JPS6226233A - 組織プラスミノ−ゲン活性化因子含有医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織プラスミノーゲン活性化因子、特に組織プ
ラスミノーゲン活性化因子を含有する医薬組成物、それ
らの製造およびそれらのヒトおよび動物医療におり゛る
使用に関する。

画境全形成できる酵素系−凝血系−と画境を溶解できる
酵素系−フィブリン溶解系との間の健全な開放状血管床
全維持している動的均衡があるものと考えられている。

損傷からの失血を制限するために、損傷した血管には画
境が形成される。損傷が自然に回復された後に、余分の
画境はフィブリン溶解系の作動により溶解される。時に
は、画境が外傷をともなうことなく形成され、これは主
要血管にとどまることがあり、血流全部分的にまｔは全
体的にさえも閉塞する結果金もたらす。これが心臓、肺
または脳で生じると、心筋梗塞、肺塞栓症または卒中を
発症させることがある。これらの組合せ症状は工業国に
おける罹病率および死亡率の主要因である。

画境はタンパク分解酵素プラスミンにより溶解されつる
繊維網状構造よりなる。この酵素に不活性なプロ酵素プ
ラスミノーゲン（これは血漿の成分である）からプラス
ミノーゲン活性化因子の作用により誘導される。２：Ｉ
ｆｉの免疫学的に異なる哺乳動物デラスミノーケ９ン活
性化因子が存在する。

ウロキナーゼとしても知られている内在性プラスミノー
ゲン活性化因子は腎臓により産生される酵素であり、尿
から単離できる。これはまた多くの組織培養源からも生
成できる。血管プラスミノーゲン活性化因子としておよ
び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ　−ＰＡ　）と
しても知られている外在性プラスミノーゲン活性化因子
はかなりの組織ホモジネート（特にヒト子宮）、面前細
胞壁およびいくつかの細胞培養物から単離できる。これ
らの２種のプラスミノーゲン活性化因子に加えて、ベー
ター−血液溶解性ストレプトコツシ（５ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｉ　）から生成される細菌生成物、ストレプトキ
ナーゼがある。ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ
の両方が付随する主要な欠点はこれらが循環器系全体に
活性であり、画境の部位でだけ活性ではないごとにある
。これらは、たとえばフイブリノーゲン、プロトロンビ
ン、ファクター■およびファクター■のようなその他の
血液タンパク全破壊し、かくして立坑形成能力を減じお
よび出血の危険全増大させる。これに対して、ｔ　−Ｐ
Ａ　の生物学的活性はｔ　−ＰＡが結合しており、これ
全活性化させるフィブリンの存在に依存する。かくして
、最大活性が画境の場所、すなわち溶解しようとするフ
ィブリン網状構造の存在する場所でだけ生じ、これは出
血の危険を格別に回避させる。

ｔ　−ＰＡ　投与の主要経路は血管内注入であり、従っ
て非経腸投与用溶液としてｔ’　−ＰＡの製剤が要求さ
れる。タンパク質の場合に、医師または獣医師に薬品を
凍結乾燥医薬組成物として提供することが好ましい。こ
れは液体製剤にまさるその有意の移送および貯蔵長所に
よるものである。しかしながら、いづれのこのような凍
結乾燥製剤も不当に不便で困難な問題全付随することな
く所望の非経腸投与用溶液に容易に変換でき、および医
師または獣医師がこの製剤を適量の溶剤中で再構成する
ことにより単純にいづれか指定の状況に要求される濃度
金得ることができることが重要である。

たとえば、心臓または腎臓の障害ｔ−Ｗする患者に大量
の溶液全投与することは、患者の心臓または腎臓により
大きいことさえあるストレス全厚えることから望ましく
ない。従って、投与容量はこのよう表状況で最低に維持
されるべきである。従って、非経腸投与用溶液は比較的
低濃度であるばかりでなく、また高い薬物濃度を有する
ものとして得ることができることが望ましい。

ｔ　−ＰＡの多くの凍結乾燥医薬製剤が従来技術で、友
とえばＥＰ−Ａ−１１３３１９およびＦＢＩ’　−Ａ−
１２３３０４に開示されている。これらの製剤はその−
４がほぼ中性であるｔ　−ＰＡの水性塩類溶液から製造
され、このような溶液中におけるｔ　−ＰＡの溶解度は
イオン性濃度全増加しないと低いという欠点に！する。

従って、このような凍結乾燥製剤から得られる非経腸投
与用溶液は成る状況では望ましくない大量の溶液全患者
に投与する必要があるほど低い濃度でｔ−ｐＡ’２含有
しているか、または高張性であって、投与すると赤血球
に対しＣ！害であることがあるかのいづれかである。

ここに、ｔ−ＰＡの水溶液中における溶解度が、浴液の
ｐＨ’に酸性範囲内にすると改善できること、凍結乾燥
医薬製剤’６ｔ−ＰＡの酸性溶液から製造できること、
およびこの寒剤が投与した場付に有意の生理学的問題全
示さない非経腸投与用酢液全提供できることが見い出さ
れた。従って、本発明にｔ　−ＰＡの凍結乾燥医薬製剤
全製造する方法？提供し、この方法はｐＨが２〜５であ
るｔ　−ＰＡの冷凍水溶液全乾燥させることよりなる方
法である。

ｔ　−ＰＡの改善された溶解度の結果として、ｔ−ＰＡ
が溶液から沈殿析出するいづれかの実質的な危険を付随
することなく、高濃度でｔ−ｐＡ’６含■する非経腸投
与用溶液を提供できる凍結乾燥医薬製剤が本発明に従い
製造できる。従って、本発明により必要な時および必要
な場合に、製剤ｔＸとえば中性または酸性−の水を使用
して所望の濃度に溶解できる医師または獣医師に凍結乾
燥製剤を提供できる。すなわち、本発明はその取り扱い
が極めて柔軟であって、医師および獣医師により使用で
きる安定な凍結乾燥医薬展剤を提供するとともに、移送
および貯蔵がさらに簡便な手段を提供する。

本発明で使用するｔ　−ＰＡは哺乳動物に実質的に対応
するいづれかの生物活性タンパク質、特にヒトｔ　−Ｐ
Ａであることができ、グリコジル化している形およびグ
リコジル化していない形のもの全包含する。これは１ｐ
−４−１１２１２２に記載されているような１鎖形また
は２鎖形ｔ　−ＰＡであることができ、充分にグリコジ
ル化しているヒトｔ　−ＰＡの場合に、ｆ１７　［１，
０００のポリアクリルアミドデルにもとづく見掛は上の
分子量および７．５〜８．０の等電点’ｋｌｌＮする。

好ましくは、ｔ　−ＰＡｉ！約５　［１０，Ｄ　００工
Ｕ／Ｉｎ９の比活性ｒｗする〔工Ｕ、／ダー国際単位／
１！Ｊ９；国際単位はＷＨＯ、ナショナル　インスチチ
ュート　フォア　バイオロジカル　スタンタート　　ア
ンド　コントロール（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　工ｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ　ｆｏｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ１日ｔａｎｄ
ａｒｉａ　ａｎｉ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　）、ホーリイ　ヒ
ル、ハムプステッド、ロンドン（Ｈｏ１ｌｙ　　Ｈｌｌ
ｌ、Ｈａｍｐｅｔｅａｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ　）　ＮＷ　
３　６１Ｂ、英国により規定されているとおりの活性単
位である〕。

ｔ　−ｐＡのアミノ酸配列は好ましくは第１図に記載の
配列に実質的に相当する。すなわち、この配列は第１図
の配列と同一であるか、または対立形質源あるいはその
他の一種またに二種以上のアミノ酸の欠落、置き換え、
挿入、転位ま友は付加全含み、生成する配列は第１図の
配列と少なくとも８０％、好ましくは９０チの相同性’
に一’Ｎし、このタンパクの同一の生物学的および免疫
学的性質全基本的に保有している。特に、ｔ−ＰＡ配列
は第１図の配列と同一であるか、あるいはセリンＮ−末
端から°２４５２４５番目にメチオニンの代りにバリン
を有する以外は同一配列含有し、これらどちらの配列も
場合により、彫りの６個のアミノ酸のいづれかが存在し
ていないか、またに場合によりＧａｙ　−Ａｌａ−Ａｒ
ｇの追加のポリペプチド全方末端先行配列金有する。

第１図に示されているアミノ酸配列は６５のシスティン
残基に！し、従って１７のジスルフィド橋金形成する能
力全方する。構造がさらに詳細に決定されているその他
のタンパクとの同族性にもとづき、９０番目の位置のア
ミノ酸とプロリンＣ−末端との間の配列についての仮定
構造が第２図に示されている。第２図において、＊印は
２鎖形鎖はセリンプロテアーゼ領域を含有する。このＮ
−末端領域の構造は確定していないが、いくつかの提案
が提示されている〔プログレス　イン　フィブリツリシ
ス（Ｐｒｏｇｒθｓｓ　ｉ、ｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙａ
ｉ、ｓ　）、１９８６年、３．２６９〜２７６頁；およ
びゾロ２・　ナトル、アカド、サイ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　）　１９８４年、８１．５６５５〜５６５９
頁参照〕。ｔ　−ＰＡの構造の最も重要な特徴はこのタ
ンパク全フィブリンに結合する役目をはたしている２つ
の環状部分（９２番目のアミノ酸と１７６番目のアミノ
酸の間および１８０番目のアミノ酸と２６１番目のアミ
ノ酸との間）およびＢ鎖の主要領域を含むことおよび、
プラスミノーゲンの活性化の役目をはた丁セリンプロテ
アーゼ領域にある。セリンプロテアーゼ領域における特
別に重要なアミノ酸は触媒的三ツ組アミノ酸、）（１８
／　Ａ８ｐ／　Ｂａｒである。ｔ　−ＰＡにおいては、
これらに６２２番目、６７１番目および４６６番目に位
置している。２６４番目および６９５番目のシスティン
アミノ酸残基もまた重要であり、これらはｔ　−ＰＡの
２つの鍋形のＡ鎖とＢ＠とｋ　−緒に保持している。

第１図および第２図において、アミノ酸残基について下
記のとおりの慣用の１字記号および６字記号を使用し几
： 八日ｐＤ　　アスパラギン酸　　　工１θ　エ　インロ
イシンＴｈｒ　　Ｔ　　スレオニン　　　　　　Ｌｅｕ
　　ＴＪ　　ロイシンＳｅｒ　　Ｓ　　セリｙ　　　　
　　　　Ｔｙｒ　　Ｙ　　チロシンＧｌｕ　　Ｅ　グル
タミン酸Ｐｈθ　Ｆ　フェニルアラニンＰｒｏ　　Ｐ　
プロリン　　　　　　Ｈｌ［３ＨヒスチジンＧｌｙ　　
Ｇ　グリシン　　　　　　　Ｌ７Ｂ　Ｋ　リジンＡｌａ
　　Ａ　アラニン　　　　　　　ＡｒｇＲアルヤニ７０
７日　Ｃシスティン　　　　　　Ｔｒｐ　　Ｗ　　）リ
プトファンＶａｌ　　Ｖ　　バリン　　　　　　　　Ｇ
ｉｎ　　Ｑ　　グルタミンＭｅｔ　　Ｍ　メチオニン　
　　　　　Ａｓｎ　　Ｎ　　アスパラギンｔ　−ＰＡは
当技術で既知のまたは開示されている製造方法のいづれ
かにより得ることができる。

−例として、ｔ−ＰＡＵバイオキミカ　エ　バイオフィ
シ力　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ、ｍ１ｃａ　ａｔ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ　）、　１９７９年、５８０、
１４０〜１５６；１ｎＰ−Ａ−４，１７６６またはＥＰ
−Ａ−１１３３１９に記載されている種類の正常ま几は
腫瘍セルラインから得ることができる。しかしながら、
ｔ−ｐＡは、友とえはＢＰ−Ａ−９３６１９：ＫＰ−Ａ
−１１７．０５９またはｇｐ−Ａ−１１７０６０に記載
されているようなりＮＡ組換え技法を用いて誘導される
培養した形質転換またはトランスフェクションされたセ
ルラインから得ると好ましい。ｔ−ＰＡの製造にチャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）細胞全使用し、モレキ
ュラー　アンド　セルラーバイオロジイ（Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ａｎｄ　（：ｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　
）、１９８５年５（７）、１７５０〜１７５９頁に記載
の方法で誘導すると特に好ましい。この方法で、クロー
ン化された遺伝子がジヒドロフオレートレダクターゼ（
ｄｈｆｒ　）　ｆ　ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞にコードする
遺伝子によりコトランスフエクションされる。形質転換
体全発現するａｈｆｒはヌクレオシド不含培地で選択さ
れ、増加する濃度のメトトレキセートにさらされる。か
くして、ａｈｆｒおよびｔ　−ＰＡ遺伝子に共に増幅さ
れて、高レベルのｔ−ｐＡｙ発現することができる安定
なセルライン全溝く。

ｔ　−ｐＡは好ましくは、下記の文献に記載されている
ような当技術で既知のまたは開示されている方法のいづ
れかを用いて精製す、る：バイオケミカ　エ　バイオロ
ジカルアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）、１９７９年、５８０．１４
０〜１５６貞：ジャーナル　オプ　バイオロジカル　ケ
ミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、１９
７９年、２５４（６）、１９９８〜２００６頁；同、１
９８１年、−３」トｊ−人−Ｌ」Ｌｌ、　７０３５〜７
０４１ｊＷ；ヨーロッパ　ジャーナル　オブバイオケミ
ストリイ（Ｅｕｒ、、ｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１
９８６年、１６２．６８１〜６８６貞；ＫＰ−Ａ−４１
７６６；ＩＩＰ−Ａ−１１３３１９；または（）Ｂ−Ａ
−２１２２２１９゜ 本発明の方法で使用するｔ　−ＰＡの水浴液中における
溶解度にはいづれかの上限が存在するようにはみえない
。１５０，０００．０００工Ｕ、／ｍｔ（国際単位／祷
）より大きいような極めて高い濃度でも、溶液はいづれ
の有意のｔ　−ＰＡ沈殿をともなうことなく単に粘性に
なるだけである。従って、水溶液中におけるｔ　−ＰＡ
の濃度は広い限界内、たとえば５０．０００〜５０，０
００．０００工Ｕ／祷で変えることができる。本発明か
ら最高の利益全確保する丸めには、ｔ　−ＰＡの濃度は
１００．０００工Ｕ　／　ｒＩＬｔ　より大、さらに特
に５００，００　［１工Ｕ／祷より犬、さらに特にｉ、
ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ工Ｕ／ｄより大である。ｔ　−
ＰＡの濃度が約５．０００．０００１Ｕ／ｍｔであると
最高に好ましい。

水溶液のＰＨの上限は好ましくは４．５である。実際に
、このＰ）Ｉは好ましくは２．５〜４．０の範囲、さら
に好ましくは２．８〜３．５の範囲、さらに特に好まし
くに約３．０である。水溶液の所望の−は生理学的に許
容されうる無機または有機酸を用いて得ると簡便である
。このような酸の例には塩酸、硫酸および硝酸、並びに
クエン酸、酒石酸およびベンゼンスルホン酸が包含され
る。これらの例の中で塩酸が好適である。

成る種の生理学的に許容されうる共浴剤を水に加えて場
合により存在させることができるが、水溶液用の媒質は
全体的にあるいは実質的に水性であると好ましい。

凍結乾燥医薬製剤から得られる非経腸投与用溶液は患者
の血清と通張、低張ま７？＋は等張であることができる
。しかしながら、望ましく′ない副作用を回避するため
に、非経腸投与用溶液に等張であると好ましく、低度の
変化は生理学的にあまり関係法ない。実質的に等仮性の
非経腸投与用溶液は溶液の張度を要求されるレベルに上
昇させることができる生理学的に許容されうる助剤を含
ませることにより得ることができる。このような助剤は
凍結乾燥医薬製剤中にすでに存在するように凍結乾燥さ
せる水溶液の中に含ませることができ、あるいは所望の
非経腸投与用溶液を得るためにこの　　　□ような製剤
全溶解するために用いられる中性または酸性−の水の中
に含有させることもできる。このような助剤の例に当技
術でよく知られており、デキストロース（無水物形また
は一水和物形）および塩化ナトリウムおよびまたその混
合物を包含する。水溶液または溶解用水中のこのような
助剤の濃度は使用する物質により変わることは勿論のこ
とである。塩化ナトリウムの場合に、この濃度は好まし
くは７〜１０ｍ９／ｍｌ、さらに好ましくは約８．５〜
／祷であり、この濃度にしばしば生理食塩液または生理
食塩水と称される濃度である。無水デキストロースの場
合に、その濃度は好ましくは６０〜７０ｒ！１ｇ／ｄ、
さらに好ましくは約５０■／−である。

水ｇｉｈ場合によりこの種の凍結乾・凍医薬製剤が通常
含封する添加剤？含有できる。このような例としてはヒ
ト血清アルブミン、結合剤およびマニトール、乳糖およ
びグルコースのような充填剤全包含する。さらに、ｔ−
ｐＡはガラスおよびプラスチック表面に吸着する傾向が
あり、従ってこのような吸着を防止するか、または最低
にするために、水溶液中に表面活性剤を含有させること
が望ましいことがある。このような表面活性剤の例には
［ライ−７８０Ｊ　（Ｔｖｖｅｅｎ　３　［］　）の商
品名で市販されているような無水ソルビトールの脂肪酸
Ｓ分エステルのポリオキシエチレン誘導体が含まれる。

本発明の驚くべき利点の一つとしては、ｔ−ＰＡの実質
的に増大した溶解度に別にして、凍結乾燥医薬製剤の再
構成により得られる酸性非経腸投与用溶液の使用が患者
に投与した時にいづれか有意の有害な生理学的作用上水
さないことにある。血流は一般に、溶液のＰＨｋ接触す
るとほとんどすぐに中性に上昇させるように見え、ｔ−
ＰＡは迅速に血流内に分布される。しかしながら、この
方法はいづれの方法でも実質的に妨害されないことおよ
びこの非経腸投与用溶液および凍結乾燥させる水溶液お
よびまた再構成用の水は強力な緩衝剤全含有しないこと
が好ましい。しかし、この方法を有意に阻害しない弱い
緩衝剤は含ませてもよく、酸性ＰＨでｔ　−ＰＡそれ自
体がそれ自体で弱いｌｊ剤として作用することも確かで
ある。さらにま元、ヒト血清アルブミンは弱い緩衝剤と
して作用できる。

ｔ　−ＰＡが２〜５の−の水浴液中で実質的に増大しｆ
ｃ溶解度に！することから、この凍結乾燥製剤の再構成
から得られる非経腸投与用溶液にはｔ　−ＰＡの溶解度
全増強するためのリジンまたにオルニチンあるいはその
混合物のようないづれか追加の助剤全。含有させる必要
はない。

ｔ　−ＰＡの水溶液は精製したｔ　−ＰＡの溶液７得、
次いで２〜５のｐＨ？！する水性媒質用メジウムと交換
することにより、あるいは精製しｆｃｔ　−ＰＡ全２〜
５のｐＨ’に有する水性メジウム中に溶解することによ
り調製できる。

ｔ　−ＰＡの精製はクロマトグラフィカラムから強力な
緩衝剤全含有する溶液としてタンパク全溶離する工程を
最終工程として含むことができる。

前記したように、非経腸投与用溶液および従って凍結乾
燥医薬製剤および水溶液は強力な緩衝剤を含■していな
い。従って、その除去を行なう簡便な手段としてメジウ
ムの交換に透析全使用すべきである。透析はｎ製溶液が
２〜５の−を有する水性メジウムに対して透析される透
析管または人工腎臓を用いて実施できる。特に精製溶液
中のｔ−ｐＡの濃度が高い場合には、先ずこの溶液のｐ
ｔ（′に２〜５に調整することが望ましいことがある。

強力な緩衝剤全除去するとともにメジウムを交換するた
めのもう一つの手段は精製浴液をゲル濾過し、次いで２
〜５のｐＨｆｆ１！する水性メジウムでカラムを展開す
る方法である。

沈殿した固体の形のｔ　−ＰＡは好ましくは精製溶液か
らそのＰ）Ｉ　ｉ約５．５に調整し、ｉｉ’ｉその凍結
点のすぐ上の温度まで冷却し、次いでたとえば遠心分離
によりタンパク全敗り…すことにより得ることができる
。沈殿した固体は次いで２〜５のｐＨ’に！する水性媒
質中に常法により溶解できる。

生成する水浴液は都合良く、たとえは濾過殺菌により殺
菌し、および次いでアンプルま′ｆｃはバイアルのよう
な無菌プラスチックま几ハガラス容器に、たとえば０．
５〜２０彪の容量で分配する。

ｔ　−ＰＡの水浴液は、好ましくは−１０〜−４０°Ｃ
の温度で冷凍する。冷凍した水溶液は次いで、好ましく
はこの温度に真空乾燥全開始するまで保持するＯ 冷凍した水溶液の真空乾燥は適宜に実施でき、たとえば
０６０１〜０．１トールで実質的に全ての冷凍液の除去
が行なわれるまで充分な時間、部分的真空または完全真
空下に乾燥させること全包含する。

真空乾燥７行なう温度に通常、水浴液が実質的にまたは
完全に凍結した形で維持されるように、処理の開始時点
で−３０〜−４０°Ｃである。処理が進行し、水が除去
されるにつれて、温度は室温に達するまで次第に上昇す
ることかある。最後の痕跡量の水をできるだけ除去する
ために、処理の終了時点において室温まｋはそのすぐ上
温度で約（ＬＯ１トールの実質的真空下に真空乾燥を行
なうと好ましい。生成する凍結乾燥医薬製剤の水含有量
は好ましくは２．５　％以下である。真空乾燥が完了し
友ならば、凍結乾燥させ友医薬製剤全含有する無菌のプ
ラスチックま几はガラス容器を都合良く密封する。

冷凍した水溶液の真空乾燥中に、水が除去され、ｔ　−
ＰＡが生理学的に許容されうる塩の形で残る。

従って、本発明はまｆｃｔ　−ＰＡの生理学的に許容さ
れうる塩、特に塩酸塩のような生理学的に許容されうる
酸付加塩を提供する。

本発明を使用することにより高濃度でｔ　−ＰＡを含有
する非経腸投与用溶液全提供できる凍結乾燥医薬製剤全
最初に得ることができる。従って、本発明はまた水を加
えるとｔ　−ｐＡ２１００，０００ＩＵ／ｒｎｔ　より
大の、さらに特に５００．０００工Ｕ／ｄより大の、最
も特別に１．０００．０００工Ｕ／祷より大の濃度で提
供することができるｔ　−ＰＡの凍結乾燥医薬製剤全提
供する。

投与用のｔ　−ＰＡの非経腸投与溶液を調製するには、
本発明の方法により得られｔ凍結乾燥医薬製剤を中性ま
たは酸性−の水で再構成する。凍結乾燥医薬製剤が得ら
れる水浴液が実質的に等張である場合に、再構成用の水
はまｆｃ災質的に等張であると好ましい。

立坑のフィブリン網状構造全溶解する際のｔ−ｐＡの生
物学的活性は血栓性障害の処置におけるその使用を導い
ている〔デ　ランセラ）　（ＴｈｅＬａｎｃｅｔ　）、
１９８１年１１月７日、１０１８〜１０２０頁：１９８
５年４月１６日、８４２〜８４７頁；デ　ニュー　イン
グランド　ジャーナル　オプ　メデイシｙ　（Ｔｈｅ　
Ｎｅｗ　１１：ｎｇｌａｎａ　Ｊｏｕｒｎａ：Ｌｏｆ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　）、１９８４年、３１０（１０）、
６０９〜６１６頁；同、１９８５年、３１２（１４）、
９６２〜９３６頁〕。従って、本発明は哺乳動物におけ
る血栓性障害の処ｔｍ法金提供し、この方法は前記定義
のとおりの凍結乾燥医薬製剤から得られ７’Ｃｔ　−Ｐ
Ａの非経腸投与用溶液を哺乳動物に投与すること金含ん
でいる。別様には、ヒトまたは動物に使用する。特に血
栓性障害の処置に使用するｋめのｔ　−ＰＡの凍結乾燥
医薬製剤全提供する。

血栓性障害の特定の例は当業者に知られているが、心筋
梗塞、深動脈血栓症、肺塞栓症および卒中を包含する。

ｔ　−ＰＡの主要投与経路は血管内、特に静脈内注入に
よるが、考えられるその他の投与経路、友とえば筋肉内
投与も使用できる。血管内注入は通常、注入用袋または
ビン内にあるいは電気的に操作される注入シリンジ内に
含有されている非経腸投与用溶液を用いて行なう。この
溶液は注入袋またはビンから患者に重力供給により、ま
たは注入ポンプ全使用することにより与えることができ
る。

重力供給注入システム金使用すると、非経腸投与用溶液
の投与速度全総体的に充分に制御して供給できない。従
って、注入ポンプの使用が比較的高濃度のｔ−ＰＡｉ含
有する溶液の場合に特に好適である。しかしながら、さ
らに好ましくは、投与速度を総体的により大きく制御で
きる電気的に操作する注入シリンジを使用する。

血栓性障害を持つ哺乳動物の処置に■効なｔ−ｐＡの量
は多くの因子、九とえば哺乳動物の年令および体重、処
置全必要とする正確な症状およびその重篤度、投与経路
を含む因子に依存して変わることは勿論であり、究極的
には主治医または主治獣医の裁量である。しかしながら
、たとえば冠状動脈血栓全溶解させる有効量は一般に１
５０，０００〜４５０．０００工Ｕ／患者の体重＃／時
の範囲テすると好ましい。従って、体重７０ｋｆｉの成
人の場合に、１時間当りの有効量は一般に１０．０００
，０００〜３０，０００，０００工Ｕ１特に約２０．０
００，０００工Ｕ　であり、この量は初回量を用いてま
たは用いることなく投与できる。さらに、この投与量は
いくつかの血栓症状、たとえば深動脈血栓症および急性
卒中のような症状に対しては、またはすでに再潅流され
ている冠状動脈の開放性全単純に維持するｔめの場合に
はさらに少量にすると好ましい。

これらの場合に、有効量は一般に７，０００〜３３．０
００工Ｕ／患者の体！ＩＣ９／時である。

次側は本発明全例示するために示すものであって、本発
明全いづれの点でも制限しようとするものではない。

例　　１ モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジイ（Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　）、１９８５年、５（７）、１７５０〜１７５
９頁の方法全使用して誘導され几培養した形成転換され
ｆｃ、ＣＩ（Ｏセルラインから得られｆｃｔ　−ＰＡの
清浄にした収穫物でクロマトグラフィにより精製し、ｔ
−ＰＡｉｏ、１７Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．０１
％（１量／容量）ツイーン８０”ｋ含有す′るｐＨ５，
５の水浴液として採取する。浴液のｐｉ−１２塩酸で３
．０に調整し、生成する溶液２Ｈ−１０カートリツジ（
Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　）　［アミコン社（八ｍ１ｃｏｎ
　Ｌｔ４−　）アッパー　ヒル　、ストーンハウス、グ
ロセスターシャー（Ｕｐｐｅｒ　Ｈｌｌｌ、８ｔｏｎｅ
ｈｏｕｓｅ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ　）、英
国〕を用いて遠心分離により濃縮する。濃縮した水浴液
をゲル濾過カラム〔セファデックス（５ｅｐｈａｉａｘ
　）　Ｇ　−１５［：ｌ　；ファーマシア　バイオチク
ノロシイ社（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　）、アップサラ、スエーデン（Ｕｐｐｓａｌａ
　、　５ｖｒｅａｅｎ　）　〕に適用し、０．０１％（
１量／容量）ツイーン８０金含有する０、８５％塩類溶
液で３．０の−において溶出することによりさらに精製
する。このようにして得られた高度に精製されｆｃ　ｔ
　−ＰＡの水溶液を便い捨て人工腎臓を用いてもう一度
濃縮する。ｔ　−ＰＡは−を水酸化ナトリウムで５．５
に増大し、次いで懸濁液′（ｆ−４°Ｃで２時間保持す
ることにより溶液から沈殿させる。ｔ−ｐＡに４°Ｃで
６０分間、４０００Ｘｇで遠心分離することにより採取
する。このｔ　−ＰＡのペレツｈ　ｉ　ｏ、ｏｉ％（重
量／容量）ライ−７８０を含有する塩化ナトリウムの水
浴液（０，８５％（重量／容量）〕に再溶解し、塩酸で
ＰＩ−１３，０に調整する。使用した塩頌溶液の容量上
７，５００，０００工Ｕ／祷〜１０、Ｇ　ＯＯ，０００
ＩＵ／ｍｌの濃度ｔうるに必要なようにする。このｔ　
−ＰＡの溶液”ｋｌ］、［１１％（重量／容量）ツイー
ン８０に含有する塩化ナトリウムの水浴液ＣＯ，８５％
（Ｎ量／容量）〕でさらに稀釈し、塩酸でｐＨ３，０に
調整し、次いでま友同−酸性塩類溶液中の１０％（重量
／容量）マニ）　−ルの溶液”ｉ　５．［１０［＋、［
１［＋　［１工Ｕ／ｍｔのｔ−ＰＡｉｉ濃度およびマニ
トール２５Ｉｎ９／ｄが得られるに充分な量で使用して
稀釈する。生成する溶液全フィルター殺菌し、次いでガ
ラスバイアル中に１１１Ｌｔの容量で分配し、バイアル
を一３５°Ｃで冷凍する。

０．０５　）−ルで減圧全適用する。約２４時間後に、
温度を徐々に５°Ｃに上昇させ、この温度で１６時間保
持する。次いで、再度２５９Ｃに上昇させ、減圧ｔ−０
，０２トールにさらに２４時間増大し、その後バイアル
を乾燥窒素の６００トールの部分減圧下に密封する。

例　　２ 例１のｔ　−ＰＡの凍結乾燥製剤から得られた非経腸投
与用溶液の血栓俗解効果を頚静脈血栓のインビボモデル
で評価する。

＋ａ＞方法 実験方法はコレン（Ｃｏ１１ｅｎ　）他により最初に記
載された方法〔ジエイ、タリン、インベスト。

（、Ｌ　Ｃ１１ｎ、工ｎｖｅｓｔ、　）、１９８６年、
７１．３６８〜６７６頁〕に基本的に従う。

例１の凍結乾燥製剤全、口、０１％ツイーン８０を含有
するｐＨ３，０に調整し友無菌の等張塩類ｍ液に迅速に
、完全に溶解する。かくして、５００，０００工Ｕ／Ｉ
Ｃｇのｔ−ＰＡｋ２時間注入するための非経腸投与用溶
液が得られる。注入は右太腿部静脈でカニユーレを用い
て行なう。４匹のニューシーラント白ウサギをこの実験
に使用する。注入後に、血栓溶解の程度全評価する。

（１））結果 例１の凍結乾燥製剤から得られ之非経腸投与用浴液の血
栓俗解効果は血栓俗解チで表わして２８．９±４．１で
ある。さらに、この溶液による有害な反応は見られない
。

【図面の簡単な説明】

第１図はｔ　−ＰＡの代表的アミノ酸配列會示すもので
あり、そして第２図はｔ　−ＰＡの９０番目の位置のア
ミノ翠とゾロリンＣ末端との間のアミノ酸配列の仮定構
造デポすものである。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨが２〜５である組織プラスミノーゲン活性化
   因子（ｔ−ＰＡ）の冷凍水溶液を真空乾燥させることか
   らなるｔ−ＰＡの凍結乾燥医薬製剤の製造方法。
2. （２）ｔ−ＰＡが一鎖形または二鎖形である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
3. （３）ｔ−ＰＡが第１図に記載されているアミノ酸配列
   を有するか、またはセリンＮ−末端から２４５番目のア
   ミノ酸がメチオニンの代りにバリンである以外は第１図
   と同一アミノ酸配列を有し、場合により最初の３つのア
   ミノ酸のいづれかが存在していないか、または場合によ
   りＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇの追加のポリペプチドＮ−末
   端先行配列を有するものである特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項に記載の方法。
4. （４）ｔ−ＰＡをＤＮＡ組換え技術を用いて誘導された
   培養した形質転換またはトランスフエクシヨンされたセ
   ルラインから得る特許請求の範囲第１項〜第３項のいづ
   れか一項に記載の方法。
5. （５）水溶液中のｔ−ＰＡの濃度が１００，０００ＩＵ
   ／ｍｌより大である特許請求の範囲第１項〜第４項のい
   づれか一項に記載の方法。
6. （６）ｔ−ＰＡの濃度が５００，０００ＩＵ／ｍｌより
   大である特許請求の範囲第５項に記載の方法。
7. （７）ｔ−ＰＡの濃度が１，０００，０００ＩＵ／ｍｌ
   より大である特許請求の範囲第６項に記載の方法。
8. （８）ｔ−ＰＡの濃度が約５，０００，０００ＩＵ／ｍ
   ｌである特許請求の範囲第７項に記載の方法。
9. （９）水溶液のｐＨが２〜４．５である特許請求の範囲
   第１項〜第８項のいづれか一項に記載の方法。
10. （１０）ｐＨが２．５〜４．０である特許請求の範囲第
    ９項に記載の方法。
11. （１１）ｐＨが２．８〜３．５である特許請求の範囲第
    １０項に記載の方法。
12. （１２）ｐＨが約３．０である特許請求の範囲第１１項
    に記載の方法。
13. （１３）水溶液用のメジウムが全体的にまたは実質的に
    水性である特許請求の範囲第１項〜第１２項に記載の方
    法。
14. （１４）水溶液用のメジウムが溶液をヒト血清と実質的
    に等張にする生理学的に許容されうる助剤を含有する特
    許請求の範囲第１項〜第１３項のいづれか一項に記載の
    方法。
15. （１５）生理学的に許容されうる助剤が塩化ナトリウム
    である特許請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. （１６）生理学的に許容されうる助剤がデキストロース
    である特許請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. （１７）水溶液が表面活性剤を含有する特許請求の範囲
    第１項〜第１６項のいづれか一項に記載の方法。
18. （１８）水溶液が実質的に緩衝されていない特許請求の
    範囲第１項〜第１７項に記載の方法。
19. （１９）水溶液がリジンまたはオルニチンあるいはその
    塩を実質的に含有していない特許請求の範囲第１項〜第
    １８項のいづれか一項に記載の方法。
20. （２０）水溶液を殺菌する特許請求の範囲１項〜第１９
    項のいづれか一項に記載の方法。
21. （２１）前記特許請求の範囲第１項〜第２０項のいづれ
    か一項に記載の方法に従い得られる凍結乾燥医薬製剤。
22. （２２）水に溶解すると、１００，０００ＩＵ／ｍｌよ
    り大きいｔ−ＰＡ濃度を付与できるｔ−ＰＡの凍結乾燥
    医薬製剤。
23. （２３）濃度が５００，０００ＩＵ／ｍｌより大きい特
    許請求の範囲第２２項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
24. （２４）濃度が１，０００，０００ＩＵ／ｍｌより大き
    い特許請求の範囲第２３項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
25. （２５）特許請求の範囲第２１項〜第２４項のいづれか
    一項に定義されているとおりの凍結乾燥医薬製剤の密封
    容器。
26. （２６）ｔ−ＰＡの生理学的に許容されうる塩。
27. （２７）ｔ−ＰＡの生理学的に許容されうる酸付加塩。
28. （２８）ｔ−ＰＡの塩酸塩。
29. （２９）特許請求の範囲第２１項〜第２４項のいづれか
    一項に定義されているとおりの凍結乾燥医薬製剤から得
    られるｔ−ＰＡの非経腸投与用溶液を哺乳動物に投与す
    ることを含む哺乳動物における血栓性障害の処置方法。
30. （３０）ヒトまたは動物医療、特に血栓性障害の処置に
    使用するための特許請求の範囲第２１項〜第２４項のい
    づれか一項に定義されているとおりの凍結乾燥医薬製剤
    。