KR100871454B1 - 단백질 용액으로부터 플라스민(오겐)의 제거 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혼합물을 견고한 아미노산과 접촉시켜 플라스민(오겐) 또는 플라스민을 함유하는 혼합물로부터 피브리노겐의 존재하에서 플라스민(오겐) 또는 플라스민을 특이적으로 제거 또는 분리하는 방법으로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 약 6∼8 옹그스트롬, 바람직하게는 약 7 옹그스트롬 떨어져 있고, 상기 견고한 아미노산은 상기 아미노산의 아미노 기를 통하여 지지체에 공유적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
플라스민, 플라스미노겐, 수지

Description

단백질 용액으로부터 플라스민(오겐)의 제거{Removal of plasmin(ogen) from protein solutions}
본 발명은 단백질로부터 플라스민(오겐) 및 그의 유도체의 특이적인 제거를 위한 수지(resin) 및 방법에 관한 것으로서, 그 결과 얻어지는 단백질 용액은 정맥내 투여 및 국부 적용, 즉 유일한 활성 성분 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 약물과의 조합으로서 지속적 방출(sustained release) 및 상처 치료를 위한 매질 지지체(matrix support)를 위하여 사용될 수 있다. 상기 플라스민(오겐)의 제거에 의하여 더 긴 배양 기간 동안 상기 단백질 용액의 견고성(integrity)과 기능이 보존된다. 또한, 본 발명은 치료적 용도를 위한 고도로 정제된 플라스민(오겐)의 생산에 관한 것이다.
플라스민(오겐)(plasmin(ogen)) 및 그의 활성분자 플라스민(이하 플라스민(오겐)이라 한다)은 아주 자주 단백질 용액, 특히 동물 체액(fluids) 또는 동물기관으로부터 추출된 단백질 용액을 오염시킨다. 다양한 단백질 및 펩티드의 아르기닐 및 라이실 펩티드 결합 (Weinstein MJ., Doolittle RF. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim Biopliys Acta. 1972 258:577- 90 and Ling CM, Summaria L, Robbins KC. Mechanism of formation of bovine plasmin(ogen) activator from human plasmin. J. Biol. chem. 1965. 240:4212-B); 및 염기성 아미노산에 작용하는 플라스민(오겐)의 단백질 분해 활성; 다양한 조직, 특히 중추 신경 조직에서의 자극적 활성(stimulatory activity) 및 결합에 있어서의 플라스민(오겐)의 역할(Chen ZL., Strickland S Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation of liminin. Cell. 1997. 91:917-25) and probably carrying prions in the blood of mammals Fischer (MB, Roeckl C, Parizek P. Schwarz HP. Aguzzi A Binding of disease associated prion protein to plasmin(ogen). Nature. 2000. 408:479-83)로 인하여, 단백질 용액에 플라스민(오겐)이 존재하는 것은 안정한 약제학적 제품으로서의 허용성에 대한 복수의 위협(multiple threat)이 된다.
단백질 용액으로부터 플라스민(오겐)의 정제 및 그에 따른, 단백질 용액으로부터의 플라스민(오겐)의 제거를 위한 여러 크로마토그래피 방법이 개발되었다.
이들 방법들은 실질적으로 2가지 원리에 근거한다. 제1 그룹은 분별적 용해도, 등전점, 또는 분자 크기 분포를 이용하는 여러 연속적 정제 단계에 근거하는 것이다(Alkjaerisig N. The purification and properties of human plasmin(ogen). Biochem. J. 1963, 93:171-182)). 이들 방법의 주목적이 플라스민(오겐)을 정제하는 것이었기 때문에, 이들 방법은 상기 단백질 용액의 조성을 완전히 왜곡시켰다.상기 방법들의 제2 그룹은 단일 단계 친화성 정제에 근거하는 것이다. 본 정제법은 상기 플라스민(오겐) 중쇄 상의 라이신 결합 부위에 결합할 수 있는 다양한 합성 ω-아미노 카르복실산 리간드에 플라스민(오겐)을 결합시키는 것에 근거한다. 이들 부위는 플라스민(오겐) 크링글(kringle)로서 알려진 내부 서열 상동성을 가진 5개 3중 루프 디술피드 브릿지로 구성되고, NH2 플라스민(오겐) 중쇄에 위치하며 피브린(오겐)(fibrin(ogen))에 결합하는 COOH 경쇄에 위치하는 촉매 부위와는 멀리 떨어져 있다. 친화성 크로마토그래피를 위한 또다른 가능성은 촉매 부위를 통하여 플라스민(오겐)을 결합시키는 것이나, 아르기닐 및 라이신 펩티드 결합 및 염기성 아미노산에 대하여 비슷한 또는 낮은 친화성을 갖는 세린 프로테아제와 같은 많은 단백질에 결합할 수 있기 때문에 잠재적으로 덜 특이적 결합이다. 요약하면, 일반적으로 플라스민(오겐) 친화성 크로마토그래피는 ω-아미노 카르복실산 또는 플라스민 촉매 부위의 기질과 화학적 및 이온적으로 닮은 특정 리간드에 의하여 수행되는 것으로 결론지을 수 있다. 상기 리간드는 적당한 스페이서 또는 링커를 통하여 수지에 결합된다. 그러나, 플라스민(오겐)의 제거를 위한 이상적 친화성 수지는 플라스민(오겐)의 정제용으로 이상적인 것으로 알려진 수지와는 실질적으로 동일하지 않다. 그러한 수지는 높은 친화성으로 플라스민(오겐)에 결합하고 다른 세린 프로테아제와 같은 다른 단백질에는 아주 낮은 친화성, 특히 혈장 콘 분획 I(plasma Cohn's fracton I) 또는 냉동침전물의 주요 단백질인 피브리노겐에 대하여 특히 낮은 친화성을 가진 리간드를 포함하여야 한다. 또한, 특정한 친화성 크로마토그래피를 사용한 플라스민(오겐)의 제거가 넓은 범위의 버퍼에서 수행될 수 있고, 플라스민(오겐)이 아니면서 주요한 용액 중의 단백질의 안정성 및 견고성을 위태롭게 할 수 있는 특정한 버퍼에 한정되지 않는다는 것은 중요하다. ω-아미노 카르복실산의 항피브린 분해능(antifibrinolytic potency) (높은 친화성으로 플라스민(오겐)이 피브리노겐에 결합하는 것을 저해하는 능력)은 유리 아미노 및 카르복실 기의 존재 및 COOH-기와 ε-아미노 카프로인산 (EACA) 및 p-아미노 벤즈아미딘 (PAMBA)과 같은 NH2 기가 부착되어 있는 탄소 원자 사이의 거리에 따라 달라진다. EACA와 PAMBA의 항피브린 분해 활성의 비교에 의하여 후자가 약 3 배 더 활성적이라는 것이 밝혀졌다. 시무라(Shimura) 등 (1984)은 p-아미노 벤즈아미딘이 스페이서 (링커) 부위에 의하여 친수성 비닐 중합체의 미세입자(microparticle)에 결합되어 있는 수지를 고안하였다. 수지를 사용함으로써, 시무라(Shimura) 등은 고속(high performance) 친화성 크로마토그래피에 의하여 플라스민 및 플라스민(오겐)을 분리할 수 있었다. 플라스민(오겐)은 6-아미노헥사노인산 단독에 의하여 용출될 수 없고 3 M 요소가 용출 버퍼에 포함되어야만 한다는 사실은 플라스민이 이 고정화된 리간드와 2-부위 상호작용, 즉, 중쇄 상의 라이신-결합 부위 및 경쇄 상의 촉매 부위와 상호작용을 한다는 것을 나타낸다. 이는 p-아미노 벤즈아미딘도 일부 다른 단백질을 제거한다는 다른 연구자들의 연구결과를 설명하는 것이다.
또다른 수지, 라이신-수지가 제조되어 플라스민(오겐)의 친화성 정제에 사용된다. 그러나, 라이신의 항피브린 분해능은 아주 낮아, 그 결합 친화성 역시 낮다. 라이신은 또한 다른 단백질에 결합하며 그 특이성은 버퍼에 의존적이다.
Moroz LA. Gilmore NJ Fibrinolysis in normal plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plasminogen-plasmin system, Blood, 1976, 48., 531-45 에는 친화성 크로마토그래피에 의하여 플라스민(오겐)-없는 혈장을 제조하는 것에 관하여 개시하고 있다. 사용된 방법에 근거하여 저자들은 피브린 분해 효소 플라스민의 생성을 최고조에 이르게 하는 과정은 정상 인간 혈장에서 측정가능한 자발적 또는 기본적 피브린 분해 활성에 있어서 미미한 역할(minor role)을 한다는 것을 나타내는 관찰에 대하여 보고하고 있다. 트라넥사민산(tranexamic acid)은 피브린 분해 활성을 측정하기 위한 플라스민 저해제로서 다른 프로테아제 저해제와 함께 사용된다. 플라스민(오겐)-없는 혈장의 제조를 위하여, Deutsch and Meltz, Science 170; 1095-1096, 1997의 방법이 이용된다.
Iwamoto in Thrombos. Diathes. Heamorrh. (Stuttg.), 1975, 33, 573에는 트라넥사민산이 플라스민에 특이적으로 결합하는 것에 관하여 개시되어 있다. 비록 트라넥사민산이 플라스민의 강력한 리간드로서 확인되어 있으나, 트라넥사민산의 항피브린 분해 효과는 플라스민(오겐)에의 결합 뿐만 아니라, 천연 항플라스민(antiplasmin)의 협력작용의 증진의 결과인 것으로 나타났다. 그러나, 당업자라면 트라넥사민산이 고체 지지체에 결합하는 것은 혈장으로부터 플라스민(오겐)을 제거할 뿐만 아니라 천연 항플라스민도 제거할 것이라는 것을 알 수 있다. 당업자라면 또한 트라넥사민산이 플라스민 저해제와의 응집체(aggregate)(집괴 : conglomerate)를 형성하게 할 것이라는 제안할(suggest) 수 있다. 이러한 이해는 유로키나제-자극된 혈장에서 98 및 91% 저해를 일으키는 ε-아미노-카프로인산과 트라넥사민산의 항-피브린 분해 활성과 경구 혈액(oral blood)을 헤파린화한 혈장 에 대한 ε-아미노-카프로인산과 트라넥사민산의 항-피브린 분해 활성(ε-아미노-카프로인산 및 트라넥사민산에 대하여 각각 65 및 39 % - Moroz 등의 문헌 표 2와 7 참조)을 비교하였을 경우 발견될 수 있는, 차이점에 근거하는 것이다. 당업자라면 높은 결합 비율로 인하여 트라넥사민산과 ε-아미노-카프로인산은 높은 친화성 리간드로서 좋은 후보인 것으로 예측할 것이다. 그러나, 당업자라면 또한 이 리간드가 플라스민과 플라스민 저해제 복합체의 결합의 결과로써 친화성 칼럼을 저해할 것이라는 것을 예측할 것이다.
본 발명은 견고한 아미노산이 놀랍게도 특이적으로 플라스민(오겐)에 결합할 수 있다는 것으로 밝혀진 결과에 근거하는 것이다. 본 발명의 명세서의 문맥의 범위 내에서 "특이적 결합(specifically binding)"이란 플라스민(오겐) 및 피브리노겐과 같은 단백질을 포함하는 혼합물로부터, 실질적으로 상기 플라스민(오겐)이 혼합물로부터 제거되는 반면 피브리노겐은 거의 영향을 받지 않고 혼합물 중에 남아 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, 적어도 85 % 내지 99 %의 플라스민(오겐)이 제거되고 적어도 85%의 피브리노겐이 혼합물 중에 남아 있는 것이다. 더 바람직하게는, 플라스민(오겐)이 적어도 98.O % 내지 99.9 % 제거되고 또는 피브리노겐이 95 % 내지 99 %가 남아 있는 것이다.
상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 약 6∼8 옹그스트롬, 바람직하게는 약 7 옹그스트롬 떨어져 있고, 상기 견고한 아미노산은 상기 아미노산의 아미노 기를 통하여 지지체에 공유적으로 결합되어 있다. 트란스구조(transconfiguration)의 트라넥사민산 및 4-아미노메틸비시클로-[2.2.2.]-옥탄-1-카르복실산 (EMBOCA)이 특히 바람직하다.
놀랍게도, 우선 트라넥사민산 뿐만 아니라ε-아미노-카프로인산은 작용하지 않았으나, 일단 트라넥사민산이 고체 표면에 결합하면 상기 트라넥사민의 모든 추가적인 플라스민(오겐) 결합 능력은 상실되어(소위 협력(cooperation)) 상기 수지는 혈장 또는 혈장 산물로부터 플라스민(오겐)만을 제거한다는 것이 밝혀졌다. ε-아미노-카프로인산이 상기 칼럼에 부착되는 경우, 그의 추가적인 플라스민(오겐) 결합 활성은 남아 있고 여전히 혈장 유래의 다른 단백질에 결합하는 반면, 본 발명에 따른 트라넥사민산의 추가적인 플라스민(오겐) 결합 활성은 완전히 제거된다. 그러나, 트라넥사민산 수지의 플라스민(오겐)에 대한 친화성은 영향을 받지 않는다.
상기 견고한 아미노산은 적절한 스페이서, 특히 3개의 탄소원자보다 긴 스페이서에 부착되고, 지지체 및 친화성 물질은 추가로 단백질 용액 조성을 변화시키지 않으면서 단백질을 함유하는 혼합물로부터 플라스민(오겐)을 고갈시킨다. 상기 제거 과정은 다양한 버퍼의 존재하에서 수행될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 친화성 지지체로부터 용출한 다음, 플라스민(오겐)의 순수한 분획을 제조하는데 적합하다.
본 발명은 혼합물을 견고한 아미노산과 접촉시켜 플라스민(오겐) 또는 플라스민을 함유하는 혼합물로부터 피브리노겐의 존재하에서 플라스민(오겐) 또는 플라스민을 특이적으로 제거 또는 분리하는 방법으로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 약 6∼8 옹그스트롬, 바람직하게는 약 7 옹그스트롬 떨어져 있고, 상기 견고한 아미노산은 상기 아미노산의 아미노 기를 통하여 지지체에 공유적으로 결합되어 있는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 혼합물은 혈액과 같은 체액, 혈액 분획, 동결침전물, 세포 배양물, 소 폐, 소 내장과 같은 동물 조직 추출물 또는 동물 뼈 추출물 젤라틴, 소혈청알부민, 라놀린(PC-포스파티딜 콜린)과 같은 동물 유래 수불용성 지방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 방법은 각 혼합물로부터 고도로 정제된 플라스민(오겐)을 얻는데 사용될 수 있다. 상기 혼합물을 예를 들면, 결합된 견고한 아미노산을 갖는 크로마토그래피 물질과 접촉시킨 후, 플라스민(오겐)은 상기 고체 친화성 물질로부터 용출될 수 있다. 알려진 바와 같은, 고상 추출의 원리가 여기에도 적용될 수 있다. 상기 플라스민(오겐)은 플라스민(오겐) 단백질의 견고한 아미노산의 결합 부위와 경쟁하는, 예를 들면, 트라넥사민산과 같은 리간드를 포함하는 용액에 의하여 용출될 수 있다. 그러한, 리간드는 일반적으로, ε-아미노산, 바람직하게는 라이신이다. 예를 들면, 라이신은 0.85 중량% 내지 0.99 중량%의 농도로 이용될 수 있다. 또한, 다른 농도도 가능하며, 특히 용출 매질(medium)의 이온 강도가 다른 성분, 예를 들면, 전해질에 의하여 균형이 맞추어져 있는 경우 가능하다.
상기 고상으로부터 용출되는 플라스민(오겐)은 버퍼 성분을 추출하는 방법, 예를 들면, 투석에 의하여 용출 버퍼 없이 제조되어질 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 얻어질 수 있는 상기 플라스민(오겐)은 아주 높은 순도를 갖는 것이 특징이 다. 상기 독특한 특징은 데이터에 의하여 명확하게 된다.
요약 표 1 : 각 수지에 대하여 바람직한 적재량 및 용출 조건을 사용한 냉동-고갈 FFP 혈장으로부터 유래한 플라스민(오겐)의 비활성, 정제 및 회수의 비교
사용한 수지 방법 비활성 (mg 플라스민(오겐)/mg 단백질) 정제 인자 회수율 (%)
TEA-Sepharose 4B 2 0.794 567 91.6
Lysine-Ceramic Hyper DF 2 0.444 444 10.9
Lysine-Sepharose 4B 1 0.121 101 11.6
요약 표 2: 각 수지에 대하여 바람직한 적재 조건을 사용한 냉동-고갈(cryo-depleted) FFP 혈장으로부터 플라스민(오겐) 제거의 비교
사용한 수지 방법 제거 (%)
TEA-Sepharose 4B 1 및 2* 99.5
Lysine-Ceramic Hyper DF 1 54.6
Lysine-Sepharose 4B 1 58.0
* 양 방법은 동일하며 결합되지 않은 피크(unbound peak)의 집합을 포함하고 있다.
요약 표에서 알 수 있는 바와 같이, 상업적으로 구입할 수 있는 고정화된-라이신 리간드를 갖는 수지 및 TEA 수지가 최적화된 크로마토그래피 조건하에서 사용되는 경우, 상기 플라스민(오겐)의 회수 및 비활성은 TEA 수지의 경우가 높았다 (요약 표 1). 또한, 상기 TEA 수지는 상기 라이신 수지에 비하여, 냉동-고갈된 혈장으로부터 플라스민(오겐)(Glu-플라스민(오겐)에 대한 시험에 의하여 나타내어짐)을 제거하는데 훨씬 효과적이다(요약 표 2).
용출물의 순도는 SDS-겔 전기영동으로 검사하였다. 3개의 다른 수지 (TEA- Sepharose, Lys-Ceramic Hyper DF 및 Lys-Sepharose 4B)의 용출물을 5 ∼ 12 % 농도구배의 아크릴아미드에 레인당 7 ㎍ 단백질을 적재함으로써 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 얻어진 쿠마시 블루 염색된 겔을 도 1에 나타내었다.
도 1은 3개의 다른 수지-TEA-Sepharose, Lys-Ceramic Hyper DF 및 Lys- Sepharose 4B를 사용한, 두가지 방법(재료 및 방법에 기재되어 있음)에 의하여 용출된 7 ㎍의 단백질의 농도구배 겔 SDS-PAGE (5∼12% 폴리아크릴아미드)의 결과를 나타낸다. 레인 1- Glu 플라스미노겐; 2- 피브리노겐; 3-알부민; 4- 면역글로불린 G; 5- 분자량 마커; 용출 피크: 6- 방법을 사용한 TEA ; 7- 방법 2를 사용한 TAE; 8- 방법 1에 의한 Lysine Ceramic Hyper D ; 9- 방법 1에 의한 Lysine Sepharose; 10- 방법 1에 의한 Lysine Ceramic Hyper D; 11- 방법 1에 의한 Lysine Sepharose.
그 결과 얻어진 단백질 밴드 및 산물의 순도는 요약 표 1에 나타낸 바와 같은 플라스민(오겐)의 비활성과 잘 상관된다. 이는 TEA-Sepharose 수지를 사용함으로써 사소한 알부민 오염만을 갖는 고도로 정제된 플라스민(오겐)을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 임상적 처방용으로 본 산물을 사용하는데 추가의 정제가 필요 없는 것처럼 보인다.
그러므로, 플라스민(오겐)을 포함하는 조성물도 또한 본 발명의 주제 (subject matter)이다.
또한, 공유적으로 결합된 견고한 아미노산을 갖는 지지체로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 약 6∼8 옹그스트롬, 바람직하게 는 약 7 옹그스트롬 떨어져 있는 지지체도 본 발명의 주제이다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 상기 지지체는 바람직하게는, 견고한 아미노산에 결합할 수 있는 크로마토그래피 물질로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 약 6∼8 옹그스트롬, 바람직하게는 약 7 옹그스트롬 떨어져 있는 크로마토그래피 물질이다. 상기 아미노 기와 상기 카르복실 기의 거리는 상기 아미노산의 견고한 구성(constitution)에 의하여 실질적으로 일정하게 유지된다. 상기 아미노산의 견고성(rigidity)은 상기 아미노 및 카르복실 기가 알리사이클릭 고리의 1,4 위치에 배열되어 있는 알리사이클릭 고리, 바람직하게는 시클로헥산 고리에 의하여 생성되어질 수 있다. 또한, 방향족 시스템 예를 들면, 치환된 벤조산 또는 아닐린 치환된 아세트산도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따른 상기 지지체는 바람직하게는, 트라넥사민산 및 EMBOCA로 구성되는 군으로부터 선택된 결합 아미노산을 가지고 있다.
본 발명의 방법에 따라 이용되는 상기 크로마토그래피 물질은 예를 들면, 아가로즈, 셀룰로즈, 제어된 공극 유리, 실리카 겔, 덱스트란과 같은 친수성 물질 또는 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌에 근거한 것과 같은 유기 인공 중합체이다. 일반적인 물질은 상표명 Sephacryl®(Pharmacia, 스웨덴), Ultragel® (Biosepara, 프랑스), TSK-Gel Toyopearl® (Toso Corp., 일본), HEMA® (Alltech Ass. (Deerfield, II, 미국)), Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, 독일)으로 상업적으로 구입가능하다. 또한, 아즈락톤(azlactone) (3M, St. Paul, Minn, 미국)에 근거한 물질이 사 용될 수 있다. Agarose® 또는 Sepharose®가 특히 바람직하다. 이들 물질은 예를 들면, 시그마 (Sigma, St. Louis) 사로부터 상업적으로 구입가능하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 입자성 크로마토그래피 물질 또는 모노리트(monolithic) 블록-물질을 이용함으로써 수행될 수 있다. 상기 입자성 물질은 적절한 매질에 현탁되어질 수 있고, 그 결과 얻어지는 슬러리는 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼에 사용되어질 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법은 또한 뱃치(batch)로 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 중합체는 입자성 물질로서 또는 막의 형태로서도 사용될 수 있다.
상기 트라넥사민산은 바람직하게는 지지체와 트라넥사민산 사이의 링커, 특히 이관능기 링커를 통하여 결합된다. 이관능기 링커가 사용되는 경우, N-히드록시 숙신이미드, DAPA, CNBr, 에폭시, 디아미노디프로필아민 (DADPA), 1,6-디아미노헥산, 숙신산, 1,3-디아미노-2-프로판올, 에틸렌디아민 (EDA), TNB, 피리딜디술피드, 요오도아세트아미드, 말레이미드 활성화된 지지체 또는 그 조합체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 상기 지지체는 바람직하게는, 일차 또는 이차 아미노 기와 결합하는 부위에 의하여 개질된다.
본 발명의 방법에 따른 상기 혼합물을 결합된 트라넥사민산을 갖는 지지체와 접촉시킨 후, 상기 혼합물을 충분한 시간 동안 상기 지지체와 배양하고, 소듐 염, 칼슘 염, 버퍼 염을 포함하는 중성 수성 용액으로 용출한다. 뒤이어, 상기 플라스 민 또는 플라스민(오겐)은 공유적으로 결합된 트라넥사민산과 경쟁하는 충분한 양의 라이신 또는 등가물을 포함하는 수성 용액으로 용출된다.
본 발명의 주제는 플라스민(오겐) 및 플라스민이 실질적으로 없는 천연 원천으로부터 유래한 혼합물이다.
특히, 본 발명의 혼합물은 혈액, 혈액 유도체 또는 혈액 분획, 냉동침전물이다.
본 발명의 혈액 유도체는 특히, FVIII, FIX, 피브리노겐, 피브로넥틴, α1-안티트립신, 안티-트롬빈 III, 폰 빌리브란트 인자, 알부민, 면역글로불린과 같은 혈장 유래 혈액 응고인자 또는 혈액 응고인자의 혼합물이다.
더욱이, 공유적으로 결합된 트라넥사민산을 갖는 지지체도 또한 본 발명의 주제이다. 본 발명의 지지체는 바람직하게는, 크로마토그래피 물질, 더 바람직하게는, 상기한 바와 같은 덱스트란 또는 유기 인공 중합체와 같은 친수성 크로마토그래피 물질이다. 매주 바람직한 지지체는 트라넥사민산이 결합된 Agarose® 또는 Sepharose®이다.
상기 지지체를 형성하는 상기 크로마토그래피 물질은 입자성 물질 또는 모노리트 블록-물질일 수 있다. 후자는 본 명세서에 참조에 의하여 포함되어지는, Hermanson 등, (Hermanson GT, Mallia AK and Smith PK 1992 "Immobilization Affinity Ligand Techniques" pp. 454 Academic Press, Inc. San Diego, USA)에 개시되어 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 트라넥사민산은 지지체와 트라넥사민산 사이의 링커를 통하여 상기 지지체에 결합되어 있다. 이것은 상기 지지체가 트라넥사민산에 공유적으로 결합할 수 있는 관능기를 가지고 있지 않을 경우 유리하다. 그러면 상기 지지체는 먼저 관능기화되고, 다음으로 트라넥사민산과 결합할 수 있는 링커와 반응되어진다. 스페이서 또는 사슬(leashe)은 지지체 또는 매질(matrix) 및 견고한 구조를 갖고 아미노 기와 카르복실 기가 약 6∼7 옹그스트롬 떨어져 있는 본 발명에 따른 아미노산인 친화성 리간드 사이의 중간 링커로서 사용되는 저분자량 분자이다. 바람직하게는, 상기 스페이서는 리간드와 지지체의 커플링을 용이하게 하기 위하여 양말단에 2개의 관능기를 포함한다. 상기 스페이서는 일반적으로 말단에 두개의 관능기를 갖는 탄화수소 화합물이다. 두 말단 중 하나는 전통적 또는 그 자체로서 알려진 반응을 사용하여 상기 매질(matrix)에 공유적으로 부착된다. 상기 제2 말단은 또다른 커플링 과정을 사용하여 상기 리간드에 공유적으로 연결된다.
바람직하게는, 상기 링커는 N-히드록시 숙신이미드, DAPA, CNBr, 에폭시, 디아미노디프로필아민 (DADPA), 1,6-디아미노헥산, 숙신산, 1,3-디아미노-2-프로판올, 에틸렌디아민 (EDA), TNB, 피리딜디술피드, 요오도아세트아미드, 말레이미드 활성화된 지지체 또는 그 조합체와 같은 이관능기 링커이다.
많은 관능기화된 지지체가 상업적으로 이용가능하기 때문에, 일차 또는 이차 아미노 기와 결합하는 부위에 의하여 개질된 지지체로 시작하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 방법을, 많은 혈액 유래 제품을 위한 출발 물질이 될 수 있는 실질적으로 플라스민(오겐)이 없는 냉동침전물(cryoprecipitate)의 제조 과정을 실시예로서 이용하여 이하 보다 상세하게 기술한다.
상기 냉동침전물은 고정화된 리간드로 친화성 크로마토그래피를 수행하여 흡착된 분획과 비흡착 분획으로 나누어진다. 상기 흡착된 분획으로부터 용출될 수 있는 상기 물질은 플라스민(오겐)이다.
상기 고정화된 리간드는 상기 플라스민(오겐) 라이신 결합 부위와 상호작용할 수 있는, 임의의 유사체(analogue)일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 고정화된 리간드의 제조 과정은 아래에 개시되어 있다. 하기 실시예는 예시적인 것이나, 한정적인 것은 아니다.
도 1은 3개의 다른 수지-TEA-Sepharose, Lys-Ceramic Hyper DF 및 Lys- Sepharose 4B를 사용한, 두가지 방법(재료 및 방법에 기재되어 있음)에 의하여 용출된 7 ㎍의 단백질의 구배(gradient) 겔 SDS-PAGE (5-12% 폴리아크릴아미드)의 결과를 나타낸다. 레인 1- Glu 플라스미노겐; 2- 피브리노겐; 3-알부민; 4- 면역글로불린 G; 5- 분자량 마커; 용출 피크: 6- 방법을 사용한 TEA ; 7- 방법 2를 사용한 TAE; 8- 방법 1에 의한 Lysine Ceramic Hyper D ; 9- 방법 1에 의한 Lysine Sepharose; 10- 방법 1에 의한 Lysine Ceramic Hyper D; 11- 방법 1에 의한 Lysine Sepharose.
실시예 1 : 다양한 ε-아미노-카프로인산 리간드의 고정화
여러 수지에서 다양한 스페이서와 조합된 일련의 ε-아미노-카프로인산 리간드를 혈장 유래 용액으로부터 상기 플라스민(오겐) 제거를 평가하기 위하여 생산 또는 구입하였다(상업적으로 구입가능한 경우). 하기 표에 연구된 모든 조합을 요약하였다(상기 수지 아래의 숫자는 각 조합을 위하여 합성 과정이 아래 개시되어 있는 절(section)을 나타낸다).
표 1
링커 리간드
p-벤즈아미딘 아르기닌 트라넥사민산 ε-아미노헥사노인산 라이신
N-히드록시-숙시닉 세파로즈 4B (1)
DADPA 아가로즈 4 % (2) 아가로즈 4 % (3) 아가로즈 4 % (4)
CNBr 세파로즈 4B (5) 세파로즈 4B (6)
에폭시 세파로즈 6B (10) 세파로즈 6B (7) 세파로즈 6B (8) Ceramic HyperDF (9)
1) ε-아미노헥사노인산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 Sepharose 4B는 시그마 사(Sigma) 로부터 구입하였다.
2) p-아미노벤즈아미딘-Agarose 4 %의 제조
Agarose 4 % (Pierce)에 디아미노디프로필아민(diaminodipropylamine) (DADPA)을 고정화하기 위하여 하기의 과정을 이용하였다. 상기 반응은 아민-종결 스페이서 겔상에서 이루어진 다음, 상기 겔은 무수물로 개질되었다.
25 ml DADPA-Agarose 겔을 정제수로 세척한 다음, 상기 겔을 동부피의 정제수에 현탁하였다. 상기 슬러리 혼합물을 2.5 g 숙신산 무수물을 첨가하는 동안 실 온에서 1시간 동안 천천히 교반하였다. 교반 완료 시점에, 상기 숙신닐화 겔을 정제수, 1M NaCl 및 다시 정제수로 순차적으로 세척하여 과량의 반응하지 않은 숙신산을 제거하였다.
TNBS (Sigma)에 의한 음성 시험(negative test) 결과는 DADPA의 모든 아민이 성공적으로 숙신산에 의하여 차단되었다는 것을 나타내었다.
상기 고정화된 숙신닐화 DADPA는 250 ml의 정제수로 세척한 다음, 과량의 물을 흡입 건조하여 습한 케이크(moist cake)를 얻고 500 ml 비이커에 옮겼다. 상기 겔을 25 ml 0.1 M MES 버퍼, pH 4.7에 재현탁하고, 천천히 교반하면서 0.25 g의 p-아미노벤즈아미딘 (Sigma) 및 0.75 g EDC (Pierce)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH는 0.5 M NaOH를 연속적으로 첨가함으로써 1시간 동안 4.7로 유지하였다. 다음으로, 상기 반응 혼합물을 연속적으로 저속 교반 하면서 실온에서 밤새 방치하였다.
상기 겔을 각각 0.5 L의 정제수; 0.1 M 소듐 아세테이트, pH 4.7의 0.5 M 소듐 비카르보네이트 및 정제수로 차례로 세척하였다.
고정화된 p-아미노벤즈아미딘을 사용할 때까지 0.02 % 소듐 아자이드에서 4 ℃에서 보관하였다.
3) 아그기닌- Agarose 4 %
아르기닌-Agarose 4 % 합성은 상기 과정, p-아미노벤즈아미딘-Agarose 4 %의 과정에 따랐다 (2 참조).
4) 트라넥사민산 (TEA)-Agarose 4 %
트라넥사민산 (TEA)-Agarose 4 % 합성은 상기 과정, p-아미노벤즈아미딘-Agarose 4 %의 과정에 따랐다 (2 참조).
5) 아르기닌- Sepharose 4B
스페이서 겔로서 CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) 상에 아르기닌 또는 트라넥사민산을 고정화하기 위하여 하기 과정을 이용하엿다. 두 가지의 다른 농도(10 mmol 또는 0.01 mmol/ml 건조 겔)의 두 가지의 리간드의 합성은 본 절 및 다음 절(5-6)에서 언급한 바와 같이, 비슷하였다.
2.5 g의 CNBr-활성화된 Sepharose 4B를 50 ml의 1 mM HCl에 현탁하였다. 상기 겔을 실온에서 10 분 동안 부풀린 다음, 소결된 유리 필터 상에서 1 mM HCl 500 ml로 15 분 동안 세척하였다.
아르기닌을 12.5 ml의 0.5 M NaCl을 포함하는 커플링 버퍼, 0.1 M NaHCO3 pH 8.3에 용해시켰다. 상기 리간드를 포함하는 상기 커플링 용액을 플라스틱 튜브에서 상기 겔과 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 회전시켰다.
배양 종결시점에서, 이 혼합물을 10 겔 부피의 커플링 버퍼로 과량의 리간드를 소결된 유리 필터를 통하여 세척하였다. 상기 단백질 용액을 pH를 변화시키면서(0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M 아세테이트 버퍼 pH 4로 세척한 다음, 0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M Tris-HCl 버퍼 pH 8로 세척) 50ml로 3회 세척하였다. 상기 고정화된 아르기닌-Sepharose 4B를 사용할 때까지 4 ℃에서 0.02 % 소듐 아자이드에서 저장하였다.
6) 트라넥사민산 (TEA)-Sepharose 4B
이 합성은 상기 아르기닌-Sepharose 4B 과정에 따랐다(5 절 참조).
7) 아르기닌-Sepharose 6B
두개의 다른 농도 (2 mmol 또는 0.2 mmol/ml 건조 겔)의 아르기닌을 하기와 같이 상업적으로 구입가능한 고정화된 Epoxy Sepharose 6B (Pharmacia)에 결합시켰다:
2.5 g의 에폭시-활성화된 Sepharose 6B를 정제수 200 ml에 현탁하였다. 상기 겔을 실온에서 약 5 분 동안 부풀린 다음, 분액(aliquot)으로 첨가된, 정제수 500 ml로 1 시간 동안 소결된 유리 필터를 통하여 세척하였다.
20 ml의 커플링 버퍼 (0.1 M NaHCO3 pH 9.3 및 0.5 M NaCl) 및 부풀린 겔을 아르기닌을 포함하는 두개의 튜브에 부었다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 동안 플라스틱 튜브에서 혼합하였다.
배양 종결시에서, 이 혼합물을 5 겔 부피의 커플링 버퍼로 소결 유리 필터를 통하여 과량의 리간드를 세척하였다. 상기 산물을 3 회의 pH(0.1 M 아세테이트 버퍼 pH 4 및 0.5 M NaCl로 세척한 다음, 0.1 M Tris-HCl 버퍼 pH 8 및 0.5 M NaCl로 세척) 변화로 세척하였다. 상기 고정화된 아르기닌-Sepharose 6B를 사용할 때까지 4 ℃에서 0.02 % 소듐 아자이드에서 저장하였다.
8) 트라넥사민산 (TEA)-Sepharose 6B
이 합성은 상기 아르기닌-Sepharose 6B 과정에 따랐다 (7절 참조).
9) L-라이신 에폭시-활성화된 Ceramic HyperDF Hydrogel은 Sigma로부터 구입하였다.
10) Sepharose 6B에 공유적으로 부착된 p-아미노벤즈아미딘은 Pharmacia로부터 구입하였다.
실시예 2: 플라스민(오겐) 제거를 위한 여러 친화성 크로마토그래피의 탐색
1 IU/ml의 플라스민(오겐) 및 50 mg/ml 피브리노겐을 포함하는 인간 혈장 풀링된 냉동침전물을 하기 연구에 사용하였다.
냉동된 냉동침전물의 분액(aliquot)을 37 ℃에서 녹이고, BN1 버퍼 (0.12 M NaCl, 10 mM Tri Na-citrate, 1 mM CaC12, pH 7.0)에 대하여 투석하였다. 이 단백질 용액을 5 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하여 맑은 용액을 얻었다. 직경 8.36 mm 의 5 ml 주사기 실린더(syringe cylinder)를 실시예 1에 기재한 하기 친화성 수지 1.5 ml (젖은 부피)로 충진하였다: 고정화된 ε-아미노헥사노인산 (스페이서로서 CNBr을 사용한 Sepharose 4B), 고정화된 p-아미노벤즈아미딘/아르기닌/TEA (스페이서로서 DADPA를 사용한 Agarose 4 %), 고정화된 아르기닌/TEA (스페이서로서 CNBr을 사용한 Sepharose 4B), 고정화된 아르기닌/TEA (스페이서로서 에폭시를 사용한 Sepharose 6B) 및 고정화된 L-라이신 (스페이서로서 에폭시를 사용한 Ceramic HyperDF Hydrogel). 최적화된 겔 충진 과정은 다음과 같다: 상기 충진된 겔을 4 부피의 i) 정제수, ii) 1 M NaCl, iii) 정제수, iv) TLN 0.1 버퍼 (Tris 0.05 M Lysine 0.02 M, 0.1 M NaCl, pH 9.0), v) TLN 1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M 및 1 M NaCl. pH 9.0) 및 vi) 정제수로 세척하였다. 모든 시료, 적재 및 세척 버퍼는 25 ℃에서 1분 동안 1000 rpm에서 원심분리 한 후 주사기 실린더에 적용되었다.
평형화는 4 부피의 BN1으로 수행되고, 상기 전-여과된 농축된 냉동침전물을 상기 수지에 적재한 (2:1 v/v, 각각) 다음, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 "스핀(spin)" 세척물의 분액을 각 원심분리 후 플라스틱 튜브에 수집하였다. 상기 수지를 O.D.280이 0.02에 도달할 때까지 적어도 13 칼럼 부피의 어느 하나의 BN1 버퍼로 세척하였다. 플라스민(오겐)의 용출은 TLN 1 버퍼로 수행하고, 4 배 베드 부피의 3 M NaCl로 세척하였다. 상기 미니(mini) 칼럼을 밀봉하고(tightly closed), 4 ℃에서 저장하였다.
상기 과정 중에 분해되거나 50 % 이하의 플라스민(오겐)을 제거하는 수지는, 본 연구에서 초기에 배제하였다. 결과를 표 2에 요약하였다.
표 2. 다른 고정화된 리간드를 사용한 상기 결합하지 않은 물질에서 BN1 버퍼로 플라스민(오겐)의 제거
고정화된 리간드 플라스민(오겐)의 제거(%)
스페이서로서 CNBr을 사용한 ε-아미노헥사노인산 13.36
스페이서로서 DADPA를 사용한 p-아미노벤즈아미딘 없음 (칼럼은 쌓여짐(stacked))
스페이서로서 에폭시를 사용한 p-아미노벤즈아미딘 19.78
스페이서로서 DADPA를 사용한 아르기닌 6.04*
스페이서로서 CNBr을 사용한 TEA (고농도) 0
스페이서로서 CNBr을 사용한 TEA (저농도) 0
스페이서로서 CNBr을 사용한 아르기닌 (저농도) 23.25
스페이서로서 에폭시를 사용한 아르기닌 (저농도) 0
스페이서로서 에폭시를 사용한 아르기닌 (고농도) 5.61
* 본 데이터 점은 3개의 전개값의 평균값이다.
상기 표는 상기 냉동침전물로부터 플라스민(오겐)을 제거하기 위한 가장 좋 은 리간드는 적재, 세척 및 용출에 대한 과정(sequence)을 붕괴하지 않고 견딜만큼 견고한 친화성 겔 또는 적재된 피브리노겐의 50 %이상을 보유하는 겔을 포함한다는 것을 나타낸다.
표 3에는 플라스민(오겐) 제거에 있어서 다양한 겔 형태의 효율과 농축된 냉동침전물 중의 피브리노겐을 보유하는 능력이 개시되어 있다.
상기 냉동침전물 내에 존재하는 잔류 플라스민(오겐)은 상기 수지에 의하여 흡착되는 반면 피브리노겐은 흡착되지 않아, 그 결과 얻어지는 상등액은 실질적으로 플라스민(오겐)이 없게 된다.
상기 피브리노겐 함량은 응집 시간 시험(clotting time test)에 의하여 측정되는 반면, 상기 플라스민(오겐) 함량은 발색 분석(chromogenic assay)에 의하여 측정된다.
라이신 겔로부터 플라스민(오겐) 및 피브리노겐의 계산된 회수율은 사용된 모든 다른 리간드에 대한 표준(golden standard)으로 하였다. 표 2에 나타낸 상기 결과는 에폭시 스페이서를 사용한 TEA 리간드만이 뛰어난 플라스민(오겐) 제거 및 높은 피브리노겐 제거율을 제공한다는 것을 나타낸다 (표 3 참조).
고농도의 고정화된 TEA는 라이신 결합 리간드에 비하여 탁월한 플라스민(오겐) 및 비슷한 피브리노겐 회수율을 제공하였다: 각각 피브리노겐에 대한 89 % 회수율 대 92 % 회수율 및 플라스민(오겐)에 대한 89 % 제거율 대 56 % 제거율. 다른 모든 수지는 플라스민(오겐) 제거 또는 피브리노겐 회수에 있어서 훨씬 덜 효과적이었다.
표 3. 다른 고정화된 리간드를 사용한 결합하지 않은 물질에서 BN1 버퍼를 사용하여 피브리노겐 회수 및 플라스민(오겐) 제거에 대하여 얻어진 데이터의 요약
고정화된 리간드 플라스민(오겐) 제거 (%) 피브리노겐 회수 (%)
스페이서로서 에폭시를 사용한 라이신 56* 92*
스페이서로서 DADP를 사용한 TEA 49 84
스페이서로서 에폭시를 사용한 TEA (저농도) 44.35 88.62
스페이서로서 에폭시를 사용한 TEA (고농도) 89 89
스페이서로서 CNBr을 사용한 아르기닌 (고농도) 91.26 49
* 본 데이터 점은 3개 전개(run)의 평균값이다.
실시예 3 : 라이신 및 TEA-고정화된 수지의 친화성 크로마토그래피 프로필에 미치는 버퍼 포스페이트 및 BN1의 영향
냉동침전물을 알루미늄 히드록사이드로 처리하여 비타민 K 의존성 응고인자를 흡착시킨 다음, 용매 세제 혼합물 (SD-1 % 트리(n-부틸)포스페이트, 1 % Triton X-100)로 30 ℃에서 4 시간 동안 배양하여 지질 엔벨로프가 있는 바이러스를 불활성화시켰다. 상기 SD 시약을 피마자유(castor oil) 추출 및 소수성 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)에 의하여 제거하고, 뒤이어 상기 조성물 (preparation)을 안정제로서 자당 및 글리신의 존재하에서 멸균하였다 (60 ℃에서 10 시간).
멸균 후, 상기 자당 및 글리신을 정용영과(diafiltration)에 의하여 제거하였다. 트라넥사민산 (TEA) 및 아르기닌 염산을 멸균 여과전에 안정화제로서 첨가하였다. 상기 안정화된 산물의 분액을 사용할 때까지 -30 ℃에서 유지하였다.
냉동된, 바이러스 불활성화된 냉동침전물의 분액을 37 ℃에서 녹이고, 버퍼 BN1 (0.12 M NaCl, 0.01 M Tri Na-citrate, 1 mM CaC12, pH 7.0)에 대하여 투석하거나 25 mM 포스페이트 버퍼에 대하여 투석하였다. 상기 투석된 용액을 5 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하여 맑은 용액을 얻었다.
직경 10 mm의 칼럼(Biorad, 미국)을 6 ml (젖은 부피)의 고정화된 TEA (TEA Sepharose 6B) 또는 고정화된 L-라이신 (Ceramic HyperDF/Sepharose 4B) 중 어느 하나로 충진하고, 4 부피의 하기 용액 각각으로 순서대로 세척하였다 : i) 정제수, ii) 1 M NaCl, iii) 정제수, iv) TLN 0.1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M, 0.1 M NaCl, pH 9.0), v) TLN 1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M 및 1 M NaCl, pH 9.0) 및 vi) 정제수로 세척하였다. 평형화는 4 부피의 BN1으로 또는 포스페이트 버퍼로 수행하였다. 상기 여과된 냉동침전물을 유속 100 ㎕/분으로 칼럼에 적재하였다.
결합되지 않은 물질의 시료를 플라스틱 튜브에 수집하고, 상기 수지를 16 칼럼 부피의 BN1 버퍼 또는 포스페이트 버퍼로 세척하였다. 플라스민(오겐)의 용출은 TLN 1 버퍼로 수행하고, 4 부피의 3 M NaCl 용액, 4 부피의 정제수 및 4 부피의 1 M NaCl로 보충된 25 % 에탄올로 세척하였다.
표 4는 다른 종류의 수지에 의한 플라스민(오겐) 제거 및 피브리노겐 회수의 효율성을 나타낸다. 상기 피브리노겐 함량은 응고 시간 분석 (Clauss assay)에 의하여 측정하고, 상기 플라스민(오겐) 함량은 발색 분석(chromogenic assay)에 의하 여 측정하였다.
다른 수지 사이의 비교 결과는 BN1 버퍼가 사용되는 경우, 상기 피브리노겐함량의 95.4 % 내지 96.4 %가 결합되지 않은 피크에 보유된다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 포스페이트 버퍼가 사용되는 경우, 피브리노겐 회수율은 낮다. 놀랍게도, 고정화된 TEA 수지만이 플라스민(오겐)의 높은 제거율과 피브리노겐의 높은 회수율을 제공하였다.
또한, 라이신 수지에 의한 결과는 포스페이트 버퍼에 비하여 BN1 버퍼가 개선된 효율을 나타내었다.
표 4. 고정화된 수지를 사용한 BN1 버퍼 또는 포스페이트 버퍼 중 어느 하나에 의한 피브리노겐 및 플라스민(오겐) 회수율을 시험함으로써 얻어진 데이터의 요약
고정화된 리간드 플라스민(오겐) 제거율(%) 피브리노겐 회수율(%)
TEA (고농도) 에폭시 + BN1 버퍼 77.1 96.4
라이신-에폭시 + BN1 버퍼 68.87 95.4
라이신-에폭시 + 포스페이트 버퍼 100 66.9
라이신 CNBr + BN1 버퍼 62.5 121.8
라이신 CNBr + 포스페이트 버퍼 100 62.2
실시예 4
냉동된, 바이러스 불활성화된 냉동침전물의 분액을 37 ℃에서 녹이고, 버퍼 BN1 (0.12 M NaCl, 0.01 M Tri Na-citrate, 1 mM CaC12, pH 7.0)에 대하여 투석하거나 25 mM 포스페이트 버퍼에 대하여 투석하였다. 상기 투석된 용액을 5 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하여 불용성 물질을 제거하였다.
직경 26 mm의 칼럼(Pharmacia, 스웨덴)을 50 ml (젖은 부피)의 고정화된 TEA (TEA Sepharose 6B)로 충진하고, 4 부피의 정제수 및 동일 부피의 TLN 0.1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M, 0.1 M NaCl, pH 9.0), TLN 1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M 및 1 M NaCl, pH 9.0) 및 정제수로 세척하였다. 평형화는 4 부피의 BN1 (0.12 M NaCl, 0.01 M Tri Na-citrate, 1 mM CaC12, pH 7.0)로 수행하고, 상기 여과된 BAC를 유속 700 ㎕/분으로 칼럼을 통하여 통과시켰다.
결합되지 않은 물질의 시료를 플라스틱 접시에 수집하고, 상기 수지를 적어도 3 겔 부피의 BN1 버퍼로 세척하였다. 플라스민(오겐)의 용출은 TLN 1 버퍼로 수행하고, 3 M NaCl로 세척하였다.
두개의 전개(run)로부터 유래한 상기 결합하지 않은 분획(fraction)을 풀링하고, 농축될 때까지 4 ℃에서 보관하였다. 마지막으로, 상기 BAC를 100 컷-오프 막을 사용하고 BN1 버퍼 (글리신, NaCl, Tri Na-citrate, CaC12, pH 7)에 대하여 정용영과(diafiltration)하여 약 원래 부피로 농축하고, 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 2 %의 아르기닌을 상기 여과물에 첨가하였다.
안정성 시험을 위하여, 얻어진 산물을 0.2 ㎛ 필터를 통하여 멸균 여과하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 TEA 리간드의 효율을 개선한 크고 긴 칼럼을 사용함으로써, 피브리노겐의 회수율은 100 %이었고, 플라스민(오겐)의 제거율은 플라스민(오겐) 발색 분석(chromogenic assay)의 검출가능한 수준 이하였다.
정용여과 전과 후의 산물 사이의 비교 결과는 피브리노겐 함량 33 %가 손실 되는 것으로 나타났다. 이 현상은 작은 규모에서만 발견되는 기술적 문제에 의하여 설명될 수 있다. 의심할 여지 없이, 고정화된 TEA 수지는 플라스민(오겐)의 뛰어난 제거율과 피브리노겐의 뛰어난 회수율을 제공하였다.
표 5. 결합하지 않은 피크에서 피브리노겐 및 플라스민(오겐) 회수율을 시험함으로써 얻어진 데이터의 요약. 각 데이터 점은 2회 전개의 평균값이다.
시료 피브리노겐 회수율(%) 플라스민(오겐) 회수율(%)
적재 후 100 0
적재 및 정용여과 후 66.2 O*
* 상기 풀링된 시료가 3.7 배 농축된 후의 플라스민(오겐)의 회수율.
상기 용출된 단백질 용액 및 농축된 한외여과된(ultrafiltrated) 산물 모두에서 어떠한 잔류 TEA도 발견되지 않았다. 트라넥사민산의 잔류 수준의 분석은 HPLC로 수행하였다.
플라스민(오겐)의 제거를 위하여, 상기한 바와 같은(실시예 4), 동일한 수지 및 전개 조건을 이용하여 4 개의 추가적인 전개(run)를 수행하였다. 일반적으로, 시험된 모든 시료의 결과는 위에서 보인 첫번째 결과와 비슷하였다.
농축된 한외여관된 산물의 용출된 단백질 용액 양자 모두에서 어떠한 잔류 TEA도 발견되지 않았다. 트라넥사민산의 잔류 수준의 분석은 HPLC로 수행하였다.
플라스민(오겐)의 제거 전 또는 랫트 모델에서 시험된 후 중 어느 스트립에서도 흡착(adhesion)은 관찰되지 않았다.
플라스민(오겐)의 제거 전과 후의 상기 냉동침전물을 실온에서 배양하면서 분해에 대하여 시험하였다. 다른 시료에 대하여 (UV 흡수에 의하여) 응고 가능한 단백질의 백분율 데이터를 표 6에 나타내었다.
표 6. 트라넥사민산에 연결된 에폭시 Sepharose 6B에 의한 플라스미노겐의 제거 전과 후의 이중 바이러스 불활성화된, 농축된 냉동침전물을 실온에서 배양한 후의 응고가능한 단백질의 백분율.
처리 배양시간 (주)
0 1 2 3 4 5 6
처리 전 62.91 0 0 0 0 0 0
처리 후 73.44 70.80 68.24 65.69 63.69 63.84 62.46
안정성 시험은 플라스민(오겐) 제거 전과 후에 냉동침전물으로부터 준비된 스트립을 버퍼의 존재하에서 37 ℃에서 배양하여 수행하였다. 이들 스트립을 글리신 및/또는 아르기닌의 첨가 또는 빼고(omission) 의하여 처리하였다. 그 결과를 아래 도 7에 요약하였다.
표 7. 플라스민(오겐) 제거 전과 후의 스프립의 분해 시간
제제 스트립 분해 시간(일)
0 1 2 3 4 5 6
처리전 +++
처러전 + 2% 아르기닌 +++ - - - - - -
처리전 + 2% 아르기닌 + 1% 글리신 +++ - - - - - -
처리후 +++ +++ +++ +++ +++ +++ -
처리후 + 2% 아르기닌 + 1% 글리신 +++ +++ +++ +++ +++ +++ -
+++ 이 데이터 점은 스트립의 존재를 의미한다.
- 이 데이터 점은 스트립의 분해를 의미한다.
1. 하기 실시예에 기재된 연구는 정상의 건강한 공여자로부터 유래한 냉동- 고갈된(cryo-depleted), 풀링된 신선한 냉동 혈장에 대하여 수행하였다. 정상의 건강한 공여자(1)에서는 높은 농도의 항플라스민과 적은 양의 플라스민으로 인하여, 플라스민을 기능적 (발색)(chromogenic) 분석에 의하여 검출할 수 없다 (Schreiber AD, Kaplan AP, Austen KF. Plasma inhibitors of the components of the fibrinolytic pathway in man, J. Clin. Invest 52: 1394-1401, 1973). 결과적으로, 건강한 공여자 혈장 시료로부터 유래한 플라스민의 TEA 수지로부터의 제거, 정제 및 회수를 증명하는 것은 불가능하다. 그러나, 아주 적은 양의 glu-플라스민(오겐)의 검출용 상업적 ELISA 키트 및 이전 연구에서 발견된 바와 같이, 상기 TEA 수지는 플라스민에 대하여 뿐만 아니라 플라스민(오겐)의 양 형태에 대하여 동등한 친화성을 갖는다 (Fredenburgh JP, Nesheim ME. Lys-plasmino(gen) is a significant intermediate in the activation of Glu-plasmino(gen) during fibrinolysis in vitro. J Biol Chem 267. 26150 1992 and Miyashita C, Wenzel E., Heiden M. Plasmino(gen): a brief introduction into ist biochemistry and function. Haemostasis 1:7-13,, 1988.)
2. 따라서 glu-플라스민(오겐)의 측정은 혈장 중의 총 플라스민(오겐)의 지시자로서 사용될 수 있다.
실시예 5
크로마토그래피 단계 :
1 IU/ml의 플라스민(오겐)을 포함하는 냉동-고갈된 신선한 냉동 혈장(FFP : Fresh Frozen Plasma)으로부터 플라스민(오겐)을 제거하는데 있어서 Sepharose 4B 상에 고정화된 TEA의 효율을 결정하기 위하여 연구를 수행하였다. 냉동-고갈된 신선한 냉동 혈장의 분액을 37 ℃에서 녹이고, 3 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하여 불용성 물질을 제거하였다.
직경 10 mm의 칼럼(Pharmacia, 스웨덴)을 2 ml (젖은 부피)의 고정화된 TEA로 충진하고, 4 부피의 정제수 및 동부피의 TLN 0.1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M, 0.1 M NaCl, pH 9.0), TLN 1 버퍼 (Tris 0.05 M, Lysine 0.02 M 및 1 M NaCl, pH 9.0) 및 정제수로 세척하였다. 평형화는 4 부피의 BN1 버퍼 (0.12M NaCl, 0.01M Tri Na-citrate, 1 mM CaC12, pH 7.0) 및 상기 여과된 혈장(∼ 20 IU의 플라스민(오겐))을 유속 1 ml/분으로 칼럼을 통하여 통과시켰다.
통과된 물질은 플라스틱 병에 수집하여 냉동하고, 상기 수지는 적어도 3 칼럼 부피의 BN1 버퍼로 세척하였다. 플라스민(오겐)의 용출은 TLN-1 버퍼로 수행하고, 약 3 부피의 3M NaCl 용액, 2 부피의 정제수 및 2 부피의 20 % 에탄올 + 1 M NaCl로 세척하였다 (방법 1). 두번째 방법에 있어서(방법 2), 플라스민(오겐) 용출전에 추가로 3 M NaCl로 세척하는 것을 제외하고는, 방법 1에 대하여 사용된 동일한 과정을 수행하였다.
분석 방법(Analytical assay):
Glu-플라스민(오겐) 검출 분석: 이들 실험에 사용된 Imunclone® Glu-플라스민(오겐) ELISA 키트 (American Diagnostica, Greenwich, CT, USA)는 천연 인간 glu-플라스민(오겐) 수준의 특이적 결정을 위한 효소-연결 샌드위치 면역분석 장치(enzyme-linked sandwich immunoassay)이다. 혈장 및 혈장 유도체에서 상기 분석 장치의 정량 한계(가장 낮은 보정 곡선 표준에 따르면)는 0.063 ㎍/ml이다.
플라스민 활성: 피브린 분해 분석(assay)은 용출액(eluate) 중의 플라스민 활성을 반-정량하기(semi-quantify) 위하여 수행하였다. 요약하면, 플라스민(오겐) 없는-피브리노겐 (Enzyme Research)을 과량의 스트렙토키나제(streptokinase)의 존재하에서, 다양한 농도의 정상인의 풀링된 혈장 (Unicalibrator, Stago) 또는 친화성 칼럼으로부터 용출되는 정제된 플라스민(오겐)과 배양하였다. 혈전(clot)의 분해가 완료되는 시간을 기록하고 시료의 완전한 혈전 분해와 비교하였다.
단백질의 결정: 총 단백질은 브레드포드 방법을 사용하여 분석하였다 (Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:248-54, 1976). 표 8a 및 b는 TEA 리간드에 의한 인간 혈장 Glu-플라스민(오겐)의 크로마토그래피 제거와 정제의 결과를 나타낸다. 표 8a는 플라스민(오겐)의 정제에 대하여 얻어진 데이터를 요약한 것이다. 상기 표는 방법 2에 의하는 경우가, 정제율 567 배와 수율 91.6 %로서, 방법 1에 비하여 다소 나은 플라스민(오겐)의 정제 결과가 얻어졌다. 표 8b는 평균 99.5 %의 플라스민(오겐)이 결합되지 않은 분획으로부터 제거되고, 용출액 중에 회수된 양에 의하여 대부분 설명되어진다는 것을 보여준다 (표 8a).
표 8a : 3M 소듐 클로라이드로 TEA 수지를 세척하는 것(방법 1 대 방법 2)이 혈장으로부터의 플라스민(오겐)의 비활성, 정제 및 회수에 미치는 영향
방법 1 방법 1 방법 2 방법 2
분획 출발물질 용출액 출발물질 용출액
부피(ml) 40 13.2 40 20
단백질(mg/ml) 46.96 0.291 55.41 0.180
Glu-플라스민(오겐)(㎍/ml) 65.4 18.2 78.O 142.9
플라스민(오겐) (IU/ml) 수행 되지 않음 ∼0.5 ∼1
비활성 (mg 플라스민(오겐)/mg 단백질) 0.0014 0.625 0.0014 0.794
정제 인자 446 567
플라스민(오겐) 회수율(%) 91.8 91.6
표 8b :혈장으로부터 플라스민(오겐) 제거(두가지 방법에 대한 평균 결과)*
방법 크로마토그래피분획 플라스민(오겐) (평균, ㎍/ml) 부피 (평균, ml) 플라스민(오겐) 제거율(%)
1&2* 혈장 71.7 40.0 99.5
결합되지 않은 분획 0.18 83.5
* 방법 1 및 2는 동일하며, 결합되지 않은(통과한) 분획의 집합(collection)을 포함한다.
실시예 6 : 플라스민(오겐)의 친화성 정제에서 크로마토그래피 조건이 고정화된-라이신 리간드의 효율성에 미치는 영향
크로마토그래피 단계:
고정화된-라이신 리간드를 갖는 수지를 이용한 친화성 정제를 두개의 상업적으로 구입가능한 라이신 수지를 사용하여 조사하였다. 문헌에 기재된 크로마토그래피 방법을 사용하였으며 (하기 방법 2에 대하여 Robbins KC, Summaria L. Plasmin(ogen) and Plasmin. Methods Enzymol. 45: 257-73, 1976. 참조), 또한 발명자의 실험실에서 개발한 방법(아래 방법 1)을 사용하였다.
두 가지의 고정화된 라이신 수지(Biosepra에 의하여 제조된 ceramic HyperDF 및 Pharmacia에 의하여 제조된 Sepharose 4B)를 10mm 직경의 칼럼 (Pharmacia, Sweden)에 각각 충진하였다. 각 칼럼은 2 ml(젖은 부피)의 수지를 포함하였다.
냉동-고갈된 신선한 냉동 혈장의 분액을 37 ℃에서 녹이고 3 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하여 맑은 용액을 얻었다.
상기 크로마토그래피 단계는 하기 방법 중 하나를 사용하여 수행하였다:
방법 1
상기 칼럼을 4 부피의 하기 용액으로 각각 세척하였다: 1) 정제수, 2) TLN 0.1, 3) TLN-1 및 4) 정제수. 평형화는 4 부피의 BN1으로 수행하였다. 상기 여과된 혈장 (40 ml)을 유속 1 ml/분으로 칼럼 상에 적재하였다. 통과한(flow through) 물질의 시료를 플라스틱 병에 수집하고 상기 수지를 BN1 버퍼로 세척하였다. 플라스민(오겐)의 용출은 TLN-1 버퍼로 수행하고, 3 M NaCl 용액, 2 부피의 정제수 및 2 부피의 20 % 에탄올 + 1 M NaCl로 세척하였다.
방법 2 : (5 참조)
냉동-고갈된 신선한 냉동 혈장(40 ml)의 분액을 3 ㎛ 깊이 필터를 통하여 여과하였다. 4 ml의 0.5M Tris, 0.2M lysine, 1M NaCl 버퍼, pH 9를 40 ml의 여과된 혈장에 첨가하였다.
상기 칼럼을 4 칼럼 부피의 정제수로 세척하고, 0.1 M 포스페이트 버퍼, pH 7.4로 평형화하였다. 상기 희석된 혈장을 유속 1 ml/분으로 수지를 통하여 통과시켰다. 상기 결합되지 않은 물질의 시료를 플라스틱 병에 수집하고, 상기 수지를 280 nm에서의 유출액(effluent)의 흡광도가 기저선에 도달할 때까지 O.1 M 포스페이트 버퍼, pH 7.4로 세척하였다. 다음으로, 상기 플라스민(오겐)을 O.1 M 포스페이트 버퍼, pH 7.4에 용해된 0.2M ε-아미노카프로인산으로 용출하고, 플라스틱 접시에 수집하였다. 상기 용출액을 약 2 부피의 3 M NaCl 용액 및 정제수로 세척하였다.
표 9a 및 9b는 각각 두가지의 다른 정제 방법을 사용한 두가지의 다른 상업적으로 구입가능한 고정화된-라이신 수지에 의한 플라스민(오겐)의 제거 및 정제를 비교한다. 비록 용출액 중의 플라스민(오겐)의 회수율은 상대적으로 거의 차이가 없을 지라도(9a), 방법 2와 수지 Ceramic HyperDF를 사용함으로써, 플라스민(오겐)의 훨씬 높은 정제가 이루어진다는 것을 알 수 있다.
상기 결과는 Lys-ceramic Hyper DF 수지 및 크로마토그래피 방법 2를 사용함으로써, 444-배의 정제가 달성된다는 것을 보여준다. 더욱이, 출발물질 중의 대부분의 플라스민(오겐)은 피크 분획에서 회수되었다 (결합되지 않은 분획 중 76.5 % + 용출액 중 10.9 %, 적재된 플라스민(오겐)의 10 % 만이 산입되지 않았다). 그러나, 상기 결합되지 않은 분획으로부터 플라스민(오겐) 제거율은 23.5 % 뿐이었다.
표 9a : 두 가지의 상업적으로 이용가능한 고정화된-라이신 수지 및 두가지의 다른 크로마토그래피 방법을 사용한 플라스민(오겐)의 혈장으로부터의 비활성, 정제 인자 및 회수
분획 방법 1 방법 2
적재 용출액 적제 용출액
Ceramic HyperDF Sepharose 4B Ceramic HyperDF Sepharose 4B
부피(ml) 40 8.1 7.2 40 8.2 9.8
단백질 (mg/ml) 55.94 0.347 O.345 6O.O5 O.O719 0.672
Glu-플라스민(오겐)(㎍/ml) 65.4 40.3 41.9 60.8 32.2 19.9
비활성(mg 플라스민(오겐)/mg 단백질) 0.0012 0.116 0.121 0.001 0.444 0.030
정제인자 97 101 444 30
회수율 (%) 12.5 11.6 10.9 8.2

표 9b : 양 방법에 대하여 결합하지 않은 피크(unbound peak)에서 플라스민(오겐) 제거
방법 사용한 수지 크로마토그래피 분획 부피 (ml) Glu-플라스민(오겐)(㎍/ml) 총 Glu-플라스민(오겐)(㎍) 플라스민(오겐) 제거(%)*
1 Ceramic HyperDF 혈장 40 65.4 2616 54.6 (45.4)
미결합 72 16.5 1188
Sepharose 4B 혈장 40 65.4 2616 58.0 (42.0)
미결합 82 13.4 1099
2 Ceramic HyperDF 혈장 40 60.8 2432 23.5 (76.5)
미결합 89 20.9 1860
Sepharose 4B 혈장 40 60.8 2432 33.0 (67.O)
미결합 91 17.9 1629
* 괄호안의 값은 미결합 피크(unbound peak)에서 플라스민오겐 회수를 나타낸다.

Claims (31)

  1. 아미노 기를 통하여 지지체에 공유적으로 결합되어 있는 견고한 아미노산과 혼합물을 접촉시켜 플라스미노겐 또는 플라스민을 함유하는 혼합물로부터 피브리노겐의 존재하에서 플라스미노겐 또는 플라스민을 특이적으로 제거 또는 분리하는 생체외(in vitro) 방법으로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 6-8 옹그스트롬 떨어져 있는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합물은 혈액을 포함하는 체액, 혈액 분획, 동결침전물, 세포 배양물, 소 폐, 소 내장을 포함하는 동물 조직 추출물 또는 동물 뼈 추출물 젤라틴, 소혈청알부민, 라놀린(PC-포스파티딜 콜린)을 포함하는 동물 유래 수불용성 지방으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 아가로즈, 셀룰로즈, 제어된 공극 유리, 실리카 겔, 덱스트란을 포함하는 친수성 물질 또는 폴리아크릴아미드 폴리스티렌을 포함하는 유기 인공 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 아가로즈 또는 세파로즈인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 입자성 물질 또는 모노리트 블록-물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 견고한 아미노산은 지지체와 트라넥사민산(tranexamic acid) 사이의 링커를 통하여 상기 지지체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커는 이관능기 링커인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이관능기 링커는 N-히드록시 숙신이미드, DAPA, CNBr, 에폭시, 디아미노디프로필아민 (DADPA), 1,6-디아미노헥산, 숙신산, 1,3-디아미노-2-프로판올, 에틸렌디아민 (EDA), TNB, 피리딜디술피드, 요오도아세트아미드, 말레이미드 활성화된 지지체 또는 그 조합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 일차 또는 이차 아미노 기와 반응하는 부위에 의하여 개질되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 혼합물을 트라넥사민산이 결합되어 있는 지지체와 접촉시킨 후 상기 혼합물을 플라스미노겐 또는 플라스민을 결합시키기에 충분한 시간 동안 상기 지지체와 배양하고, 소듐 염, 칼슘 염, 버퍼 염을 포함하는 중성 수성 용액으로 용출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 혼합물을 접촉시킨 후 뒤이어 상기 플라스민 또는 플라스미노겐은 견고한 아미노산 결합 지지체의 플라스미노겐 결합 부위와 경쟁하기에 충분한 양의 리간드를 포함하는 수성 용액으로 용출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 리간드는 라이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 공유적으로 결합된 견고한 아미노산을 갖는 지지체로서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 6-8 옹그스트롬 떨어져 있는 지지체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아미노산은 트라넥사민산 및 4-아미노메틸비시클로-[2.2.2.]-옥탄-1-카르복실산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 지지체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 지지체는 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 지지체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 아가로즈, 셀룰로즈, 제어된 공극 유리, 실리카 겔, 덱스트란을 포함하는 친수성 물질 또는 폴리아크릴아미드 폴리스티렌을 포함하는 유기 인공 중합체인 것을 특징으로 하는 지지체.
  18. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 아가로즈 또는 세파로즈인 것을 특징으로 하는 지지체.
  19. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질은 입자성 물질 또는 모노리트블록-물질인 것을 특징으로 하는 지지체.
  20. 제14항에 있어서, 상기 트라넥사민산은 지지체와 트라넥사민산 사이의 링커를 통하여 상기 지지체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 지지체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 링커는 이관능기 링커인 지지체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 이관능기 링커는 N-히드록시 숙신이미드, DAPA, CNBr, 에폭시, 디아미노디프로필아민 (DADPA), 1,6-디아미노헥산, 숙신산, 1,3-디아미노-2-프로판올, 에틸렌디아민 (EDA), TNB, 피리딜디술피드, 요오도아세트아미드, 말레이미드 활성화된 지지체 또는 그 조합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지지체.
  23. 제14항에 있어서, 상기 지지체는 일차 또는 이차 아미노 기와 반응하는 부위에 의하여 개질되어 있는 것을 특징으로 하는 지지체.
  24. 제1항에 있어서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 7 옹그스트롬 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 아미노산의 아미노 기와 상기 아미노산의 카르복실 기는 7 옹그스트롬 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 지지체.
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