JPS62292729A - ヒト子宮組織由来プラスミノ−ゲン活性化因子製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 不発明は、強力な血栓溶解作用を有し、深部静脈血・栓
症、ｆｓ６塞栓症、心筋梗塞、動脈閉塞、脳梗塞などの
治療にその有用性が期待されている、実質的に１重鎖か
ら成るヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化因子（
以下、組織由来プラスミノ製剤に関するものである。

（従来の技術） 従来、心筋梗塞、脳梗塞、ＦＡ梗塞などの治療に有用な
血栓溶解剤として、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ
等が使用されてきた。しかしながら、これ等は血中から
の正常なプラスミノーゲン活性化因子とは異なること、
またフィブリンに対して特異的な親和性をもつわけでな
いことから、これ等による泊りはすべての点で満足でさ
るものではなかった。近年、ウロキナーゼ、ストレプト
千ナーゼと構造ならびに免疫学的にも異なり、更に強い
フィブリン親和性を有するＴＰＡがヒトまたは動物の各
種組織中に見い出され、ウロキナーゼ、ストレプトキナ
ーゼに勝る血栓溶解剤として、その応用が期待されてい
る。

一方、Ｐ　、ＬＶａ　１１　ｅｎ等（Ｐｒｏｇ、Ｃｈｅ
ｍ、ＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏ　ｌｙｓ
　ｉ　ｓ±、１６−２３（１９８１）　）によれば、Ｔ
　Ｐ　Ａは２つの異なった形状で生じ、１つは１重鎖形
状であり、化ニオジスルフィドブリッジで法合スる２重
鎖形状である。更に１重鎖ＴＰＡは２重鎮ＴＰＡよりも
フィブリンへの吸着のより高い親和性を有すること、お
よび１重ｇＴＰＡが、フィブリンへ吸着すると非常に速
く２重鎮ＴＰＡに転換され、次いでこれを必要とする凝
血部分で最大限の活性が得られる（特開昭５９−１１８
７１７　）ことがら、１重ａＴＰＡの方がより高い治療
効果を有することが期待されている。

本発明者らは、この様に有用な、実質的に１重鎖から成
るｕ−ＴＰＡを遺伝子組換技術により大量に生産し、精
製し、製剤化することを試みた。

（発明の解決しようとする間領点） ところが遺伝子組換技術により得られた、実質的に１重
鎖からなるｕ−ＴＰＡは、 ■　水に対する溶解度が低く、凍結乾燥に供する為のシ
、１製液を保存する際に濃度に依っては沈澱を生じ躬い
こと。また、凍結乾燥で得られた製剤を少量の蒸留水や
生理食塩水で溶解させる時にしばしば完全溶解が困ｗｉ
なこと。

■　調製液の保存時、凍結乾燥時、凍結乾燥で得られた
製剤の保存時、および製剤の再溶解時の安定性が乏しく
、活性が徐々に低下したり、２重鎖ｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａへ
変換し易いこと。

■　製剤容器、への吸着が大きく、投与量を一定に設定
することが困難であること等、工業的規模で一定品質の
製剤を製造する為には、溶液状態、凍結乾燥時、凍結乾
燥後の固体状態での安定性に関し、多くの解決すべき問
題がめることが明らかになった。

一般に酵素類の安定化方法に関して種々の提案がなされ
ているが、酵素組成は千差万別であり、そのため酵素の
組成も全て異なり同じ系統に属する酵素であっても、性
質が必ずしも同じでないためにその特性に応じた安定化
方決はそれぞれについて見出されなくてはならない。

従来開発されてきた技術の一部を略載する。

■　α−アミラーゼやＬ−アスパラギナーゼにアミノ酸
類を添加する（特公昭４１−１６５４１号公報、特公昭
４６−４１５９３号公報、特公昭４８−７７９７号公報
）。

■　肝臓カタラーゼ、細菌性プロテアーゼ、エラスター
ゼ等に糖類を配合する（特公昭４０−１０９５３号公報
、特公昭４１−４３９４号公報、特公昭４４−５０７２
号公報、特開昭５２−４７９８４号公報）。

■　ウロキナーゼにゼラチン又はアルブミンを配合する
（特公昭５６−４３２３３号公報）。

本発明者らは、遺伝子組換技術により得られた実質的に
１重鎖から成るｕ−ＴＰＡについて上記技術の効果を確
めたがいずれも安定化方法として不十分であることが判
った。

一方、種々組織から得られたＴＰＡについては安定化方
法として、アルギニン（Ｊ、Ｂ、Ｃｍ、　１９９８（１
９７９））、ゼラチン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
８．７９（１９６９））、あるいはフィブリン（Ｔｈｒ
ｏｍｂａｓＨａｅｍｏｓｔａａ　、　４旦、４３（１９
８１）　〕、アルブミン〔特開昭５８−６５２１８号公
報〕号公報間昭５８−２２４６８７　号公報〕、ポリオ
キシエチレ〉・ソルビタン・モノオレーｒト〔特開昭５
８−２２４６８７号公報〕等が報告されている。しかし
、アルギニンはＴＰＡと強固に結合する為に活性を大き
く低下させ、フィブリンは医薬品に添加できない。

また、ゼラチンやアルブミン、ポリオキシエチレンソル
ビタン・モノオレイト等は単独では、実質的に１重鎖か
らなるｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａの多様な不安定性要因を解決す
ることが出来ず、より効果的な安定化方法を見出す必要
があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは従来技術のこの様な欠点に鑑み、実質的に
１重鎖から成るｕ−ＴＰＡの安定化方法に関して鋭意工
夫した結果、従来技術では達成し得゛なかった極めて安
定な製剤を得る方法を見出し、本発明に到達したもので
ある、 すなわち、本発明は実質的に１重鎖からなるＵ−ＴＰＡ
、　０．００１〜１重量％の非イオン界面活性剤および
０．０１重量％以上のアルブミン、糖類、ゼラチンおよ
びデキストランからなる群から選ばれた１種または２種
以上の化合物を含有するｐＨ４〜６の緩衝溶液又は該溶
液を凍結乾燥して得られたものであることを特徴とする
ヒト子宮組織由来ブラスミノーゲン活性化因子製剤であ
る。

↓ 本発明に用いるｕ−ＴＰＡは、雇伝子組換技術により生
産したｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａならびにヒト子宮組織から採っ
たｕ−ＴＰＡを含む。

遺伝子組換技術により生産したｕ−ＴＰＡとは、ｕ−Ｔ
ＰＡ７伝子を有するベクターを挿入された大腸菌、酵母
、動物細胞などが生産するｕ−ＴＰＡである。

本発明に用いるｕ−ＴＰＡは例えば以下のようにして製
造される。

ＣＤ　ヒト子宮組織をグアニジンチオシアネートの如き
ＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で破砕した後、遠心分離
操作により全ＲＮＡを単離した。

■　得られたヒト子宮組織全ＲＮＡからオリゴｄＴアフ
ィニティーカラムクロマトによりメツセンジャーＲＮ　
Ａ　（ｍＲＮＡ　）を単離し、更にシーＪ塘密度勾配沈
降法により該ｒｎＲＮＡをサイズ分画した。

ｕ−ＴＰＡｖｐ異的ｍＲＮＡを含む分画はノザンブロノ
ト法によって得た。

■　上記の様にして同定されたｕ−ＴＰＡｅ異的ｍＲＮ
Ａを含む分画からＲＮ　Ａを回収し、該ＲＮＡに対応す
る一重鎖ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いて作製し、該−重
鎖ｃＤＮＡからＤＮＡポリメラーゼにより二重［ｃＤＮ
Ａを作製した。

■　得られた二重鎖ｃＤＮＡをＳＩニュークレアーゼで
処理した後、オリゴｄｃテールを末端に付与しオリゴｄ
ａ末端を有するｃＤＮＡを作製した。

■　前記の如く得られたオリゴｄＣ末端を有するｃ　Ｄ
　Ｎ　ＡをオリゴｄＧ末端を有する直＠　ｐ　Ｂ　Ｒ３
２２プラスミドに挿入した。得られたベクターを使用し
、大腸菌を形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作製した
。

■　前記の如く作製されたｃＤＮＡライブラリーからコ
ロニーハイブリダイ−ビイジョン法によりホ“ジティブ
なｃＤＮＡクローンを単離した。単層したクローンから
プラスミドＤＮＡを単離し該Ｄ　Ｎ　Ａの配列を決定し
た。

■　以上の様にして得られ、配列を決定された複数のｅ
ＤＮＡを適当な制限酵素による切断とＤＮＡライゲース
による結合を組合せて、全ｕＴＰＡコーディング部を含
むｕ−ＴＰＡｃＤＮＡを構築した。

■　上記の様にして構築したｕ−ＴＰＡｃＤＮＡを適当
な制限酵素による切断と末端の修飾処理とＤＮＡライゲ
ースによる結合とを組合せて適当な発現ベクターに挿入
した。

■　本発明にかかわる発現ベクターは下記のＤＮＡ配列
を含む。すなわちｕ−ＴＰＡｃＤＮＡ以外に牛乳頭腫ウ
ィルスＤＮＡ配列の全部もしくは一部と、ｐＢＲ３２２
プラスミドＤＮＡの一部とｕ　−Ｔ　ＰＡｃＤＮＡの発
現に必要なりＮＡ配列と転写停止に必要なりＮＡ配列を
含み、場合によっては発現ベクターによる形質転換体を
選別するのに有効なりＮＡ配列も含む。

［相］　前記の如く得られた発現ベクターを適当な宿主
細Ｑ、例えばマウス細胞Ｃ１２７に形質転換し、得られ
た形質転換細胞を培養により増殖させ、目的とするｕ　
−Ｔ　Ｐ　Ａを培地中に分泌産生させた。

実質的に１重鎖から成るｕ−ＴＰＡとは、２重鎖が含ま
れていても柵く少量であり、物理化学的性質、生物学的
性質等いずれに於ても１重鎖ｕ　−ＴＰＡとほぼ同じ特
徴を有するものを言い、その意味で通常１重鎖／２重鎮
比が９／１より大きいｕ　−１’　Ｐ　Ａを指す。

本発明に用いられる緩衝液はｐＨ４〜６のｑｆ域に於て
緩衝作用を有するものであり、酢酸、クエン酸、酒石原
などの緩衝液を挙げることが出来る。

その中でも酒石酸緩衝液が緩衝作用、注＝ｑ時の刺激性
などの点で最も好ましい。

緩衝液濃度は任意に選ぶことが出来るが、通常０．００
２〜０．５　Ｍの範囲が用いられる。０．００２Ｍより
薄いときは緩衝作用か弱すぎる為、ｐＨを安定に保つこ
とが困難である。実質的に１重鎖からなるｕ−ＴＰＡの
溶解度は塩濃度が増加すると共に増大する為、塩ａ度が
濃い程、使用時の溶解が容易であり、凍結乾燥前の調製
液段階で析出する心配が少ないが、余り濃すぎると注射
時に通常使用する溶解液（生理食塩水又は注射用蒸留水
）ｔｔで溶解させた時の浸透圧が高くなりすぎて、好古
しくけ無い。その意味で緩衝液励度としては０．５Ｍを
越えないことが望ましい。また、薄いω受液に食塩など
の中性塩を添加することに依り、緩衝作用と、溶解度の
増加を達成することも可能である。その場合にも塩濃度
の合計がｏ、ｓｈｉ以下であることが望ましい。

緩衝液を調整する際のｐＨは４〜６の範囲であることが
必要であり、これより酸性では溶液での安定性が十分で
なく、徐々に失活する。これよりアルカリ性側では、や
はり徐々に失活すると同時に、１重鎖ｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａ
の２重鎖ｕ−ＴＰＡへの変換が生じる。更に、ｕ−ＴＰ
Ａの溶解度が低下し、安定な溶液をつくることが困難で
ある。その意味で９１は通常４〜６、好ましくは４．５
〜５．５が用いられ、その範囲ではｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａは
容易に溶解し、活性の低下、２重鎖への変換等は全く問
題にならない。

従来、種々ＴＰＡの製剤化については、あまり検討され
ておらず、例えば特開昭５７−１２０５２３号公報、５
７−２８００９号公報、５８　６５２１８号公報、５８
−２２４６８７号公報等の実施例に於て述ぺられている
製剤処方はリン酸緩衝液などの中性付近に使用される緩
衝液が使用されているが、本発明の様に酸性領域で調製
されたＴＰＡ溶液から凍結乾燥して製剤を得ることに依
り優れた効果が得られることについては、全く予期され
ていなかった。

本発明の製剤に用いられる非イオン界面活性剤とは、脂
肪族アルコールのポリアルキレングリコールエーテル、
アルキルフェノールのポリアルキレングリコールエーテ
ル、脂肪醗のポリアルキレングリコールエステルなど、
イオン性を示さない界面活性剤を指し、好適な例として
、ツイーン８０■（Ｊ、Ｔ、ペーカー・ケミカルズ）及
びＨＣＯ−６００にツコーケミカルズ）が挙げられる。

非イオン界面活性剤は調整液中に０．００１〜１重量％
の範囲にあることが必要で、特に０．０１〜０．１重量
％の範囲が好ましい。非イオン界面活性剤が０．００１
重量％より薄いと、調整液タンクの壁面への吸着、注射
剤用充填機の機材への吸着、充填後のバイアルへの吸着
等により活性が低下する。

上記非イオン性界面活性剤は人体に投与しても安全であ
るが、余り多く用いることは溶血などの微弱な副作用を
もたらすことも有り、その意味で１重量％を越えないこ
とが好ましい。

本発明の実質的に１重頭からなるｕ−ＴＰＡ製剤には、
上記の成分以外に、アルブミン、糖類、ゼラチン、およ
びデキストランからなる群から選ばれた１種または２種
以上の化合物を調整液中に帆０１重量％以上の濃度で含
ませることが必要であり、これ等により製剤の安定性を
より高めることができる。０．０１重量％より少ない濃
度では十分な効果が得られない。

糖類の例としては、グルコース、キシロース、ガラクト
ース、フラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルト
ース、サッカロースなどの二糖類、マンニット、ソルビ
ット、キシリットなどの糖アルコール類を挙げることが
できる。

本発明の調剤を得る方法は特に限定されないが具体例を
述べると、前述の遺伝子組換技術を用いて分泌産生させ
た実質的に１重鎖から成るｕ　−ＴＰＡ（培養中に１１
鎖から２重鎖に変換することを防止する為に培養液甲に
は少量の抗プラスミン剤が通常添加される）を常法に依
り精製し、得られた高純度の実質的に１！鎧からなるｕ
−ＴＰＡを取得する。この精製操作は特に限定されない
が、１製方法に依っては、操作の各段階に少量の抗プラ
スミン剤および非イオン界面活性剤が添加されることが
ある。

得られた実質的に１重鎖から成るｕ−ＴＰＡ溶液を０．
００１〜１２１ｉｊｉ％の非イオン界面活性剤を含むｐ
Ｈ４〜６の扁新液（必要に応じて、食塩などの中性塩が
添加される）に透析する。透析液中には少量の抗プラス
ミン剤を添加しておく方が、より確実に２重鎖への変換
が防止できる為に好ましい。

この透析の目的は、凍結乾燥に供する？Ｊ３整液を得る
ことにあり、必ずしも透析で無くとも、ゲル濾過法に依
る溶媒置換を用いることも可能である。

ゲル濾過法を用いる場合にも少量の抗プラスミン剤を移
動層溶媒に含ませることが好ましい。抗プラスミン剤と
はセトラキｆ−）（：４−（２−カルボキシエチル）フ
ェニル−トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボキシレート）　、ｌ−アミノカルボン酸、トラネキ
サム酸〔トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸〕等の抗プラスミン作用を看するものを言い、
通常１０−８〜１０’Ｍの濃度で用いられる。

得られたｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａ溶液を透析液またはゲル１過
溶媒と同一組成の溶媒にて適宜希釈し、所定濃度のｕ　
−Ｔ　Ｐ　Ａ溶液を得る。

このｕ−ＴＰＡ溶液にヒト血清アルブミン、糖類、ゼラ
チンおよびデキストランからなる群から選ばれた１種ま
たは２種以上の化合物を溶液の０，０１重ｆｆｉ％以上
の濃度になる様に添加し、調整液を得る。

精製ｕ−ＴＰＡが調整液と同じ溶媒組成の溶液として得
られる場合には溶媒置換は不要であり、不足する添加物
をｕ　−Ｔ　Ｐ　Ａ溶液に添加することで、調整液を得
ることができる。

得られたｕ−ＴＰＡ調整液をそのま一製剤として使用し
てもよいが、一般には常法により容器に必要陸分注し、
凍結乾燥を行うことに依り製剤として極めて容易に得る
ことができる。

（発１月の効果） 本発明は実質的に１重鎖から成るヒト子宮組織白米プラ
スミノーゲン活性化因子製剤に関するものであり、例え
ば実質的に１重鎖から成るヒト子宮組織由来プラスミノ
ーゲン活性化因子を、ｐＨ４〜６のｖｈ液および０．０
０１〜１重ｉｆ１％の非イメン界面活性剤および０．０
１重量％以上のアルブミン・糖類、ゼラチンおよびテキ
ストランからなる群から選ばれた１種または２種以上の
化合物を含有する溶液に溶解させた又は該溶液を凍結乾
燥して得られた実質的に１重鎖から成るヒト子宮組織由
来プラスミノーゲン活性化因子裂創である。

口σ述のように本発明の実質的に１重鎖から成るｕ　−
Ｔ　Ｐ　Ａ製剤は保存安定性にすぐれているのみでなく
、溶解が容易であり、更に溶液とした場合の安定性にも
極めてすぐれた特徴を有するものである。

（実施例） 以下実施例に依り本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれ等により限定されるものでは無い。

試験方法１．ＦＣＬＴ法（フィブリンクロットライシス
タイム法）による活性の測定。

Ｊ４１ｏｕｇら％　Ｂｌｏｃｈｉｍｌｃａ　ｅｔ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ。

ユ、２７８〜２８２（１９５７）の方法に従って測定し
た。なおサンプルの希釈は０．０１％ＨＣＯ−６０を含
む生理食塩水にて行い、活性の表示はＷＨＯの標準Ｔ　
Ｐ　Ａ　ｆ−基準として行った。

試験方法２．８−２２８８法（合成基準法）による活性
の測定 Ｓ−２２８８基質（Ｈ−Ｄ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐｒｏ　−
Ａｒｇ　−ＮＨ−し、遊離するｐ−ニトロアニリンの吸
光度を測定する標準操作方法で測定した。

試験方法３．ｕ−ＴＰＡの１重鎖／２重鎖比の定量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて銀染色
後のデンジトメ）　ＩＪ−を行い、予め作成した２重鎖
ｕ−ＴＰＡの検′ｊＡ線から求めた。

実施例１゜ 本発明の製剤添加物のＦＣＬＴ活性への影響ｕ−ＴＰＡ
ｍ伝子を有するベクターを挿入したマウスＣ−１２７細
胞を培養し、精製して得られた１重鎖／２重鎖比９８／
２のｕ−ＴＰＡを用いて、２５４００単（ｆ！、／−の
ｆｉ’ｃＬＴ活性を有するＵ−丁ＰＡ溶液（０，３Ｍ　
Ｎ１１７１，０．０３Ｍ酒石ｍＢ衝液、０．０２ｆｆｉ
遺％ツイーン８０を含む、ｐＨ５，０）を得た。この溶
液および溶液量の０．５重足％のツイーン８ｏおよび５
重景％のアルブミン、ゼラチン、デキストラン又は糖類
を添加した溶液を得た。この溶液を０．０２％のツイー
ン８０を含む生理食塩水で２００倍に希釈し、ＦＣＬＴ
活性を測定した。その結果３第１表に示す。

比較例１゜ アルギニンのＦＣＬＴ活性へのｌｌ！ｊｉ害効果実施例
１のｕ　−’ＦＰ　Ａ溶液に溶液量の５重ａ％のアルギ
ニン・塩酸を添加した溶液を用い、実施例１と同様の実
験を行なった。その結果を実施例１と共に第１表に示す
。

第１表の実施例と比較例より本発明に用いられる添加物
はＦＣＬＴ活性に影響しないのに対し、アルギニンはｕ
　−’Ｉ’　Ｐ　Ａと相互作用し、活性を低下させるこ
とかわかる。

第１表 ＊１０．０２重量％のツイーン８０を含む＊１０．５２
２ｊｆのツイーン８０を含む実施例２゜ 本発明の製剤処方に於る溶解度 実施例１と同様の方法で得た１重鎖／２重鎮比９０／１
０の１ｌ−ＴＰＡを用いて、ＦＣＬＴ活性４，１３０．
０００重位／ゴ（７”ｉ／　−）の溶液（１，６Ｍチオ
シアン化カリ、０．０２％ツイーン８０を含む）を得た
。この溶液の一部、２５０μｔずつをコロジオンバッグ
５Ｍ１３２００に入れ、それぞれ１重量％のマンニトー
ルを含む３０　ｍ　Ｍ酒石酸緩衝液（ｐｆ−１４，ｓ　
、　ｓ、ｓ、ｓ）又は１重ｔｈｌｌｔ％のマンニトール
を含０３０　ｍ　Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐ）１４．８．
５，５．５　）に対し４℃で透析し、２時間をかけて完
全に溶媒置換を行なった。透析終了後、遠心分離（４℃
、　１６０００　ｒ、ｐ、ｍ　）を行ない、上清中のｕ
−ＴＰＡ濃度をＳ−２２８８活性測定決を用いて計質し
た。

この結果を第１図に示す。図中・は酒石酸緩衝液、○は
クエン酸緩衝液の場合をそれぞれ示す。

更に、１重蓋％のマンニトールを含む５　ｍ　Ｍ酒石酸
緩衝液（ＰＨ４，８，５）に食塩を種々濃度添加した液
に対し透析し、溶解度を測定した結果を第２図に示すっ
第２図中、口はｐＨ４，８、・はｐＨ５の場合の結果を
それぞれ示す。

第１図より本発明のｐＨ４〜６の溶液では高い溶解度が
得られることがわかる。また第２図より塩濃度を上げる
ことに依り、更に高い溶解度が得られることがわかる。

比較例２゜ 本発明の製剤処方のｐＨ領域以外での溶解度実施例２の
ｕ−ＴＰＡ溶液２５０μｔずつを用いて、０．０２　ｆ
ｆ１Ｍ　％のツイーン８０を含む３０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０，６，５）に対し、同様に透析し、同様
の方法で溶解度を求めた。この結果を第１図の口の点で
示す。第１図より中性付近では高い溶解度が得られない
ことがわかる。

実施例３゜ 本製剤処方の溶液状態での安定性 実施例１と同様の方法で得た１重鎖／２重鎮比９８／２
のｕ−ＴＰＡを用いて、３１０．０００重位／−のＦＣ
ＬＴ活性を有するｕ−ＴＰＡ溶液（０，３ＭＮａＣ１、
０，０３Ｍ酒石酸緩衝液、０．０２７Ｒｈｔ　％ツイー
ン８０を含む、ｐＨ５，０）を得た。この溶液１〇−ず
つを透析チューブに入れ、１［ｔ％のマンニトール、０
．０２重量％のツイーン８０およびｌＸｌ０　　’Ｍの
セトラキセートを含むｐＨ５，５，５，４，５の各緩衝
液に対し、４℃で透析し、８時間をかけて完全に溶媒を
置換した。透析終了後の液をポリプロピレン容器に移し
密閉後、３７℃の恒温槽に入れ、７日後にサンプリング
し、１ｊｆ［／２重鎮比及びＦＣＬＴ活性を測定した。

その結果を第２表に示す。

比較例３゜ 本発明の製剤処方のｐＨ領域以外での溶解度実施例３で
得られたｕ−ＴＰＡ溶液の１０−ずつを用いて、ｌｉ！
ｉＭｋ％のマンニトール、０．０２！！量％のツイーン
８０およびｌＸ１０’Ｍのセトラキセートを含むｐＨ９
，７，０，６，５および３．５の種々緩衝液に対し、同
様の方法で溶媒置換を行った。実施例３と同様の試験で
得られた１３！ｉ鎖／２重鎖比、及びＦＣＬＴ活性の測
定結果を実施Ｌ！Ａ３の結果と共に第２表に示す。

第２表より本発明の製剤処方ＯｐＨ領域では、それより
アルカリ側、酸性側に比べ、活性の保持率も高く、２ｉ
鎖への変換が少ないことがわかる。

以下余日 第２表 実施例４゜ 本製剤の凍結乾燥時及び凍結乾燥後の安定性実施例１と
同様の方法で得た１重鎖／２重趙比９９／１のｕ−ＴＰ
Ａを用いて１；’　ＣＬ、　Ｔ活性２６５，０００単位
／ゴのｕ　−Ｔ　Ｐ　／、溶液（０，３Ｍ　ＮａＣ１，
０，０３Ｍ酒石酸、１０’Ｍセトラキセートを含む、Ｐ
Ｈ５）を得た。これを種々濃度の非イオン界面活性剤お
よびアルブミン、ゼラチン、糖類またはデキストランを
含む溶媒（０，３ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍ酒石酸、１０
’Ｍ七トラキセートを含む、ｐＨ５）で２倍に希釈し、
非イオン界面活性剤を０．００１〜１重量％の＝Ｘで含
み、更にアルブミン、ゼラチン、！：Ｉｔ類古たけデキ
ストランを０．０１重量％以上の濃度で含む調製液を得
た。これを２０−のシリコンコートバイアルにそれぞれ
４　ｙｔずつ分注した。これを通當の方法で凍結乾燥し
、−得：枦滓た猿増渠項目−得られた凍結乾燥製剤およ
びこれを６０℃の恒温槽中に３日間保持した時のｌ；’
　ＣＬ　Ｔ活性を測定した。

この結果を第３表に示す。

比較例４゜ 本発明の製剤処方外の場合の凍結乾燥時及び凍結乾燥後
の安定性 実施例４と同様のｕ−ＴＰＡ溶液を用い、これを種々濃
度の非イオン界面活性剤、アルブミン、ゼラチン、糖類
またはデキストランのそれぞれ単独を含む溶媒（ｏ、ａ
　ｈｒ　ＮａＣ１，０，０３Ｍ酒石酸、１０−６Ｍセト
ラキセートを含む、ｐ）Ｉ５）で２倍に希釈し、非イオ
ン界面活性剤、アルブミン、ゼラチン、糖類またはデキ
ストランのぞれぞれを単独で含む調製液を得た。一方、
非イオン界面活性剤およびアルブミン、ゼラチン、糖類
またはデキストランを本発明の処方の範囲外の組合せで
なる調製液を得た。これらを実施例４と同様に凍結乾燥
し、凍結乾燥時及び凍結乾燥後の安定性をみた。この結
果を実施例４の結果と併せて第３表に示す。第３表より
、本製剤処方のすぐれた安定性かわかる。

以下余白

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＨと溶解度の関係を示したものであり、図中
・は酒石酸緩衝液（￥Ｌ：ｉ！ｉ例２）、○はクエン酸
緩衝液（実施例２）、口はリン改ｖ新液（比較例２）の
それぞれ３０ｍＭを用いたときの溶解度を表わす。 第２図は５　ｍ　Ｍの酒石酸緩衝液に食塩を添加したと
きの溶解度の変化を示したものであり、図中・はｐＨ５
、口はｐＨ４，８の溶解度を示す。 特許出願人　東洋紡！六株式会社 早　ｌＩ２１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 実質的に１重鎖から成るヒト子宮組織由来プラスミノー
   ゲン活性化因子、０．００１〜１重量％の非イオン界面
   活性剤および０．０１重量％以上のアルブミン、糖類、
   ゼラチンおよびデキストランからなる群から選ばれた１
   種または２種以上の化合物を含有するｐＨ４〜６の緩衝
   溶液又は該溶液を凍結乾燥して得られたものであること
   を特徴とするヒト子宮組織由来プラスミノーゲン活性化
   因子製剤。