールである、前記(1)から(8)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(10)リフォールディング制御因子が、ポリエチレングリコール(PEG20K、PEG3350、PEG800、PEG200)、Ficol170、Ficol1400、アルギニン、EDTA、NaCl、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Dextran T−500、Tween20、Tween40、Tween60、NP−40、SB3−14、SB12、CTAB、又はTriton X−100のうちの1種以上により構成される、前記(1)から(9)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(11)分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートが、96穴マイクロプレート、又はそれ以上の穴数を有するマイクロプレートであり、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成の溶液が注入されていることにより、同時並行的に複数の条件による試験を行うことができる、前記(1)から(10)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(12)上記キットが、一連の操作を、自動ないし半自動で行う自動タンパク質リフォールディング条件設定装置である、前記(1)から(11)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
(13)溶液成分の基本構成成分、ゼオライトが分注もしくは固定されたマイクロプレート、及び操作法を記載した取り扱い説明書を一組のパッケージとして組み合わせた、前記(1)から(12)のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
本発明者らは、先に、BEA構造のゼオライトの吸着性能を利用した汎用性のあるタンパク質リフォールディング手法を開発した(特許文献1−4及び非特許文献2)。本手法には、該手法に関する特許文献及び非特許文献に開示されているように、処理時間が短く、かつ処理方法がタンパク質の違いに依存しないという利点がある。本手法では、アミノ酸鎖を一旦引き延ばしてゼオライトに吸着させ、その後、剥離剤を用いることで、リフォールディングを起こさせる。剥離剤に用いるバッファー組成の調整をするのみで、多様なタンパク質に対応させることが可能であり、このことは、上記特許文献及び非特許文献の開示から自明であるといえる。したがって、本発明のタンパク質リフォールディング条件設定キットにおいても、タンパク質の違いに依存しないという利点があり、タンパク質の種類に制限されることなく、多様なタンパク質に対応させることが可能である。
(1)広範な不活性タンパク質に対して、それらの本来の機能を賦活させる、BEA構造ゼオライト(ゼオライトベータ・β−ゼオライト)によるリフォールディング法を適用する場合の、最適ないし好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に設定するための、ハイスループットのタンパク質リフォールディング スクリーニング方法及びシステムとしての、リフォールディング条件設定キットを提供することができる。
(2)大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質に対して、それら本来の機能を賦活させるBEA構造ゼオライトを用いたリフォールディング法を適用する場合の最適ないし好適条件を選定することができる。
(3)インクルージョンボディのタンパク質に対して、BEA構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する場合の、最適ないし好適条件を選定することができる。
(4)BEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤のケイ素とアルミニウムの比を変化させたり、NH4 +もしくはNa+フォームにしたゼオライトに変更することにより、BEA構造ゼオライトによるリフォールディング法を適用する際のリフォールディング剤の条件について、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
(6)分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、例えば、96穴マイクロプレート、もしくはそれ以上の穴数を有するマイクロプレート、もしくはそれに類似又は機能を同じくするものの条件について、最適ないし好適条件を、同時並行的に検討することができる。
(7)BEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を、粉末状態もしくは粒子状にして、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに分注することで、遠心分離等の操作を省略することができる。
(9)溶液成分の基本構成材料と、ゼオライトが既に分注もしくは固定されたマイクロプレートと、更には、操作法を記載した取り扱い説明書等を一組のパッケージとした形態の、キットを提供することができる。
(10)BEA構造ゼオライトによるリフォールディング法の有するスケールアップの容易性との相乗効果により、タンパク質の種類を問わず、広範な不活性タンパク質に対して、それらの本来の機能を賦活させることができ、高次構造が制御されて、該タンパク質固有の本来の機能が備わったタンパク質を生産する新規の活性タンパク質製造プロセスを確立することができる。
キットには、930NHA(東ソー製);NH4型(NH4 +フォーム)であるゼオライトを用いた。このゼオライトが、96穴ディープウェルプレートの各穴に、30mgずつ、分注されたものを用意し、これに、96穴ディープウェルプレート用キャップを付属として用いた。
1.変性バッファー:20mM Tris−HCl pH7.5,6M 塩酸グアニジン,0.5M NaCl,10mM 2−メルカプトエタノール
2.洗浄バッファー:1mM Tris−HCl pH7.5
4.pH7.5基本バッファー:125mM Tris−HCl(pH7.5),1.25%(w/v)ポリエチレングリコール20000,1.25M アルギニン、2.5mM EDTA
6.pH8.5基本バッファー:125mM Tris−HCl(pH8.5),1.25%(w/v)ポリエチレングリコール20000,1.25M アルギニン、2.5mM EDTA
使用する器具の構成は、8連ピペット(20μl)、8連ピペット(300μl)、8連ピペット(1250μl)、12連ピペット(300μl)、リザーバー、とした。尚、リザーバーは、キットの付属としてセットすることも可能とした。
まず、96条件のリフォールディングバッファーの準備を行った。以下に示す手順で、リフォールディングバッファー作製用の96穴ディープウェルプレートに、各種バッファーを分注した。表2に、96穴マイクロプレートを用いたときの各穴のバッファー成分を示す。以下の手順により、表2に示すような、96通りの異なる構成のリフォールディングバッファーを準備し、これを用いて、96通りのリフォールディング条件の同時検討を行った。
2. 22μlずつのddH2Oを、12連ピペット(300μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートのA,C,E,Gの列の1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行に加えた。
4. 330μlずつのddH2Oを、8連ピペット(300μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,4,5,7,8,10,11行のA,B,C,D,E,F,G,Hに加えた。
6. 440μlずつの上記4のpH7.5基本バッファーを、8連ピペット(1250μl)に6本のチップを付け、96穴ディープウェルプレートのC,D列の1,2,3,4,5,6行及びC,D列の7,8,9,10,11,12行に加えた。
8. 440μlずつの上記6のpH8.5基本バッファーを、8連ピペットに(1250μl)に6本のチップを付け、96穴ディープウェルプレートのG,H列の1,2,3,4,5,6行及びG,H列の7,8,9,10,11,12行に加えた。
10. 22μlずつの上記10の10%(v/v)Tween20を、12連ピペット(300μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートのB,D,F,H列の1,2,3,4,5,6,7,8,9,10、11,12行に加えた。
12. 330μlずつの上記9の66.7%(v/v)グリセロールを、8連ピペット(1250μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの3,6,9,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
14. 5.5μlずつの上記12の200mM シスチンを、8連ピペット(20μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの4,5,6,10,11,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
16. キャップをして、転倒、混和後、4℃、3000rpmにて、1分間遠心した。
その結果を、図1に示す。図1は、蛍光強度を測定した結果をまとめたものである。表3に、蛍光強度を測定した数値結果を示す。表4に、活性の高かったC1,C7,E1,E4,E7,E10,G1,G4,G7,G10,H3及びH9のタンパク濃度を測定し、回収率、及び活性回復率を算出した結果を示す。
pH8.0
0.5M アルギニン
0.5% ポリエチレングリコール 20000
0.5M NaCl
10mM 2−メルカプトエタノールもしくは、10mM システイン + 1mM シスチン
2.5mM EDTA
キットには、930NHA(東ソー製);NH4型(NH4 +フォーム)に固定しているゼオライトを用いた。このゼオライトが、96穴ディープウェルプレートの各穴に30mgずつ、分注されたものを用意した。これに、96穴ディープウェルプレート用キャップを付属としてセットした。
1.変性バッファー:20mM Tris−HCl pH7.5,6M塩酸グアニジン,0.5M NaCl,10mM 2−メルカプトエタノール
2.洗浄バッファー:1mM Tris−HCl pH7.5
4.pH7.5基本バッファー:125mM Tris−HCl(pH7.5),1.25%(w/v)ポリエチレングリコール20000、1.25M アルギニン、5mM MgCl2
6.pH8.5基本バッファー:125mM Tris−HCl(pH8.5),1.25%(w/v)ポリエチレングリコール20000、1.25M アルギニン、5mM MgCl2
使用する器具の構成は、8連ピペット(20μl)、8連ピペット(300μl)、8連ピペット(1250μl)、12連ピペット(300μl)、リザーバー、とした。尚、リザーバーは、キットの付属としてセットすることも可能とした。
まず、96条件のリフォールディングバッファーの準備を行った。以下に示す手順で、リフォールディングバッファー作製用の96穴ディープウェルプレートに、各種バッファーを分注した。表6に、96穴マイクロプレートを用いたときの各穴のバッファー成分を示す。この手順により、表6に示すような、96通りの異なる構成のリフォールディングバッファーが準備され、これを用いて、96通りのリフォールディング条件の同時検討を行った。
2. 22μlずつのddH2Oを、12連ピペット(300μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートのA,C,E,Gの列の1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行に加えた。
4. 330μlずつのddH2Oを、8連ピペット(300μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,4,5,7,8,10,11行のA,B,C,D,E,F,G,Hに加えた。
6. 440μlずつの上記4のpH7.5基本バッファーを、8連ピペット(1250μl)に6本のチップを付け、96穴ディープウェルプレートのC,D列の1,2,3,4,5,6行及びC,D列の7,8,9,10,11,12行に加えた。
8. 440μlずつの上記6のpH8.5基本バッファーを、8連ピペットに(1250μl)に6本のチップを付け、96穴ディープウェルプレートのG,H列の1,2,3,4,5,6行及びG,H列の7,8,9,10,11,12行に加えた。
12. 330μlずつの上記9の66.7%(v/v)グリセロールを、8連ピペット(1250μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの3,6,9,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
14. 5.5μlずつの上記12の200mM シスチンを、8連ピペット(20μl)を用いて、96穴ディープウェルプレートの4,5,6,10,11,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
16. キャップをして、転倒、混和後、4℃、3000rpmにて、1分間遠心した。
(基質混合溶液)
100mM Tris−HCl pH7.0
2mM ATP
10mM MgCl2
1mM DTT
500μM NADP
50mM D−グルコース
1.リフォールディングしたサンプルを、10倍希釈した。
2.希釈したサンプルを、コーニング製のUV透過96穴プレートに分注した。
3.基質混合溶液を、200μlずつ、96穴プレートに分注し、CORONA Microplate Reader SH−8000を用いて、OD340を1分ごとに10分間測った(24サンプルずつ測った)。
4.グラフの傾きを求めて活性を計算した。
Units/mL enzyme=(ΔA340nm/min Sample−ΔA340nm/min Blank)(0.21mL)(df)/(6.22)(0.01)
ここで、6.22=Millimolar extintion coefficient of NADPH at 340nm、0.01=Volume(mL)of enzyme used、である。
その結果を、図2に示す。活性が高かったのは、C2,D2,E2,F2,C8,D8,E8,F8の条件であることが分かる。
pH8.0
0.5M アルギニン
0.5% ポリエチレングリコール 20,000
0.5M NaCl
0.2% Tween20
1M 塩酸グアニジン
5mM MgCl2
1mM DTT
(1)クレアチンキナーゼのクローニング、発現
ヒトクレアチンキナーゼ遺伝子を含むESTクローン(clone ID:MHS1011−60128)は、Open biosystemsより購入した。このESTクローンを鋳型として、iProof High−Fidelity DNA ポリメラーゼを用いて、クレアチンキナーゼ遺伝子を増幅した。なお、プライマーとして、以下の配列のものを用いた。
フォワードプライマー:aaaaaaCATATGGCTGGTCCCTTCTCCC
リバースプライマー:aaaaaaGTCGACATGCTTGGTGTGGATGACAGG
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、4℃で、30〜60分間インキュベートした。
(試薬)
100mM PMSF 800μL
1mg/mL Pepstatin A 80μL
1M MgCl2 100μL
2U/μL DNaseI 100μL
50mg/mL Lysozyme 400μL
可溶性画分を、0.45μmフィルターでろ過し、最終濃度が5mMになるように、500mMイミダゾールバッファー(0Mイミダゾールバッファー+500mMイミダゾール)を加えた。His−Trap HPカラム(5mL)2本を連結したAKTA10Sにロードし、5−500mMのイミダゾール勾配をかけて溶出させた。クレアチンキナーゼのピークフラクションを集め、Amicon Ultra−15(MWCF=10,000)で濃縮後、TBSで、4℃、1晩透析した。透析サンプルを遠心し、0.45μmフィルターでろ過後、タンパク質濃度を測定した。
インクルージョンボディを、30mLの0Mイミダゾールバッファー+0.5%TritonX−100で洗浄した。25mLの変性0Mイミダゾールバッファー(0Mイミダゾールバッファー+6M塩酸グアニジン)を加え、室温で1晩インキュベーションして、変性、溶解させた。100000×g、4℃で、45分間遠心して、不溶性物質を除いた後、0.45μmフィルターでろ過した。
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファー条件について検討した。図6に、作成したマトリックスを示す。また、検討したバッファー条件について、以下の表に示した。
試薬として、以下の試薬を用いた。
(試薬)
Zelolite:HSZ930−NHA 30mg/well
pH7.5基本バッファー[500mM Tris−HCl(pH7.5),5%(w/v)PEG 20000,10mM EDTA]
pH8.5基本バッファー[500mM Tris−HCl(pH8.5),5%(w/v)PEG 20000,510mM EDTA]
1M NDSB256
5M 塩酸グアニジン(Gdn−HCl)
Salt(3M NaCl,1M KCl)
20mM DTT
2Mアルギニン(Arg)(pH7.5,pH8.5)
96穴ディープウェルプレートに、以下のように試薬を作成し、該試薬を分注した。
1)100μLずつのddH2Oを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,4行のA,B,C,D,E,F列に加えた。
2)500μLずつのddH2Oを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6行のA,D列に加えた。
4)100μLずつのpH7.5基本バッファーを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3行のA,B,C,D,E,F列に加えた。
6)500μLずつの1%(v/v)Tween20を、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6行のB,E列に加えた。
8)100μLずつのSalt(3M NaCl,1M KCl)を、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの2,5行のA,B,C,D,E,F列に加えた。
10)250μLずつの2Mアルギニン(pH7.5)を、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3行のD,E,F列に加えた。
12)50μLずつの20mM DTTを、8連ピペットを用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6行のA,B,C,D,E,F列に加えた。
ゼオライト(HSZ930 NHA)を、約30mgずつ、ディープウェルプレートに加えた。500μLの変性0Mイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。0.3mgの変性クレアチンキナーゼを加え、1時間振盪してゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを、2150×g、4℃で、5分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
活性測定は、CKII−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。リフォールディングしたサンプルを、5μlずつ、96穴アッセイプレートに分注した。150μLの基質を分注し、570nmの吸光度の変化をプレートリーダー(Model 680 XR、バイオラッド)を用いて測定することにより、活性を求めた。
測定結果を以下の表に示す。pH7.5(50mM Tris−HCl)、500mMアルギニン、0.5%(v/v)Tween20、500mM塩酸グアニジンの条件下で、回収率14%であった。更に、可溶性クレアチンキナーゼと比活性の比較を行ったところ、活性回復率51.1%であった。
(1)MMP−3の発現
ヒトMMP−3発現コンストラクトは、松浦氏(産業技術総合研究所、東北センター)より譲渡されたものを用いた。MMP−3発現コンストラクトを30mLのLB−1.5%グルコース−100μg/mLアンピシリン培地で、37℃、1晩培養した。20mLの前培養液を2Lのターボブロス−1.5%グルコース−100μg/mLアンピシリン培地に移し、37℃で、OD600が0.6になるまで培養した。最終濃度が100μMになるようにIPTGを加え、更に、37℃で、4.5時間培養した。
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、4℃で、30〜60分間インキュベートした。
(試薬)
100mM PMSF 800μL
1mg/mL Pepstatin A 80μL
1M MgCl2 100μL
2U/μL DNaseI 100μL
50mg/mL Lysozyme 400μL
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファ条件について検討した。図7に、作成したマトリックスを示す。また、検討したバッファー条件について、以下の表に示した
試薬として、以下の試薬を用いた。
(試薬)
ゼオライト(HSZ930−NHA)30mg/well
pH6.0基本バッファー[500mM MES−Na(pH6.5),5%(w/v)PEG 20000,50mM CaCl2,5mM Zn−Acetate]
pH8.5基本バッファー[500mM Tris−HCl(pH8.5),5%(w/v)PEG 20000,50mM CaCl2,5mM Zn−Acetate]
1% Tween20
1M NDSB256
5M 塩酸グアニジン(Gdn−HCl)
Salt(3M NaCl,1M KCl)
20mM DTT
100mM還元型グルタチオン(GSH),20mM酸化型グルタチオン(GSSG)
2Mアルギニン(Arg)(pH6.0,pH7.5,pH8.5)
96穴ディープウェルプレートに、以下のように試薬を作成し、該試薬を分注した。
1)750μLずつのddH2Oを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行のA,B列に加えた。
2)375μLずつのddH2Oを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,3,5,7,9,11行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
4)150μLずつのpH7.5基本バッファーを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの5,6,7,8行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
6)750μLずつの1%(v/v)Tween20を、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,1011,12行のC,D列に加えた。
8)750μLずつの1M NDSB256を、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,1011,12行のG,H列に加えた。
10)150μLずつの5M塩酸グアニジンを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行のB,D,F,H列に加えた。
12)375μLずつの2Mアルギニン(pH7.5)を、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの6,8行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
14)75μLずつの20mM DTTを、8連ピペットを用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,5,6,9,10行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
15)75μLずつの100mM還元型グルタチオン,20mM酸化型グルタチオンを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの3,4,7,8,11,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
ゼオライトを、約30mgずつ、96穴ディープウェルプレートに加えた。500μLの変性0Mイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。0.25mgの変性MMP−3を加え、1時間振盪して、ゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを、2150×g、4℃、5分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
活性測定は、490 MMP−3 Assay Kit(SensoLyte社)を使用した。キットに付属のMMP−3 substrate 50μLを、Assay buffer 10mLに加え、アッセイ溶液を作製した。100μLずつ、96穴黒色アッセイプレートに分注した。リフォールディングサンプルを、ddH2Oで2倍希釈し、そのうち5μLを加えた。SH−8000マイクロプレートリーダー(コロナ電気株式会社)にて、励起波長340nm、放射波長490nmを測定することにより、活性を求めた。
上記測定結果を、以下の表に示す。pH8.5(50mM Tris−HCl)、500mMアルギニン,5mM CaCl2、0.5mM Zn−acetate、0.5%(w/v)PEG 20000、300mM NaCl、100mM KCl、500mM塩酸グアニジン、500mM NDSB256の条件下で、最大活性及び、21.8%の回収率を得た。また、比活性は、希釈法(Rosenfeld et al.,Geen,1994,139,p281−286)によって得られた値と比べて、3.7倍高かった。
(1)抗ヒトアルブミン単鎖可変領域断片(HSAscFv)のクローニング、発現
ヒトアルブミンを認識するマウスIgG可変部位の遺伝子配列は、文献(P2000−139460A)を参考にした。該文献に示してあるH鎖及びL鎖のアミノ酸配列を、リンカー(GlyGlyGlyGlySer×3)でつないだ配列を、大腸菌のコドンに合わせたDNA配列である人工遺伝子として合成した。なお、人口遺伝子の合成は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼した。
凍結した菌体を溶解後、以下の試薬を加え、4℃で、30〜60分間インキュベートした。
(試薬)
100mM PMSF 800μL
1mg/mL Pepstatin A 80μL
1M MgCl2 100μL
2U/μL DNaseI 100μL
50mg/mL Lysozyme 400μL
リフォールディング条件検討マトリックスを作成し、バッファ条件について検討した。図8に、リフォールディングマトリックスを示す。検討したバッファー条件について、以下の表に示した。
試薬として、以下の試薬を用いた。
(試薬)
ゼオライト(HSZ930−NHA)50mg/well
バッファー組成
pH6.0基本バッファー[200mM MES−Na(pH6.0),2%(w/v)PEG 20000]
pH7.5基本バッファー[200mM Tris−HCl(pH7.5),2%(w/v)PEG 20000]
pH8.5基本バッファー[200mM Tris−HCl(pH8.5),2%(w/v)PEG 20000]
Salt(2.4M NaCl,0.8M KCl)
8%(v/v)Tween20
160mM システイン、16mM シスチン
2M アルギニン(pH6.0,pH7.5,pH8.5)
以下に示すように試薬を作成し、96穴ディープウェルプレートにバッファーを分注した。
1)100μLずつのddH2Oを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,5,6,9,10行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
2)100μLずつのddH2Oを、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,3,5,7,9,11行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
4)400μLずつのddH2Oを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行のA,B,E,F列に加えた。
6)400μLずつのpH6.0基本バッファーを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
8)400μLずつのpH8.5基本バッファーを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの9,10,11,12行のA,B,C,D,E,F,G,H列に加えた。
10)200μLずつのSalt(2.4M NaCl,0.8M KCl)を、8連ピペット(300μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行のE,F,G,H列に加えた。
12)400μLずつの2Mアルギニン(pH7.5)を、8連ピペット(1250μLを用いて、96穴ディープウェルプレートの5,6,7,8行のC,D,G,H列に加えた。
14)400μLずつの4M塩酸グアニジンを、8連ピペット(1250μL)を用いて、96穴ディープウェルプレートの1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12行のB,D,F,H列に加えた。
ゼオライトを、約50mgずつ、96穴ディープウェルプレートに加えた。500μLの変性0Mイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。0.2mgの変性HSAscFvを加え、1時間、振盪して、ゼオライトに吸着させた。ディープウェルプレートを2150×g、4℃で、5分間遠心して、ゼオライトを沈殿させた。
ELISAプレートを使用し、以下の試薬を用いた。
ヒト血清アルブミン(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)
ブロックエース(DSファーマバイオメディカル株式会社)
抗ヒスタグ抗体ペルオキダーゼコンジュゲート
上記測定結果を以下の表に示す。pH8.5(50mM Tris−HCl),500mMアルギニン、0.5%(w/v)Tween20、0.5%(w/v)PEG20000の条件で、最も吸光が高かった。
1)使用したゼオライト
使用したゼオライトについて、以下の表に示す。
各種ゼオライトを20mgずつ、2mLチューブに分注した。500μLの変性0Mイミダゾールバッファーを加え、平衡化した。0.2mgの変性HSAscFvを加え、1時間、振盪して、ゼオライトに吸着させた。21000×g、20℃で、1分間、遠心して、ゼオライトを沈殿させた。上清を捨て、1mLの5mM Tris−HCl、pH7.5を加え、ゼオライトを再懸濁した。
その結果を図9に示す。回収率、ELISAともに、CP811E−150が最大であった。
Claims (13)
- 高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の高次構造を整えて活性型にするタンパク質のリフォールディング操作・工程を実施する際に、好適なリフォールディング条件を簡便かつ迅速に導き出すことができるタンパク質リフォールディング条件設定キットであって、
タンパク質変性剤により変性状態となって可溶化しているタンパク質を、変性剤中で吸着する担体として機能するBEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤を必須構成成分とし、
該BEA構造ゼオライトからなるリフォールディング剤に、変性状態となって吸着しているタンパク質を、溶液中に解離させる溶液成分である、純水成分又はpH調整剤を必須構成成分とし、更に、リフォールディング制御因子としてのタンパク質S−S架橋形成制御剤、界面活性剤、塩類、タンパク質変性剤、又は金属イオンの1種以上を含む組み合わせから構成され、
更に、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレート、を構成要素として含み、同時並行的に、複数の条件による試験を行うキット製品であることを特徴とするタンパク質リフォールディング条件設定キット。 - BEA構造ゼオライトの骨格構造が、酸素と、それ以外の1種又は2種以上の元素からなる、あるいは、ケイ素と酸素又はケイ素とアルミニウムと酸素のみからなる、請求項1に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- BEA構造ゼオライトが、NH4 +もしくはNa+フォームにしたゼオライトである、請求項1又は2に記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- BEA構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状に造粒されている、請求項1から3のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- BEA構造ゼオライトが、粉末状態もしくは粒子状で、分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化されている、請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- BEA構造ゼオライトを造粒するための糊料、あるいは、一体型試験管、もしくは試験プレートに固定化するための糊料が、タンパク質に悪影響を与えない材料である、請求項1から5のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- タンパク質変性剤が、塩酸グアニジン、又は尿素である、請求項1から6のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- pH調整剤が、トリスアミノメタン三塩酸塩(Tris−HCl)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、又はN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−ジンエタンスルホン酸(HEPES)である、請求項1から7のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- タンパク質S−S架橋形成制御剤が、シスチン、システイン、2−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、又はチオフェノールである、請求項1から8のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- リフォールディング制御因子が、ポリエチレングリコール(PEG20K、PEG3350、PEG800、PEG200)、Ficol170、Ficol1400、アルギニン、EDTA、NaCl、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Dextran T−500、Tween20、Tween40、Tween60、NP−40、SB3−14、SB12、CTAB、又はTriton X−100のうちの1種以上により構成される、請求項1から9のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- 分割された複数の同容積の空間を有する一体型試験管、もしくは試験プレートが、96穴マイクロプレート、又はそれ以上の穴数を有するマイクロプレートであり、各試験管、もしくはプレート上の穴に対して、おのおの異なる構成の溶液が注入されていることにより、同時並行的に複数の条件による試験を行うことができる、請求項1から10のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- 上記キットが、一連の操作を、自動ないし半自動で行う自動タンパク質リフォールディング条件設定装置である、請求項1から11のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
- 溶液成分の基本構成成分、ゼオライトが分注もしくは固定されたマイクロプレート、及び操作法を記載した取り扱い説明書を一組のパッケージとして組み合わせた、請求項1から12のいずれかに記載のタンパク質リフォールディング条件設定キット。
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