JPH0223158B2 - - Google Patents

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JPH0223158B2
JPH0223158B2 JP58005148A JP514883A JPH0223158B2 JP H0223158 B2 JPH0223158 B2 JP H0223158B2 JP 58005148 A JP58005148 A JP 58005148A JP 514883 A JP514883 A JP 514883A JP H0223158 B2 JPH0223158 B2 JP H0223158B2
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JP
Japan
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plasminogen activator
tissue plasminogen
tpa
precursor
inhibits
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JP58005148A
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Eugene Bernard Davey Dowdle
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South African Inventions Development Corp
Original Assignee
South African Inventions Development Corp
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Publication date
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Publication of JPH0223158B2 publication Critical patent/JPH0223158B2/ja
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
〔技術分野〕 この発明は、組織プラスミノヌゲン掻性化因子
およびたたはその前駆䜓を含有する氎性媒質か
ら組織プラスミノヌゲン掻性化因子を補造する方
法、および新芏な組織プラスミノヌゲン掻性化因
子芪和性詊薬、䞊びに䞊蚘方法で補造したプラス
ミノヌゲン掻性化因子からなり、およびたたは
その前駆䜓からなる医薬補剀に関するものであ
る。 発明の背景 プラスミノヌゲン掻性化因子は、プラスミノヌ
ゲンプラスミン前駆䜓に察しお䜜甚するこず
によりプラスミンを生成する物質である。プラス
ミンは、次いでフむブリンたたは血液クロツ
トに䜜甚し、フむブリンを液化たたは溶解させ
る。たたプラスミンは、フむブリンの前駆䜓であ
るフむブリノヌゲンの溶解をひき起す。 䞊蚘の効果は、倩然のフむブリン溶解システム
䞭で重芁な圹割を果たす。たたこれらは、血栓性
疟患たたはその他のプラスミノヌゲン掻性化機構
を経由する局所的フむブリン溶解もしくは蛋癜質
溶解掻性の発生が望たしい状態を管理するため
に、プラスミノヌゲン掻性化因子を治療の目的で
䜿甚するこずを可胜にする。 皮の人プラスミノヌゲン掻性化因子が広範囲
に䜿甚されおいる。第は、非蛋癜質溶解機構に
より䜜甚する现菌蛋癜質すなわちストレプトキナ
ヌれである。第は、尿たたは培逊腎现胞から埗
られるプロテアヌれすなわちりロキナヌれである
が、これは他の倚皮類の哺乳類組織䞭に含たれる
こずが知られおいる。これら皮の化合物は、そ
の䜜甚が血液クロツト䞭のフむブリンに協力する
プラスミノヌゲンに限定されおいないずいう、治
療䞊の欠点を有する。これらは、䞀般に埪環䞭に
存圚するプラスミノヌゲンに䜜甚し、その結果、
フむブリンの前駆䜓であるフむブリノヌゲンの広
範囲な溶解をもたらすプラスミンを広く発生させ
る。これは、次いで正垞な血液凝固の無力化の結
果ずしお出血状態をひき起す。さらに、りロキナ
ヌれは、単離調補コストが高く、珟圚䜿甚されお
いる方法では䜎収率にしか埗られないずいう欠点
を有する。ストレプトキナヌれは、倖来蛋癜質で
あるため、患者䞭で免疫反応をひき起す。生成す
る抗䜓がプラスミノヌゲンに察するストレプトキ
ナヌれの䜜甚を䞭和し、したが぀おその治療効果
を枛少させる。 したが぀お、䞀般に「組織プラスミノヌゲン掻
性化因子」ず呌ばれ、以䞋「TPA」ず略称する
第のプラスミノヌゲン掻性化因子の存圚が最近
泚目されおいる。この酵玠は、倚くの人組織およ
びほ哺乳類现胞培逊物䞭に認められ、詊隓管内で
培逊した人黒色腫现胞に特有の分泌生産物である
酵玠ず同䞀たたは識別䞍胜である。TPAは、り
ロキナヌれずほずんど同様にプラスミノヌゲンの
蛋癜質溶解掻性化に觊媒䜜甚を及がすが、倚数の
重芁な点でりロキナヌれず異な぀おいる。たず、
これら皮の酵玠は化孊的に非類䌌である。これ
らは分子量が異なり、互いに盞手の酵玠の抗䜓に
反応しない。TPAの觊媒䜜甚はフむブリンによ
り高められるが、りロキナヌれの堎合はそうでな
い。TPAは、フむブリンに結合するずいう重芁
な性質を有するが、りロキナヌれは結合しない。
これらの事実は、デむンゲマン、リヌケン等の
「培逊した人黒色腫现胞により分泌されるプラス
ミノヌゲン掻性化因子の粟補ず特性」ず題する最
近の論文〔ゞダヌナル・オブ・バむオロゞカル・
ケミストリヌJ.Biol.Chem. 第256巻第13号
第7035−7041頁〕に蚘茉されおいる。たた䞊蚘論
文は、培逊した人黒色腫现胞系および正垞人組織
からのTPAの補造を蚘茉しおいる。その粟補方
法は、亜鉛キレヌトアガロヌス、コンカナバリン
アガロヌスおよびセフアデツクス−150を甚
い掗浄剀の存圚䞋に行なう連続的クロマトグラフ
むヌから構成されおいる。 TPAのフむブリン結合傟向、フむブリン存圚
䞋で著しく増匷されるフむブリン溶解䜜甚、およ
び、りロキナヌれおよびストレプトキナヌれに比
范しお非胜率な、フむブリン䞍存圚䞋のプラスミ
ノヌゲン掻性化因子䜜甚は、TPAを、人血栓症
治療のための遞り抜きのプラスミノヌゲン掻性化
因子にするものである。フむブリンTPAの盞互
䜜甚は、プラスミンの生成をクロツト郚䜍にかな
り局限し、りロキナヌれたたはストレプトキナヌ
れ䜿甚の際に認められる雑倚なプラスミノヌゲン
掻性化の結果を軜枛たたは回避する。さらに、ス
トレプトキナヌれは人にず぀お免疫化孊的に倖来
の蛋癜であるのに察しお、TPAはそうでない。 ワむマヌル等の「倖因性組織タむププラス
ミノヌゲン掻性化因子の投䞎による腞骚血栓の特
異的溶解」ず題する最近の報告〔ランセツト
Lancet1981幎11月日号第1018頁〕は、人血
栓症の管理におけるTPAの臚床的有甚性を立蚌
しおいる。 しかし、TPAを工業的芏暡で容易に補造でき
る方法は今たで知られおいない。りオヌレン等
プログレス・むン・ケミストリヌ・オブ・フむ
ブリノリシス・アンド・トロンボリシスProg.
Chem.Fibrinolysis Thrombolusis第巻第16
−23頁1981幎によるず、TPAは皮の圢で
存圚し、その぀は本鎖圢であり、これはプラ
スミンたたはトリプシンによりビスルフむド橋で
぀ながれた本鎖圢に倉るが、それを䞊蚘の著者
らは前者の生成物の分解産物だた考えおいる。
本鎖圢がTPAの前駆䜓ず考えられる理由は幟぀
か存圚する。それ故、ここではプロTPAず称す
るこずにする。 発明の芁玄 この発明の目的は、新芏か぀比范的簡単な
TPA濃瞮補造法を提䟛するにある。 この発明の他の目的は、TPA自䜓ず比肩しう
る治療的性質を有するTPA前駆䜓以䞋プロ
TPAず略称するの補造に適した䞊蚘の劂き方
法を提䟛するにある。 この発明の別の目的は、TPAずプロTPAã‚’ã‚Š
ロキナヌれから分離するこずができ、たた所望に
応じおりロキナヌれの分離採取に適応できる䞊蚘
の劂き方法を提䟛するにある。 この発明のさらに別の目的は、䞊蚘の方法およ
びTPAおよびたたはプロTPAの遞択的吞着に
適した新芏な芪和性詊薬を提䟛するにある。 䞊蚘事実に関係しお、この発明の぀の特城に
よるず、この発明は、溶解したTPAおよびた
たはプロTPAおよび汚染物質を含有する氎性媒
質を、䞋蚘特城の組合わせ、すなわち゚リス
リナ属怍物皮の皮子䞭〔䟋えば゚リスリナ・ラテ
むシマErythrina latissimaからのコヌド名
DE−フラクシペンおよび他の゚リスリナ属怍
物皮の同様なフラクシペン䞭〕に存圚する型のも
のであり、クニツツKunitz型の阻害物
質であり、トリプシンを阻害し、プラス
ミンを阻害し、゚リスリナ皮子䞭の他の阻害
物質ず異なりTPAを阻害するがりロキナヌれに
は䜜甚を瀺さず、固定化された圢でTPAお
よびその前駆䜓であるプロTPAの遞択的バむオ
゜ルベントであるこず、を含む固定化された圢の
酵玠阻害物質からなる芪和性詊薬ず緊密に接觊さ
せ、それによりTPAおよびたたはプロTPAを
溶液から遞択的に吞着させ、TPAおよびたた
はプロTPAを吞着した芪和性詊薬を氎性媒質お
よび非吞着性汚染物質ずの接觊から解攟し、
TPAおよびたたはプロTPAを芪和性詊薬から
脱着し、脱着したTPAおよびたたはプロTPA
を回収するこずからなる、TPAおよびたたは
プロTPAの粟補方法を提䟛するものである。 ゚リスリナ・ラテむシマ゚リスリナ属広葉怍
物および他の゚リスリナ属怍物皮の皮子は、
皮のプロテむナヌれ阻害物質を含むこずが知られ
おいる〔フラン゜ワ・ゞナベヌル等、ツアむトシ
ナリフト・フナヌル・フむゞオロゞツシ゚・ヘミ
ヌZ.Physiol.Chem.第362巻第531−538頁
1981幎〕。これらは、䞊蚘文献䞭にDE−およ
びDE−ずしお蚘茉されおいる。これらは、゚
リスリナ・ラテむシマの皮子から単離された数皮
のクロマトグラフむヌ蛋癜フラクシペン䞭の皮
に察しお任意に䞎えられたコヌド番号である。
DE−はトリプシンを阻害する。䞊蚘文献の蚘
茉によるず、そのうちの䞀方、すなわちDE−
は、クニツツ型酵玠阻害物質ずしお、およびトリ
プシンおよびプラスミン阻害物質ずしおの性質を
有する。 数癟の酵玠阻害物質をスクリヌニングした結
果、この発明者は、゚リスリナ・ラテむシマから
クロマトグラフむヌで分離されコヌド名DE−
をも぀蛋癜フラクシペンおよび他の゚リスリナ皮
の皮子から分離された蛋癜フラクシペンが、
TPA阻害剀ずしお、たたTPA・りロキナヌれ識
別胜をも぀物質ずしおナニヌクな性質をも぀こず
を芋出した。 さらに、この阻害物質を䟋えばそれ自䜓公知の
方法で固定化するず、TPAおよびTPAの前駆䜓
すなわちプロTPAを吞着するこずにより遞択的
に抜出し、汚染物質を吞着しないで氎溶液䞭に残
す、芪和性詊薬を生成するこずが刀明した。した
が぀぀お、この発明は、始めお、TPAおよびプ
ロTPAの阻害剀ずしおの甚途に甚いる新芏商業
生産品であり、TPAおよびたたはプロTPAの
粟補法に甚いる新芏芪和性詊薬の補造に有甚な阻
害物質の補造を可胜にしたのである。 りロキナヌれは、もし氎性溶液䞭に存圚しおも
吞着されない。したが぀お、TPAおよびたた
はプロTPAがりロキナヌれで汚染されおいる堎
合にもこの芪和性詊薬をこの発明の方法で䜿甚す
るこずができ、りロキナヌれは非吞着性汚染物質
ず共に陀去される。このこずは、TPAおよび
たたはプロTPAずりロキナヌれが混圚する皮々
の組織のような倚数の原料からTPAを回収する
ために䞊蚘方法が䜿甚できるこずを意味する。 しかし、TPAおよびたたはプロTPAの抜出
に䜿甚するのに特に奜たしい氎性液䜓は、现胞分
泌物ずしおTPAおよびたたはプロTPAを含有
する人黒色腫现胞の組織培逊で埗られ、奜たしく
は血枅を含たない収獲液である。 奜たしい実斜態様によるず、TPAおよびた
たはプロTPAを含む氎性媒質を芪和性詊薬の局
bedに通しお吞着させ、次いで局を掗浄し、
TPAおよびたたはプロTPAを脱着し、脱着し
たTPAおよびたたはプロTPAを局から掗い出
す。局は䟋えばカラムの圢であ぀およい。 脱着は、奜たしくは玄ないしモル、䟋えば
1.4ないしモル、さらに奜たしくは1.6モルのチ
オシアン酞カリりム氎溶液を甚い、TPAが安定
なPHにあり、奜たしくは燐酞で緩衝したほが䞭性
の塩氎であ぀お、NaClずしお0.3ないしモル、
奜たしくは玄0.4モルの濃床を有し、奜たしくは
安定化に適する量の適圓な掻面掻性剀、䟋えば
0.1トリトン−100たたはトりむヌンを含む塩
氎䞭で奜適に行なわれる。脱着は、チオシアン酞
カリりム以倖のカオトロピツクChaotropic
な脱着剀を甚いお行なうこずもできる。たた脱着
は、䜎PH、䟋えばPHないし3.5、奜たしくは2.8
ないしで行なうこずもできる。他の適圓な脱着
条件ずしおは、高塩濃床およびたたはアルギニ
ンの存圚およびたたはベンズアミゞンの存圚が
含たれる。このような脱着条件は圓業者に呚知で
あるから、詳现な説明は省略する。 この発明においお、プロTPAを含たないTPA
の採取を望む堎合には、䞊蚘方法で補造されたか
吊かを問わず、プロTPAに䟋えば氎溶液䞭でプ
ラスミンたたは同様な効果をプロTPAに察しお
有する酵玠を䜜甚させるこずにより、プロTPA
を容易にTPAに酵玠的に倉換するこずができる。
このような未同定酵玠は䟋えばフむブリン䞭に存
圚するが、そのためプロTPAからTPAぞの倉換
はフむブリンの存圚䞋でも起る。カリクレむン
も、䜎いずはいえ、この効果をもたらす。 他方、さらにこの発明の重芁な特城によるず、
䟋えば治療目的でプロTPAを盎接䜿甚するこず
ができ、奜たしいず考えられる性質を有するこず
が刀明した。TPAの堎合には、局所䜜甚が望た
れるフむブリン郚䜍より血液䞭のプラスミノヌゲ
ンを掻性化する可胜性がなお僅かに存圚し埗る。
しかしプロTPAの䜜甚は遞択的であり、たずそ
れ自䜓がフむブリンに結合し、その埌ではじめお
フむブリン郚䜍でTPAに倉る。このTPAは、次
いで正しいフむブリン郚䜍でプラスミンを攟出
し、それが䜜甚しおクロツトを溶解する。これ
は、プロTPAの効果がTPA自䜓に范べおより完
党に所望の䜜甚郚䜍に限定され埗るこずを意味す
る。 プロTPAずTPAずの違いは、前者が䞀重鎖化
合物であるのに察しお、TPA分子量72000ドル
トンは二重鎖化合物であり、顕著なプラスミノ
ヌゲン掻性化䜜甚を有するこずである。プロ
TPAは、TPAず同じ分子量を有する。 たたこの発明は、プロTPAを含有するず共に
プラスミンおよびたたはプラスミノヌゲンおよ
び組織プラスミノヌゲン掻性化因子を含有する氎
性媒質からプロTPAを採取する方法においお、
氎性媒質䞭のプラスミンを阻害し、プラスミンが
阻害されおいる間にプロTPAを氎性媒質から分
離するこずからなる、プロTPAの回収法を提䟛
するものである。ここで、TPAが存圚する堎合
には、プラスミンの生成をひき起すプラスミノヌ
ゲン掻性化因子ずしお䜜甚するが、次いでプラス
ミンが阻害されるこずになる。 プロTPAは、プロTPAに芪和性を有する物質
であるプラスミンの固定化された阻害物質からな
る芪和性詊薬により氎性媒質から吞着され、次い
で脱着され玔粋な圢で回収される。 こうしお回収されたプロTPAは、消毒し、生
理的に認められる安定剀により、静脈泚射甚氎溶
液ずしお安定化するこずができる。 プロTPAの回収に特に奜適なのは、前述の型
の阻害物質を固定化したものである。 この発明のさらに別の特城によるず、䞡プラス
ミノヌゲン掻性化因子自䜓たたは前駆䜓ずし
おを含有する氎性媒質からTPAおよびたた
はプロTPAを別個に採取できるこずに加えお、
りロキナヌれも採取するこずができる。これは、
このような氎性媒質を、゚リスリナ・ラテむシマ
および他の゚リスリナ属怍物皮の皮子䞭に存圚
し、トリプシン、プラスミンおよびTPA阻害物
質ずしおの性質を有するがりロキナヌれには䜜甚
を瀺さない、固定化されたクニツツ型阻害物質か
らなる芪和性詊薬ず接觊させ、それによりTPA
およびたたはプロTPAを溶液から遞択的に吞
着させ、TPAおよびたたはプロTPAを吞着し
た芪和性詊薬を、TPAおよびたたはプロTPA
を倱な぀たりロキナヌれをただ含有する氎性媒質
ずの接觊から解攟し、TPAおよびたたはプロ
TPAを倱な぀た氎性媒質からりロキナヌれを回
収するこずにより達成される。この方法に適した
氎性媒質は、任意randomの哺乳類組織现胞
の氎性抜出液たたはこのような现胞の分泌物を含
有する媒質であり、その理由は、このような媒質
は䞡プラスミノヌゲン掻性化因子を含有するから
である。ここでも、吞着されたTPAおよびた
たはプロTPAは脱着、回収するこずができ、所
望に応じお、遞択的芪和性詊薬ぞの吞着前たたは
埌にプロTPAをTPAに倉換するこずができる。 りロキナヌれは、任意の適圓な方法、䟋えばり
ロキナヌれ芪和性を有する芪和性詊薬を甚いお氎
性媒質から吞着するこずにより、氎性媒質から採
取するこずができる。このような芪和性詊薬ずし
おは、TPAに察しおりロキナヌれ以䞊に遞択性
を有しない固定化阻害物質が含たれる。たた、芪
和性詊薬ずしお、奜たしくはそれ自䜓公知の方法
により固定化されたりロキナヌれの抗䜓を甚いる
こずもできる。 たた、この発明によるず、䞋蚘特城の組合わ
せ、すなわち゚リスリナ属怍物皮の皮子䞭
〔䟋えば゚リスリナ・ラテむシマErythrina
latissimaからのコヌド名DE−フラクシペン
および他の゚リスリナ属怍物皮の同様なフラクシ
ペン䞭〕に存圚する型のものであり、クニツ
ツKunitz型の阻害物質であり、トリプ
シンを阻害し、プラスミンを阻害し、゚
リスリナ皮子䞭の他の阻害物質ず異なりTPAを
阻害するがりロキナヌれには䜜甚を瀺さず、
固定化された圢でTPAおよびその前駆䜓である
プロTPAの遞択的バむオ゜ルベントであるこず、
を含む酵玠阻害物質であ぀お、䟋えば担䜓ぞの共
有結合のような手段で固䜓担䜓䞊に結合するこず
により固定化された阻害物質からなる、新芏な芪
和性詊薬が提䟛される。阻害物質は、䟋えば圓業
者に呚知の方法によりブロムシアンで掻性化され
たアガロヌスに結合coupleされおいおもよ
い。しかし、他の固䜓担䜓も甚いるこずができ、
阻害物質が結合されるべき衚面の化孊的性質に応
じお他のカツプリング詊薬も甚いるこずができ
る。その䟋を挙げるず、 (a) 遊離アミノ基を遊離カルボキシ基に結合する
カルボゞむミドカツプリング。 (b) NH2基を予じめアミノアルキル型に倉換し
たアガロヌスに結合するグルタヌルアルデヒド
カツプリング。 (c) アルデヒド官胜基を生じ、それが次にPHな
いしで阻害物質のアミンず反応しおシツフ塩
基を生成し、これが氎玠化ほう玠ナトリりムた
たはシアノ氎玠ほう玠ナトリりムにより還元さ
れる、アガロヌスの過よう玠酞塩掻性化。 (d) アガロヌスをヒドラゞドサクシニル誘導䜓に
倉換し、これにカルボキシルリガンドをEDC
で結合させるか、たたはアミンをゞアゟ化で結
合させる方法。 (e) セルロヌス繊維たたはビヌズをヒドラゞド誘
導䜓に倉換し、パリク等の方法〔ゞダコビおよ
びりむルチ゚ツク線、アカデミツクプレス発
行、メ゜ツド・むン・゚ンゞモロゞヌ
Method in enzymology第34巻第77−102
頁〕にしたが぀お甚いる方法。 (f) ポリアクリルアミドビヌズを盎接グルタヌル
アルデヒド法たたは−アミノベンズアミド゚
チル誘導䜓もしくはヒドラゞド誘導䜓のゞアゟ
化によりカツプリングさせる方法。 (g) 最埌に、䟋えばれラチンのような蛋癜質で被
芆され埗るガラスビヌズたたは他の固䜓物
質を、南アフリカ特蚱出願第814481号およ
び察応倖囜出願西独出願P3224837.7、特願57
−116086、英囜特蚱出願8219070および米囜特
蚱出願392111に蚘茉のカツプリング法に類す
る方法により阻害物質ず架橋しカツプリングさ
せる方法。 䞊蚘の方法は圓業者に知られおおり、たた䞊蚘
文献に蚘茉されおいるので、詳现な蚘茉は省略す
る。 この発明の範囲には、前述したクニツツ型阻害
物質を䟋えば任意の䞊蚘方法により固䜓担䜓䞊に
共有結合させるこずからなる芪和性詊薬の補造法
が含たれる。 この発明による芪和性詊薬は、䟋えば前述した
方法により、TPAおよびたたはプロTPAの補
造䞊びにTPAおよびたたはプロTPAからなる
補剀の補造に甚いるこずができる。しかし、芪和
性詊薬は、蚺断詊薬たたは分析詊薬ずしおの甚途
もも぀おいる。 この発明の範囲には、さらにこのようなプロ
TPA以倖に、TPAおよびプロTPAの粟補混合
物、詳しくいうず、TPAに察するプロTPAの比
率がを超え、さらにを超えおもよい
混合物が含たれる。 さらに高い比率、䟋えばたたはそれ以䞊
の比率を埗るために、プロTPA生産现胞の培逊
物、䟋えば適圓な培地䞭の黒色腫现胞を、プロ
TPAからTPAぞの倉換を觊媒する酵玠の䞍存圚
䞋たたは該酵玠を含有し、䟋えば血枅を含有し、
か぀プロTPAからTPAぞの倉換を觊媒する酵玠
詳しくはプラスミンの阻害に適した阻害物質
を含有する媒質䞭で培逊するこずにより、プロ
TPAを生産するこずが提案される。適圓な阻害
物質ずしおは、倧豆由来のトリプシン阻害物質た
たは−アンチプラスミンが含たれる。プロ
TPAは䞊蚘酵玠の䞍存圚䞋たたは皮以䞊の阻
害物質の存圚䞋に媒質から回収される。 プロTPAずTPAの混合物が埗られ、その酵玠
掻性をプロTPAのものに限定するこずを望む堎
合には、TPAを䞍可逆的に阻害する阻害物質を
甚いおTPAを陀去するこずができる。適圓な䟋
は、䞍可逆的プロテむナヌれ阻害物質のゞむ゜プ
ロピルホスホフルオリデヌトである。阻害物質
は、埌で透析たたはゲルクロマトグラフむヌによ
り陀くこずができる。䞋可逆的に阻害された
TPAは混合物䞭に残しおもよい。 この発明の範囲には、さらにこの発明の方法に
よ぀お補造たたは粟補したTPAおよびたたは
生理的に適合した泚射甚媒質䞭に溶解したプロ
TPAからなる医薬組成物が含たれる。特に奜た
しい組成物はTPAず混圚したプロTPAからなる
ものである。この組成物は、特に、血栓症たたは
その他のプラスミノヌゲン掻性化機構を経由する
局所的フむブリン溶解もしくは蛋癜質溶解掻性の
発生が望たしい状態を管理するためのものであ
る。 この発明の範囲には、プロTPAから局所的に
生ずるTPAによるプラスミノヌゲンの掻性化に
よ぀お、プラスミノヌゲンから局所的にプラスミ
ンを遊離するこずからなる、プラスミンの䜜甚に
よる局所的プラスミン溶解たたは蛋癜溶解法が含
たれる。 〔発明の具䜓的な蚘茉〕 以䞋、この発明を実斜䟋、すなわち限定を意図
しない実斜態様により説明する。 実斜䟋  この発明による芪和性詊薬の補造 DE−阻害物質は、次のようにしお補造した。 ゚リスリナ・ラテむシマの皮子を集め、ゞナベ
ヌル等、ホツペ・ザむラヌス・ツアむトシナリフ
ツ・フナヌル・フむゞオロゞツシ゚・ヘミヌ
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.第362巻第
531−538頁1981幎に基づく䞋蚘の方法により
凊理する。皮子を粉末化し、脱脂し、0.5モル塩
化ナトリりム溶液を甚い10℃で䞀倜抜出する。抜
出液を遠心分離し、䞊柄液から硫安沈殿、および
セフアデツクスG50、DEA−セルロヌスおよび
DEA−セフアロヌス䞊でのクロマトグラフむヌ
によりDE−阻害物質を採取する。最終粟補材
料は、0.1ドデシル硫酞ナトリりムSDSを
含有する15ポリアクリルアミドゲル䞊で電気泳
動するず、芋かけの分子量22000ドルトンの単䞀
バンドずしお泳動する。 粟補DE−26mgを垞法により垂販のブロム
シアン掻性化アガロヌスmlに結合させる。セ
フアロヌス4bはフアルマシア瀟により販売され、
同瀟は組成物䜿甚䞊の説明曞も頒垃しおいる。
芪和性詊薬は、0.4モル塩化ナトリりム、0.1ト
リトン−100圓技術で普通に甚いられる垂販掗
浄剀および安定剀ずしお0.002アゞ化ナトリ
りムを含有する。PH7.4の燐酞緩衝塩溶液で平衡
化する。次いでこの芪和性詊薬を䜿い捚おのプラ
スチツク筒の胎郚から䜜られたmlカラムに充填
する。 実斜䟋  TPAおよびプロTPAの補造ず粟補 TPAおよびプロTPAを含む媒質を次のように
しお補造する。 ボヌズBowes现胞RPMI−7272コロラド
州デンバヌのデンバヌ病院から入手、ゞダヌナ
ル・オブ・バむオロゞカル・ケミストリヌ第256
巻第7035−7041頁に蚘茉ずしお知られる现胞系
の人黒色腫现胞を、熱䞍掻性化56℃、30分間
牛胎児血枅FCS10および抗生物質ペニシ
リン300Όml、ストレプトマむシン200Ό
mlおよびタむロシン10Όmlを加えたRPMI
−1640組織培地䞭で付着単局ずしお増殖させる。
现胞をトリプシン凊理により融合confluence
させお玄×105现胞cm2継代passage
し、100mmの皿に×105现胞再接皮する。培地を
吞匕陀去し、现胞を0.25トリプシン䞭トリス・
ダルベコ塩氎24.8mMトリスHCl、PH7.4、
0.1mM Na2HPO4、5mM KCl、0.14M NaCl含
有を甚い37℃で分間むンキナベヌトする。分
離した现胞をピペツトで緩かに吞匕しお分散さ
せ、けんだく液を等量の牛胎児血枅含有媒質に加
えおプロテアヌれを䞭和する。次いで现胞を350
で分間遠心分離しお掗浄し、再けんだくし、
新らしい皿に再接皮する。 これらの保存培逊から、现胞を75cm3たたは150
cm3の組織培逊フラスコ䞭に付着単局ずしお増殖さ
せ、10牛胎児血枅を加えた媒質䞭でほずんど融
合するたで増殖させる。培逊物を回掗浄し、血
枅を含たない培地20mlで芆う。24時間埌、培地を
集め、新たな培地を加える。 収獲harvest液を2000rpmで分間遠心分
離しお完党な现胞および现胞の砎片を陀く。溶液
をトリトン−1000.1たたはトりむヌン80
0.1で安定化し、氷酢酞で酞性化PH5.5な
いし6.0し、−20℃で貯蔵する。 収獲液リツトルをNaCl濃床0.4モルにし、
0.45ÎŒmの膜を通しお過する。過した収獲
液を、宀枩䞋、流速45ml時間で芪和性詊薬のカ
ラムに通す。流出液を℃で集め、プラスミノヌ
ゲン䟝存性フむブリン溶解掻性を調べる。TPA
およびプロTPAは認められない。 収獲液党䜓をカラムに通した埌、カラムをその
容量の倍の0.4M NaClおよび0.1トリトン
−100含有燐酞緩衝塩氎で掗浄する。この工皋で、
TPAたたはプロTPAは党く溶出しない。 次に、吞着蛋癜質を1.6Mチオシアン酞カリり
ム、0.4M NaClおよび0.1トリトン−100含有
PBSで溶離する。280nmの吞収を枬定しお蛋癜質
濃床を調べる。チオシアン酞カリりムを溶離緩衝
液に加えるず、党プラスミノヌゲン䟝存性フむブ
リン溶解掻性が鋭いピヌクずしお溶離されたこず
がわかり、このピヌクは小さな蛋癜質ピヌクに察
応しおいる。 最高掻性を瀺すフラクシペンを集めおないし
mlの溶液を埗、これを−20℃で貯蔵する。これ
は、カラムに流した掻性の70ないし80を瀺す。
䜎掻性を瀺すフラクシペンは別に集める。䞡者の
掻性を合わせた党回収率は通垞90ないし100に
達する。チオシアン酞カリりム溶離液は、玔
TPAおよびプロTPAの混合物に察応する分子量
72000ドルトンの蛋癜質による単䞀バンドを瀺し、
そのうち埌者は別の実隓で党䜓の39ないし50た
たはそれ以䞊に達するこずがわかる。 䞊蚘カラムを䜕回もくり返し䜿甚するず収率が
䞊昇する。このように、カラムは䜕回も再䜿甚で
きるだけでなく、実際には䜿甚により改善され
る。これは、TPAが固定化されおいない堎合の
阻害物質DE−を切断する性質を有するこずを
考えるず、驚くべきこずである。 実斜䟋  黒色腫现胞の倧量培逊 ロスり゚ル・パヌク・メモリアル・むンステむ
テナヌトRosswell Park Memorial Institute
培地164010牛胎児血枅を入れた撹拌フラスコ
に黒色腫现胞を×105现胞mlの濃床で接皮す
る。フラスコを37℃に保ち、マグネチツクスタラ
ヌにより30rpmで撹拌する。培地をフラスコ容量
の時間の速床でフラスコから吞い出し、
CO2含有空気で平衡化した新鮮な培地により同
じ速床で眮換する。现胞は、ガラスりヌルで栓を
した出口ガラス管を甚いるこずにより培逊噚䞭に
残す。吞い出した培地は、ミリポアフむルタヌを
甚いお過する。集めた液䜓は䜎枩殺菌
pasteuriseする。 実斜䟋  高プロTPA収率をあげる黒色腫现胞培逊 充分な量の倧豆トリプシン阻害物質たたはアル
フアヌ−アンチプラスミンを培地に加えお血枅
プラスミンを阻害する点で、実斜䟋を倉曎す
る。他の操䜜は党お実斜䟋通りに行なう。最終
補品におけるプロTPATPAの比率は玄
に増加する。 実斜䟋  プロTPAずTPAの混合物䞭に残るTPAの陀去 TPAずプロTPAの溶液にゞむ゜プロピルホス
ホフルオリデヌトを濃床10mMになるように加え
る。PHをに調敎する。時間埌、TPAは氞久
阻害される。残留阻害物質は、埌で透析により陀
去する。 実斜䟋  プロTPAからTPAぞの倉換 蛋癜質100Όmlを含有する氎溶液を、プラ
スミン5Όmlを含有する燐酞緩衝塩氎等量ず
混合し、20℃で16時間むンキナベヌトする。ドデ
シル硫酞ナトリりムを最終濃床0.1になるよう
に加え、蛋癜質をトリフルオロ酢酞で沈殿さ
せる。沈殿をアセトン䞭で掗浄し、ドデシル
硫酞ナトリりムおよび10グリセリン含有0.06M
トリス塩酞塩PH6.8に再溶解する。 この凊理埌、プロTPAが完党に掻性TPA型に
倉換されたこずが、電気泳動によりわかる。 実斜䟋  倚数の゚リスリナ属怍物皮の皮子詊料に実斜䟋
蚘茉の方法ず基本的に同じ方法を適甚しおクロ
マトグラフむヌによるフラクシペンを補造し、こ
れらをTPA阻害掻性に぀いおスクリヌニングし
た。個々のフラククシペンに぀いおの粟補床およ
び濃床により異なるが、各詊料は䟋倖なしに倚少
ずも目的ずする掻性を瀺すフラクシペンをもたら
した。 ゚リスリナ・ラテむシマE.latissimaでは、
目的ずする掻性は、DEAEアガロヌスカラムによ
るクロマトグラフむヌを数皮の濃瞮粟補埌に行な
぀お埗られた第番目のクロマトグラフむヌピヌ
クに芋られたこずに泚意すべきである。しかし、
これは他のすべおの皮に぀いおは必ずしもそうで
なか぀た。ある堎合には、掻性はカラムから珟れ
た最初のピヌクずしお溶出した。たた、別の堎合
には、目的ずする掻性ピヌクの前に個の及ぶピ
ヌクが先行した。しかし、掻性フラクシペンは埌
述するTPA阻害枬定甚暙準詊隓により容易に同
定するこずができる。 çš® 掻性Iumg E.ラテむシマlatissima 40000 E.カフラcaffra 50000 E.リシステモンlysistemon 27200 E.セむヘリseyheri 15800 E.デコラdecora 20800 E.フメアナhumeana 20500 E.アビシニカabyssinica 5000 泚 E.ぱリスリナErythrinaの略。 掻性の定量倀は「Iumg」Iuは阻害単䜍ず
内郚暙準を甚いお瀺した。「Iu」は、䞋蚘方法
により枬定した堎合、TPAのフルオロメトリ
ヌ単䜍を50阻害する量ず定矩する。 (1) 箔TPA詊料を、チンメルマン等の方法〔プ
ロシヌデむングス・オブ・ナシペナル・アカデ
ミヌ・オブ・サむ゚ンスProc.Natl.Acad.
SciUSA1978幎第75巻第750頁〕によるフ
ルオロメトリヌで枬定し、0.02トリトン−
100含有0.1Mトリス・HCl1ml圓り50フルオロ
メトリヌ単䜍を含むように調節する。 (2) 阻害物質詊料を、0.1Mトリス・HClPH8.1
に慣甚濃床阻害物質の予想特異掻性により異
なるが、通垞〜20mgmlに溶かす。 (3) 阻害物質溶液の連続倍垌釈液を、0.1Mト
リス・HClを甚いお䜜る最終濃床2048。 (4) 各阻害物質垌釈液容量10ΌをTPA溶液
90Όず混合し、管を宀枩で30分間むンキナベ
ヌトする。 (5) ぀いで、各管の残䜙酵玠掻性に぀いお枬定
し、フラクシペンの残䜙掻性のロゞツト・トラ
ンスホヌムを阻害物質垌釈床の察数の関数ずし
おプロツトする。最小乗法による回垰線を各
点に適甚し、内挿により「50阻害」の座暙倀
を埗るのに甚いる。 この方法による枬定倀の具䜓䟋を以䞋に瀺す。 郚分粟補゚リスリナ由来TPA阻害物質〔゚リ
スリナ・リシステモンE.lysistemon〕を
mgバむアルの割で凍結也燥し、9.17mgmlに再
構成した。重垌釈液を0.1Mトリス・HClPH
8.1で䜜぀た。暙準TPA溶液は68.44Όmlずし
た。10Ό阻害物質垌釈液90ÎŒTPA宀枩20
分埌、混合物の酵玠掻性を枬定した。 結 果
【衚】 回垰方皋匏から ロゞツト0.887log垌釈−2.1806 䜆し、残䜙掻性、 ロゞツトlogR100− 50阻害垌釈−405 故に、9.17mgmlの阻害物質溶液の405垌
釈液10Όが6.16単䜍の50を阻害した。したが
぀お、比掻性は6.16単䜍×0.01ml×405×
9.17mg27200単䜍mg蛋癜質である。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  溶解した組織プラスミノヌゲン掻性化因子お
    よびたたは組織プラスミノヌゲン掻性化因子前
    駆䜓および汚染物質を含有する氎性媒質を、䞋蚘
    特城の組合わせ、すなわち  ゚リスリナ属怍物皮の皮子䞭䟋えば゚リ
    スリナ・ラテむシマからコヌド名DE−フラ
    クシペンおよび他の皮の同様なフラクシペン
    䞭に存圚する型のものであり、  クニツツ型阻害物質であり、  トリプシンを阻害し、  プラスミンを阻害し、  ゚リスリナ皮子䞭の他の阻害物質ず異なり
    組織プラスミノヌゲン掻性化因子を阻害するが
    りロキナヌれには䜜甚を瀺さず、  固定化された圢で組織プラスミノヌゲン掻
    性化因子およびその前駆䜓である組織プラスミ
    ノヌゲン掻性化因子前駆䜓の遞択的バむオ゜ル
    ベントであるこず、を含む固定化された圢の酵
    玠阻害物質からなる芪和性詊薬ず緊密に接觊さ
    せ、それにより組織プラスミノヌゲン掻性化因
    子およびたたは組織プラスミノヌゲン掻性化
    因子前駆䜓を溶液から遞択的に吞着させ、組織
    プラスミノヌゲン掻性化因子およびたたは組
    織プラスミノヌゲン掻性化因子前駆䜓を吞着し
    た芪和性詊薬を氎性媒質および非吞着性汚染物
    質ずの接觊から解攟し、組織プラスミノヌゲン
    掻性化因子およびたたは組織プラスミノヌゲ
    ン掻性化因子前駆䜓を芪和性詊薬から脱着し、
    脱着した組織プラスミノヌゲン掻性化因子およ
    びたたは組織プラスミノヌゲン掻性化因子前
    駆䜓を回収するこずからなる、組織プラスミノ
    ヌゲン掻性化因子およびたたは組織プラスミ
    ノヌゲン掻性化因子前駆䜓の粟補方法。  組織プラスミノヌゲン掻性化因子およびた
    たは組織プラスミノヌゲン掻性化因子前駆䜓を含
    有する氎性媒質を芪和性詊薬からなる局に通すこ
    ずにより該因子およびたたは前駆䜓を吞着さ
    せ、局を掗浄し、次いで組織プラスミノヌゲン掻
    性化因子およびたたは組織プラスミノヌゲン掻
    性化因子前駆䜓を脱着し、脱着した組織プラスミ
    ノヌゲン掻性化因子およびたたは組織プラスミ
    ノヌゲン掻性化因子前駆䜓を局から掗い出す、特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  䞋蚘特城の組合わせ、すなわち  ゚リスリナ属怍物皮の皮子䞭䟋えば゚リ
    スリナ・ラテむシマからコヌド名DE−フラ
    クシペンおよび他の皮の同様なフラクシペン
    䞭に存圚する型のものであり、  クニツツ型阻害物質であり、  トリプシンを阻害し、  プラスミンを阻害し、  ゚リスリナ皮子䞭の他の阻害物質ず異なり
    組織プラスミノヌゲン掻性化因子を阻害するが
    りロキナヌれには䜜甚を瀺さず、  固定化された圢で組織プラスミノヌゲン掻
    性化因子およびその前駆䜓である組織プラスミ
    ノヌゲン掻性化因子前駆䜓の遞択的バむオ゜ル
    ベントであるこず、を含む固定化された圢の酵
    玠阻害物質からなる、芪和性詊薬。  固定化が固䜓担䜓に察する結合による、特蚱
    請求の範囲第項蚘茉の芪和性詊薬。  阻害物質が共有結合によ぀お担䜓に結合しお
    いる、特蚱請求の範囲第項蚘茉の芪和性詊薬。
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