CN111035754A - 抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)的药物中的应用。本发明抗血小板溶栓素限制了血小板的黏附和聚集，恢复血小板、红细胞和血红蛋白水平，同时降低乳酸脱氢酶水平，有效的抑制了血小板减少症和裂细胞性溶血性贫血，从而达到治疗TTP的目的，具有良好的临床应用前景。

Description

抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物 中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)的药物中的应用。

背景技术

血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)是一种严重的弥散性血栓性微血管病，以微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少，以及微血栓形成造成器官损害(如肾脏、中枢神经系统等)为特征。其发病机制与一种vWF蛋白裂解酶(血管性血友病因子裂解酶，ADAMTS13)密切相关。该酶的作用在于特异性地裂解血液中的血管性血友病因子(vWF)，以保证人体正常的止血作用。在TTP的病程中，由于此酶的活性降低，vWF在血管内皮细胞上大量聚集，成为多个超大的多聚体，该多聚体又可与血流中血小板表面的GPIb受体结合，介导血小板在内皮细胞上的黏附及聚集，最终导致血栓形成及进一步的TTP发生。

根据病因可将TTP分为遗传性TTP和获得性TTP，两者发病机理的差异在于引起ADAMTS13酶活性降低的起因不同：遗传性的患者是由于这种酶先天性表达不足，是基因缺陷引起的；而在获得性的患者中，造成酶活性降低的原因在于患者体内可产生一种针对ADAMTS13的自身抗体，这种抗体造成了酶的灭活。

对于以上病因，目前最有效的治疗TTP方法为新鲜血浆输注和血浆置换,但其缺陷在于依赖客观条件，并且对获得性TTP患者具有很高的复发率和死亡率。对于获得性TTP患者，可用免疫抑制药物或丙球等抑制抗ADAMTS13自身抗体的产生，但这类治疗起效较慢，效果因患者而异、并不确切。而补充ADAMTS13蛋白的方法只对于先天性TTP患者有效，因为对于获得性TTP患者而言，补充的ADAMTS13蛋白会很快被自身抗体所抑制。TTP患者中有70％-80％属于获得性，因此这种方法的临床应用非常局限。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用，本发明发现，抗血小板溶栓素在TTP患者血液中能够恢复血小板、红细胞和血红蛋白水平，同时降低乳酸脱氢酶水平，有效的抑制了血小板减少症和裂细胞性溶血性贫血，起到抑制血小板聚集的作用，从而达到预防血栓形成，改善TTP症状的目的。

本发明所述抗血小板溶栓素(Antiplatelet thrombolysin，APT)是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离出来的一种蛋白水解酶，由α链、β链两条肽链组成，α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其在专利201310228219.2中公开。

作为优选，血栓性血小板减少性紫癜为先天性或获得性血栓性血小板减少性紫癜。

作为优选，本发明提供的治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物为化学药物或生物制剂。

作为优选，治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物，包括抗血小板溶栓素与药学上可接受的辅料。

优选的，本发明提供的治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物为口服制剂或注射剂。

更优选的，治疗血栓性血小板减少性紫癜的口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、微囊剂或微丸剂。

更优选的，治疗血栓性血小板减少性紫癜的口服制剂或注射剂中抗血小板溶栓素的质量-体积浓度为1.8-10μg/mL。

更优选的，治疗血栓性血小板减少性紫癜的口服制剂或注射剂中抗血小板溶栓素的剂量为0.03-3mg/kg。

本发明还提供了一种血浆ADAMTS13活性的检测方法，包含以下步骤：

步骤一、待测血浆按1:25浓度与荧光缓冲液混匀，同时将正常人血浆作为标准品，按1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200、1:400与上述缓冲液进行稀释；所述荧光缓冲液为5mmol/L Bis-Tris,25mmoI/L CaCl2,0.005％Tween 20,pH 6.0；

步骤二、将所述不同浓度的正常人血浆及待测标本同时分别加入荧光标记底物FRETS-VWF73，充分反应后放入酶标仪进行检测，将各孔各时间点数据进行曲线拟合，得到样本反应曲线方程；

步骤三、将待测样本的数据代入所述曲线方程，以1:25浓度正常人血浆的ADAMTS13活性作为100％，与之相比即得到待测血浆ADAMTS13活性。

在本发明的具体实施方式中，本发明还提供血栓性血小板减少性紫癜动物模型的建模方法，每隔48小时对动物进行抗ADAMTS13抗体的注射，检测到ADAMTS13酶活性的显著降低，并同时引起ADAMTS13抗原浓度的降低，且出现血小板计数和结合珠蛋白计数减少，并伴有裂红细胞计数和乳酸脱氢酶水平升高，证明建模成功。

作为优选，所述动物为狒狒。

本发明提供了一种抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用。抗血小板溶栓素可以预防并治疗获得性TTP狒狒模型中的主要病症，恢复血小板、红细胞和血红蛋白水平，同时降低乳酸脱氢酶水平，有效的抑制了血小板减少症和裂细胞性溶血性贫血，从而达到治疗TTP的目的。可见，本发明提供的抗血小板溶栓素的用途，与现有技术中公布的用途不相同，其作用机理也优于现有的治疗TTP的手段，且可以补充它们的不足。实验显示，经抗血小板溶栓素处理后，TTP患者的富含血小板血浆(PRP)样本中的血小板聚集抑制率较空白对照组有了显著提高，表明抗血小板溶栓素对TTP患者有着明显的抑制血小板聚集，防止血栓形成和血小板减少的作用，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1示不同浓度抗血小板溶栓素对正常人血浆Ristocetin诱导血小板聚集抑制效果：绿色曲线表示空白对照组的血小板聚集情况与时间曲线；紫色曲线表示加入1.5μg/mL抗血小板溶栓素后的血小板聚集情况与时间曲线；蓝色曲线表示加入1.8μg/mL抗血小板溶栓素后的血小板聚集情况与时间曲线；黑色曲线表示加入2.1μg/mL抗血小板溶栓素后的血小板聚集情况与时间曲线。

图2示抗血小板溶栓素对正常人和TTP患者血浆ADAMTS13活性的影响；

图3示抗ADAMTS13抗体3H9在不同组别中对ADAMTS13抗原浓度及活性的影响，用以部分反应获得性TTP模型的建立情况：图3A表示注射3H9后，对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中ADAMTS13酶活性随时间的变化曲线；图3B表示注射3H9后，对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中ADAMTS13抗原浓度随时间的变化曲线。

图4示抗血小板溶栓素对血小板减少症和裂细胞性溶血性贫血的各项指标的预防和治疗效果：图4A表示对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中血小板计数随时间的变化曲线；图4B表示对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中结合珠蛋白浓度随时间的变化曲线；图4C表示对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中裂红细胞计数随时间的变化曲线；图4D表示对照组(图例为实心圆形)、预防组(图例为空心方块)及治疗组(图例为实心三角)中乳酸脱氢酶水平随时间的变化曲线。

具体实施方式

本发明提供了抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1抗血小板溶栓素在体外对正常人及TTP患者瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的抑制效果

1.样本采集

正常人血样3例采自健康献血员。TTP患者3例采自急诊TTP患者，3例患者均有临床上典型的“TTP三联征”，实验室检测其ADAMTS13活性均低于10％。上述样本均取外周静脉血，枸橼酸钠抗凝。

2.实验方法

(1)血小板聚集抑制试验(光学比浊法)：

取3.2％枸橼酸钠抗凝全血，800rpm离心10min，制备富血小板血浆(PRP)，其余血液以3000rpm，离心10min制备贫血小板血浆(PPP)。将PRP血小板浓度以PPP调整为300×10⁹/L左右，以PPP调零，观察PRP中加入终浓度10μmol/L的Ristocetin后，5min内透光度的变化，以最大透光度，作为该PRP的最大聚集率(PAGm)。

(2)血浆ADAMTS13活性检测试验(化学荧光FRET法)

待测血浆按1:25浓度与荧光缓冲液(5mmol/L Bis-Tris,25mmoI/L CaCl2,0.005％Tween 20,pH 6.0)混匀，同时将正常人混合血浆作为标准品。按1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200、1:400与上述缓冲液进行稀释，作为标准曲线。将上述不同浓度的正常人混合血浆及待测标本一同加入96孔半量白板，每孔50μl，再将一定浓度(2μmol/L)的荧光标记底物FRETS-VWF73每孔50ul,加入上述96孔白板与待测血楽进行酶切反应。反应5分钟后放入酶标仪进行检测，设置反应温度为4度，荧光激发/发射波长为485/530nm，频率为每2分读数一次，60分钟终止读数，整个操作过程不超过2小时。将各孔各时间点数据进行曲线拟合，得到样本反应曲线方程，将待测样本的斜率分别代入以上对数直线回归方程，以1:25浓度正常混合血浆的ADAMTS13活性作为100％,与之相比即可得到待测样本ADAMTS13活性(％)。

3.实验结果

(1)血小板聚集抑制试验：

抗血小板溶栓素对正常人血浆Ristocetin诱导的血小板聚集抑制终浓度1.8μg/mL即可达抑制率93％，由聚集曲线及量效关系的特征来看，抗血小板溶栓素主要抑制血小板聚集的“第一相”，即通过对“outside-in”信号途径的阻断从而抑制了血小板的活化以及进一步的聚集反应，其抑制聚集的效果十分有效(图1)。

抗血小板溶栓素对TTP患者血浆Ristocetin诱导的血小板聚集抑制由三例TTP样本检测结果来看，1.8μg/mL浓度的抗血小板溶栓素对TTP患者血小板聚集的抑制同样有效(表1)，表1示抗血小板溶栓素(1.8μg/mL)对不同人群血小板聚集的抑制效果。

(2)血浆ADAMTS13活性检测试验

两种不同浓度的抗血小板溶栓素(5μg/mL、1.8μg/mL)对正常人或TTP患者血浆中的ADAMTS13活性均无明显影响(图2)。

4.结论

(1)抗血小板溶栓素对正常人或TTP患者血浆Ristocetin诱导的血小板聚集均有明显抑制作用，该批次(20130603)产品1.8ug/mL(终浓度)即可达到最大抑制率90％以上，对TTP患者血小板聚集的抑制与正常人无差异。

(2)正常治疗浓度的抗血小板溶栓素对正常人血浆中的ADAMTS13活性无明显影响，说明其不会对正常的ADAMTS13裂解vWF行为产生抑制。

实施例2抗血小板溶栓素用于获得性TTP狒狒模型的有效性实验

1.实验设计和方法

试验分三组，每组4只动物。第一组为阳性对照，从试验第0天开始，每48小时由股静脉注射剂量为为600μg/kg的抗ADAMTS13抗体3H9，直至试验第9天结束，用以建立TTP模型。第2组为预防组，在第1天和第3天注射相同剂量的3H9，并在第1天与第5天皮下注射0.3mg/kg的抗血小板溶栓素，用以观察其预防TTP的作用。而第3组为治疗组，从试验第0天开始，每48小时由股静脉注射剂量为为600μg/kg的抗ADAMTS13抗体3H9，直至试验第9天结束，用以建立TTP模型。其中，在第5到第11天，每天由皮下注射0.3mg/kg的抗血小板溶栓素，用以观察其治疗TTP的作用。

每天抽取血样并进行血液学参数的测量，其包括：全血细胞计数，乳酸脱氢酶水平，结合珠蛋白水平，裂红细胞计数等，而ADAMTS13抗原浓度及活性参数用专用的ELISA试验测定。

2.实验结果

(1)TTP模型的建立：

每隔48小时的抗ADAMTS13抗体3H9的注射导致了ADAMTS13酶活性的显著降低，并同时引起ADAMTS13抗原浓度的降低(图3)。这直接导致了动物体内出现血小板减少和溶血性贫血，表现为血小板计数和结合珠蛋白计数减少，并伴有裂红细胞计数和乳酸脱氢酶水平升高(图4)。这些都是TTP的典型症状，也是该模型建立成功的指标。

(2)预防组中溶栓素的有效性：

相对于对照组，预防组中，抗血小板溶栓素防止了血小板计数的减少，抑制了裂红细胞症，溶血性贫血和乳酸脱氢酶水平异常等症状的出现。该组动物也没有出现红细胞计数和血红蛋白浓度的减少(图4)。

(3)治疗组中溶栓素的有效性：

治疗组中，在试验第5天，动物出现了TTP症状，各项指标与对照组一致，提示模型建立良好。第5天开始注射抗血小板溶栓素后，血小板计数有了明显增加，并在第9天恢复初始水平，而在第11天升高至比初始水平的180％。裂细胞性溶血性贫血在第5天后得到了有效的治疗，裂红细胞计数也显著降低，而结合珠蛋白浓度则从第10天开始趋于正常化(图4)。

3.结论

实验证实，抗血小板溶栓素可以预防并治疗获得性TTP狒狒模型中的主要病症，恢复血小板、红细胞和血红蛋白水平，同时降低乳酸脱氢酶水平，有效的抑制了血小板减少症和裂细胞性溶血性贫血，从而达到治疗TTP的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 兆科药业（合肥）有限公司

<120> 抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> Artifical

<400> 1

Asp Val Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gln Ser Cys Tyr

1 5 10 15

Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

20 25 30

Thr Glu Arg Pro Lys Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Ala Gly

35 40 45

Glu Arg Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Ser Glu Asn Lys Gln Thr Asp

50 55 60

Asn Val Trp Leu Gly Leu Lys Ile Gln Ser Lys Gly Gln Gln Cys Ser

65 70 75 80

Thr Glu Trp Thr Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn Phe Ser Glu

85 90 95

Tyr Gln Ser Lys Lys Cys Phe Val Glu Lys Asn Thr Gly Phe Arg Thr

100 105 110

Trp Leu Asn Leu Asn Cys Gly Ser Glu Tyr Ala Phe Val Cys Lys Ser

115 120 125

Pro Pro

130

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> Artifical

<400> 2

Gly Phe Cys Cys Pro Leu Arg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys

20 25 30

Thr Glu Gln Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg Glu

35 40 45

Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro Ile Leu Asp Leu Ser

50 55 60

Leu Ile Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg Glu

65 70 75 80

Trp Ser Asp Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Ala Trp Ala Lys Thr Ser

85 90 95

Asp Cys Leu Ile Gly Lys Thr Asp Asp Asn Gln Trp Leu Asn Met Asp

100 105 110

Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu

115 120 125

Claims (10)

1.一种抗血小板溶栓素在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜的药物中的应用，所述抗血小板溶栓素由α链、β链两条肽链组成，其中，α链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓性血小板减少性紫癜为先天性或获得性血栓性血小板减少性紫癜。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为化学药物或生物制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括抗血小板溶栓素与药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、微囊剂或微丸剂。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂或注射剂中抗血小板溶栓素的质量-体积浓度为1.8-10μg/mL。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂或注射剂中抗血小板溶栓素的剂量为0.03-3mg/kg。

9.一种血浆ADAMTS13活性的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤一、将待测血浆按1:25体积比与荧光缓冲液混匀，同时将正常人血浆作为标准品，按体积比1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200、1:400与上述缓冲液进行稀释；所述荧光缓冲液为5mmol/L Bis-Tris,25mmoI/L CaCl2,0.005％Tween 20,pH 6.0；

步骤二、将所述不同浓度的正常人血浆及待测标本同时分别加入荧光标记底物FRETS-VWF73，充分反应后放入酶标仪进行检测，将各孔各时间点数据进行曲线拟合，得到样本反应曲线方程；

步骤三、将待测样本的数据代入所述曲线方程，以1:25浓度正常人血浆的ADAMTS13活性作为100％，与之相比即得到待测血浆ADAMTS13活性。

10.血栓性血小板减少性紫癜动物模型的建模方法，其特征在于，每隔48小时对动物进行抗ADAMTS13抗体的注射，作为优选，所述动物为狒狒。

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