JPH0759191B2 - ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 - Google Patents
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法Info
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- JPH0759191B2 JPH0759191B2 JP28434985A JP28434985A JPH0759191B2 JP H0759191 B2 JPH0759191 B2 JP H0759191B2 JP 28434985 A JP28434985 A JP 28434985A JP 28434985 A JP28434985 A JP 28434985A JP H0759191 B2 JPH0759191 B2 JP H0759191B2
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Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明はヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ
ー複合体の製造方法及び精製方法に関する。さらに詳し
くは、ヒト血漿あるいは血液にプラスミノーゲンアクチ
ベーターを添加することによりプラスミン−ヒトα２−
プラスミンインヒビター複合体を生成させること及びそ
の複合体を選択的に分離する方法に関する。
ー複合体の製造方法及び精製方法に関する。さらに詳し
くは、ヒト血漿あるいは血液にプラスミノーゲンアクチ
ベーターを添加することによりプラスミン−ヒトα２−
プラスミンインヒビター複合体を生成させること及びそ
の複合体を選択的に分離する方法に関する。
b.従来技術 ヒトのα２−プラスミンインヒビターは、青木と諸井に
よつて最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害す
る強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖を
含む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが知
られている〔Moroi＆Aoki;The Journal of Biological
Chemistry,251,5956−5965（1976）参照〕。
よつて最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害す
る強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖を
含む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが知
られている〔Moroi＆Aoki;The Journal of Biological
Chemistry,251,5956−5965（1976）参照〕。
一方ヒトのα２−プラスミンインヒビターには３種類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用を阻止する部位（以下これを“リアク
テイブサイド”ということがある）〔B.Wiman＆D.Colle
n;The Journal of Biological Chemistry,254,9291〜92
97（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側
のプラスミン結合部位〔B.Wiman＆D.Collen;European J
ournal of Biochemistry,84,573−578（1978）参照〕で
あり、第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位である
〔Y.Sakata,et al.,Thrombosis Research,16 279〜282
（1979）参照〕。
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用を阻止する部位（以下これを“リアク
テイブサイド”ということがある）〔B.Wiman＆D.Colle
n;The Journal of Biological Chemistry,254,9291〜92
97（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側
のプラスミン結合部位〔B.Wiman＆D.Collen;European J
ournal of Biochemistry,84,573−578（1978）参照〕で
あり、第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位である
〔Y.Sakata,et al.,Thrombosis Research,16 279〜282
（1979）参照〕。
ヒトα２−プラスミンインヒビターは、プラスミン活性
をほとんど瞬間的に阻害し、α２−プラスミンインヒビ
ターは、プラスミンと1:1の割合で結合し複合体を形成
する。
をほとんど瞬間的に阻害し、α２−プラスミンインヒビ
ターは、プラスミンと1:1の割合で結合し複合体を形成
する。
（B.Wiman＆D.Collen;The Journal of Biological Chem
istry,254,9291〜9297（1979）,D.Collen;Thrombosis a
nd Haemostasis,43,77−89（1980）参照） 汎発性血管内凝固（DIC）やウロキナーゼによる血栓溶
解療法など、プラスミノーゲンの活性化のみられる状態
では、生成したプラスミンとα２−プラスミンインヒビ
ターは反応し、複合体を形成する。
istry,254,9291〜9297（1979）,D.Collen;Thrombosis a
nd Haemostasis,43,77−89（1980）参照） 汎発性血管内凝固（DIC）やウロキナーゼによる血栓溶
解療法など、プラスミノーゲンの活性化のみられる状態
では、生成したプラスミンとα２−プラスミンインヒビ
ターは反応し、複合体を形成する。
最近、血漿中のプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの
診断等に有効であると考えられている（例えばN.A.Boot
h＆B.Bennett:British Journal of Haematology,50,537
〜541（1982）参照）。
ター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの
診断等に有効であると考えられている（例えばN.A.Boot
h＆B.Bennett:British Journal of Haematology,50,537
〜541（1982）参照）。
従つて、血液中のプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体の量を正確且つ簡便に測定することができ
れば、種々の病気に対してその予防，診断に極めて役立
つことである。
ビター複合体の量を正確且つ簡便に測定することができ
れば、種々の病気に対してその予防，診断に極めて役立
つことである。
従来知られたプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ
ー複合体の測定方法として、第１の方法は二次元交叉免
疫電気泳動を用いる方法であり、第２の方法は抗血清よ
り得た抗体を固定化し、酵素抗体法を応用したいわゆる
サンドイツチ法によるものである。
ー複合体の測定方法として、第１の方法は二次元交叉免
疫電気泳動を用いる方法であり、第２の方法は抗血清よ
り得た抗体を固定化し、酵素抗体法を応用したいわゆる
サンドイツチ法によるものである。
一方プラミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の
精製標準物質が多量且つ容易に入手することができれ
ば、診断薬及びそのためのキツトの作成のために、極め
て有利である。
精製標準物質が多量且つ容易に入手することができれ
ば、診断薬及びそのためのキツトの作成のために、極め
て有利である。
従来知られているヒトプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体の製造法及び分離法は、プラスミノー
ゲンを除去した血漿にプラスミンを添加してプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体を生成せしめこ
れをリジンセフアロースに吸着させ、50mMのε−アミノ
カプロン酸で溶出し、最後にゲル過法により精製標品
を得る方法である（B.Wiman＆D.Collen;The Journal of
Biological Chemistry,254,9291〜9297（1979）参
照）。
ンヒビター複合体の製造法及び分離法は、プラスミノー
ゲンを除去した血漿にプラスミンを添加してプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体を生成せしめこ
れをリジンセフアロースに吸着させ、50mMのε−アミノ
カプロン酸で溶出し、最後にゲル過法により精製標品
を得る方法である（B.Wiman＆D.Collen;The Journal of
Biological Chemistry,254,9291〜9297（1979）参
照）。
しかしながら、この方法においては、Glu−プラスミン
及びLysプラスミンもリジンセフアロースに吸着し、ま
たこれらが50mMのε−アミノカプロン酸によつてプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体と共に溶出
し、これらタンパクの分離操作が困難であつた。
及びLysプラスミンもリジンセフアロースに吸着し、ま
たこれらが50mMのε−アミノカプロン酸によつてプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体と共に溶出
し、これらタンパクの分離操作が困難であつた。
また上記方法においては、血漿に加えるプラスミンが保
存中に失活し安定性に欠けるという欠点があり、さらに
添加するプラスミンを適正量使用する点においても難点
があつた。さらに重要なことは、ヒトプラスミン−α２
−マクログロブリン複合体の形成が同時に起り、二種の
複合体の分離・精製が困難なことである。
存中に失活し安定性に欠けるという欠点があり、さらに
添加するプラスミンを適正量使用する点においても難点
があつた。さらに重要なことは、ヒトプラスミン−α２
−マクログロブリン複合体の形成が同時に起り、二種の
複合体の分離・精製が困難なことである。
c.発明の構成 そこで本発明者らは、ヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体の製造及びその分離・精製につい
て研究を進めたところ、ヒト血漿にヒトプラスミノーゲ
ンアクチベーターを添加することにより、多量のプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体が形成され
ること、リジンセフアロースに吸着させたヒトプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体をε−アミノ
カプロン酸の濃度を直線的に上げるとGlu−プラスミノ
ーゲン及びLys−プラスミノーゲンと分離，溶出するこ
とを見出した。
ンインヒビター複合体の製造及びその分離・精製につい
て研究を進めたところ、ヒト血漿にヒトプラスミノーゲ
ンアクチベーターを添加することにより、多量のプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体が形成され
ること、リジンセフアロースに吸着させたヒトプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体をε−アミノ
カプロン酸の濃度を直線的に上げるとGlu−プラスミノ
ーゲン及びLys−プラスミノーゲンと分離，溶出するこ
とを見出した。
さらに上記のリジンセフアロースを用いて分離，溶出し
たヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合
体画分中に微量存在するヒトプラスミン−α２−マクロ
グロブリン複合体及びプラスミノーゲンは、ヒドロキシ
アパタイトカラムとゲルロ過を用いた高速液体クロマト
グラフイーにより分離できること、かくしてヒトプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を高度に精
製しうることも併せて見出した。
たヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合
体画分中に微量存在するヒトプラスミン−α２−マクロ
グロブリン複合体及びプラスミノーゲンは、ヒドロキシ
アパタイトカラムとゲルロ過を用いた高速液体クロマト
グラフイーにより分離できること、かくしてヒトプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を高度に精
製しうることも併せて見出した。
さらにヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター
複合体を形成させる前に予め、ヒト−α２−マクログロ
ブリンの不活性化剤を添加しておくと、ヒトプラスミン
−α２−マクログロブリン複合体の形成が著しく抑制さ
れることができると共にヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体の収量を増大させることがでる
ことが見出された。
複合体を形成させる前に予め、ヒト−α２−マクログロ
ブリンの不活性化剤を添加しておくと、ヒトプラスミン
−α２−マクログロブリン複合体の形成が著しく抑制さ
れることができると共にヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体の収量を増大させることがでる
ことが見出された。
本発明は、かゝる知見に基いて到達されたものであり、
第１の発明はヒト血液または血漿にプラスミノーゲンア
クチベーターを添加することを特徴とするヒトプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体の製造方法で
あり、第２の発明はヒト血液または血漿にヒトα２−マ
クログロブリンの不活性化剤を添加し、次いでプラスミ
ノーゲンアクチベーターを添加することを特徴とするヒ
トプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の
製造方法であり、第３の発明はヒト血液または血漿にプ
ラスミノーゲンアクチベーターを添加し、しかる後得ら
れた反応混合物をヒドロキシアパタイトカラムと接触せ
しめ、次いでゲルロ過することを特徴とするヒト血液ま
たは血漿からその中に含まれるヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターをヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体として分離する方法であり、第４の発明は
ヒト血液または血漿にヒトα２−マクログロブリンの不
活性化剤を添加し、次いでプラスミノーゲンアクチベー
ターを添加し、しかる後得られた反応混合物をヒドロキ
シアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲルロ過する
ことを特徴とするヒト血液または血漿からその中に含ま
れるヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体として分離する方法である。
第１の発明はヒト血液または血漿にプラスミノーゲンア
クチベーターを添加することを特徴とするヒトプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体の製造方法で
あり、第２の発明はヒト血液または血漿にヒトα２−マ
クログロブリンの不活性化剤を添加し、次いでプラスミ
ノーゲンアクチベーターを添加することを特徴とするヒ
トプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の
製造方法であり、第３の発明はヒト血液または血漿にプ
ラスミノーゲンアクチベーターを添加し、しかる後得ら
れた反応混合物をヒドロキシアパタイトカラムと接触せ
しめ、次いでゲルロ過することを特徴とするヒト血液ま
たは血漿からその中に含まれるヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターをヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体として分離する方法であり、第４の発明は
ヒト血液または血漿にヒトα２−マクログロブリンの不
活性化剤を添加し、次いでプラスミノーゲンアクチベー
ターを添加し、しかる後得られた反応混合物をヒドロキ
シアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲルロ過する
ことを特徴とするヒト血液または血漿からその中に含ま
れるヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体として分離する方法である。
以下本発明方法について更は詳細に説明する。ヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の形成： ヒト血漿（pooled plasma）中の凝集物をロ紙で除き、
セフアロース4Bカラムに通した後、予め適当な緩衝液
（0.15M NaClを含む50mM Tris−HCl pH7.4）で平衡化し
ておいたリジンセフアロースカラムに続けて流し、プラ
スミノーゲン除去血漿を得る。この血漿中のα２−プラ
スミンインヒビターのモル数の約1/2のプラスミノーゲ
ンを新たに添加する。室温で攪拌しながら、血漿1ml当
たり912Uのウロキナーゼを30分おきに数回に分けて血漿
に滴下し加え、最後に最終濃度が1mM DFP,10U/mlアプロ
チニン,5mMベンザミジンになるように、プロテアーゼイ
ンヒピターを加え、反応を停止する。
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の形成： ヒト血漿（pooled plasma）中の凝集物をロ紙で除き、
セフアロース4Bカラムに通した後、予め適当な緩衝液
（0.15M NaClを含む50mM Tris−HCl pH7.4）で平衡化し
ておいたリジンセフアロースカラムに続けて流し、プラ
スミノーゲン除去血漿を得る。この血漿中のα２−プラ
スミンインヒビターのモル数の約1/2のプラスミノーゲ
ンを新たに添加する。室温で攪拌しながら、血漿1ml当
たり912Uのウロキナーゼを30分おきに数回に分けて血漿
に滴下し加え、最後に最終濃度が1mM DFP,10U/mlアプロ
チニン,5mMベンザミジンになるように、プロテアーゼイ
ンヒピターを加え、反応を停止する。
以上の操作によつて、ウロキナーゼでプラスミノーゲン
はプラスミンに変換し、このプラスミンは瞬時的にα２
−プラスミンインヒビターと複合体を形成する。
はプラスミンに変換し、このプラスミンは瞬時的にα２
−プラスミンインヒビターと複合体を形成する。
上記操作において、プラスミノーゲンアクチベーターと
してウロキナーゼを使用しているが、それ以外他のアク
チベーター、例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー（tissue plasminogen activator），血管組織由来プ
ラスミノーゲンアクチベーター（vascular plasminogen
activator）も同様に使用することができる。
してウロキナーゼを使用しているが、それ以外他のアク
チベーター、例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー（tissue plasminogen activator），血管組織由来プ
ラスミノーゲンアクチベーター（vascular plasminogen
activator）も同様に使用することができる。
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体
の分離； 前記方法により得られたプラスミン・α２−プラスミン
インヒビター複合体を含む血漿をリジンセフアロースに
通し、リジン結合部位を有するタンパクであるプラスミ
ン，プラスミノーゲン，ヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体及びヒトプラスミン−α２−マ
クログロブリン複合体をリジンセフアロースに吸着せし
める。他方複合体を形成していないヒトα２−プラスミ
ンインヒビターは吸着せず、前記のタンパクとは分離す
ることができる。このリジンセフアロースを適当な洗浄
液（例えば1M NaCl,10U/mlアプロチニンを含む,50mM Tr
is−HCl pH7.2）で充分に洗浄する。次にε−アミノカ
プロン酸の0mMから25mMの直線濃度勾配をかけて、リジ
ンセフアロースカラムからヒトプラスミン・α２−プラ
スミンインヒビター複合体を溶出する。この操作によ
り、血漿中に存在するプラスミン及びプラスミノーゲン
とプラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体と
を分離することが可能である。かくして分離，分散した
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体
画分を濃縮し、適当な緩衝液（例えば10mMリン酸緩衝液
pH6.8）に対して透析後、高速液体クロマトグラフイー
を用いて、微量に含まれるプラスミノーゲンを分離，除
去する。カラムはヒドロキシアパタイトカラムを用いリ
ン酸10mMから200mMの直線濃度勾配で、複合体画分とプ
ラスミノーゲンを分離した。続いて、この複合体画分を
ゲルロ過し、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体とヒトプラスミン−α２−マクログロブリ
ン複合体を分離する。
の分離； 前記方法により得られたプラスミン・α２−プラスミン
インヒビター複合体を含む血漿をリジンセフアロースに
通し、リジン結合部位を有するタンパクであるプラスミ
ン，プラスミノーゲン，ヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体及びヒトプラスミン−α２−マ
クログロブリン複合体をリジンセフアロースに吸着せし
める。他方複合体を形成していないヒトα２−プラスミ
ンインヒビターは吸着せず、前記のタンパクとは分離す
ることができる。このリジンセフアロースを適当な洗浄
液（例えば1M NaCl,10U/mlアプロチニンを含む,50mM Tr
is−HCl pH7.2）で充分に洗浄する。次にε−アミノカ
プロン酸の0mMから25mMの直線濃度勾配をかけて、リジ
ンセフアロースカラムからヒトプラスミン・α２−プラ
スミンインヒビター複合体を溶出する。この操作によ
り、血漿中に存在するプラスミン及びプラスミノーゲン
とプラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体と
を分離することが可能である。かくして分離，分散した
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体
画分を濃縮し、適当な緩衝液（例えば10mMリン酸緩衝液
pH6.8）に対して透析後、高速液体クロマトグラフイー
を用いて、微量に含まれるプラスミノーゲンを分離，除
去する。カラムはヒドロキシアパタイトカラムを用いリ
ン酸10mMから200mMの直線濃度勾配で、複合体画分とプ
ラスミノーゲンを分離した。続いて、この複合体画分を
ゲルロ過し、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体とヒトプラスミン−α２−マクログロブリ
ン複合体を分離する。
上記リジンセフアロースを使用する代りに各種タンパク
のリジン結合部位に親和性を有する不溶性担体であれ
ば、他のものであつても使用でき、ε−アミノカプロン
酸の濃度勾配は0mMから100mMの範囲、好ましくは0mMか
ら25mMが適当である。またヒドロキシアパタイトカラム
からの溶出におけるリン酸の濃度勾配は0mMから500mMの
範囲、好ましくは10mMから200mMが適当である。
のリジン結合部位に親和性を有する不溶性担体であれ
ば、他のものであつても使用でき、ε−アミノカプロン
酸の濃度勾配は0mMから100mMの範囲、好ましくは0mMか
ら25mMが適当である。またヒドロキシアパタイトカラム
からの溶出におけるリン酸の濃度勾配は0mMから500mMの
範囲、好ましくは10mMから200mMが適当である。
前記した本発明方法において、ヒトプラスミン−α２−
プラスミンアクチベータ複合体を形成させる前にヒト血
漿を塩酸モノメチルアミンなどのヒトα２−マクログロ
ブリンの不活性化剤を添加しておくとヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体の純度及び収量を
向上させることができる。
プラスミンアクチベータ複合体を形成させる前にヒト血
漿を塩酸モノメチルアミンなどのヒトα２−マクログロ
ブリンの不活性化剤を添加しておくとヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体の純度及び収量を
向上させることができる。
前記説明した方法は、ヒト血漿を原料とする場合につい
て述べたが、ヒト血液に対しても同様に本発明方法を適
用できる。
て述べたが、ヒト血液に対しても同様に本発明方法を適
用できる。
以上本発明によれば、ヒト血液又はヒト血漿からヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を製造
することができ、しかも選択的に容易に精製された該複
合体を分離することができる。
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を製造
することができ、しかも選択的に容易に精製された該複
合体を分離することができる。
以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。
実施例１ リジンセフアロースに通したヒト血漿250mlに、新たに
9.30mgのプラスミノーゲン精製標品を加え、室温で攪拌
しながらウロキナーゼを徐々に滴下し、加え、ヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を生成さ
せた。228,000Unitのウロキナーゼを添加したところで
最後に最終濃度が1mMDFP,10Unit/mlアプロチニン,5mMベ
ンザミジンになるように加え、反応を停止した。次にカ
ラム体積が50mlのリジンセフアロースに、ウロキナーゼ
添加により得られたヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体を含む血漿265mlを流し、1M NaCl,1
0Unit/mlアプロチニンを含む50mM Tris−HCl pH7.4で充
分洗浄後、0mMから25mM濃度のε−アミノカプロン酸の
直線濃度勾配でヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の溶出を行なつた。この操作により、プ
ラスミン,Glu−プラスミノーゲン及びLys−プラスミノ
ーゲンと複合体を分離溶出し得られた複合体画分をヒド
ロキシアパタイトカラムを用いた高速液体クロマトグラ
フイーを行なつた。
9.30mgのプラスミノーゲン精製標品を加え、室温で攪拌
しながらウロキナーゼを徐々に滴下し、加え、ヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を生成さ
せた。228,000Unitのウロキナーゼを添加したところで
最後に最終濃度が1mMDFP,10Unit/mlアプロチニン,5mMベ
ンザミジンになるように加え、反応を停止した。次にカ
ラム体積が50mlのリジンセフアロースに、ウロキナーゼ
添加により得られたヒトプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体を含む血漿265mlを流し、1M NaCl,1
0Unit/mlアプロチニンを含む50mM Tris−HCl pH7.4で充
分洗浄後、0mMから25mM濃度のε−アミノカプロン酸の
直線濃度勾配でヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の溶出を行なつた。この操作により、プ
ラスミン,Glu−プラスミノーゲン及びLys−プラスミノ
ーゲンと複合体を分離溶出し得られた複合体画分をヒド
ロキシアパタイトカラムを用いた高速液体クロマトグラ
フイーを行なつた。
ヒドロキシアパタイトカラムに吸着したタンパクの溶出
は、10mMリン酸緩衝液pH6.8から0.1M NaClを含む200mM
リン酸緩衝液pH6.8までの直線濃度勾配を用いた。溶出
した複合体画分を透析，濃縮後、ゲルろ過（G4000SWカ
ラム；高速液体クロマトグラフイー，東洋曹達（株）
製）を行ない、ヒトプラスミン−α２マクログロブリン
複合体を分離し、ヒトプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体精製品を得た。純度の確認は、7.5％
ゲル濃度のSDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて行
つた。ヒドロキシアパタイトカラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）及びゲルろ過により、ヒトプ
ラスミンインヒビター複合体を精製し得た。
は、10mMリン酸緩衝液pH6.8から0.1M NaClを含む200mM
リン酸緩衝液pH6.8までの直線濃度勾配を用いた。溶出
した複合体画分を透析，濃縮後、ゲルろ過（G4000SWカ
ラム；高速液体クロマトグラフイー，東洋曹達（株）
製）を行ない、ヒトプラスミン−α２マクログロブリン
複合体を分離し、ヒトプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体精製品を得た。純度の確認は、7.5％
ゲル濃度のSDSポリアクリルアミド電気泳動を用いて行
つた。ヒドロキシアパタイトカラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）及びゲルろ過により、ヒトプ
ラスミンインヒビター複合体を精製し得た。
リジンセフアロース，ヒドロキシアパタイトカラム，ゲ
ルろ過を用いて最終的に1.82mgのヒトプラスミン−α２
−プラスミンインヒビター複合体を得た。
ルろ過を用いて最終的に1.82mgのヒトプラスミン−α２
−プラスミンインヒビター複合体を得た。
上記実施例１におけるリジンセフアロースからのヒトプ
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の溶出
において、各分画における吸光度（280nm）とε−アミ
ノカプロン酸（ε−ACA）の濃度との関係を添付図１に
示した。この溶出において、カラムから溶出した分画サ
イズはそれぞれ2.0mlであり、カラムにおけるバツフア
の流速は25.7ml/hrであつた。図１において分画Ａはヒ
トプラスミン−α２−マクログロブリン複合体及びヒト
プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を含
む分画であり、分画Ｂはヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体及びGlu−プラスミノーゲンを
含む分画であり、分画ＣはLys−プラスミノーゲンを含
む分画である。
ラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の溶出
において、各分画における吸光度（280nm）とε−アミ
ノカプロン酸（ε−ACA）の濃度との関係を添付図１に
示した。この溶出において、カラムから溶出した分画サ
イズはそれぞれ2.0mlであり、カラムにおけるバツフア
の流速は25.7ml/hrであつた。図１において分画Ａはヒ
トプラスミン−α２−マクログロブリン複合体及びヒト
プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を含
む分画であり、分画Ｂはヒトプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体及びGlu−プラスミノーゲンを
含む分画であり、分画ＣはLys−プラスミノーゲンを含
む分画である。
また上記実施例１において、ヒトプラスミン−α２−プ
ラスミンインヒビター複合体の精製を確認のためのSDS
−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を図２に示した。
ラスミンインヒビター複合体の精製を確認のためのSDS
−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を図２に示した。
図２において、試料番号１は、分画Ａ（リジンセフアロ
ース溶出物）であり、試料番号２は前記分画Ａをヒドロ
キシアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲルロ過し
た後のものであり、試料番号３は、分画Ｂ（リジンセフ
アロース溶出物）であり、試料番号４は、前記分画Ｂを
ヒドロキシアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲル
ロ過した後のものであり、試料番号５はGlu−プラスミ
ノーゲンであり、試料番号６は分子量マーカーである。
なお試料番号１〜５は還元処理を行なわなかつたもので
あり、試料番号６は還元処理を行つたものである。
ース溶出物）であり、試料番号２は前記分画Ａをヒドロ
キシアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲルロ過し
た後のものであり、試料番号３は、分画Ｂ（リジンセフ
アロース溶出物）であり、試料番号４は、前記分画Ｂを
ヒドロキシアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲル
ロ過した後のものであり、試料番号５はGlu−プラスミ
ノーゲンであり、試料番号６は分子量マーカーである。
なお試料番号１〜５は還元処理を行なわなかつたもので
あり、試料番号６は還元処理を行つたものである。
実施例２ ヒト正常血漿10mlとプラスミノーゲン除去血漿200mlを
混ぜ、2M Tris−HCl pH7.4を5ml,塩酸モノメチルアミン
を43.1g添加し、最終濃度3Mとした。４℃で攪拌しなが
らウロキナーゼ溶液を滴下し、プラスミノーゲンを徐々
に活性化した。プラスミノーゲン活性が出発の反応混液
中プラスミノーゲン活性の５％以下となつたところで、
最終濃度が1mM DFP,10U/mlアプロチニン,10mMベンザミ
ジンになるようにプロテアーゼインヒビターを添加して
反応を停止した。要したウロキナーゼ量は血漿1ml当り8
64Unit,時間は20時間であつた。
混ぜ、2M Tris−HCl pH7.4を5ml,塩酸モノメチルアミン
を43.1g添加し、最終濃度3Mとした。４℃で攪拌しなが
らウロキナーゼ溶液を滴下し、プラスミノーゲンを徐々
に活性化した。プラスミノーゲン活性が出発の反応混液
中プラスミノーゲン活性の５％以下となつたところで、
最終濃度が1mM DFP,10U/mlアプロチニン,10mMベンザミ
ジンになるようにプロテアーゼインヒビターを添加して
反応を停止した。要したウロキナーゼ量は血漿1ml当り8
64Unit,時間は20時間であつた。
このヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体を含む血漿を20mMトリス緩衝液pH7.4（0.15M NaCl,
10U/mlアプロチニン,1mMベンザミジンを含む）40lに対
して充分に透析後、リジンセフアロースカラム（体積30
ml）に通し、リジン結合部位を有するタンパクを吸着さ
せた。このカラムを20mMトリス緩衝液pH7.4（0.15M NaC
l,10U/mlアプロチニン,1mMベンザミジンを含む）150ml,
20mMトリス緩衝液pH7.4（1M NaCl,10U/mlアプロチニン,
1mMベンザミジン,0.05％Tween20を含む）500ml,20mMト
リス緩衝液pH7.4（0.15M NaCl,10U/mlアプロチニンを含
む）250mlで洗浄した。次に、0mMから25mMのε−アミノ
カプロン酸の直線濃度勾配で、リジンセフアロースから
タンパクを溶出した。溶出画分を透析，濃縮後ヒドロキ
シアパタイトカラム（7.6mmφ×100mm;三井東圧（株）
製）の高速液体クロマトグラフイーを用いて、リン酸10
mMから200mMの直線濃度勾配で複合体を溶出した。続け
て、透析・濃縮後、ゲルろ過カラム（Ｇ−4000SWカラ
ム；東洋曹達（株）製）の高速液体クロマトグラフイー
でヒトプラスミン−α２−マクログロブリン複合体を分
離し、精製ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体240μｇを得た。
合体を含む血漿を20mMトリス緩衝液pH7.4（0.15M NaCl,
10U/mlアプロチニン,1mMベンザミジンを含む）40lに対
して充分に透析後、リジンセフアロースカラム（体積30
ml）に通し、リジン結合部位を有するタンパクを吸着さ
せた。このカラムを20mMトリス緩衝液pH7.4（0.15M NaC
l,10U/mlアプロチニン,1mMベンザミジンを含む）150ml,
20mMトリス緩衝液pH7.4（1M NaCl,10U/mlアプロチニン,
1mMベンザミジン,0.05％Tween20を含む）500ml,20mMト
リス緩衝液pH7.4（0.15M NaCl,10U/mlアプロチニンを含
む）250mlで洗浄した。次に、0mMから25mMのε−アミノ
カプロン酸の直線濃度勾配で、リジンセフアロースから
タンパクを溶出した。溶出画分を透析，濃縮後ヒドロキ
シアパタイトカラム（7.6mmφ×100mm;三井東圧（株）
製）の高速液体クロマトグラフイーを用いて、リン酸10
mMから200mMの直線濃度勾配で複合体を溶出した。続け
て、透析・濃縮後、ゲルろ過カラム（Ｇ−4000SWカラ
ム；東洋曹達（株）製）の高速液体クロマトグラフイー
でヒトプラスミン−α２−マクログロブリン複合体を分
離し、精製ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体240μｇを得た。
第１図はヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ
ー複合体のリジンセフアロースからの溶出パターンを示
したものである。 第２図はヒドロキシアパタイト及びゲルロ過によつて分
離，精製されたヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の確認のためのSDSポリアクリルアミド
電気泳動の結果を示したものである。
ー複合体のリジンセフアロースからの溶出パターンを示
したものである。 第２図はヒドロキシアパタイト及びゲルロ過によつて分
離，精製されたヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の確認のためのSDSポリアクリルアミド
電気泳動の結果を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂田 洋一 栃木県小山市花垣町１−13―39 (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４−20―２―304
Claims (4)
- 【請求項１】ヒト血液または血漿にプラスミノーゲンア
クチベーターを添加することを特徴とするヒトプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体の製造方法。 - 【請求項２】ヒト血液または血漿にヒトα２−マクログ
ロブリンの不活性化剤を添加し、次いでプラスミノーゲ
ンアクチベーターを添加することを特徴とするヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の製造方
法。 - 【請求項３】ヒト血液または血漿にプラスミノーゲンア
クチベーターを添加し、しかる後得られた反応混合物を
ヒドロキシアパタイトカラムと接触せしめ、次いでゲル
ロ過することを特徴とするヒト血液または血漿からその
中に含まれるヒトα２−プラスミンインヒビターをヒト
プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体とし
て分離する方法。 - 【請求項４】ヒト血液または血漿にヒトα２−マクログ
ロブリンの不活性化剤を添加し、次いでプラスミノーゲ
ンアクチベーターを添加し、しかる後得られた反応混合
物をヒトロキシアパタイトカラムと接触せしめ、次いで
ゲルロ過することを特徴とするヒト血液または血漿から
その中に含まれるヒトα２−プラスミンインヒビターを
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体
として分離する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28434985A JPH0759191B2 (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28434985A JPH0759191B2 (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62163690A JPS62163690A (ja) | 1987-07-20 |
| JPH0759191B2 true JPH0759191B2 (ja) | 1995-06-28 |
Family
ID=17677429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28434985A Expired - Lifetime JPH0759191B2 (ja) | 1985-12-19 | 1985-12-19 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759191B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117568445B (zh) * | 2024-01-18 | 2024-04-09 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
-
1985
- 1985-12-19 JP JP28434985A patent/JPH0759191B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62163690A (ja) | 1987-07-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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