JPS59118717A - プラスミノーゲン活性化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プラスミノーゲン活性剤に関し、更に詳しく
は適当な培地中でプロＴＰＡ生産細胞培養物を培養し、
ついでプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａ　（および要すればＴＰＡ）を
回収することを特徴とするＴＰＡ／プロＴＰＡカップル
をベースとする精製プラスミノーゲン活性剤の製法に関
する。ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルは薬理製剤に用いら
れる。

本明細青て用いる［ＴＰＡ／プロＴＰＡカップル」なる
用語は、例えばポウズ（Ｂｏｗｅｓ　）メラノマ細胞組
織培養から回収可能であり、以下に規定される組織プラ
スミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）または／および以下で規
定されるその前駆吻であるプロＴ　Ｐ　Ａのどちらかま
たは両方の組み合せを意味するものとする。

ＴＰＡは、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔｉｓｓｕｅ
ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）に対し
て、当該技術分野で用いられる略語であり、例えはホウ
ズ（Ｂｏｗｅｓ　）メラノマ細胞において同定された二
重鎖型プラスミノ−ケン活性剤について用いられる。

プロＴＰＡはＴ　Ｐ　Ａ前駆物（ｐｒｏｃｕｒｓｏｒ　
ｏｆ　ＴＰＡ）の略語であり、即ちＴＰＡと同じ分子量
を有し、かつある酵素により二重鎖Ｔ　Ｐ　Ａに転換さ
れる一重鎖化合物である。従来技術文献によれは、−重
および二重鎖形状の両方は実質上同一の活性を有すると
されている。本発明は、その観点から％は全く異なる知
見を含んでいる。

プラスミノーゲン活性剤は、プラスミノーゲン（プラス
ミン前駆＠）への作用によりプラスミンを生成する物質
である。そして、プラスミンはフゝイブリン（または凝
血）に作用してフィブリンを液化または溶解させる。プ
ラスミンはフィブリン前駆動であるフィブリノ−ケンの
溶解現象も起こす０ 前述の効果は、自然のフィブリン溶解系において大切な
役割を果たす。プラスミノーゲン活性機構を通して局部
的なフィブリン溶解または蛋白溶解活性を生じさせるこ
とが望まれる血栓症または他の病状の処置のためのプラ
スミノーゲン活性剤の治療投与においてもプラスミノー
ゲン活性剤は用いられる。

プラスミノーゲン活性剤は、生体外のフィブリン溶解を
含む科学テスト、診断テストまたは病理学テストのため
の試薬としても使用することができる。

２つのヒトプラスミノーゲン活性剤が広範囲ニ使用され
ている。第１の活性剤は、非蛋白溶解機構により作用す
るバクテリア蛋白、ストレプトキナーゼである。第二の
活性剤は、尿または培養腎臓細胞から得られるプロテア
ーゼ、ウロキナーゼであるか、ウロキナーゼは他のほと
んどの種類の咄乳類組織において生じることが知られて
いる。

この２つの化合物は、その作用か凝血におけるフィブリ
ンに関係したプラスミノーゲンに限定されないという治
療上の欠点を有する。これらの化合物か一般に血液循環
においてプラスミノーゲンに作用し、結果としてフィブ
リンの前駆吻であるフイブリノーゲンの広範囲の溶解に
伴って広範にわたってプラスミンを発生させる。これに
より、血液の非効果的な通常凝集の結果として、出血状
態が導かれる。更に、ウロキナーゼは、単離および製造
に高くつくという不利を有し、現在用いられている方法
によっては低い収量でしか得られない。

この不利は、フィブリン溶解治療以外のウロキナーゼの
貴重な用途にもあてはまり、このような用途での貴重な
市販品であるウロキナーゼの入手可能性を限定する。ス
トレプトキナーゼは、異種蛋白であり、患者に免疫反応
を誘引する。生ずる抗体はプラスミノーゲンに対するス
トレプトキナーゼの作用を中和し、よって治療効能を減
少させる。

一般に「組織プラスミノーゲン活性剤」、本明細書では
［ＴＰＡＪと略称する第三のプラスミノーゲン活性剤も
存在することが知られている。この酵素はたいていのヒ
ト組織に見られ、生体外で培養されるヒトメラノマ細胞
の特性分泌生成物でもある酵素と同一であるかまたは区
別がつかない。

−ｒ　Ｐ　Ａはウロキナーゼが行なうのとほとんど同じ
ようにプラスミノーゲンの蛋白溶解活性を触媒するが、
多くの重要な点でウロキナーゼと異なっている。この２
つの酵素は、化学的に異なっている。

分子量が異なっており、一方の酵素は他方の酵素の抗体
と反応しない。−ｒ　Ｐ　Ａの触媒作用はフィブリンに
より高められるが、ウロキナーゼはそうではない。Ｔ　
Ｐ　Ａはフィブリンに結合するという大切な性質を有す
るが、ウロキナーゼは結合しない。

これらの事実は、ＣＤｉｎｇｅｍａｎ　Ｃ，Ｒｉ　ｊｋ
ｅｎ等、”　Ｐｕｒｉｆｉｃａ（ｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｐｌａｓ
ｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　５ｅｃｒｅｔｅ
ｄ　ｂｙｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　　ｃｅｌｌｓ
　　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ″（Ｊ。

ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ、、　２５６
．　Ｎ０１３．７０３５−７０４１　）　　という最近
の論文に記されている。この論文は、冴通のヒト組織か
ら同様に培養ヒトメラノマ細胞からＴＰＡを製造するこ
とをも記載している。精製方法は洗剤存在下で亜鉛キレ
ート−アカロース、コンカナバリン−Ａアガロースおよ
びセファデックスＧ−１５０のクロマトグラフィーから
構成される。

フイブリノにＴＰＡの結合する傾向、フィブリンの存″
在下おおいに高められたＴＰＡのフィブリン溶解作用、
およびウロキナーゼなら０・にストレプトキナーゼと比
較した場合フィブリンの不在下てプラスミノ−ケン活性
剤として比較的劣るＴＰＡの作用が積み重なって、ＴＰ
Ａがヒトの血栓治療のプラスミノ−ケン活性剤に選択さ
れる。フィブリンとＴＰＡの間のかなりの程度の相互作
用は、凝血部分にプラスミン生成を局在化させ、ウロキ
ナーゼまたはストレプトキナーゼを使用する場合に見ら
れるような無差別なプラスミノーゲン活性化の影響を静
めるか、または回避する。更に、ストレプトキナーゼは
免疫化学的にヒトに対して異質蛋白であるが、ＴＰＡは
そうではない。

Ｗ、Ｗｅ　ｉ　ｍａ　ｒ等、”　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　
１ｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ａｎｉｌｉｏｆｅｍｏｒａｌ　
　ｃｈｒｏｍｂｉｓ　ｂｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ
ｏｎｏｆ　ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　（ｔｉｓｓｅ　ｔｙｐ
ｅ）　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ”　
（Ｌａｎｃｅｃ、　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　７．１０１８（
１９８１））という最近の報告は、ヒトの血栓症の処置
におけるＴＰＡの臨床的有用性を試験しているｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｔｈｒｏｍｂｏｌ　ｙ
ｓｉｓＰ　、Ｗａ　Ｉ　ｌ　ｅ　ｎ等（Ｐｒｏｇ、　Ｃ
ｈｅｍ、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉ込５．１６−２３　
（１９８１））によｈは、ＴＰＡは２つの異なった形状
で生じ、１つは一重鎖形状であり；この−重鎖形状はプ
ラスミンまたはトリプシンによりジスルフィドブリッジ
で結合する二重鎖に転化する。この著者らは、この二重
鎖を一重鎖の分解生成物と考えた。二重鎖形状は、フィ
ブリン溶解テスト系（生体外）において−重鎖形状より
フィブリン溶解性について効果的であると言える。アプ
ロチニンは、唯一のまたは優先する形状として一重鎖形
状か回収される様に、二重鎖形状への一重鎖の転化を妨
害する。両方の形状は組織プラスミノーゲン活性剤であ
ると考えられる。

この研究にツイテは、Ｄｉｎｇｅｍａｎ、　Ｒｉｊｋｅ
ｎ、ＨｏｙｌａｅｒＬｓ　　およ０：’　Ｃｏｌ　ｌ　
ｅｎの更に最近の出版吻（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、、　２５７．２９２０−２９２５　（１９８２）、ヨ
ーロッパ特許出願第０．０４１，７６６号）が参照され
、彼らは、両者の「プラスミノーゲン活性化性質は・・
・・・・同じである。」とプラスミノ−ケン活性剤とし
て両方の形状を記載している。

−重鎖形状は、フィブリン凝血に吸着された場合、フィ
ブリン溶解が「主に二重鎖誘導体を通して起こる」よう
にすぐに二重鎖形状に転化することを彼らは示唆した。

彼らは、「この転化は、フィブリン溶解の調節における
役割を果たしていると思えない。」と結論している。彼
らの発見によれば、［二つの分子形状は同じ活性（溶解
時間）を持ち」、かつ［両方の分子形状の触媒効果は実
質的に同じであるので、−重鎮形状は活性が低い前駆物
であるとか、二重鎖形状は活性か低い分解生成物である
とは考えられない」。前述の結論が全く正しいかそうで
ないにしても、両方の１分子形状」が生体外の溶解と同
じくらい治療上の有用性を有することは明らかである。

実際に、本発明者らの最近の研究結果所見によると、前
述の結論がある限定を必要とすることは明らかである。

プロＴＰＡは本当の意味でＴＰＡの前駆物であるか、全
く不活性な前駆物ではない。

プロＴＰへの固有活性はＴＰＡの約１／ｌＯであるので
、これだけに基づいて、プロＴＰＡがその最大限の治療
効果を発現する前にＴＰＡにまず初めに転化せねばなら
ないプロ″ｒＰＡよりもＴＰＡを治療目的で投与するこ
とは好ましいと即座に考えられる。

実際、ヨーロッパ特許出願０．０４１，７６６号には、
プロＴＰＡと同様にＴＰＡを多分衣わす２つの化合物が
記載されているが、後者の化合物だけがフィブリン溶解
、フィブリノーゲン溶解および血栓溶解効果に関して特
色がある。プロＴ　Ｐ　Ａについてのこのような記載お
よび薬理組成吻とじてのプロＴＰＡ使用に関する特別な
記載はない。化合物が特異である程度での化合物の薬理
的使用は、二重鎖形状、即ちＴＰＡに対してたけ特許請
求されている。唯一の出版された実際の治療における物
質の使用において、二重ストランド形状ＴＰＡを使用し
ている（　Ｗｅｉｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｔｈｅ　
Ｌａｎｃｅｔ。

ＮＯＶ、７．１０１８−１０２０（１９８１））。

前述の従来技術によれは、商業的規模で二重鎖ＴＰＡお
よび本明細書中で［プロＴＰＡＪと言っている一重鎖形
状切を容易に製造する方法は知られていなかった。

本発明者らの最近の提案（南アフリカ特許出願第８２／
９１６８号およびこれに基つく他国の出願であり、該出
願は現時点で当該技術水準の一部ではない。）によると
、商業的規模でたやすく製造する方法が提供されている
。

本発明の目的は、特に精製プラスミノーゲン活性剤製造
のために溶液からＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡの選
択的可逆的吸着の新規で比較的簡単な方法を提供するこ
とである。

本発明の特別な目的は、要すれば精製ＴＩ’Ａ、しかし
好ましくは精製プロＴＰＡおよびプロＴＰＡが主である
ＴＰＡとプロＴＰＡの精製混合吻を製造する新規な方法
を提供することである。更なる目的は、ＴＰＡおよびプ
ロＴＰＡをウロキナーゼから分離するのを可能にする前
述の方法および所望ならウロキナーゼの分離回収に適用
される方法を提供することである。

要すればＴＰＡ、しかし好ましくはプロＴＰＡまたはプ
ロＴＰＡが主である両者の混合吻の製剤を提供すること
も目的である。

ＴＰＡを凌ぐプロＴＰＡの以前には知られていなかった
性質および有益性に基づいた薬理製剤であり、該製剤は
血栓症および塞栓症の治療において有益に使用されるた
けでなく、このような疾病の予防も行なう薬理製剤を提
供することは特別な目的である。

本発明の一つの要旨は、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルを
ベースとする精製されたプラスミノーゲン活性剤の製法
であって、プロＴＰＡ生産細胞培養物を適当な培地中に
おいて培養するにあたり、細胞をプロＴＰＡからＴＰＡ
への変換を触媒する酵素の不在下、または該酵素が存在
した場合には該酵素を阻害するのに適した阻害剤の存在
下に培養して、カップルが５０〜１００％プロＴＰＡお
よび残部のＴＰＡて示される収穫液を生産し、溶解した
プｏ　Ｔ　Ｐ　Ａおよび不純物を含む収穫液を、エリス
リナ　ラテイツンマおよび他のエリスリナ種の種子中に
生成し、かつトリプシン、プラスミンおよびＴＰＡの阻
害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型の固定化
クーニッッ型阻害剤を含んで成る親和試薬と密接に接触
させ、これにより選択的にプロＴＰＡおよび存在するＴ
ＰＡを媒体から吸着し、プロＴＰＡおよび存在するＴＰ
Ａを負荷した親和試薬を水性媒体および非吸着不純物と
の接触から除き、プロＴＰＡおよび存在する’ｒ　Ｐ　
Ａを親和剤から脱着し、ついで脱着したプロＴＰＡおよ
び要すればＴＰＡを回収することを特徴とする製法に存
する。

ウロキナーゼをも生産する細胞培養を使用するならは、
収穫液中のプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａおよび存在するＴＰＡはウ
ロキナーゼにより不純になっており、ウロキナーゼは非
吸着不純物とともに除かれてそれから要すれば貴重なる
生成吻として回収される。゛好ましくは水性媒体、即ち
収穫液はメラノマ細胞培養物を培養することから作られ
る。

エリスリナ　ラテイツシマ（ＥｒｙｔｈｒｉｎａＬａｔ
ｉｓｓｉｍａ、　　広葉エリスリナ）および他のエリス
リナ種の種子は、２つの蛋白分解酵素阻害剤をＣｈｅｍ
、、３６２．５３１　５３８）。この２つの阻害剤は、
上記文献ではＤＥ−１およびＤＥ−３と呼ばれている。

ＤＥ−１は牛のキモトリプシンを阻害し、牛のトリプシ
ンを阻害しないか、ＤＥ−３は牛のトリプシンを阻害し
、牛のキモトリプシンを阻害しない。ＤＥ−３はクーニ
ア　７　（Ｋｕｎｉ　ｔｚ）型酵素阻害剤としての性質
およびトリプシン、プラスミンならびにＴＰＡの阻害剤
としての性質を有するが、ウロキナーゼに効果を有さな
い。ＤＥ−３は、何百もの酵素阻害剤のスクリーニング
の後、ＴＰＡとウロキナーゼを区別できる唯一の阻害剤
として選はれた。こめ阻害剤が、例えば自体既知の方法
で固定化されるならば、以前は知られていなかったＴＰ
Ａの前駆物質、プロＴＰＡと同様にＴＩ’Ａを吸着によ
り選択的に抽出して親和試薬を形成する。しかし、非吸
着不純物は水溶液中に残る。ＤＥ−３はプラスミンの阻
害剤であるので、ＴＰＡおよび／′ｆ、、たはプロＴＰ
Ａ供給源として適当な水溶液に普通存在するプラスミン
作用によるプロ、ＴＰＡＯＴ　Ｐ　Ａへの転化を阻害す
る。従って、この固定化された阻害剤は、プロＴＰＡの
吸着剤として用いる場合、顕著なる性質を有する。ＤＥ
−３の更に完全な化学特性は、前述のＪｏｕｂｅｒｔら
の文献に記述されている。

ウロキナーゼは水溶液中に存在するとしても吸名されな
い。従って、ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡがウロキ
ナーゼにより汚染されている場合にも本発明の方法にお
いて親和試薬を使用でき、ウロキナーゼは非吸着不純物
とともに除かれる。

このことは、ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡがウロキ
ナーゼとの混合物として生じている種々の組織のような
多数の供給源からプロＴＰＡおよびＴＰＡを回収するの
にこの方法を適用できることを意味する。

しかし、プロＴＰＡおよび要すればＴＰＡを水性媒体か
ら抽出するに用いられる特に好ましい水性媒体は、細胞
の分泌生成物におけるプロＴＰＡおよび０〜５０％のＴ
ＰＡを含むヒトメラノマ細胞の組織培養から得られる、
好ましくは血清を含まない収穫液である。

好ましい態様に従えは、プロＴＰＡおよび存在するＴＰ
Ａは、これらを含む水性媒体を親和試薬＋１ｉｊへ通過
させることより吸着され、次いで層を洗浄し、プロＴＰ
Ａおよび存在するＴＰＡを脱着させ、脱着したプロＴＰ
Ａおよび存在するＴＰＡを層から洗い出す。Ｊ曽はカラ
ムの形状をしていてよい。

脱着は、好ましくは約１〜３モル／Ｉ！（例えば１．４
〜２モル／ｌ！、好ましくは１．６モル／ｌりのカリウ
ムチオシアネート水溶液を用いて行う。この場合、該化
合物はＴＰＡが安定であるｐＨにおいて、好ましくはほ
ぼ中性のリン酸緩衝塩水（例えばＮａＣＡ’については
０．３〜１モル／ｌ、好ましくは約０．４モル／Ｉりに
溶解され、好ましくは安定化量の適当な界面活性剤（例
えば０．１％の１”ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００またはＴｗ
ｅｅｎ）を存在させる。

脱着は、カリウムチオシアネート以外のカオトロピック
（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　）脱着剤によって行ってもよ
い。脱着は、低いｐＨ１例えは２〜３．５、好ましくは
２．８〜３て行われてもよい。他の適当な脱着条件は、
高一度の塩水および／またはアルギニンの存在および／
またはベンズアミジンの存在である。このような脱着条
件は、当該技術者には既知であるので、詳細には記述し
ない。

本発明に従っても、プロＴＰＡを含まないＴＰ溶液中の
プロＴＰＡをプラスミンまたはプロＴＰＡに等価効果を
有する酵素にさらすことによって、容易に触媒的にＴＰ
Ａへ転化することができる。

まだ同定されていないそのような酵素は、ＴＰＡへのプ
ロＴＰＡの転化がフィブリンの存在下で起こるのと同じ
理由で、例えばライフリン中で生じる。カリクレインも
また、効果は低いが、この効果を生じる。

本発明に従って製造されたプロＴＰＡは、これが少しの
プラスミノ−ケン活性剤性質しが有さない一重鎖化合物
であるか、ＴＰＡ　（分子量７２，０００ドルトン）が
二重鎖化合物であり、プロＴＰＡの約１０倍の強さであ
る著しいプラスミノーゲン活性を有するという点におい
て、ＴＰＡと異なっていることが見い出された。プロＴ
ＰＡはＴＰＡと同じ分子量を有する。

ｍ−重鎖形状における弱い活性の故および二重鎖ＴＰＡ
かすっと活性であるという知見の故、生体内で凝結溶解
過程でより効果的なのはＴＰＡ形であるので、従来技術
において薬理組成物中にＴＰＡ形（即ち、二重ストラン
ド分子形状）のプラスミノーゲン活性剤を使用する強い
動機が通常あった。

この考えは、プロＴＰＡが非常に弱い活性であるという
知見により確固たるものにされる。

しかし、驚くべきことに、プラスミノーゲン活性剤のフ
ィブリン溶解効果か利用される血栓症の処置および他の
治療のための薬理組成物の活性成分として、ＴＰＡを使
用するよりプｏＴＰＡ形のプラスミノーゲン活性剤（好
ましくは少なくとも主としてプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａを含み、
更に好ましくは全部かプロＴ　Ｐ　Ａである。）を使用
することに確信てきる理由があることが実験証拠により
立証された。

この理由は、プロＴＰＡがＴＰＡ形よりもフィブリンへ
の吸着のより高い親和性を有すること、およびプロＴＰ
Ａがフィフリンヘ吸着すると非宮に速（ＴＰＡに転化さ
れ、次いてこれを必要とする正にその場所で、即ち凝血
部分て最大限の所望の活性が得られるということである
。この発見から下される結論を以下に示す。

（ａｌ　　プｏＴＰＡは、より迅速にかつ完全に凝集フ
ィブリン部分、すなわち活性剤を実際上必要とする場所
に吸着される。その場所でプロＴＰＡはフィブリンにあ
る蛋白分解酵素によりＴＰＡに迅速に転化され、Ｔ　Ｐ
　Ａの最大限のプラスミノ−ケン活性剤活性は凝血の実
際部分て直ちに利用されるようになる。

ｆｂ）　　プロＴＰＡは、フィブリン溶解をもたらすこ
とにおいてＴＰＡより選択的である。なぜなら、プロＴ
ＰＡはフィブリンに結合するまで比較的不活′匣であり
、その場でＴＰＡに転化することによって最大限に活性
になるからである。ＴＰＡには、フィブリン溶解効果を
必要とする血栓部分でなくて血流でのプラスミノーゲン
を活性化させる約１０倍の可能性がある。このかなりの
可能性は、フィブリン部分へ吸着するＴ　Ｐ　Ａの低い
親和性によって更に増加される。

（Ｃ）　　血流において激しく減少された活性のため、
未来に血栓または塞栓が起こる危険性のある場合の予防
にプロＴＰＡを用いることを確信をもって勧めることが
できる。

ｆｄ）　　一方、急性の血栓閉塞において比較的多い投
薬量を用いる場合、副作用の危険性を減少させる。

（ｅ）ＴＰＡは生体内で短い半減期を有する。プロＴＰ
Ａの性質は、プラスミノ−ケン活性剤の利用をより効果
的にすることである。一方ではプロＴＰＡは血流にある
時の無効な反応によって消費される可能性が低く、他方
ではプロＴＰＡは、プロＴＰＡか有用であり得る凝血部
分に迅速に「捕捉」される可能性が制い。

前記の知見における大切な概念に基づいて、本発明は、
プラスミノーゲン活性機構を通して局在的フィブリン溶
解または蛋白溶解活性を生じさせることが望まれる血栓
症、塞栓症または他の疾病の治療または予防のための薬
理組成物であり、該薬理組成物は、５０〜１００％のプ
ロＴＰＡおよび０〜５０％のＴＰＡから成るＴＰＡ／プ
ロＴＰＡカップルと筏示されるプラスミノーゲン活性剤
成分を含んで成り、該組成物は、ＴＰＡ／プロＴＰＡカ
ップル１５■を越えない投与単位で静脈投与またはＴＰ
Ａ／プロＴＰＡカップル注入速度１５■／２４時間を越
えない静脈注入に適用され、ＴＰＡ１５ｍ７／２４時間
を越えない投与から生じる平均プラスミノーゲン活性剤
活性の５０％以下、好ましくは５〜３０ｚ１例えば２０
％の平均プラスミノーゲン活性剤活性を血流において生
しさせるのに適用されることを特徴とする薬理組成物を
提供する。残りの点については、処置方法に関して前述
したところが必要な変更を加えて薬理組成物に適用され
る。

本発明は、プラスミノーゲン活性機構を通してフィブリ
ン溶解または蛋白溶解活性を生じさせることが望まれる
血栓症、塞栓症または他の疾病の処置または予防のため
のフィブリン溶解処置方法であり、該方法は、５０〜１
００％のプロＴＰＡおよび０〜５０％のＴＰＡから成る
ＴＰＡ／プロＴ　Ｐ　Ａカップルと衣示されるプラスミ
ノーゲン活性剤成分を設定された投与速度で患者の静脈
に投与し、ＴＰＡ１５７１１１２／２４時間と越えない
投与から生じる平均プラスミノーゲン活性剤活性の５０
％以下、例えは５〜３０％の平均プラスミ／−ケン活性
剤活性を血流において生じさせることを特徴とするフィ
ブリン溶解処置方法のために用いられる。

好ましくはＴＰＡ／プロＴＰＡカップルの投与量は１５
ｍｇ／２４時間を越えない。ＴＰＡ／プロＴＰＡカップ
ルは、好ましくはプロＴＰＡ３０〜７０％およびＴＰＡ
Ｑ〜３０％、更に好ましくはプロＴＰＡ８Ｑ〜１００％
およびＴＰＡＱ〜２０％から成る。

血清中でのプラスミノーゲン活性剤活性がＴＰＡ１５η
／２４時間を越えない投与から生じるプラスミノーゲン
活性剤活性の２０％より少ない状態を維持することは好
ましい（かつ治療的に有効な投与でのプロＴＰＡの低い
活性のため、容易に実現できる。）。

本発明方法は、血栓閉塞がすでに生じた場合の血栓症、
塞栓症の処置に適用されてよく、ＴＰＡ／プｏＴＰＡカ
ップル３〜１５　ｍｆ７２４時間を患者へ静脈に投与す
ることを特徴とする。投与はＴＰＡ／プロＴＰＡカップ
ル３〜１５７ｆｌｌｉ’の投薬単位で行なわれうる。投
与は、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップル注入速度１／８〜５
／８ｉｙ／時の静脈注入によっても行なわれつる。

本発明は、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップル１〜ｌＯキの投
薬単位で患者に静脈投与するか、または１”ＰＡ／プｏ
　Ｔ　Ｐ　Ａカップル注入速度０．５〜２　ｍｇ／時で
プラスミノーゲン活性組成物を静脈注入することを特徴
とする血栓閉塞を含む疾病の予防にも特に適用できる。

このような処置は、危険状態にあり券りなから血栓症ま
たは塞栓症の徴候を全く示さない患者に施されてよい。

例として、静脈血行停止のためにひどい静脈血栓症およ
び塞栓症を特に患いがちである寝たきり患者および衰弱
患者が挙けられる。他の例として、冠状動脈血栓閉鎖が
起こりそうな不安定な狭心症の患者がある。別の例とし
て、血栓部位が存在し、脳塞栓の危険性のある心臓弁膜
症患者がある。例として、心膜腔または大血管は、凝血
が移動して心臓血管閉塞を起こす（発作）危険が存在す
る様な部位または損傷を有する患者がある。例として、
補綴血管弁膜、心房細動およびやや急性のバクテリア性
心内膜炎などを有する患者もある。本発明方法は、大静
脈へ静脈を挿入する場合および刺激剤溶液を注入する場
合、静脈の血栓閉塞ンよび／または塞栓を生じそうであ
る静脈治療または非経口栄養を受ける患者の予防処置に
有用である。

投与のため連続静脈注入は好ましいが、断続的な一気の
静脈投与は２〜２４時間毎に例えば１〜１０ｍ２の前記
投薬量で適用されてよい。

本発明は、本明細書の一部分である特許請求範囲で更に
最大限に規定されているように、前記用途に使用するた
めに特に調製および適用される種々の薬理組成物を提供
する。

本発明により、精製ＴＰＡまたプＣ）ＴＰＡを分離して
または混合物として調剤できる。

本発明により、ＴＰＡおよびプラスミンおよび／または
プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン活性剤を含む
水性触媒体からＴＰＡを回収できる。このために、水性
媒体中のプラスミンを阻害して、プラスミンが阻害され
ている間に水性媒体からプロＴＰＡを除去することが要
求される。これらのことから、存在するＴＰＡは、阻害
されねハナラないプラスミンの形成を起こすプラスミノ
ーゲン活性剤として作用することが指摘される。

本発明に従って、前記方法において、プロ１゛ＰＡへの
親和性を有するとともにプラスミンの固定化阻害剤を含
んで成る親和試薬によって水性媒体からプロ”ｒＰＡを
吸着し、次いで親和試薬がらＴＰＡを脱着してプロＴＰ
Ａを精製状態で回収する。

このように回収されたプロＴＰＡは次に、殺菌消毒され
、生理的に適合可能な安定剤により安定化され、静脈注
入できる水性溶液の形にされる。

本発明に従って親和試薬として固定化形状で使用される
ＤＥ−３阻害剤は偶然にプラスミンの阻害剤であり、し
かもプラスミンはＴＰＡおよびプロＴＰＡか回収される
媒体中に普通存在し、プロＴ　、Ｐ　ＡをＴＰＡに転化
する性質を有するので、プロＴＰＡを同時に単離するた
めのＤＥ−３阻害剤の使用はプロＴＰＡをプロＴＰＡ形
状に保つ役目を果たす。

本発明の他の要旨に従うと、両方のプラスミノーゲン活
性剤（そのもの自体または前駆物として）を含む水性媒
体からウロキナーゼと分離してまたはとともにＴＰＡお
よび／またはプロＴＰＡを選択的に吸着することは可能
である。これは、一方でウロキナーゼ無含有精製ＴＰＡ
および／またはプロ’］’　Ｐ　Ａまたは他方でＴＰＡ
およびプロＴＰＡ無含有精製ウロキナーゼまたは両方を
含む精製プラスミノーゲン活性剤の製造に適用される。

これは、そのような水性媒体を、エリスリナ　ラテイツ
ンマおよび他のエリスリナ種の種子中に生成し、かつト
リプシン、プラスミンおよびＴＰＡの阻害剤であるが、
ウロキナーゼには作用しない型の固定化クーニッッ型阻
害剤を含んで成る親和試薬と接触させ、これにより選択
的にＴＰＡおよび／またはプロＴ　Ｐ　Ａを媒体から吸
着し、ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡを負荷した親和
試薬を、ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡがなくなった
が、またウロキナーゼを含む水性媒体との接触から除去
し、ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡのな（なった水性
媒体からウロキナーゼを回収することにより実施される
。この方法に適当な水性媒体は、媒体の両方のプラスミ
ノーゲン活性剤を含むので、任意の哺乳類組繊細胞の水
性抽出物であってよく、またそのような細胞の分泌物を
含む媒体であってよい。もう一度述べるが、吸着された
ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡは脱着、回収され、も
し所望なら選択性親和試薬に吸着される前または後にプ
ロＴＰＡはＴＰＡに転化してよい。

ウロキナーゼは水性媒体から適当な方法で、例えばウロ
キナーゼに親和性を有する親和試薬を用いて水性媒体か
ら吸温されることより、回収されてよい。そのような親
和試薬は、ウロキナーゼを上まわって１”ＰＡに選択性
を有さない固定化阻害剤であってよい。親和試薬として
自体既知の方法で適当に固定化された抗ウロキナーゼ抗
体を使用することも可能である。

本発明の方法での使用のため、クーニッッ型阻害剤は、
エリスリナ　ラテイツシマおよび他のエリスリナ種の種
子中に生成し、かつトリプシン、プラスミンおよびＴＰ
Ａの阻害剤であるが、ウロキナーゼには作用しない型で
あり、例えば担体に共有結合されることより固形担体に
結合されて固定化されている。例えは、阻害剤は、当業
者に既知である方法で臭化シアン活性化アガロースに結
合されてよい。しかし、阻害剤が結合する板面の性質の
化学性質に依存するが、他のカップリング剤および他の
固形担体が使用されてよい。例としては、次のものか挙
けられる。

［ａ）　　遊離カルボキシル基へ遊離アミン基を結合さ
せるカルホジイミドヵップリング剤。

（ｂ）前もってアミノアルキル形に転化したアガロース
へＮＨ２基を結合させるグルタルアルデヒドカップリン
グ剤。

（Ｃ）　　アルデヒド官能基を生成し、次にｐＨ４〜６
で阻害剤のアミンと反応してシッフ塩基を形成し、次い
でナトリウムポロハイドライドまたはナトリウムシアノ
ボロハイドライドによって還元する過ヨウ素酸塩活在化
アガロース。

（ｄ）　　アガロースは、ヒドラジドスクシニル誘導体
に転化してよく、この為、カルボキシル配位子はＥＤＣ
，またはジアゾ化によってアミンと結合してよい。

（ｅ）　　セルロース繊維または粒子は、ヒドラジド誘
導体に転化され、Ｐａｒｉｋｈらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎ　ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ、　３４．　７７〜ｌ　
Ｑ　２．　　ｅｄｉｔｏｒｓ”ＷＢ　Ｊａｋｏｂｉ　　
ａｎｄ　Ｗｉｌｃｈｅｃｋ　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ
ｒｅｓｓＮＹ）に従って用いられてよい。

（ｆ）　　ポリアクリルアミド粒子は、直接グルタルア
ルデヒド法またはＰ−アミノベンズアミドエチル誘導体
もしくはヒドラジド誘導体のジアゾ化によって結合され
てよい。

（ｇ）　　蛋白質、例えばアルブミンまたはトリプシン
またはゼラチンは、例えばヒドラジドの形で結合してよ
い。

（ｈ）　　最後に、蛋白質で被覆され得るガラス粒子（
または他の固形物）も使用されてよく、蛋白質として、
南アフリカ特許出願第８１／４４８１号、および海外対
応特許である西ドイツ特許出願Ｐ３２２４８３７．７号
、特願昭５７−１１６０８６号、イギリス特許出願８２
１９０７０号、アメリカ合衆国特許出願３”９２１１１
号に記載されているカツブリング法に類似した方法によ
って阻害剤に結合し、架橋してよいゼラチンか挙けられ
る。

前記の方法は、当該業者に既知であり、かつ／または示
した文献に記載されているので、更に詳しくは述べない
。

本発明の親和試薬は、例えは前に詳しく述べたような方
法て、ＴＰＡおよび／またはプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａあるいは
１’　Ｐ　Ａおよび／またはプロＴＰＡを含んで成る製
剤を製造するのに用いられてよい。しかし、親和試薬も
、診断または分析の試薬としての有用性を有しうる。

本発明の範囲は、Ｔ　Ｐ　ＡとプｏＴＰＡの精製混合物
および特にプロＴＰＡのＴＰＡに対する比か１：ｌを越
える混合物と同様に、本発明に従って精製されたプロＴ
ＰＡをも含むものである。

高い比、例えば９：１またはそれ以上の高い比を得るた
めに、プロＴＰＡのＴＰＡへの転化を触媒する酵素不在
の適当な媒体中、またはこのような酵素（これを含む媒
体として血清がある）ならびにプロＴＰＡのＴＰＡへの
転化を触媒する酵素（特にプラスミン）を阻害するのに
適用される適当な阻害剤を含む媒体中でプロＴ　Ｐ　Ａ
生産細胞培養（例えばメラノマ細胞）によりプロＴＰＡ
を生産することが提案される。適当な阻害剤は、大豆か
ら誘導されたトリプシン阻害剤またはα−１−アンチプ
ラスミンである。アプロチニンか代わりに使用され得る
（既知のように）。次いで、プロＴＰＡは、前述の触媒
不在下または阻害剤の存在下の媒体から回収される。

プロＴＰＡとＴＰＡの混合物が入手でき、両者の触媒活
性をプロＴＰＡの触媒活性に限定することが望才れるな
ら、ＴＰＡを不可逆的に阻害する阻害剤を使用すること
よりＴＰＡを除去することが可能である。これの適当な
例は、不可逆プロティアーゼ阻害剤ジイソプロピルフル
オロリン酸である。阻害剤は続いて透析またはゲルクロ
マトグラフィにより除去される。不可逆的に阻害された
ＴＰＡは混合物中に残されたままであってよい。

本発明の範囲は、生理的に適合し得る注入媒体に溶解さ
れ、本発明の方法により調製または精製された’Ｉ’　
Ｐ　Ａおよび／またはプロＴＰＡを含んて成る薬理組成
物に及ぶ。本発明の範囲は、例えは診断または病理的ま
たは一般科学の目的のため生体外でフィブリン溶解を実
施するフィブリン溶解製剤にも及ぶ。

唯一の活性成分として１”ＰＡもしくはプロＴＰＡ、ま
たは所望の比でＴＰＡならひにプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａを含ん
で成る前述の組成物を生産するのに実質的に随薫に適用
され得ることは本発明の有益性と考えられる。

以下に実施例を示すことにより、本発明を更に詳しく説
明する。

実施例１ 親和試薬の調製ニー ＤＥ−３阻害剤を以下のようにして調製した：エリスリ
ナ　ラティシマ種子をＪ　ｏｕｂｅｒｔ　らの方法に従
って採集し、加工した。種子をすりつぶし、脱脂し、０
．５　モ／ｌ／／　ｌ　ＮａＣＪ水溶液により１０℃で
一夜抽出した。抽出物を遠心分離し、ＤＥ−３を硫酸ア
ンモニウム沈殿により上澄みから回収シ、続いてセファ
デックスｃ５　ｏ、ＤＥＡ−セ／Ｌ’ロースオよびＤＥ
Ａ−セファローズのクロマトクラフィーニカケタ。最終
精製物は、０．１％ドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　
）含有１５％ポリアクリ。

ルアミドゲルの電気泳動に付した場合、みがけ分子量２
２．０００ドルトンの単一バンドとして移動した。

精製ＤＥ−３（２６ｙｉｉｒ）を市販臭化シアン活性化
アガロース５ｍｌに通常方法で結合させた（調製物の使
用方法も教示するＰｈａｒｍａｃ　ｉａ　により市販さ
れているセファローズ４ｂ）。親和試薬は、ＮａＣＡ’
　０．４モル／Ｉ！、０．１　ＸＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−
１０□（当該技術において普通使用される市販界面活性
剤）および０．０２％ナトリウムアジド安定剤を含むＰ
Ｈ７，４のリン酸緩衝液に対して平衡化させた。

この親和試薬を使い捨てプラスチックシリンジの円筒か
ら造られた５ｍｌのカラムに充填した。

実施例２ ＴＰＡおよびプロＴＰＡの調製および精製ニーＴ　Ｐ　
Ａ　ｇよひプロＴＰＡを含む媒体を以下のようにして製
造した。ポウズ（Ｂｏｗｅ　ｓ　）　細胞ＲＰＭＩ−７
２７２（コロ、ラド、デンバー在、デンノ戸院から入手
可能。Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６．７０
３５−７０４１に記述されている。）として知られる細
胞系列のヒトメラノマ細胞を、１０％熱不活性（５６°
Ｃ１３０分間）胎児牛血清（Ｆｅ２）および抗生物質（
ペニシリン３００μ９／ｒｎｌ、ストレプトマイシン２
００■／−およびチロシン１０〜／　ｍｌ　）を補充し
たＲＰＭＩ−１６４０組織培養媒体に付着単一層として
成長させた。集合している（約４　Ｘ　１０５細胞／ｃ
−Ｊ）細胞をトリプシン分解に付し、５Ｘ１０５細胞／
１００ｍｍ皿で再植する。

媒体を吸い出した後、細胞をトリスダルベツコ塩水（Ｎ
ａ２ＨＰＯ４０，１ミリモル／１ＸＫＣＩ！　５ミリモ
ル／　ｌ、　ＮａＣ１！０．１４　モル／　ｌ、トリス
ＨＣｌ２４８ミリモル／／！を含むＰＨ７，４の液）中
の０．２５％トリプシン液中で３７℃で５分間培養した
。分離した細胞を穏やかにピペットで移動させることよ
り分散させ、プロテアーゼを中和するために分散液をＦ
ｅ２を含む媒体を含む等体積の媒体に加えた。３５０Ｇ
で５分間の遠心分離により細胞を洗い、新しい皿に再植
した。

この原培養物から、７５ｃ＋４または１５０ｃＪの組織
培養フラスコ中で付着単一層として細胞を育成し、１０
％ＦＣ５の入った媒体中で細胞をほぼ融合するまで育て
た。プロＴＰＡ　：　１”ＰＡの最終比を１：１以上に
するために、血清の蛋白溶解酵素（即ちプラスミン）を
実施例５で更に詳しく記述しているようにもしくはアプ
ロチニンで阻害するか、または除去した。培養物を一度
洗い、血清を含まない媒体２０ｍ１で被覆した。２４時
間後、媒体を集め、新しい媒体を加えた。

全細胞および細胞片を除くため、収穫液を２００Ｏｒｐ
ｍで５分間遠心分離した。溶液をＴｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−
１００（０，１％）またはＴ’ｗｅｅｎ　（Ｑ、　１％
）で安定化し、氷酢酸テ酸注化Ｌ　（ｐＨ５，５〜６．
０　）、−２０’Ｃで貯蔵した。

収穫液２７？を、Ｎ　ａ　Ｃｌ：に関しテ０．４　モル
／　ｚ　ニし、０．４５μｍ膜でｒ過した。ρ過収穫液
を室温において流速４５ｄ／時で親和カラムに適用した
。

４℃で流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン
溶解油圧の存在を測定した。ＴＰＡまたはプロＴＰＡは
検出されなかった。

全収穫液をカラムに通過させた後、ＮａＣＡ’　０．４
モ）Ｌｉ／！および０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００
を含む６倍カラム容量のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）てカ
ラムを洗った。この方法により、ＴＰＡ７たはプロＴＰ
Ａは溶出しなかった。

吸着した蛋白質は、カリウムチオシア第一ト１．６モル
／　／ｊ　、　ＮａＣｌ０．４モル／ｌおよび０．１％
ノＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含むＰＢＳを用いて溶
出された。

２８００ｍの吸収を読むことより、蛋白質含量を測定し
た。

溶出緩衝液にカリウムチオシアネートを加える場合、全
てのプラスミノーゲン依存フィブリン溶解活性剤は溶出
し、鋭いピークとして見られ、このピークは蛋白質の小
さなピークに一致する。

最も高い活・圧を有する分画を貯留して、−２０℃で貯
蔵される６〜８ｍｌの溶液を得た。この分画はカラムに
適用された活・圧の７０〜８０％を示す。

低い油圧を有する分画は、別に貯留される。この両方の
貯留物中の全回酸油・比は通常、９０〜１００％になる
。カリウムチオシアネート溶出液は、純粋なＴＰＡおよ
びプロＴＰＡの混合物に一致する分子量７２．０００ド
ルトンの蛋白質の単一ハンドを含み、別のランにおける
後者は全体の約３９〜５０％またはそれ以上になる。

同一カラムをくり返して何度も使用すると、収量は向上
する。カラムは何度も再使用するのに効果的であるたけ
でなく、事実使用すると良くなる。

ＴＰＡが固定化形状にない場合に阻害剤ＤＥ−３に付着
する・上質を有するので、これは驚くべきことである。

実施例３ ＴＰＡおよび／またはプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａを含む薬理製糸
１ｊ　二　− ＴＰＡおよび／またはプロＴＰＡを含む貯留分画を０，
０１容量％のＴｗｅｅｎ８Ｑを含むＮａＣＪｏ、３モル
／ｌ水溶液で透析し、−８０℃で貯蔵する。

投与前に濃度をＴＰＡとプロＴＰＡ７５μｇ／ｍｌ（治
療目的でのＴＰＡの投与速度はプロＴＰＡと同じである
。）およびＮａＣＪｏ、３モル／ｌに調節した。０．２
２１ｒ　ｍ’ｌｆ’過膜によるρ過により溶液を殺菌す
る。

溶液を投与速度３〜１５ｍＦ／２４時間、典型的には７
．５ｍ’ｉ／’２４時間で注入し、静脈投与する。

理想的には投与速度は、処置の間、血中の全プラスミノ
ーゲン活・匠（前駆物を含む）レベルか０．６〜１、好
ましくは約０．８国際車位／ｄになる様でなくてはなら
ない。そのような濃度での処置は血覆材府栓をきれいに
するのに効果的であるのがわかっており、全身的フィブ
リン石解は観測されない。

しかし、プロ１１’　Ｐ　Ａはフィブリンに結合してか
らＴＰＡに転化するのみなので、血流中にある時の実際
的な活′匠は、全プラスミノ−ケン活・吐剤が最大限に
活性なＴＰＡ形にある場合に存在する活性の１０％程度
の小さいものであることがわかる。

さらにプロＴＰＡはＴＰＡより速く、強くフィブリンに
よって吸着されるからである。無差別反応が更に減少さ
れる。

実施例４ メラノマ細胞の大量培養ニー Ｒｏｓｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ
５ｔｉｔｕＬｅ培地１６４０および１０％Ｆ　ＣＳをつ
めたスピナーフラスコに濃度５　Ｘ　１０５細胞／　ｍ
Ａでメラノマ細胞を接種した。フラスコを３７℃に保ち
、３０ｒｐｍでマグネット攪拌した。フラスコ容積の１
％／時の速度で媒体をフラスコからポンプで外へ出し、
５％ＣＯ３を含む空気と平衡にある新鮮な媒体を同速度
で入れる。ガラスウールで出口ガラス管を詰めた培養容
器中に細胞を保つ。回収した媒体をミリポアフィルタ−
でρ過する。

集めた液を低温殺菌し、実施例２に従って培養すること
ができる。

実施例５ プロＴ　Ｐ　Ａ高生産メラノマ細胞の培養ニー十分な大
豆トリプシン阻害剤または血清プラスミンを阻害するα
−ｌ−アンチプラスミンを培養媒体に加えて、実施例２
を変形した。他の点では、実施例２をくり返し、最終生
成物のプｏ　Ｔ　Ｐ　Ａの１’　Ｐ　Ａに対する比はほ
ぼ９二１に増加した。実験の詳細は次の通りである。

ボウズ（Ｂｏｗｅｓ　）細胞培地は０．１　％（７）　
Ｔｒ　ｌ　ｔ　ｏｆｉおよ０’　１０　Ｋ　Ｉ　Ｕ　Ｔ
ｒａｓｙｌｏｌ　（ブーｙスミン阻害剤）を含んでいた
。元の収穫液は体積１９６ｏ−であった・カリウムチオ
シアイード溶出液は体ｉ　２０．８−であった。ＴＰＡ
＋プロＴ　Ｐ　Ａの回収は１００％であり、そのうち８
７％がプロＴＰＡであった。

Ｔ’ｒａｓｙｌｏｌを用いない比較実験を実施すると、
回収は９８％であり、これは全部ｌ″ＰＡであり、プロ
ＴＰＡは検出されなかった。

実施例６ プロＴＰＡと１’　Ｐ　Ａの混合物での残存ＴＰＡの除
去ニー ＴＰＡおよびプロＴＰＡの溶液のジイソプロピルフルオ
ロリン酸を１０ミリモル／ｌにする。ｐＨを８に調節す
る。４時間後、ＴＰＡは永久に阻害される。それから残
存する阻害剤を透析により除去する。

実施例７ プロＴＰＡのＴＰＡへの転化ニー 蛋白質１００μｇ／ｒｎｌ含有の水溶液をプラスミン５
μｇ／ｍｌ含有の同体積のリン酸緩衝塩水と混合シ、２
０℃で１６時間培養する。ドデシル硫酸ナトリウムを最
終重度０．１％になる様に加え、６％トリクロロ酢酸で
蛋白質を沈殿させる。沈殿物をアセトンで洗い、１％ド
デシル硫酸ナトリウムおよび１０％グリセロールを含む
トリスＨＣ１！０．０６モル／ｌのｐＨ６，８の液に溶
解する。

この処理の後、プロＴＰＡは活性ＴＰＡへ完全に転化し
たことが電気泳動により示された。

実施例８ 不溶化フィブリンへのプロＴＰＡの選択性ニ一種々の割
合のプロＴＰＡ　（残りはＴＰＡ）含有ＴＰＡ／プロＴ
Ｐ八カッへルのサンプルについて、各々の場合にフィブ
リンへ結合する物質の割合を確証するために同一条件下
で試験した。

ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルのサンプル中のプ口１”Ｐ
Ａの割合（残りはＴ　Ｐ　Ａ　）を、プラスミンによる
処理（プロＴＰＡをＴＰ八に転化するため）の前後にお
けるサンプルのフィブリン溶解活性を測定することより
決定した。その後、プロＴＰＡはＴ　Ｐ　ＡのＩＯＸの
フィブリン溶解活性を有するという事実があるので、補
正するために補正係数１０％を適用した。０１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ　ｇ＝　１００　　含有トリスＨＣＪ　Ｏ，１モ
ル／ｌのｐＨ８，１の液にサンプルを希釈すると、プラ
スミノーゲン数μｇの存在下で、ヨウ素１２５でラベル
され、かつリンプロウェルズ（Ｌｉｍｂｒｏ　ｗｅｌｌ
ｓ）の底を被覆していたフィブリンの約３０〜５０％が
１時間のうちに０、２　ｍｌで解放された。放射性同位
ヨウ素でラベルされたフィブリンで被覆されたリンプロ
ウェルズに少量（ｏ、２ｍｚ）を４回加えた。０℃で１
時間培養後、２つのウェルをトリスＨＣ１！で３回処理
し、結合していないＴＰＡを除去した。その後結合活性
を決定した。この結果を洗浄していないウェルて得られ
た結果と比較した。結果を第１表に示す。

結果（−１、プｏＴＰＡが実質的にＴＰＡより完全にフ
ィブリンに結合することを示している。

第　　１　表 実施例９ 予防処置ニー 血栓症または塞栓症の実質的な危険性のある患者に予防
処置を行なった（注：手術後またはパーテム（Ｐａｒｔ
ｅｍ　）直後には、この処置を禁忌と指示する。）。適
当な患者としては、静脈血行停止のためにひどい静脈血
栓症および塞栓症を患いがちである寝たきりまたは衰弱
した患者、冠状動脈血栓閉鎖が起こりそうな不安定な狭
心症患者、病んた心臓腔または大血管、補綴血管弁膜、
心房細動、やや急性のｆくクチリア性心内膜炎を有する
患者、および刺激剤溶液での静脈処置を受けている患者
を含む。

実施例１０ プロＴ’　Ｐ　Ａのプラスミノ−ケン活性化活性が大抵
の酵素前駆物のように０ではないが、二重鎖ＴＰＡへの
完全な転化後の活性の１０％であることが決定された。

この効果プロＴＰＡ５Ｑ〜１００％およびＴＰＡＯ〜５
０％から成るＴＰＡ／プロＴＰＡカップルの投与（一度
が最も高い注入時でさえ、生体内での物質の半減期と関
係を有する。）が、当量のＴＰＡの投与から生じるのよ
りすっと低い活性を血流で生じることである。これは第
２表より理解される。

第２衣 第２筏は、プロ１’　Ｐ　ＡがＴＰＡがＴＰＡ活性の１
０％である活性を有するという新発見の事実だけから生
じる血流での無差別なプラスミノ−ケン活性の減少した
可能性を示す。これに加えて、プロＴ　Ｐ　Ａはフィブ
リン部分に到達するとすぐに選択的に（即ち、速くかつ
強く）血流から吸着されるという新発見の効果もある（
実施例８参照）。

この種の処置のための投薬速度は、断続的パルス静脈投
与により２〜２４時間毎に１〜１０ｍｇである。このた
めに、０，０１容量％のＴｗｅｅｎ８Ｑおよび所望によ
りアルブミンまたはマイ、トールのような従来の安定剤
を含む塩０．３モル／ｌの塩水５−に所望の量１〜１０
■を溶解させて成るアンプルを作る。

注入溶液は、プロＴＰＡ／ＴＰＡカップル投薬速度０，
５〜２ｖｒｇ／時に設計された濃度の同じ媒体で作られ
る。

典型的なそのような溶液は、４〜１６ｍｇ／Ｉ！、平均
８■／ｌのＭ度である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルをベースとする精製さ
   れたプラスミノーゲン活性剤の製法であって、プロＴ　
   Ｐ　Ａ生産細胞培養物を適当な培地中において培養する
   にあたり、細胞をプロＴＰＡからＴＰＡへの変換を触媒
   する酵素の不在下、または該酵素か存在した場合には該
   酵素を阻害するのに適した阻害剤の存在下に培養して、
   カップルが５０〜１００％プロＴＰＡおよび残部のＴＰ
   Ａで示される収穫液を生産し、溶解したプロＴ　Ｐ　Ａ
   および不純物を含む収穫液を、エリスリナ、ラテイツン
   マおよび他のエリスリナ種の種子中に生成し、かつトリ
   プシン、プラスミンおよびＴＰＡの阻害剤であるが、ウ
   ロキナーゼには作用しない型の固定化クーニソツ型阻害
   剤を含んで成る親和試薬と密接に接触させ、これにより
   選択的にプロＴＰＡおよび存在するＴＰＡを媒体から吸
   着し、プロＴＰＡおよび存在するＴＰＡを負荷した親和
   試薬を水性媒体および非吸着不純物との接触から除き、
   プロＴ、ＰＡおよび存在するＴＰＡを親和剤から脱着し
   、ついで脱着したプロＴ　Ｐ　Ａおよび要すればＴＰＡ
   を回収することを特徴とする製法。 ２６　　プロＴＰＡおよび存在するＴＰＡは、ウロキナ
   ーゼにより不純になっており、ウロキナーゼを非吸着不
   純物とともに除去し、所望により回収することを特徴と
   する第１項に記載の製法。 ３、水性媒体はメラノマ細胞培養物を培養することから
   誘導される第１項または第２項に記載の製法。 ４、プロＴ　Ｐ　Ａおよび存在するＴＰＡを含む水性媒
   体を親和試薬の廊に通過させることよりプロＴＰＡおよ
   び存在するＴＰＡを吸着し、続いて層を洗浄し、プロＴ
   ＰＡおよび存在するＴＰＡを脱着し、プロＴＰＡおよび
   ／またはＴＰＡを層から洗い出すことを特徴とする第１
   項〜第３項のいずれかに記載の製法。 ５、　プラスミノーゲン活性化機構を通して局所的フィ
   ブリン溶解または蛋白分解活性を生じさせることが望ま
   れる血栓症または他の疾病の予防または治療のための薬
   理組成物であり、第１項〜第４項のいずれかに記載の製
   法により調製かつ精製されたプロＴＰＡを含んで敗り、
   注入媒体に溶解されたことを特徴とする薬理組成物。 ６、　フィブリンでのフィブリン溶解を誘導し、かつ第
   １項〜第４項のいずれかに記載の製法により調製かつ精
   製されるプロＴＰＡを活性成分の全部または主部分とし
   て含んで成る薬理組成物。 ７、　プラスミノ−ケン活性化機構を通して局所的フィ
   ブリン溶解または蛋白分解活性を生じさせることが望ま
   れる血栓症、塞栓症または他の疾病の予防または治療の
   ための薬理組成物であり、プロＴＰＡ５　Ｑ〜１００％
   およびＴＰＡＱ〜５０％から成り、かつＴＰＡ／プロＴ
   ＰＡカップルで衣わされるプラスミノーゲン活性剤を含
   んでなる薬理組成物であり、該組成物は、静脈注入また
   は投薬単位での静脈投与に適用され、ＴＰＡ４５ｍ！？
   ／２４時間を越えない投与から生じる活性の半分より少
   ない平均プラスミノーゲン活性を血液中で生じる様に調
   剤されたことを特徴とする薬理組成物。 ８、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップル１５　ｍｑを越えない
   断続的静脈注入用の投薬単位である第７項に記載の薬理
   組成＠。 の ９、２４時間治療のためＴＰＡ／プロＴＰＡ力／＼ ツプル３〜１５■の投薬単位である第８項に記載の薬理
   組成物。 １０、静脈注入に適用され、かつ投薬速度３〜１５ｍ１
   ７２４時間（１／８〜５／８ｍｇ／時）で処方される第
   ７項に記載の薬理組成物。 １１、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルはプロ丁ＰＡ７０〜
   １００％およびＴＰＡＱ〜３０％で衣わされることを特
   徴とする第７項〜第１０項のいずれかに記載の薬理組成
   物。 １２、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルはプロＴＰＡ８０〜
   １００％およびＴＰＡ□〜２０％で衣わされることを特
   徴とする第７項〜第１１項のいずれかに記載の薬理組成
   物。 １３、ＴＰＡ／プロＴＰＡカップルは木質的に純粋なプ
   ロＴＰＡで表わされることを特徴とする第７項〜第１２
   項のいずれかに記載の薬理組成物。 １４、血栓症または塞栓症を生じるような疾病の予防の
   ための、Ｔ”　Ｐ　Ａ　／プロＴＰ′Ａカップル１〜１
   ０ｍｆの静脈投与のための投薬単位でのまたはＴＰＡ／
   プロＴＰＡカップル注入速度０．５〜２〜／時で適用さ
   れる注入溶液の形である第７項に記載の薬理組成物。 １５、エリスリナ　ラティッシマおよび他のエリスリナ
   種の種子中に生成し、かつトリプシン、プラスミンおよ
   びＴＰＡの阻害剤であるが、ウロキナーゼには作用しな
   い型の固定化クーニツッ型阻害剤を含んで成る親和試薬
   とプｏＴＰＡおよび要すればＴＰＡを含む水性媒体を密
   接に接触させ、これにより選択的にプロＴＰＡおよび存
   在するＴＰＡを媒体から吸着し、プロＴＰＡおよび存在
   するＴＰＡを負荷した親和試薬を、プｏ　Ｔ　Ｐ　Ａお
   よび存在するＴＰＡのなくなった水性媒体との接触から
   除き、プロＴＰＡおよび要すればＴＰＡを回収すること
   から成る製法によってＴＰＡ／プロＴＰＡカップルは精
   製されたことを特徴とする第７項に記載の薬理組成物。 １６、血流への注入で、ＴＰＡ１５ｍ？７２４時間を越
   えない投与から生じる活性の５〜３０％の平均プラスミ
   ノーゲン活性剤活性を生じる様に適用されることを特徴
   とする第１項〜第１５項のいずれかに記載の薬理組成物
   。 １７、血流ヘノ注入テ、ＴＰＡＩ　５ｍｇ７２４時間を
   越えない投与から生じる活性の２０Ｘを越えない平均プ
   ラスミノーゲン活性剤活性を生じる様に適用されること
   を特徴とする第１項〜第１６項のいずれかに記載の薬理
   組成物。