JP2012529445A - 線溶亢進を伴う凝固障害の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低減されたトロンビンに対する結合親和性、および/またはkD値が0.2nMより大きいトロンビンに対する結合親和性;
(ii)TM類似体TMEM388Lの補因子活性と比べて低下した補因子活性、あるいは
(iii)TM類似体TMEM388Lと比べて増大した補因子活性に対するTAFI活性化活性の比率
の1つ以上を有する。
以下の特性:
(i) 酸化抵抗性を示す
(ii) プロテアーゼ抵抗性を示す
(iii) 均一なN−末端またはC−末端を有する
(iv) 例えば、天然トロンボモジュリン(配列番号1)のグリコシル化部位の少なくとも一部のグリコシル化によって翻訳後修飾されている
(v) 線形の二重逆数トロンビン結合特性を有する
(vi) デタージェントの量が比較的少ない水溶液中で可溶性であり、典型的には膜貫通配列がない
(vii) グリコサミノグリカン鎖がない
の1つ以上を有するものである。
aa) 349Asp;
bb) 355Asn;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
af) 363Leu;
ai) 368Tyr;
aj) 371Val;
ak) 374Glu;
al) 376Phe;
am) 384His;
an) 385Arg;
ba) 387Gln;
bb) 389Phe;
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bf) 403Thr;
bg) 408Glu;
bh) 411Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
bn) 420Ile;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
ce) 428Glu;
cf) 429Asp;
cg) 432Phe;
ch) 434Ser;
ci) 436Val;
cj) 438His;
ck) 439Asp;
cl) 440Leu;
cm) 443Thr;
cn) 444Phe;
co) 445Glu;
cp) 456Arg;
cq) 458Ile;または
cr) 461Asp
を有する。
aa) 349Asp;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
aj) 371Val;
ak) 374Glu;
al) 376Phe;
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
bo) 423Asp;
bp) 424Ile;
bq) 425Asp;
cd) 426Glu;
ce) 429Asp;
ck) 439Asp;
cn) 444Phe;または
cr) 461Asp
を有する。
aa) 349Asp;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
aj) 371Val;または
al) 376Phe
を有する。
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bf) 403Thr;
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
cf) 429Asp;
ck) 439Asp;
cn) 444Phe;または
cr) 461Asp
を有する。
aa) 349Asp;
bb) 355Asn;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
af) 363Leu;
ai) 368Tyr;
aj) 371Val;
ak) 374Glu;
al) 376Phe;
am) 384His;または
an) 385Arg
である。
aa) 349Asp;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
aj) 371Val;または
al) 376Phe
である。
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bf) 403Thr;
bg) 408Glu;
bh) 411Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;または
bn) 420Ile
により、補因子活性が少なくとも50%の低下した類似体がもたらされた。
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;または
bm) 417Asp
に従ってさらに小群に分けられ得る。
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
ce) 428Glu;
cf) 429Asp;
cg) 432Phe;
ch) 434Ser;
ci) 436Val;
cj) 438His;
ck) 439Asp;
cl) 440Leu;
cm) 443Thr;
cn) 444Phe;
co) 445Glu;
cp) 456Arg;
cq) 458Ile;または
cr) 461Asp
である。
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
cf) 429Asp;
ck) 439Asp;
cn) 444Phe;または
cr) 461Asp
である。
aa) 349Asp;
bb) 355Asn;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;または
ae) 359Gln
に対応する。
af) 363Leu;
aj) 371Val;
ak) 374Glu;
al) 376Phe;
am) 384His;
an) 385Arg;
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;または
be) 402Asn
に対応する。
bg) 408Glu;
bh) 411Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
bn) 420Ile;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
ce) 428Glu;
cf) 429Asp;
cg) 432Phe;
ch) 434Ser;
ci) 436Val;
cj) 438His;
ck) 439Asp;
cl) 440Leu;
cm) 443Thr;
cn) 444Phe;
co) 445Glu;
cp) 456Arg;
cq) 458Ile;または
cr) 461Asp
に対応する。
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
cf) 429Asp;
ck) 439Asp;
cn) 444Phe;または
cr) 461Asp。
a) 位置(配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸位置):
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
bn) 420Ile;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
ce) 428Glu;
cf) 429Asp;
cg) 432Phe;
ch) 434Ser;
ci) 436Val;
cj) 438His;
ck) 439Asp;
cl) 440Leu;
cm) 443Thr;
cn) 444Phe;
co) 445Glu;
cp) 456Arg;
cq) 458Ile;
cr) 461Asp;
にアミノ酸置換を作製する工程、および
b) トロンビンに対するKDを対照分子と比較する工程
を含む方法を記載する。
bg) 408Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
ca) 423Asp;
cb) 424Ile;
cc) 425Asp;
cd) 426Glu;
cf) 429Asp;
ck) 439Asp;
cn) 444Phe;または
cr) 461Asp
である。
a) 位置(配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸位置):
aa) 349Asp;
bb) 355Asn;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
にアミノ酸置換を作製する工程、および
b) トロンビンへの結合に関する補因子活性の割合を対照分子の割合と比較する工程
を含む方法を記載する。
本発明との関連において用いる場合、用語「抗フィブリン溶解効果」は、トロンボモジュリン類似体が、該トロンボモジュリン類似体の添加なしでの同一アッセイ条件と比べてクロット溶解時間(実施例Iに記載)を延長する能力をいうものとする。この抗フィブリン溶解効果は、TM類似体の抗フィブリン溶解活性が、そのフィブリン溶解促進活性と比べて優勢なためである。
ヒト血漿でのクロット溶解アッセイ
インビトロクロット溶解モデルを使用し、可溶性トロンボモジュリン(Solulin)が正常血漿と第VIII因子欠損血漿の混合物において、クロット溶解時間を減少または増大させる能力を試験した。
この血漿組成物中で、トロンビン(第IIa因子)、塩化カルシウムおよびホスファチジルコリン/ホスファチジルセリン(PCPS)小胞を混合することにより、インビトロで凝固を起こした。凝固およびフィブリン溶解の時間的推移を濁度アッセイにより調べ、「TAFIa産生能」を、機能アッセイを用いて調べた。
材料.トロンビンおよびフィブリノゲンは、1点を除き(フィブリノゲンの調製では、β−アラニン沈殿処理後、水中40%(w/v)PEG−8000を添加することによって、溶液を2%PEG−8000ではなく1.2%PEG−8000にしたこと)、Walkerら(J.Biol.Chem.1999;274:5201−5212)に記載のようにして調製した。このプロトコルの変更によって、より多くのフィブリノゲンを得ることが可能になった。TAFIaアッセイで使用したQSY−FDP(クエンチャーであるQSY9 C5−マレイミドに共有結合させたフィブリン分解生成物)およびTAFIa標準品は、既報のとおりに調製し(Kimら,2008;Anal.Biochem 372:32−40;Neillら,2004;Anal.Biochem.330:332−341)、組換えヒトPg(S741C)およびフルオレセイン誘導体(5IAF−Pg)は、Horrevoetsら(J.Biol.Chem 1997;272:2176−2182)に記載のとおりに調製した。S525C−プロトロンビンを、Brufattoら(J.Biol.Chem.2001;276:17663−17671)に既報のようにして精製し、5−ヨードアミドフルオレセイン(5IAF)で蛍光標識した。QSY9 C5−マレイミドおよび5−ヨードアミドフルオレセインは、Invitrogen Canada Inc.(バーリントン,ON,カナダ)から購入した。プラスミンはHaematologic Technologies Inc.(Essex Junction,VT,USA)から購入し、組換えヒト可溶性トロンボモジュリン(Solulin;sTM)は、Paion Deutschland GmbH(アーヘン,ドイツ)から提供された。正常ヒトプール血漿(NP)は、カナダのオンタリオ州キングストンのキングストン総合病院(KGH)の血液バンクの健常ドナーから取得し、FVIII欠損血漿(FVIII−DP)は、Affinity Biologicals,Inc.(ハミルトン,ON,カナダ)から購入した。TAFI欠損血漿(TDP)は、固定化した抗ヒトTAFIモノクローナル抗体のカラムでの正常血漿のアフィニティクロマトグラフィーによって、Schneiderら,(J.Biol.Chem.2002;277:1021−1030)に記載のとおりに調製した。プラスミン阻害剤D−Val−Phe−Lysクロロメチルケトン(VFKck)、トロンビン阻害剤D−Phe−Pro−Argクロロメチルケトン(PPAck)およびイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤(PTCI)は、Calbiochem(サンディエゴ,CA,USA)から購入した。組織型プラスミノゲン活性化因子(Activase;tPA)は、KGH(キングストン,ON,カナダ)の薬局から購入し、他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
TAFI活性化の程度を調べるためのクロット溶解アッセイおよび試料の調製
FVIII−DPをNPと、NPの最終割合が0、1、6、10、50または100%(0〜100%NP)となるように混合した。混合前に、各血漿を光学密度が32になるまで希釈し、1.5nM tPA、40μM PCPSおよび20mM CaCl2を含有する等容量の溶液に、20nMのトロンビンの存在下または非存在下で添加し(終濃度:0.75nM tPA,20μM PCPS,10mM CaCl2、±10nMトロンビン)、試料を複数のエッペンドルフチューブに分け、37℃の水浴中に入れた。これらのチューブにおいて、種々の時点で、トロンビンとプラスミンをそれぞれ選択的に阻害するための、10μM PPAckおよび10μM VFKckを添加することによって凝固および溶解を停止させた。試料を激しく混合し、次いで、16000gで30秒間遠心分離し(室温)、TAFIaの熱不活化を防ぐために直ちに氷上に置いた。各試料の上清をTAFI欠損血漿で5倍ずつ連続希釈し、Kimら(Anal.Biochem 2008;372:32−40)により記載された機能アッセイを用いてTAFIaを測定した。同一の実験を、覆いをした96ウェルプレートで行ない、SpectraMax Plus分光測光器(Molecular Devices,サニーベール,CA,USA)を用いて経時的に400nmで濁度をモニタリングし、凝固およびフィブリン溶解のタイミングを調べた。4つのtPA濃度(0.25、0.75、1.5および3nM)において可溶性トロンボモジュリン(0〜100nM)の存在下または非存在下で同様の実験を行ない、TAFI活性化と溶解時間に対するsTMの効果を調べた。また、これらの実験を、5μMのPTCIの存在下でも行なうと、正常血漿およびFVIII欠損血漿においてTAFIa依存性溶解延長が示された。
正常血漿およびFVIII欠損血漿(0〜100%NP)に、プロトロンビン誘導体(5IAF−II;300nM最終)ならびに20μM PCPSおよび10mM CaCl2を、10nMトロンビンの存在下で補給して凝固を開始させた。この実験は、不透明なプラスチックカバー付きの96ウェルプレート内で行なった。SpectraMax GeminiXS(Molecular Devices,サニーベール,CA,USA)を使用し、経時的に37℃にて、それぞれ495nmおよび535nmの励起波長および発光波長で、530nm発光カットオフフィルターを用いて蛍光強度をモニタリングした。蛍光のベースラインと完全なプロトロンビン活性化と相関する最大蛍光を反映させるために蛍光を標準化した(0〜1)。
TAFIaプロット下面積を、実験過程にわたるTAFIaの効果を定量するためのパラメータとして選択した。このパラメータを、Hemkerら(Thromb.Haemost.1993;85:5−11)によって定義された「トロンビン産生能」と同様に「TAFIa産生能」と命名した。TAFIa産生能は、トロンビン産生能と同様、切断された基質の量に比例し、数学的には以下のとおりに説明される:
クロット溶解時間は、正常血漿をFVIII欠損血漿に添加することによって増大する
10nMの第IIa因子、10mM CaCl2および20μM PCPSの小胞を用いて凝固を開始し、クロット構造物がFVIII濃度に対して非感受性であるモデルを作出した。FVIII濃度に関係なくクロット構造物が類似しているため、tPA依存性(0.75nM)のクロット溶解に対するFVIIIの効果を調べることができる。この溶解モデルを使用すると、正常血漿の割合が増加するにつれて溶解時間が増大した。図1は、正常血漿を0〜100%で添加したFVIII−DPのクロット溶解プロフィールを示し、溶解時間を図1にまとめている(差し込み図)。FVIII−DPでは、溶解時間は37分であり、正常血漿の添加によっておよそ50%増大され得る。
10%正常血漿で、FVIII−DPと関連している溶解時間の短縮は、正常血漿で観察される時間まで修正された(図1,差し込み図参照)。
TAFI活性化を正常血漿、FVIII欠損血漿および混合血漿において測定し、活性化の時間的推移に対するFVIIIの効果を定量した。機能アッセイを使用し、凝固および溶解の時間的推移にわたるTAFIaを測定し、その結果を図2に示している。トロンビン、カルシウムイオンおよびPCPSを用いてFVIII−DP中で凝固を開始した場合、5分後、およそ30pMのTAFIaが測定された。正常血漿の割合が増加するにつれて、TAFIaのピーク濃度も増大した。FVIII−DPに10%正常血漿を補給することによって溶解時間は修正されたが、これは、TAFI活性化を完全に修正するには充分ではなかった。TAFIa時間推移プロット下面積(図2A)を計算することにより、最初の50分間では、正常血漿中と50%正常血漿中で、ほぼ同じTAFIa産生能(図2B)が得られる(それぞれ、16800pM分および14100pM分)が、10%正常血漿と混合したFVIII−DP血漿が有したTAFIa産生能は、正常血漿におけるTAFIa産生能のわずか50%であることが測定された。
0〜100%のFVIIIの範囲にわたる溶解時間とTAFI活性化間の関係を定量するため、log溶解時間に対してlog TAFIa産生能をプロットした(図2B,差し込み図)。予測どおり、データは、0〜100%のFVIIIを含有する血漿中において溶解時間とTAFIa産生能間の強い正の相関を示す。トロンビンはTAFIの活性化因子であるため、図2AのTAFI活性化プロフィールは、血漿中でのプロトロンビン活性化を解析することにより合理的に説明され得る(図3)。一般的な傾向は、正常血漿の割合が増加するにつれて、プロトロンビンの活性化速度も増大する(これは、図3の曲線の傾きを調べることによって決定され得る)というものである。正常血漿では例外が生じる。正常血漿では、プロトロンビンの活性化速度は、50%正常血漿と混合したFVIII−DPよりも低い。この速度は正常血漿中では遅いが、プロトロンビン活性化は、50%正常血漿と混合したFVIII−DP中よりも約2倍長く持続する。どの実験でも、プロトロンビン活性化のタイミングは、TAFI活性化に充分対応している。また、正常血漿を、トロンビンを添加せずにカルシウムイオンとPCPSを用いて凝固させた。カルシウム誘導性の凝固はすぐには起こらない;正常血漿中でクロットが形成されるのにおよそ15分かかる。この時点で、プロトロンビン活性化は伝播期に入り、その結果、TAFIが活性化される。クロットの形成に関するTAFI活性化の程度とタイミングは、凝固が添加トロンビンの存在下で開始しようと非存在下で開始しようと同じであり、これは、TAFI活性化が、インサイチュで生成されたトロンビンの結果であって、凝固を誘導するために添加されたトロンビンの結果ではないことを示唆する。トロンビンの存在下では、TAFIa産生能が16,800pM分であったのに対して、トロンビンの非存在下では14,150pM分であった。
正常血漿では、ピークTAFIaレベルおよびTAFIa産生能は、それぞれ、sTMの非存在下での600pMおよび16800pM分から、それぞれ、10nMのsTMの存在下で、およそ6000pMおよび150,000pM分に増大した。このTAFI活性化の増大により、溶解時間の70%の増大がもたらされた。FVIII−DP中での溶解の相対的延長に対する10nMのsTMの効果は、FVIII−DPをsTMの存在下で凝固および溶解させると溶解が65%延長したという点で、正常血漿と類似していた。10nMのsTMの存在下では、ピークTAFIa濃度で750pMのTAFIaが存在したのに対して、sTMの非存在下では30pMであった。クロットの開始からクロット溶解時間までの時間中、TAFIa産生能は、10nMのsTMの存在下で12800pM分であると測定されたのに対して、sTMの非存在下では600pM分であった。
溶解時間に対するTAFI活性化の効果をtPA濃度およびsTM濃度の範囲にわたって解析し、FVIII−DPにおける溶解の欠陥がTAFI活性化の刺激によって修正され得るかどうかを調べた。図4にまとめた溶解時間は、TAFIaの阻害剤であるPTCIを含めた同様の実験での溶解時間との対比である。PTCIの存在下では、機能性TAFIaは存在せず、そのため図4に示した相対溶解時間は、TAFIa依存性溶解延長に典型的なものである。最も低いtPA濃度(0.25nM)では、1nMのsTMを正常血漿に添加した場合、最大のTAFIa依存性溶解延長(2倍)が観察された。FVIII−DPにsTMを補給すると、溶解時間の用量依存性の延長が引き起こされた(図4)。100nMのsTMをFVIII−DPに添加した場合、溶解時間は、正常血漿でみられる時間まで完全に修正された。tPA濃度を増大させるにつれて、最大のTAFIa依存性溶解延長を得るために、より高濃度のsTMが必要とされた。例えば、1.5nMのtPA(図4)を存在させた場合、TAFIa依存性溶解延長を最大にするために、正常血漿中では25nMのsTMが必要とされ、FVIII−DP中では100nMのsTMが必要とされる。また、このクロット溶解実験でtPAが増加するにつれて、TAFIaは、溶解時間に対してずっと大きな効果を有するようである(1.5nM tPAでは5.2倍までに対して0.25nM tPAでは2.3倍)。tPA濃度が増加するにつれて、任意のTAFIa依存性溶解延長を得るために必要とされるsTMの濃度も増大するようである。0.25nM tPAでは、正常血漿において溶解延長を得るためにsTMは必要とされなかったが、3nMのtPA(図4)を正常血漿に添加すると、溶解延長を得るために25nMのsTMが必要とされた。実際の溶解時間がtPAおよびsTMによってどのように影響されるのかを示すため、TAFIa阻害正常血漿およびFVIII欠損血漿での溶解時間を表1に示す。
正常血漿では、sTMの非存在下(○;600pMのTAFIa;図5A参照)と比べて、10nMのsTMの存在下で(●;ピークレベルで6000pMのTAFIa)、TAFI活性化が有意に増大していることが示されている。sTMを伴うクロット溶解プロフィールは、10nMのsTMの添加により、溶解時間の70%の増大がもたらされたことを示す。10nMのsTMを補給したFVIII−DPでは、TAFIaは、sTMの非存在下で30pMであるのに比べて、ピークでは750pMであると測定された(図5B参照)。TAFI活性化の増大により、sTMなしのFVIII−DPと比べて溶解の60%延長がもたらされた。
トロンビンとトロンボモジュリンの結合親和性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、KD値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合について測定した。
トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合の親和性は、蛍光速度論アッセイを用いて測定し、KD値で表示した。
材料
ヒトトロンビンは血漿から、Bajzarら(J.Biol.Chem.1995;270:14477−14484)に記載のようにして単離した。組換え可溶性トロンボモジュリン(Solulin)は、PAION Deutschland GmbH(アーヘン,ドイツ)から取得した。他の試薬はすべて、Sigma社から分析用品質で取得した。
トロンボモジュリンおよびTAFIに対するトロンビンの結合の測定
トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合は、平衡結合アッセイとして測定した。トロンビン(20nM)、トロンボモジュリン(1.54μM)およびDAPA(20nM,ダンシルアルギニンN−3−(エチル−1,5−ペンタンジイル)アミド,蛍光性の可逆性トロンビン阻害剤)を0.02M Tris−HCl、0.15M NaCl、5.0mM CaCl2、0.01%Tween80(pH7.4)中に含む溶液を、少量のアリコートに分けて連続的に、トロンボモジュリンを含まないこと以外は同一の溶液に添加した。添加は、Perkin−ElmerモデルLS50B分光蛍光光度計の試料区画内で、磁気撹拌器を取り付けたキュベット内で行なった。強度の値を、それぞれ280nmおよび545nmの励起波長および発光波長で継続的に記録した。発光ビームにおいて430nmカットオフフィルターを使用した。データを以下のようにして解析した。蛍光強度Iを、トロンビン−DAPA(T・D)とトロンビン−トロンボモジュリン−DAPA(T・TM・D)の強度の和と仮定した。すなわち、I=i1・[T・D]+i2・[T・TM・D]であり、式中、i1およびi2は、T・DおよびT・TM・Dの蛍光係数(coefficient of fluorescence)である(励起は280nmであったため、遊離DAPAからの発光は無視できた)。TMによってプロテインC活性化またはTAFI活性化いずれかのKmは感知できるほどには変わらないため(Bajzarら,1996;J.Biol.Chem.271:16603−16608参照)、トロンビン−DAPA相互作用の親和性は変わらないと仮定することが可能である。
および [T・TM・D]=([T・TM]+[T・TM・D])/(1+KDAPA/[DAPA])
(式中、KDAPAはトロンビン−DAPA相互作用の解離定数である)。
したがって、
I=i1・([T]+[T・D])/(1+KDAPA/[DAPA])+i2([T・TM]+[T・TM・D])/(1+KDAPA/[DAPA])。
トロンビンは可溶性トロンボモジュリンにKD=23±14nMの親和性で結合する
可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合を、DAPAの蛍光の摂動によって測定した。図6に示したように、滴定曲線では、0〜75nMの可溶性トロンボモジュリン濃度範囲で相対蛍光の増大が示された。データ解析により、可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビン結合はKD=23±14nMで特性評価されることが示された。
変異トロンボモジュリン類似体の補因子活性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、KD値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について測定した。
材料および方法
TM変異体がプロテインCのトロンビン媒介性活性化の補因子として作用する能力を、ショッケート(shockate)において直接アッセイした。組換えヒトプロテインCは、John McPherson博士(Genzyme Corp.,Framingham,MA.)からのものであり、既報(BioTechnology 1990;8:655−661)のとおりに精製した。25μlの各ショッケートを等容量の組換えヒトプロテインC(終濃度0.3μM)およびヒトαトロンビン(Sigma Chemicals,セントルイス,MO)と、マイクロタイタープレート内で1nMの終濃度で混合した。使用した試薬はすべて、5mg/mlのウシ血清アルブミンを含有する20mM Tris,pH7.4/100mM NaCl/3.75mM CaCl2/0.1%NaN3(w/V)中で希釈した。混合物を37℃で1時間インキュベートし、800単位/mlの25μlのヒルジン(Sigma Chemicals,セントルイス,MO)の添加によって反応を終了させた。活性化プロテインCの量を、100μlの色素形成性基質D−バリル−L−ロイシル−L−アルギニン−p−ニトロアニリド(S−2266)(1mM)の添加によって決定した。プレートリーダーを使用し、405nmにおける吸光度によって変化を経時的に測定する。データはミリOD単位/分で記録され、Molecular Devicesプレートリーダーを用いて吸光度を10秒ごとに15分間測定することにより、各試料について決定する。すべてのアッセイに三連のショッケート試料(各DH5α細胞は、内部対照として、pSELECT−1ベクター(TMなし)、pTHR211(野生型)またはpMJM57(388位のメチオニンがロイシンに変えたpTHR211)のいずれかでトランスフェクトした)を含めた。TM変異体の補因子活性は、pMJM57で得られたものの平均値として示した。
各変異体を活性について少なくとも2回アッセイし(陽性クローンが2つしか単離されなかった変異体では3回)、すべてのデータを、スチューデントのt−検定を用いた有意差の判定に含めた。プレート間の変動係数は16.7%であった(n=18)。
大腸菌ショッケートを、製造業者の使用説明書(Novex Inc.,サンディエゴ,CA)に従い、還元条件下で10%Tris−トリシンSDS PAGEにおいて実行した。10mMのジチオトレイトールを含有する試料バッファー(62.5mM Tris,pH6.8,2%SDS,10%グリセロール,0.0025%ブロモフェノールブルー)中でショッケートを10分間煮沸することにより、還元アルキル化試料を調製した後、50mMのヨードアセトアミドとともにインキュベートした。
TAFIおよびプロテインCの活性化に関するトロンボモジュリン類似体の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、KD値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について決定した。
タンパク質および試薬
Solulin(残基4〜490)、TME(残基227〜462)、TMEcループ3〜6(残基333〜462)、およびTMEi4〜6(残基345〜362)を含むトロンボモジュリンの切断型形態を、Parkinsonら(Biochem.Biophys.Res.Commun.1992;185:567−576)に記載のとおりに調製した。Sf9細胞をTM構築物でトランスフェクトし、タンパク質を培地から、クロマトグラフィー手順(アニオン交換、ゲル濾過およびトロンビン親和性の組合せを使用)によって単離した。純度(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によって評価)は95%以上であった。ヒト血漿TAFIを、Bajzarら(J.Biol.Chem.1995;270:14477−14484)に記載のようにして単離した。ヒトプロテインCおよびトロンビンは、BajzarおよびNesheim(J.Biol.Chem.1993;268:8608−8616)に記載のとおりに調製した。トロンビン阻害剤であるダンシルアルギニンN−(3−エチル−1,5−ペンタンジイル)アミド(DAPA)は、Nesheimら(Biochemistry 1979;18:996−1003)に記載のとおり合成した。アラニンスキャニングによって得られる点変異体を、TMEM388L構築物から作製した。タンパク質は大腸菌において発現させた。ペリプラズム抽出物の手順および調製は、Nagashimaら,(J.Biol.Chem.1993;268:8608−8616)に記載されている。HEPES、塩基性カルボキシペプチダーゼ基質であるヒップリル−アルギニン、塩化シアヌル、および1,4−ジオキサンはSigma社から入手した。他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
TAFIの活性化のため、各ペリプラズム抽出物の20μlアリコートをトロンビン(13nM最終)とともに、20mM HEPES,pH7.5,150mM NaCl,5mM CaCl2中、室温で5分間プレインキュベートした。次いで、混合物を、精製組換えTAFI(18nM最終)および基質ヒップリル−アルギニン(1.0mM最終)とともに、総容量60μlで60分間インキュベートした。ヒップリル−アルギニンから馬尿酸への加水分解、続いて、馬尿酸の色原体への変換(80μlのリン酸バッファー(0.2M,pH8.3)および60μlの3%シアヌル酸含有ジオキサン(w/v)を使用)を測定することにより、活性化TAFIの量を定量した。充分に混合した後、透明な上清の吸光度を382nmにおいて測定した。各変異体について、TAFIのトロンビン依存性活性化の量を、トロンビンの非存在下で生じたバックグラウンド吸光度を差し引くことにより計算した。TMEM388L−アラニン変異体によるプロテインCの活性化を以下のようにしてアッセイした。
TM変異体で得られた結果(図7)は、8つ(eigth)の変異体のうち5つで、補因子活性化が実質的に低減していたことを示す。また、これらの5つの変異体のうち4つの変異体は、同時にTAFIの活性化活性の低下も示す。F376Aにおける変異のみで、プロテインC活性化の顕著な減損がもたらされたが、TAFI活性化の低減は中程度にすぎなかった。興味深いことに、TAFIおよびプロテインCの活性化に対するPhe376の重要性に違いのあることから、プロテインCがトロンビン−トロンボモジュリン複合体の基質である場合の方が、トロンボモジュリン構造についての要件に制限のあることが示唆される。
酸化に関するプロテインC活性化についてのMet特異的TM変異体の解析
トロンボモジュリン類似体の特定のメチオニン変異体を使用し、補因子活性化に対する、また、タンパク質の酸化に関するこの残基の役割を、プロテインC活性化アッセイを用いて解析した。
タンパク質および試薬
ヒト組換えプロテインCはGenzyme Corp.(ボストン,MA)製のものであった。ウシトロンビンはMiles Laboratories Inc.(ダラス,TX)製のものであった。D−Val−Leu−L−Arg−p−ニトロアニリドは、Glaserら(Prep.Biochem.11975;5:333−348)に記載のとおりに調製した。ヒトα−トロンビン(4,000 NIH U/mg)、ウシ血清アルブミン(フラクションV)およびクロラミンTはSigma Chemical Co.(セントルイス,MO)製のものであった。
全手順は4℃で行なった。TMの6 EGF様反復配列(アミノ酸227〜462)をコードするDNA配列を、昆虫プロテアーゼであるヒポデルミン(hypodermin)Aのシグナル配列に連結し、このハイブリッド遺伝子を、ポリヘドリン(polyhedron)遺伝子プロモーターの制御下でバキュロウイルスシャトルベクターpTMHY101内に配置した。組換えウイルスは標準的な手法を用いて作製した。記載の変異体類似体は、ミューテーター部位特異的変異誘発キット(Stratagene,Inc.,ラ・ホーヤ,CA)の使用によって調製し、同じ方法によってバキュロウイルス系での発現のためのウイルスを調製した。
分泌されたTME変異体(Sf9)を含有する増殖培地を遠心分離によって清澄にし、凍結乾燥させ、1:10容量の0.2%NEM−Ac(pH7)/0.008%Tween80に再溶解させた。アリコートを5μlのH20または5μlの100mMクロラミンTのいずれかで処理し;室温で20分間インキュベートし;希釈によって酸化剤を除去し;NAP−5カラム(20mM Tris−HCl,0.1M NaCl,2.5mM CaCl2,5mg/ml BSA,pH7.4;Pharmacia Inc.)で脱塩し;プロテインCの活性化について以下のようにしてアッセイした。
試料および試薬はすべて、APCアッセイ希釈剤(20mM Tris−HCl,pH7.4,100mM NaCl,2.5mM CaCl2,0.5%BSA)中で希釈した。試料およびTM標準品(0〜1nM)を、60μlの総容量で37℃にて、96ウェルプレート内で0.5μMのプロテインCおよび1nMのトロンビンとともに60分間インキュベートしてAPCを生成させた後、20μlのヒルジン(0.16U/μl,570nM)でクエンチした。S−2266(1mMを100μl)の加水分解をプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,Menlo Park,CA)を用いて405nmにて1分間隔でモニタリングすることにより、形成されたAPCの量を決定した。1Uの活性により、1pmolの活性化プロテインC/分が生成される(37℃)。
Met388の酸化によるTMの補因子活性の低下
変異体および野生型のTME(Sf9)を昆虫細胞において発現させ、クロラミンTで処理し、補因子活性についてアッセイし、結果を比較した(表2)。TMEは、クロラミンTなどの酸化剤で処理すると、その補因子活性をおよそ85%失う(表2参照)。Met291およびMet388の部位特異的変異により、TME(Sf9)の不活化が単一のメチオニンの酸化によるものであることが実証される。Met388を保持した誘導体はクロラミンTによって同程度(>80%)まで不活化されたが、Met388Leu変異体は抵抗性であった。Met291を置き換えた変異体は、活性であったが、酸化的不活化に対して抵抗性でなかった。
EGF4とEGF5の間にドメイン間ループの変異を有するTM類似体の解析(Gln387,Met388,Phe389)
トロンボモジュリン類似体の特定の変異体を使用し(sing)、これらの残基およびその酸化の役割を、プロテインC活性化アッセイを用いて解析した。
プラスミドの構築.EGF様ドメインのみからなるトロンボモジュリン断片(TME)を大腸菌において以下のようにして発現させ、完全長TMのTME(残基227〜462)をコードするDNA断片を、ポリメラーゼ連鎖反応によってヒトゲノムDNAから、プライマー5’−CCGGGATCCTCAACAGTCGGTGCCAATGTGGCG−3’と5’−CCGGGATCCTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGC−3’を用いて得た。この断片を、β−ラクタマーゼプロモーターおよびシグナル配列の制御下でpKT279内に配置した。次いで、得られたプラスミドのEcoRV−BgIII断片およびf1複製起点を含むpGEM3zfのScaI−SacI断片を、それぞれ、pSelect−1ベクター内のEcoRV−BamHIおよびScaI−SacI部位に挿入し、大腸菌発現プラスミドpTHR211を構築した。387位、388位または389位のTM変異体をコードするプラスミドを、改変部位インビトロ(in vitor)変異誘発キットに記載の部位特異的変異誘発手順を使用し、単鎖pTHR211 DNA鋳型を用いて構築した。部位特異的変異の各プライマーは制限解析によって確認した。
試料および試薬はすべて、APCアッセイ希釈剤(20mM Tris−HCl,pH7.4,100mM NaCl,2.5mM CaCl2,0.5%BSA)中で希釈した。試料およびTM標準品(0〜1nM)を、60μlの総容量で37℃にて、96ウェルプレート内で0.5μMのプロテインCおよび1nMのトロンビンとともに60分間インキュベートしてAPCを生成させた後、20μlのヒルジン(0.16U/μl,570nM)でクエンチした。S−2266(1mMを100μl)の加水分解をプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,Menlo Park,CA)を用いて405nmにて1分間隔でモニタリングすることにより、形成されたAPCの量を決定した。1Uの活性により、1pmolの活性化プロテインC/分が生成される(37℃)。
ループ間ドメインの変異によるTMの補因子活性の低下
部位特異的変異誘発を使用し、387位、388位または389位に改変アミノ酸、欠失または挿入のいずれかを有するTM変異体を発現させた(図8)。TM変異体の補因子活性は、3つの独立したクローンから得た平均であり、TME(Sf9)WTで見られた活性に対する割合で示す。ウエスタンブロットのゲルスキャンは、新しいすべての388位の変異体および選択した387位の変異体について、TMに対するポリクローナル抗体を用いて行なった。このスキャンによりほぼ同等量のTMが得られ、これは、発現の差が、観察された活性の差をもたらし得ないことを示す。また、387位(図8A)、388位(図8B)、389位(図8C)の独立した置換またはドメイン間ループ内の任意の箇所における挿入および欠失(図8D)により、APCアッセイでおおむね野生型TMEよりも(then)不充分な補因子である類似体がもたらされる。Gln387がThr、MetまたはAlaで置き換えられた類似体は、70%超の補因子活性を保持しているが、Gluでの置換により、これは対照の58%まで低下し、他のすべてのアミノ酸では50%超の低下がもたらされる。LeuでのMet388の置換のみ、野生型より実質的に高い補因子活性(1.8倍)がもたらされる。GlnとTyrを除くMet388の他のすべての置換では、補因子活性の50%超の低下がもたらされた。TM補因子活性はPhe389のアミノ酸置換に対して感受性が低く、この位置の点変異体のうち9つが、対照でみられる活性の70%を超保持している。任意の位置でのProまたはCys置換により活性が10%超まで低下したが、Met388Proは例外であり、これは30%の活性を保持していた。個々のアミノ酸の欠失または4つの可能な各位置へのAlaの挿入いずれかによってEGF4とEGF5の間のドメイン間ループの長さを変えると、野生型TMEの活性の10%未満の変異体がもたらされた。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1) 線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用であって、該TM類似体が治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すことを特徴とする、使用。
(項目2) 前記トロンボモジュリン類似体が以下の特徴:
(i)ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低下した、トロンビンに対する結合親和性、および/またはk D 値が0.2nMより大きい、トロンビンに対する結合親和性;
および/または
(ii)TM類似体TMEM388Lの補因子活性と比べて低下した補因子活性、
(iii)TM類似体TM E M388Lと比べて増大した補因子活性に対するTAFI活性化活性の比率
の1つ以上を示す、項目1に記載の使用。
(項目3) 前記線溶亢進を伴う凝固障害が、以下:血友病A、血友病B、血友病C、フォン・ヴィレブランド病(vWD)、後天性フォン・ヴィレブランド病、第X因子欠損症、パラ血友病、凝固第I、II、VもしくはVII因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固欠損症の疾患の群から選択される、項目1または2に記載の使用。
(項目4) 前記トロンボモジュリン類似体が、頭蓋内または他のCNSの出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織での出血からなる群より選択される出血事象の1つ以上を処置するために使用される、項目1〜3のいずれかに記載の使用。
(項目5) 前記トロンボモジュリン類似体が出血エピソードのときに投与される、項目1〜4のいずれかに記載の使用。
(項目6) 前記トロンボモジュリン類似体が、出血リスクが増大する前、例えば、手術または抜歯の前に投与される、項目1〜3のいずれかに記載の使用。
(項目7) 前記トロンボモジュリン類似体が、血液/血漿の輸血または凝固因子補充療法に対して抗療性の患者に投与される、項目1〜6のいずれかに記載の使用。
(項目8) 前記トロンボモジュリン類似体が、1週間未満から4週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは1日1回、2日に1回、または3日、4日、5日、6日もしくは7日おきに1回、より好ましくは長期投与として投与される、項目1〜7のいずれかに記載の使用。
(項目9) 前記トロンボモジュリン類似体が非経口適用として、好ましくは静脈内または皮下適用として与えられる、項目1〜8のいずれかに記載の使用。
(項目10)前記 トロンボモジュリン類似体が可溶性TM類似体である、項目1〜9のいずれかに記載の使用。
(項目11) 前記トロンボモジュリン類似体がヒト可溶性TM類似体である、項目10に記載の使用。
(項目12) 前記トロンボモジュリン類似体が、EGF3、EGF4、EGF5、EGF6を含み、好ましくは断片EGF3〜EGF6を含み、より好ましくはEGFドメイン1〜6を含む群から選択される、少なくとも1つの構造ドメインを含む、項目1〜11のいずれかに記載の使用。
(項目13) 前記トロンボモジュリン類似体が、EGFドメインEGF1〜EGF6からなる、より好ましくは、EGFドメインEGF3〜EGF6からなる、項目1〜12のいずれかに記載の使用。
(項目14) 前記トロンボモジュリン類似体が、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列(配列番号1または配列番号3に示す)に対応するアミノ酸配列を有し、以下の改変:
a) アミノ酸1〜3の除去
b) M388L
c) R456G
d) H457Q
e) S474A、およびP490での終結
の1つ以上を含む、項目1〜13のいずれかに記載の使用。
(項目15) 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号2と少なくとも85%、または少なくとも90%もしくは95%配列が同一の配列を含むアミノ酸配列を有する、項目1〜14のいずれかに記載の使用。
(項目16) 前記トロンボモジュリン類似体が、以下:
aa) 349 Asp;
bb) 355 Asn;
ac) 357 Glu;
ad) 358 Tyr;
ae) 359 Gln;
af) 361 Gln;
ag) 363 Leu;
ah) 364 Asn;
ai) 368 Tyr;
aj) 371 Val;
ak) 374 Glu;
al) 376 Phe;
am) 384 His;
an) 385 Arg;
ba) 387 Gln;
bb) 389 Phe;
bc) 398 Asp;
bd) 400 Asp;
be) 402 Asn;
bf) 403 Thr;
bg) 408 Glu;
bh) 411 Glu;
bi) 413 Tyr;
bj) 414 Ile;
bk) 415 Leu;
bl) 416 Asp;
bm) 417 Asp;
bn) 420 Ile;
bo) 423 Asp;
bp) 424 Ile;
bq) 425 Asp;
br) 426 Glu;
ca) 428 Glu;
cb) 429 Asp;
cc) 432 Phe;
cd) 434 Ser;
ce) 436 Val;
cf) 438 His;
cg) 439 Asp;
ch) 440 Leu;
ci) 443 Thr;
cj) 444 Phe;
ck) 445 Glu;
cl) 456 Arg;
cm) 458 Ile;または
cn) 461 Asp
(配列番号1または配列番号3による)で、天然配列に対応する1つ以上の位置にアミノ酸改変を有する、項目1〜15のいずれかに記載の使用。
(項目17) 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号1または配列番号3による376位のフェニルアラニンの改変を有し、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換され、より好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンで置換される、項目1〜16のいずれかに記載の使用。
(項目18) 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号1または配列番号3による以下のアミノ酸:
a) 387 Gln;
b) 388 Met;
b) 389 Phe
の1つ以上の改変を有し、
それにより、該アミノ酸は欠失しているか、1つ以上のさらなるアミノ酸が挿入されているか、または好ましくは置換されている、項目1〜17のいずれかに記載の使用。
(項目19) 前記トロンボモジュリン類似体が、その酸化型形態で使用され、好ましくは、クロラミンT、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された形態で使用される、項目1〜18のいずれかに記載の使用。
(項目20) 前記TM類似体内の1つ以上のメチオニン残基、好ましくは、388位(配列番号1または配列番号3による)のメチオニン残基が酸化される、項目19に記載の使用。
(項目21) 線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適したトロンボモジュリンの類似体をスクリーニングするための方法であって、該トロンボモジュリンが以下の特徴:
(i)トロンビンに対する結合親和性の低下、
(ii)補因子活性の低下、
(iii)TAFI活性化活性の増大、
の1つ以上を示し、
a)該トロンボモジュリンの配列(配列番号1または配列番号3)に、好ましくは項目15に列挙したアミノ酸位置に、1つ以上のアミノ酸置換を作製する工程;
b)該改変した類似体を対照分子と、好ましくは、ウサギ肺TMまたは可溶性ヒトTM類似体と、以下の特性:
ba)トロンビンに対する結合親和性(KD値);
bb)補因子活性;
bc)TAFI活性化活性もしくはTAFIa産生能;
bd)TAFI活性化活性と補因子活性の比率;
be)タンパク質酸化の効果;
bf)インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果;または
bg)凝固関連動物モデルにおける効果
の1つ以上に関して比較する工程
を含む、方法。
(項目22) 治療有効量の項目1〜20のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
Claims (22)
- 線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用であって、該TM類似体が治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すことを特徴とする、使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が以下の特徴:
(i)ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低下した、トロンビンに対する結合親和性、および/またはkD値が0.2nMより大きい、トロンビンに対する結合親和性;
および/または
(ii)TM類似体TMEM388Lの補因子活性と比べて低下した補因子活性、
(iii)TM類似体TMEM388Lと比べて増大した補因子活性に対するTAFI活性化活性の比率
の1つ以上を示す、請求項1に記載の使用。 - 前記線溶亢進を伴う凝固障害が、以下:血友病A、血友病B、血友病C、フォン・ヴィレブランド病(vWD)、後天性フォン・ヴィレブランド病、第X因子欠損症、パラ血友病、凝固第I、II、VもしくはVII因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固欠損症の疾患の群から選択される、請求項1または2に記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、頭蓋内または他のCNSの出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織での出血からなる群より選択される出血事象の1つ以上を処置するために使用される、請求項1〜3のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が出血エピソードのときに投与される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、出血リスクが増大する前、例えば、手術または抜歯の前に投与される、請求項1〜3のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、血液/血漿の輸血または凝固因子補充療法に対して抗療性の患者に投与される、請求項1〜6のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、1週間未満から4週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは1日1回、2日に1回、または3日、4日、5日、6日もしくは7日おきに1回、より好ましくは長期投与として投与される、請求項1〜7のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が非経口適用として、好ましくは静脈内または皮下適用として与えられる、請求項1〜8のいずれかに記載の使用。
- 前記 トロンボモジュリン類似体が可溶性TM類似体である、請求項1〜9のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体がヒト可溶性TM類似体である、請求項10に記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、EGF3、EGF4、EGF5、EGF6を含み、好ましくは断片EGF3〜EGF6を含み、より好ましくはEGFドメイン1〜6を含む群から選択される、少なくとも1つの構造ドメインを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、EGFドメインEGF1〜EGF6からなる、より好ましくは、EGFドメインEGF3〜EGF6からなる、請求項1〜12のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列(配列番号1または配列番号3に示す)に対応するアミノ酸配列を有し、以下の改変:
a) アミノ酸1〜3の除去
b) M388L
c) R456G
d) H457Q
e) S474A、およびP490での終結
の1つ以上を含む、請求項1〜13のいずれかに記載の使用。 - 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号2と少なくとも85%、または少なくとも90%もしくは95%配列が同一の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項1〜14のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、以下:
aa) 349Asp;
bb) 355Asn;
ac) 357Glu;
ad) 358Tyr;
ae) 359Gln;
af) 361Gln;
ag) 363Leu;
ah) 364Asn;
ai) 368Tyr;
aj) 371Val;
ak) 374Glu;
al) 376Phe;
am) 384His;
an) 385Arg;
ba) 387Gln;
bb) 389Phe;
bc) 398Asp;
bd) 400Asp;
be) 402Asn;
bf) 403Thr;
bg) 408Glu;
bh) 411Glu;
bi) 413Tyr;
bj) 414Ile;
bk) 415Leu;
bl) 416Asp;
bm) 417Asp;
bn) 420Ile;
bo) 423Asp;
bp) 424Ile;
bq) 425Asp;
br) 426Glu;
ca) 428Glu;
cb) 429Asp;
cc) 432Phe;
cd) 434Ser;
ce) 436Val;
cf) 438His;
cg) 439Asp;
ch) 440Leu;
ci) 443Thr;
cj) 444Phe;
ck) 445Glu;
cl) 456Arg;
cm) 458Ile;または
cn) 461Asp
(配列番号1または配列番号3による)で、天然配列に対応する1つ以上の位置にアミノ酸改変を有する、請求項1〜15のいずれかに記載の使用。 - 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号1または配列番号3による376位のフェニルアラニンの改変を有し、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換され、より好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンでの置換でされる、請求項1〜16のいずれかに記載の使用。
- 前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号1または配列番号3による以下のアミノ酸:
a)387Gln;
b)388Met;
b)389Phe
の1つ以上の改変を有し、
それにより、該アミノ酸は欠失しているか、1つ以上のさらなるアミノ酸が挿入されているか、または好ましくは置換されている、請求項1〜17のいずれかに記載の使用。 - 前記トロンボモジュリン類似体が、その酸化型形態で使用され、好ましくは、クロラミンT、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された形態で使用される、請求項1〜18のいずれかに記載の使用。
- 前記TM類似体内の1つ以上のメチオニン残基、好ましくは、388位(配列番号1または配列番号3による)のメチオニン残基が酸化される、請求項19に記載の使用。
- 線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適したトロンボモジュリンの類似体をスクリーニングするための方法であって、該トロンボモジュリンが以下の特徴:
(i)トロンビンに対する結合親和性の低下、
(ii)補因子活性の低下、
(iii)TAFI活性化活性の増大、
の1つ以上を示し、
a)該トロンボモジュリンの配列(配列番号1または配列番号3)に、好ましくは請求項15に列挙したアミノ酸位置に、1つ以上のアミノ酸置換を作製する工程;
b)該改変した類似体を対照分子と、好ましくは、ウサギ肺TMまたは可溶性ヒトTM類似体と、以下の特性:
ba)トロンビンに対する結合親和性(KD値);
bb)補因子活性;
bc)TAFI活性化活性もしくはTAFIa産生能;
bd)TAFI活性化活性と補因子活性の比率;
be)タンパク質酸化の効果;
bf)インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果;または
bg)凝固関連動物モデルにおける効果
の1つ以上に関して比較する工程
を含む、方法。 - 治療有効量の請求項1〜20のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
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