JP2002531519A - 血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症性症候群の処置法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プロテインＣを用いた血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）の処置法を提供する。特許請求する本発明は、合併症（例えば、出血傾向、毒性、および血漿交換の通常の副作用または現在に利用可能な抗凝固剤の通常の副作用）を避けながら、潜在的に深刻で、且つ衰弱性である障害について必要とされる療法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、医学、特にプロテインＣを用いた血栓性血小板減少性紫斑病（thro
mbotic thrombocytopenia purpura）および溶血性尿毒症性症候群（hemolytic u
remia syndrome）の処置に関する。

【０００２】 （背景技術） プロテインＣはビタミンＫ依存型セリンプロテアーゼであり、天然に存在する
抗凝固物質であって、凝固カスケードのＶａ因子およびＶＩＩＩａ因子を失活さ
せることによって止血の調節に役割を果たしている。ヒトプロテインＣは２本鎖
チモーゲンとして循環するが、細胞表面膜プロテインであるトロンボモジュリン
との複合体としてトロンビンによる限定的なタンパク分解反応による活性化プロ
テインＣ（ａＰＣ）への変換後、内皮表面および血小板表面で作用する。

【０００３】 他のタンパク質と共に、ａＰＣは血液凝固作用のおそらく最も重要な下方調節
因子として働き、血栓症を防止するであろう。その抗凝固機能に加えて、ａＰＣ
はサイトカイン（例えば、ＴＮＦおよびＩＬ−１）の生成を阻害することによっ
て抗炎症効果を有し、また血塊の溶解を促進するプロフィブリン溶解の性質（Ｐ
ＡＩ−１の阻害）をも発揮する。従って、プロテインＣ酵素系は、抗凝固作用、
抗炎症作用およびフィブリン溶解の主要な生理学的機構である。

【０００４】 血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）
は、微小血栓による細動脈および毛細血管の閉塞、血小板減少、神経系機能の損
傷および進行性の腎不全を特徴とする血栓性微小血管症と定義される。ＴＴＰは
、発熱、変動性の中枢系異常（fluctuating central nervous system abnormali
ties）、腎不全、微小血管性溶血性貧血および血小板減少を特徴とする多系統疾
患と定義される。ＨＵＳは、赤血球の断片化に関係する血管内溶血性貧血、血小
板減少および終末器官の損傷を特徴とするが、それら終末器官の損傷は（ａ）血
栓性微小血管症の過程の組織学上という証拠（腎臓中が最も一般的である）、ま
たは（ｂ）いずれかの他の疾患もしくはそれらの原因となりそうなものがない場
合でのそれら終末器官の損傷という臨床学的証拠を有する［Neild, G.によるKid ney International 53（補遺、64）: S-45-S-49, 1988］。

【０００５】 ＴＴＰ／ＨＵＳの病態生理学の原因である因子は、内皮細胞の損傷および初期
の血小板の凝集であると考えられている［MoakeによるSeminars in Hematology,
34(2): 83-89, 1997］。内皮損傷は、異常に大きいフォンウィルブランド因子
（unusually large von Willebrand factor (UL vWF））マルチマーの放出をも
たらし、これらは次に血小板凝集となる。フィブリン血栓は身体のフィブリン溶
解システムの低下の結果として、血小板血栓上に蓄積する。ＨＵＳおよびＴＴＰ
において、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質（ＰＡＩ−１）のレベルの上昇
およびプロテインＣ活性のレベルの低下を見出した。

【０００６】 ＴＰＰは、バルトネラ属（Bartonella sp.）のバクテリア感染、そしてまたＨ
ＩＶおよび内臓カポジ肉腫に関係する［AvertyらによるAmerican Journal of He matology , 58: 148-149, 1988］。ＴＴＰはまた、多数の薬物（例えば、チクロ
ビジン、ＦＫ５０６、高用量のコルチコステロイド、タモキシフェンまたはシク
ロスポリンＡ）の使用と関係する［GordonらによるSeminars in Hematology, 34
(2),: 140-147, 1997］。

【０００７】 ＨＵＳは、多数の細菌（例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７菌株、赤痢菌、肺炎球
菌、溶血性連鎖球菌またはエルシニア）の感染と関係している。ＨＵＳは、ウイ
ルス（例えば、ＨＩＶウイルス、コクサッキーウイルスまたはアデノウイルス）
の感染とも関係している。加えて、ＨＵＳはＴＰＰについての上記の薬物と類似
する多数の薬物の使用と関係している［Gordenらによる1997］。ＴＴＰおよびＨ
ＵＳは共に、妊娠中の合併症と関係している［EgermanらによるAm J Obstet Gyn ecol , 175: 950-956, 1996］。

【０００８】 血栓性微小血菅症の臨床上の発見は、微小血管性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）、急
性腎不全および血小板減少を含み、ＴＴＰの場合では急性の神経系の変化を含む
。未処置のまま放置すると、ＴＴＰおよびＨＵＳは予後に乏しく、死亡率は９０
％に達する。生き残った患者は、末期の腎疾患に発展することが多い。好ましい
結果を有する唯一の処置方法は、新鮮な凍結血漿を用いた血漿交換［ＰＥ］であ
る［HollenbeckらによるNephrol Dial Transplant 13: 76081, 1998］。しかし
ながら、ＰＥで処置した場合でさえも、死はなお生じ、多数の患者は長期の合併
症を患う。従って、ＴＴＰおよび／またはＨＵＳのより効果的な処置についての
要求が存在する。

【０００９】 本発明は、プロテインＣを用いたＴＴＰおよび／またはＨＵＳの処置を記載す
る初めてのものである。抗凝固性およびプロフィブリン溶解活性、並びにＰＡＩ
−１を失活させる能力を有するプロテインＣは、ＴＴＰおよびＨＵＳを有する患
者において生じる微小血栓による細動脈および毛細血管の閉塞の処置に有用であ
る。

【００１０】 （本発明の概要） 本発明は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を患っている患者の処置方法
を提供し、該方法はその患者に医薬的に有効な量のプロテインＣを投与すること
を含む。

【００１１】 別の態様において、本発明は溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）を患っている患
者の処置方法を提供し、該方法はその患者に医薬的に有効な量のプロテインＣを
投与することを含む。

【００１２】 別の態様において、本発明は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置方法
を提供し、該方法は活性化プロテインＣの血中レベルが約２ｎｇ／ｍＬ〜約３０
０ｎｇ／ｍＬに達するように、その患者に医薬的に有効な量の活性化プロテイン
Ｃを投与することを含む。

【００１３】 更に別の態様において、本発明は処置が必要な患者における溶血性尿毒症性症
候群（ＨＵＳ）の処置方法を提供し、該方法は活性化プロテインＣの血中レベル
が約２ｎｇ／ｍＬ〜約３００ｎｇ／ｍＬに達するように、その患者に医薬的に有
効な量の活性化プロテインＣを投与することを含む。

【００１４】 （発明の詳細な記載） 本明細書で開示し、特許請求する本発明の目的のために、次の用語は以下に定
義する通りである。

【００１５】 プロテインＣは、抗凝固性、抗炎症性およびプロフィブリン溶解性を有するビ
タミンＫ依存型セリンプロテアーゼを意味し、このものは血漿由来のプロテイン
Ｃおよび組換え産生のプロテインＣを含むが、これらに限定されない。プロテイ
ンＣはプロテインＣのタンパク質分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性
および生物学的（抗凝固性、プロフィブリン溶解性および抗炎症性）活性を有す
る他の種または他の誘導体をも含み得るが、プロテインＣはヒトプロテインＣを
含み、ヒトプロテインＣであることが好ましい。プロテインＣ誘導体の例は、Ge
rlitzらによる米国特許第5,453,373号およびFosterらによる米国特許第5,516,65
0号（これらの教示は本明細書の一部を構成する）に記載されている。

【００１６】 チモーゲンとは、タンパク質分解酵素の酵素的に不活性な前駆体である。本明
細書で使用するプロテインＣチモーゲンは、分泌された不活性な形態の１本鎖ま
たは２本鎖のプロテインＣを意味する。

【００１７】 活性化プロテインＣまたはａＰＣとは、限定的なタンパク質分解反応によって
その活性化形態に変換されるプロテインＣチモーゲンを意味する。ａＰＣはプロ
テインＣのタンパク質分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性および生物
学的活性（抗凝固性またはプロフィブリン溶解性）を有する他の種または他の誘
導体をも含み得るが、ａＰＣはヒトプロテインＣを含み、ヒトプロテインＣであ
ることが好ましい。プロテインＣ誘導体の例は、上記のプロテインＣに関する記
載の通りである。 ＨＰＣ：ヒトプロテインＣチモーゲン。 ｒ−ｈＰＣ：組換えヒトプロテインＣチモーゲン。 ｒ−ａＰＣ：ｒ−ｈＰＣをインビトロで活性化することによって産生するか、
または原核生物細胞、真核生物細胞およびトランスジェニックな動物もしくは植
物から活性化型プロテインＣを直接に分泌させることによって製造した組換えヒ
ト活性化プロテインＣであり、チモーゲンとしてヒトの腎臓２９３細胞から分泌
させ、次いで当業者にとってよく知られる方法、およびYanによる米国特許第4,9
81,952号およびCottinghamによるWO97/20043（これらは本明細書の一部を構成す
る）に示された方法によって精製し、活性化させたものを含む。

【００１８】 血漿由来の活性化プロテインＣとは、Eiblによる米国特許第5,478,558号（こ
の教示は本明細書の一部を構成する）に記載されているように、血漿ＨＰＣを活
性化することによって産生する活性化プロテインＣである。

【００１９】 連続注入とは、一定の期間、静脈中に実質的に中断せずに、連続して溶液を導
入することである。

【００２０】 ボーラス注入とは、決まった量（ボーラスと呼ばれる）の薬物を約１２０分間
までの時間に注入することである。

【００２１】 投与に適当であるとは、治療学的薬剤として与えることが適当な凍結乾燥した
製剤および溶液である。

【００２２】 単位用量形態とは、ヒトの被験者にとって単一用量として適当な物理的に別個
の単位を言い、各単位は適当な医薬賦形剤と共に、目的の治療学的効果を得るよ
うに計算された、予め決定した量の活性物質を含む。

【００２３】 医薬的に有効な量とは、ヒトの敗血症を阻害することができる本発明の化合物
の量を意味する。本発明に従って投与する化合物の用量は、当然に患者の置かれ
ている状況を考慮して、医師によって決定されるべきである。

【００２４】 本発明は、活性化プロテインＣを用いた血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
および溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）の処置方法を提供する。ＴＴＰは、発熱
、変動性の中枢系異常、腎不全、微小血管性溶血性貧血および血小板減少を特徴
とする多系統疾患と定義されている。ＨＵＳは、赤血球の断片化に関係する血管
内溶血性貧血、血小板減少および終末器官の損傷を特徴とするが、それら終末器
官の損傷は（ａ）血管性微小血管症の過程という組織学上の証拠（腎臓中が最も
一般的である）、または（ｂ）いずれかの他の疾患もしくはそれらの原因となり
そうなものがない場合でのそれら終末器官の損傷という臨床学的証拠を有する。
抗凝固性およびプロフィブリン溶解活性、並びにＰＡＩ−１を失活させる能力を
有するプロテインＣは、ＴＴＰおよびＨＵＳを有する患者において生じる微小血
栓による細動脈および毛細血管の閉塞の処置に有用である。

【００２５】 本発明に従って投与するプロテインＣは、当該分野で知られるか、または米国
特許第4,981,952号および米国特許第5,550,036号（これらは本明細書の一部を構
成する）に記載のいずれかの方法によって生成し、および／または単離すること
ができる。例えば、本発明は完全鎖の溶解性プロテインＣ、またはプロテインＣ
の生物学的に活性なポリペプチド変異体を細胞から生産し、分泌させる方法を提
供し、その方法は（ａ）プロテインＣをコードしたＤＮＡを含むベクターを構築
し；（ｂ）そのベクターを用いて細胞をトランスフェクトし；そして（ｃ）完全
鎖の溶解性プロテインＣまたは生物学的に活性なプロテインＣのポリペプチド変
異体が分泌される条件下で培地中で、トランスフェクトした細胞を培養すること
を含む。更に、その細胞は真核生物細胞（例えば、シリアン（Syrian）ハムスタ
ーのＡＶ１２細胞、ヒトの胚の２９３細胞または仔ハムスターの腎臓細胞などの
哺乳動物の細胞）である。

【００２６】 ＴＴＰおよび／またはＨＵＳの処置において使用するプロテインＣは、公知の
方法に従って製剤化を行って医薬的に有用な組成物を製造することができる。例
えば、目的の製剤は安定な高純度の凍結乾燥した生成物であって、これはバルク
剤（例えば、スクロース）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、バッファー（例え
ば、クエン酸ナトリウム）およびプロテインＣもしくはａＰＣを含む。

【００２７】 プロテインＣは、有効な形態での血流中への運搬を保証するために、適量を約
１時間〜約２４０時間連続注入として注入することによって非経口投与する。

【００２８】 良い医療と個々の患者の臨床学上の病状によって決まる通り、当該分野の当業
者は、プロテインＣを含む治療学的な組成物の医薬的に有効な量および投与レジ
メを容易に最適化することができる。通常、投与するプロテインＣの量は、約５
.０μｇ／ｋｇ／時間〜約２５０μｇ／ｋｇ／時間である。ＴＴＰ／ＨＵＳの処
置に使用されるプロテインＣは活性化プロテインＣであることが好ましい。投与
するａＰＣの量は約１.０μｇ／ｋｇ／時間〜約９６μｇ／ｋｇ／時間である。
その投与するａＰＣの量は、約１.０μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時
間であることがより好ましい。その投与するａＰＣの量は、約１.０μｇ／ｋｇ
／時間〜約３５μｇ／ｋｇ／時間であることがなおより好ましい。その投与する
ａＰＣの量は、約５.０μｇ／ｋｇ／時間〜約３０μｇ／ｋｇ／時間であること
がより一層好ましい。その投与するａＰＣの量は、約１５μｇ／ｋｇ／時間〜約
３０μｇ／ｋｇ／時間であることがなおより一層好ましい。その投与するａＰＣ
の量は、約２０μｇ／ｋｇ／時間〜３０μｇ／ｋｇ／時間であることが更により
一層好ましい。その投与するａＰＣの最も好ましい量は、約２４μｇ／ｋｇ／時
間である。適当な用量のａＰＣを投与することにより、ＴＴＰおよびＨＵＳを有
する患者において生じる微小血栓による細動脈および毛細血管の閉塞の軽減が得
られる。

【００２９】 投与するａＰＣの量から得られる血中濃度の範囲は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約３０
０ｎｇ／ｍＬである。その好ましい血中濃度の範囲は約２ｎｇ／ｍＬ〜約２００
ｎｇ／ｍＬである。その血中濃度の範囲は約３０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍ
Ｌであることが最も好ましく、約１００ｎｇ／ｍＬであることが一層より好まし
い。

【００３０】 別法として、ａＰＣを１時間当りの適当な用量の１／３をボーラス注入として
投与し、続いてその１時間当りの用量の残り２／３を１時間で連続注入によって
投与し、続いてその適当な用量を２３時間連続注入することによって、結果とし
てその適当な用量を２４時間投与する。加えて、ボーラス注入は、通常の約２倍
の速度で１０〜２０分間、続いて通常の約１.５倍の速度で４０〜５０分間、静
脈内持続点滴用ポンプ（intravenous bag drip pump）またはシリンジ用ポンプ
によって投与する。次いで、その通常の速度（すなわち、１時間につき適当な用
量レベルの治療剤を投与するように決められた速度）を２４０時間まで続ける。

【００３１】 本発明で示す、ＴＴＰ／ＨＵＳの処置におけるプロテインＣの使用は、潜在的
に深刻であって、且つ衰弱性である障害について要求される療法を提供する。プ
ロテインＣの使用は効果があり、合併症（例えば、毒性および、現在に利用可能
な新鮮な凍結血漿を用いる血漿交換療法［ＰＥ］の通常の副作用または他の現在
に利用可能な抗凝固剤の通常の副作用）を避ける。

【００３２】 以下の実施例は更に本発明を例示するためにのみ提供する。本発明の範囲を以
下の実施例だけからなるものと解すべきではない。

【００３３】 製造例１ ヒトプロテインＣの調製 組換えヒトプロテインＣ（ｒ−ｈＰＣ）は、当業者にとってよく知られた技術
（例えば、前述のYanによる米国特許第4,981,952号、これは本明細書の一部を構
成する）によって、ヒト腎臓２９３細胞中で製造した。ヒトプロテインＣをコー
ドする遺伝子については、Bangらによる米国特許第4,755,624号（これは本明細
書の一部を構成する）に開示され、特許請求されている。２９３細胞中でヒトプ
ロテインＣを発現するのに使用するプラスミドはプラスミドｐＬＰＣであって、
これはBangらによる米国特許第4,992,373号（これは本明細書の一部を構成する
）に開示されている。プラスミドｐＬＰＣの構築については、欧州特許公報0445
939号およびGrinnellらによるBio/Technology 5: 1189-1192，1987 (1987)（こ
れらは本明細書の一部を構成する）にも記載されている。要するに、そのプラス
ミドを２９３細胞中にトランスフェクトし、次いで安定な形質転換物を同定し、
継代培養し、血清を含まない培地中で増殖させる。発酵後、ミクロろ過によって
細胞を含まない培地を得る。

【００３４】 ヒトプロテインＣを、Yanによる米国特許第4,981,952号の教示を適応すること
によって培養液から分離した。アニオン交換樹脂（Fast-Flow Q、ファーマシア
）に吸着させる前に、清澄化した培地をＥＤＴＡ中で４ｍＭに調製した。カラム
の４倍量の２０ｍＭのトリス、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７.４、およびカ
ラムの２倍量の２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７.４を用い
て洗浄後、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、
ｐＨ ７.４を用いて、結合した組換えヒトプロテインＣチモーゲンを溶出した
。溶出後の溶出したタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって判定すると、純度は９５％より大きかった。

【００３５】 タンパク質の更なる精製は、３Ｍのタンパク質のＮａＣｌ液を調製し、続いて
疎水的相互作用樹脂（Toyopearl Phenyl 650M、TosoHaas）（２０ｍＭのトリス
、３ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ ７.４で平衡化した）に吸着
させることによって達成した。カラムの２倍量のＣａＣｌ_２を含まない平衡化バ
ッファーで洗浄後、組み換えヒトプロテインＣを２０ｍＭのトリス、ｐＨ ７.
４を用いて溶出した。

【００３６】 溶出したタンパク質を、残留カルシウムを除去することによって活性化のため
に調製した。その組換えヒトプロテインＣを金属アフィニティーカラム（Chelex
-100、Bio-Rad）を通してカルシウムを除き、再びアニオン交換体（Fast Flow Q
、ファーマシア）に結合させた。これら両方のカラムを直列に配置し、２０ｍＭ
のトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７.４中で平衡化
させた。タンパク質をロードした後、Chelex-100カラムをカラムの１倍量の同一
バッファーを用いて洗浄し、その直列からはずした。そのアニオン交換カラムを
カラムの３倍量の平衡バッファーを用いて洗浄し、そのタンパク質を０.４Ｍの
ＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ ６.５を用いて溶出した。組換え
ヒトプロテインＣ溶液および組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度は
、ＵＶ ２８０ｎｍでの吸光度によって測定し、それぞれＥ^０.１％＝１.８１ま
たは１.８５を得た。

【００３７】 製造例２ 組換えヒトプロテインＣの活性化 ウシトロンビンを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７.５、４℃）の存在下で
、活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（ファーマシア）に結合させた。その結合反応
を、カラムに既に充填した樹脂上で約５０００ユニットのトロンビン／樹脂ｍＬ
を用いて行った。２−アミノエタノール（ＭＥＡ）を加えて循環溶液の濃度を０
.６ｍＬ／Ｌとする前に、トロンビン溶液を該カラムに約３時間循環させた。樹
脂上の未反応のアミンを完全に遮断することを保証するために、そのＭＥＡを含
有する溶液を更に１０〜１２時間循環させた。遮断した後、トロンビンを結合さ
せた樹脂を、カラムの１０倍量の１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ ６
.５を用いて洗浄して、全ての非特異的に結合したタンパク質を除去し、そして
活性化バッファー中で平衡化の後、活性化反応液に使用した。

【００３８】 精製したｒ−ｈＰＣをＥＤＴＡ中で５ｍＭに調製し（残留カルシウムをキレー
トさせるため）、２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７.４）または２０ｍＭのトリス−
酢酸塩（ｐＨ ６.５）を用いて２ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。この物質を
、５０ｍＭのＮａＣｌおよび、２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７.４）または２０ｍ
Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ ６.５）を用いて３７℃で平衡化したトロンビンカ
ラムを通した。流速は、ｒ−ｈＰＣとトロンビン樹脂の接触時間が約２０分とな
るように調節した。流出液を集め、直ちにアミド分解活性をアッセイした。その
物質が確立されたプロテインＣ標準液に匹敵する比活性（アミド分解性）を有し
ない場合、そのトロンビンカラムに再循環させて、そのｒ−ｈＰＣの活性化を完
結させた。これに続いて、次の処理工程を待つ間、プロテインＣをより低濃度に
保つために、上記の通り、２０ｍＭのバッファー（ｐＨは７.４または６.５）を
用いてその物質を１：１に希釈した。

【００３９】 １５０ｍＭのＮａＣｌを含む活性化バッファー（２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７
.４）または２０ｍＭのトリス−酢酸塩（ｐＨ ６.５））中で平衡化させたアニ
オン交換樹脂（Fast Flow Q，ファルマシア）にプロテインＣを結合させること
によって、プロテインＣ物質から浸出したトロンビンを除去した。トロンビンは
これらの条件下でアニオン交換樹脂と相互作用せず、そのカラムを通過して試料
適用流出液に入る。プロテインＣをそのカラム上にロードしたら、カラムの２〜
６倍量の２０ｍＭの平衡バッファーを用いて洗浄を行った後に、５ｍＭのトリス
−酢酸塩（ｐＨ ６.５）または２０ｍＭのトリス（ｐＨ ７.４）中の０.４Ｍ
のＮａＣｌを用いた逐次溶出によって結合したプロテインＣを溶出する。カラム
のより高容量の洗液により、ドデカペプチドのより完全な除去が容易となった。
このカラムから溶出した物質を、凍結した溶液（−２０℃）または凍結乾燥した
粉末として保存した。

【００４０】 活性化プロテインＣの抗凝固活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａ
ＰＴＴ）凝固アッセイの凝固時間の延長を測定することによって測定した。プロ
テインＣの濃度が１２５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲である希釈バッファー（１
ｍｇ／ｍＬのラジオイムノアッセイグレードウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、２
０ｍＭのトリス、ｐＨ ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０.０２％のＮａＮ_３）
で標準曲線を作製し、この濃度範囲内のいくつかの希釈液の試料を調製した。各
試料キュベットに、５０μＬの冷ホース血漿および５０μＬの再構成した活性部
分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、シグマ）を加え、３７℃で５分
間インキュベートした。インキュベートした後、５０μＬの適当な試料および標
準液を各キュベットに加えた。基本（basal）凝固時間を測定するために、試料
または標準液の代わりに希釈バッファーを用いた。各試料または標準液にＣａＣ
ｌ_２（５０μＬ、３７℃、３０ｍＭ）を加えた後、直ちに、フィブロメーター（
fibrometer）（CoA Screener Hemostasis Analyzer、American Labor）のタイマ
ーを開始させた。試料中の活性化プロテインＣの濃度は、標準曲線の直線回帰式
から算出した。本明細書で報告する凝固時間は、３つの反復試験（標準曲線用試
料を含む）の最小値の平均である。

【００４１】 上の記載により、当業者は血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症性症
候群の処置において有用なプロテインＣを製造することが可能である。

【００４２】 製造例３ 活性化プロテインＣの製剤化 活性化プロテインＣの安定な凍結乾燥製剤は、約２.５ｍｇ／ｍＬの活性化プ
ロテインＣ、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約２０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌおよ
びｐＨが５.５よりも高いが６.５よりも低いクエン酸ナトリウムバッファーを含
む溶液を凍結乾燥することを含む方法によって製造した。加えて、活性化プロテ
インＣの安定な凍結乾燥製剤化は、約５ｍｇ／ｍＬの活性化プロテインＣ、約３
０ｍｇ／ｍＬのスクロース、約３８ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌおよびｐＨが５.５よ
り高いが６.５より低いクエン酸ナトリウムバッファーを含む溶液を凍結乾燥す
ることを含む。

【００４３】 プロテインＣ：塩：バルク剤の重量比は、凍結乾燥法に適当な製剤化における
重要な因子である。その比は、プロテインＣの濃度、塩の選択およびその濃度、
並びにバルク剤の選択およびその濃度に応じて変わる。特に、活性化プロテイン
Ｃ：塩：バルク剤（約１：約７.６：約６）の比が好ましい。

【００４４】 連続注入による投与が適当な活性化プロテインＣの単位用量製剤は、活性化プ
ロテインＣ、ＮａＣｌ、スクロースおよびクエン酸ナトリウムバッファーを混合
することによって製造される。混合した後、４ｍＬの溶液を単位用量容器に移し
、凍結乾燥した。それらの処置が必要な患者に約０.０１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約
０.０５ｍｇ／ｋｇ／時間の用量を投与するのに適当な、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ
の活性化プロテインＣを含む単位用量容器を封して、使用するまで保存した。

【００４５】 実施例１ 血栓性微小血管症の処置における組換え活性化プロテインＣ（ｒ−ａＰＣ）のプ
ラシーボコントロール二重盲無作為試験 溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）および血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
は、刺激事象として内皮の損傷を有する２種類の血栓性微小血管症である。これ
らの疾患状態において、内皮の損傷は感染性生物（例えば、大腸菌１５７：Ｈ７
および赤痢菌）からのベロ毒素によるか、薬物（例えば、ＦＫ５０６およびチク
ロビジン）によるか、または自己抗体による。内皮の損傷は、異常に大きいフォ
ンウィルブランド因子マルチマーの放出をもたらし、これは次に血小板凝集とな
る。フィブリン血栓は身体のフィブリン溶解システムの低下の結果として、血小
板血栓上に蓄積する。

【００４６】 ＨＵＳおよびＴＴＰにおいて、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質（ＰＡＩ
−１）のレベルの上昇およびプロテインＣの活性レベルの低下が見出された。血
栓性微小血管症の臨床上の発見は、微小血管性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）、急性腎
不全、血小板減少を含み、ＴＴＰの場合では、急性の神経の変化を含む。

【００４７】 本試験の第１の目的は、ｒ−ａＰＣの注入により、プラシーボの場合と比較し
て、病気の寛解時間における統計学上の有意な減少を示すことである。第２の目
的は、ｒ−ａＰＣの注入により、腎不全を有する日数、必要な輸血回数および痙
攣発現の回数の統計学上の有意な減少を示すことである。この試験の主要な安全
性の目的は、ｒ−ａＰＣはプラシーボの場合と比較して臨床的に重要な出血事象
の回数が統計学上で有意に増加しないことを示すことである。

【００４８】 試験へのエントリーを考慮する患者についての包含基準は、血栓性微小血管症
の証拠であり、このことは１）血小板の数が＜８０×１０^９細胞／Ｌであると定
義される血小板減少の存在；２）末梢赤血球標本の視野毎に＞２の分裂赤血球を
有し、直接的および間接的なクームス試験が陰性であり、そしてＨｇｂが＜１０
ｇ／ｄｌであると定義される微小血管性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）の存在；３）患
者のベースラインの血清中クレアチニンが２倍であると定義される急性腎不全ま
たは尿の排泄量が＜０.５ｍＬ／ｋｇ／時間であると定義される乏尿の存在；４
）正常な凝固時間（ＰＴ、ＰＴＴおよびフィブリノーゲン）の存在によって定義
される。患者に抗凝固薬および治験薬を与えている場合、その患者は該試験から
除く。呼吸器官または胃腸器官からの活発な出血を有する患者は、該研究から除
いた。

【００４９】 すべての包含基準を満たし、且つ排除基準を有しない患者を無作為化し、プラ
シーボを与えるか、または４８μｇ／ｋｇ／時間までの用量（これは、以前にａ
ＰＴＴがベースラインの２倍まで上昇を示した）のｒ−ａＰＣの注入を９６時間
与えた。Ｈｇｂ数、血小板数、血清中クレアチニン、２４時間の尿の排泄量、痙
攣発現の回数およびパックした赤血球の輸血した回数のデータを試験中に集めた
。分析の主要な終点、すなわち病気の寛解の時間は、血小板の輸血を行わない状
態で２日間、＞１００×１０^９細胞数／Ｌの持続的な血小板の計数によって決め
た。

【００５０】 従って、抗凝固性およびプロフィブリン溶解活性、並びにＰＡＩ−１を失活さ
せる能力を有するｒ−ａＰＣを用いた療法は、ＴＴＰおよびＨＵＳを有する患者
において生じる血栓性微小血管症の処置に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サウ−チ・ベティ・ヤン アメリカ合衆国46240インディアナ州イン ディアナポリス、メンロ・コート・イース ト・ドライブ8131番 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 BA44 DC03 NA14 ZA541 ZA811 ZC192

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症性症候群の処
   置法であって、該患者に医薬的に有効な量のプロテインＣを投与することを含む
   方法。
2. 【請求項２】 プロテインＣはヒトプロテインＣチモーゲンである、請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 プロテインＣはヒト活性化プロテインＣである、請求項１に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 ヒト活性化プロテインＣの量は、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約
   ９６μｇ／ｋｇ／時間である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 ヒト活性化プロテインＣは、連続注入によって約１〜約２４
   ０時間投与する、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 処置の必要な患者における血栓性血小板減少性紫斑病および
   溶血性尿毒症性症候群の処置法であって、該患者に医薬的に有効な量の活性化プ
   ロテインＣを投与し、その結果、活性化プロテインＣの血中レベルが約２ｎｇ／
   ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌに達する方法。
7. 【請求項７】 活性化プロテインＣをボーラス注入で投与する、請求項６に
   記載の方法。
8. 【請求項８】 活性化プロテインＣを、連続注入によって約１〜約２４０時
   間投与する、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 活性化プロテインＣを先ずボーラス注入として投与し、次い
   で連続注入として投与する、請求項６に記載の方法。
10. 【請求項１０】 活性化プロテインＣの血中レベルが約２ｎｇ／ｍｌ〜約３
    ００ｎｇ／ｍｌの範囲に達するのに必要な活性化プロテインＣの１／３をボーラ
    ス注入で投与し、続いて該活性化プロテインＣの残り２／３を連続注入によって
    投与する、請求項９に記載の方法。