JPS6226234A - 非経口溶液製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規製剤 本発明は、組織プラスミノゲン試活物質、特に組織プラ
スミノゲン賦活物質を含む薬学的製剤、それらの調製及
び医薬品と動物用医薬品への使用に関するものである。

脈管床に完全な特徴を維持している機能的平衡があると
信じられている。すなわち血沈を形成し得る酵素系−凝
固系一と血沈を溶解し得る酵素系−線維素溶解系との間
の平衡である。創傷による血液の流出を制限するために
、創（ｎを受けた脈管床に血沈が形成される。創傷の自
然治癒後には、よけいな血沈は線帷素分解系の作用によ
り溶解される。時には外信なしに血沈が形成され、主要
血管にとどまり、部分的にあるいは全身的障害を血流に
及ぼ寸ことがある。このことが心臓、肺臓あるいは脳に
起きた場合には、心筋梗塞、肺塞栓症あるいは脳出血と
なることもある。これらの複合条件は先進国の罹病率及
び死亡率の主要原因となっている。

血沈は蛋白分解酵素プラスミンにより溶解性となり得る
線維素性網状組織からなる。この酵素は血漿の一成分で
ある不活性プロ酵素すなわちプラスミノゲンから、プラ
スミノグン賦活物質の作用により得られる。免疫学的に
異なった哺乳類のプラスミノゲン斌活物質は２つある。

内在性プラスミノゲン賦活物質またの名をウロキナーゼ
として知られているものは、腎臓によって生成される酵
素であり、尿から分離される。また多種の組織培養源か
らも調製し得られる。外来性のプラスミノゲン賦活物質
またの名を脈管性プラスミノゲン賦活物質及び組織性プ
ラスミノゲン賦活物質（１−ＰＡ）として知られている
ものは、多くの組織ホモジネート（特にヒト子宮）、脈
管細胞壁及びある種の細胞培養から分離される。これら
の２種のプラスミノゲン賦活物質に加えて、細菌生成物
すなわちβ−溶血性連鎖球菌から調製されたストレプト
キナーゼがある。ウロキナーゼとストレプトキナーゼ両
方の重要な弱点は、全循環を通して、血栓部位に局限せ
ずに活性であることである。これらは血液凝固を減じ、
出血の危険を増加するように例えばフイブリノゲン、プ
ロトロンビン、■因子、ＶＩＩＩ因子のような他の血液
蛋白を破壊する。一方、ｔ−ＰＡの生物学的活性はそれ
が結合しかつ活性化される線雑素の存在の如何にかかつ
ている。最大限の活性はこのように血栓部位即ち溶解さ
れるべき線維素の存在においてのみあられれ、このこと
は出血の危険を大いに回避することとなる。

ｔ−ＰＡの適用の主な経路は血管内注入であるのでｔ−
ＰＡの製剤は非経口溶液であることが要求される。非経
口溶液は一般に薬を高濃度含有することが望ましい。こ
うなっていれば、医師または獣医師は、添加溶媒あるい
は媒体で簡単に溶液を希釈して、如何なる状況にも応じ
て所要の濃度を得ることが可能である。加つるに、心臓
あるいは腎臓障害のある患者に大［相］を適用すること
は、心臓あるいは腎臓をさらにより大きなストレスの下
に置くことになるので勧められないことである。

従って用量はより高濃度の製剤を使用することによって
最小限に保たれなければならない。同時に、非経口的溶
液は、貯蔵中も希釈操作中にも溶液から沈殿を生じる有
意な傾向がないように、安定であるべきである。

ｔ−ＰＡの多くの非経口溶液は、一般名でＥＰ−Ａ−４
１７６６、ＥＰ−Ａ−９３６１９、ＥＰ−Ａ−１１２１
２２、ＥＰ−Ａ−１１３３１９、ＥＰ−Ａ−１２３３０
４日本特許公報５７−１２０５２３　（申請５６−６９
３６＞及び日本特許公報５８−６５２１８　（申請５６
−１６３１４５）に記載されている。これらの製剤はｔ
−ＰＡの食塩水で、そのｐｌ＋はおおよそ中性で、その
ような溶液中のｔ−ＰＡの溶解性は、イオン濃度の増加
がなくては、低いという不利益をこうむっている。その
結果ｔ−ＰＡの濃度が低いことは、必然的にある状況の
下では、好ましくない大暑の溶液を患者に適用するとか
、あるいは製剤が高張液である場合には、その適用に際
しては赤血球に有害となる。

非経口水溶液中のｔ−ＰＡの溶解性はその溶液のｐＨが
酸性側にある場合には改良し得るし、また適用に際して
そのような溶液の酸度が著しい生理学的問題を示さない
ことも今ははっきりしている。

従って本発明では、ｔ−ＰＡの非経口水溶液をｐｌ＋２
〜５に規定している。

ｔ−ＰＡの改良された溶解性の結果として、本発明の非
経口溶液は溶液から沈殿が生じるといったｔ−ＰＡの実
際上の危険なしに、ｔ−ＰＡの濃度を高め得る。加うる
に、そのような溶液となっているｔ−ＰＡの濃度はｔ−
ＰＡが沈殿するという実際上の危険なしに再び中性ある
いは酸性の水で薄めて減らすことができることが判明し
た。従って本発明では、医師及び獣医師による操作及び
使用に際してより大きな融通性を与える安定した非経口
溶液を規定する。

本発明で使用したｔ−ＰＡは、哺乳動物、特にヒトのｔ
−ＰＡと実質的に生物学的活性が一致しているもので、
配糖体のものとそうでないものとを含んでいる。それは
ＥＰ−Ａ−１１２１２２に記載されているごとく、−鎖
、あるいは二鎖のｔ−ＰＡもしくはそれらの混合物で、
完全に配糖体となっているヒトのｔ−ＰＡの場合にあっ
てはポリアクリルアミドゲル上の見かけの分子量は約７
０．０００．等電点は７．５と８．Ｏ（７）Ｉｍにある
。ｔ　−Ｐ　Ａ　ハ約５００．ｏｏｏｒｕ、”Ｉｎｇの
比活性（国際単位／ｒＰｊ、国際単位はＷＨＯの英国ロ
ンドンの１ｌｏｌｌｙ　Ｈｉｌｌ、　Ｉｌａｍｐｓｔｅ
ａｃｌ　　（ＮＨ３６Ｒ８，Ｕ、に、　　）にある国立
生物学的基準・管理研究所によって規定されている活性
単位）を有することが望ましい。

ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は実質上図１に示された配列に
一致することが望ましい。配列はこのように図１のそれ
に一致するか、１つあるいはそれ以上のアミノ酸の欠失
、置換、挿入、逆位あるいは対立遺伝子由来のもの、あ
るいはそうでないものの付加があっても、その結果とし
て生じた配列が図１の配列との相同性が少なくとも８０
％、なるべくは９０％であり、その蛋白質が本質的に同
一の生物学的及び免疫学的性状を保留している。

特にｔ−ＰＡ配列は図１のそれと全く同じかあるいはＮ
−末端であるセリンから２４５番目のアミノ酸がメチオ
ニンの代りにバリンであり、何れの配列６選択的に最初
の３つのアミノ酸の何れかを欠く配列か、あるいは選択
的にポリペプチドのＮ−末端にＧ　ｌ　ｙ−／ｉ、ｌ　
ａ−Ａｒ（Ｊの先導配列を付加している。

図１に示しであるアミノ酸配列は３５個のシスティン残
基を有し、１７個のＳ−Ｓボンドを形成づるポテンシャ
ルを持っている。その構造がより詳細に確定されている
他の蛋白質との類似性に基づいて、９０番目の位置から
とプロリンであるＣ末端までの間のアミノ酸配列（Ｓ−
Ｓボンド形成から出現する）がとると予想される構造は
図２に示されている。Ｎ−末端の領域の構造については
先に提起したものもいくつかあるが前者より不確かであ
る（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉ
ｓ、　１９８３．６゜２６９−２７３；　ａｎｄ　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７９８
４゜８１、５３５５−５３５９　）。ｔ−ｐ△の構造の
最も重要な特徴はこの蛋白質と線維素との結合の役割を
する２つのＫｒｉｎｇｌｅ領ｈｉｌｔ（９２番目と１７
３番目のアミノ酸の間及び１８０番目と２６１番目のア
ミノ酸の間）と、Ｂ鎖の主要部分を構成しプラスミノゲ
ンの活性の要因であるセリンプロテアーゼ領域である。

セリンプロテアーゼの中の特に重要なアミノ酸は「触媒
する３つ組み」である１ｌｉｓ／へｓｐ／Ｓｅｒである
。ｔ−ＰＡにおいてはこれらは、３２２番目、３７１番
目及び４６３番目の位置に存在する６２６４番目と３９
５番目のシスティンアミノ酸残基の間のＳ−Ｓボンドは
またｔ−ＰＡの２本鎖におけるＡ及びＢ鎖を結合するの
に重要である。

第１図及び第２図においては慣例的な１文字記号及び３
文字記号が下記のようにアミノ酸残基に当てられた。

ＡＳｐ　Ｄ　　アスパラギン酸 １１ｅ　　Ｉ　　イソロイシン Ｔｈｒ　　Ｔ　　スレオニン １−ｅｕ　　ｌ　　ロイシン Ｓｅｒ　Ｓ　セリン Ｔｙｒ　　Ｙ　　チロシン Ｇｌｕ　　Ｅ　　グルタミン酸 Ｐｈｅ　　Ｆ　　フェニルアラニン ｐｒｏ　　ｐ　　プロリン ＨｉｓＨヒスチジン Ｇｌｙ　　Ｇ　　グリシン ＬｙＳ　Ｋ　リジン Ａｌａ　　Ａ　　アラニン Ａｒｇ　　Ｒアルギニン ｃｙｓ　　ｃ　　システィン Ｔｒｐ　　Ｗ　　ｔ−リブトファン ｖａＩ　Ｖ　バリン Ｇｌｎ　　Ｑ　　グルタミン Ｍｅｔ　Ｍ　メチオニン ＡＳｎ　　Ｎ　　アルバラギン ｔ−ＰＡは記載されあるいは当業者に知られている手順
によって得られる。それは例えばＢｉＯＣｈｉｍｉＣａ
旦Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　ＡＣｔａ、　１９７９．５８
０．１４０−１５３；　　ＥＰ−Ａ−４１７６６あるい
はＥＰ−Ａ−１１３３１９に記載されている種類の正常
あるいは新生動形細胞系統から得られる。しかしながら
ｔ−ＰＡは例えばＥＰ−Ａ−９３６１９：ＥＰ−Ａ−１
１７０５９あるいはＥＰ−Ａ−１１７０６０に記載され
ている組換型ＤＮＡ技術をもらいで生成した、培養され
た形質転換細胞系統あるいはトランスフェクション細胞
系統から得られることが望ましい。ｔ−ＰＡ生産の細胞
としてはヂャイニーズハムスターの子宮（ＣＨＯ）細胞
で、Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８５゜皿、　１７５０−１７５
９に記載された方法で生成したものを使用することが特
に望ましい。このようにしてクローニングした遺伝子は
ジヒドロＭＷ還元酵素（ｄｈｆｒ）をコードした遺伝子
と同時にｄｈｆｒ　　−ＣＨ０ＩＩ胞にトランスフェク
トされる。

ｄｈｆｒを表現する形質転換体はヌクレオシドを欠いた
培地上で選択され、メトトレキセート濃度を次第に高め
てさらされる。このようにしてｄｈｆｒとｔ−ＰＡ遺伝
子とは同時に高濃度を−ＰＡを発現し得る安定した細胞
系統になるように増幅される。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　
Ａｃｔａ、　１９７９．５８０．１４０−１５３；去　
Ｕ剣、吐皿、、　　１９７９．　２５４（６）、　　１
９９８−２００３；　棟割、　　１９８１．　２５６（
１３）、　　７０３５−７０４１；セ扛、去Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、　　１９８３，１３２．６８１−６８６；　　
Ｅ　Ｐ　−Ａ　−４１７６６：ＥＰ−Ａ’１１３　３１
９あるいは、ＧＢ−Ａ−２１２２２１９に記載されてい
る方法のように、記載され、あるいは当業者に知られて
いる方法を使って精製されることが望ましい。

非経口溶液中のｔ−ＰＡの溶解性に上限があるかは明白
でない。１５０，０００．０ＯＯＩＵ／ｄ（国際単位／
ｄ）よりはるかに高濃度においては、ｔ−ＰＡの有意な
沈殿は起こらず単に粘着性を呈するようになる。従って
非経口溶液中の１−ＰＡＩ度は例えば５０，０００から
５０．０００゜０００ＴＵ／ｌｅといった広範囲内でさ
まざまなのかもしれない。本発明から最大の利益を確保
するためには、ｔ−ＰＡの濃度は１００．０ＯＯＩＬＩ
／−以上、特に５００．０ＯＯＩＵ／ｍｅ以上、さらに
は１，０００．０ＯＯＩＵ／ｄ以上であることが望まし
い。特にｔ−ＰＡの濃度が約５．０００．０ＯＯＩＵ／
−であることが最も望ましい。

非経口溶液のＩＩＨの上限はなるべくは４．５である。

事実、２．５から４．０の範囲内が望ましく、２．８か
ら３．５がさらに望ましく、約３．０が最も望ましい。

非経口溶液の望みのｐＨは、生理的に許容される無機も
しくは有機酸を使用して適宜に得られる。例えば塩酸、
硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸を
含む酸である。これらの酸のうち塩酸が望ましい。

選択的にある種の生理的に許容される助溶剤が水に加え
られていることがあるが、非経口溶液のための媒体は完
全にあるいは実質的に水性であることが望ましい。

非経口溶液は患者の血清と高張性、低張性あるいは等慢
性である。しかしながら好ましくない副作用を避けるた
めに、非経口溶液は小さい偏差は生理的に大きな懸念は
ないけれども、等慢性であることが望ましい。実質的に
等慢性の非経口溶液は溶液の張度を目的値まで高め得る
生理的に許容される薬剤の添加により得られる。そのよ
うな薬剤の例は当業者に知られており、デキストローゼ
（無水あるいは一水化物）及び塩化ナトリウム及びこれ
らの混合物を含んでいる。もちろん非経口溶液中の薬剤
の濃度は薬によってさまざまである。

塩化ナトリウムの場合その濃度は７〜１０ＩＩ！ｇ／ｒ
ｒｄｌが望ましく、約８．５ｍ９／−が最も望ましい。

その濃度はしばしば生理食塩水あるいは単に生理食塩と
して引用される。無水デキストローゼの場合には、その
濃度はなるべく３０〜７０ｇｐｉ／ｒｔｔｌであること
が好ましいが、約５０＃１ｇ／ｄであることが最も望ま
しい。実質的に等張の非経口溶液中１−ＰＡの濃度が減
らされるように望まれる場合には、実質的に等張溶液で
あることを維持するように、同濃度の同薬剤の水溶液で
希釈することが望ましい。

非経口溶液は選択的に通常このタイプの製剤と関連のあ
る添加物を含有している。例えばヒト血清アルブミンで
ある。加うるに、ｔ−ＰＡはガラス及びプラスチック表
面に吸着する傾向を有し、従ってそのような吸着を防止
しあるいは最小限にするために非経口溶液中に界面活性
剤を含有させることが望ましいかもしれない。商品名”
　Ｔｗｅｅｎ８０″の名の下に市販されているようなソ
ルビトール無水物の脂肪酸の部分的エステルのポリオキ
シエチレン誘導体が含まれる。

ｔ−ＰＡの実質的に増加される溶解性とは別に本発明の
ずぼらしい有利さの１つはここに規定した範囲の１１Ｈ
の酸性の非経口溶液の使用では、患者への適用で有意に
有害ないかなる生理的作用も現れないということである
。血流は一般にほとんど接触するや否や、溶液のｐＨを
中性側に上昇させ、ｔ−ＰＡは速かに血流中に分散させ
られるらしい。

しかしながら、この過程がいずれにせよ実質的に妨害さ
れず、またこの非経口溶液が強い緩衝剤を含有していな
いことが望ましい。もつともこの過程を有意に抑制しな
い弱緩衝剤は含有されて差し支えないし、事実酸性のＩ
）Ｈにおいてｔ−ＰＡそのものがその弱い緩衝剤として
作用し得るものである。更にヒト血清アルブミンも、弱
！ｌ衝剤として作用し得る。

本発明の非経口溶液中のｔ−ＰＡの実質的に増加した溶
解性のために、ｔ−ＰＡの溶解性を高めるためにリジン
あるいはオルニチンあるいはそれらの塩のような添加物
を含有させる必要はない。

非経口溶液は、精製溶液あるいは固体の形状ぐｔ−ＰＡ
を使用して、ありふれた薬学的製剤方法と手法に従って
調製され得る。従って本発明は、ここに規定するごとく
、ｔ−ＰＡの非経口水溶液を調製する工程を規定する。

それは次のことを包含する。

（ｉ）　ｔ−ＰＡの精製溶液を得ること及び２から５ま
でのｐＨを保持する水性培地のための培地の交換；ある
いは （ｉｉ）２から５までのｐ＋＋を保持する水性培地中へ
のｔ　−Ｐ　Ａの溶解及び外戚溶液の滅菌。

ｔ−ＰＡの精製は強い緩衝剤を含有する溶液同様、最終
Ｔ稈としてクロマトグラ７カラムから蛋白の溶出を伴う
。前に述べたごとく非経口溶液は強い緩衝液を含有しな
いことが望ましい。従って培地の交換の間中、その除去
を実施するための慣例的方法は透析法をもちいることで
ある。そのｐｔ＋が２〜５である水性培地に対して精製
溶液が透析されている透析用チューブあるいは人工腎臓
を使用し−Ｃ透析が４１されて差し支えがない。特に精
製溶液中の１１つΔの濃度が高い場合には、まず溶液の
ｐＨを２〜５になるように調製することが望ましい。培
地の交換中強い緩衝剤の除去を実施する他の方法は精製
溶液をゲル濾過にゆだねるとか、ｐＨが２〜５である水
性培地でカラムを展開するかである。

沈殿された固体の形状のｔ−ＰＡは、ｐＨを約５．５に
調製し、その鶏固点寸前にまでその溶液を冷却し、その
蛋白質を例えば遠心分離器によって回収して精製された
溶液から得られるのが望ましい。この沈殿した固体はそ
の後通常の方法で２〜５のｌ）Ｈをもつ水性培地中に溶
解する。

生成溶液の滅菌は慣例的に例えば濾過滅菌法によって実
施する。

非経口溶液は通常密封、滅菌されたプラスチックあるい
はガラス容器中に収納されている。それはまたアンプル
、バイアルあるいはディスポーザブル注射器のような規
定用場の形状でか、あるいは注射用バッグあるいは瓶の
ような大用量の形状である。そのような容器に納められ
る溶液の吊は、広範囲にわたっているが、慣例的には０
．５〜２０ｄである。

↑＞ＰＡを安定化するために、非経口溶液は凍結させ−
１０〜−３０℃に保存することが望ましい。

ｔ−ＰＡの商魂の線維素網状組織を溶解する生物学的活
性は血栓障害の治療において利用されている。（Ｔｈｅ
　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　７ｔｈ　１９８
１．１０１８−−９３６＞従って本発明は吐乳動物にＪ
５ける血栓障害の治療に対する方法を規定している。そ
してそれはここに規定しでいるようにｔ−ＰＡの非経口
水溶液の吐乳動物への適用を包含している。代案として
は、医薬品用、動物医薬品用、とくに血栓障害治療用に
はここに規定しているようにｔ−ＰＡの非経口水溶液が
用意されでいる。

血栓障害の特例は、少なくとも心筋梗塞、強度の静脈血
栓症、肺塞栓症及び脳出血を包含して、当業者に知られ
ている。

非経口溶液の主要適用経路は、たぶん筋肉内投与のよう
な他の方法ら使用され得るが、血管内特に静脈内注入で
ある。血管的注入は通常注入バッグあるいは注入瓶内に
、または電気的に操作される注入器内に収納された非経
口溶液で実施される。

溶液は注入用バッグあるいは瓶から重力給水あるいは注
入用ポンプの使用により、患者に供給される。重力給水
注入システムの使用では非経口溶液の適用程度に十分な
コントロールができない。従って比較的高濃度のｔ−Ｐ
Ａを含む溶液では特に注入ポンプの使用が望ましい。し
かしながら適用程度をより十分にコントロールし得る電
気的に操作する注入器の使用がより望ましい。

血栓障害にかかつている浦乳動物を治療するｔ−ＰＡの
効果的用量はもちろん、例えば吐乳動物の年齢及び体重
、治療を要する精密な状況及びその程度、投与経路を含
む多くの要因に左右される。

そしてそれは結局主治医あるいは１冶獣医の自由裁倒と
なる。しかしながらたとえば心冠血栓を溶解する有効量
は通常１時間あたり、息者の体重あたりで１５０，００
０〜４５０．０００１　Ｕ／Ｋｇの範囲であるのが好ま
しい。従って、７０に９体重の成人では１時間あたりの
有効量は通常１０．Ｏｏｏ、ｏｏｏより３０，０００．
０ＯＯＩＩＪ、特に約２０．０００．０Ｏ０１ｔＪであ
り、この量はｐｒｉｍｉｎｇ　ｄｏｓｅ　（下地向）の
ある・なしにかかわらず適用される。また強度の静脈血
栓、急性脳卒中のような血栓状態あるいはすでに再環流
された０冠動脈の解放性を単に維持するためにはより少
ない用量が妥当と思える。これらの状態には、一般に有
効量は１詩副あたり忠者の体重Ｋｆｌあたり７゜０００
ないし３６．０ＯＯＩＵ／ｌ（ｇである。

本発明の説明に次の例が用意されているが、いずれにせ
よその限度を制定しているものと解釈されるべきではな
い。

例ｌ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏ　　、　１９８５゜５（７）、　１７５０−１７
５９の手順方法を用いて由来した、培養されて形質転換
されたＣＨＯ細胞系統から得られたｔ−ｐ△の明瞭な収
穫物はクロマトグラフィにより精製され、ｔ−ＰＡは０
．１Ｍクエン酸ナトリウム及び０．０１％（Ｗ　／　Ｖ
　）　Ｔｗｅｅｎ　８０ヲ含有し、ｐＨ５，５に調製さ
れた水性溶液として収集された。その溶液のｐＨ１は塩
酸で３．０に調製され、得られた溶液はＨ−１０Ｃａｒ
ｔｒｉｄｅ　（ＡｍｉｃｏｎＬｔｄ、、　Ｕｐｐｅｒ　
Ｈｉｌｌ、　５ｔｏｎｅｈｏｕｓｅ。

Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｓｈｉｒｅ、英国）を使用して限外
濾過法により濃縮された。０．１Ｍクエン酸ナトリウム
、０．２３Ｍ塩化ナトリウム（塩酸の添加により生じる
）及び０．０１％（ｗ／ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ　８０を含
有し、ｐＨ３，ｏのｔ−ＰＡ　（２，５００，０００Ｉ
Ｕ／ｄ）の高濃度の精製水溶液はこのようにして得られ
た。この溶液は約１４．０００の分子量のカットオフを
もつ、透析用チューブに入れられ、濃塩酸でｐＨ３，０
に調製され、濾過、滅菌された０、０１％（ｗ／　ｖ　
）　Ｔｗｅｅｎ　８０加生理食塩水（０，８５％（Ｗ／
Ｖ）塩化すｉ−リウム）の５０倍容聞で４回、４℃で透
析された。各透析時間は、７２時間続くようにされた。

透析用バッグから水性溶液の回収に次いで濾過滅菌し、
ｔ−ＰＡ５００．０ＯＯＩＵ／−を含有するように、生
理食塩水で希釈された。、得られた非経口溶液は、ガラ
ス性バイアル瓶に充填され、密栓され、凍結されて、−
２０℃で保存された。

例２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　　１９８５．　５（７）。

１７５０−１７５９の手法を用いて由来された、培養し
て形質転換されたＣ）−１０＄１１１胞系統から得られ
た、明白なｔ、ＰＡの収穫物はクロマトグラフィにより
精製され、ｔ−ＰＡは０．１７Ｍ　　クエン酸ナトリウ
ム及び０．０１％（ｗ／ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ　８０を含
有し、ｐＨ５，５に調製された水溶液として収集された
。溶液のｐｌ＋は塩酸で３．０に調製され、その得られ
た溶液はＨ−１０Ｃａｒｔｒｉｄｏｅ　　（Ａｍ１ＣＯ
ｎＬｔｄ、、　ｔｌ（ｌｐｅｒ旧ＩＩ、　５ｔｏｎｅｈ
ｏｕｓｅ、　Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈ；ｒｅ、英国）
を使用して言外濾過法により濃縮された。この高濃度水
溶液はさらにゲル濾過カラム（セファデックスＧ　−１
５０：　　ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、υｐｐｓａｌａ、　５ｖｅｄｅｎ）及びｐＨ３，
０に調製された０、０１％（ｗ／ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ　
８０加０．８５％食塩水溶液での溶出により精製された
。

高精度のｔ−ＰＡの水溶液はディスポーザブルの人工腎
を使用して今一度濃縮されて得られる。ｔ−ＰＡは水酸
化ナトリウムでｐｌ＋５．５に上昇させ、その懸濁液を
４℃、２時間保持して溶液から沈殿した。ｔ−ＰＡは４
０００ＸＱ、４℃で３０分間遠心分離により回収された
。ｔ−ＰＡのペレットは０．０１％（ｗ／　ｖ　）　Ｔ
ｗｅｅｎ　８０を含有し、塩酸でｐＨ３，０に調製され
た塩化す］〜リウム（０，８５％（ｗ／ｖ））の水性溶
液中に溶解された。使用した食塩水溶液の吊は、ｔ−Ｐ
Ａの濃１１７．５００，０ＯＯＩＵ／ｍ、！＝１０，０
００゜０００１Ｕ／ｄの間になるに必要なｊであった。

ｔ−ＰＡのこの溶液はさらに、０．０１％（Ｗ／ｖ　）
　Ｔｗｅｅｎ　８０を含有し、塩酸でｐＨ３，０に調製
された０、８５％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムの水性溶液
で希釈され、かつ同じ酸性の食Ｊｇ水溶液の１０％（Ｗ
／Ｖ）マンニトール溶液で希釈し、最終濃度をｔ−ＰＡ
で５，０００，０ＯＯＩＵ／ＩＲ１！、マンニトールで
２５ｍｇ／ｄとなるよう稀釈する。

得られた溶液は濾過滅菌し、ガラス性バイアル版に１−
ずつ分注され、凍結され、−２０℃で貯蔵された。

例３ 例１の非経口溶液の血栓溶解効果は肘静脈血栓症の生体
上デルで評価された。

（ａ）手法： 実験の手法は本質的にはＣｏ１１ｅｎら（Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８３．７１．３６８−３７６　
＞に記載された方法に従った。

例１の非経口溶液は溶解され、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　
８０を含有し、ｐＨ３，０に調製された滅菌等張食塩水
で希釈され、ｔ−ＰＡの５００．０００ＩＵ／Ｋｇの２
時間注入に十分な溶液が準備された。

注入は右投静脈中にカニユーレを経由してなされた。３
羽の白色のニューシーラント種の家兎が本試験で使用さ
れた。注入後血栓症の程度が評価された。

（ｂ）成績： 血栓症の百分率は例１の非杼口溶液の血栓溶解効果を証
明して２２．３±４．２％であった。加うるに、この溶
液の注入による悪い反応は観察されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はｔ−ＰＡのアミノ酸配列を示す。 第２図は２重鎖ｔ−ＰＡを生じるべき１重鎖ｔ−ＰＡの
開裂の位置を示す。 ＊印はＡ鎖が２つのＫｒ１ｎ［ｌｌ（！領域を、Ｂ鎖が
セリンプロテアーゼ領域を含有する２重鎖ｔ−ＰＡを生
じるべき１重鎖ｔ−ＰＡの開裂の位置。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨが２〜５の組織プラスミノゲン賦活物質（ｔ
   −ＰＡ）の非経口水溶液。
2. （２）ｔ−ＰＡが１本鎖型もしくは２本鎖型である特許
   請求の範囲第１項に記載の非経口溶液。
3. （３）ｔ−ＰＡが図１に示されているアミノ酸配列を有
   するか、あるいは同じアミノ酸配列ではあるがセリンＮ
   −末端から２４５番目の位置にあるアミノ酸がメチオニ
   ンの代りにバリンであり、場合により最初の３つのアミ
   ノ酸のいずれかを欠く配列であるかあるいは場合により
   Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇの先導配列をポリペプチドのＮ
   −末端に付加してなる特許請求の範囲第１項あるいは第
   ２項のいずれか一つに記載の非経口溶液。
4. （４）ｔ−ＰＡが組換えＤＮＡ手法で得た形質転換また
   はトランスフエクシヨン細胞系統の培養により得られる
   、特許請求の範囲第１〜３項の何れか一つに記載の非経
   口溶液。
5. （５）ｔ−ＰＡの濃度が１００，０００ＩＵ／ｍｌ以上
   である特許請求の範囲第１〜４項の何れか一つに記載の
   非経口溶液。
6. （６）ｔ−ＰＡの濃度が５００，０００ＩＵ／ｍｌ以上
   である特許請求の範囲第５項に記載の非経口溶液。
7. （７）ｔ−ＰＡの濃度が１，０００，０００ＩＵ／ｍｌ
   以上である特許請求の範囲第６項に記載の非経口溶液。
8. （８）ｔ−ＰＡの濃度が約５，０００，０００ＩＵ／ｍ
   ｌである特許請求の範囲第７項に記載の非経口溶液。
9. （９）ｐＨが２〜４．５である特許請求の範囲第１〜８
   項の何れか一つに記載の非経口溶液。
10. （１０）ｐＨが２．５〜４．０である特許請求の範囲第
    ９項に記載の非経口溶液。
11. （１１）ｐＨが２．８〜３．５である特許請求の範囲第
    １０項に記載の非経口溶液。
12. （１２）ｐＨが約３．０である特許請求の範囲第１１項
    に記載の非経口溶液。
13. （１３）メジウムが完全にあるいは実質的に水性である
    、特許請求の範囲第１〜１２項の何れか一つに記載の非
    経口溶液。
14. （１４）非経口溶液をヒト血清と実質的に等張とする生
    理的に許容される薬剤を含有する特許請求の範囲第１〜
    １３項の何れか一つに記載の非経口溶液。
15. （１５）生理的に許容される薬剤が塩化ナトリウムであ
    る特許請求の範囲第１４項に記載の非経口溶液。
16. （１６）生理的に許容される薬剤がデキストローゼであ
    る特許請求の範囲第１４項に記載の非経口溶液。
17. （１７）界面活性剤を含有する特許請求の範囲第１〜１
    ６項の何れか一つに記載の非経口溶液。
18. （１８）実質的に緩衝剤を加えていない特許請求の範囲
    第１〜１７項の何れか一つに記載の非経口溶液。
19. （１９）実質的にリジンあるいはオルニチンあるいはそ
    の塩を含まない特許請求の範囲第１〜１８項の何れか一
    つに記載の非経口溶液。
20. （２０）ｐＨが２〜５であるｔ−ＰＡの非経口塩類水溶
    液。
21. （２１）（ｉ）ｔ−ＰＡの精製溶液を得、そしてメジウ
    ムをｐＨ２〜５をもつ水性メジウムに交換するか、ある
    いは、 （ｉｉ）ｐＨ２〜５の水性メジウム中にｔ−ＰＡを溶解
    し、そして得られた溶液を滅菌することからなる特許請
    求の範囲第１〜２０項の何れか一つに記載の非経口溶液
    製造法。
22. （２２）特許請求の範囲第１〜２０項の何れか一つに記
    載の非経口溶液の哺乳動物への投与を特徴とする、哺乳
    動物における血栓障害の治療方法。
23. （２３）特許請求の範囲第１〜２０項の何れか一つに記
    載の、医薬品用及び動物用医薬品用、特に血栓障害の治
    療用の非経口溶液。
24. （２４）特許請求の範囲第１〜２０項及び第２３項の何
    れか一つに記載の非経口溶液の密封容器。